KR102423739B1 - 트립토판 또는 타이로신으로 안정화된 액체 신경독 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물성 단백질이 없는 안정한 액체 신경독 제형에 관한 것으로 이는 계면 활성제, 트립토판 및 타이로신으로부터 선택된 아미노산, 나트륨, 염화물 및 인산염 이온을 포함하는 완충액을 포함하고, pH 5.5 내지 8을 가지며, 2 개월 동안 안정하다. 이들 조성물은 치료 요법에 사용하기 적합하고 특히 원하는 치료적 또는 심미적 효과를 달성하려는 환자에게 투여하기 적합하다. 본 발명은 또한 동물 유래 단백질이 없는 액체 조성물에서 단백질성 신경독을 분해로부터 보호하기 위한 트립토판 및 타이로신으로부터 선택된 아미노산의 용도에 관한 것이다.

Description

트립토판 또는 타이로신으로 안정화된 액체 신경독 제형{Liquid neurotoxin formulation stabilized with tryptophan or tyrosine}

본 발명은 동물성 단백질이 없는 액체 신경독 제형(liquid neurotoxin formulations)과 관련된 것이다. 특히, 본 발명은 비단백질성 첨가제(non proteinaceous excipients)로 안정화된 동물성 단백질이 없는 액체 보툴리눔 신경독 제형과 관련된 것이다.

본 명세서에 기재된 신경독 제형은 치료에 사용하기 적합하며 특히 원하는 치료적 또는 심미적 효과를 달성려는 환자에게 투여하기 적합하다.

클로스트리디움 균주에 의해 자연적으로 생산되는 클로스트리디움 신경독은 지금까지 알려진 가장 유독한 생물학적 제제이며 동시에 하기를 포함한 수많은 신경근육 및 내분비 장애를 치료하는 강력한 도구이다: 경부 근긴장이상증, 강직, 안검경련, 다한증 또는 타액과다증. 또한 주름살을 매끈하게 하는 미적 분야에서도 사용된다.

약제학적 제품으로서 용도에 적합하려면, 신경독 조성물은 신경독 활성의 상당한 손실없이 보관될 수 있어야만 한다.

보툴리눔 신경독의 현재 입증된 모든 제형에는 동물(인간을 포함) 단백질, 보통 인간 혈청 알부민(HSA)이 안정제로 사용된다.

그러나, 약제학적 조성물에 HSA같은 동물성 단백질의 존재는 환자에게 프리온 같은 동물로 전달되는 감염원을 본의 아니게 전달할 위험 때문에, 비록 낮을지라도, 바람직하지 않다.

동물성 단백질이 없는 보툴리눔 독소 제형은 당업계에 개시되어 있다. 예를 들어, WO0158472에는 2-하이드록시에틸 전분 같은 다당류를 사용하여 보툴리눔 독소를 안정화한 동결 건조된 조성물이 기재되어 있다. WO2005007185에는 표면 활성 물질 및 Glu 및 Gln 또는 Asp 및 Asn으로부터 선택된 적어도 두개의 아미노산 혼합물이 보툴리눔 독소를 안정화하기 위해 사용된 조성물이 기재되어 있다.

그러나, 대부분의 선행 기술 제형은 액체 형태로는 불안정해서 동결 건조 또는 냉동-건조 형태로 보관된다. 그런 제형들은 환자에게 투여하기 전에 멸균 식염수로 의료진에 의해 재구성될 필요가 있다. 이러한 재구성 단계는 의료진의 시간 손실, 희석 오류의 위험 및 재구성 과정 중 오염의 위험과도 관련되어 있다. 보툴리눔 독소 공급자는 재구성 단계가 적절하게 수행되는 것을 보장하기 위해 의료진을 또한 훈련시켜야만 한다.

그러므로, 액체 제형은 의료진의 시간 손실, 희석 오류의 위험, 오염의 위험 및 공급자에 대한 훈련 제공의 필요성을 제거하기 때문에 유리하다.

HSA가 없는 액체 제형은 계면활성제, 염화나트륨 및 이당류를 포함하는 액체 보툴리눔 독소 제형을 개시하는 예를 들어 WO2006005910에 기재되어 있다. WO2009008595에는 폴리소르베이트 20 및 메티오닌을 포함하는 액체 보툴리눔 독소 제형이 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 저장 및 치료에 사용하기에 적합한 유리한 액체의 동물성 단백질이 없는 보툴리눔 신경독 제형을 제공하는 것이다. 특히, 안정화 제형은 제품 안정성이 유지되어야 하고, 동물성 단백질이 없어야 하며, 또한 복합체 단백질이 없는 신경독을 안정화시키는데 적합해야한다.

발명의 요약

본 발명의 제 1 양태는 단백질성 신경독, 계면 활성제, 트립토판 및 타이로신으로부터 선택되는 아미노산, 나트륨, 염화물 및 인산염 이온을 포함하는 완충액을 포함하는 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 액체 조성물로서, 이는 시간이 지남에 따라 안정하며 동물 유래 단백질이 없고 5.5 내지 8의 pH를 갖는다.

또 다른 양태는 치료 및/또는 미용에서의 본 발명에 따른 액체 조성물의 용도이다.

본 발명의 추가 양태는 동물 유래 단백질이 없는 액체 조성물에서 단백질성 신경독을 분해로부터 보호하기 위한, 트립토판 및 타이로신으로부터 선택된 아미노산의 용도이다.

본 발명의 제 1 양태는 단백질성 신경독, 계면 활성제, 트립토판 및 타이로신으로부터 선택되는 아미노산, 나트륨, 염화물 및 인산염 이온을 포함하는 완충액을 포함하는 또는 이것으로 본질적으로 구성되는 액체 조성물로서, 이는 시간이 지남에 따라 안정하며 동물 유래 단백질이 없고 5.5 내지 8의 pH를 갖는다.

"동물성 단백질이 없는"은 인간 기원을 포함하여 동물의 단백질을 포함하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

신경독(neurotoxin)은 신경 세포를 표적으로 하고 신경 기능에 영향을 미치는 물질이다. 단백질성 신경독은 보툴리눔 독소(BoNT) 및 파상풍 독소(TeNT)를 포함한다. 바람직하게는, 단백질성 신경독은 보툴리눔 신경독이다.

보툴리눔 신경독은 디설파이드 교상 결합으로 연결된 50 kDa 경쇄(L)와 100 kDa 중쇄(H)의 활성 형태로 구성된 150 Kda 금속 단백질 분해 효소이다. L 쇄는 소포 매개성 신경 전달 물질 방출에 관여하는 SNARE(용해성 NSF 부착 단백질 수용체) 단백질 중 하나를 세포 내로 절단하여 신경 전달 물질 매개 메커니즘을 파괴시키는 아연-프로테아제이다. 중쇄는 두 개의 도메인: N-말단 50 kDa 전좌 도메인(HN) 및 C-말단 50 kDa 수용체-결합 도메인(H_C)을 포함한다. 보툴리눔 신경독의 H_C 도메인은 H_CC 및 H_CN 도메인으로 지칭되는 2 개의 구별되는 구조적 특징을 포함한다. 수용체 결합에 관련된 아미노산 잔기는 주로 H_CC 도메인에 위치한다고 믿어진다.

보툴리눔 신경독은 7 개의 항원과 관련하여 구별되는 혈청형(A 내지 G)으로 분류된다. 각 혈청형에 대한 예시적인 아미노산 서열이 SEQ ID NO 1 내지 7로 본 명세서에서 제공된다.

각 서열에 대한, 상이한 도메인은 예를 들어 하기 표와 같을 수 있다.

당업자는 각각의 보툴리눔 신경독 도메인에 일부 변이가 있을 수 있음을 이해할 것이다.

BoNT는 예를 들어 아세틸 콜린의 방출을 방지하여 근육 수축을 예방함으로써 신경근 신경 접합부에 작용한다. 신경 말단 중독은 가역적이며 그 지속 기간은 상이한 BoNT 혈청형마다 다르다.

천연 BoNT는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 및 클로스트리디움 부티리쿰(C. butyricum), 클로스트리디움 바라티이(C. baratii) 및 클로스트리디움 아르겐티넨세(C. argentinense)와 같은 다른 클로스트리디움 종에 의해 단백 분해 효소에 의한 분해로부터 신경독을 보호하는 다중-단백질 복합체의 일부로서 생산된다. "복합체 형태의 보툴리눔 신경독"은 보툴리눔 신경독 및 이러한 다중-단백질 복합체(신경독 관련 단백질 또는 "NAP")의 성질에 속하는 하나 이상의 단백질을 의미한다. NAP에는 비-독성 비-혈구 응집소(NTNH) 단백질 및 혈구 응집소 단백질(HA-17, HA-33 및 HA-70)이 포함된다. "고순도 보툴리눔 신경독"은 본질적으로 NAP가 없는 보툴리눔 신경독을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 보툴리눔 신경독은 복합체 형태의 보툴리눔 신경독이다. 다른 구현예에 따르면, 보툴리눔 신경독은 고순도 보툴리눔 신경독이다.

천연 클로스트리디움 균주의 배양을 통해 BoNT를 생산하고 이들을 복합체 형태 또는 고순도 형태로 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌(Pickett, Andy; "임상 제품으로서 보툴리눔 독소: 제조 및 약리학" 보툴리눔 신경독의 임상적 적용; Springer New York, 2014.7-49)에 기재되어있다.

고순도 또는 본질적으로 순수한 보툴리눔 신경독은 예를 들어, 문헌((미생물학 및 면역학에서 현재 주제: Current Topics in Microbiology and Immunology) (1995), 195, p. 151-154)에 기재된 방법에 따라 보툴리눔 독소를 포함하는 단백질 복합체로부터 수득될 수 있다.

대안적으로, 고순도 보툴리눔 신경독은 대장균(E. coli)과 같은 이종 숙주에서 BoNT 유전자의 재조합 발현에 의해 생산되고 그로부터 정제될 수 있다.

바람직하게는, 단백질성 신경독은 보툴리눔 신경독이다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 보툴리눔 신경독은 복합체 형태의 보툴리눔 신경독이다. 다른 구현예에 따라, 보툴리눔 신경독은 고순도 보툴리눔 신경독이다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 보툴리눔 신경독은 천연의 클로스트리디움 균주로부터 정제된 보툴리눔 신경독이다. 다른 구현예에 따라, 보툴리눔 신경독은 대장균과 같은 이종 숙주에서 재조합으로 생산된 보툴리눔 신경독이다.

본 발명에 따라, 보툴리눔 신경독은 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G의 BoNT일 수 있다.

본 발명에 따라, 보툴리눔 신경독은 변형된 보툴리눔 신경독일 수 있다. 본 발명에 따라, "변형된 BoNT"는 SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 적어도 50 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 BoNT이다. 바람직하게는, 변형된 BoNT는 SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고 있다. 바람직하게는, 변형된 BoNT는 그것의 아미노산 서열이 600, 400, 200, 150, 100, 50 또는 20개 미만의 아미노산 치환, 결실 또는 부가로, 예를 들면, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가로 SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과는 다른 BoNT이다.

본 발명에 따라, 재조합 보툴리눔 신경독은 키메라 보툴리눔 신경독일 수 있다. 본 발명에 따라, "키메라 BoNT"는 모두 동일한 혈청형에 속하지 않는 L, H_N, H_CN, 및 H_CC 도메인으로 구성된다. 예를 들어, 키메라 BoNT는 한 혈청형의 L 쇄와 상이한 혈청형의 모든 H 쇄(H_N, H_CN, 및 H_CC 도메인)로 이루어질 수 있다. 키메라 BoNT는 또한 L 쇄 및 한 혈청형의 H_N 도메인("LH_N") 및 상이한 혈청형의 H_C 도메인(H_CN 및 H_CC)으로 이루어질 수 있다. 키메라 BoNT는 또한 L 쇄 및 한 혈청형의 H_N 및 H_CN 도메인("확장된 LH_N") 및 상이한 혈청형의 H_CC 도메인으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따라 경쇄 도메인(L)은 하기 아미노산 서열 중 하나와 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %의 서열 동일성을 갖고, 소포 매개성 신경 전달 물질 방출에 관련된 SNARE 단백질 중 하나를 절단할 수 있는 능력을 보유한 아미노산 서열을 가질 수 있다:

· SEQ ID NO:1의 아미노산 1-448

· SEQ ID NO:2의 아미노산 1-440

· SEQ ID NO:3의 아미노산 1-441

· SEQ ID NO:4의 아미노산 1-445

· SEQ ID NO:5의 아미노산 1-422

· SEQ ID NO:6의 아미노산 1-439

· SEQ ID NO:7의 아미노산 1-441

본 발명에 따라 H_N 도메인은 하기 아미노산 서열 중 하나와 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %의 서열 동일성을 갖고 전좌 능력을 보유한 아미노산 서열을 가질 수 있다:

· SEQ ID NO:1의 아미노산 449-871

· SEQ ID NO:2의 아미노산 441-858

· SEQ ID NO:3의 아미노산 442-866

· SEQ ID NO:4의 아미노산 446-862

· SEQ ID NO:5의 아미노산 423-845

· SEQ ID NO:6의 아미노산 440-864

· SEQ ID NO:7의 아미노산 442-863

본 발명에 따라 H_C 도메인은 하기 아미노산 서열 중 하나와 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %의 서열 동일성을 갖고 신경근육 세포에 결합할 수 있는 능력을 보유한 아미노산 서열을 가질 수 있다:

· SEQ ID NO:1의 아미노산 872-1296

· SEQ ID NO:2의 아미노산 859-1291

· SEQ ID NO:3의 아미노산 867-1291

· SEQ ID NO:4의 아미노산 863-1276

· SEQ ID NO:5의 아미노산 846-1252

· SEQ ID NO:6의 아미노산 865-1274

· SEQ ID NO:7의 아미노산 864-1297

본 발명에 따라 H_CC 도메인은 하기 아미노산 서열 중 하나와 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %의 서열 동일성을 갖고 신경근육 세포에 결합할 수 있는 능력을 보유한 아미노산 서열을 가질 수 있다:

· SEQ ID NO:1의 아미노산 1111-1296

· SEQ ID NO:2의 아미노산 1098-1291

· SEQ ID NO:3의 아미노산 1112-1291

· SEQ ID NO:4의 아미노산 1099-1276

· SEQ ID NO:5의 아미노산 1086-1252

· SEQ ID NO:6의 아미노산 1106-1274

· SEQ ID NO:7의 아미노산 1106-1297

하위 혈청형에 따라 약간의 변이가 발생할 수 있으므로 상기에 확인된 참조 서열을 가이드로 고려해야 한다.

2 개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "백분율 서열 동일성"은 정렬된 서열에 의해 공유되는 동일한 위치에서의 동일한 뉴클레오타이드/아미노산의 수의 함수이다. 따라서 % 동일성은 정렬된 각 위치에서의 동일한 뉴클레오타이드/아미노산의 수를, 정렬된 서열의 총 뉴클레오타이드/아미노산의 수로 나누어 100을 곱한 값으로서 계산될 수 있다. % 서열 동일성의 계산은 또한 두 개 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이 및 갭의 숫자를 고려할 수 있다. 서열 비교 및 둘 이상의 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 BLAST와 같은, 당업자에게 친숙한, 특정 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.

계면 활성제(또는 표면 활성제)는 액체와 고체 사이 또는 2 개의 액체 사이의 표면 장력을 낮출 수 있는 화합물이다. 계면 활성제는 비-이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물에서, 계면 활성제는 바람직하게는 비-이온성 계면 활성제이다. 비-이온성 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 예컨대 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 또는 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 폴리옥시프로필렌 글리콜 알킬 에테르; 글루코시드 알킬 에테르, 예컨대 데실 글루코시드, 라우릴 글루코시드 또는 옥틸 글루코시드; 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르, 예컨대 트리톤 X-100; 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르, 예컨대 노녹시놀-9; 글리세롤 알킬 에스테르, 예컨대 글리세릴 라우레이트; 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 예컨대 폴리소르베이트; 소르비탄 알킬 에스테르, 예컨대 스판(spans); 코카미드 MEA, 코카미드 DEA; 도데실디메틸아민 옥사이드; 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 블록 공중합체, 예컨대 폴록사머(Poloxamer); 폴리에톡실화된 탤로우 아민(POEA)을 포함한다.

바람직한 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 비-이온성계면 활성제로 폴리소르베이트, 바람직하게는 폴리소르베이트 20(PS20), 폴리소르베이트 60(PS60) 또는 폴리소르베이트 80(PS80)을 포함한다. 가장 바람직하게는, 비-이온성계면 활성제는 PS80이다. 계면 활성제가 폴리소르베이트인 경우, 이의 농도는 바람직하게는 0.001 % 내지 15 % v/v, 더 바람직하게는 0.005 내지 2 % v/v, 더욱 더 바람직하게는 0.01 내지 1 %, 예를 들어 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1 % v/v이다. 일 구현예에 따라, 계면 활성제 PS80의 농도는 0.05 내지 0.2 % v/v, 예를 들어 약 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19 또는 0.20 % v/v이다.

PS20은 대략 1.1 g/mL의 밀도를 갖는다. PS60은 대략 1.044 g/mL의 밀도를 갖는다. PS80은 대략 1.06 내지 1.09 g/mL의 밀도를 갖는다.

폴리소르베이트는 미셀을 형성해서 단백질의 표면 흡착 및 단백질의 집적을 방지한다고 믿어진다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, 분해/산화시 폴리소르베이트는 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있는 과산화물 및 산을 형성할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 폴리소르베이트의 농도는 제품의 제형에서 가능한 낮게 하는 것이 바람직하게 여겨진다. 따라서 폴리소르베이트의 농도는 임계 미셀 농도(CMC)의 200 배를 초과하지 않아야 하며, 보다 바람직하게는 CMC의 100, 50, 20, 10 또는 5배를 초과하지 않아야 하는 것이 바람직하게 여겨진다.

PS20(Mw 1227.5 g/mol)에 대하여, CMC는 21 ℃에서 대략적으로 8x10^-5 M, 즉 대략 0.01 % w/v이다.

PS60(Mw 1309 g/mol)에 대하여, CMC는 21 ℃에서 대략 21x10^-6 M, 즉 대략 0.003 % w/v이다.

PS80(Mw 1310 g/mol)에 대하여, CMC는 21 ℃에서 대략적으로 12x10^-6 M, 즉 대략 0.002 % w/v이다.

바람직한 구현예에 따라, 폴리소르베이트 농도는 주어진 온도에서 CMC의 1 내지 200 배, 예를 들어 약 21 ℃에서, 바람직하게는 CMC의 2 내지 100 배, 예를 들어 CMC의 약 20 배 또는 약 50 배이다.

본 발명에 따른 액체 조성물은 트립토판 또는 타이로신인 아미노산을 포함한다. 이론에 구속되지 않고, 트립토판 또는 타이로신은 비기능적으로 만드는 활성 단백질의 산화를 막을 수 있다고 가정된다. 실제로 신경독에 비해 몰 초과로 첨가된 아미노산은 먼저 산화되어 신경독을 보호하는 것으로 생각된다. 트립토판 또는 타이로신은 폴리소르베이트와 같은 계면 활성제의 반응성 분해 산물을 중화시킬 수 있음이 또한 가정된다.

바람직하게는 아미노산은 트립토판이다. 보다 바람직하게는, 아미노산은 L-트립토판이다.

아미노산 농도는 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/mL, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5 mg/mL, 0.25 내지 3 mg/mL 예를 들어 약 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2 또는 3 mg/mL이다.

본 발명에 따른 조성물은 나트륨, 염화물 및 인산염 이온을 포함하는 완충액을 포함한다. 본 발명자들은 실로 놀랍게도 나트륨, 염화물 및 인산염 이온이 없는 완충액에서는 독소의 안정성이 낮음을 발견하였다. 바람직하게 완충액은 또한 칼륨 이온을 포함한다.

완충액은 예를 들어 염화 나트륨, 염화 칼륨 및 인산 나트륨 염을 조합하여 수득될 수 있다. 염화 나트륨 농도는 바람직하게는 10 내지 500 mM, 바람직하게는 약 25 내지 300 mM, 예를 들어 약 25, 50, 75, 100, 140, 150, 200, 250 또는 300 mM이다.

인산 나트륨 농도는 바람직하게는 1 내지 100 mM, 바람직하게는 2 내지 50 mM, 예를 들어 약 2, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50 mM이다.

염화 칼륨 농도는 바람직하게는 1 내지 50 mM, 바람직하게는 1 내지 10 mM 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 10 mM이다.

본 발명에 따른 조성물은 pH 5.5 내지 8을 갖는다. 바람직한 구현예에 따라, pH는 6.0 내지 7.5, 예를 들어 약 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75, 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45 또는 7.5이다. 바람직하게는 pH는 생리학적 pH(약 7.4)에서 1 단위 내에 있다.

본 발명에 따른 조성물은 액체이다. 상기 조성물은 바람직하게는 수성 희석제, 보다 바람직하게는 물, 예를 들어 멸균수, 주사용 물, 정제된 물, 주사용 멸균수를 포함한다.

바람직하게는 상기 제형은 등장성이고 환자 특히 인간 환자에게 주사하기에 적합하다.

보툴리눔 신경독의 양은 마우스에서 치명적인 복강 내 투여량의 중앙값으로 정의되는 마우스 LD50(치사량 50) 단위로 일반적으로 표현된다.

보툴리눔 독소에 대한 마우스 LD50(MLD50) 단위는 표준화된 단위가 아니다. 실제로, 판매되는 독소의 상이한 제조자에 의해 사용된 분석은 희석 완충제의 선택에서 특히 다르다. 예를 들어, Dysport^®에 사용된 테스트는 젤라틴 인산염 완충액을 사용하는 반면, BOTOX^®에 사용된 분석은 염수를 희석제로 사용한다. 젤라틴 완충액은 LD50 분석에 사용된 고희석에서 독소를 보호한다고 믿어진다. 반대로 희석제로 염수를 사용하면 역가의 일부를 상실할 것으로 여겨진다. 이것은 Dysport^® 분석으로 테스트 했을 때 BOTOX^® 1 단위가 Dysport의 3단위와 대략 동일한지 이유를 설명할 수 있다(Straughan, D. W., 2006, ATLA 34(3), 305-313; Hambleton and Pickett, Hambleton, P., and A. M. Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87.11: 719).

바람직하게는, 마우스 LD50을 결정하기 위해 사용되는 희석 완충액은 젤라틴 인산염 완충액이다. 예를 들어, 마우스 LD50은 문헌[Hambleton, P. et al. 클로스트리디움 보툴리눔 A형 독소의 생산, 정제 및 독소 처리. Eds. G. E. Jr Lewis, and P. S. Angel. Academic Press, Inc., New York, USA, 1981, p. 248.]에 기재된 바와 같이 결정할 수 있다. 간단히, 보툴리눔 독소 샘플을 pH 6.5에서 0.2 %(w/v) 젤라틴 0.07 M 인산나트륨(Na2HPO4) 완충액으로 연속 희석한다. 몸무게가 약 20 g인 마우스 그룹(예: 그룹당 4~8 마우스)에 희석된 독소 샘플(예: 동물당 0.5 ml)을 복강 내로 주사한다. 희석 그룹, 예를 들어 5 희석 그룹이 50 % 치사량을 포괄하도록 선택된다. 마우스를 최대 96 시간 동안 관찰하고 마우스 치사량 50(MLD50)을 추정한다.

본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 보툴리눔 신경독을 mL당 4 내지 10000 LD50 단위, 보다 바람직하게는 보툴리눔 신경독을 mL당 10 내지 2000 LD50 단위, 예를 들어 보툴리눔 신경독을 mL당 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 1500 LD50 단위 포함한다.

보툴리눔 신경독의 양은 또한 ng으로 표현할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 보툴리눔 신경독을 mL당 약 0.01 내지 75 ng, 보다 바람직하게는 보툴리눔 신경독을 mL당 약 0.03 내지 20 ng, 더욱 더 바람직하게는 보툴리눔 신경독을 mL당 약 0.1 내지 15 ng, 예를 들어 보툴리눔 신경독을 mL당 약 0.15, 0.3, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ng 포함한다.

본 발명에 따른 제형은 동물성 단백질이 없다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 알부민을 포함하지 않고, 특히 인간 혈청 알부민을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 동물성 제품이 없는데 이는 이것이 동물(인간 포함) 기원의 구성 요소를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 단백질성 신경독 외에 어떤 단백질도 포함하지 않는다. 다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 단백질성 신경독 및 하나 이상의 NAP(신경독-관련 단백질) 외에는 어떤 단백질도 포함하지 않는다. 의심 때문에, 아미노산은 단백질이 아님을 특별히 언급한다.

본 발명의 구현예에 따라, 상기 조성물은 단당류, 이당류 및 다당류를 포함하여 어떤 당류도 포함하지 않는다.

본 발명에 따른 액체 조성물은 시간이 지남에 따라 안정하다. 예를 들어, 상기 조성물은 2 개월 동안 2 내지 8 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 3 개월 동안 2 내지 8 ℃에서, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 바람직한 구현예에 따라, 상기 조성물은 6 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 12 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 18 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 24 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 36 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 3 개월 동안 실온에서, 예를 들어 25 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 6 개월 동안 실온에서, 예를 들어 25 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 2 개월 동안 37 ℃에서 안정하다.

본 발명에 따른 액체 조성물은 바람직하게는 0 °내지 30 ℃의 온도에서 보관된다. 바람직한 구현예에서 상기 조성물은 2-8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 보관된다. 다른 구현예에서, 상기 조성물은 실온에서 보관된다. 상기 조성물은 동결되지 않는 것이 바람직하다.

안정성은 시간이 지남에 따라 보툴리눔 신경독의 활성을 비교함으로써 분석할 수 있다. 보툴리눔 신경독의 활성은 보툴리눔 신경독이 세포의 표적 수용체에 결합하는 활성 능력, 경쇄를 세포로 전좌시키는 활성 능력 및/또는 표적 SNARE 단백질을 절단하는 활성 능력을 지칭할 수 있다.

보툴리눔 신경독 활성을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 보툴리눔 신경독 활성은 예를 들어, 상기에 기재한 바와 같이 마우스 치사성 분석(LD50), 근육 조직 기본 분석 예컨대 마우스 횡격 신경 편측 횡격막 분석(예를 들어, Bigalke, H. and Rummel A., Toxins 7.12 (2015):4895-4905에 기재된 바와 같음), 세포 기반 분석(예를 들어 WO201349508또는 WO2012166943에 기재된 바와 같음) 또는 세포 외 단백질 분해 활성 분석 예컨대 BoTest^®(BioSentinel Inc.으로부터 입수 가능한 보툴리눔 신경독 검출 키트)를 사용하여 분석할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 주어진 시간 주기에 따라 및 주어진 온도에서 주어진 백분율 이상의 활성 손실이 없으면 안정한 것으로 간주된다.

일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 만일 세포 외 단백질 분해 활성에서 30 % 이하의 손실(no more than 30% loss)이 3, 6, 12, 18, 24 또는 36 개월에 거쳐 2 내지 8 ℃에서 있다면, 예를 들어 세포 외 단백질 분해 활성에서 30 % 이하의 손실이 6 개월에 거쳐 5 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 만일 세포 외 단백질 분해 활성에서 20 % 이하의 손실이 3 개월에 거쳐 5 ℃에서, 보다 바람직하게는 6, 12, 18, 24 또는 36 개월에 거쳐 5 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, 만일 세포 외 단백질 분해 활성에서 40 % 이하의 손실이 3 개월에 거쳐 실온에서, 예를 들어 25 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 만일 세포 외 단백질 분해 활성에서 30 % 이하의 손실이 3개월에 거쳐 25 ℃, 보다 바람직하게는 6 개월에 거쳐 25 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 만일 세포 외 단백질 분해 활성에서 50 % 이하의 손실이 2 개월에 거쳐 37 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 세포 외 단백질 분해 활성은 BoTest^® 분석으로 측정될 수 있다.

*일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 만일 MLD50 단위로 30 % 이하의 손실이 2, 3, 6, 12, 18, 24 또는 36 개월에 거쳐 2 내지 8 ℃에서 있다면, 예를 들어 MLD50 단위로 30 % 이하의 손실이 6 개월에 거쳐 5 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 만일 MLD50 단위로 20 % 이하의 손실이 2 개월에 거쳐 5 ℃에서, 보다 바람직하게는 3, 6, 12, 18, 24 또는 36 개월에 거쳐 5 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 만일 MLD50 단위로 40 % 이하의 손실이 2 또는 3개월에 거쳐 실온에서, 예를 들어 25 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 만일 MLD50 단위로 30 % 이하의 손실이 3 개월에 거쳐 25 ℃, 보다 바람직하게는 6 개월에 거쳐 25 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. 다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 만일 MLD50 단위로 50 % 이하의 손실이 2 개월에 거쳐 37 ℃에서 있다면 안정한 것으로 간주된다. MLD50 단위는 상기에 명시한 바와 같이 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 액체 조성물은 밀봉된 바이알 또는 주사기, 예를 들어 유리 바이알 또는 주사기, 바람직하게는 타입 1 (또는 "바디 뉴트럴") 유리 바이알 또는 주사기에 저장할 수 있다. 바람직하게는 바이알 또는 주사기 내에 산소가 극소량 존재하거나 또는 전혀 존재하지 않는다. 바이알 또는 주사기는 예를 들어 100 ppm 미만, 바람직하게는 50 ppm 미만의 산소 대기로 채워질 수 있으며, 질소 가스가 바이알 내 보호 대기로 사용될 수 있다. 유리 바이알을 사용하는 경우, 이것을 예를 들어 클로로부틸 또는 브로모부틸 고무 마개로 덮을 수 있는데, 이는 FluroTec^® 코팅 마개일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 액체 조성물은 FluroTec^® 코팅 마개로 덮힌 유리 바이알에 보관된다.

일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 4 내지 10000 LD50 보툴리눔 신경독 단위/mL,

o 0.001 내지 15 % v/v 폴리소르베이트,

o 0.1 내지 5 mg/mL 트립토판,

o 10 내지 500 mM NaCl,

o 1 내지 50 mM KCl,

o 1 내지 100 mM 인산 나트륨,

pH 5.5 내지 8을 갖고, 6 개월 동안 5 ℃에서 안정하다.

일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 10 내지 2000 LD50 보툴리눔 신경독 단위/mL,

o 0.005 내지 2 % v/v 폴리소르베이트,

o 0.1 내지 5 mg/mL 트립토판,

o 25 내지 300 mM NaCl,

o 1 내지 10mM KCl,

o 2 내지 50 mM 인산 나트륨,

pH 6.0 내지 7.5를 갖고, 12 개월 동안 5 ℃에서 안정하다.

일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 10 내지 2000 LD50 보툴리눔 신경독 단위/mL,

o 0.05 내지 0.2 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 0.1 내지 5 mg/mL 트립토판,

o 25 내지 300 mM NaCl,

o 1 내지 10 mM KCl,

o 2 내지 50 mM 인산 나트륨,

pH 6.0 내지 7.5를 갖고, 12 개월 동안 5 ℃에서 안정하다.

일 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.2 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 1 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.6이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.04 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 1 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.9이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 B,

o 0.25 % v/v 폴리소르베이트 20,

o 4 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 7.4이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.01 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 0.25 mg/mL 트립토판

o 255 mM NaCl,

o 2 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 7.2이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.01 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 0.25 mg/mL 트립토판

o 255 mM NaCl,

o 10 mM KCl,

o 50 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.3이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 1 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 0.25 mg/mL 트립토판

o 255 mM NaCl,

o 50 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.3이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 1 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 3 mg/mL 트립토판

o 255 mM NaCl,

o 10 mM KCl,

o 50 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 7.2이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.1 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 1.625 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.75이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.01 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 1 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.75이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 0.1 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 1 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.75이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 A,

o 1 % v/v 폴리소르베이트 80,

o 1 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 6.75이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 B,

o 15 % v/v 폴리소르베이트 20,

o 1 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 7.4이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 B,

o 15 % v/v 폴리소르베이트 20,

o 4 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 7.4이다.

다른 구현예에 따라, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어져 있으며:

o 보툴리눔 신경독 B,

o 0.25 % v/v 폴리소르베이트 20,

o 4 mg/mL 트립토판

o 140 mM NaCl,

o 3 mM KCl,

o 10 mM 인산 나트륨,

여기에서 상기 조성물의 pH는 대략 7.4이다.

다른 양태는 치료 요법에서 본 발명에 따른 액체 조성물의 용도이다.

본 발명에 따른 액체 조성물은 근육 장애, 신경근 장애, 신경 장애, 안과 장애, 통증 장애, 심인성 장애, 관절 장애, 염증성 장애, 내분비 장애 또는 비뇨기과 장애를 치료 또는 예방하기 위한 요법에 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 액체 조성물은 하기로부터 선택된 질환, 병태 또는 증후군을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다:

· 안검경련, 사시(제한적 사시 또는 근육성 사시 포함), 약시, 진동시, 보호적 안검하수, 각막 보호를 위한 치료적 안검 하수, 안진증, 에스트로피아(estropia), 복시, 안검 내번, 눈꺼풀 수축, 안와 근질환, 잠복 사시, 수반성 부정 정렬, 비수반성 부정 정렬, 일차 또는 이차 내사시 또는 외사시, 핵간 안근마비, 스큐 편위, 두엔(Duane) 증후군 및 위 눈꺼풀 수축으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안과 장애;

· 반축안면경련, 사경, 어린이 또는 성인의 강직(예: 뇌성 마비, 뇌졸중 후, 다발성 경화증, 외상성 뇌 손상 또는 척수 손상 환자에서), 특발성 국소성 근긴장 이상증, 근육 긴장, 작가의 경련, 손 근육 긴장이상, VI 신경 마비, 경구 하악 근긴장 이상증, 두부 진전, 지발성 운동장애, 지발성 근긴장 이상증, 직업성 경련(연주자의 경련 포함), 얼굴 신경 마비, 턱 폐쇄 발작, 안면 발작, 협진증, 진전, 일차적인 글쓰기 진전, 간대성 근경련, 강직-인간-증후군, 발 근긴장 이상증, 안면 마비, 아픈-팔-및-움직이는-손가락-증후군, 틱 장애, 근긴장 이상성 틱, 투렛(Tourette) 증후군, 신경근 이상증, 떨리는 턱, 측면 직근 마비, 근긴장 이상 발 역전, 턱 근긴장 이상증, 래빗 증후군, 소뇌성 진전, III 신경 마비, 구개 간대성 근경련, 정좌 불능증, 근육 경련, IV 신경 마비, 보행동결, 신근 줄기 근긴장 이상증, 후-안면 신경 마비 협진증, 2차 근긴장 이상증, 파킨슨 병, 헌팅턴 무도병, 간질, 오프 주기 근긴장 이상증, 두부 파상풍, 섬유성 근간대경련 및 양성 경련-섬유성 축닉 증후군을 포함하는 운동 장애;

· 경련성 발성장애, 귀 장애, 청각 손상, 귀 클릭, 이명증, 현기증, 메니에르병, 달팽이관 신경 기능장애, 말더듬, 반지인두근 장애, 알치증, 만성 호흡시 후두 폐쇄, 성대 육아종, 심실근 긴장 이상증, 심실근 발성장애, 돌연변이성 발성장애, 개구장애, 코골이, 목소리 떨림, 호흡, 혀 돌출 근긴장 이상증, 구개음 떨림, 깊은 입술 물기 및 후두의 근긴장 이상증; 첫 저작 증후군을 포함하는 이비인후과적 장애;

· 이완 불능증, 항문 열상, 변비, 턱관절 조인트 기능장애, 오디 기능장애 괄약근, 오디 고혈압 지속성 괄약근, 소장 근육 장애, 치골직장근 증후군, 아니스무스(anismus), 날문연축, 담낭 기능 장애, 위장 또는 식도 운동성 기능 장애, 확산형 식도 경련 및 위 마비를 포함하는 위장 장애;

· 배뇨근 괄약근 협동장애, 배뇨근 반사항진, 신경성 방광 기능 장애(예: 파킨슨병, 척수 손상, 뇌졸중 또는 다발성 경화증 환자에서), 과민성 방광, 신경성 배뇨근 과활동성, 방광 경련, 요실금, 요정체, 비대 방광 목, 배뇨 장애, 간질성 방광염, 질경, 자궁 내막증, 골반 통증, 전립선 비대증(양성 전립선 과형성), 전립샘통증, 전립선 암 및 지속 발기증을 포함하는 비뇨생식기 장애;

· 피부 세포 증식성 장애, 피부 상처, 건선, 주사비, 여드름; 폭스-포어다이스(Fox-Fordyce) 증후군 또는 헤일리-헤일리(Hailey-Hailey)병과 같은 드문 유전성 피부 장애; 켈로이드 및 비후 흉터 감소; 모공 크기 감소; 피부의 염증성 병태; 고통스런 피부의 염증성 병태를 포함하는 피부과적 장애;

· 요통(상부 등 통증, 하부 요통), 근막 통증, 긴장성 두통, 섬유근육통, 통증 증후군, 근육통, 편두통, 편타증, 관절 통증, 수술 후 통증, 근육 경련과 관련되지 않은 통증 및 평활근 장애과 관련된 통증을 포함하는 통증 장애;

· 췌장염, 신경성 염증성 장애(통풍, 힘줄염, 활액낭염, 피부근염 및 강직성 척추염을 포함)를 포함하는 염증성장애;

· 과도한 샘 분비, 다한증(겨드랑이 다한증, 손바닥 다한증 및 프레이(Frey) 증후군을 포함), 타액분비항진, 타액과다증, 땀악취증, 점액 과다분비, 과도한 눈물흘림, 온분비샘 기능 장애; 과도한 피지 분비 같은 분비성 장애;

· 비염(알레르기성 비염 포함), COPD, 천식 및 결핵을 포함하는 호흡기 장애;

· 근육 확대, 저작근 비대, 근육통을 수반하는 말단 비대증 및 신경성 전경골 비대를 포함하는 비대성 장애;

· 테니스 엘보(또는 팔꿈치의 상과염), 관절의 염증, 고관절증, 골관절염, 어깨의 회전근 슬개골 병리학, 류마티스성 관절염 및 손목골 증후군을 포함하는 관절 장애;

· 유형 2 당뇨병, 고글루카곤증, 고인슐린증, 저인슐린증, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 갑상선 장애(그레이브즈 병, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 갑상선 기능 항진증 및 갑상선 기능 저하증을 포함), 부갑상선 장애(부갑상선 기능 항진증 및 부갑상선 기능 저하증을 포함), 거싱 증후군(Gushing' s syndrome) 및 비만과 유사한 내분비 장애;

· 전신성 홍반 루푸스와 같은 자가 면역 질환;

· 부신경절 종양, 전립선 암 및 골 종양을 포함하는 증식성 질환;

· 스포츠 부상, 근육 부상, 힘줄 상처 및 뼈 골절을 포함한 외상성 부상; 및

· 수의학 용도(예: 포유 동물의 고정, 말의 산통, 동물의 이완불능 또는 동물의 근육 경련).

본 발명에 따른 액체 조성물은 심미적 의료(외관 개선을 위한), 특히 피부 주름, 특히 얼굴의 안면 주름, 눈 윤곽의 주름, 미간 곡선 라인, 아래로 향한 입 같은 얼굴 주름, 목의 주름(활경근 띠), 턱의 주름(턱끝근, 오렌지 껍질 피부, 움푹 들어간 턱), 이마 주름, "긁힌 피부" 주름, 코 높이기 치료 또는 수면 라인을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 외관 개선을 위해 치료 또는 예방될 대상체는 바람직하게는 상기에 기재된 장애, 병태 또는 증후군 중 어느 것도 앓고 있지 않을 것이다. 보다 바람직하게는 상기 대상체는 건강한 대상체(즉 어떤 질병, 병태 또는 증후군도 앓고 있지 않음)이다.

본 발명에 따른 액체 조성물을 다른 치료 화합물과 결합하여 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 액체 조성물은 통증을 치료하기 위한 진통제 화합물, 특히 참조로 그 내용이 본 명세서에 편입된 WO 2007/144493에 기재된 바와 같은 모르핀과 같은 오피오이드 유도체와 결합하여 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 액체 조성물은 예를 들어 참조로 그 내용이 본 명세서에 편입된 WO 2015/0444416에 기재된 바와 같이 전립선 암을 치료하기 위해 히알루론산과 결합하여 투여된다.

본 발명의 다른 측면은 트립토판 및 타이로신으로부터 선택된, 동물 유래 단백질이 없는 액체 조성물에서 단백질성 신경독을 분해로부터 보호하는, 아미노산의 용도이다.

바람직한 구현예에 따라, 상기 아미노산은 트립토판이고, 보다 바람직하게는 L-트립토판이다.

바람직하게는, 단백질성 신경독은 보툴리눔 신경독이다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 보툴리눔 신경독은 복합체 형태의 보툴리눔 신경독이다. 다른 구현예에 따라, 상기 보툴리눔 신경독은 고순도 보툴리눔 신경독이다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 보툴리눔 신경독은 천연의 클로스트리디움 균주로부터 정제된 보툴리눔 신경독이다. 다른 구현예에 따라, 보툴리눔 신경독은 대장균(E. coli)과 같은 이종 숙주에서 재조합으로 생산된 보툴리눔 신경독이다. 본 발명에 따라, 상기 보툴리눔 신경독은 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G의 BoNT일 수 있다. 본 발명에 따라, 보툴리눔 신경독은 상기에 기재된 바와 같이 변형된 보툴리눔 신경독일 수 있다. 본 발명에 따라, 재조합 보툴리눔 신경독은 상기에 기재된 바와 같이 키메라 보툴리눔 신경독일 수 있다.

바람직한 구현예에 따라, 상기 아미노산은 계면 활성제 및 나트륨, 염화물 및 인산염 이온을 포함하는 완충액과 결합하여 사용되며 상기 액체 조성물의 pH는 5.5 내지 8이다. 바람직하게는, 상기 계면 활성제는 비-이온성 계면 활성제, 보다 바람직하게는 폴리소르베이트, 예를 들어 PS20, PS60 또는 PS80이다. 가장 바람직하게는, 상기 비-이온성 계면 활성제는 PS80이다. 바람직하게는, 상기 완충액은 또한 칼륨 이온을 포함한다. 상기 완충액은 예를 들어 염화 나트륨, 염화 칼륨 및 인산 나트륨 염을 결합하여 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에 따라, 상기 pH는 6.0 내지 7.5, 예를 들어 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75, 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45 또는 7.5이다. 바람직하게는, 상기 pH는 생리적 pH로부터 1 단위 이내(약 7.4)이다.

본 발명에 따른 용도의 바람직한 구현예에 따라, 상기 액체 조성물은 2 개월 동안 안정하다. 예를 들어, 상기 조성물은 2 개월 동안 2 내지 8 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 3 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 바람직한 구현예에 따라, 상기 조성물은 6 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 12 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 18 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 24 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 36 개월 동안 2 내지 8 ℃, 예를 들어 5 ℃에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 3 개월 동안 실온에서, 예를 들어 25 ℃ 에서 안정하다. 일 구현예에 따라, 상기 조성물은 6 개월 동안 실온에서, 예를 들어 25 ℃ 에서 안정하다.

실시예

1. 안정한 액체 보툴리눔 독소 A 제형의 제조

고순도의 BoNT/A 15 ng/mL, 15 % v/v 폴리소르베이트 20, 타이로신(Tyr), 트립토판(Trp) 및 시스테인(Cys)으로부터, 또는 메티오닌(Met), 타이로신(Tyr), 트립토판(Trp) 및 시스테인(Cys)(Sigma Aldrich)의 혼합물로부터 선택된 아미노산 및 인산염 완충액 염수(Calbiochem의 PBS)(pH7.4, 25 ℃에서 140 mM NaCl, 10 mM 인산 나트륨 및 3 mM KCl)를 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 제조하여 0.22 μm PVDF(폴리비닐리덴플로리드) 필터를 사용하여 여과하고 40 ℃에서 6일 동안 실리콘으로 처리한 2 mL 유리 주사기에 보관한 후, 각 제제에 대해 역가 시험을 수행하였다.

역가 시험(potency test)에 대해, 상기 제제를 함유하는 주사기를 둘 모두 낮은 단백질 흡착 성질을 갖는 PTFE 처리된 고무 격막을 함유하는 뚜껑(Chromacol)이 있는 2 mL 유리 바이알(Chromacol, Gold) 또는 1.7 mL 플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브(Axygen, Maximum Recovery) 안에 비웠다. 상기 제제를 이어서 3 % 인간 혈청 알부민(HSA)이 있는 0.9 % NaCl 용액을 사용하여 희석했다. 각 제제에 대하여, 샘플 50 μL를 희석이 수행된 바로 당일에 마우스의 비장근에 주사했다. 상기 마우스를 3 일 동안 모니터링하고 마비 정도를 기록했다.

상기 결과는 표 1에 나와 있다.

타이로신 및 트립토판은 BoNT/A 분해에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 트립토판은 가장 강력한 보호 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 4개의 아미노산 모두를 함유하는 혼합물 뿐만 아니라 시스테인은 보호 효과를 갖지 않았다.

2. 안정한 액체 보툴리눔 독소 B 제형의 제조

350 ng/mL의 고순도 BoNT/B, 15 % v/v 폴리소르베이트 20, 타이로신(Tyr), 트립토판(Trp) 및 시스테인(Cys)으로부터, 또는 메티오닌(Met), 타이로신(Tyr), 트립토판(Trp) 및 시스테인(Cys)의 혼합물로부터 선택된 아미노산, 및 pH 7.4의 인산염 완충액 염수(PBS)를 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 제조하여 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고 40 ℃에서 2 주 동안 실리콘으로 처리한 2 mL 유리 주사기에 보관한 뒤 상기에 기재된 바와 같이 각 제제에 대해 역가 시험을 수행하였다.

상기 결과는 표 2에 나와 있다.

타이로신 및 트립토판은 BoNT/B 분해에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 4개의 아미노산 모두를 함유하는 혼합물 뿐만 아니라 시스테인도 보호 효과를 가지나 더 약한 정도였다.

3. 트립토판 및 폴리소르베이트 20의 상이한 농도 평가

고순도의 BoNT/A 또는 BoNT/B 및 다양한 농도의 폴리소르베이트 20(PS 20) 및 트립토판 및 pH 7.4의 인산염 완충액 염수(PBS)를 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 제조하여 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고 실리콘으로 처리한 2 mL 유리 주사기에 보관했다. 상기에 기재된 바와 같이 각 제제에 대해 뒷 다리 마비 역가 시험을 수행하였다.

상기 결과는 표 3에 나와 있다.

4. BoNT/B 제제에서 상이한 염 농도의 평가

100 ng/mL의 고순도 BoNT/B, 폴리소르베이트 20, 다양한 아미노산 공급자로부터 트립토판 및 pH 7.4의 PBS(Calbiochem)로부터 선택된 완충액, pH 7의 12 nM 인산염 완충액(Apoteket) 및 pH 5.5의 20 mM 아세트산 나트륨(NaAc)(Fluka의 NaAc 및 Merck의 아세트산)을 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 제조하여 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고 실리콘으로 처리한 2 mL 유리 주사기에 보관했다. 상기에서 기재된 바와 같이 각 제제에 대해 뒷 다리 마비 역가 시험을 수행했다.

상기 결과는 표 4에 나와 있다.

상기 결과는 PBS 완충액(나트륨, 염화물, 인산염 및 칼륨 이온을 함유하는)을 함유하는 제제는 보툴리눔 독소의 안정성에 어떤 역할을 하는 것으로 보임을 나타낸다.

5.상이한 안정제의 평가

15 ng/mL의 고순도 BoNT/A, 폴리소르베이트 20(PS20) 또는 폴리소르베이트 80(PS80) 또는 HSA, 트립토판 및 PBS를 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 제조하고, 0.22 μm 필터를 이용하여 여과해서 실리콘으로 처리한 2 mL 유리 주사기에 보관했다. 상기에 기재된 바와 같이 각 제제에 대해 뒷 다리 마비 역가 시험을 수행하였다.

결과는 표 5에 나와있다.

6. 상이한 제형의 평가

10 ng/mL의 고순도 BoNT/A, 0.25 % PS80, 1 mg/mL 트립토판 및 PBS를 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 상기에 기재된 바와 같이 제조하였다. pH는 HCl을 첨가하여 6.6 및 7.0으로 조정하였다. 각 제제를 40 ℃에서 5 주 보관했다.

각 제제는 10 배 희석해서 상기에 기재된 바와 같이(주사 당 0.05 ng) 뒷 다리 마비 역가 시험을 수행했다. 두 케이스 모두에서, 뒷 다리 마비가 3 일에 관찰되었다. 상기 마비는 pH 6.6 제제에서 더 강했다.

7. 상이한 제형의 평가

0.3 ng/mL의 고순도 BoNT/A, PS20 및 PS80으로부터 선택된 폴리소르베이트, 1 mg/mL 트립토판 및 pH 7.4의 12 mM PBS를 함유하는 액체 보툴리눔 독소 제제를 상기에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 제제의 pH는 1.2 M HCl을 첨가하여 pH 6.6 또는 6.9로 조정하였다.

폴리소르베이트 20을 그것의 CMC(임계 미셀 농도, 21 ℃에서 약 0.01 % w/v)의 약 20 배에 상응하는 0.2 % w/v, 하나의 농도에서 시험하였다. 폴리소르베이트 80은 그것의 CMC (21 ℃에서 약 0.002 % w/v)의 약 20 배 및 100 배에 각각 상응하는 0.04 % 및 0.2 % w/v를 시험하였다.

각 제제에 대해, 0.5 mL의 부피를 1 mL 길이의 유리 주사기(BD)에 채우고 플루오로카본 코팅 플런저로 밀봉했다.

역가를 상기에 기재된 바와 같이 마우스에서 뒷 다리 마비 시험으로 측정하였다.

5 ℃ 및 25 ℃에서 6 개월 저장 후 어떠한 제형에서도 역가의 감소는 관찰되지 않았다.

8. 상이한 제형의 평가

고순도 보툴리눔 신경독 유형 A를 함유한 19 개의 상이한 제형을 다양한 농도의 폴리소르베이트 80, 트립토판, 인산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨 및 다양한 pH로 제조하였다. 각 제형은 500 U/mL의 명목상의 표적 역가를 가졌다. 각 제형의 가스를 제거하고 0.2 μm 필터로 여과하고 바이알에 채웠다. 질소 가스가 바이알 내에 보호 대기로 사용되었다. 혐기성 챔버에서 상기 채움을 수행하였다. 각 제형을, 알루미늄 플립 오프 봉인으로 밀봉되어 FluroTec^® 마개로 덮인 2 mL 유리 바이알에 질소 대기에서 1 mL 분취량으로 채우고 수직으로 보관하였다.

상기 19개의 제형의 안정성을 BoTest^®를 사용하여 5 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 분석하여 역가를 측정하였다.

모든 제형에서 상기 용액은 투명하고 대부분의 부분은 무색으로 유지되었다.

이 연구에서 시험한 첨가제 농도는 시험한 시간 간격 동안 제형의 pH에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 역가 결과는 표 9에 제시된다.

여러 가지 조성물에서 6 개월에 거쳐 5 ℃에서 역가에서 30 % 이하의 손실(no more than 30% loss in potency)이 있었고/거나 역가에서 약 40 % 이하의 손실이 3 개월에 거쳐 25 ℃에서 있었고/거나 역가에서 약 50 % 이하의 손실이 2 개월에 거쳐 37 ℃에서 있었다.

9. PS 60의 평가

0.1 %(v/v) PS60, 1 mg/mL L-트립토판, 10 mM 인산 나트륨, 140 mM 염화 나트륨, 3 mM 염화 칼륨 및 주사용 물과 함께 고순도 보툴리눔 신경독 유형 A를 함유하는 제형을 제조하였다. pH를 HCl로 6.75로 조정하였다. 상기 제형은 100 U/mL의 명목상의 표적 역가를 가지고 있었다. 상기 제형의 가스를 제거하고 0.2 μm 필터로 여과하고 질소 대기의 혐기성 챔버에서 무균적으로 2 mL 바이알에 1 mL 부피로 채웠다. 질소 가스를 바이알 내의 보호 대기로 사용하였다. 상기 바이알을 알루미늄 플립 오프 봉인으로 밀봉된 FluroTec^® 마개로 덮었다.

37 ℃ 및 25 ℃에서 시간이 지남에 따른 역가를 본 명세서에 기재된 바와 같이 MLD50 테스트로 측정하였다.

37 ℃에서, 9 주 후의 남아 있는 역가는 초기 역가의 약 50-55 %이었다.

25 ℃에서, 3 개월 후의 남아 있는 역가는 초기 역가의 약 80 %이었다.

SEQUENCE LISTING <110> IPSEN BIOPHARM Ltd NESTLE SKIN HEALTH SA <120> Neurotoxin formulation <130> IBGA 001-WO(2) <150> PCT/EP2016/062085 <151> 2016-05-27 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 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Thr Glu 1295

Claims (8)

1. 보툴리눔 신경독, 트립토판 및 타이로신으로부터 선택된 아미노산, 나트륨, 염화물 및 인산염 이온을 포함하는 완충액을 포함하는 액체 조성물로서,
   상기 액체 조성물은 pH 5.5 내지 8을 갖고,
   상기 조성물은 동물 유래 단백질이 없고, 및
   상기 액체 조성물은 2 내지 8℃에서 2개월 동안 안정한, 액체 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산은 트립토판인, 액체 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 트립토판은 L-트립토판인, 액체 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 완충액은 칼륨 이온을 추가로 포함하는, 액체 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 pH 6.0 내지 7.5를 갖는, 액체 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 세포외 단백질 분해 활성에서 30 % 이하의 손실(no more than 30% loss)이 5 ℃에서 2, 3, 6, 12, 18, 24 또는 36 개월에 거쳐 발생하는, 액체 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 보툴리눔 신경독은 복합체 형태의 천연 보툴리눔 신경독, 고순도 천연 보툴리눔 신경독 및 재조합 보툴리눔 신경독으로부터 선택된 보툴리눔 신경독인, 액체 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 보툴리눔 신경독은 보툴리눔 신경독 A, B, C, D, E, F 또는 G, 변형된 보툴리눔 신경독 및 키메라 보툴리눔 신경독으로부터 선택된 재조합 보툴리눔 신경독인, 액체 조성물.