TW201742632A

TW201742632A - 神經毒素調配物

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Publication number: TW201742632A
Application number: TW106117499A
Authority: TW
Inventors: 安德斯賈斯達; 安娜佛里斯; 烏夫史塔爾; 安古瑞爾; 巴伯洛安古倫; 艾蜜莉亞艾德斯壯; 安德魯皮凱特
Original assignee: 雀巢肌膚健康公司
Priority date: 2016-05-27
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2017-12-16
Also published as: TWI777955B; GEP20207139B; EP4026532A1; CN111701010B; RU2018142149A; ZA201807904B; EP3679946B1; PL3679946T3; ES2911124T3; CA3025437A1; CY1124916T1; EA038124B1; SI3463432T1; US20210330765A1; SG11201810561YA; JP2019517481A; LT3679946T; HRP20202070T1; HUE052023T2; AU2017270359A1

Abstract

本發明係關於不含動物蛋白質之穩定液體神經毒素調配物，其包含界面活性劑、選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸、包含鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液，該等調配物具有在5.5與8之間的pH，且其穩定2個月。此等組合物適用於治療且尤其適用於投與患者以達成所要治療或美容效果。本發明亦關於選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸之用途，其用於保護蛋白質神經毒素在不含動物來源之蛋白質的液體組合物中免遭降解。

Description

神經毒素調配物

本發明係關於無動物蛋白質之液體神經毒素調配物。特定而言，本發明係關於藉由非蛋白質賦形劑穩定之無動物蛋白質之液體肉毒桿菌神經毒素調配物。本文所述之神經毒素調配物適用於治療且尤其適用於投與患者以達成所要治療或美容效果。

由梭菌菌株天然產生之梭菌神經毒素為到目前為止已知之最毒的生物試劑且同時為用於治療多種神經肌肉及內分泌病症(包括頸肌張力障礙、痙攣、眼瞼痙攣、多汗症或流涎)之強有力工具。其亦在美容領域中發現用於平滑皺紋之用途。為了適合於用作醫藥產品，神經毒素組合物必須為可經儲存的，且無神經毒素活性之顯著耗損。在肉毒桿菌神經毒素之所有當前經批准調配物中，動物(包括人類)蛋白質，通常人類血清白蛋白(HSA)，係用作穩定劑。然而，因為無意地將動物源性感染性試劑(諸如朊病毒)傳輸給患者之風險(即使較低)，故諸如HSA之動物蛋白質在醫藥組合物中之存在為非所要的。無動物蛋白質之肉毒桿菌毒素調配物已揭示於此項技術中。舉例而言，WO0158472描述冷凍組合物，其中諸如2-羥基乙基澱粉之多醣用於使肉毒桿菌毒素穩定。WO2005007185描述組合物，其中表面活性物質以及選自麩胺酸及麩胺醯胺或天冬胺酸及天冬醯胺之至少兩種胺基酸之混合物係用於使肉毒桿菌毒素穩定。然而，大多數先前技術調配物在液態形式中不穩定且因此以冷凍或凍乾形式儲存。此類調配物在向患者投與之前需要由醫師在無菌鹽水溶液中復水。此復水步驟與醫師時間之耗損、稀釋誤差之風險以及復水程序期間之污染風險相關聯。肉毒桿菌毒素提供者亦必須訓練醫師以便確保復水步驟得以充分執行。因此，液體調配物係有利的，因為其除去醫師時間之耗損、稀釋誤差之風險、污染風險及對於提供者而言提供培訓之需求。液體無HSA調配物例如描述於WO2006005910中，其揭示包含界面活性劑、氯化鈉及雙醣之液體肉毒桿菌毒素調配物。WO2009008595揭示包含聚山梨醇酯20及甲硫胺酸之液體肉毒桿菌毒素調配物。本發明之目標為提供有利的液體無動物蛋白質肉毒桿菌神經毒素調配物，其適合於儲存及用於治療。特定而言，穩定調配物應維持產品穩定性，不含動物蛋白質且亦適合於穩定不含複合蛋白質之神經毒素。

本發明之第一態樣為液體組合物，其包含以下各者或主要由以下各者組成：蛋白質神經毒素、界面活性劑、選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸、包含鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液，該液體組合物具有在5.5與8之間的pH，其隨時間推移穩定且其不含動物來源之蛋白質。另一態樣為根據本發明之液體組合物在治療中及/或化妝品中之用途。本發明之另一態樣為選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸的用途，其用於保護蛋白質神經毒素在不含動物來源之蛋白質的液體組合物中免遭降解。

本發明之第一態樣為液體組合物，其包含以下各者或主要由以下各者組成：蛋白質神經毒素、界面活性劑、選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸、包含鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液，該液體組合物具有在5.5與8之間的pH，其隨時間推移穩定且其不含動物來源之蛋白質。「無動物蛋白質」應理解為不包含動物(包括人類)來源之蛋白質。神經毒素為靶向神經細胞且影響神經功能之物質。蛋白質神經毒素包括肉毒桿菌毒素(BoNT)及破傷風毒素(TeNT)。較佳地，蛋白質神經毒素為肉毒桿菌神經毒素。肉毒桿菌神經毒素為150 kDa金屬蛋白酶，其以由雙硫橋鍵鍵聯之50 kDa輕鏈(L)及100 kDa重鏈(H)之其活性形式組成。L鏈為鋅蛋白酶，其胞內分解參與囊泡介導之神經傳遞素釋放之SNARE (可溶NSF附接蛋白質受體)蛋白質中之一者，由此破壞神經傳遞素介導之機制。重鏈涵蓋兩個結構域：N端50 kDa移位結構域(H_N )及C端50 kDa受體結合結構域(H_C )。肉毒桿菌神經毒素之H_C 結構域包含被稱為H_CC 結構域及H_CN 結構域的兩個不同結構特徵。參與受體結合之胺基酸殘基被認為主要定位於H_CC 結構域中。已將肉毒桿菌神經毒素分類為7種抗原性不同的血清型(A至G)。各血清型之例示性胺基酸序列在本文中經提供為SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 7。對於序列中之每一者，不同結構域可(例如)如下。熟習此項技術者將瞭解，在肉毒桿菌神經毒素結構域中之每一者中可存在一些變化。舉例而言，藉由預防乙醯膽鹼之釋放且因此預防肌肉收縮，BoNT作用於神經肌肉神經接合點上。神經末端毒物係可逆的且其持續時間針對不同BoNT血清型而變化。天然BoNT係藉由保護神經毒素免遭蛋白分解降解之肉毒梭菌及作為多蛋白質複合物之部分的其他梭菌物種(諸如丁酸梭菌(C. butyricum )、巴氏梭菌(C. baratii )及阿根廷梭菌(C. argentinense ))產生。「呈複合形式之肉毒桿菌神經毒素」意謂肉毒桿菌神經毒素及本質上為此類多蛋白質複合物之部分的蛋白質中之一或多者(神經毒素相關之蛋白質或「NAP」)。NAP包括無毒性非紅血球凝集素(NTNH)蛋白質及紅血球凝集素蛋白質(HA-17、HA-33及HA-70)。「高純度肉毒桿菌神經毒素」意謂基本上不含NAP之肉毒桿菌神經毒素。根據本發明之一實施例，肉毒桿菌神經毒素為呈複合形式之肉毒桿菌神經毒素。根據另一實施例，肉毒桿菌神經毒素為高純度肉毒桿菌神經毒素。用於經由培養天然梭菌菌株產生BoNT且純化呈複合形式或高純度形式之BoNT的方法在此項技術中已為所熟知的且描述於例如Pickett、Andy. 「Botulinum toxin as a clinical product: manufacture and pharmacology」，Clinical Applications of Botulinum Neurotoxin，Springer New York, 2014. 7-49中。高純度或基本上純的肉毒桿菌神經毒素可例如根據Microbiology and Immunology (1995), 195, 第151至154頁中之當前論題(Current topics)中所描述之方法自包含肉毒桿菌毒素之蛋白質複合物獲得。替代地，高純度肉毒桿菌神經毒素可藉由在異質宿主(諸如大腸桿菌(E.coli ))中重組BoNT基因之表現且自其中純化來產生。較佳地，蛋白質神經毒素為肉毒桿菌神經毒素。根據本發明之一實施例，肉毒桿菌神經毒素為呈複合形式之肉毒桿菌神經毒素。根據另一實施例，肉毒桿菌神經毒素為高純度肉毒桿菌神經毒素。根據本發明之一實施例，肉毒桿菌神經毒素為自其天然梭菌菌株純化之肉毒桿菌神經毒素。根據另一實施例，肉毒桿菌神經毒素為在異質宿主(諸如大腸桿菌)中以重組方式產生之肉毒桿菌神經毒素。根據本發明，肉毒桿菌神經毒素可為血清型A、血清型B、血清型C、血清型D、血清型E、血清型F或血清型G之BoNT。根據本發明，肉毒桿菌神經毒素可為經修飾之肉毒桿菌神經毒素。根據本發明，「經修飾之BoNT」為具有胺基酸序列之BoNT，該胺基酸序列與SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7具有至少50%之序列一致性。較佳地，經修飾之BoNT具有胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性。較佳地，經修飾之BoNT為其胺基酸序列與SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7相差少於600、400、200、150、100、50或20個胺基酸取代、缺失或添加，例如相差10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、缺失或添加的BoNT。根據本發明，重組肉毒桿菌神經毒素可為嵌合肉毒桿菌神經毒素。根據本發明，「嵌合BoNT」係由並不全部屬於同一血清型的L結構域、H_N 結構域、H_CN 結構域及H_CC 結構域組成。舉例而言，嵌合BoNT可能由來自一個血清型之L鏈及來自不同血清型之完整H鏈(H_N 、H_CN 及H_CC 結構域)組成。嵌合BoNT亦可由來自一個血清型之L鏈及H_N 結構域(「LH_N 」)及來自不同血清型之H_C 結構域(H_CN 及H_CC )組成。嵌合BoNT亦可由來自一個血清型之L鏈及H_N 結構域及H_CN 結構域(「經擴展LH_N 」及來自不同血清型之H_CC 結構域組成。根據本發明，輕鏈結構域(L)可具有與下列胺基酸序列中之一者具有至少50%，較佳至少60%、70%、80%、90%或95%之序列一致性且保留分解參與囊泡介導之神經傳遞素釋放之SNARE蛋白質中之一者之能力的胺基酸序列： · SEQ ID NO:1之胺基酸1-448 · SEQ ID NO:2之胺基酸1-440 · SEQ ID NO:3之胺基酸1-441 · SEQ ID NO:4之胺基酸1-445 · SEQ ID NO:5之胺基酸1-422 · SEQ ID NO:6之胺基酸1-439 · SEQ ID NO:7之胺基酸1-441 根據本發明，H_N 結構域可具有與下列胺基酸序列中之一者具有至少50%，較佳至少60%、70%、80%、90%或95%之序列一致性且保留移位能力之胺基酸序列： · SEQ ID NO:1之胺基酸449-871 · SEQ ID NO:2之胺基酸441-858 · SEQ ID NO:3之胺基酸442-866 · SEQ ID NO:4之胺基酸446-862 · SEQ ID NO:5之胺基酸423-845 · SEQ ID NO:6之胺基酸440-864 · SEQ ID NO:7之胺基酸442-863 根據本發明，H_C 結構域可具有與下列胺基酸序列中之一者具有至少50%，較佳至少60%、70%、80%、90%或95%之序列一致性及保留結合至神經肌肉細胞之能力的胺基酸序列： · SEQ ID NO:1之胺基酸872-1296 · SEQ ID NO:2之胺基酸859-1291 · SEQ ID NO:3之胺基酸867-1291 · SEQ ID NO:4之胺基酸863-1276 · SEQ ID NO:5之胺基酸846-1252 · SEQ ID NO:6之胺基酸865-1274 · SEQ ID NO:7之胺基酸864-1297 根據本發明，H_CC 結構域可具有與下列胺基酸序列中之一者至少50%，較佳至少60%、70%、80%、90%或95%之序列一致性且保留結合至神經肌肉細胞之能力的胺基酸序列： · SEQ ID NO:1之胺基酸1111-1296 · SEQ ID NO:2之胺基酸1098-1291 · SEQ ID NO:3之胺基酸1112-1291 · SEQ ID NO:4之胺基酸1099-1276 · SEQ ID NO:5之胺基酸1086-1252 · SEQ ID NO:6之胺基酸1106-1274 · SEQ ID NO:7之胺基酸1106-1297 以上識別之參考序列應被視為導引，此係因為輕微變化可根據亞血清型出現。兩個或多於兩個核酸或胺基酸序列之間的「序列一致性百分比」為在由經比對序列共有之相同位置處之相同核苷酸/胺基酸之數目之函式。因此，一致性%可經計算為比對中之各位置處之相同核苷酸/胺基酸之數目除以經比對序列中之核苷酸/胺基酸之總數乘以100。序列一致性%之計算亦可考慮間隙之數目及需要引入以最佳化兩個或多於兩個序列之比對之各間隙之長度。可使用特定數學演算法(諸如BLAST)來進行兩個或多於兩個序列之間的序列比較及一致性百分比之判定，其將為熟習此項技術者所熟悉。界面活性劑(或表面活性劑)為能夠降低液體與固體之間或兩種液體之間的表面張力的化合物。界面活性劑可為非離子、陰離子、陽離子或兩性的。在根據本發明之組合物中，界面活性劑較佳為非離子界面活性劑。非離子界面活性劑包括：聚氧化乙烯二醇烷基醚，諸如八伸乙基二醇單十二烷基醚或五伸乙基二醇單十二烷基醚；聚氧丙烯二醇烷基醚；葡糖苷烷基醚，諸如癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷或辛基葡糖苷；聚氧化乙烯二醇辛基苯酚醚，諸如特立通(Triton) X-100；聚氧化乙烯二醇烷基苯酚醚，諸如壬苯醇醚-9；甘油烷基酯，諸如月桂酸甘油酯；聚氧化乙烯二醇脫水山梨糖醇烷基酯，諸如聚山梨醇酯；脫水山梨糖醇烷基酯，諸如斯潘(Span)；椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA；氧化十二烷基二甲胺；聚乙二醇及聚丙二醇之嵌段共聚物，諸如泊洛沙姆(Poloxamer)；聚乙氧基化動物脂胺(POEA)。根據一較佳實施例，根據本發明之液體組合物包含非離子界面活性劑，該非離子界面活性劑為聚山梨醇酯，較佳聚山梨醇酯20 (PS20)、聚山梨醇酯60 (PS60)或聚山梨醇酯80 (PS80)。最佳，非離子界面活性劑為PS80。當界面活性劑為聚山梨醇酯時，其濃度較佳為0.001% v/v至15% v/v，更佳0.005% v/v至2% v/v，再更佳0.01% v/v至1% v/v，例如0.01% v/v、0.05% v/v、0.1% v/v、0.2% v/v、0.5% v/v或1% v/v。根據一個實施例，界面活性劑為PS80，其濃度為0.05% v/v至0.2% v/v，例如約0.05% v/v、0.06% v/v、0.07% v/v、0.08% v/v、0.09% v/v、0.10% v/v、0.11% v/v、0.12% v/v、0.13% v/v、0.14% v/v、0.15% v/v、0.16% v/v、0.17% v/v、0.18% v/v、0.19% v/v或0.20% v/v。 PS20具有大致1.1 g/mL之密度。PS60具有大致1.044 g/mL之密度。PS80具有大致1.06 g/mL至1.09 g/mL之密度。聚山梨醇酯咸信形成微胞且防止蛋白質吸附至表面及蛋白質聚集。在不欲受理論束縛之情況下，咸信在降解/氧化後，聚山梨醇酯可形成可對蛋白質穩定性具有影響之過氧化物及酸。因此，認為聚山梨醇酯之濃度在產品之調配物中儘可能低係較佳的。因此，認為聚山梨醇酯之濃度不超出其臨界微胞濃度(CMC)之200倍係較佳的，不超出其CMC之100倍、50倍、20倍、10倍或5倍係更佳的。對於PS20 (Mw 1227.5 g/mol)，CMC在21℃下大致為8×10^-5 M，亦即大致0.01% w/v。對於PS60 (Mw 1309 g/mol)，CMC在21℃下大致為21×10^-6 M，亦即大致0.003% w/v。對於PS80 (Mw 1310 g/mol)，CMC在21℃下大致為12×10^-6 M，亦即大致0.002% w/v。根據一較佳實施例，聚山梨醇酯濃度在給定溫度(例如，約21℃)下在其CMC之1倍與200倍之間，較佳在其CMC之2倍與100倍之間，例如其CMC之約20倍或50倍。根據本發明之液體組合物包含作為色胺酸或酪胺酸之胺基酸。在不欲受理論束縛之情況下，假設色胺酸或酪胺酸可防止將呈現其非功能性之活性蛋白質之氧化。實際上，認為以相較於神經毒素莫耳過量添加之胺基酸將首先經氧化，從而保留神經毒素。亦假設色胺酸或酪胺酸可中和諸如聚山梨醇酯的界面活性劑之反應性降解產品。較佳地，胺基酸為色胺酸。更佳地，胺基酸為L-色胺酸。胺基酸濃度較佳為約0.1 mg/mL至5 mg/mL，更佳在0.1 mg/mL與5 mg/mL之間，0.25 mg/mL及3 mg/mL，例如約0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL或3 mg/mL。根據本發明之組合物包含緩衝液，其包含鈉、氯及磷酸根離子。本發明人實際上出人意料地發現不具有鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液會降低毒素之穩定性。較佳地，緩衝液亦包含鉀離子。緩衝液可(例如)藉由組合氯化鈉、氯化鉀及磷酸鈉鹽獲得。氯化鈉濃度較佳為10 mM至500 mM，較佳約25 mM至300 mM，例如約25 mM、50 mM、75 mM、100 mM、140 mM、150 mM、200 mM、250 mM或300 mM。磷酸鈉濃度較佳為1 mM至100 mM，較佳2 mM至50 mM，例如約2 mM、5 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM或50 mM。氯化鉀濃度較佳為1 mM至50 mM，較佳1 mM到10 mM，例如約1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM或10 mM。根據本發明之組合物具有在5.5與8之間的pH。根據一較佳實施例，pH在6.0與7.5之間，例如約6.3、6.35、6.4、6.45、6.5、6.55、6.6、6.65、6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。較佳地，pH在距生理pH (其為約7.4)之一個單位內。根據本發明之組合物為液體。組合物較佳包含水性稀釋劑，更佳為水，例如無菌水、注射用水、純化水、注射用無菌水。較佳地，調配物為等滲的且適合於注射至患者，特定而言人類患者。肉毒桿菌神經毒素之數量通常以小鼠LD50 (致死性劑量50)單位表現，經定義為小鼠之中間致死腹膜內劑量。用於肉毒桿菌毒素之小鼠LD50 (MLD50)單位不為標準化單位。實際上，供出售毒素之不同製造商使用之檢定在選擇稀釋緩衝液時特別不同。舉例而言，供Dysport®使用之測試使用明膠磷酸鹽緩衝液，而供BOTOX®使用之檢定使用鹽水作為稀釋液。咸信明膠緩衝液以LD50檢定中使用之較高稀釋度保護毒素。對比而言，將鹽水用作稀釋液被認為引起效能之一些耗損。此可闡釋為何在用Dysport®檢定測試時，一個BOTOX®單位等效於大致Dysport之三個單位(Straughan、D. W. , 2006, ATLA 34(3), 305-313；Hambleton及Pickett, Hambleton, P.,及A. M. Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87.11: 719)。較佳地，用於測定小鼠LD50之稀釋緩衝液為明膠磷酸鹽緩衝液。舉例而言，小鼠LD50可如Hambleton, P.等人，Production, purification and toxoiding of Clostridium botulinum type A toxin. G. E. Jr Lewis及P. S. Angel編. Academic Press, Inc., New York, USA, 1981，第248頁中所描述來測定。簡言之，在呈pH 6.5之0.2% (w/v)明膠0.07M Na2HPO4緩衝液中連續稀釋肉毒桿菌毒素樣品。重量約20 g之小鼠之群組(例如，每組4至8隻小鼠)腹膜內注入經稀釋之毒素之樣品(例如，每隻動物0.5 ml)。選擇稀釋群組(例如，5個稀釋群組)以跨越50%之致死劑量。觀測小鼠高達96小時且估計小鼠致死劑量50 (MLD50)。根據本發明之組合物較佳包含每毫升4 LD50單位至10000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素，更佳每毫升10 LD50至2000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素，例如每毫升20 LD50單位、30 LD50單位、40 LD50單位、50 LD50單位、75 LD50單位、100 LD50單位、200 LD50單位、300 LD50單位、400 LD50單位、500 LD50單位、600 LD50單位、700 LD50單位、800 LD50單位、900 LD50單位、1000 LD50單位或1500 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素。肉毒桿菌神經毒素之數量亦可以ng表現。根據本發明之組合物較佳包含每毫升約0.01 ng至75 ng之肉毒桿菌神經毒素，更佳每毫升約0.03 ng至20 ng之肉毒桿菌神經毒素，再更佳每毫升約0.1 ng至15 ng之肉毒桿菌神經毒素，例如每毫升約0.15 ng、0.3 ng、0.5 ng、0.75 ng、1 ng、2 ng、3 ng、4 ng、5 ng、6 ng、7 ng、8 ng、9 ng或10 ng之肉毒桿菌神經毒素。根據本發明之調配物無動物蛋白質。特定而言，根據本發明之組合物不包含白蛋白，且特定而言人類血清白蛋白。較佳地，根據本發明之組合物無動物產品，意謂其不包含動物(包括人類)來源之成分。較佳地，根據本發明之組合物不包含除蛋白質神經毒素外之蛋白質。根據另一實施例，根據本發明之組合物不包含除蛋白質神經毒素及一或多個NAP (神經毒素相關之蛋白質)外之蛋白質。為了疑惑起見，注意胺基酸不為蛋白質。根據本發明之一實施例，組合物不包含醣類，不包括單醣、雙醣及多醣。根據本發明之液體組合物隨時間推移穩定。舉例而言，其在2℃至8℃下穩定2個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定3個月。根據一較佳實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定6個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定12個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定18個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定24個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定36個月。根據一個實施例，其在室溫下(例如，在25℃下)穩定3個月。根據一個實施例，其在室溫下(例如，在25℃下)穩定6個月。根據一個實施例，其在37℃下穩定2個月。根據本發明之液體組合物較佳在介於0℃與30℃之間的溫度下儲存。在一較佳實施例中，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)儲存。在另一實施例中，其在室溫下儲存。較佳地，其不經冷凍。穩定性可經由比較肉毒桿菌神經毒素隨時間推移之活性來評定。肉毒桿菌神經毒素之活性可指代肉毒桿菌神經毒素之活性結合細胞上之其靶受體，將輕鏈移位至細胞中及/或分解其靶SNARE蛋白質之能力。用於量測肉毒桿菌神經毒素活性之方法在此項技術中已為所熟知的。肉毒桿菌神經毒素活性可(例如)藉由使用如上文所描述之小鼠致死率檢定(LD50)、諸如小鼠膈神經半膈檢定的基於肌肉組織之檢定(例如，如Bigalke, H.及Rummel A., Toxins 7.12 (2015): 4895-4905中所描述)、基於細胞之檢定(例如，如WO201349508中或WO2012166943中所描述)或諸如BoTest®之胞外蛋白分解活性檢定(購自BioSentinel Inc.之肉毒桿菌神經毒素檢測套組)來評定。較佳地，若歷經給定時段且在給定溫度下活性之耗損不大於給定百分比，則將根據本發明之組合物視為穩定的。根據一個實施例，若在2℃至8℃下歷經3個月、6個月、12個月、18個月、24個月或36個月胞外蛋白分解活性之耗損不大於30%，例如在5℃下歷經6個月胞外蛋白分解活性之耗損不大於30%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。較佳地，若在5℃下歷經3個月，更佳在5℃下歷經6個月、12個月、18個月、24個月或36個月胞外蛋白分解活性之耗損不大於20%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。根據另一實施例，若在室溫下(例如，在25℃下)歷經3個月胞外蛋白分解活性之耗損不大於40%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。較佳地，若在25℃下歷經3個月，更佳在25℃下歷經6個月胞外蛋白分解活性之耗損不大於30%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。根據另一實施例，若在37℃下歷經2個月胞外蛋白分解活性之耗損不大於50%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。胞外蛋白分解活性可藉由BoTest^® 檢定來量測。根據一個實施例，若在2℃至8℃下歷經2個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月或36個月呈MLD50單位之耗損不大於30%，例如在5℃下歷經6個月呈MLD50單位之耗損不大於30%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。較佳地，若在5℃下歷經2個月，更佳在5℃下歷經3個月、6個月、12個月、18個月、24個月或36個月呈MLD50單位之耗損不大於20%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。根據另一實施例，若在室溫下(例如，在25℃下)歷經2個月或3個月呈MLD50單位之耗損不大於40%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。較佳地，若在25℃下歷經3個月，更佳在25℃下歷經6個月呈MLD50單位之耗損不大於30%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。根據另一實施例，若在37℃下歷經2個月呈MLD50單位之耗損不大於50%，則將根據本發明之組合物視為穩定的。MLD50單位可如上所指示來量測。根據本發明之液體組合物可儲存於密封小瓶或注射器中，例如玻璃小瓶或注射器，較佳地1型 (或「本體中立」)玻璃小瓶或注射器。較佳地，小瓶或注射器中不存在氧或存在極少氧。小瓶或注射器可(例如)在氧氣低於100 ppm較佳低於50 ppm之氛圍中填充，且氮氣可用作小瓶中之保護氛圍。當使用玻璃小瓶時，其可(例如)利用氯丁基或溴丁基橡膠塞子加帽，該等塞子可為經FluroTec^® 塗佈之塞子。較佳地，根據本發明之液體組合物儲存於利用經FluroTec®塗佈之塞子加帽之玻璃小瓶中。根據一個實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 每毫升4 LD50單位至10000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素， o 0.001% v/v至15% v/v之聚山梨醇酯， o 0.1 mg/mL至5 mg/mL之色胺酸， o 10 mM至500 mM NaCl， o 1 mM至50 mM KCl， o 1 mM至100 mM磷酸鈉，具有在5.5與8之間的pH，且在5℃下穩定6個月。根據一個實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 每毫升10 LD50單位至2000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素， o 0.005% v/v至2% v/v之聚山梨醇酯， o 0.1 mg/mL至5 mg/mL之色胺酸， o 25 mM至300 mM NaCl， o 1 mM至10 mM KCl， o 2 mM至50 mM磷酸鈉，具有在6.0與7.5之間的pH，且在5℃下穩定12個月。根據一個實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 每毫升10 LD50單位至2000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素， o 0.05% v/v至0.2% v/v之聚山梨醇酯80， o 0.1 mg/mL至5 mg/mL之色胺酸， o 25 mM至300 mM NaCl， o 1 mM至10 mM KCl， o 2 mM至50 mM磷酸鈉，具有在6.0與7.5之間的pH，且在5℃下穩定12個月。根據一個實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.2% v/v之聚山梨醇酯80， o 1 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.6。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.04% v/v之聚山梨醇酯80， o 1 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.9。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素B， o 0.25% v/v之聚山梨醇酯20， o 4 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為7.4。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.01% v/v之聚山梨醇酯80， o 0.25 mg/mL之色胺酸， o 255 mM NaCl， o 2 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為7.2。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.01% v/v之聚山梨醇酯80， o 0.25 mg/mL之色胺酸， o 255 mM NaCl， o 10 mM KCl， o 50 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.3。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 1% v/v之聚山梨醇酯80， o 0.25 mg/mL之色胺酸， o 255 mM NaCl， o 50 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.3。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 1% v/v之聚山梨醇酯80， o 3 mg/mL之色胺酸， o 255 mM NaCl， o 10 mM KCl， o 50 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為7.2。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.1% v/v之聚山梨醇酯80， o 1.625 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.75。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.01% v/v之聚山梨醇酯80， o 1 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.75。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 0.1% v/v之聚山梨醇酯80， o 1 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.75。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素A， o 1% v/v之聚山梨醇酯80， o 1 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為6.75。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素B， o 15% v/v之聚山梨醇酯20， o 1 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為7.4。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素B， o 15% v/v之聚山梨醇酯20， o 4 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為7.4。根據另一實施例，根據本發明之液體組合物包含以下各者或主要由以下各者組成： o 肉毒桿菌神經毒素B， o 0.25% v/v之聚山梨醇酯20， o 4 mg/mL之色胺酸， o 140 mM NaCl， o 3 mM KCl， o 10 mM磷酸鈉，其中該組合物之pH大致為7.4。另一態樣為根據本發明之液體組合物在治療中之用途。根據本發明之液體組合物可用於治療以治療或預防肌肉病症、神經肌肉病症、神經病症、眼科病症、疼痛病症、心理病症、關節病症、發炎性病症、內分泌病症或泌尿病症。舉例而言，根據本發明之液體組合物可用於治療或預防選自下列之疾病、病況或症候群： · 眼科病症，其選自由以下各者組成之群：瞼痙攣、斜視(包括限制性或肌原性斜視)、弱視、振動幻視、保護性上瞼下垂、用於角膜保護之治療性上瞼下垂、眼球震顫、內斜視、複視、瞼內翻、眼瞼回縮、眼眶肌病、隱斜視、伴隨性錯位、非伴隨性錯位、原發性或繼發性內斜視或外斜視、核間眼肌麻痺、反側偏斜、杜安氏症候群(Duane's syndrome)及上部眼瞼回縮； · 運動障礙，包括：半面痙攣、斜頸、(例如，大腦麻痺、中風後、多發性硬化、創傷性腦損傷或脊髓損傷患者中之)兒童或成人之痙攣、特發性病灶性肌張力障礙、肌肉僵硬、書寫痙攣(Writer's cramp)、手部肌張力障礙、VI型神經麻痺、口下頜肌張力障礙、頭部震顫、遲發性運動不能、遲緩性肌張力障礙、職業性痙攣(包括音樂家的痙攣)、面部神經麻痺、顎部閉合痙攣、面部痙攣、聯帶運動、震顫、原發性書寫震顫、肌陣攣、僵人症候群、足部肌張力障礙、面部麻痺、疼痛臂及運動手指症候群、抽搐病症、肌張力障礙抽搐、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、神經肌強直、下頜顫抖、外直肌麻痺、肌張力障礙足內翻、顎部肌張力障礙、家兔症候群(Rabbit syndrome)、小腦震顫、III型神經麻痺、齶部肌陣攣、靜坐不能、肌肉痙攣、IV型神經麻痺、步態凍結、伸肌軀幹肌張力障礙、面部神經麻痺後聯帶運動、繼發性肌張力障礙、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷頓氏舞蹈症(Huntington's chorea)、癲癇症、關期肌張力障礙、頭部破傷風、肌纖維顫動及良性痙攣-肌束顫搐症候群； · 耳鼻喉科病症，包括：痙攣性發音障礙、耳部病症、聽覺減損、耳部咔嗒聲、耳鳴、頭暈、梅尼爾氏疾病(Meniere's disease)、耳蝸神經功能不全、口吃、環咽吞咽困難、睡中磨牙、慢性誤吸時喉之閉合、聲帶褶肉芽腫、室性肌張力障礙、室性發音障礙、突變性發音障礙、牙關緊閉、打鼾、話音震顫、誤吸、舌突起肌張力障礙、齶部震顫、深咬唇及喉部肌張力障礙；初次咀嚼症候群(First Bite Syndrome)； · 腸胃病症，包括：弛緩不能、裂肛、便秘、顳下頜關節功能不全、歐蒂氏括約肌功能不全(sphincter of Oddi dysfunction)、歐蒂氏持久括約肌高血壓(sustained sphincter of Oddi hypertension)、腸肌肉病症、恥骨直腸肌症候群、肛門痙攣、幽門痙攣、膽囊功能不全、腸胃或食道運動功能不全、瀰漫性食道痙攣及胃輕癱； · 尿生殖病症，包括：逼尿肌括約肌共濟不能、逼尿肌過度反射、(例如，帕金森氏病、脊髓損傷、中風或多發性硬化患者中之)神經性膀胱功能不全、膀胱過動症、神經性逼尿肌活動過度、膀胱痙攣、尿失禁、尿瀦留、肥大膀胱頸、排尿功能不全、間質性膀胱炎、陰道痙攣、子宮內膜異位、骨盆疼痛、前列腺腺體增大(良性前列腺增生)、前列腺痛、前列腺癌及異常勃起； · 皮膚病症，包括：皮膚細胞增生性病症、皮膚創傷、牛皮癬、紅斑痤瘡、痤瘡；罕見遺傳性皮膚病症，諸如福克斯-福代斯症候群(Fox-Fordyce syndrome)或海利-海利疾病(Hailey-Hailey disease)；瘢痕瘤及肥厚性瘢痕減少；毛孔大小減少；皮膚之發炎病況；皮膚之疼痛發炎病況； · 疼痛病症，包括：背部之疼痛(上背痛、下背痛)、肌筋膜疼痛、緊張性頭痛、肌肉纖維疼痛、疼痛症候群、肌痛、偏頭痛、頸部過度屈伸、關節疼痛、手術後疼痛、不與肌肉痙攣相關聯之疼痛及與平滑肌病症相關聯之疼痛； · 發炎性病症，包括：胰臟炎、神經性發炎性病症(包括痛風、肌腱炎、滑囊炎、皮肌炎及僵直性脊椎炎)； · 分泌性病症，諸如過量腺體分泌、多汗症(包括腋下多汗症、掌部多汗症及弗雷氏症候群(Frey's syndrome))、流涎過多、流涎、溴汗症、黏液分泌過多、過度流淚、全泌腺功能不全；過量皮脂分泌； · 呼吸病症，包括：鼻炎(包括過敏性鼻炎)、COPD、哮喘及肺結核； · 肥厚性病症，包括：肌肉增大、咬肌肥大症、肢端肥大症及伴隨肌痛之神經性脛骨前端肥大症。 · 關節病症，包括：網球肘(或肘部之上髁炎)、關節炎、髖關節骨關節炎、骨關節炎、肩部之迴旋肌冠病變、類風濕性關節炎及腕隧道症候群； · 內分泌病症，如2型糖尿病、高胰高血糖素血症、高胰島素症、低胰島素症、高鈣血症、低鈣血症、甲狀腺病症(包括格雷弗氏疾病(Grave's disease)、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲狀腺高能症及甲狀腺低能症)、副甲狀腺病症(包括副甲狀腺高能症及副甲狀腺低能症)、顧新氏症候群(Gushing' s syndrome)及肥胖症； · 自體免疫疾病，如全身性紅斑狼瘡； · 增生性疾病，包括：副神經節瘤腫瘤、前列腺癌及骨腫瘤； · 創傷損傷，包括：運動損傷、肌肉損傷、肌腱創傷及骨骼破裂；及 · 獸醫用途(例如，哺乳動物之固定化、馬絞痛、動物弛緩不能或動物肌肉痙攣)。根據本發明之液體組合物亦可用於美容醫學(亦即用於改良美容外觀)，特定而言用於治療或預防皮膚皺紋，特定而言面部皺紋，諸如面部皺眉線、眼部輪廓之皺紋、眉間皺眉線、下垂口部、頸部之皺紋(頸闊肌帶)、下頜之皺紋(頦、橘皮、凹陷下頜)、前額線、「擦傷皮膚」皺紋、鼻部提昇治療線或睡眠線。根據本發明之此態樣，待治療或預防以供改良美容外觀的個體較佳不患有上述之任何病症、病況或症候群。更佳，該個體為健康個體(亦即，不患有任何疾病、病況或症候群)。根據本發明之液體組合物可用於與另一治療性化合物組合。在一個實施例中，根據本發明之液體組合物與用於治療疼痛之鎮痛劑化合物組合，特定而言與諸如嗎啡鹼之類鴉片衍生物組合投藥，如WO 2007/144493中所描述，其內容以引用之方式併入本文中。在另一實施例中，根據本發明之液體組合物與(例如)用於治療前列腺癌之玻尿酸組合投藥，如WO2015/0444416中所描述，其內容以引用之方式併入本文中。本發明之另一態樣為選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸的用途，其用於保護蛋白質神經毒素在不含動物來源之蛋白質的液體組合物中免遭降解。根據一較佳實施例，胺基酸為色胺酸，更佳L-色胺酸。較佳地，蛋白質神經毒素為肉毒桿菌神經毒素。根據本發明之一實施例，肉毒桿菌神經毒素為呈複合形式之肉毒桿菌神經毒素。根據另一實施例，肉毒桿菌神經毒素為高純度肉毒桿菌神經毒素。根據本發明之一實施例，肉毒桿菌神經毒素為自其天然梭菌菌株純化之肉毒桿菌神經毒素。根據另一實施例，肉毒桿菌神經毒素為在異質宿主(諸如大腸桿菌)中以重組方式產生之肉毒桿菌神經毒素。根據本發明，肉毒桿菌神經毒素可為血清型A、血清型B、血清型C、血清型D、血清型E、血清型F或血清型G之BoNT。根據本發明，肉毒桿菌神經毒素可為如上文所描述經修飾之肉毒桿菌神經毒素。根據本發明，重組肉毒桿菌神經毒素可為如上文所描述之嵌合肉毒桿菌神經毒素。根據一較佳實施例，胺基酸與界面活性劑及包含鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液組合使用，且該液體組合物具有在5.5與8之間的pH。較佳地，界面活性劑為非離子界面活性劑，更佳聚山梨醇酯，例如PS20、PS60或PS80。最佳地，非離子界面活性劑為PS80。較佳地，緩衝液亦包含鉀離子。緩衝液可(例如)藉由組合氯化鈉、氯化鉀及磷酸鈉鹽獲得。根據一較佳實施例，pH在6.0與7.5之間，例如6.3、6.35、6.4、6.45、6.5、6.55、6.6、6.65、6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。較佳地，pH在距生理pH (其為約7.4)之一個單位內。根據本發明之用途之一較佳實施例，液體組合物穩定2個月。舉例而言，其在2℃至8℃下穩定2個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定3個月。根據一較佳實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定6個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定12個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定18個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定24個月。根據一個實施例，其在2℃至8℃下(例如，在5℃下)穩定36個月。根據一個實施例，其在室溫下(例如，在25℃下)穩定3個月。根據一個實施例，其在室溫下(例如，在25℃下)穩定6個月。實例 1.穩定液體肉毒桿菌毒素 A 調配物之製備 製備液體肉毒桿菌毒素製劑，其含有15 ng/mL之經高度純化之BoNT/A、15% v/v聚山梨醇酯20、選自酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)及半胱胺酸(Cys)之胺基酸或者甲硫胺酸(Met)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)及半胱胺酸(Cys)之混合物(Sigma Aldrich)及磷酸鹽緩衝液鹽水(來自Calbiochem之PBS) (在25℃下呈pH 7.4之140 mM NaCl、10 mM磷酸鈉及3 mM KCl)，使用0.22 μm PVDF (聚偏二氟乙烯)過濾器過濾並在40℃下儲存於矽化2 mL玻璃注射器中6天，其後對各製劑進行效能測試。對於效能測試，將含有該等製劑之注射器排空於蓋子含有經PTFE處理之橡膠隔墊(Chromacol)之2 mL玻璃小瓶(Chromacol，Gold)或1.7 mL塑膠微型離心機試管(Axygen，Maximum Recovery)中(該二者皆具有較低蛋白質吸附特性)。隨後使用具有3%人類血清白蛋白(HSA)之0.9% NaCl溶液稀釋該等製劑。對於各製劑，在進行稀釋之同一天將50 μL之樣品注入至小鼠之腓腸肌肌肉中。監測小鼠3天且記錄麻痺之程度。結果展示於表1中。.表 1- 胺基酸添加物對 BoNT/A 穩定性之經加速儲存測試 ( 在 40 ℃ 下 6 天 ) 。 麻痺導致小鼠 ： -= 未經分析 ， WN= 未標註 ， PA= 麻痺及 †= 死亡。 發現酪胺酸及色胺酸對BoNT/A降解具有保護作用。發現色胺酸具有最強保護作用。半胱胺酸以及含有全部4種胺基酸之混合物不具有保護作用。 2.穩定液體肉毒桿菌毒素 B 調配物之製備 製備液體肉毒桿菌毒素製劑，其含有350 ng/mL之經高度純化之BoNT/B、15% v/v 聚山梨醇酯20、選自酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)及半胱胺酸(Cys)之胺基酸或者甲硫胺酸(Met)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)及半胱胺酸(Cys)之混合物及呈pH 7.4之磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)，使用0.22 μm過濾器過濾並在40℃下儲存於矽化2 mL玻璃注射器中兩週，其後對如上文所描述之各製劑進行效能測試。結果展示於表2中。表 2- 胺基酸添加物對 BoNT/B 穩定性之經加速儲存測試 ( 在 40 ℃ 下兩週 ) 。麻痺導致小鼠： -= 未經分析， WN= 未標註， PA= 麻痺及 †= 死亡。 發現酪胺酸及色胺酸對BoNT/B降解具有保護作用。半胱胺酸以及含有全部4種胺基酸之混合物亦具有保護作用，但程度較弱。 3.色胺酸及聚山梨醇酯 20 之不同濃度之評估 製備液體肉毒桿菌毒素製劑，其含有經高度純化之BoNT/A或BoNT/B及不同濃度之聚山梨醇酯20 (PS 20)及色胺酸及呈pH 7.4之磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)，使用0.22 μm過濾器過濾並儲存於矽化2 mL玻璃注射器中。對如上文所描述之各製劑進行後肢麻痺效能測試。結果展示於表3中。表 3-Trp 及聚山梨醇酯 20 (PS20) 濃度對 BoNT/A 或 BoNT/B 穩定性之評估。麻 痺導致小鼠 ： -= 未經分析 ， WN= 未標註 ， PA= 麻痺及 †= 死亡。 麻痺程度(PA)：1.腳趾受影響；2.後腿略微失去知覺；3.兩隻後腿麻痺；4.後腿麻痺；來自純化(5)之溶離緩衝液：具有0.2% (v:v)聚山梨醇酯20之50 mM乙酸鈉pH 4.5及400 mM氯化鈉。*可能出現25℃之8 mg/mL Trp 0.25%聚山梨醇酯20之兩種BoNT/A稀釋液之混合。 4.BoNT/B 製劑中之不同鹽濃度之評估 製備液體肉毒桿菌毒素製劑，其含有100 ng/mL之經高度純化之BoNT/B、聚山梨醇酯20、來自不同胺基酸供應商之色胺酸及選自PBS pH 7.4之緩衝液(Calbiochem)、12 nM磷酸鹽緩衝液pH 7 (Apoteket)及20 mM乙酸鈉(NaAc) pH 5.5 (來自Fluka之NaAc及來自Merck之乙酸)，使用0.22 μm過濾器過濾並儲存於矽化2 mL玻璃注射器中。對如上文所描述之各製劑進行後肢麻痺效能測試。結果展示於表4中。表 4- 不同鹽濃度對 BoNT/B 之穩定性的評估。麻痺導致小鼠 ： -= 未經分析 ， WN= 未標註 ， PA= 麻痺及 †= 死亡。 1.一些功能損失；2.微弱麻痺結果展示含有PBS緩衝液(含有鈉、氯、磷酸根及鉀離子)之製劑似乎在肉毒桿菌毒素之穩定性中起作用。 5.不同穩定劑之評估製備含有15 ng/mL之經高度純化之BoNT/A、聚山梨醇酯20 (PS20)或聚山梨醇酯80 (PS80)或HSA、色胺酸及PBS的液體肉毒桿菌毒素製劑，使用0.22 μm過濾器過濾並儲存於矽化2 mL玻璃注射器中。對如上文所描述之各製劑進行後肢麻痺效能測試。結果展示於表5中。表 5- 不同界面活性劑對 BoNT/A 之穩定性之評估。麻 痺導致小鼠 ： -= 未經分析 ， WN= 未標註 ， PA= 麻痺及 †= 死亡。 1.重度麻痺兩隻後腿；2.角腳爪；3.重度麻痺 6.不同調配物之評估如上文所描述製備液體肉毒桿菌毒素製劑，其含有10 ng/mL之經高度純化之BoNT/A、0.25% PS80、1 mg/mL色胺酸及PBS。藉由添加HCl將pH調整至6.6及7.0。在40℃下將各製劑儲存5週。接著10倍稀釋各製劑且如上文所描述進行後肢麻痺效能測試(每次注射0.05 ng)。在兩種情況下，均在第3天觀測後肢麻痺。麻痺在pH 6.6製劑下更強。 7.不同調配物之評估如上文所描述製備含有0.3 ng/mL之經高度純化之BoNT/A、選自PS20及PS80之聚山梨醇酯、1 mg/mL色胺酸及呈pH 7.4之12 mM PBS的液體肉毒桿菌毒素製劑。藉由添加1.2 M HCl將各製劑之pH調整至pH 6.6或6.9。在對應於其CMC (臨界微胞濃度，在21℃下約0.01% w/v)約20倍之一個濃度(0.2% w/v)下測試聚山梨醇酯20。聚山梨醇酯80測試0.04% w/v及0.2% w/v，分別對應於其CMC(在21℃下約0.002% w/v)之約20倍及100倍。表 6- 聚山梨醇酯 及 pH 之選擇 對於各製劑，0.5 mL之體積填充於1 mL長玻璃注射器(BD)中且用經碳氟化合物塗佈之柱塞密封。藉由如上文所描述之對小鼠之後肢麻痺測試量測效能。在5℃及隨後25℃下儲存6個月之後，未在任何調配物中觀測到效能之降低。 8.不同調配物之評估藉由不同濃度之聚山梨醇酯80、色胺酸、磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及不同pH來製備含有經高度純化之肉毒桿菌神經毒素A型的十九種不同調配物。各調配物具有500 U/mL目標標稱效能。各調配物經脫氣，經由0.2 μm過濾器過濾並填充至小瓶中。氮氣用作小瓶中之保護性氛圍。在厭氧腔室中進行填充。各調配物在氮氣氛圍中以1 mL等分試樣填充於藉由用鋁彈開式密封件密封之FluroTec^® 塞子加帽之2 mL玻璃小瓶中且豎直儲存。使用BoTest^® 在5℃、25℃及37℃下評定19種調配物之穩定性以量測效能。表 7- 賦形劑組合 物表 8- 封裝組分 對於所有調配物，溶液保持澄清且大多數係無色。此研究中所測試之賦形劑濃度在所測試時間間隔期間似乎不影響調配物之pH。效能結果呈現於表9中。表 9-Botest 效能結果 對於若干組合物，在5℃下歷經6個月之效能耗損不大於30%及/或在25℃下歷經3個月之效能耗損不大於約40%及/或在37℃下歷經2個月之效能耗損不大於約50%。 9.PS 60 之評估 藉由0.1% (v/v) PS60、1 mg/mL L-色胺酸、10 mM磷酸鈉、140 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀及注射用水製備含有經高度純化之肉毒桿菌神經毒素A型的調配物。藉由HCl將pH調整至6.75。調配物具有100 U/mL之目標標稱效能。調配物經脫氣，經由0.2 µm過濾器過濾並以1 mL之填充體積無菌填充至具有氮氣氛圍之厭氧腔室中之2 mL小瓶中。氮氣用作小瓶中之保護性氛圍。小瓶藉由用鋁彈開式密封件密封之FluroTec^® 塞子加帽。表 10- 封裝組分 藉由如本文所描述之MLD50測試量測在37℃及25℃下隨時間推移之效能。在37℃下，9週後之剩餘效能為初始效能之約50%至55%。在25℃下，3個月後之剩餘效能為初始效能之約80%。

無

Claims

一種液體組合物，其包含蛋白質神經毒素、界面活性劑、選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸、包含鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液，其中該液體組合物具有在5.5與8之間的pH，其中該組合物不含動物來源之蛋白質，及其中該液體組合物隨時間推移穩定。
如請求項1之液體組合物，其中該界面活性劑為非離子界面活性劑。
如請求項2之液體組合物，其中該非離子界面活性劑為聚山梨醇酯，較佳聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。
如請求項1至3中任一項之液體組合物，其中該胺基酸為色胺酸，較佳地L-色胺酸。
如請求項1至4中任一項之液體組合物，其中該緩衝液進一步包含鉀離子。
如請求項1至5中任一項之液體組合物，其中該組合物具有在6.0與7.5之間的pH。
如請求項1至6中任一項之液體組合物，其中在5℃下歷經2個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月或36個月出現不大於30%之胞外蛋白分解活性之耗損。
如請求項1至7中任一項之液體組合物，其中該蛋白質神經毒素為肉毒桿菌神經毒素，其選自呈複合形式之天然肉毒桿菌神經毒素、高純度天然肉毒桿菌神經毒素及重組肉毒桿菌神經毒素。
如請求項8之液體組合物，其中該肉毒桿菌神經毒素為重組肉毒桿菌神經毒素，其選自肉毒桿菌神經毒素A、肉毒桿菌神經毒素B、肉毒桿菌神經毒素C、肉毒桿菌神經毒素D、肉毒桿菌神經毒素E、肉毒桿菌神經毒素F或肉毒桿菌神經毒素G、經修飾之肉毒桿菌神經毒素及嵌合肉毒桿菌神經毒素。
如請求項1至9中任一項之液體組合物，其中該液體組合物包含：每毫升4 LD50單位至10000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素， 0.001% v/v至15% v/v之聚山梨醇酯， 0.1 mg/mL至5 mg/mL之色胺酸， 10 mM至500 mM NaCl， 1 mM至50 mM KCl， 1 mM至100 mM磷酸鈉，具有在5.5與8之間的pH，且在5℃下穩定6個月。
如請求項10之液體組合物，其中該液體組合物包含：每毫升10 LD50單位至2000 LD50單位之肉毒桿菌神經毒素， 0.05% v/v至0.2% v/v之聚山梨醇酯80， 0.1 mg/mL至5 mg/mL之色胺酸， 25 mM至300 mM NaCl， 1 mM至10 mM KCl， 2 mM至50 mM磷酸鈉，具有在6.0與7.5之間的pH，且在5℃下穩定12個月。
如請求項1至11中任一項之液體組合物，其用於治療。
如請求項12之液體組合物，其用於治療或預防肌肉病症、神經肌肉病症、神經病症、眼科病症、疼痛病症、心理病症、關節病症、發炎性病症、內分泌病症或泌尿病症。
一種如請求項1至11中任一項之液體組合物之用途，其用於美容醫學，例如以供治療或預防皮膚皺紋，特定而言面部皺紋，諸如面部皺眉線、眼部輪廓之皺紋、眉間皺眉線、下垂口部、頸部之皺紋(頸闊肌帶)、下頜之皺紋(頦、橘皮、凹陷下頜)、前額線、「擦傷皮膚」皺紋、鼻部提昇治療線或睡眠線。
一種選自色胺酸及酪胺酸之胺基酸之用途，其用以保護蛋白質神經毒素在不含動物來源之蛋白質的液體組合物中免遭降解。
如請求項15之用途，其中該胺基酸為色胺酸。
如請求項15或16之用途，其中該蛋白質神經毒素為肉毒桿菌神經毒素。
如請求項15之用途，其中該胺基酸與界面活性劑及包含鈉、氯及磷酸根離子之緩衝液組合使用，且該液體組合物具有在5.5與8之間的pH。