JP7053498B2 - トリプトファンまたはチロシンで安定化された液体神経毒素製剤 - Google Patents

Description

本発明は、動物性タンパク質非含有液体神経毒素製剤に関する。特に、本発明は、非タンパク質性賦形剤で安定化された動物性タンパク質非含有液体ボツリヌス神経毒素製剤に関する。

本明細書に記載の神経毒素製剤は、治療において使用するのに好適であり、特に所望の治療効果または美容効果を達成するために患者に投与するのに好適である。

クロストリジウム株によって天然に生産されるクロストリジウム神経毒素は、今日までに知られている最も有毒な生物由来物質であり、同時に、頸部ジストニア、痙縮、眼瞼痙攣、多汗症または流涎症を含む多くの神経筋および内分泌障害を治療するための強力な手段である。また、しわを滑らかにするという美容分野における用途も見出されている。

医薬品としての使用に好適であるためには、神経毒素組成物は、神経毒素活性を著しく損失することなく保存できるようなものでなければならない。

現在承認されているボツリヌス神経毒素製剤ではいずれも、動物性（ヒトを含む）タンパク質、通常はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が安定剤として使用されている。

しかしながら、医薬組成物中にＨＳＡなどの動物性タンパク質が存在する場合、プリオンなどの動物由来感染病原体を患者に不本意に感染させてしまう危険性がたとえ低いとしてもあるので、望ましくない。

動物性タンパク質非含有ボツリヌス毒素製剤は当技術分野において既に開示されている。例えば、特許文献１には、ボツリヌス毒素を安定化するために２－ヒドロキシエチルデンプンなどの多糖が使用されている凍結乾燥組成物が記載されている。特許文献２には、ボツリヌス毒素を安定化するために界面活性物質と、ＧｌｕおよびＧｌｎまたはＡｓｐおよびＡｓｎから選択される少なくとも２種のアミノ酸の混合物とが使用されている組成物が記載されている。

しかしながら、大部分の先行技術製剤は液体形態では安定ではないため、凍結乾燥またはフリーズドライ形態で保存される。そのような製剤は、患者に投与する前に、医師が滅菌生理食塩水中で再構成する必要がある。この再構成工程は、医師の時間損失、希釈ミスの危険性、さらに再構成工程中の汚染の危険性も伴う。また、ボツリヌス毒素供給者は、確実に再構成工程が充分に行われるように医師を訓練しなければならない。

したがって、液体製剤は、医師の時間損失、希釈ミスの危険性、汚染の危険性、および供給者が訓練を施す必要性がなくなるため、有利である。

ＨＳＡ非含有液体製剤は、例えば特許文献３に記載されており、該文献には、界面活性剤、塩化ナトリウムおよび二糖を含む液体ボツリヌス毒素製剤が開示されている。特許文献４には、ポリソルベート２０およびメチオニンを含む液体ボツリヌス毒素製剤が開示されている。

国際公開第０１５８４７２号 国際公開第２００５００７１８５号 国際公開第２００６００５９１０号 国際公開第２００９００８５９５号

本発明の目的は、保存および治療における使用に好適である有利な動物性タンパク質非含有液体ボツリヌス神経毒素製剤を提供することである。特に、安定化製剤は、製品の安定性を維持すること、動物性タンパク質を含まないこと、さらに、複合タンパク質を含まない神経毒素の安定化に好適であることが望ましい。

本発明の第１の態様は、タンパク質性神経毒素と、界面活性剤と、トリプトファンおよびチロシンから選択されるアミノ酸と、ナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含む緩衝液とを含むか、または本質的にこれらからなる液体組成物であって、ｐＨ５．５～８であり、経時的に安定であり、かつ動物由来タンパク質を含まない液体組成物である。

別の態様は、治療および／または美容における本発明に係る液体組成物の使用である。

本発明のさらなる態様は、動物由来タンパク質を含まない液体組成物においてタンパク質性神経毒素を分解から保護するための、トリプトファンおよびチロシンから選択されるアミノ酸の使用である。

本発明の第１の態様は、タンパク質性神経毒素と、界面活性剤と、トリプトファンおよびチロシンから選択されるアミノ酸と、ナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含む緩衝液とを含むか、または本質的にこれらからなる液体組成物であって、ｐＨ５．５～８であり、経時的に安定であり、かつ動物由来タンパク質を含まない液体組成物である。

「動物性タンパク質非含有」とは、動物（ヒトを含む）由来のタンパク質を含まないと理解すべきである。

神経毒素は、神経細胞を標的とし、神経機能に影響を与える物質である。タンパク質性神経毒素としては、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）および破傷風毒素（ＴｅＮＴ）が挙げられる。好ましくは、上記タンパク質性神経毒素はボツリヌス神経毒素である。

ボツリヌス神経毒素は、それらの活性型においてジスルフィド架橋により連結された５０ｋＤａの軽鎖（Ｌ）および１００ｋＤａの重鎖（Ｈ）からなる１５０ｋＤａのメタロプロテアーゼである。Ｌ鎖は、小胞媒介性神経伝達物質放出に関与するＳＮＡＲＥ（可溶性ＮＳＦ結合タンパク質受容体）タンパク質の１つを細胞内で切断することにより、神経伝達物質媒介機構を破壊する亜鉛プロテアーゼである。重鎖は、２つのドメイン、すなわち、Ｎ末端５０ｋＤａ転移ドメイン（Ｈ_Ｎ）およびＣ末端５０ｋＤａ受容体結合ドメイン（Ｈ_Ｃ）を包含する。ボツリヌス神経毒素のＨ_Ｃドメインは、Ｈ_ＣＣドメインおよびＨ_ＣＮドメインと呼ばれる２つの異なる構造的特徴を含む。受容体結合に関与するアミノ酸残基は、主にＨ_ＣＣドメインに位置すると考えられている。

ボツリヌス神経毒素は、７つの抗原的に異なる血清型（Ａ～Ｇ）に分類されている。各血清型のアミノ酸配列の例を本明細書中で配列番号１～７として示す。

各配列について、各種ドメインは例えば以下の通りである。

当業者であれば、各ボツリヌス神経毒素ドメインに若干変動があり得ることが分かるであろう。

ＢｏＮＴは、例えば、アセチルコリンの放出を妨げ、それにより筋収縮を妨げることで、神経筋神経接合部に作用する。神経末端中毒は可逆的であり、その期間はＢｏＮＴ血清型によって異なる。

天然のＢｏＮＴは、タンパク質分解から神経毒素を保護する多タンパク質複合体の一部として、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）および他のクロストリジウム種（クロストリジウム・ブチリカム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・バラティ（Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ）およびクロストリジウム・アルゲンチネンセ（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｅ）など）によって産生される。「複合体のボツリヌス神経毒素」とは、ボツリヌス神経毒素、および本質的にそのような多タンパク質複合体の一部である１種以上のタンパク質（神経毒素結合タンパク質または「ＮＡＰ」）を意味する。ＮＡＰとしては、無毒性の非赤血球凝集素（ＮＴＮＨ）タンパク質および赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ－１７、ＨＡ－３３およびＨＡ－７０）が挙げられる。「高純度ボツリヌス神経毒素」とは、本質的にＮＡＰを含まないボツリヌス神経毒素を意味する。

本発明の一実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は複合体のボツリヌス神経毒素である。別の実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は高純度ボツリヌス神経毒素である。

天然クロストリジウム株の培養によりＢｏＮＴを生成し、複合体または高純度形態として精製する方法は、当技術分野において周知であり、例えばＰｉｃｋｅｔｔ，Ａｎｄｙ．，“Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ａｓ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ：ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４年，７～４９頁に記載されている。

高純度または本質的に純粋なボツリヌス神経毒素は、例えばＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９５年），１９５，１５１～１５４頁の「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ」に記載の方法に従って、ボツリヌス毒素を含むタンパク質複合体から得ることができる。

あるいは、高純度ボツリヌス神経毒素は、大腸菌などの異種宿主におけるＢｏＮＴ遺伝子の組換え発現によって生成し、精製することもできる。

好ましくは、上記タンパク質性神経毒素はボツリヌス神経毒素である。本発明の一実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は複合体のボツリヌス神経毒素である。別の実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は高純度ボツリヌス神経毒素である。

本発明の一実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は、その天然クロストリジウム株から精製したボツリヌス神経毒素である。別の実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は、大腸菌などの異種宿主において組換え的に生産されたボツリヌス神経毒素である。

本発明によれば、上記ボツリヌス神経毒素は、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのＢｏＮＴであってもよい。

本発明によれば、ボツリヌス神経毒素は修飾ボツリヌス神経毒素であってもよい。本発明によれば、「修飾ＢｏＮＴ」は、配列番号１、２、３、４、５、６または７と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＢｏＮＴである。好ましくは、修飾ＢｏＮＴは、配列番号１、２、３、４、５、６または７と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、修飾ＢｏＮＴは、そのアミノ酸配列が、６００、４００、２００、１５０、１００、５０または２０個未満のアミノ酸置換、欠失または付加、例えば１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、欠失または付加によって、配列番号１、２、３、４、５、６または７と異なるＢｏＮＴである。

本発明によれば、組換えボツリヌス神経毒素はキメラボツリヌス神経毒素であってもよい。本発明によれば、「キメラＢｏＮＴ」は、すべてが同じ血清型に属するわけではないＬ、Ｈ_Ｎ、Ｈ_ＣＮ、およびＨ_ＣＣドメインによって構成される。例えば、キメラＢｏＮＴは、ある血清型由来のＬ鎖と、別の血清型由来の完全なＨ鎖（Ｈ_Ｎ、Ｈ_ＣＮ、およびＨ_ＣＣドメイン）とからなっていてもよい。また、キメラＢｏＮＴは、ある血清型由来のＬ鎖およびＨ_Ｎドメイン（「ＬＨ_Ｎ」）と、別の血清型由来のＨ_Ｃドメイン（Ｈ_ＣＮおよびＨ_ＣＣ）とからなっていてもよい。また、キメラＢｏＮＴは、ある血清型由来のＬ鎖ならびにＨ_ＮおよびＨ_ＣＮドメイン（「伸長ＬＨ_Ｎ」）と、別の血清型由来のＨ_ＣＣドメインとからなっていてもよい。

本発明によれば、軽鎖ドメイン（Ｌ）は、以下のアミノ酸配列：
・配列番号１のアミノ酸１～４４８
・配列番号２のアミノ酸１～４４０
・配列番号３のアミノ酸１～４４１
・配列番号４のアミノ酸１～４４５
・配列番号５のアミノ酸１～４２２
・配列番号６のアミノ酸１～４３９
・配列番号７のアミノ酸１～４４１
のうち１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、小胞媒介性神経伝達物質放出に関与するＳＮＡＲＥタンパク質の１つを切断する能力を保持するアミノ酸配列を有していてもよい。

本発明によれば、Ｈ_Ｎドメインは、以下のアミノ酸配列：
・配列番号１のアミノ酸４４９～８７１
・配列番号２のアミノ酸４４１～８５８
・配列番号３のアミノ酸４４２～８６６
・配列番号４のアミノ酸４４６～８６２
・配列番号５のアミノ酸４２３～８４５
・配列番号６のアミノ酸４４０～８６４
・配列番号７のアミノ酸４４２～８６３
のうち１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、転移能力を保持するアミノ酸配列を有していてもよい。

本発明によれば、Ｈ_Ｃドメインは、以下のアミノ酸配列：
・配列番号１のアミノ酸８７２～１２９６
・配列番号２のアミノ酸８５９～１２９１
・配列番号３のアミノ酸８６７～１２９１
・配列番号４のアミノ酸８６３～１２７６
・配列番号５のアミノ酸８４６～１２５２
・配列番号６のアミノ酸８６５～１２７４
・配列番号７のアミノ酸８６４～１２９７
のうち１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、神経筋細胞に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有していてもよい。

本発明によれば、Ｈ_ＣＣドメインは、以下のアミノ酸配列：
・配列番号１のアミノ酸１１１１～１２９６
・配列番号２のアミノ酸１０９８～１２９１
・配列番号３のアミノ酸１１１２～１２９１
・配列番号４のアミノ酸１０９９～１２７６
・配列番号５のアミノ酸１０８６～１２５２
・配列番号６のアミノ酸１１０６～１２７４
・配列番号７のアミノ酸１１０６～１２９７
のうち１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、神経筋細胞に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有していてもよい。

亜血清型によってわずかな変動が生じ得るので、上記で特定した参照配列は目安として考慮されるべきである。

２つ以上の核酸またはアミノ酸配列間の「配列同一性％」は、アライメントした配列によって共有される同一の位置の同一のヌクレオチド／アミノ酸の数の関数である。したがって、同一性％は、アライメントにおける各位置の同一のヌクレオチド／アミノ酸の数を、アライメントした配列中のヌクレオチド／アミノ酸の総数で割って、１００を乗じたものとして計算できる。また、配列同一性％の計算は、ギャップ数や、２つ以上の配列のアライメントを最適化するために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮してもよい。２つ以上の配列間の配列比較および同一性％の決定は、当業者によく知られているであろうＢＬＡＳＴなどの特定の数学的アルゴリズムを用いて実施できる。

界面活性剤は、液体と固体の間または２種類の液体間の表面張力を低下させることができる化合物である。界面活性剤には、非イオン性、アニオン性、カチオン性または両性のものがある。本発明に係る組成物において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であることが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテルまたはペンタエチレングリコールモノドデシルエーテルなどのポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル；ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル；デシルグルコシド、ラウリルグルコシドまたはオクチルグルコシドなどのグルコシドアルキルエーテル；ＴｒｉｔｏｎＸ－１００などのポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル；ノノキシノール－９などのポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル；グリセリルラウレートなどのグリセロールアルキルエステル；ポリソルベートなどのポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル；スパンなどのソルビタンアルキルエステル；コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ；ドデシルジメチルアミンオキシド；ポロキサマーなどのポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのブロックコポリマー；ポリエトキシ化牛脂アミン（ＰＯＥＡ）が挙げられる。

好ましい実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）またはポリソルベート８０（ＰＳ８０）である非イオン性界面活性剤を含む。最も好ましくは、上記非イオン性界面活性剤はＰＳ８０である。界面活性剤がポリソルベートである場合、その濃度は、好ましくは０．００１％～１５％ｖ／ｖ、より好ましくは０．００５～２％ｖ／ｖ、さらに好ましくは０．０１～１％ｖ／ｖ、例えば０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５または１％ｖ／ｖである。一実施形態によれば、界面活性剤は、濃度が０．０５～０．２％ｖ／ｖ、例えば約０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９または０．２０％ｖ／ｖのＰＳ８０である。

ＰＳ２０は、密度が約１．１ｇ／ｍＬである。ＰＳ６０は、密度が約１．０４４ｇ／ｍＬである。ＰＳ８０は、密度が約１．０６～１．０９ｇ／ｍＬである。

ポリソルベートは、ミセルを形成し、タンパク質の表面への吸着およびタンパク質の凝集を防ぐと考えられている。理論に拘束されることを望むものではないが、分解／酸化時に、ポリソルベートは、タンパク質安定性に影響を及ぼし得る過酸化物および酸を形成し得ると思われる。したがって、ポリソルベートの濃度は、製品の組成においてできるだけ低いことが好ましいと考えられる。したがって、ポリソルベートの濃度は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の２００倍を超えないことが好ましいと考えられ、そのＣＭＣの１００、５０、２０、１０または５倍を超えないことがより好ましい。

ＰＳ２０（Ｍｗ１２２７．５ｇ／ｍｏｌ）の場合、ＣＭＣは２１℃で約８×１０^－５Ｍ、すなわち約０．０１％ｗ／ｖである。

ＰＳ６０（Ｍｗ１３０９ｇ／ｍｏｌ）の場合、ＣＭＣは２１℃で約２１×１０^－６Ｍ、すなわち約０．００３％ｗ／ｖである。

ＰＳ８０（Ｍｗ１３１０ｇ／ｍｏｌ）の場合、ＣＭＣは２１℃で約１２×１０^－６Ｍ、すなわち約０．００２％ｗ／ｖである。

好ましい実施形態によれば、ポリソルベート濃度は、所与の温度、例えば約２１℃でそのＣＭＣの１～２００倍、好ましくは２～１００倍、例えば約２０または５０倍である。

本発明に係る液体組成物は、トリプトファンまたはチロシンであるアミノ酸を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、トリプトファンまたはチロシンは、活性タンパク質が酸化して機能しなくなってしまうことを防ぐことができると仮定される。実際、神経毒素に対してモル過剰に添加されたアミノ酸がまず第一に酸化されることで、神経毒素を保護すると考えられている。また、トリプトファンまたはチロシンは、ポリソルベートなどの界面活性剤の反応性分解生成物を中和できるとも仮定される。

好ましくは、上記アミノ酸はトリプトファンである。より好ましくは、上記アミノ酸はＬ－トリプトファンである。

アミノ酸濃度は、好ましくは約０．１～５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍＬ、０．２５～３ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．２５、０．５、１、１．５、２または３ｍｇ／ｍＬである。

本発明に係る組成物は、ナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含む緩衝液を含む。本発明者らは、実際、驚くべきことに、ナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含まない緩衝液が毒素の安定性を低下させることを見出した。上記緩衝液はカリウムイオンも含むことが好ましい。

上記緩衝液は、例えば、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩およびリン酸ナトリウム塩を組み合わせて得ることができる。塩化ナトリウム濃度は、好ましくは１０～５００ｍＭ、好ましくは約２５～３００ｍＭ、例えば約２５、５０、７５、１００、１４０、１５０、２００、２５０または３００ｍＭである。

リン酸ナトリウム濃度は、好ましくは１～１００ｍＭ、好ましくは２～５０ｍＭ、例えば約２、５、１０、２０、３０、４０または５０ｍＭである。

塩化カリウム濃度は、好ましくは１～５０ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭ、例えば約１、２、３、４、５または１０ｍＭである。

本発明に係る組成物は、ｐＨが５．５～８である。好ましい実施形態によれば、ｐＨは、６．０～７．５、例えば約６．３、６．３５、６．４、６．４５、６．５、６．５５、６．６、６．６５、６．７、６．７５、６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５または７．５である。好ましくは、ｐＨは生理的ｐＨ（約７．４）から１単位以内である。

本発明に係る組成物は液体である。該組成物は、好ましくは水性希釈剤、より好ましくは水、例えば滅菌水、注射用水、精製水、注射用滅菌水を含む。

好ましくは、上記製剤は等張性であり、患者、特にヒト患者に注射するのに好適である。

ボツリヌス神経毒素の量は、通常、マウスにおける腹腔内投与の半数致死量として定義されるマウスＬＤ５０（５０％致死量）単位で表される。

ボツリヌス毒素のマウスＬＤ５０（ＭＬＤ５０）単位は標準化された単位ではない。実際、市販の毒素の各製造業者が用いるアッセイは、特に希釈緩衝液の選択において異なる。例えば、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）に用いられた試験では、ゼラチンリン酸緩衝液を使用するのに対して、ＢＯＴＯＸ（登録商標）に用いられたアッセイでは、希釈剤として食塩水を使用する。ゼラチン緩衝液は、ＬＤ５０アッセイで使用される高希釈度の毒素を保護すると考えられる。対照的に、希釈剤として食塩水を使用すると、力価が若干損失すると考えられている。これにより、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）アッセイで試験した場合に、ＢＯＴＯＸ（登録商標）１単位が約３単位のＤｙｓｐｏｒｔに相当する理由を説明できるだろう（Ｓｔｒａｕｇｈａｎ，Ｄ．Ｗ．，２００６年，ＡＴＬＡ ３４（３），３０５～３１３頁；ＨａｍｂｌｅｔｏｎおよびＰｉｃｋｅｔｔ，Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ，Ｐ．およびＡ．Ｍ．Ｐｉｃｋｅｔｔ．，１９９４年，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８７．１１：７１９頁）。

マウスＬＤ５０の測定に使用される希釈緩衝液は、ゼラチンリン酸緩衝液であることが好ましい。例えば、マウスＬＤ５０は、Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｘｏｉｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｙｐｅ Ａ ｔｏｘｉｎ．，Ｇ．Ｅ．Ｊｒ ＬｅｗｉｓおよびＰ．Ｓ．Ａｎｇｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，１９８１年，２４８頁に記載されるように測定できる。要約すれば、ボツリヌス毒素サンプルをｐＨ６．５の０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチン０．０７Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液で段階希釈する。体重約２０ｇのマウス群（例えば、１群あたり４～８匹のマウス）に希釈毒素のサンプル（例えば、１動物あたり０．５ｍｌ）を腹腔内注射する。５０％致死量に及ぶように希釈群、例えば５つの希釈群を選択する。マウスを最大９６時間観察し、マウス致死量５０（ＭＬＤ５０）を見積もる。

本発明に係る組成物は、好ましくは１ｍＬあたり４～１００００ＬＤ５０単位、より好ましくは１ｍＬあたり１０～２０００ＬＤ５０単位、例えば１ｍＬあたり２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００または１５００ＬＤ５０単位のボツリヌス神経毒素を含む。

ボツリヌス神経毒素の量は、ｎｇで表すこともできる。本発明に係る組成物は、好ましくは１ｍＬあたり約０．０１～７５ｎｇ、より好ましくは１ｍＬあたり約０．０３～２０ｎｇ、さらに好ましくは１ｍＬあたり約０．１～１５ｎｇ、例えば１ｍＬあたり約０．１５、０．３、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｇのボツリヌス神経毒素を含む。

本発明に係る製剤は、動物性タンパク質を含まない。特に、本発明に係る組成物はアルブミン、特にヒト血清アルブミンを含まない。好ましくは、本発明に係る組成物は動物性物質を含まず、これは、動物（ヒトを含む）由来の成分を含まないことを意味する。好ましくは、本発明に係る組成物は、タンパク質性神経毒素以外のタンパク質を含まない。別の実施形態によれば、本発明に係る組成物は、タンパク質性神経毒素以外のタンパク質を含まず、１種以上のＮＡＰ（神経毒素結合タンパク質）を含む。念のためだが、アミノ酸はタンパク質ではないことに注意されたい。

本発明の一実施形態によれば、上記組成物は、糖を含まず、単糖、二糖、および多糖を含まない。

本発明に係る液体組成物は経時的に安定である。例えば、２～８℃で２ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で３ヶ月間安定である。好ましい実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で６ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で１２ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で１８ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で２４ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で３６ヶ月間安定である。一実施形態によれば、室温、例えば２５℃で３ヶ月間安定である。一実施形態によれば、室温、例えば２５℃で６ヶ月間安定である。一実施形態によれば、３７℃で２ヶ月間安定である。

本発明に係る液体組成物は、０℃～３０℃の温度で保存することが好ましい。好ましい実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で保存する。別の実施形態では、室温で保存する。好ましくは、凍結されない。

安定性は、ボツリヌス神経毒素の活性を経時的に比較することで評価できる。ボツリヌス神経毒素の活性とは、細胞上のその標的受容体に結合でき、軽鎖を細胞内に転移でき、および／またはその標的ＳＮＡＲＥタンパク質を切断できるボツリヌス神経毒素の活性を指すものであってもよい。

ボツリヌス神経毒素活性を測定する方法は当技術分野において周知である。ボツリヌス神経毒素活性は、例えば、上述したようなマウス致死アッセイ（ＬＤ５０）、マウス横隔神経片側横隔膜アッセイなどの筋肉組織を用いたアッセイ（例えば、Ｂｉｇａｌｋｅ，Ｈ．およびＲｕｍｍｅｌ Ａ．，Ｔｏｘｉｎｓ ７．１２（２０１５年）：４８９５～４９０５頁に記載されるもの）、細胞を用いたアッセイ（例えば、国際公開第２０１３４９５０８号または国際公開第２０１２１６６９４３号に記載されるもの）、またはＢｏＴｅｓｔ（Ｒ）（ＢｉｏＳｅｎｔｉｎｅｌ Ｉｎｃ．製のボツリヌス神経毒素検出キット）などの細胞外タンパク質分解活性アッセイを用いて評価できる。

好ましくは、本発明に係る組成物は、所与の温度で所与の期間にわたって活性損失が所与のパーセント以下である場合、安定であると考えられる。

一実施形態によれば、本発明に係る組成物は、２～８℃で３、６、１２、１８、２４または３６ヶ月にわたって細胞外タンパク質分解活性の損失が３０％以下である場合、例えば５℃で６ヶ月にわたって細胞外タンパク質分解活性の損失が３０％以下である場合、安定であると考えられる。好ましくは、本発明に係る組成物は、５℃で３ヶ月にわたって、より好ましくは５℃で６、１２、１８、２４または３６ヶ月にわたって細胞外タンパク質分解活性の損失が２０％以下である場合、安定であると考えられる。別の実施形態によれば、本発明に係る組成物は、室温、例えば２５℃で３ヶ月にわたって細胞外タンパク質分解活性の損失が４０％以下である場合、安定であると考えられる。好ましくは、本発明に係る組成物は、２５℃で３ヶ月にわたって、より好ましくは２５℃で６ヶ月にわたって細胞外タンパク質分解活性の損失が３０％以下である場合、安定であると考えられる。別の実施形態によれば、本発明に係る組成物は、３７℃で２ヶ月にわたって細胞外タンパク質分解活性の損失が５０％以下である場合、安定であると考えられる。細胞外タンパク質分解活性は、ＢｏＴｅｓｔ（Ｒ）アッセイで測定できる。

一実施形態によれば、本発明に係る組成物は、２～８℃で２、３、６、１２、１８、２４または３６ヶ月にわたってＭＬＤ５０単位の損失が３０％以下である場合、例えば５℃で６ヶ月にわたってＭＬＤ５０単位の損失が３０％以下である場合、安定であると考えられる。好ましくは、本発明に係る組成物は、５℃で２ヶ月にわたって、より好ましくは５℃で３、６、１２、１８、２４または３６ヶ月にわたってＭＬＤ５０単位の損失が２０％以下である場合、安定であると考えられる。別の実施形態によれば、本発明に係る組成物は、室温、例えば２５℃で２または３ヶ月にわたってＭＬＤ５０単位の損失が４０％以下である場合、安定であると考えられる。好ましくは、本発明に係る組成物は、２５℃で３ヶ月にわたって、より好ましくは２５℃で６ヶ月にわたってＭＬＤ５０単位の損失が３０％以下である場合、安定であると考えられる。別の実施形態によれば、本発明に係る組成物は、３７℃で２ヶ月にわたってＭＬＤ５０単位の損失が５０％以下である場合、安定であると考えられる。ＭＬＤ５０単位は、上述したように測定することができる。

本発明に係る液体組成物は、密封したバイアルまたはシリンジ、例えばガラスバイアルまたはシリンジ、好ましくはタイプＩ（または「ボディニュートラル」）ガラスバイアルまたはシリンジ中に保存できる。バイアルまたはシリンジ中に酸素がないまたはごくわずかしかないことが好ましい。バイアルまたはシリンジは、例えば、１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満の酸素量の雰囲気で充填することができ、バイアル中の保護雰囲気として窒素ガスを使用できる。ガラスバイアルを使用する場合、例えば、クロロブチルまたはブロモブチルゴム栓で蓋をすることができ、上記ゴム栓は、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（Ｒ）コーティングされていてもよい。好ましくは、本発明に係る液体組成物は、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（Ｒ）コーティングされた栓で蓋をしたガラスバイアル中に保存する。

一実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・１ｍＬあたり４～１００００ＬＤ５０単位のボツリヌス神経毒素、
・０．００１～１５％ｖ／ｖのポリソルベート、
・０．１～５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１０～５００ｍＭのＮａＣｌ、
・１～５０ｍＭのＫＣｌ、
・１～１００ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨ５．５～８であり、５℃で６ヶ月間安定である。

一実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・１ｍＬあたり１０～２０００ＬＤ５０単位のボツリヌス神経毒素、
・０．００５～２％ｖ／ｖのポリソルベート、
・０．１～５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・２５～３００ｍＭのＮａＣｌ、
・１～１０ｍＭのＫＣｌ、
・２～５０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨ６．０～７．５であり、５℃で１２ヶ月間安定である。

一実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・１ｍＬあたり１０～２０００ＬＤ５０単位のボツリヌス神経毒素、
・０．０５～０．２％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・０．１～５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・２５～３００ｍＭのＮａＣｌ、
・１～１０ｍＭのＫＣｌ、
・２～５０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨ６．０～７．５であり、５℃で１２ヶ月間安定である。

一実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．２％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・１ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．６である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．０４％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・１ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．９である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ｂ、
・０．２５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、
・４ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約７．４である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．０１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・０．２５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・２５５ｍＭのＮａＣｌ、
・２ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約７．２である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．０１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・０．２５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・２５５ｍＭのＮａＣｌ、
・１０ｍＭのＫＣｌ、
・５０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．３である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・０．２５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・２５５ｍＭのＮａＣｌ、
・５０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．３である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・３ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・２５５ｍＭのＮａＣｌ、
・１０ｍＭのＫＣｌ、
・５０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約７．２である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・１．６２５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．７５である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．０１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・１ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．７５である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・０．１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・１ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．７５である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ａ、
・１％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
・１ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約６．７５である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ｂ、
・１５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、
・１ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約７．４である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ｂ、
・１５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、
・４ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約７．４である。

別の実施形態によれば、本発明に係る液体組成物は、
・ボツリヌス神経毒素Ｂ、
・０．２５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、
・４ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
・１４０ｍＭのＮａＣｌ、
・３ｍＭのＫＣｌ、
・１０ｍＭのリン酸ナトリウム
を含むか、または本質的にそれらからなり、
ｐＨが約７．４である。

別の態様は、治療における本発明に係る液体組成物の使用である。

本発明に係る液体組成物は、筋障害、神経筋障害、神経障害、眼科障害、疼痛障害、心理的障害、関節障害、炎症性障害、内分泌障害または泌尿器障害を治療または予防するための治療に使用できる。

例えば、本発明に係る液体組成物は、以下から選択される疾患、異常または症候群を治療または予防するために使用できる:
・眼瞼痙攣、斜視（拘束型または筋性斜視を含む）、弱視、動揺視、保護性眼瞼下垂、角膜保護のための治療的眼瞼下垂、眼振、内斜視、複視、眼瞼内反、眼瞼後退、眼窩ミオパチー、眼球斜位、共同性眼位異常、非共同性眼位異常、原発性または二次性内斜視または外斜視、核間性眼筋麻痺、斜偏位、デュアン症候群および上眼瞼後退からなる群から選択される眼科障害、
・片側顔面痙攣、斜頸、小児または成人の痙縮（脳性麻痺、脳卒中後、多発性硬化症、外傷性脳損傷または脊髄損傷患者など）、特発性限局性ジストニア、筋硬直、書痙、手のジストニア、第ＶＩ神経麻痺、顎口腔ジストニア、頭部振戦、遅発性ジスキネジア、遅発性ジストニア、職業性痙攣（音楽家の痙攣を含む）、顔面神経麻痺、閉口痙攣、顔面痙攣、病的共同運動、振戦、原発性書字振戦、ミオクローヌス、全身強直性症候群、足のジストニア、顔面麻痺、ｐａｉｎｆｕｌ－ａｒｍ－ａｎｄ－ｍｏｖｉｎｇ－ｆｉｎｇｅｒｓ症候群、チック障害、ジストニア性チック、トゥレット症候群、神経性筋強直症、顎の震え、外直筋麻痺、ジストニア性内反足、下顎ジストニア、ラビット症候群、小脳性振戦、第ＩＩＩ神経麻痺、軟口蓋ミオクローヌス、アカシジア（ａｋａｓｔｈｅｓｉａ）、筋痙攣、第ＩＶ神経麻痺、すくみ足歩行、伸筋躯幹ジストニア、顔面神経麻痺後の病的共同運動、二次性ジストニア、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、てんかん、オフピリオドジストニア、頭部破傷風、ミオキミアおよび筋痙攣線維束性収縮症候群を含む運動障害、
・痙攣性発声障害、耳の障害、聴覚障害、イヤークリック、耳鳴り、めまい、メニエール病、蝸牛神経機能障害、吃音、輪状咽頭嚥下障害、歯ぎしり、慢性誤嚥の喉頭閉鎖、声帯肉芽腫、喉頭室ジストニア（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｏｎｉａ）、仮声帯発声、変声障害、開口障害、いびき、声の震え、誤嚥、舌突出ジストニア、口蓋の震え、唇の過蓋咬合および喉頭ジストニア、ファーストバイト症候群を含む耳鼻咽喉科障害、
・アカラシア、裂肛、便秘、顎関節機能障害、オディ括約筋機能障害、オディ括約筋の持続性緊張亢進、腸管筋障害、恥骨直腸筋症候群、アニスムス、幽門痙攣、胆嚢機能不全、胃腸または食道の運動機能障害、びまん性食道痙攣および胃不全麻痺を含む胃腸障害、
・排尿筋括約筋協調不全、排尿筋反射亢進、（パーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中または多発性硬化症患者などにおける）神経性膀胱機能障害、過活動膀胱、神経性排尿筋過活動、膀胱痙攣、尿失禁、尿閉、膀胱頚部肥大、排尿障害、間質性膀胱炎、膣痙、子宮内膜症、骨盤痛、前立腺肥大（良性前立腺肥大症）、前立腺痛、前立腺癌および持続勃起症を含む泌尿生殖器障害、
・皮膚細胞増殖性障害、皮膚創傷、乾癬、酒さ、にきび；フォックス・フォアダイス症候群またはヘイリー・ヘイリー病などの希少な遺伝性皮膚疾患；ケロイドおよび肥厚性瘢痕の減少；ポアサイズの減少；皮膚の炎症症状；皮膚の疼痛性炎症症状を含む皮膚科障害、
・背部痛（上部背痛、下部背痛）、筋筋膜痛、緊張型頭痛、線維筋痛症、有痛性症候群、筋肉痛、片頭痛、むち打ち症、関節痛、術後疼痛、筋けいれんに関連しない疼痛、および平滑筋障害に関連した疼痛を含む疼痛障害、
・膵炎、神経性炎症性障害（痛風、腱炎、滑液包炎、皮膚筋炎および強直性脊椎炎を含む）を含む炎症性障害、
・過度の腺分泌、多汗症（腋窩多汗症、手掌多汗症およびフレイ症候群を含む）、唾液分泌過多、流涎症、臭汗症、粘液分泌過多、流涙過多、ホロクリン腺機能不全、皮脂分泌過剰などの分泌障害、
・鼻炎（アレルギー性鼻炎を含む）、ＣＯＰＤ、喘息および結核を含む呼吸器障害、
・筋肉肥大、咬筋肥大、末端肥大症、および筋肉痛を伴う神経性前脛骨筋肥大を含む肥大性障害、
・テニスひじ（またはひじの上顆炎）、関節の炎症、股関節炎、変形性関節症、肩の回転筋帽（ｒｏｔａｔｏｒ ｍｕｓｃｌｅ ｃａｐ）の病理、関節リウマチおよび手根管症候群を含む関節障害、
・２型糖尿病、高グルカゴン血症、高インスリン血症、低インスリン血症、高カルシウム血症、低カルシウム血症、甲状腺障害（グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症を含む）、副甲状腺障害（副甲状腺機能亢進症および副甲状腺機能低下症を含む）、グッシング症候群および肥満などの内分泌障害、
・全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、
・傍神経節腫、前立腺癌および骨腫瘍などの増殖性疾患、
・スポーツ傷害、筋肉傷害、腱創傷および骨折を含む外傷性傷害、ならびに
・獣医学的用途（例えば、哺乳動物の不動化、ウマ疝痛、動物のアカラシア、または動物の筋痙攣）。

また、本発明に係る液体組成物は、美容医療において（すなわち、美容的外観を改善するために）、特に皮膚のしわ、特にしかめ面ラインなどの顔のしわ、目の輪郭のしわ、眉間しわ線、への字口、首のしわ（プラティスマバンド）、顎のしわ（オトガイ筋、橙皮状皮膚、割れ顎）、額のしわ、「引っかき傷のある皮膚」のしわ、鼻のリフト治療または睡眠線を治療または予防するために使用できる。本発明のこの態様によれば、美容的外観を改善するために治療または予防する対象は、上述した障害、異常または症候群のいずれにも罹患していないことが好ましい。より好ましくは、上記対象は健常対象である（すなわち、いかなる疾患、異常または症候群にも罹患していない）。

本発明に係る液体組成物は、別の治療用化合物と併用できる。一実施形態では、本発明に係る液体組成物は、疼痛を治療するための鎮痛化合物と組み合わせて、特に国際公開第２００７／１４４４９３号（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているモルヒネなどのオピオイド誘導体と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明に係る液体組成物は、例えば国際公開第２０１５／０４４４４１６号（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように前立腺癌を治療するために、ヒアルロン酸と組み合わせて投与する。

本発明のさらなる態様は、動物由来タンパク質を含まない液体組成物においてタンパク質性神経毒素を分解から保護するための、トリプトファンおよびチロシンから選択されるアミノ酸の使用である。

好ましい実施形態によれば、上記アミノ酸はトリプトファン、より好ましくはＬ－トリプトファンである。

好ましくは、上記タンパク質性神経毒素はボツリヌス神経毒素である。本発明の一実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は複合体のボツリヌス神経毒素である。別の実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は高純度ボツリヌス神経毒素である。本発明の一実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は、その天然クロストリジウム株から精製したボツリヌス神経毒素である。別の実施形態によれば、上記ボツリヌス神経毒素は、大腸菌などの異種宿主において組換え的に生産されたボツリヌス神経毒素である。本発明によれば、上記ボツリヌス神経毒素は、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのＢｏＮＴであってもよい。本発明によれば、ボツリヌス神経毒素は、上述したような修飾ボツリヌス神経毒素であってもよい。本発明によれば、組換えボツリヌス神経毒素は、上述したようなキメラボツリヌス神経毒素であってもよい。

好ましい実施形態によれば、上記アミノ酸は、界面活性剤、ならびにナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含む緩衝液と併用され、かつ上記液体組成物のｐＨが５．５～８である。好ましくは、上記界面活性剤は非イオン性界面活性剤、より好ましくはポリソルベート、例えばＰＳ２０、ＰＳ６０またはＰＳ８０である。最も好ましくは、上記非イオン性界面活性剤はＰＳ８０である。上記緩衝液はカリウムイオンも含むことが好ましい。上記緩衝液は、例えば、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩およびリン酸ナトリウム塩を組み合わせて得ることができる。好ましい実施形態によれば、上記ｐＨは、６．０～７．５、例えば６．３、６．３５、６．４、６．４５、６．５、６．５５、６．６、６．６５、６．７、６．７５、６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５または７．５である。好ましくは、上記ｐＨは生理的ｐＨ（約７．４）から１単位以内である。

本発明に係る使用の好ましい実施形態によれば、上記液体組成物は２ヶ月間安定である。例えば、２～８℃で２ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で３ヶ月間安定である。好ましい実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で６ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で１２ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で１８ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で２４ヶ月間安定である。一実施形態によれば、２～８℃、例えば５℃で３６ヶ月間安定である。一実施形態によれば、室温、例えば２５℃で３ヶ月間安定である。一実施形態によれば、室温、例えば２５℃で６ヶ月間安定である。

１．安定した液体ボツリヌス毒素Ａ製剤の調製
１５ｎｇ／ｍＬの高純度ＢｏＮＴ／Ａと、１５％ｖ／ｖのポリソルベート２０と、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびシステイン（Ｃｙｓ）から選択したアミノ酸、またはメチオニン（Ｍｅｔ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびシステイン（Ｃｙｓ）の混合物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と、リン酸緩衝生理食塩水（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製ＰＢＳ）（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４）とを含む液体ボツリヌス毒素調製物を調製し、０．２２μｍＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）フィルターを使用して濾過し、２ｍＬシリコーン処理ガラスシリンジに４０℃で６日間保管し、その後、各調製物について力価試験を実施した。

力価試験では、いずれもタンパク質吸着性が低い容器であるＰＴＦＥ処理したゴムセプタム（Ｃｈｒｏｍａｃｏｌ）を含む蓋が付いた２ｍＬガラスバイアル（Ｃｈｒｏｍａｃｏｌ、Ｇｏｌｄ）または１．７ｍＬプラスチックマイクロ遠心管（Ａｘｙｇｅｎ、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）中に、調製物が入った注射器の中身を取り出した。続いて、３％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて調製物を希釈した。各調製物について、５０μＬのサンプルを、希釈を行ったのと同じ日にマウスの腓腹筋に注射した。マウスを３日間監視し、麻痺度を記録した。

結果を表１に示す。

チロシンおよびトリプトファンは、ＢｏＮＴ／Ａ分解に対して保護効果を示すことが分かった。トリプトファンは最も強力な保護効果を示すことが分かった。システイン、および４つのアミノ酸すべてを含む混合物は保護効果を示さなかった。

２．安定した液体ボツリヌス毒素Ｂ製剤の調製
３５０ｎｇ／ｍＬの高純度ＢｏＮＴ／Ｂと、１５％ｖ／ｖのポリソルベート２０と、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびシステイン（Ｃｙｓ）から選択したアミノ酸、またはメチオニン（Ｍｅｔ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびシステイン（Ｃｙｓ）の混合物と、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とを含む液体ボツリヌス毒素調製物を調製し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過し、２ｍＬシリコーン処理ガラスシリンジに４０℃で２週間保管し、その後、上述したように各調製物について力価試験を実施した。

結果を表２に示す。

チロシンおよびトリプトファンは、ＢｏＮＴ／Ｂ分解に対して保護効果を示すことが分かった。システイン、および４つのアミノ酸すべてを含む混合物も保護効果を示したが、その程度はより弱いものであった。

３．各種濃度のトリプトファンおよびポリソルベート２０の評価
高純度ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｂと、様々な濃度のポリソルベート２０（ＰＳ２０）およびトリプトファンと、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とを含む液体ボツリヌス毒素調製物を調製し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過し、２ｍＬシリコーン処理ガラスシリンジに保管した。後肢麻痺力価試験を上述したように各調製物について実施した。

結果を表３に示す。

麻痺度（ＰＡ）：１．つま先に影響有り；２．後肢にわずかな痺れ；３．両後肢が麻痺；４．後肢が麻痺
精製による溶出緩衝液（５）：０．２％（ｖ：ｖ）ポリソルベート２０を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、および４００ｍＭ塩化ナトリウム。
＊２５℃の８ｍｇ／ｍＬ Ｔｒｐ０．２５％ポリソルベート２０の２種類のＢｏＮＴ／Ａ希釈液の混同がおそらく生じた。

４．ＢｏＮＴ／Ｂ調製物中の各種塩濃度の評価
１００ｎｇ／ｍＬの高純度ＢｏＮＴ／Ｂと、ポリソルベート２０と、様々なアミノ酸供給業者から入手したトリプトファンと、ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ｐＨ７の１２ｎＭリン酸緩衝液（Ａｐｏｔｅｋｅｔ）、およびｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）（Ｆｌｕｋａ製ＮａＡｃおよびＭｅｒｃｋ製酢酸）から選択した緩衝液とを含む液体ボツリヌス毒素調製物を調製し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過し、２ｍＬシリコーン処理ガラスシリンジに保管した。後肢麻痺力価試験を上述したように各調製物について実施した。

結果を表４に示す。

結果から、（ナトリウムイオン、塩化物イオン、リン酸イオンおよびカリウムイオンを含む）ＰＢＳ緩衝液を含む調製物が、ボツリヌス毒素の安定性に影響を及ぼすように思われた。

５．各種安定剤の評価
１５ｎｇ／ｍＬの高純度ＢｏＮＴ／Ａと、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）またはポリソルベート８０（ＰＳ８０）またはＨＳＡと、トリプトファンと、ＰＢＳとを含む液体ボツリヌス毒素調製物を調製し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過し、２ｍＬシリコーン処理ガラスシリンジに保管した。後肢麻痺力価試験を上述したように各調製物について実施した。

結果を表５に示す。

６．各種製剤の評価
１０ｎｇ／ｍＬの高純度ＢｏＮＴ／Ａと、０．２５％のＰＳ８０と、１ｍｇ／ｍＬのトリプトファンと、ＰＢＳとを含む液体ボツリヌス毒素調製物を上述したように調製した。ＨＣｌを添加してｐＨを６．６および７．０に調整した。各調製物を４０℃で５週間保管した。

次いで各調製物を１０倍希釈し、後肢麻痺力価試験を上記のように実施した（注射１回につき０．０５ｎｇ）。いずれの場合も、後肢麻痺を３日目に観察した。麻痺はｐＨ６．６の調製物でより強かった。

７．各種製剤の評価
０．３ｎｇ／ｍＬの高純度ＢｏＮＴ／Ａと、ＰＳ２０およびＰＳ８０から選択したポリソルベートと、１ｍｇ／ｍＬのトリプトファンと、１２ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）とを含む液体ボツリヌス毒素調製物を上述したように調製した。１．２Ｍ ＨＣｌを添加して各調製物のｐＨをｐＨ６．６または６．９に調整した。

ポリソルベート２０は、１つの濃度、すなわち、そのＣＭＣ（臨界ミセル濃度、２１℃で約０．０１％ｗ／ｖ）の約２０倍に相当する０．２％ｗ／ｖで試験した。ポリソルベート８０は、そのＣＭＣ（２１℃で約０．００２％ｗ／ｖ）の約２０倍および１００倍にそれぞれ相当する０．０４％および０．２％ｗ／ｖで試験した。

各調製物について、０．５ｍＬを１ｍＬロングガラスシリンジ（ＢＤ）に充填し、フルオロカーボンコーティングプランジャで密封した。

力価は、上述したようにマウスの後肢麻痺試験により測定した。

５℃で６ヶ月保存後および２５℃保存後、いずれの製剤においても力価の低下は観察されなかった。

８．各種製剤の評価
様々な濃度のポリソルベート８０、トリプトファン、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび様々なｐＨを用いて、高純度Ａ型ボツリヌス神経毒素を含む各種製剤を１９種類調製した。各製剤は、５００Ｕ／ｍＬの目標名目力価を有していた。各製剤を脱気し、０．２μｍフィルターで濾過し、バイアルに充填した。バイアル内の保護雰囲気として窒素ガスを使用した。充填は嫌気性チャンバ内で行った。２ｍＬガラスバイアルに窒素雰囲気中で各製剤を１ｍＬアリコートとして充填し、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（Ｒ）栓で蓋をし、アルミニウムフリップオフシールで密封し、直立で保管した。

１９種類の製剤の安定性は、ＢｏＴｅｓｔ（Ｒ）を用いて力価を測定して５℃、２５℃および３７℃で評価した。

すべての製剤について溶液は清澄なままであり、大部分は無色であった。

この試験で試験した賦形剤濃度では、試験した時間間隔中に製剤のｐＨに影響が及ぼされないように思われる。力価結果を表９に示す。

いくつかの組成物については、５℃で６ヶ月にわたり３０％以下の力価の損失、および／または２５℃で３ヶ月にわたり約４０％以下の力価の損失、および／または３７℃で２ヶ月にわたり約５０％以下の力価の損失があった。

９．ＰＳ６０の評価
０．１％（ｖ／ｖ）ＰＳ６０、１ｍｇ／ｍＬのＬ－トリプトファン、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、および注射用水を用いて、高純度Ａ型ボツリヌス神経毒素を含む製剤を調製した。ＨＣｌでｐＨを６．７５に調整した。製剤は、１００Ｕ／ｍＬの目標名目力価を有していた。製剤を脱気し、０．２μｍフィルターで濾過し、窒素雰囲気の嫌気性チャンバ中の２ｍＬバイアルに１ｍＬの充填量で無菌充填した。バイアル内の保護雰囲気として窒素ガスを使用した。バイアルは、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（Ｒ）栓で蓋をしてアルミニウムフリップオフシールで密封した。

本明細書に記載のＭＬＤ５０試験によって、３７℃および２５℃での経時的力価を測定した。

３７℃では、９週間後の残存力価は初期力価の約５０～５５％であった。

２５℃では、３ヶ月後の残存力価は初期力価の約８０％であった。

Claims (20)

1. ボツリヌス神経毒素と、非イオン性界面活性剤と、トリプトファンおよびチロシンから選択されるアミノ酸と、ナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含む緩衝液とを含む液体組成物であって、
   ｐＨ５．５～８であり、
   動物由来タンパク質を含まず、かつ
   ２～８℃で２ヶ月間安定である液体組成物。
2. 上記非イオン性界面活性剤がポリソルベートである、請求項１に記載の液体組成物。
3. ポリソルベートがポリソルベート２０、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０である、請求項２に記載の液体組成物。
4. 上記アミノ酸がトリプトファンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の液体組成物。
5. トリプトファンがＬ－トリプトファンである、請求項４に記載の液体組成物。
6. 上記緩衝液がカリウムイオンをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の液体組成物。
7. ｐＨが６．０～７．５である請求項１～６のいずれか一項に記載の液体組成物。
8. ５℃で２、３、６、１２、１８、２４または３６ヶ月にわたって起こる細胞外タンパク質分解活性の損失が３０％以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の液体組成物。
9. ボツリヌス神経毒素が、複合体の天然ボツリヌス神経毒素、高純度天然ボツリヌス神経毒素、および組換えボツリヌス神経毒素から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の液体組成物。
10. 上記ボツリヌス神経毒素が、ボツリヌス神経毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ、修飾ボツリヌス神経毒素、およびキメラボツリヌス神経毒素から選択される組換えボツリヌス神経毒素である、請求項９に記載の液体組成物。
11. １ｍＬあたり４～１００００ＬＤ５０単位のボツリヌス神経毒素、
    ０．００１～１５％ｖ／ｖのポリソルベート、
    ０．１～５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
    １０～５００ｍＭのＮａＣｌ、
    １～５０ｍＭのＫＣｌ、
    １～１００ｍＭのリン酸ナトリウム
    を含み、
    ｐＨ５．５～８であり、かつ５℃で１２ヶ月間安定である請求項１～１０のいずれか一項に記載の液体組成物。
12. １ｍＬあたり１０～２０００ＬＤ５０単位のボツリヌス神経毒素、
    ０．０５～０．２％ｖ／ｖのポリソルベート８０、
    ０．１～５ｍｇ／ｍＬのトリプトファン、
    ２５～３００ｍＭのＮａＣｌ、
    １～１０ｍＭのＫＣｌ、
    ２～５０ｍＭのリン酸ナトリウム
    を含み、
    ｐＨ６．０～７．５であり、かつ５℃で１８ヶ月間安定である請求項１１に記載の液体組成物。
13. 治療に使用するための請求項１～１２のいずれか一項に記載の液体組成物。
14. 筋障害、神経筋障害、神経障害、眼科障害、疼痛障害、心理的障害、関節障害、炎症性障害、内分泌障害または泌尿器障害を治療または予防するのに使用するための請求項１３に記載の液体組成物。
15. 美容医療用の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の液体組成物。
16. 皮膚のしわを治療または予防するための、請求項１５に記載の美容医療用の液体組成物。
17. 皮膚のしわが、顔のしわを含む、請求項１６に記載の美容医療用の液体組成物。
18. 顔のしわが、しかめ面ライン、目の輪郭のしわ、眉間しわ線、への字口、首のしわ、顎のしわ、額のしわ、「引っかき傷のある皮膚」のしわ、または鼻のリフト治療または睡眠線を含む、請求項１７に記載の美容医療用の液体組成物。
19. 動物由来タンパク質を含まない液体組成物においてボツリヌス神経毒素を分解から保護するための、トリプトファンおよびチロシンから選択されるアミノ酸の使用であって、
    前記液体組成物が２～８℃で２ヶ月間安定であり、非イオン性界面活性剤、ならびにナトリウムイオン、塩化物イオンおよびリン酸イオンを含む緩衝液を含み、ｐＨ５．５～８である、
    使用。
20. 上記アミノ酸がトリプトファンである、請求項１９に記載の使用。