TW201936207A - 含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明是關於一種含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法。
根據本發明的含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的調配物為容易儲存及分散的液體調配物，且其在根據人體的溫度及pH值的適合條件下在具有局部麻醉劑的肉毒桿菌毒素的穩定化上呈現顯著效應。因此，預期本發明的調配物將非常有助於肉毒桿菌毒素安全且適宜的醫療用途。

Description

含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法

本發明是關於一種含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法。

自1890年代直至本發明時間已發現了分泌具有神經毒性效應的毒素的多種梭菌屬（Clostridium sp.）菌株，且過去70年間已得到了自這些菌株中分泌的毒素的特徵（Schant, E. J.等人，微生物學評論（Microbiol. Rev.），56:80，1992）。在這些毒素當中，肉毒桿菌毒素在具有神經功能的動物中抑制肌神經接頭的膽鹼激導性突觸前處（cholinergic presynapse）的乙醯膽鹼（acetylcholine）的胞外分泌從而引起乏力（asthenia）。因此，最近做出了將肉毒桿菌毒素的神經毒性用於美容或治療目的的努力。已提出或嘗試了將肉毒桿菌毒素用於眼睛疾病（美國專利第6,265,379號）、疼痛（美國專利第6,113,915號）、包含汗腺疾病的各種自主神經疾病（美國專利第5,766,605號）、偏頭痛（美國專利第5,714,468號）、術後疼痛及內臟疼痛（美國專利第6,464,986號）、牛皮癬及皮膚炎（美國專利第5,670,484號）、各種癌症（美國專利第6,139,845號及美國專利第6,063,768號）以及神經性炎症（美國專利第6,063,768號）等的治療。然而，肉毒桿菌毒素（一種蛋白質劑）存在的問題在於其並不易於調配至醫藥組成物中且亦並不易於儲存、分散及管理。此問題由蛋白質的不穩定性引起，且在蛋白質劑（例如肉毒桿菌毒素）以極低濃度配製至醫藥組成物中的情況下問題為嚴重的。肉毒桿菌毒素蛋白具有黏著至固體表面的特性，且出於此原因，當將所述蛋白質注射至容器中時，蛋白質的一部分可黏著於容器的內壁從而導致活性成份的損耗，且蛋白質可容易地氧化或分解成小片段。出於此原因，為了儘可能地防止肉毒桿菌毒素的變性，在其製備製程中純化的肉毒桿菌毒素經分散為凍乾粉末，在即將用於臨床應用及以液體形式向患者投與之前將所述凍乾粉末稀釋於生理鹽水中。然而，在此情況下，亦存在的問題在於由於人為誤差而極可能出現醫療事故，例如因使用者導致的稀釋因數誤差或稀釋生理鹽水的污染。因此，迫切地需要研發穩定劑，所述穩定劑可甚至在肉毒桿菌毒素的液體調配物的製備及分散期間防止蛋白質變性。

在先前技術中，白蛋白有效地用作穩定劑以維持肉毒桿菌毒素的活性。然而，由於交叉感染的風險及動物來源成分的副作用，因此最近已需要非動物調配物的研發。回應於此需要，美國專利申請公開案第2007-0134199號揭露包括麩醯胺酸（glutamine）及麩胺酸（glutamic acid）或天冬醯胺（asparagine）及天冬胺酸（aspartic acid）作為胺基酸的肉毒桿菌毒素組成物，且韓國專利第1087017號揭露包括甲硫胺酸（methionine）作為穩定劑的肉毒桿菌毒素組成物。然而，這些專利文獻未提出在根據人體的溫度及pH值的適合條件下的顯著效應。特定言之，當局部麻醉劑包含於醫藥調配物中時，已知的是所述局部麻醉劑影響肉毒桿菌毒素蛋白的穩定性。然而，為便於患者及醫師，將非常需要含有局部麻醉劑的穩定肉毒桿菌毒素調配物。

因此，本發明是關於一種含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法。

根據本發明的包括肉毒桿菌毒素的醫藥組成物可含有精胺酸（arginine）、麩胺酸或天冬胺酸作為穩定劑，或可含有葡萄糖酸內酯（gluconolactone）緩衝劑或酒石酸（tartaric acid）緩衝劑作為穩定性緩衝劑，或可含有用於肉毒桿菌毒素的局部麻醉劑。且其在根據人體的溫度及pH值的適合條件下對肉毒桿菌毒素的穩定性呈現顯著效應。因此，預期本發明的醫藥組成物將非常有助於肉毒桿菌毒素安全及適宜的醫療用途。

[技術問題]
已做出本發明以便解決先前技術中出現的上文所描述的問題，且本發明的目標是提供含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法。

然而，藉由本發明達成的技術目標不限於上述技術目標，且上文未提及的其他目標可自以下描述中由本領域的技術人員清晰地理解。

[技術解決方案]
下文中，將參看圖式描述本文中所描述的各種實施例。在以下描述中，闡述諸如特定組態、組成物以及製程等的眾多特定細節，以便提供對本發明的透徹理解。然而，某些實施例可在無這些特定細節中的一或多者的情況下或與其他已知方法及組態組合而加以實踐。在其他情況下，在特定細節中未描述已知製程及製備技術，以便不非必要地混淆本發明。貫穿本說明書參考「一個實施例」或「一實施例」意謂結合實施例描述的特定特點、組態、組成物或特徵包含於本發明的至少一個實施例中。因此，貫穿本說明書在不同位置中的片語「在一個實施例中」或「一實施例」的出現不一定參考本發明的同一實施例。另外，特定特點、組態、組成物或特徵可在一或多個實施例中以任何適合的方式組合。

除非在本說明書中另外規定，否則本說明書中所用的全部科學及技術術語具有與本發明涉及的技術領域的技術人員所通常理解的相同的含義。

在本發明的一個實施例中，「肉毒桿菌毒素」為藉由細菌肉毒梭菌（Clostridium botulinum ）產生的神經毒性蛋白質。梭菌屬具有根據其形態學及功能分組的大於127種物種。厭氧的革蘭氏陽性細菌肉毒梭菌產生強效的多肽神經毒素（肉毒桿菌毒素），其造成在人體及動物體內稱為肉毒中毒的神經性麻痹疾病。肉毒梭菌的孢子見於土壤中且可在家庭式罐頭工廠的未經恰當除菌及密封的食物容器中生長，其導致多種情況的肉毒中毒。肉毒中毒症狀通常在食用經肉毒梭菌培養物或孢子感染的食物18小時至36小時後出現。顯然，肉毒桿菌毒素可不減毒（unattenuated）地穿過腸道膜且展示對膽鹼激導性運動神經元的高親和性。肉毒桿菌毒素中毒的症狀可自行走、吞咽以及言語困難發展至呼吸肌麻痹及死亡。

A型肉毒桿菌毒素為人類已知的最具殺傷性的天然生物因子。約50皮克（picogram）的可商購A型肉毒桿菌毒素（經純化神經毒素複合物）為LD50（即，1單元）。引起關注地，以莫耳計，A型肉毒桿菌毒素比白喉大約18億倍殺傷性，比氰化鈉大約6億倍殺傷性，比眼鏡蛇毒素大約3千萬倍殺傷性且比霍亂大約1200萬倍殺傷性。在腹膜內注射至每只重18公克至20公克的瑞士韋伯斯特（Swiss Webster）雌性小鼠中後將一個單元（U）的肉毒桿菌毒素定義為LD50。

免疫學上不同的7種肉毒桿菌神經毒素已大體上特徵化為A血清型肉毒桿菌神經毒素、B血清型肉毒桿菌神經毒素、C1血清型肉毒桿菌神經毒素、D血清型肉毒桿菌神經毒素、E血清型肉毒桿菌神經毒素、F血清型肉毒桿菌神經毒素以及G血清型肉毒桿菌神經毒素，其中的每一者藉由用類型特異性抗體中和來區別。不同血清型的肉毒桿菌毒素在其作用的動物物種上及在其引起的麻痹的嚴重程度及持續時間上不同。舉例而言，已確定的是如藉由大鼠中產生的麻痹的比率所量測，A型肉毒桿菌毒素比B型肉毒桿菌毒素更強效500倍。另外，已確定B型肉毒桿菌毒素在480 U/kg （其為A型肉毒桿菌毒素的靈長類動物LD50的約12倍）的劑量下對靈長類動物無毒性。肉毒桿菌毒素顯然與膽鹼激導性運動神經元以高親和性結合，易位至神經元中且阻斷乙醯膽鹼的釋放。額外攝取可經由低親和力受體以及藉由吞噬作用及胞飲作用而發生。

無論血清型如何，毒素中毒的分子機制看起來類似且涉及至少3個步驟。在過程的第一步驟中，毒素經由重鏈（H鏈或HC）與細胞表面受體之間的特定相互作用而結合至標靶神經元的突觸前膜。受體被認為對每一類型的肉毒桿菌毒素及對破傷風毒素而言是不同的。HC的羧基末端區段對肉毒桿菌毒素靶向至細胞表面是重要的。

在第二步驟中，肉毒桿菌毒素穿過標靶細胞的質膜。肉毒桿菌毒素首先經由受體介導的內吞作用由細胞吞噬，且含有肉毒桿菌毒素的核內體形成。毒素隨後逸出核內體至細胞的細胞質中。此步驟被認為是由重鏈（HN）的胺基末端區段介導，所述重鏈的胺基末端區段回應於約5.5或低於5.5的pH值而觸發毒素的構形改變。核內體已知具有減小核內體內pH值的質子泵。構形變化暴露毒素中的疏水性殘基，其容許肉毒桿菌毒素將自身嵌入在核內體膜中。肉毒桿菌毒素（或至少肉毒桿菌毒素的輕鏈）隨後經由核內體膜易位至細胞質中。

肉毒桿菌毒素活性的機制的最後一個步驟與結合重鏈及輕鏈的二硫鍵的減少有關。肉毒桿菌及破傷風毒素的整個毒性活性包含於全毒素的輕鏈中；所述輕鏈為鋅（Zn⁺⁺ ）內肽酶，其選擇性地裂解含有神經傳遞質的囊泡與質膜的細胞質表面的識別及停靠以及囊泡與質膜的融合必需的蛋白質。破傷風神經毒素、B型肉毒桿菌毒素、D型肉毒桿菌毒素、F型肉毒桿菌毒素以及G型肉毒桿菌毒素引起突觸泡蛋白（亦稱作囊泡相關膜蛋白（vesicle-associated membrane protein；VAMP））、突觸體膜蛋白的分解。作為這些裂解事件中的任一者結果，存在於突觸囊泡的細胞質表面處的大多數VAMP經移除。A血清型及E血清型裂解SNAP-25。最初認為C1血清型裂解突觸蛋白，但發現C1血清型裂解突觸蛋白及SNAP-25。除B型（及破傷風毒素）裂解相同鍵外，肉毒桿菌毒素中的每一者特異性地裂解不同鍵。這些裂解中的每一者阻斷囊泡膜停靠的過程，進而防止囊泡內含物的胞外分泌。

肉毒桿菌毒素已用於臨床配置中以治療以高度活化骨架肌肉（即，運動病症）為特徵的肌神經疾病。在1989年，A型肉毒桿菌毒素複合物經美國食品與藥物管理局批准用於治療眼瞼痙攣、斜視以及半面部痙攣。隨後，A型肉毒桿菌毒素亦經FDA批准用於治療頸肌張力障礙及用於治療眉間細紋，且B型肉毒桿菌毒素經批准用於治療頸肌張力障礙。非A型肉毒桿菌毒素血清型與A型肉毒桿菌毒素相比顯然具有更低的效力和/或更短的活性持續時間。外周肌內A型肉毒桿菌毒素的臨床效應通常在注射一週內見效。A型肉毒桿菌毒素的單次肌內注射所致的症狀緩解的典型持續時間平均約3個月，但是已報告了顯著更長時間段的治療活性。

儘管所有肉毒桿菌毒素血清型明顯抑制肌神經接頭處的神經傳遞質乙醯膽鹼的釋放，但所述肉毒桿菌毒素血清型藉由影響不同神經分泌蛋白及在不同位點處裂解這些蛋白質而具有此效應。舉例而言，A型肉毒桿菌及E型肉毒桿菌兩者均裂解25千道耳頓突觸體相關蛋白（SNAP-25），但其靶向此蛋白質內的不同胺基酸序列。B型肉毒桿菌毒素、D型肉毒桿菌毒素、F型肉毒桿菌毒素以及G型肉毒桿菌毒素對囊泡相關膜蛋白（VAMP，亦稱作突觸泡蛋白）起作用，其中每一種血清型在不同位點處裂解蛋白質。最後，C1型肉毒桿菌毒素裂解突觸蛋白及SNAP-25兩者。作用機制中的這些差異可影響不同肉毒桿菌毒素血清型的相對效力和/或作用持續時間。特定言之，肉毒桿菌毒素的受質可見於多種不同細胞類型中。

對於所有七種已知肉毒桿菌毒素血清型，肉毒桿菌毒素的分子量為約150千道耳頓（kDa）。引起關注地，肉毒桿菌毒素由梭菌細菌釋放作為複合物，所述複合物包括150千道耳頓肉毒桿菌毒素蛋白質分子以及相關的非毒素蛋白質。因此，A型肉毒桿菌毒素複合物可藉由梭菌細菌產生為900千道耳頓、500千道耳頓或300千道耳頓形式。B型肉毒桿菌毒素及C1型肉毒桿菌毒素顯然經產生為僅700千道耳頓或500千道耳頓複合物。D型肉毒桿菌毒素經產生為300千道耳頓或500千道耳頓複合物。最後，E型肉毒桿菌毒素及F型肉毒桿菌毒素經產生為僅大致300千道耳頓複合物。所述複合物（即，分子量大於約150千道耳頓）被認為含有非毒素血球凝集素蛋白、非毒素及無毒性的非血球凝集素蛋白。這兩種非毒素蛋白質（其以及肉毒桿菌毒素分子包括相關神經毒素複合物）可用以提供抵抗肉毒桿菌毒素分子變性的穩定性且在肉毒桿菌毒素經攝取時提供保護以不受消化酸影響。另外，較大（大於約150千道耳頓分子量）肉毒桿菌毒素複合物有可能引起肉毒桿菌毒素遠離肉毒桿菌毒素複合物的肌內注射位點的較慢擴散速率。

活體外研究已指示了肉毒桿菌毒素抑制鉀陽離子引發的乙醯膽鹼及正腎上腺素兩者自腦幹組織的原代細胞培養物的釋放。另外，已報告了肉毒桿菌毒素抑制脊髓神經元的原代培養物中的甘胺酸及麩胺酸兩者的所引起釋放，且在腦突觸體製劑中，肉毒桿菌毒素抑制神經傳遞質乙醯膽鹼、多巴胺、正腎上腺素、CGRP、P物質以及麩胺酸中的每一者的釋放。因此，當使用足夠濃度時，刺激引起的大多數神經傳遞質釋放可藉由肉毒桿菌毒素阻斷。

A型肉毒桿菌毒素可藉由在醱酵器中建立及生長肉毒梭菌培養物且接著根據已知程序收穫及純化經醱酵混合物而獲得。所有肉毒桿菌毒素血清型最初經合成為非活性單鏈蛋白質，所述非活性單鏈蛋白質必須由蛋白酶裂解或切斷以變為神經活性。產生A血清型肉毒桿菌毒素及G血清型肉毒桿菌毒素的細菌菌株具有內源性蛋白酶，且因此，A血清型及G血清型可自細菌培養物中回收大部分其活性形式。相反地，C1血清型肉毒桿菌毒素、D血清型肉毒桿菌毒素以及E血清型肉毒桿菌毒素藉由非蛋白水解菌株合成且因此當自培養物回收時通常不活化。B血清型及F血清型藉由蛋白水解及非蛋白水解菌株兩者產生，且因此可以活性或非活性形式回收。然而，甚至產生（例如）B型血清型肉毒桿菌毒素的蛋白水解菌株亦僅裂解所產生毒素的一部分。切斷分子與未切斷分子的準確比例視培養的長度及培養物的溫度而定。因此，某一百分比的（例如）肉毒桿菌毒素B型毒素的任何製劑可能是非活性的，有可能是B型肉毒桿菌毒素與A型肉毒桿菌毒素相比的已知明顯較低效力的原因。在臨床製劑中非活性肉毒桿菌毒素分子的存在將增加製劑的總體蛋白質負載，其已與增大的抗原性有關，但對其臨床效力沒有幫助。另外，已知的是B型肉毒桿菌毒素在肌內注射後具有較短持續時間的活性，且在相同劑量水準下亦比A型肉毒桿菌毒素更不具效力。

高質量晶體A型肉毒桿菌毒素可產生自肉毒梭菌的霍爾A（Hall A）菌株，其特徵為≥3×10⁷ U/mg、A260/A278小於0.60以及在凝膠電泳上呈現獨特的條帶圖案。已知尚茨（Schantz）法可用於獲得晶體A型肉毒桿菌毒素。一般而言，A型肉毒桿菌毒素複合物可藉由在適合介質中培養A型肉毒梭菌而自厭氧醱酵分離及純化。已知方法亦可在分離出非毒素蛋白質後用以獲得純肉毒桿菌毒素，例如：經純化A型肉毒桿菌毒素，具有大致150千道耳頓分子量，具有1-2×10⁸ LD50 U/mg或大於1-2×10⁸ LD50 U/mg的特定效力；經純化B型肉毒桿菌毒素，具有大致156千道耳頓分子量，具有1-2×10⁸ LD50 U/mg或大於1-2×10⁸ LD50 U/mg的特定效力；以及經純化F型肉毒桿菌毒素，具有大致155千道耳頓分子量，具有1-2×10⁷ LD50 U/mg或大於1-2×10⁷ LD50 U/mg的特定效力。

肉毒桿菌毒素和/或肉毒桿菌毒素複合物可購自本領域中已知的化合物製造商，且純肉毒桿菌毒素亦可用於製備醫藥組成物。

如同酶一樣，一般而言，肉毒桿菌毒素（其為細胞內肽酶）的生物活性至少部分地視其三維構形而定。因此，A型肉毒桿菌毒素藉由加熱、各種化學品表面拉伸以及表面乾燥來解毒。另外，已知的是除非存在適合的穩定劑，否則將藉由已知培養、醱酵以及純化獲得的肉毒桿菌毒素複合物稀釋至用於醫藥組成物調配物的極低毒素濃度引起毒素的快速解毒。毒素自毫克量稀釋至溶液含有奈克每毫升存在明顯困難，因為特定毒性在此類極大稀釋後快速損耗。由於肉毒桿菌毒素可在含有毒素的醫藥組成物經調配數月或數年後使用，因此毒素應經適合的穩定劑穩定化。因此，如本發明中所揭露，理想穩定劑技術的研發為將肉毒桿菌毒素的活體內釋放控制至緩慢釋放形式所必需。

已報告了A型肉毒桿菌毒素已如下用於臨床配置中：

活體內投與的肉毒桿菌毒素的肌內注射的常見持續時間為通常約3個月至4個月。然而，在一些情況下，A亞型肉毒桿菌毒素可具有長達12個月的功效（歐洲神經學雜誌（European J. Neurology ）6 (增刊4):S111-S1150:1999），且當用於治療腺體時，例如在多汗症的治療中，在某些情況下具有長達27個月的效力。

除了在外周位置具有藥理學作用之外，肉毒桿菌毒素亦可對中樞神經系統具有抑制效應。Weigand等人，瑙約-斯密特貝爾格藥理學文獻（Nauny -Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. ）1976; 292, 161-165及Habermann，瑙約-斯密特貝爾格藥理學文獻1974; 281, 47-56的研究顯示肉毒桿菌毒素能夠藉由逆行輸送而上升至脊椎區域。如此，在外周位置（例如肌內）注射的肉毒桿菌毒素可逆行運輸至脊髓。

肉毒桿菌毒素亦已經提出用於或已用於治療皮膚、骨骼以及肌腱創傷（美國專利第6,447,787號）；鞘內疼痛（參見美國專利第6,113,915號）；各種自主神經疾病，包含汗腺疾病（參見例如美國專利第5,766,605號及Goldman（2000），美容整形外科（Aesthetic Plastic Surgery）7月-8月 24(4):280-282）；緊張性頭痛（美國專利第6,458,365號）；偏頭痛（美國專利第5,714,468號）；術後疼痛及內臟疼痛（美國專利第6,464,986號）；毛髮生長及毛髮保持（美國專利第6,299,893號）；牛皮癬及皮膚炎（美國專利第5,670,484號）；受傷肌肉（美國專利第6,423,319號）；各種癌症（美國專利第6,139,845號及美國專利第6,063,768號），平滑肌疾病（美國專利第5,437,291號）；神經卡壓綜合症（美國專利申請案2003-0224019）；痤瘡（WO 03/011333）；神經性炎症（美國專利第6,063,768號）；眼睛疾病（參見美國專利第6,265,379號）；胰臟疾病（參見美國專利第6,143,306號及美國專利第6,261,572號）；前列腺疾病，包含前列腺增生、前列腺癌以及尿失禁（參見美國專利第6,365,164號及美國專利第6,667,041號以及Doggweiler R.等人，A型肉毒桿菌毒素引起大鼠前列腺彌漫性及高選擇性萎縮（Botulinum toxin type A causes diffuse and highly selective atrophy of rat prostate ），Neurourol Urodyn 1998; 17(4):363）；肌肉纖維疼痛（美國專利第6,623,742號），以及梨狀肌綜合症（參見Childers等人（2002），美國物理醫學與康復雜誌（American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation），81:751-759）。

美國專利第5,989,545號揭露與特定靶向部分以化學方式結合或以重組方式稠合的經修改梭菌神經毒素或其片段（較佳地肉毒桿菌毒素）可用於藉由向脊髓投與試劑來治療疼痛。另外，已揭露的是經靶向肉毒桿菌毒素（即，具有非天然結合部分）可用於治療各種病症（參見WO 96/33273；WO 99/17806；WO 98/07864；WO 00/57897；WO 01/21213；WO 00/10598）。

另外，肉毒桿菌毒素已注射至胸肌中以控制胸肌痙攣（Senior M.，保妥適與胸肌下植入物插入後的肉毒桿菌毒素以及胸肌痙攣處理（Botox and the management of pectoral spasm after subpectoral implant insertion），整形以及重建手術（Plastic and Recon Surg），2000年7月，224-225）。可控釋放的毒素植入劑是已知的（參見美國專利第6,306,423號及美國專利第6,312,708號），經皮肉毒桿菌毒素投與亦為已知的（美國專利申請第10/194,805號）。已知的是肉毒桿菌毒素可用以：使嘴的咀嚼肌或咬肌弱化，使得自身造成的創傷及產生的潰爛可癒合（Payne M.等人，肉毒桿菌毒素用作萊施-奈恩綜合症自殘的新穎療法（Botulinum toxin as a novel treatment for self mutilation in Lesch-Nyhan syndrome），神經學年度期刊（Ann Neurol）2002年9月; 52 (3增刊1):S157）；允許良性囊性病變或腫瘤的恢復（Blugerman G.等人，多發性小汗腺汗囊腫：利用肉毒桿菌毒素的新治療選擇方案（Multiple eccrine hidrocystomas: A new therapeutic option with botulinum toxin），皮膚病外科（Dermatol Surg）2003年5月; 29(5):557 -9）；治療肛裂（Jost W.，肉毒桿菌毒素用於肛裂的十年經驗（Ten years' experience with botulinum toxin in anal fissure），直腸疾病國際期刊（Int J Colorectal Dis）2002年9月; 17(5):298-302）；以及治療某些類型的異位性皮膚炎（Heckmann M.等人，治療單純性苔癬的A型肉毒桿菌毒素注射：開放試驗研究（Botulinum toxin type A injection in the treatment of lichen simplex: An open pilot study），美國皮膚病學會雜誌（J Am Acad Dermatol）2002年4月; 46(4):617 -9）。

另外，肉毒桿菌毒素可具有減少大鼠福馬林模型中引發的發炎性疼痛的效應（Aoki K.等人，皮下保妥適的抗傷痛感受效應的機制：外周及中樞傷痛感受過程的抑制（Mechanisms of the antinociceptive effect of subcutaneous Botox: Inhibition of peripheral and central nociceptive processing），頭痛（Cephalalgia）2003年9月; 23(7):649）。此外，已報告了肉毒桿菌毒素神經阻斷會引起表皮厚度的減小（Li Y等人，感覺及運動去神經對大鼠足部光滑皮膚的表皮厚度的影響（Sensory and motor denervation influences epidermal thickness in rat foot glabrous skin），實驗神經學（Exp Neurol）1997; 147:452-462）。最後，已知向足部投與肉毒桿菌毒素來治療足部過量出汗（Katsambas A.等人，足部皮膚病：未經批准的療法（Cutaneous diseases of the foot: Unapproved treatments），臨床皮膚病（Clin Dermatol）2002年11月-12月; 20(6):689-699；Sevim, S.等人，用於掌蹠多汗症的肉毒桿菌毒素-A療法（Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantar hyperhidrosis），比利時神經學報（Acta Neurol Belg）2002年12月; 102(4):167 -70）、痙攣性腳趾（Suputtitada, A.，痙攣性腳趾治療中的局部A型肉毒桿菌毒素注射（Local botulinum toxin type A injections in the treatment of spastic toes），美國物理醫學與康復雜誌（Am J Phys Med Rehabil）2002年10月; 81(10):770-5）、特發性腳趾行走（Tacks, L.等人，特發性腳趾行走：用肉毒桿菌毒素A注射進行的治療（Idiopathic toe walking: Treatment with botulinum toxin A injection），發育醫學與兒童神經病學（Dev Med Child Neurol）2002; 44(增刊91):6）以及足肌張力障礙（Rogers J.等人，足肌張力障礙中的肉毒桿菌毒素A注射（Injections of botulinum toxin A in foot dystonia），神經學（Neurology）1993年4月; 43(4增刊2)）。

破傷風毒素以及其衍生物（即，具有非天然靶向部分）、片段、雜合體以及嵌合體亦可具有治療效用。破傷風毒素與肉毒桿菌毒素具有許多類似性。因此，破傷風毒素及肉毒桿菌毒素兩者均為由緊密相關的梭菌屬物種（分別，破傷風梭菌（Clostridium tetani ）及肉毒梭菌）得到的多肽。另外，破傷風毒素及肉毒桿菌毒素兩者均為由利用單個二硫鍵與重鏈（分子量：約100千道耳頓）共價結合的輕鏈（分子量：約50千道耳頓）構成的雙鏈蛋白質。因此，破傷風毒素的分子量及7種肉毒桿菌毒素（非複合的）中的每一者的分子量為約150千道耳頓。此外，對於破傷風毒素及肉毒桿菌兩者，輕鏈具有呈現細胞內生物（蛋白酶）活性的域，而重鏈包括受體結合（免疫原性）域及細胞膜移位域。

此外，破傷風毒素及肉毒桿菌毒素兩者呈現對突觸前膽鹼激導性神經元的表面上的神經節苷脂受體的特定高親和力。在外周膽鹼激導性神經元中，受體介導的對破傷風毒素的內吞作用引起逆行軸突運輸，從而阻擋自中樞突觸的抑制性神經傳遞質的釋放，且導致痙攣性麻痹。相反地認為，在外周膽鹼激導性神經元中受體介導的對肉毒桿菌毒素的內吞作用幾乎不引起逆行運輸、抑制自中樞突觸的乙醯膽鹼胞外分泌以及弛緩性麻痹。然而，每一最近報告已提出，肉毒桿菌毒素亦可沿軸突進行逆行運輸且有可能抑制中樞突觸中的乙醯膽鹼釋放（Bomba-Warczak等人，破傷風毒素以及肉毒桿菌神經毒素A及D在中樞神經元中的神經元間傳遞及遠端作用（Interneuronal Transfer and Distal Action of Tetanus Toxin and Botulinum Neurotoxins A and D in Central Neurons），細胞報告（Cell Reports），2016年8月; 16，1974-1987）。

最後，破傷風毒素及肉毒桿菌毒素在生物合成及分子架構兩者上彼此類似。因此，破傷風毒素與A型肉毒桿菌毒素的蛋白質序列之間存在總共34%一致性，且就一些功能域而言存在高至62%的序列一致性（Binz T.等人，A型肉毒桿菌神經毒素的完整順序及與其他梭菌神經毒素的比較（The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins），生物化學雜誌（J Biological Chemistry）265(16); 9153-9158:1990）。

在本發明的一個實施例中，「乙醯膽鹼」為膽鹼與乙酸的酯，其為最初已知的神經傳遞質。其分散遍及神經元，且具有化學式C₇ H₁₆ NO₂ 及146.21千道耳頓的分子量。

通常，哺乳動物神經系統中的各類型的神經元僅釋放單一類型的小分子神經傳遞質，但跡象表明相同神經元可釋放若干種神經調節物質。神經傳遞質乙醯膽鹼由大腦的許多區域中的神經元分泌，特異性地由以下分泌：運動皮質的大錐體細胞、基底神經節中的若干不同神經元、支配骨骼肌的運動神經元、自主神經系統（交感神經及副交感神經兩者）的節前神經元、肌梭纖維的袋1纖維、副交感神經系統的節後神經元以及交感神經系統的節後神經元中的一些。實質上，僅汗腺、立毛肌以及少數血管的節後交感神經纖維為膽鹼激導性，因為交感神經系統的大多數節後神經元分泌神經傳遞質去甲腎上腺素。在大多數情形中，乙醯膽鹼具有興奮性效應。然而，已知的是乙醯膽鹼在一些外周副交感神經末梢處具有抑制性效應（例如，藉由迷走神經抑制心率）。

自主神經系統的傳出信號經由交感神經系統或副交感神經系統傳遞至身體。交感神經系統的節前神經元自位於脊髓的中間側角中的節前交感神經元細胞體延伸。自所述細胞體延伸的節前交感神經纖維與位於脊柱旁交感神經節中或脊柱前神經節中的節後神經元接觸。由於交感神經系統及副交感神經系統兩者的節前神經元為膽鹼激導性，因此對神經節施加乙醯膽鹼將使交感節後神經元及副交感節後神經元兩者興奮。

乙醯膽鹼活化兩種類型的受體，即蕈毒鹼受體及菸鹼受體。蕈毒鹼受體見於由副交感神經系統的節後神經元刺激的全部效應細胞中以及由交感神經系統的節後膽鹼激導性神經元刺激的那些效應細胞中。菸鹼受體見於腎上腺髓質中，以及自主神經節內，其在交感系統及副交感系統兩者的節前神經元與節後神經元之間的突觸處的節後神經元的細胞表面上。菸鹼受體亦見於許多非自主神經末梢中，例如肌神經接頭處的骨胳肌纖維的膜中。

當小而空的細胞內囊泡與突觸前神經元細胞膜融合時，乙醯膽鹼自膽鹼激導性神經元釋放。多種非神經元分泌細胞，諸如腎上腺髓質（以及PC12細胞株）及胰島細胞，分別自大的緻密核心囊泡釋放兒茶酚胺及副甲狀腺激素。PC12細胞株為廣泛用作研究交感腎上腺進展的組織培養模型的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞的殖株。當去神經細胞經透性化（如藉由電致孔（electroporation））或直接經注射毒素時，肉毒桿菌毒素抑制來自兩種類型的活體外細胞的兩種類型的化合物的釋放。亦已知的是肉毒桿菌毒素阻斷神經傳遞質麩胺酸自皮層突觸體細胞培養物釋放。

肌神經接頭藉由軸突與肌肉細胞接近而形成於骨胳肌中。經由神經系統傳遞的信號引起末端軸突處的動作電位，伴有離子通道的活化且引起神經傳遞質乙醯膽鹼自神經元內突觸囊泡釋放，例如在肌神經接頭的運動終板處。乙醯膽鹼穿過細胞外間隙以與肌肉終板的表面上的乙醯膽鹼受體蛋白結合。在足夠結合已出現後，肌肉細胞的動作電位引起特定膜離子通道改變，從而引起肌肉細胞收縮。乙醯膽鹼隨後自肌肉細胞釋放且藉由細胞外間隙中的膽鹼酯酶代謝。代謝物再循環回到末端軸突中以用於再處理為更多乙醯膽鹼。

在本發明的一個實施例中，術語「穩定劑（stabilizing agent/stabilizer）」意謂經添加以增大活性成份的穩定性且防止活性成份氧化、結晶的任何添加劑，且只要醫藥學上可接受，其不受特定限制。穩定劑的穩定效應的評估可在不限制溫度的情況下執行，但應理解，穩定效應在較低溫度下維持比高溫下更長時間段。因此，低溫下的長期穩定性效力的評估可短時間由在高溫下執行的「加速測試」替換。舉例而言，在37℃下評估特定穩定劑的穩定性效應9天的結果與在4℃下評估3個月的結果相同，且在37℃下評估特定穩定劑的穩定性效應74天的結果與在24℃下評估24個月的結果相同（http://iso-inc.com/medical-package-testing/ accelerated-aging.html）。

在本發明中，穩定劑經添加以保持或維持包括肉毒桿菌毒素的梭菌型神經毒素蛋白的生物活性，且較佳地選自精胺酸、甲硫胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、葡萄糖酸內酯、酒石酸或連二硫酸鈉，且更佳地精胺酸、天冬胺酸或麩胺酸，但不限於此。

在本發明的一個實施例中，術語「穩定性緩衝劑（stabilization buffer/stabilization buffering agent）」意謂穩定劑及作為緩衝劑的效應兩者。其可藉由將具有穩定效應的物質添加至常用緩衝劑來製備，通過包含額外穩定劑可預期穩定協同效應。在本發明中，穩定性緩衝劑較佳地為葡萄糖酸內酯緩衝劑，或酒石酸緩衝劑，但不限於此。

在本發明的一個實施例中，「精胺酸（arginine）」為一種基礎胺基酸，具有分子式C₆ H₁₄ N₄ O₂ 及174.21的分子量，且為水溶性的。此基團縮寫為『Arg』且由單個字母『R』表示。其由M. J. S. Schulze及E. Steiger首先自羽扇豆（一種豆）的幼苗分離。因為其硝酸鹽為銀（argent）所以命名精胺酸。L-精胺酸作為構成蛋白質的胺基酸之一而存在，且見於魚的精子中存在的蛋白質魚精蛋白中。構成鯡魚及鮭魚中的胺基酸的約70%為精胺酸。在植物種子中，精胺酸以自由狀態存在。精胺酸由於其胍基而具有強鹼性。其可經量化，因為當其與α-萘酚及鹼性次氯酸鹽反應時，其展示其獨特的紅顏色。在活體內代謝路徑中，精胺酸為由H. A. Krebs等人發現的鳥胺酸（ornithine）途徑的組分，且藉由精氨酸酶的作用而裂解為尿素及鳥胺酸。精胺酸產生自瓜胺酸（citrulline）及天冬氨酸（asparaginic acid）。其為成人的非必需胺基酸，但為嬰兒的必需胺基酸。其防止氨或大量胺基酸的毒性。精氨酸酶存在於大腦中且控制精胺酸的量，所述精胺酸為γ-胍基丁酸（γ-guanidinobutyric acid）的前驅體。在無脊椎動物中，精胺酸以磷酸精胺酸形式存在，在與磷酸原的肌肉收縮中起重要作用，且亦作為特定的胍基（quanidine base）（magmatin，章魚鹼（octopine））的前驅體而廣泛存在。

在本發明的一個實施例中，「麩胺酸（glutamic acid）」為一種胺基酸，且亦稱為「麩胺酸」，且由基團「Glu」或「E」表示，且分子式為C₅ H₉ NO₄ 。其首次在小麥麩質的水解產物中發現。其為最豐富的蛋白質胺基酸之一，尤其在小麥麥膠蛋白中，含有43.7%所述蛋白質。有可能藉由飽和氯化氫自小麥、大豆等的蛋白質的水解產物分離氫氯化物。

在本發明的一個實施例中，「天冬胺酸（aspartic acid）」為一種胺基酸，且亦稱為「天冬胺酸」，且由基團「Asp」或「D」表示且分子式為C₄ H₇ NO₄ 。其為構成蛋白質的胺基酸之一。其為在分子中具有兩個羧基（-COOH）的酸性胺基酸，且自然地歸類為非必需胺基酸。類似麩醯胺酸，已知其在活體內胺基酸的轉氨作用中起主要作用。

在本發明的一個實施例中，「葡萄糖酸內酯（gluconolactone）」意謂不具有氣味或具有極小氣味的白色晶體或結晶粉末，初嘗為甜味，後嘗為微酸味。化學式為C₆ H₁₀ O₆ 。其為合成烘焙劑，易溶於水且微溶於乙醇，但不溶於醚。水溶液緩慢水解以形成葡糖酸、δ-內酯以及γ-內酯當中的平衡態，且溫度及pH值越高，越快出現水解。在25℃室溫下約2小時後，其完全地水解為具有55-60%葡糖酸及40-50%內酯的溶液。儘管葡萄糖酸-δ-內酯（glucono-δ-lactone）並不為酸，但其經水解以溶解於水中從而呈酸性。因此，較佳地使用其作為酸性改質劑以用於膨潤劑，且即使其與碳酸氫鈉（sodium hydrogen carbonate）（碳酸氫鈉（sodium bicarbonate））混合亦不發生反應。另外，由於水解緩慢發生，因此當用作酸性改質劑以用於鵬潤劑時，其可與碳酸氫鈉反應以使產品具有非常精細的質地。此外，其具有抗氧化能力，因為其與金屬形成複合物。儘管其不為酸，但其用於降低經軟化產品的pH值，因為水溶液藉由加熱而呈酸性。

在本發明的一個實施例中，「酒石酸（tartaric acid）」為藉由用將碳酸鈣添加至錫形成的沈澱物處理硫酸獲得的有機化合物。其亦稱作二氧丁二酸（dioxysuccinic acid），因為其包含於製作葡萄酒時沈澱的錫中。由式C₄ H₆ O₆ 表示。右旋L-酒石酸、左旋D-酒石酸、同樣存在的外消旋酒石酸（亦稱作葡萄酸）以及不具有光學活性的間酒石酸存在若干異構體。當自然存在時，L-酒石酸占主導，且其在植物系統中廣泛分佈為游離酸、鈣鹽以及鉀鹽。

在本發明的一個實施例中，術語「局部麻醉劑（local anesthetic）」為以化學及可逆方式阻斷支配身體的一部分的位點的神經傳導的藥物。使用此藥物的獲得麻醉劑效應的麻醉劑方法稱作局部麻醉或區域麻醉。其對全部神經系統及神經纖維起作用以阻斷神經興奮的傳導且使神經分佈的區域的感覺及動作麻痹。

局部麻醉劑分為酯型及醯胺型。酯型由血漿膽鹼酯酶水解，且由於分解產物之一的對胺基苯甲酸（p-aminobenzoic acid；PABA），有可能導致過敏，因此應注意連續使用。其具有強麻醉劑作用且減緩血漿中的分解，使得作用時間為長且系統毒化頻率為高。酯型局部麻醉劑包含可卡因、普魯卡因、氯普魯卡因氫氯化物以及四卡因。醯胺型大部分在肝中代謝且不產生胺基苯甲酸，因此幾乎不存在過敏性反應物。醯胺型局部麻醉劑包含利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、布比卡因、羅比卡因、苯佐卡因以及阿替卡因。在本發明中，局部麻醉劑不限於所述系列及類型，且只要其作用於神經纖維以阻斷神經興奮的傳導就可不受限制地經使用。

在本發明的一個實施例中，術語「醫藥組成物（pharmaceutical composition）」指代出於特定目的投與的組成物。出於本發明的目的，根據本發明的醫藥組成物為包括精胺酸（arginine）、麩胺酸（glutamic acid）或天冬胺酸（aspartic acid）作為穩定劑或包括葡萄糖酸內酯緩衝劑或酒石酸緩衝劑作為穩定性緩衝劑的肉毒桿菌毒素組成物，且可包括此投與中涉及的蛋白質及醫藥學上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。術語「醫藥學上可接受的」載劑或賦形劑意謂經政府的監管機構批准或在藥典（Pharmacopeia）或其他一般公認的藥典中列出適用於哺乳動物，且更特定言之適用於人類。對於非經腸投與（parenteral administration），本發明的醫藥組成物可呈油性或水性載劑中的懸浮液、溶液或乳液形式，且可以固體或半固體形式製備。更佳地，其可為液體形式。另外，本發明的醫藥組成物可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑、增溶劑及/或分散劑，且可經除菌。醫藥組成物在製造及儲存條件下可為穩定的，且可受保護免於微生物（諸如細菌或真菌）的污染作用。替代地，根據本發明的包括精胺酸作為穩定劑的肉毒桿菌毒素組成物在使用之前可呈具有適合載劑的無菌復原用散劑形式。醫藥組成物可以安瓿或其他單位劑量容器中或多劑量容器中的單位劑量形式、微針貼劑存在。替代地，醫藥組成物可儲存於僅需要在即將使用之前添加無菌液體載劑（例如水）以用於注射的凍乾（freeze-dried）（凍乾（lyophilized））條件下。可自無菌粉末、顆粒以及錠劑製備即用型注射溶液及懸浮液。

在一些非限制性實施例中，根據本發明的含有精胺酸作為穩定劑的肉毒桿菌毒素組成物可調配為液體，或可以液體中的微球形式包含。在任何非限制性實施例中，含有精胺酸作為穩定劑的肉毒桿菌毒素組成物可含有濃度為0.001 U/kg至100,000 U/kg的肉毒桿菌毒素或醫藥學上可接受的化合物及/或其混合物。在任何非限制性實施例中，適用於含有精胺酸作為穩定劑的肉毒桿菌毒素組成物的賦形劑包含防腐劑、懸浮劑、穩定劑、染料、緩衝劑、抗細菌劑、抗真菌劑、等張劑（例如，糖或氯化鈉）以及額外穩定劑。如本文中所使用，術語「額外穩定劑（additional stabilizer）」指代除本發明的穩定劑（精胺酸、麩胺酸或天冬胺酸）或穩定性緩衝劑（葡萄糖酸內酯緩衝劑或酒石酸緩衝劑）以外另外含有的穩定劑。所述「額外穩定劑」只要其大體上在本領域中已知就可不受限制地使用。根據本發明的醫藥組成物亦可含有一或多種醫藥學上可接受的載劑。載劑可為溶劑或分散介質。醫藥學上可接受的載劑的非限制性實例包含水、生理鹽水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇以及液體聚乙二醇）、油以及其適合的混合物。應用於本發明的醫藥組成物的除菌技術的非限制性實例包含經由細菌截留過濾器過濾、終端除菌、除菌劑的併入、照射、除菌氣體照射、加熱、真空乾燥以及冷凍乾燥。

在本發明的一個實施例中，術語「投與」意謂藉由任何適合的方法向患者引入本發明的組成物。本發明的組成物只要其可達到標靶組織就可經由任何常用途徑投與。本發明的組成物可經口、腹膜內、經靜脈內、肌內、皮下、皮內、鼻內、肺內、直腸內或鞘內投與。然而，根據本發明的肉毒桿菌毒素組成物最佳地藉由肌內注射投與為液體調配物，但不限於此。

根據本發明的治療方法可包括投與醫藥學上有效量的醫藥組成物。在本發明中，有效量可視各種因素而變化，包含疾病種類、疾病嚴重性、活性成份的種類及含量以及包含於組成物中的其他成分、調配物種類、患者的年齡、體重、一般健康狀態、性別及飲食、投與時間、投與途徑、組成物的分泌速率、處理時間段以及同時使用的藥物。

在本發明的一個實施例中，提供一種含有以下的醫藥調配物：神經毒素、穩定劑以及局部麻醉劑。在醫藥組成物中，神經毒素為選自由肉毒桿菌（botulinum）毒素、破傷風（tetanus）毒素、霍亂（cholera）毒素以及百日咳（pertussis）毒素組成的群組的任何一或多者。肉毒桿菌毒素可由A型肉毒桿菌毒素、B型肉毒桿菌毒素、C型肉毒桿菌毒素、D型肉毒桿菌毒素、E型肉毒桿菌毒素、F型肉毒桿菌毒素以及G型肉毒桿菌毒素組成的族群中選出。肉毒桿菌毒素較佳地為A型肉毒桿菌毒素。另外，肉毒桿菌毒素可為不含複合蛋白質的形式或含有複合蛋白質的複合物形式蛋白質。在醫藥調配物中，穩定劑為選自精胺酸、麩胺酸以及天冬胺酸中的任何一或多者，且穩定劑以穩定緩衝劑形式提供，其中穩定緩衝劑為選自葡萄糖酸內酯緩衝劑及酒石酸緩衝劑中的任何一或多者。另外，可以0.01毫莫耳（mM）至1,000毫莫耳每100單元肉毒桿菌毒素的濃度含有穩定劑。醫藥調配物可具有5.5至7.0的pH值。且在醫藥調配物中，局部麻醉劑為選自可卡因（cocaine）、普魯卡因（procaine）、氯普魯卡因（chloroprocaine）、四卡因（tetracaine）、利多卡因（lidocaine）、甲哌卡因（mepivacaine）、丙胺卡因（prilocaine）、布比卡因（bupivacaine）、羅比卡因（ropivacaine）、苯佐卡因（benzocaine）以及阿替卡因（articaine）中的任何一或多者，且可更佳地為利多卡因，且可以按醫藥調配物的總重量計0.1重量%（wt%）至1重量%的量經包含。另外，醫藥調配物可更含有聚山梨醇酯，且可為液體。

在本發明中，局部麻醉劑只要其作用於神經纖維以阻斷神經興奮的傳導就並不限制系列及類型。但其較佳地為醯胺型局部麻醉劑，更佳地為利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、布比卡因、羅比卡因、苯佐卡因或阿替卡因，且更佳地為利多卡因。

在本發明的另一個實施例中，提供一種用於製備醫藥調配物的方法，包括以下步驟：（a）純化神經毒素；（b）將穩定劑添加至神經毒素；以及（c）將局部麻醉劑添加至神經毒素。在所述方法中，神經毒素可較佳地為A型肉毒桿菌毒素。在方法中，穩定劑為選自精胺酸、麩胺酸以及天冬胺酸中的任何一或多者，且穩定劑以穩定緩衝劑形式提供，其中穩定緩衝劑為選自葡萄糖酸內酯緩衝劑及酒石酸緩衝劑中的任何一或多者。另外，局部麻醉劑為選自可卡因、普魯卡因、氯普魯卡因、四卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、布比卡因、羅比卡因、苯佐卡因以及阿替卡因中的任何一或多者，且更佳地為利多卡因。在方法中，醫藥調配物可為液體。

在下文中，將詳細描述本發明的各步驟。

[有利效應]
肉毒桿菌毒素抑制具有神經功能的動物中的肌神經接頭的膽鹼激導性突觸前處的乙醯膽鹼的胞外分泌從而導致乏力。肉毒桿菌毒素由於其神經毒性功能而對各種疾病具有極大治療效應，但由於其強毒性即使極小的量亦具有殺傷性。出於此原因，當肉毒桿菌毒素將用於活體時，有必要精細地控制肉毒桿菌毒素的濃度。然而，含有肉毒桿菌毒素的當前可用醫藥組成物具有與蛋白質變性相關聯的問題。由於此類問題，當前醫藥組成物以凍乾調配物形式而製備且分佈，且在臨床應用中於即將使用之前由使用者以液體生理鹽水進行稀釋。出於此原因，在當前醫藥組成物的情況下，存在的問題在於由人類誤差（諸如稀釋因數誤差或稀釋生理鹽水的雜質）引起的醫療事故的風險高。

根據本發明的包括肉毒桿菌毒素的醫藥組成物可含有精胺酸、麩胺酸或天冬胺酸作為穩定劑，或可含有葡萄糖酸內酯緩衝劑或酒石酸緩衝劑作為穩定性緩衝劑，或可含有用於肉毒桿菌毒素的局部麻醉劑。且甚至在本發明的組成物以液體調配物分佈時，本發明的組成物對肉毒桿菌毒素的穩定性呈現顯著效應。因此，預期本發明的組成物將非常有助於肉毒桿菌毒素安全且適宜的醫療用途。

在本發明中執行的實驗的結果展示精胺酸及甲硫胺酸對肉毒桿菌毒素的穩定效應是pH依賴的。基於這些結果，液體BoNT/A調配物的pH值設置成6.0，且液體BoNT/A調配物中的精胺酸的濃度改變為各種濃度。將BoNT/A添加至調配物至80單元/毫升（units/ml）的最初效力，且接著在37℃下培養調配物8週，且藉由DESCR分析量測BoNT/A的效力。因此，其展示了不含穩定劑的對照組中的BoNT/A的殘餘效力在2週後為10%，且含有50毫莫耳甲硫胺酸的實驗組展示了在2週、4週以及8週後分別67%、47%以及27%的殘餘效力。此展示甲硫胺酸具有顯著穩定效應。同時，精胺酸展示了在50毫莫耳至100毫莫耳濃度下大於甲硫胺酸的穩定效應，且含有甲硫胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力甚至在8週後為31%至65%。

[發明模式]
在下文中，將參考實例更詳細地描述本發明。本領域的技術人員將明白這些實例僅出於說明的目的且不意圖限制本發明的範疇。

以下（*）列舉本發明的實例中所使用的全部試劑的來源。

*葡萄糖酸內酯（西格瑪（Sigma）G2164）；L(+)-酒石酸（默克（Merck）100804）；利多卡因氫氯化物單水合物（西格瑪L5647）；辛酸（西格瑪C2875）；L-甲硫胺酸（默克K45023607 414）；L-精胺酸（默克K45895542 534）；甘胺酸（Bioshop GLN001-1）；L-麩胺酸（默克100291）；天冬胺酸（默克K45895542 534）；順丁烯二酸（默克S6858580 534）；丁基化羥基甲氧苯（西格瑪SLBM1210V）；沒食子酸丙酯（西格瑪P3130）；偏亞硫酸氫鈉（西格瑪MKBR6468V）；硫代乙醇酸（西格瑪T3758）；L-半胱胺酸氫氯化物（K46446495 513）；丁二酸（默克K46618782 533）；磷酸二氫鈉（西格瑪S5011）；磷酸氫二鈉（西格瑪S7907）；氯化鈉（默克K47013904 548）；聚山梨醇酯（西格瑪P7949）；以及DL-二硫蘇糖醇（西格瑪D0632）。

以下（**）列舉本發明的實例中所用的緩衝劑的縮寫及組成物。

**L-甲硫胺酸（Met，或「M」），L-精胺酸（Arg，或「R」），L-麩胺酸（Glu，或「E」），天冬胺酸（ASP，或「D」），緩衝劑P（10毫莫耳NaPO₄ ，pH 6.0，45毫莫耳NaCl，以及0.05%聚山梨醇酯），緩衝劑G（10毫莫耳葡萄糖酸內酯，pH 6.0，45毫莫耳NaCl，以及0.05%聚山梨醇酯），緩衝劑R（補充有50毫莫耳精胺酸的緩衝劑G）。
實例 1 ： 使用 BoTest® 研發肉毒桿菌毒素穩定劑
實例 1-1 ： 製備實驗

本發明中所用的肉毒桿菌毒素為藉由秀杰（Hugel）制藥有限公司（韓國）製備且調節至0.1毫克/毫升（units/ml）濃度及1,529單元/微升（units/µl）效力（基於BoTest®）的一種肉毒桿菌毒素。在用於識別具有穩定效應的添加劑的全部實驗中，肉毒桿菌毒素在用具有組成物（50毫莫耳NaPO₄ ，pH 7.0，1毫莫耳DTT，0.05重量%聚山梨醇酯，以及20重量%甘油）的「蛋白質稀釋緩衝液」將其稀釋至50單元/微升後使用。

對於具有穩定效應的添加劑候選物的識別，各實驗組（100微升）藉由稀釋200單元的肉毒桿菌毒素及「穩定液體組成物（10毫莫耳NaPO₄ （pH 5.5-7.0），0.01重量%聚山梨醇酯，130毫莫耳NaCl）」中的穩定劑添加劑候選物而製備。隨後，在37℃溫度下培養各實驗組1週至11週，且其部分（25%）用於量測其殘餘效力。使用BoTest®肉毒桿菌神經毒素偵測套組（BioSentinel，美國）來量測肉毒桿菌毒素的效力。為此，將5毫莫耳HEPES-NaOH（pH 7.1）、0.1重量%聚山梨醇酯、10微莫耳ZnCl₂ （西格瑪229997）、0.2微莫耳BoTest® A/E報導子（A/E reporter）以及25微升穩定實驗組彼此混合以製備最終反應溶液（100微升），且在37℃下培養反應溶液21小時。使用Synergy Neo2多模讀取器（Multi-Mode Reader）（伯騰（BioTek），美國）系統來量測所培養反應溶液的CFP/FRET比率且將所述比率應用於標準曲線，進而確定肉毒桿菌毒素的殘餘效力。另外，將在根據本發明的肉毒桿菌毒素的穩定性上的研究中所使用的全部試劑溶解於三次蒸餾水中且藉由添加鹽酸及氫氧化鈉來調節至pH 5.5至7.0。
實例 1-2 ： 比較在改變 pH 下的 精胺酸或甲硫胺酸的穩定效應

相對地檢查在pH範圍為5.5至7.0下精胺酸及甲硫胺酸作為穩定劑對肉毒桿菌毒素的穩定性的效應。

為此，將肉毒桿菌毒素添加至實例1中描述的穩定液體組成物，且將50毫莫耳精胺酸或甲硫胺酸進一步添加至所述液體組成物。在37℃下培養所得組成物28天至56天，且接著量測肉毒桿菌毒素的殘餘效力。量測結果展示於下表1及圖1中。
[表1]

如自實驗結果可看出，在不含穩定候選物的陰性對照組中，肉毒桿菌毒素在全部pH下不穩定，且因此肉毒桿菌毒素的殘餘效力在28天後實質上偵測不到。含有甲硫胺酸作為穩定劑的實驗組在pH 5.5至7.0下展示了約10%的殘餘效力，而含有精胺酸的實驗組展示了高達30%的殘餘效力。另外，量測了精胺酸對肉毒桿菌毒素的穩定性的效應在pH範圍為5.5至6.0下比在pH範圍為6.5至7.0下更高。
實例 1-3 ： 精胺酸或甲硫胺酸的穩定效應的比較性檢驗

為了驗證精胺酸或甲硫胺酸對肉毒桿菌毒素的穩定性的效應，將含有精胺酸（50毫莫耳）或甲硫胺酸（50毫莫耳）作為穩定添加劑的肉毒桿菌毒素組成物培養56天，且在三個獨立實驗中量測肉毒桿菌毒素的殘餘效力。以統計方式處理量測結果，進而相對地驗證精胺酸及甲硫胺酸的效應。作為對照組，使用不含添加劑的樣本。為了測定三個實驗組之間的顯著性，使用單因素ANOVA法。當顯著性概率（p值）為0.05或小於0.05時，確定了三個實驗組之間存在顯著差異，且藉由最低顯著差（Least Significant Difference；LSD）法執行事後分析。量測結果展示於下表2及圖2a、圖2b及圖2c中。
[表2]

此實例中獲得的結果指示精胺酸及甲硫胺酸均在pH 6.0下展示高穩定效應，且這些實驗結果與上文所描述的實驗結果相一致。然而，在相同pH條件下，在全部實驗組中，精胺酸展示了相較於甲硫胺酸更高的穩定效應。舉例而言，在不含穩定劑的對照組中，在培養56天後全部條件下均量測不到肉毒桿菌毒素的效力，但在含有甲硫胺酸的實驗組中，在pH 6.0下量測到22.6%的殘餘效力，且在含有精胺酸的實驗組中，在相同條件下量測到69.1%的效力。

使用單因素 ANOVA法檢查精胺酸與甲硫胺酸的相對穩定效應的顯著性，且因此，展示了在pH 6.0下，穩定效應值在除培養14天的實驗組以外的全部實驗組中是顯著的。對於此類結果，藉由最低顯著差（LSD）法執行事後分析，且因此，展示了在p＜0.05至p＜0.001的水準下，精胺酸的穩定效應比甲硫胺酸的穩定效應顯著更佳。舉例而言，在pH 7.0下培養28天後量測的值的比較指示含有甲硫胺酸的實驗組展示17.1%的殘餘效力且含有精胺酸的實驗組展示55.8%的殘餘效力，且因此兩組之間的穩定效應中存在p＜0.001的顯著差異。另外，在pH 6.0下培養56天後量測的值的比較指示含有甲硫胺酸的實驗組展示22.6%的殘餘效力且含有精胺酸的實驗組展示69.1%的殘餘效力，且因此兩組之間的穩定效應中存在p＜0.01的顯著差異。

且本發明者檢查了當添加甲硫胺酸或精胺酸時，聚山梨醇酯的表面活性劑特性對肉毒桿菌毒素的穩定效應的效應。為此，將肉毒桿菌毒素及50毫莫耳精胺酸或甲硫胺酸添加至含有0重量%至0.05重量%聚山梨醇酯的穩定液體組成物，且在37℃下培養所得組成物28天至56天，其後量測肉毒桿菌毒素的殘餘效力。自實驗結果，在含有甲硫胺酸的穩定組成物的情況下，在pH範圍為5.5至6.0下，穩定效應展示了與聚山梨醇酯濃度成比例增大的傾向，且在pH範圍為6.5至7.0下，聚山梨醇酯的效應大體上並不出現。在含有精胺酸的實驗組的情況下，在pH範圍為5.5至6.5下，添加聚山梨醇酯展示了有助於穩定效應的傾向，但聚山梨醇酯的效應並不十分顯著。此類結果表明向含有精胺酸作為穩定劑的液體肉毒桿菌毒素調配物添加聚山梨醇酯並非必需的。
實例 1-4 ： 識別用於肉毒桿菌毒素液體調配物的新穩定劑

實例1-2至實例1-3的結果指示精胺酸對肉毒桿菌毒素液體調配物的穩定性具有相對於甲硫胺酸更佳的效應。然而，展示與精胺酸的效應類似的效應的新添加劑的偵測實現各種產品的研發。為此，本發明者相對地檢查下表3中展示的各種穩定性候選物的肉毒桿菌毒素穩定效應。檢驗結果展示於圖3及圖4中。
[表3]

圖3展示量測在培養含有上表3展示的抗氧化劑的肉毒桿菌毒素組成物28天後的肉毒桿菌毒素的殘餘效力的結果。量測結果指示檢驗中所使用的全部抗氧化劑添加劑展示比對照甲硫胺酸的穩定效應更低的穩定效應。然而，在緩衝劑的情況下，葡萄糖酸內酯展示在pH 6.5下的顯著穩定效應，且酒石酸展示在pH範圍為5.5至6.5下的穩定效應（圖4）。此類結果提出研發具有顯著效應的新添加劑的可能性。
實例 2. 使用 DESCR 研發肉毒桿菌毒素穩定劑
實例 2-1. 製備實驗

在實例1中，含有具有相對高效力（200單元/0.1毫升）的肉毒桿菌毒素的液體調配物樣本製備於聚丙烯管中，且使用BoTest®分析來量測肉毒桿菌毒素的殘餘效力。然而，此肉毒桿菌毒素濃度顯著不同於臨床使用可購得的肉毒桿菌毒素的濃度。因此，在本發明中，使用具有與當前可購得肉毒桿菌產品的那些組成物類似的組成物的調配物（也就是說，肉毒桿菌毒素的最初效力為40單元/毫升至80單元/毫升的調配物）來執行對用於穩定肉毒桿菌毒素的調配物的研究。由於BoTest®分析需要至少50單元的效力，因此其不能量測在上文所描述的條件下製備的液體調配物中的肉毒桿菌毒素的殘餘效力。因此，本發明者已研發了能夠定量地量測以痕量存在的BoNT/A的效力的與活體外SNAP25裂解反應結合的直接ELISA（Direct ELISA coupled within vitro SNAP25 cleavage reaction；DESCR）法。DESCR方法將詳細描述於以下實例2-2中。

簡要地，儘管將200單元BoNT/A添加至100微升的各液體調配物樣本且藉由實例1中的BoTest®分析量測全部調配物樣本中的其殘餘效力，但將40單元/毫升至80單元/毫升BoNT/A添加至0.1毫升至1毫升的各液體調配物樣本且藉由實例2中的DESCR法（由本發明者最新研發）量測全部調配物樣本中的其殘餘效力。

對於識別具有穩定效應的添加劑候選物，使用含有10毫莫耳NaPO₄ （pH 6.0）、10毫莫耳酒石酸（pH 6.0）或10毫莫耳葡萄糖酸內酯（pH 6.0）作為緩衝劑的各實驗組的樣本作為陰性對照，且全部調配物樣本通常含有0.05%聚山梨醇酯、45毫莫耳至130毫莫耳NaCl、肉毒桿菌毒素以及穩定劑添加劑候選物。在37℃下培養這些調配物樣本2週至8週，且10微升（0.4單元）的各調配物樣本用於量測肉毒桿菌毒素的殘餘效力。省略詳細描述的實驗方法如以上實例1中所描述。
實例 2-2. DESCR 量測方法的研發

與活體外SNAP25裂解反應結合的直接ELISA（DESCR）由以下兩個步驟組成：
（1）在BoNT/A與作為受質的高純重組蛋白（GST-SNAP25）之間執行活體外酶反應（活體外SNAP25裂解反應）；以及
（2）藉由酶聯結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）定量地量測酶反應的程度。

藉由顏色反應偵測反應程度。具體言之，其可使用初級抗體及結合辣根過氧化酶（horseradish peroxidase；HRP）的次級抗體藉由顏色反應來偵測，所述初級抗體與由BoNT/A裂解的形式（SNAP25197）特異性地反應。步驟中的每一者如下執行。
（1）活體外SNAP25裂解反應

實驗中所用的肉毒桿菌毒素經稀釋至各種濃度（0單元、0.2單元、0.4單元、0.6單元、0.8單元、1.2單元以及1.6單元）且在37℃下在20微升緩衝溶液（20毫莫耳HEPES-NaOH（pH 7.1）、0.1%吐溫20、10微莫耳ZnCl₂ 以及1微克GST-SNAP25）中進行酶反應21小時（過夜（overnight；O/N））。
（2）ELISA

將80微升RSB（反應停止緩衝劑（Reaction Stop Buffer）；125毫莫耳碳酸（pH 9.6，西格瑪S6014），以及6.25毫莫耳EDTA）添加至反應溶液以便停止BoNT/A反應，且將反應溶液轉移至Maxisorp免疫板（Immuno-plate）（NUNC，目錄號170-6531）上，之後在37℃下塗佈2小時。用WB（洗滌緩衝液（Washing Buffer）；含有0.05%吐溫20的1X PBS，及0.2莫耳NaCl）洗滌各孔三次，且接著在37℃下用BS（阻斷溶液（Blocking Solution）；5%脫脂牛奶（skim milk（脫脂奶粉（non-fat dry milk；NFDM）））於1X PBS中）阻斷15分鐘。接著，用WB洗滌各孔一次，且將在BS中稀釋的100微升SNAP25₁₉₇ -特異性抗體（1:250稀釋，R&D）施配至各孔中且使其在37℃下反應1小時。在用WB洗滌三次後，將在BS中稀釋的100微升結合HRP的次級抗體（1:1000稀釋，AbFrontier，LF-SA8001）施配至各孔中且使其在37℃下反應1小時。在用WB洗滌三次後，將100微升TMB受質（賽默飛，目錄號34028）施配至各孔中以誘導顏色反應。藉由添加相同量的2M硫酸（西格瑪，目錄號258105）來使反應停止，且使用吸收率分析器（多模讀取器Synergy Neo2，BioTek）系統來量測450奈米下的吸收率（A450），且計算AU值。這些步驟示意性地展示在5圖中。
實例 2-3. 比較精胺酸與甲硫胺酸對液體肉毒桿菌調配物的穩定性的效應

實例1的結果展示了精胺酸及甲硫胺酸對肉毒桿菌毒素的穩定效應是pH依賴的。具體言之，在含有甲硫胺酸作為穩定劑的實驗組中，肉毒桿菌毒素展示了在pH範圍為5.5至7.0中的至多約10%的殘餘效力，但在含有精胺酸的實驗組中，量測到至多約30%的殘餘效力。此外，展示了精胺酸對BoNT/A的穩定性的效應在pH 5.5至6.0下比在pH 6.5至7.0下更高。在含有穩定劑添加劑候選物的陰性對照組中，BoNT/A傾向於在全部pH條件下均不穩定，且因此在28天後未偵測到BoNT/A的殘餘效力。

基於這些結果，液體BoNT/A調配物的pH值設置成6.0，且液體BoNT/A調配物中的精胺酸的濃度改變為各種濃度。將BoNT/A添加至調配物至80單元/毫升的最初效力，且接著在37℃下培養調配物8週，且藉由DESCR分析量測BoNT/A的效力。量測結果展示於圖6a及圖6b中。

因此，其展示了不含穩定劑的對照組中的BoNT/A的殘餘效力在2週後為10%，且含有50毫莫耳甲硫胺酸的實驗組展示了在2週、4週以及8週後分別67%、47%以及27%的殘餘效力。此展示甲硫胺酸具有顯著穩定效應。同時，精胺酸展示了在50毫莫耳至100毫莫耳濃度下高於甲硫胺酸的穩定效應，且量測到含有甲硫胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力甚至在8週後為31%至65%。

甲硫胺酸與精胺酸的相對穩定效應中的差異亦在含有0.3%利多卡因的調配物中觀測到。換言之，在8週後，含有甲硫胺酸的實驗組展示了27%的殘餘效力，且含有精胺酸的實驗組展示了44%至62%的殘餘效力。

以上結果展示：（1）精胺酸的穩定效應經校驗與各種量測方法無關，包含BoTest®分析及DESCR分析；（2）精胺酸即使在含有具有與實際上臨床使用所製備/分散的產品的那些效力類似的效力的肉毒桿菌毒素的調配物的條件下亦呈現穩定效應；以及（3）精胺酸的穩定效應即使在含有利多卡因的調配物中亦經維持。
實例 2-4. 評估液體調配物容器材料對 BoNT/A 效力的穩定性的效應

上述實例2-3示出通過在聚丙烯管中製備含肉毒桿菌毒素的調配物而獲得的結果。然而，由於實際上分佈用於臨床用途的肉毒桿菌毒素液體調配物是在玻璃容器中製備的，因此同樣使用玻璃容器來評估甲硫胺酸及精胺酸對肉毒桿菌毒素的殘餘效力的穩定效應。特定言之，將BoNT/A製備成具有40單元/毫升的初始效力且含有20毫莫耳甲硫胺酸或100毫莫耳精胺酸的液體調配物，且藉由DESCR分析來量測調配物中的BoNT/A的殘餘效力同時在37℃下培養調配物8週。量測結果展示於圖7a及圖7b中。

因此，含有甲硫胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力在2週、4週以及8週之後分別經量測為41%、15%以及8%。同時，含有精胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力在相同時間段之後經量測為84%、64%以及43%，且展示出與含有甲硫胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力有較大差異。

即使在液體調配物含有利多卡因時，甲硫胺酸及精胺酸皆展示穩定效應。特定言之，含有甲硫胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力在2週、4週以及8週之後分別經量測為47%、21%以及16%，且含有精胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力經量測為79%、71%以及55%，從而指示精胺酸的穩定效應與甲硫胺酸的穩定效應顯著地不同。

上述結果展示出：（1）即使在調配物具有相同組成物的情況下，在聚丙烯管中製備的調配物樣本中的BoNT/A的效力比在玻璃容器中製備的調配物樣本中的BoNT/A的效力更加穩定地維持；以及（2）精胺酸對在玻璃容器中製備的BoNT/A液體調配物的穩定效應比甲硫胺酸對其的穩定效應更佳。
實例 2-5. 評估緩衝劑及麩胺酸對精胺酸的穩定效應的效應

上述實例1-4指示作為緩衝劑的酒石酸及葡萄糖酸內酯具有穩定效應且在約pH 6.0下皆呈現最優效應。相應地，使用玻璃容器來檢測精胺酸對含有酒石酸或葡萄糖酸內酯作為緩衝劑的BoNT/A調配物的穩定效應。用作陰性對照的緩衝劑是最常用的磷酸鈉（NaPO₄ ，pH 6.0）。比較結果展示於圖8a及圖8b中。

因此，展示精胺酸的穩定效應在所有液體調配物中皆展示類似模式，且即使在8週之後，含有精胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力經量測為57%至70%。在實驗中所使用的所有緩衝劑當中，精胺酸對含有葡萄糖酸內酯的調配物的穩定效應顯著較高，且量測出此調配物中的BoNT/A的殘餘效力比其他調配物樣本中的彼等高出約10%。含有利多卡因的調配物中亦呈現此趨勢。

另外，評估在含有除了酒石酸或葡萄糖酸內酯緩衝劑以外還含有麩胺酸的調配物中作為穩定劑的精胺酸的效應。評估結果展示於圖9a及圖9b中。在上述實例2-3中，展示當將50毫莫耳麩胺酸添加至含有磷酸鈉緩衝劑的BoNT/A液體調配物及50毫莫耳精胺酸時，在8週之後，調配物中的BoNT/A的殘餘效力為65%。當並不將麩胺酸添加至所述調配物時，調配物中的BoNT/A的殘餘效力為32%。亦針對含有利多卡因的調配物獲得類似結果，且特定言之，在8週之後，此調配物中BoNT/A的殘餘效力經量測為71%。在此情況下，當調配物不含有麩胺酸時，殘餘效力經量測為45%（參見圖6a及圖6b）。

基於實驗結果，為了為含有精胺酸及麩胺酸兩者的BoNT/A液體調配物選擇用於穩定的最優緩衝劑，使用玻璃容器來比較含有磷酸鈉、酒石酸或葡萄糖酸內酯的調配物中的BoNT/A的效力。因此，展示在2週、4週以及8週之後藉由DESCR分析量測的DESCR的殘餘效力在含有葡萄糖酸內酯作為緩衝劑的調配物中顯著較高。特定言之，當調配物不含有利多卡因時，殘餘效力在2週、4週以及8週之後分別達至96%、87%以及71%，且當調配物含有利多卡因時，殘餘效力經量測為96%、86%以及68%。

最後，為了評估有助於精胺酸的穩定效應的麩胺酸的最優濃度，將50毫莫耳精胺酸及10毫莫耳至50毫莫耳麩胺酸添加至含有葡萄糖酸內酯作為緩衝劑的調配物中，且在聚丙烯管中量測調配物中的BoNT/A的效力。量測結果展示於圖10a及圖10b中。因此，在僅含有麩胺酸而無精胺酸的調配物中亦偵測出BoNT/A效力的顯著水準，且含有利多卡因的調配物中的效力更加明顯。特定言之，在於37℃下培養8週之後量測的殘餘效力在陰性對照中為15%且在僅含有麩胺酸的調配物中為41%。然而，當僅使用麩胺酸時，其對BoNT/A的穩定效應比精胺酸對BoNT/A的穩定效應低。特定言之，在於37℃下培養8週之後，展示出僅含有精胺酸的調配物的殘餘效力為61%。量測含有10毫莫耳至50毫莫耳麩胺酸以及50毫莫耳精胺酸的調配物中的BoNT/A的效力，且因此，展示在幾乎所有實驗組中，在2週至8週之後，經量測殘餘效力與僅含有精胺酸的調配物中的BoNT/A的效力極其類似。含有利多卡因的調配物中亦呈現此趨勢。特定言之，培養8週之後量測的殘餘效力在僅含有精胺酸的調配物中為61%，且在含有精胺酸及麩胺酸兩者的調配物中為約57%至65%，而不展示與濃度的顯著關係。

上述結果表明以下重要事實。麩胺酸在液體調配物中具有穩定BoNT/A的效應，但麩胺酸單獨的效應與精胺酸單獨的效應相比並不顯著。即使在8週的相對較長存儲時間段之後，含有麩胺酸及精胺酸兩者的調配物未展示出協同效應，且此調配物中的BoNT/A的殘餘效力維持在恆定水準（60%至80%）下。
實例 2-6. 評估天冬胺酸對精胺酸作為穩定劑的穩定效應的效應

檢測作為例如麩胺酸的酸性胺基酸的天冬胺酸對精胺酸的BoNT/A穩定效應的效應，且結果展示於圖11a及圖11b中。僅含有天冬胺酸的調配物中的BoNT/A展示在2週至8週的培養之後的相對較高殘餘效力，且含有利多卡因的調配物中顯著地呈現天冬胺酸的此穩定效應。在陰性對照組中，在2週、4週以及8週之後效力殘餘分別經量測為73%、30%以及15%，但在含有天冬胺酸的實驗組中，殘餘效力經量測為88%、73%以及52%。量測在8週之後含有10毫莫耳至50毫莫耳天冬胺酸以及50毫莫耳精胺酸的調配物中的BoNT/A的殘餘效力，且因此，展示殘餘效力在僅含有精胺酸的調配物中為61%，且在除了含有天冬胺酸以外還含有精胺酸的調配物中為約58%至73%，而不展示與濃度的顯著關係。不同於在8週之後量測的殘餘效力，在2週至4週之後量測的BoNT/A的殘餘效力展示統計學上顯著之差。特定言之，在僅含有精胺酸的調配物中，在2週及4週之後殘餘效力分別經量測為82%及76%，但當將天冬胺酸添加至調配物中時，殘餘效力經量測為92%至100%及85%至94%。另外，在含有麩胺酸的調配物中，在相同時間段期間呈現類似穩定效應，但效應的程度相對較低且殘餘效力經量測為83%至98%及76%至88%。下表4中展示含有天冬胺酸的調配物的量測結果，且下表5中展示含有麩胺酸的調配物的量測結果。
[表4]
[表5]
實例 2-7. 確認由新穎液體調配物製備的 BoNT/A 產品的穩定性

BoNT/A的新穎液體組成物包括10毫莫耳葡萄糖酸內酯（pH 6.0）、45毫莫耳至130毫莫耳氯化鈉、50毫莫耳精胺酸、50毫莫耳天冬胺酸以及0.05%聚山梨醇酯，所述新穎液體組成物基於藉由本發明者確認了其安全性的多種液體可注射添加劑的以系統及相對方式分析的結果而確立。為了藉由小鼠LD₅₀ 分析來驗證液體調配物的安全性，使用玻璃容器製備具有上文所描述的組成物的BoNT/A調配物以便具有40單元/毫升的最初潛能。含有代替精胺酸的甲硫胺酸的液體調配物產品用作對照，且相對地檢查所述產品的穩定性。檢驗結果展示於圖12中。因此，展示了由新穎液體組成物製備的BoNT/A產品的穩定性極類似於活體外研究中獲得的結果。具體言之，在2週、4週以及8週後量測的此BoNT/A產品的殘餘效力分別是96%、84%以及66%，且在2週、4週以及8週後的對照的殘餘效力分別是41%、15%以及8%。

[工業實用性]
肉毒桿菌毒素抑制具有神經功能的動物中的肌神經接頭的膽鹼激導性突觸前處的乙醯膽鹼的胞外分泌從而導致乏力。因此，最近做出了將肉毒桿菌毒素的神經毒性用於美容或治療目的的努力。然而，肉毒桿菌毒素（一種蛋白質劑）存在的問題在於其並不易於調配至醫藥組成物中且亦並不易於儲存、分散及管理。此問題由蛋白質的不穩定性引起，且在蛋白質劑（例如肉毒桿菌毒素）以極低濃度配製至醫藥組成物中的情況下問題為嚴重的。

本發明是關於一種含有肉毒桿菌毒素、穩定劑以及局部麻醉劑的液體調配物及用於其的製備方法。根據本發明的包括肉毒桿菌毒素的醫藥組成物為易於儲存及分散的液體調配物，且其在根據人體的溫度及pH值的適合條件下呈現對肉毒桿菌毒素的穩定性的顯著效應。因此，預期本發明的醫藥組成物將非常有助於肉毒桿菌毒素安全及適宜的醫療用途。

無

圖1展示量測在將肉毒桿菌毒素與精胺酸或甲硫胺酸一起培養28天至56天後的肉毒桿菌毒素的殘餘效力的結果。

圖2a、圖2b及圖2c展示量測在pH 6.0至7.0下培養含有精胺酸或甲硫胺酸的肉毒桿菌毒素組成物56天後的肉毒桿菌毒素的殘餘效力的結果。詳細地，圖2a中的pH 6.0，圖2b中的pH 6.5，圖2c中的pH 7.0。

圖3展示量測在培養含有各種抗氧化劑的肉毒桿菌毒素組成物28天後的肉毒桿菌毒素的殘餘效力的結果。

圖4展示量測在培養含有各種緩衝劑的肉毒桿菌毒素組成物28天後的肉毒桿菌毒素的殘餘效力的結果。

圖5展示用於量測根據本發明的一個實例的肉毒桿菌毒素的效力的DESCR分析的各步驟。

圖6a及圖6b展示根據本發明的一個實例的比較精胺酸與甲硫胺酸對液體肉毒桿菌調配物的穩定性的效應的結果。具體言之，圖6a展示用於不含局部麻醉劑的調配物的比較結果，且圖6b展示用於含有局部麻醉劑（0.3%利多卡因）的調配物的比較結果。

圖7a及圖7b展示評估液體調配物容器的材料對BoNT/A效力的穩定性的效應的結果。具體言之，圖7a展示用於不含局部麻醉劑的調配物的評估結果，且圖7b展示用於含有局部麻醉劑（0.3%利多卡因）的調配物的評估結果。

圖8a及圖8b展示根據本發明的一個實例的藉由使用玻璃容器來比較精胺酸對含有酒石酸或葡萄糖酸內酯作為緩衝劑的調配物的穩定效應的結果。具體言之，圖8a展示用於不含局部麻醉劑的調配物的比較結果，且圖8b展示用於含有局部麻醉劑（0.3%利多卡因）的調配物的比較結果。

圖9a及圖9b展示根據本發明的一個實例的評估作為穩定劑的精胺酸對除了酒石酸或葡萄糖酸內酯緩衝劑之外含有麩胺酸的調配物的效應的結果。具體言之，圖9a展示用於不含局部麻醉劑的調配物的評估結果，且圖9b展示用於含有局部麻醉劑（0.3%利多卡因）的調配物的評估結果。

圖10a及圖10b展示根據本發明的一個實例的評估有助於精胺酸對含有葡萄糖酸內酯作為緩衝劑的調配物的穩定效應的麩胺酸的最優濃度的結果。具體言之，圖10a展示用於不含局部麻醉劑的調配物的評估結果，且圖10b展示用於含有局部麻醉劑（0.3%利多卡因）的調配物的評估結果。

圖11a及圖11b展示根據本發明的一個實例的評估天冬胺酸對精胺酸的BoNT/A穩定效力的效應的結果。具體言之，圖11a展示用於不含局部麻醉劑的調配物的評估結果，且圖11b展示用於含有局部麻醉劑（0.3%利多卡因）的調配物的評估結果。

圖12展示根據本發明的一個實例的比較當將精胺酸或甲硫胺酸添加至產品時由具有新穎組成物的液體調配物製備的BoNT/A產品的穩定性的結果。

Claims (15)

1. 一種醫藥調配物，包括：神經毒素、穩定劑以及局部麻醉劑。
2. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥調配物，其中所述神經毒素為選自由肉毒桿菌毒素、破傷風毒素、霍亂毒素以及百日咳毒素組成的群組中的任何一或多者。
3. 如申請專利範圍第2項所述的醫藥調配物，其中所述肉毒桿菌毒素為A型肉毒桿菌毒素。
4. 如申請專利範圍第2項所述的醫藥調配物，其中所述肉毒桿菌毒素為不含複合蛋白質的形式或含有複合蛋白質的複合物形式。
5. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥調配物，其中所述穩定劑為選自精胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、葡萄糖酸內酯以及酒石酸中的任何一或多者。
6. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥調配物，其中所述局部麻醉劑為選自可卡因、普魯卡因、氯普魯卡因、四卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、布比卡因、羅比卡因、苯唑卡因以及阿替卡因中的任何一或多者。
7. 如申請專利範圍第6項所述的醫藥調配物，其中所述局部麻醉劑為利多卡因。
8. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥調配物，更包括聚山梨醇酯。
9. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥調配物，其中所述醫藥調配物為液體。
10. 一種用於製備醫藥調配物的方法，包括以下步驟： （a）純化神經毒素； （b）將穩定劑添加至所述神經毒素；以及 （c）將局部麻醉劑添加至所述神經毒素。
11. 如申請專利範圍第10項所述的用於製備醫藥調配物的方法，其中所述神經毒素為選自由肉毒桿菌毒素、破傷風毒素、霍亂毒素以及百日咳毒素組成的群組中的任何一或多者。
12. 如申請專利範圍第10項所述的用於製備醫藥調配物的方法，其中所述穩定劑為選自精胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、葡萄糖酸內酯以及酒石酸中的任何一或多者。
13. 如申請專利範圍第10項所述的用於製備醫藥調配物的方法，其中所述局部麻醉劑為選自可卡因、普魯卡因、氯普魯卡因、四卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、布比卡因、羅比卡因、苯唑卡因以及阿替卡因中的任何一或多者。
14. 如申請專利範圍第10項所述的用於製備醫藥調配物的方法，其中所述醫藥調配物更包括聚山梨醇酯。
15. 如申請專利範圍第10項所述的用於製備醫藥調配物的方法，其中所述醫藥調配物為液體。