CN111701010A - 用色氨酸或酪氨酸稳定的液体神经毒素制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及不含动物蛋白质的稳定液体神经毒素制剂，其包含表面活性剂，选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸，包含钠、氯和磷酸根离子的缓冲剂，其pH值在5.5和8之间，并且其稳定2个月。这些组合物适用于治疗，特别是用于施用给患者以获得所需的治疗或审美效果。本发明还涉及选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸用于保护蛋白质性神经毒素免于在不含动物来源的蛋白质的液体组合物中降解的用途。

Description

用色氨酸或酪氨酸稳定的液体神经毒素制剂

本申请为申请号为2017800445651，申请日为2017年5月26日，发明名称为“用色氨酸或酪氨酸稳定的液体神经毒素制剂”的分案申请。

技术领域

本发明涉及无动物蛋白质的液体神经毒素制剂。特别地，本发明涉及用非蛋白质赋形剂稳定的无动物蛋白质的液体肉毒杆菌神经毒素制剂。

本文所述的神经毒素制剂适用于治疗，特别是施用给患者以达到所需的治疗或审美效果(aesthetic effect)。

背景技术

由梭菌菌株天然产生的梭菌神经毒素是迄今已知的毒性最大的生物剂，同时是治疗许多神经肌肉和内分泌疾病的有力工具，包括颈肌张力障碍、痉挛、眼睑痉挛、多汗症或流涎。它们还在审美领域中用于抚平皱纹。

为了适合用作药物产品，神经毒素组合物必须能够储存而不会显著丧失神经毒素活性。

在目前批准的所有肉毒神经毒素制剂中，动物(包括人)蛋白质，通常是人血清白蛋白(HSA)，用作稳定剂。

然而，药物组合物中动物蛋白质如HSA的存在是不希望的，这归因于非意愿地将动物源性传染物如朊病毒传播给患者的风险，即使这种风险低。

本领域已经公开了不含动物蛋白质的肉毒杆菌毒素制剂。例如，WO0158472描述了冻干组合物，其中多糖如2-羟乙基淀粉用于稳定肉毒杆菌毒素。WO2005007185描述了组合物，其中表面活性物质和选自Glu和Gln或Asp和Asn的至少两种氨基酸的混合物用于稳定肉毒杆菌毒素。

然而，大多数现有技术的制剂在液体形式时是不稳定的，并因此以冻干或冷冻干燥的形式储存。在施予患者之前，医师需要将这些制剂重建于无菌盐水溶液中。该重建步骤造成医生的时间损失、稀释错误的风险以及重构过程中的污染风险。肉毒杆菌毒素提供者还必须培训医生，以确保重建步骤得到恰当执行。

因此，液体制剂是有利的，因为它们避免了医生的时间损失、稀释错误的风险、污染风险并且无需为提供者提供培训。

例如在WO 2006005910中描述了不含HSA的液体制剂，其公开了包含表面活性剂、氯化钠和二糖的液体肉毒杆菌毒素制剂。WO2009008595公开了包含聚山梨醇酯20和甲硫氨酸的液体肉毒杆菌毒素制剂。

本发明的目的是提供有利的无动物蛋白质的肉毒杆菌神经毒素液体制剂，其适于储存和用于治疗。特别地，稳定制剂应该保持产品稳定性，不含动物蛋白质，并且还适合于稳定不含复合蛋白质的神经毒素。

发明内容

本发明的第一方面是一种液体组合物，其包含蛋白质性神经毒素，表面活性剂，选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸，包含钠、氯和磷酸根离子的缓冲液，或基本上由其组成，其pH值在5.5和8之间，其随时间稳定且其不含动物来源的蛋白质。

另一方面是本发明的液体组合物在治疗和/或美容中的用途。

本发明的另一方面是选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸用于保护蛋白质性神经毒素免于在不含动物来源的蛋白质的液体组合物中降解的用途。

具体实施方式

本发明的第一方面是液体组合物，其包含蛋白质性神经毒素，表面活性剂，选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸，包含钠、氯和磷酸根离子的缓冲液，或基本上由其组成，其pH值在5.5和8之间，其随时间稳定且其不含动物来源的蛋白质。

“不含动物蛋白”应理解为不包含动物包括人来源的蛋白。

神经毒素是一类靶向神经细胞并影响神经功能的物质。蛋白质性神经毒素包括肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。优选地，蛋白质性神经毒素是肉毒杆菌神经毒素。

肉毒杆菌神经毒素是150kDa金属蛋白酶，其由通过二硫桥连接的活性形式的50kDa轻链(L)和100kDa重链(H)组成。L链是锌-蛋白酶，其在细胞内切割参与囊泡介导的神经递质释放的SNARE(可溶性NSF附着蛋白受体)蛋白之一，从而破坏神经递质介导的机制。重链包括两个结构域：N端50kDa易位结构域(H_N)和C端50kDa受体结合结构域(H_C)。肉毒杆菌神经毒素的H_C结构域包含两个不同的结构特征，称为H_CC和H_CN结构域。据信参与受体结合的氨基酸残基主要位于H_CC结构域中。

肉毒杆菌神经毒素已被分类为7种抗原性不同的血清型(A至G)。每种血清型的示例性氨基酸序列在本文中为SEQ ID NO 1至7。

对于每个序列，不同的结构域可以例如如下所示。

血清型	L链	H<sub>N</sub>结构域	H<sub>CN</sub>结构域	H<sub>CC</sub>结构域
					BoNT/A(SEQ ID NO 1)	1-448	449-871	872-1110	1111-1296
BoNT/B(SEQ ID NO 2)	1-440	441-858	859-1097	1098-1291
					BoNT/C(SEQ ID NO 3)	1-441	442-866	867-1111	1112-1291
BoNT/D(SEQ ID NO 4)	1-445	446-862	863-1098	1099-1276
					BoNT/E(SEQ ID NO 5)	1-422	423-845	846-1085	1086-1252
BoNT/F(SEQ ID NO 6)	1-439	440-864	865-1105	1106-1274
					BoNT/G(SEQ ID NO 7)	1-441	442-863	864-1105	1106-1297

技术人员理解，每个肉毒杆菌神经毒素结构域中均可以存在一些变化。

例如，BoNT通过阻止乙酰胆碱的释放从而防止肌肉收缩而作用于神经肌肉神经连接。神经末梢中毒是可逆的，且其持续时间因不同的BoNT血清型而异。

天然BoNT由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和其他梭菌属物种如酪酸杆菌(C.butyricum)、巴氏梭菌(C.baratii)和阿根廷梭菌(C.argentinense)产生，作为保护神经毒素免于蛋白水解降解的多蛋白复合物的一部分。“复合物形式的肉毒杆菌神经毒素”是指肉毒杆菌神经毒素和在性质上属于这类多蛋白质复合物的部分的一种或多种蛋白质(神经毒素相关蛋白质或“NAP”)。NAP包括无毒的非血凝素(NTNH)蛋白和血凝素蛋白(HA-17、HA-33和HA-70)。“高纯度肉毒杆菌神经毒素”是指基本上不含NAP的肉毒杆菌神经毒素。

根据本发明的一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是复合物形式的肉毒杆菌神经毒素。根据另一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是高纯度的肉毒杆菌神经毒素。

通过培养天然梭菌菌株生产BoNT并以复合物形式或高纯度形式纯化它们的方法是本领域熟知的，并且描述于例如Pickett，Andy."Botulinum toxin as a clinicalproduct:manufacture and pharmacology."Clinical Applications of BotulinumNeurotoxin.Springer New York,2014.7-49。

高纯度或基本上纯的肉毒杆菌神经毒素可以从包含肉毒杆菌毒素的蛋白质复合物中获得，例如根据Current Topics in Microbiology and Immunology(1995),195,p.151-154中描述的方法。

或者，可以通过在异源宿主如大肠杆菌中重组表达BoNT基因并从中纯化来产生高纯度肉毒杆菌神经毒素。

优选地，蛋白质性神经毒素是肉毒杆菌神经毒素。根据本发明的一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是复合物形式的肉毒杆菌神经毒素。根据另一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是高纯度的肉毒杆菌神经毒素。

根据本发明的一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是从其天然梭菌菌株纯化的肉毒杆菌神经毒素。根据另一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是在异源宿主如大肠杆菌中重组产生的肉毒杆菌神经毒素。

根据本发明，肉毒杆菌神经毒素可以是血清型A、B、C、D、E、F或G的BoNT。

根据本发明，肉毒杆菌神经毒素可以是修饰的肉毒杆菌神经毒素。根据本发明，“修饰的BoNT”是具有与SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6或7具有至少50％序列同一性的氨基酸序列的BoNT。优选地，修饰的BoNT具有与SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6或7具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。优选地，修饰的BoNT是如下所述的BoNT：其氨基酸序列与SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6或7相差小于600、400、200、150、100、50或20个氨基酸取代、缺失或添加，例如10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、缺失或添加。

根据本发明，重组肉毒杆菌神经毒素可以是嵌合肉毒杆菌神经毒素。根据本发明，“嵌合BoNT”由不全属于同一血清型的L、H_N、H_CN和H_CC结构域构成。例如，嵌合BoNT可以由来自一种血清型的L链和来自不同血清型的完整H链(H_N、H_CN和H_CC结构域)组成。嵌合BoNT还可以由来自一种血清型的L链和H_N结构域(“LH_N”)和来自不同血清型的H_C结构域(H_CN和H_CC)组成。嵌合BoNT还可以由来自一种血清型的L链和H_N和H_CN结构域(“延伸的LH_N”)和来自不同血清型的H_CC结构域组成。

根据本发明，轻链结构域(L)可具有与下列氨基酸序列之一具有至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性且保留切割参与囊泡介导的神经递质释放的SNARE蛋白之一的能力的氨基酸序列：

·SEQ ID NO：1的氨基酸1-448

·SEQ ID NO：2的氨基酸1-440

·SEQ ID NO：3的氨基酸1-441

·SEQ ID NO：4的氨基酸1-445

·SEQ ID NO：5的氨基酸1-422

·SEQ ID NO：6的氨基酸1-439

·SEQ ID NO：7的氨基酸1-441

根据本发明，H_N结构域可具有与下列氨基酸序列之一具有至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性且保留易位能力的氨基酸序列：

·SEQ ID NO：1的氨基酸449-871

·SEQ ID NO：2的氨基酸441-858

·SEQ ID NO：3的氨基酸442-866

·SEQ ID NO：4的氨基酸446-862

·SEQ ID NO：5的氨基酸423-845

·SEQ ID NO：6的氨基酸440-864

·SEQ ID NO：7的氨基酸442-863

根据本发明，H_C结构域可具有与下列氨基酸序列之一具有至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性且保留结合神经肌肉细胞的能力的氨基酸序列：

·SEQ ID NO：1的氨基酸872-1296

·SEQ ID NO：2的氨基酸859-1291

·SEQ ID NO：3的氨基酸867-1291

·SEQ ID NO：4的氨基酸863-1276

·SEQ ID NO：5的氨基酸846-1252

·SEQ ID NO：6的氨基酸865-1274

·SEQ ID NO：7的氨基酸864-1297

根据本发明，H_CC结构域可具有与以下氨基酸序列之一具有至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％或95％序列同一性且保留结合神经肌肉细胞的能力的氨基酸序列：

·SEQ ID NO：1的氨基酸1111-1296

·SEQ ID NO：2的氨基酸1098-1291

·SEQ ID NO：3的氨基酸1112-1291

·SEQ ID NO：4的氨基酸1099-1276

·SEQ ID NO：5的氨基酸1086-1252

·SEQ ID NO：6的氨基酸1106-1274

·SEQ ID NO：7的氨基酸1106-1297

上述参考序列应被视为指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。

两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“百分比序列同一性”是所比对的序列享有的相同位置处的相同核苷酸/氨基酸数量的函数。因此，％同一性可以计算为比对中每个位置的相同核苷酸/氨基酸的数量除以比对的序列中核苷酸/氨基酸的总数乘以100。％序列同一性的计算还可能考虑空位的数量，以及需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。序列比较和两个或多个序列之间的百分比同一性的确定可以通过使用特定的数学算法进行，例如BLAST，这是技术人员熟悉的。

表面活性剂是能够降低液体和固体之间或两种液体之间的表面张力的化合物。表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的。在本发明的组合物中，表面活性剂优选是非离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括聚氧乙二醇烷基醚，如八乙二醇单十二醚或五乙二醇单十二醚；聚氧丙二醇烷基醚；葡糖苷烷基醚，如癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷或辛基葡糖苷；聚氧乙二醇辛基酚醚，如Triton X-100；聚氧乙二醇烷基酚醚，如Nonoxynol-9；甘油烷基酯，如月桂酸甘油酯；聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯，如聚山梨醇酯；脱水山梨糖醇烷基酯，如司盘类；椰油酰胺MEA，椰油酰胺DEA；十二烷基二甲胺；聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物，如泊洛沙姆；聚乙氧基化牛脂胺(POEA)。

根据优选的实施方案，本发明的液体组合物包含非离子表面活性剂，其为聚山梨醇酯(polysorbate)，优选聚山梨醇酯20(PS20)、聚山梨醇酯60(PS60)或聚山梨醇酯80(PS80)。最优选地，非离子表面活性剂是PS80。当表面活性剂是聚山梨醇酯时，其浓度优选为0.001％至15％v/v，更优选0.005至2％v/v，更优选0.01至1％，例如0.01、0.05、0.1、0.2、0.5或1％v/v。根据一个实施方案，表面活性剂为PS80，浓度为0.05至0.2％v/v，例如约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19或0.20％v/v。

PS20的密度约为1.1g/mL。PS60的密度约为1.044g/mL。PS80的密度为约1.06至1.09g/mL。

聚山梨醇酯被认为形成胶束并防止蛋白质吸附到表面和蛋白质聚集。不希望受理论束缚，认为在降解/氧化时，聚山梨醇酯可形成可能对蛋白质稳定性具有影响的过氧化物和酸。因此，认为优选聚山梨醇酯的浓度在产品配方中尽可能低。因此，认为优选聚山梨醇酯的浓度不应超过其临界胶束浓度(CMC)的200倍，更优选其不应超过其CMC的100、50、20、10或5倍。

对于PS20(Mw 1227.5g/mol)，CMC在21℃下近似为8×10^-5M，即约0.01％w/v。

对于PS60(Mw 1309g/mol)，CMC在21℃下约为21×10^-6M，即约0.003％w/v。

对于PS80(Mw 1310g/mol)，CMC在21℃下近似为12×10^-6M，即约0.002％w/v。

根据优选的实施方案，聚山梨醇酯浓度在给定温度下为其CMC的1至200倍，例如约21℃，优选其CMC的2至100倍，例如其CMC的约20或50倍。

本发明的液体组合物包含氨基酸色氨酸或酪氨酸。不希望受理论束缚，推测色氨酸或酪氨酸可以防止活性蛋白质的氧化，所述氧化将使其无功能。实际上，认为相对于神经毒素以摩尔过量添加的氨基酸首先被氧化，从而挽救神经毒素。还推测色氨酸或酪氨酸可以中和表面活性剂如聚山梨醇酯的反应性降解产物。

优选地，氨基酸是色氨酸。更优选地，氨基酸是L-色氨酸。

氨基酸浓度优选为约0.1至5mg/mL，更优选0.1至5mg/mL、0.25至3mg/mL，例如约0.25、0.5、1、1.5、2或3mg/mL。

本发明的组合物包含缓冲剂，其包含钠、氯和磷酸根离子。发明人确实惊奇地发现，没有钠、氯离子和磷酸根离子的缓冲剂降低了毒素的稳定性。优选地，缓冲剂还包含钾离子。

缓冲剂可以例如通过组合氯化钠、氯化钾和磷酸钠盐来获得。氯化钠浓度优选为10至500mM，优选约25至300mM，例如约25、50、75、100、140、150、200、250或300mM。

磷酸钠浓度优选为1至100mM，优选为2至50mM，例如约2、5、10、20、30、40或50mM。

氯化钾浓度优选为1至50mM，优选1至10mM，例如约1、2、3、4、5或10mM。

本发明的组合物具有5.5至8的pH。根据优选的实施方案，pH为6.0-7.5，例如约6.3、6.35、6.4、6.45、6.5、6.55、6.6、6.65、6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。优选地，pH在距生理pH(其为约7.4)的一个单位内。

本发明的组合物是液体。组合物优选包含水性稀释剂，更优选水，例如无菌水、注射用水、净化水、注射用无菌水。

优选地，该制剂是等渗的并且适合于注射给患者，特别是人类患者。

肉毒杆菌神经毒素的量通常以小鼠LD50(50致死剂量)单位表示，定义为小鼠的半数致死的腹膜内剂量。

用于肉毒杆菌毒素的小鼠LD50(MLD50)单位不是标准化单位。实际上，市售毒素的不同制造商使用的测定方法在稀释缓冲剂的选择方面尤其不同。例如，用于

的测试使用明胶磷酸盐缓冲液，而用于

的测定方法使用盐水作为稀释剂。明胶缓冲液被认为以LD50测定方法中使用的高稀释度保护毒素。相比之下，认为使用盐水作为稀释剂会导致一些效力损失。这可以解释为什么当使用

测定方法进行测试时，一个

单位等于大约三个Dysport单位(Straughan,DW,2006,ATLA 34(3),305-313；Hambleton和Pickett,Hambleton,P.和A.M.Pickett.,1994,Journal of the RoyalSociety of Medicine 87.11:719)。

优选地，用于测定小鼠LD50的稀释缓冲液是明胶磷酸盐缓冲液。例如，可以如Hambleton,P.等人,Production,purification and toxoiding of Clostridiumbotulinum type A toxin.Eds.G.E.Jr Lewis,and P.S.Angel.Academic Press,Inc.,NewYork,USA,1981,p.248所述测定小鼠LD50。简言之，将肉毒杆菌毒素样品在pH6.5的0.2％(w/v)明胶0.07M Na2HPO4缓冲液中系列稀释。将体重约20g的小鼠组(例如每组4至8只小鼠)腹膜内注射稀释的毒素样品(例如每只动物0.5ml)。选择稀释组，例如5个稀释组，以跨越50％致死剂量。观察小鼠长达96小时，并且估计小鼠50致死剂量(MLD50)。

本发明的组合物优选包含每毫升4至10000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，更优选每毫升10至2000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，例如每毫升20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素。

肉毒杆菌神经毒素的量也可以用ng表示。本发明的组合物优选包含每mL约0.01至75ng的肉毒杆菌神经毒素，更优选每mL约0.03至20ng的肉毒杆菌神经毒素，更优选每mL约0.1至15ng的肉毒杆菌神经毒素，例如约每毫升0.15、0.3、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng的肉毒杆菌神经毒素。

本发明的制剂不含动物蛋白质。特别地，本发明的组合物不包含白蛋白，并且特别是不包含人血清白蛋白。优选地，本发明的组合物不含动物产品，这意味着它们不包含动物(包括人)来源的成分。优选地，本发明的组合物不包含除蛋白质性神经毒素以外的蛋白质。根据另一个实施方案，本发明的组合物不包含除蛋白质性神经毒素和一种或多种NAP(神经毒素相关蛋白)以外的蛋白质。为了避免怀疑，注意氨基酸不是蛋白质。

根据本发明的一个实施方案，组合物不包含糖类，包括不含单糖，不含二糖和不含多糖。

本发明的液体组合物随时间稳定。例如，它在2至8℃下稳定2个月。根据一个实施方案，其在2至8℃下稳定3个月，例如在5℃下。根据优选的实施方案，它在2至8℃下稳定6个月，例如在5℃下。根据一个实施方案，其在2至8℃下稳定12个月，例如在5℃下。根据一个实施方案，其在2至8℃下稳定18个月，例如在5℃下。根据一个实施方案，其在2至8℃下稳定24个月，例如在5℃下。根据一个实施方案，其在2至8℃下稳定36个月，例如在5℃下。根据一个实施方案，其在室温下稳定3个月，例如在25℃下。根据一个实施方案，其在室温下稳定6个月，例如在25℃下。根据一个实施方案，它在37℃下稳定2个月。

本发明的液体组合物优选在0°至30℃的温度下储存。在优选的实施方案中，将其储存在2-8℃，例如5℃。在另一个实施方案中，将其储存在室温下。优选地，它不是冷冻的。

可以通过比较肉毒杆菌神经毒素随时间的活性来评估稳定性。肉毒杆菌神经毒素的活性可以指肉毒杆菌神经毒素与细胞上其靶受体结合，将轻链转移到细胞中，和/或切割其靶SNARE蛋白的活性的能力。

测量肉毒杆菌神经毒素活性的方法是本领域熟知的。肉毒杆菌神经毒素活性可以例如通过使用下述方法来评估：如上所述的小鼠致死率测定方法(LD50)，诸如小鼠膈神经膈肌测定方法的基于肌肉组织的测定方法(例如，如Bigalke,H.和Rummel A.,Toxins 7.12(2015):4895-4905)中所述的)，基于细胞的测定方法(例如，如WO201349508或WO2012166943中所述的)或细胞外蛋白水解活性测定方法，例如Bo

(可从BioSentinel Inc.获得的肉毒杆菌神经毒素检测试剂盒)。

优选地，如果在给定的时间段和给定温度下存在不超过给定百分比的活性损失，则认为本发明的组合物是稳定的。

根据一个实施方案，如果在2至8℃下在3、6、12、18、24或36个月时细胞外蛋白水解活性损失不超过30％，则认为本发明的组合物是稳定的，例如在5℃下在6个月时细胞外蛋白水解活性损失不超过30％。优选地，如果在5℃下在3个月时，更优选在5℃下在6、12、18、24或36个月时，细胞外蛋白水解活性损失不超过20％，则认为本发明的组合物是稳定的。根据另一个实施方案，如果在室温下，例如在25℃下在3个月时细胞外蛋白水解活性损失不超过40％，则认为本发明的组合物是稳定的。优选地，如果在25℃下在3个月时，更优选地，在25℃下在6个月时细胞外蛋白水解活性损失不超过30％，则认为本发明的组合物是稳定的。根据另一个实施方案，如果在37℃下在2个月时细胞外蛋白水解活性损失不超过50％，则认为本发明的组合物是稳定的。细胞外蛋白水解活性可以用Bo

测定方法测量。

根据一个实施方案，如果在2至8℃下在2、3、6、12、18、24或36个月时MLD50单位损失不超过30％，则认为本发明的组合物是稳定的，例如在5℃下在6个月时MLD50单位损失不超过30％。优选地，如果在5℃下在2个月时，更优选在5℃下在3、6、12、18、24或36个月时MLD50单位损失不超过20％，则认为本发明的组合物是稳定的。根据另一个实施方案，如果在室温下，例如在25℃下，在2或3个月时MLD50单位损失不超过40％，则认为本发明的组合物是稳定的。优选地，如果在25℃下在3个月时，更优选在25℃下在6个月时，MLD50单位损失不超过30％，则认为本发明的组合物是稳定的。根据另一个实施方案，如果在37℃下在2个月时MLD50单位损失不超过50％，则认为本发明的组合物是稳定的。可以如上所述测量MLD50单位。

本发明的液体组合物可以储存在密封的小瓶或注射器中，例如玻璃小瓶或注射器，优选1型(或“体中性(body neutral)”)玻璃小瓶或注射器。优选地，小瓶或注射器中没有氧气或氧气很少。小瓶或注射器可以例如在氧气低于100ppm，优选低于50ppm的气氛中填充，并且氮气可以用作小瓶中的保护气氛。当使用玻璃小瓶时，它们可以例如用氯丁基橡胶或溴丁基橡胶塞盖住，其可以是Fluro

涂覆的塞子。优选地，将根据本发明的液体组合物储存在用Fluro

涂覆的塞子盖住的玻璃小瓶中。

根据一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο每毫升4至10000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，

ο0.001至15％v/v聚山梨醇酯，

ο0.1至5mg/mL色氨酸，

ο10至500mM NaCl，

ο1至50mM KCI，

ο1至100mM磷酸钠，

pH值介于5.5和8之间，可在5℃下稳定6个月。

根据一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο每毫升10至2000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，

ο0.005至2％v/v聚山梨醇酯，

ο0.1至5mg/mL色氨酸，

ο25至300mM NaCl，

ο1至10mM KCI，

ο2至50mM磷酸钠，

pH值介于6.0和7.5之间，可在5℃下稳定12个月。

根据一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο每毫升10至2000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，

ο0.05至0.2％v/v聚山梨醇酯80，

ο0.1至5mg/mL色氨酸，

ο25至300mM NaCl，

ο1至10mM KCI，

ο2至50mM磷酸钠，

pH值介于6.0和7.5之间，可在5℃下稳定12个月。

根据一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.2％v/v聚山梨醇酯80，

ο1mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.6。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.04％v/v聚山梨醇酯80，

ο1mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.9。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒神经毒素B，

ο0.25％v/v聚山梨醇酯20，

ο4mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为7.4。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.01％v/v聚山梨醇酯80，

ο0.25mg/mL色氨酸

ο255mM NaCl，

ο2mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为7.2。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.01％v/v聚山梨醇酯80，

ο0.25mg/mL色氨酸

ο255mM NaCl，

ο10mM KCI，

ο50mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.3。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο1％v/v聚山梨醇酯80，

ο0.25mg/mL色氨酸

ο255mM NaCl，

ο50mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.3。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο1％v/v聚山梨醇酯80，

ο3mg/mL色氨酸

ο255mM NaCl，

ο10mM KCI，

ο50mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为7.2。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.1％v/v聚山梨醇酯80，

ο1.625mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.75。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.01％v/v聚山梨醇酯80，

ο1mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.75。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο0.1％v/v聚山梨醇酯80，

ο1mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.75。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒杆菌神经毒素A，

ο1％v/v聚山梨醇酯80，

ο1mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为6.75。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒神经毒素B，

ο15％v/v聚山梨醇酯20，

ο1mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为7.4。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒神经毒素B，

ο15％v/v聚山梨醇酯20，

ο4mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为7.4。

根据另一个实施方案，本发明的液体组合物包含以下或基本上由以下组成：

ο肉毒神经毒素B，

ο0.25％v/v聚山梨醇酯20，

ο4mg/mL色氨酸

ο140mM NaCl，

ο3mM KCI，

ο10mM磷酸钠，

其中所述组合物的pH约为7.4。

另一方面是本发明的液体组合物在治疗(therapy)中的用途。

本发明的液体组合物可用于治疗中以治疗或预防肌肉疾病、神经肌肉疾病、神经疾病、眼科疾病、疼痛疾病、心理疾病、关节疾病、炎性疾病、内分泌疾病或泌尿疾病。

例如，本发明的液体组合物可用于治疗或预防选自以下的疾病、病况或综合征：

·眼科学疾病，其选自眼睑痉挛、斜视(包括限制性或肌性斜视)、弱视、振动幻视(oscillopsia)、保护性上睑下垂、为保护角膜的治疗性上睑下垂、眼球震颤、内斜视(estropia)、复视、睑内翻、眼睑回缩、眼眶肌病、隐斜视、伴发性失调(concomitantmisalignment)、非伴发性失调、原发性或继发性内斜视或外斜视、核间性眼肌麻痹、反向偏斜、杜安氏综合征和上睑回缩；

·运动疾病，包括半面痉挛、斜颈、儿童或成人(如大脑性瘫痪、脑卒中后、多发性硬化、创伤性脑损伤或脊髓损伤患者)的痉挛状态、特发性局限性肌张力障碍、肌强直、书写痉挛、手肌张力障碍、VI型神经麻痹、口下颌肌张力障碍、头部震颤、迟发性运动障碍、迟发性肌张力障碍、职业性痉挛(包括音乐家的抽筋)、面神经麻痹、颌闭合痉挛、面部痉挛、联带运动(synkinesia)、震颤、原发性书写震颤、僵人综合症、足肌张力障碍、面瘫、臂痛及指动综合症(painful-arm-and-moving-fingers-syndrome)、抽动障碍、肌张力障碍性抽动(dystonic tics)、图雷特综合症、神经性肌强直、下颌震颤、外直肌麻痹、张力障碍性足内翻倒转(dystonic foot inversion)、颌肌张力障碍、兔唇综合征、小脑性震颤、III型神经麻痹、腭肌阵挛、静坐不能(akasthesia)、肌痉挛，IV型神经麻痹，步态呆板、躯干伸肌肌张力障碍、面神经麻痹后联带运动、继发性肌张力障碍、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、癫痫，休克期(off period)肌张力障碍、头部破伤风、多发性纤维性肌阵挛和良性痉挛-肌束震颤综合征；

·耳鼻喉科学疾病，包括痉挛性发音困难、耳部疾病、听力损伤、耳内喀喇音(earclick)、耳鸣、眩晕、梅尼埃病、蜗神经功能障碍、口吃、环咽性吞咽困难、磨牙症、慢性抽吸中的喉闭合、声带肉芽肿、室性肌张力障碍、室性发音困难、突发性发声困难、牙关紧闭、打鼾、声音震颤、抽吸、舌突肌张力障碍、腭震颤、深度咬唇和喉肌张力障碍；第一次咬合综合症(First Bite Syndrome)；

·胃肠疾病，包括失弛缓症、肛裂，便秘、颞下颌关节功能障碍、总胆管括约肌功能障碍、持续性总胆管括约肌高压、肠肌障碍、耻骨直肠肌综合征、肛门痉挛(anismus)、幽门痉挛、胆囊功能障碍、胃肠或食管动力障碍、弥漫性食管痉挛和胃轻瘫；

·泌尿生殖疾病，包括排尿肌括约肌失调、排尿肌反射亢进、神经性膀胱功能障碍(如帕金森病、脊髓损伤、中风或多发性硬化症患者中)、膀胱过度活动症、神经性排尿肌过度活动、膀胱痉挛、尿失禁、尿潴留、肥大性膀胱颈、排泄功能障碍、间质性膀胱炎、阴道痉挛、子宫内膜异位症、骨盆疼痛、前列腺增生(良性前列腺增生)、前列腺痛、前列腺癌和阴茎异常勃起；

·皮肤病学疾病，包括皮肤细胞增殖性疾病疾病、皮肤伤口、银屑病、酒渣鼻、痤疮；罕见的遗传性皮肤疾病，如干性粟粒疹综合征(Fox-Fordyce syndrome)或黑利-黑利二氏病(Hailey-Hailey disease)；瘢痕疙瘩和增生性瘢痕减少；孔径减小；皮肤炎性病况；疼痛的皮肤炎性病况；

·疼痛疾病，包括背痛(上背痛，下背痛)、肌筋膜疼痛、紧张性头痛、纤维肌痛、疼痛综合征、肌痛、偏头痛、急性颈部扭伤、关节疼痛、术后疼痛、与肌肉痉挛无关的疼痛和与平滑肌疾病有关的疼痛；

·炎性疾病，包括胰腺炎、神经源性炎性疾病(包括痛风、肌腱炎、滑囊炎、皮肌炎和强直性脊柱炎)；

·分泌性疾病，如腺体分泌过多、多汗症(包括腋窝多汗症、手掌多汗症和弗莱氏综合征)、多涎、流涎、臭汗症、粘液分泌过多、流泪过多、全分泌腺功能障碍；皮脂分泌过多；

·呼吸性疾病，包括鼻炎(包括过敏性鼻炎)、COPD、哮喘和肺结核；

·肥大性疾病，包括肌肉增大、咬肌肥大、肢端肥大症和伴有肌痛的神经源性胫骨前肌肥大；

·关节疾病，包括网球肘(或肘部上髁炎)、关节炎、髋关节炎、骨关节炎、肩关节旋转肌帽病变、类风湿性关节炎和腕管综合症；

·内分泌疾病，如2型糖尿病、高胰高血糖素血症(hyperglucagonism)、高胰岛素血症、低胰岛素血症、高钙血症、低钙血症、甲状腺疾病(包括格雷夫斯氏病、甲状腺炎、桥本甲状腺炎、甲状腺功能亢进症和甲状腺功能减退症)、甲状旁腺疾病(包括甲状旁腺功能亢进症和甲状旁腺功能减退症)、库欣综合征(Gushing's syndrome)和肥胖症；

·自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮；

·增殖性疾病，包括副神经节瘤、前列腺癌和骨肿瘤；

·创伤性损伤，包括运动损伤、肌肉损伤、肌腱创伤和骨折；和

·兽医用途(例如哺乳动物的固定、马绞痛、动物失弛缓症或动物肌肉痉挛)。

本发明的液体组合物还可以用于审美医学(aesthetic medicine)(用于改善美容外观)，特别是用于治疗或预防皮肤皱纹，特别是面部皱纹，例如面部皱眉纹、眼部轮廓的皱纹、眉间皱眉纹、口角下垂、颈部皱纹(颈阔肌带)、下巴皱纹(颏肌纹、橘皮状皮肤、凹陷的下巴(dimpled chin)、额头纹、“抓伤的皮肤”皱纹、鼻托处理(nasal lift treatment)或睡纹。根据本发明的该方面，待治疗或预防以改善美容外观的受试者优选不患有上述任何疾病、病况或综合征。更优选地，所述受试者是健康受试者(即未患有任何疾病、病况或综合征)。

本发明的液体组合物可以与另一种治疗化合物组合使用。在一个实施方案中，本发明的液体组合物与用于治疗疼痛的镇痛化合物组合施用，特别是与如WO 2007/144493中所述的阿片样物质衍生物如吗啡组合施用，其内容通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本发明的液体组合物与透明质酸组合施用，例如如WO2015/0444416中所述用于治疗前列腺癌，其内容通过引用并入本文。

本发明的另一方面是选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸用于保护蛋白质性神经毒素免于在不含动物来源的蛋白质的液体组合物中降解的用途。

根据优选的实施方案，氨基酸是色氨酸，更优选L-色氨酸。

优选地，蛋白质性神经毒素是肉毒杆菌神经毒素。根据本发明的一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是复合物形式的肉毒杆菌神经毒素。根据另一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是高纯度肉毒杆菌神经毒素。根据本发明的一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是从其天然梭菌菌株纯化的肉毒杆菌神经毒素。根据另一个实施方案，肉毒杆菌神经毒素是在异源宿主例如大肠杆菌中重组产生的肉毒杆菌神经毒素。根据本发明，肉毒杆菌神经毒素可以是血清型A、B、C、D、E、F或G的BoNT。根据本发明，肉毒杆菌神经毒素可以是如上所述的修饰的肉毒杆菌神经毒素。根据本发明，重组肉毒杆菌神经毒素可以是如上所述的嵌合肉毒杆菌神经毒素。

根据优选的实施方案，氨基酸与表面活性剂和包含钠、氯和磷酸根离子的缓冲剂组合使用，并且液体组合物具有5.5至8的pH。优选地，表面活性剂是非离子表面活性剂，更优选聚山梨醇酯，例如PS20、PS60或PS80。最优选地，非离子表面活性剂是PS80。优选地，缓冲剂还包含钾离子。缓冲剂可以例如通过组合氯化钠、氯化钾和磷酸钠盐来获得。根据优选的实施方案，pH为6.0至7.5，例如6.3、6.35、6.4、6.45、6.5、6.55、6.6、6.65、6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7.0,、7.0、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。优选地，pH在距生理pH(其为约7.4)的一个单位内。

根据本发明用途的优选实施方案，液体组合物稳定2个月。例如，它在2至8℃下稳定2个月。根据一个实施方案，其在2至8℃下，例如在5℃下稳定3个月。根据优选的实施方案，它在2至8℃下，例如在5℃下稳定6个月。根据一个实施方案，其在2至8℃下，例如在5℃下稳定12个月。根据一个实施方案，其在2至8℃下，例如在5℃下稳定18个月。根据一个实施方案，其在2至8℃下，例如在5℃下稳定24个月。根据一个实施方案，其在2至8℃下，例如在5℃下稳定36个月。根据一个实施方案，其在室温下，例如在25℃下稳定3个月。根据一个实施方案，其在室温下，例如在25℃下稳定6个月。

实施例

1、制备稳定的液体肉毒杆菌毒素A制剂

制备含有15ng/mL高度纯化的BoNT/A，15％v/v聚山梨醇酯20，选自酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)的氨基酸或甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)的混合物(Sigma Aldrich)和磷酸盐缓冲盐水(来自Calbiochem的PBS)(140mMNaCl，10mM磷酸钠和3mM KCl，pH 7.4，25℃)的液体肉毒杆菌毒素制剂，使用0.22μm PVDF(聚偏氟乙烯)过滤器过滤，并在40℃下在硅化的2mL玻璃注射器中储存6天，之后对每种制剂进行效力测试。

对于效力测试，将含有制剂的注射器排至2mL玻璃瓶(Chromacol，Gold)中，其盖子含有PTFE处理的橡胶隔垫(Chromacol)，或至1.7mL塑料微量离心管(Axygen，MaximumRecovery)中，两者均具有低蛋白质吸附特性。随后使用含有3％人血清白蛋白(HSA)的0.9％NaCl溶液稀释制剂。对于每种制剂，在进行稀释的同一天将50μL样品注射到小鼠的腓肠肌中。监测小鼠3天并记录麻痹程度。

结果如表1所示。

表1-氨基酸添加对BoNT/A稳定性的加速储存试验(在40℃下6天)。小鼠中的麻痹 结果：-＝未分析，WN＝无记录，PA＝麻痹，

发现酪氨酸和色氨酸对BoNT/A降解具有保护作用。发现色氨酸具有最强的保护作用。半胱氨酸以及含有所有4种氨基酸的混合物没有保护作用。

2、制备稳定的液体肉毒杆菌毒素B制剂

制备含有350ng/mL高度纯化的BoNT/B，15％v/v聚山梨醇酯20，选自酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)的氨基酸或甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)的混合物，以及pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的液体肉毒杆菌毒素制剂，使用0.22μm过滤器过滤，并在40℃下在硅化的2mL玻璃注射器中储存两周，然后，如上所述对每种制剂进行效力试验。

结果如表2所示。

表2-氨基酸添加对BoNT/B稳定性的加速储存试验(在40℃下两周)。小鼠中的麻痹 结果：-＝未分析，WN＝无记录，PA＝麻痹，

发现酪氨酸和色氨酸对BoNT/B降解具有保护作用。半胱氨酸以及含有所有4种氨基酸的混合物也具有保护作用，但程度较弱。

3、评估不同浓度的色氨酸和聚山梨醇酯20

制备含有高度纯化的BoNT/A或BoNT/B和各种浓度的聚山梨醇酯20(PS20)和色氨酸和pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的液体肉毒杆菌毒素制剂，使用0.22μm过滤器过滤并储存在硅化的2mL玻璃注射器中。如上所述对每种制剂进行后肢麻痹效力测试。

结果如表3所示。

表3-Trp和聚山梨醇酯20(PS20)浓度对BoNT/A或BoNT/B稳定性的评估。小鼠中的 麻痹结果：-＝未分析，WN＝无记录，PA＝麻痹，

麻痹程度(PA)：1、脚趾受影响；2、后肢轻微麻木；3、两只后肢都麻痹；4、后肢麻痹；来自纯化的洗脱缓冲液(5)：50mM乙酸钠pH 4.5，含0.2％(v:v)聚山梨醇酯20和400mM氯化钠。*可能发生了25℃8mg/mL Trp 0.25％聚山梨醇酯20的两种BoNT/A稀释液的混合。

4、评估BoNT/B制剂中不同的盐浓度

制备含有100ng/mL高度纯化的BoNT/B，聚山梨醇酯20，来自各种氨基酸供应商的色氨酸和选自PBS pH 7.4(Calbiochem)、12nM磷酸盐缓冲液pH 7(Apoteket)和20mM乙酸钠缓冲液(NaAc)pH5.5(来自Fluka的NaAc和来自Merck的乙酸)的缓冲液的液体肉毒杆菌毒素制剂，使用0.22μm过滤器过滤并储存在硅化的2mL玻璃注射器中。如上所述对每种制剂进行后肢麻痹效力测试。

结果如表4所示。

表4-不同盐浓度对BoNT/B稳定性的评估。小鼠中的麻痹结果：-＝未分析，WN＝无 记录，PA＝麻痹，

1、丧失一些功能；2、弱麻痹

结果显示含有PBS缓冲液(含有钠、氯、磷酸根和钾离子)的制剂在肉毒杆菌毒素的稳定性方面起作用。

5、评估不同的稳定剂

制备含有15ng/mL高度纯化的BoNT/A，聚山梨醇酯20(PS20)或聚山梨醇酯80(PS80)或HSA，色氨酸和PBS的液体肉毒杆菌毒素制剂，使用0.22μm过滤器过滤并储存在硅化的2mL玻璃注射器中。如上所述对每种制剂进行后肢麻痹效力测试。

结果如表5所示。

表5-不同表面活性剂对BoNT/A稳定性的评价。小鼠中的麻痹结果：-＝未分析，WN ＝无记录，PA＝麻痹，

1、双后肢严重麻痹；2、角爪(angles paws)；3、严重麻痹

6、评估不同的制剂

如上所述制备含有10ng/mL高度纯化的BoNT/A，0.25％PS80，1mg/mL色氨酸和PBS的液体肉毒杆菌毒素制剂。通过添加HCl将pH调节至6.6和7.0。每种制剂在40℃下储存5周。

然后将每种制剂稀释10倍，并如上所述进行后肢麻痹效力测试(每次注射0.05ng)。在两种情况下，在第3天均观察到后肢麻痹。pH 6.6制剂的麻痹更强烈。

7、评估不同的制剂

如上所述制备含有0.3ng/mL高度纯化的BoNT/A，选自PS20和PS80的聚山梨醇酯，1mg/mL色氨酸和pH7.4的12mM PBS的液体肉毒杆菌毒素制剂。通过加入1.2M HCl将每种制剂的pH调节至pH 6.6或6.9。

在一种浓度，0.2％w/v，测试聚山梨醇酯20，该浓度相当于其CMC(临界胶束浓度，在21℃下约0.01％w/v)的约20倍。测试的聚山梨醇酯80为0.04％和0.2％w/v，分别对应于其CMC(在21℃下约0.002％w/v)的约20和100倍。

表6-聚山梨醇酯和pH的选择

对于每种制剂，将0.5mL体积装入1mL长玻璃注射器(BD)中并用涂有碳氟化合物的柱塞密封。

如上所述，通过对小鼠的后肢麻痹试验测量效力。

在5℃和25℃下储存6个月后，在任何制剂中均未观察到效力降低。

8、评估不同的制剂

用不同浓度的聚山梨醇酯80、色氨酸、磷酸钠、氯化钠、氯化钾和不同的pH制备含有高度纯化的A型肉毒杆菌神经毒素的19种不同制剂。每种制剂的目标标称效力为500U/mL。将每种制剂脱气，通过0.2μm过滤器过滤并装入小瓶中。氮气用作小瓶中的保护气氛。填充在厌氧室中进行。将每种制剂以1mL等分试样在氮气气氛下装入2mL玻璃瓶中，该玻璃瓶盖有用铝制易拉密封盖密封的Fluro

塞子并直立储存。

使用Bo

在5℃、25℃和37℃下评估19种制剂的稳定性以测量效力。

表7-赋形剂组合物

表8-包装组件

物件	物件编号，供应商
		I类plus透明硼硅玻璃瓶，2mL	1097221，Schott
灰色涂覆Flurotec的溴化丁基塞Westar RS，13mm	1356 4023/50，West
		铝制易拉密封盖，13mm	5920-6623，West

对于所有配方，溶液保持透明且大多数部分无色。

在该研究中测试的赋形剂浓度在测试的时间间隔内不影响制剂的pH。效力结果列于表9中。

表9-Botest效力结果

对于几种组合物，在5℃下在6个月时效力损失不超过30％和/或在25℃下在3个月时效力损失不超过约40％和/或在37℃下在2个月时效力损失不超过约50％。

9、评估PS 60

用0.1％(v/v)PS60、1mg/mL L-色氨酸、10mM磷酸钠、140mM氯化钠、3mM氯化钾和注射用水制备含有高度纯化的A型肉毒杆菌神经毒素的制剂。用HCl将pH调节至6.75。该制剂的目标标称效力为100U/mL。将制剂脱气，通过0.2μm过滤器过滤，并在厌氧室中在氮气氛下无菌填充到2mL小瓶中，填充体积为1mL。氮气用作小瓶中的保护气氛。用密封有铝制易拉密封盖的Fluro

塞子盖住小瓶。

表10-包装组件

通过如本文所述的MLD50测试测量了在37℃和25℃下随时间的效力。

在37℃下，9周后的剩余效力为初始效力的约50-55％。

在25℃下，3个月后的剩余效力是初始效力的约80％。

序列表

<110> 益普生生物制药有限公司（IPSEN BIOPHARM Ltd）

<120> 用色氨酸或酪氨酸稳定的液体神经毒素制剂

<130> IBGA 001-WO(2)

<150> PCT/EP2016/062085

<151> 2016-05-27

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1296

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 1

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 2

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 2

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 3

<211> 1291

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 3

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn

1 5 10 15

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu

20 25 30

Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp

35 40 45

Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn

130 135 140

Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly

145 150 155 160

Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr

165 170 175

Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile

180 185 190

Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp

195 200 205

Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile

245 250 255

Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala

260 265 270

Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr

275 280 285

Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser

325 330 335

Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn

355 360 365

Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn

385 390 395 400

Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn

435 440 445

Lys Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro

450 455 460

Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys

465 470 475 480

Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Ser

485 490 495

Val Asp Gln Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gln Leu

500 505 510

Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly

515 520 525

Glu Asn Gln Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gln Asn Val Asp Tyr Leu

530 535 540

Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu

545 550 555 560

Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala

565 570 575

Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly

580 585 590

Val Gln Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp

595 600 605

Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp

610 615 620

Val Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn

625 630 635 640

Ser Val Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val

645 650 655

Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly

660 665 670

Ala Phe Val Ile Tyr Ser Lys Val Gln Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys

675 680 685

Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gln Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser

690 695 700

Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gln Phe

705 710 715 720

Asn Asn Ile Ser Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gln Ala Gly

725 730 735

Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser

740 745 750

Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu

755 760 765

Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg

770 775 780

Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile

785 790 795 800

Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn

805 810 815

Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gln Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile

835 840 845

Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr

850 855 860

Phe Asn Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys

865 870 875 880

Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu

885 890 895

Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly

900 905 910

Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn

915 920 925

Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile

930 935 940

Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp

945 950 955 960

Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe

965 970 975

Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn

980 985 990

Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe

995 1000 1005

Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr

1010 1015 1020

Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr

1025 1030 1035

Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met

1055 1060 1065

Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys

1070 1075 1080

Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val

1085 1090 1095

Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr

1100 1105 1110

Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser

1115 1120 1125

Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn

1130 1135 1140

Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn

1145 1150 1155

Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr

1160 1165 1170

Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met

1175 1180 1185

Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu

1190 1195 1200

Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile

1205 1210 1215

Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys

1220 1225 1230

Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly

1235 1240 1245

Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr

1250 1255 1260

Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu

1265 1270 1275

Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu

1280 1285 1290

<210> 4

<211> 1276

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 4

Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr

20 25 30

Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro

50 55 60

Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val

100 105 110

Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly

165 170 175

Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val

210 215 220

Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly

245 250 255

Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln

275 280 285

Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn

325 330 335

Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser

340 345 350

Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn

355 360 365

Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn

385 390 395 400

Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser

435 440 445

Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys

450 455 460

Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Asn Lys Ile Ile Thr Asp Glu

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile

485 490 495

Leu Asp Gly Gln Val Pro Ile Asn Pro Glu Ile Val Asp Pro Leu Leu

500 505 510

Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Glu Glu Ile Val

515 520 525

Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr

530 535 540

Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu

545 550 555 560

Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr

565 570 575

Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly

580 585 590

Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn

595 600 605

Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Val Ile

610 615 620

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg

625 630 635 640

Gly Asn Phe Asn Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu

645 650 655

Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe

660 665 670

Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn

675 680 685

Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Asn

705 710 715 720

Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala

725 730 735

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn

740 745 750

Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile

755 760 765

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val

770 775 780

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn

785 790 795 800

Lys Phe Asp Leu Arg Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser

805 810 815

His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val

820 825 830

Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Met Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr

835 840 845

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile

850 855 860

Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val

865 870 875 880

Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln

885 890 895

Leu Asn Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp

900 905 910

Lys Ile Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr

915 920 925

Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr

930 935 940

Asn Ser His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln

965 970 975

Asp Val Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser

980 985 990

Leu Ser His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu

1010 1015 1020

Lys Gln Ser Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp

1025 1030 1035

Lys Thr Ile Val Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln

1040 1045 1050

Met Leu Trp Ile Arg Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser

1055 1060 1065

Asn Glu Asp Ile Asn Ile Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn

1070 1075 1080

Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu

1085 1090 1095

Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro

1100 1105 1110

Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Pro Asp Arg Ser Lys

1115 1120 1125

Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys Ser Val Ser Asp Lys

1130 1135 1140

Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn Ile Ile Leu His

1145 1150 1155

Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg Asp Thr Asp

1160 1165 1170

Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Cys Val

1175 1180 1185

Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile Gly

1190 1195 1200

Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp

1220 1225 1230

Ile Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro

1235 1240 1245

Val Ala Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser

1250 1255 1260

Phe Trp Lys Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu

1265 1270 1275

<210> 5

<211> 1252

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 5

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr

1205 1210 1215

Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr

1220 1225 1230

Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly

1235 1240 1245

Trp Gln Glu Lys

1250

<210> 6

<211> 1274

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 6

Met Pro Val Ala Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asn Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser

50 55 60

Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr

65 70 75 80

Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys

85 90 95

Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Lys Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser

100 105 110

Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Pro Ile Asp Glu Phe

115 120 125

Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Leu Ser Thr Asn

130 135 140

Val Glu Ser Ser Met Leu Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ile Phe Glu Ser Cys Cys Tyr Pro Val Arg Lys Leu Ile Asp Pro

165 170 175

Asp Val Val Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile

180 185 190

Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly

195 200 205

Gly His Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser

210 215 220

Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg

225 230 235 240

Gly Val Thr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Val Lys Gln Ala Pro Leu Met

245 250 255

Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

260 265 270

Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn

275 280 285

Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Glu Val

290 295 300

Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

305 310 315 320

Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val

325 330 335

Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr

340 345 350

Glu Ser Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr

355 360 365

Phe Ile Lys Tyr Glu Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp

370 375 380

Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn

385 390 395 400

Asn Arg Gly Gln Ser Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile

405 410 415

Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val

420 425 430

Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val

435 440 445

Asn Asn Ser Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu

450 455 460

Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn

465 470 475 480

Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser

485 490 495

Gln Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln

500 505 510

Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile

515 520 525

Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala

530 535 540

Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile

545 550 555 560

Asp Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ser Lys Asp Ile Phe Phe Ser Ser Glu

565 570 575

Phe Ile Asp Thr Ile Asn Lys Pro Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile Asp

580 585 590

Trp Ile Ser Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln Lys

595 600 605

Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Val

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Glu Ala Glu Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Val Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val Pro

645 650 655

Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ser

675 680 685

Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile Val

690 695 700

Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu

705 710 715 720

Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr Ala

725 730 735

Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg Leu

740 745 750

Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys Lys

755 760 765

Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Gly Lys Leu

785 790 795 800

Lys Lys Tyr Asp Asn His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asn Tyr Ile Leu

805 810 815

Asp His Arg Ser Ile Leu Gly Glu Gln Thr Asn Glu Leu Ser Asp Leu

820 825 830

Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser Tyr

835 840 845

Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys Lys

850 855 860

Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe

865 870 875 880

Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn Val

885 890 895

Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Ser Arg

900 905 910

Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Ser

915 920 925

Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys His

930 935 940

Tyr Lys Pro Met Asn His Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met

945 950 955 960

Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Thr Val Arg Asp

965 970 975

Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu Asn

980 985 990

Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Asn Arg Ile Ser Asn Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser

1010 1015 1020

Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile Ser

1025 1030 1035

Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile

1040 1045 1050

Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys

1055 1060 1065

Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr

1070 1075 1080

Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asn Tyr Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu Arg

1100 1105 1110

Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile Asn

1115 1120 1125

Gln Gln Arg Gly Val Thr Glu Gly Ser Val Phe Leu Asn Tyr Lys

1130 1135 1140

Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Pro Ile

1145 1150 1155

Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala

1160 1165 1170

Tyr Ile Asn Val Val Asp Arg Gly Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala

1175 1180 1185

Asp Thr Lys Ser Glu Lys Glu Lys Ile Ile Arg Thr Ser Asn Leu

1190 1195 1200

Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser Ile Gly Asn

1205 1210 1215

Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Ser Asn Ile Gly

1220 1225 1230

Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr

1235 1240 1245

Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp

1250 1255 1260

Ser Ser Ile Ser Lys Glu Asn Gly Trp Lys Glu

1265 1270

<210> 7

<211> 1297

<212> PRT

<213> 肉毒杆菌（Clostridium botulinum）

<400> 7

Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn

1 5 10 15

Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly

50 55 60

Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys

65 70 75 80

Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile

100 105 110

Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys

115 120 125

Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln

130 135 140

Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile

165 170 175

Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met

180 185 190

Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe

245 250 255

Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile

275 280 285

Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn

290 295 300

Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met

340 345 350

Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr

355 360 365

Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala

385 390 395 400

Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn

405 410 415

Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg

420 425 430

Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu

435 440 445

Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys

450 455 460

Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn

465 470 475 480

Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile

485 490 495

Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr

500 505 510

Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys

515 520 525

Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu

530 535 540

Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu

545 550 555 560

Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr

565 570 575

Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala

580 585 590

Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser

595 600 605

Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile

610 615 620

Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala

625 630 635 640

Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu

645 650 655

Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr

660 665 670

Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser

675 680 685

Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu

690 695 700

Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile

705 710 715 720

Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu

725 730 735

Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met

740 745 750

Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser

755 760 765

Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu

785 790 795 800

Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp

805 810 815

Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys

820 825 830

Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr

835 840 845

Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn

850 855 860

Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu

865 870 875 880

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val

885 890 895

Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu

900 905 910

Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser

915 920 925

Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr

930 935 940

Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

945 950 955 960

Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn

965 970 975

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile

980 985 990

Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys

995 1000 1005

Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn

1010 1015 1020

Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn

1025 1030 1035

Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile

1040 1045 1050

Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn

1055 1060 1065

Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr

1070 1075 1080

Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met

1100 1105 1110

Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu

1115 1120 1125

Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln

1130 1135 1140

Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn

1145 1150 1155

Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr

1160 1165 1170

Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val

1175 1180 1185

Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu

1190 1195 1200

Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile

1205 1210 1215

Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys

1220 1225 1230

Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe

1235 1240 1245

Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe

1250 1255 1260

Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn

1265 1270 1275

Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu

1280 1285 1290

Gly Trp Thr Glu

1295

Claims (18)

1.一种液体组合物，其包含蛋白质性神经毒素，表面活性剂，选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸，包含钠、氯和磷酸根离子的缓冲剂，

其中所述液体组合物具有5.5至8的pH，

其中所述组合物不含动物来源的蛋白质，并且

其中所述液体组合物随时间稳定。

2.根据权利要求1所述的液体组合物，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。

3.根据权利要求2所述的液体组合物，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。

4.根据权利要求1-3任一项所述的液体组合物，其中所述氨基酸是色氨酸，优选L-色氨酸。

5.根据权利要求1-4任一项所述的液体组合物，其中所述缓冲剂还包含钾离子。

6.根据权利要求1-5任一项所述的液体组合物，其中所述组合物的pH为6.0-7.5。

7.根据权利要求1-6任一项所述的液体组合物，其中在5℃下在2、3、6、12、18、24或36个月时细胞外蛋白水解活性的损失不超过30％。

8.根据权利要求1-7任一项所述的液体组合物，其中所述蛋白质性神经毒素是肉毒杆菌神经毒素，其选自复合物形式的天然肉毒杆菌神经毒素、高纯度天然肉毒杆菌神经毒素和重组肉毒杆菌神经毒素。

9.根据权利要求8所述的液体组合物，其中所述肉毒杆菌神经毒素是选自肉毒杆菌神经毒素A、B、C、D、E、F或G，修饰的肉毒杆菌神经毒素和嵌合的肉毒杆菌神经毒素的重组肉毒杆菌神经毒素。

10.根据权利要求1-9任一项所述的液体组合物，其中所述液体组合物包含：

○每毫升4至10000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，

○0.001至15％v/v聚山梨醇酯，

○0.1至5mg/mL色氨酸，

○10至500mM NaCl，

○1至50mM KCl，

○1至100mM磷酸钠，

pH为5.5至8，并且在5℃下稳定6个月。

11.根据权利要求10所述的液体组合物，其中所述液体组合物包含：

○每毫升10至2000个LD50单位的肉毒杆菌神经毒素，

○0.05至0.2％v/v聚山梨醇酯80，

○0.1至5mg/mL色氨酸，

○25至300mM NaCl，

○1至10mM KCl，

○2至50mM磷酸钠，

pH为6.0至7.5，并且在5℃下稳定12个月。

12.根据权利要求1-11任一项所述的液体组合物，其用于治疗。

13.根据权利要求12所述的液体组合物，其用于治疗或预防肌肉疾病、神经肌肉疾病、神经疾病、眼科疾病、疼痛疾病、心理疾病、关节疾病、炎性疾病、内分泌疾病或泌尿疾病。

14.根据权利要求1-11任一项所述的液体组合物在审美医学中的用途，例如用于治疗或预防皮肤皱纹，特别是面部皱纹，例如面部皱眉纹、眼部轮廓的皱纹、眉间皱眉纹、口角下垂、颈部皱纹(颈阔肌带)、下巴皱纹(颏肌纹、橘皮状皮肤、凹陷的下巴)、额头纹、“抓伤的皮肤”皱纹、鼻托处理或睡纹。

15.选自色氨酸和酪氨酸的氨基酸保护蛋白质性神经毒素免于在不含动物来源的蛋白质的液体组合物中降解的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述氨基酸是色氨酸。

17.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述蛋白质性神经毒素是肉毒杆菌神经毒素。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述氨基酸与表面活性剂和包含钠、氯和磷酸根离子的缓冲剂组合使用，并且所述液体组合物具有5.5至8的pH。