JP2021508453A - ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび皮膚の若返りのための使用方法 - Google Patents

ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび皮膚の若返りのための使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2021508453A
JP2021508453A JP2020534267A JP2020534267A JP2021508453A JP 2021508453 A JP2021508453 A JP 2021508453A JP 2020534267 A JP2020534267 A JP 2020534267A JP 2020534267 A JP2020534267 A JP 2020534267A JP 2021508453 A JP2021508453 A JP 2021508453A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
kda
polypeptide
bont
seq
botulinum toxin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2020534267A
Other languages
English (en)
Inventor
バージット ピー エス ジャッキー
バージット ピー エス ジャッキー
アンダーセン エイミー ブリドー
アンダーセン エイミー ブリドー
フイ ヨウ
フイ ヨウ
シアザー ゼット マリク
シアザー ゼット マリク
ドナルド イー フレイル
ドナルド イー フレイル
ミッチェル エフ ブリン
ミッチェル エフ ブリン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Allergan Inc
Original Assignee
Allergan Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Allergan Inc filed Critical Allergan Inc
Publication of JP2021508453A publication Critical patent/JP2021508453A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/007—Preparations for dry skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/008—Preparations for oily skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

ボツリヌス毒素の結合ドメインに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドが記載される。ポリペプチドは、例えば、コラーゲン産生および細胞外マトリックス組織化に関与する遺伝子の発現をモジュレートし、それにより、弾力、硬さなどの皮膚の質特性をモジュレートすることにおける使用を見出す。さらに、ポリペプチドは、分化した細胞において脂質生合成を阻害し、それにより、大きな毛穴およびざ瘡に悩まされている皮膚組織において頻繁に観察される皮膚の脂性を低減することにおける使用を見出す。ポリペプチドをコードする核酸ならびに、核酸を含むベクター、宿主細胞および系もさらに記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／６０８，１１９号、２０１７年１２月２０日出願および米国仮特許出願第６２／７２７，６４０号、２０１８年９月６日出願の利益を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年１２月１７日に作成した前記ＡＳＣＩＩ複製物は、１９９８０−ＵＳ−ＮＴＢ＿ＳＬ１９９８０ＰＲＯＶ２（ＮＴＢ）＿ＳＬ．ｔｘｔと名前を付けられ、サイズ７１，９９４バイトである。
技術分野
本開示は、ボツリヌス毒素の細胞結合ドメイン由来のポリペプチドおよび皮膚の若返りに関する美容適用のためのポリペプチドの使用に一般に関する。
嫌気性グラム陽性細菌ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｉｌｉｎｕｍ）は、十分に実証された医学的適用を有する強力なポリペプチド神経毒、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を産生する。天然に存在するクロストリジウム毒素は、酵素ドメインを含むおよそ５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）、ならびにＮ末端移行ドメイン（ＨN）およびＣ末端受容体結合ドメイン（ＨC）を含むおよそ１００ｋＤａの重鎖のおよそ１５０キロダルトン（ｋＤａ）の１本鎖ポリペプチドとしてそれぞれ翻訳される。したがって、全長クロストリジウム毒素分子は、以下の３個の機能的に異なるドメインを含む：（１）ＬＣに位置し、神経伝達物質放出装置のコア構成成分を特異的に標的にする亜鉛依存性エンドペプチダーゼを含有するメタロプロテアーゼ領域を含む酵素ドメイン；（２）重鎖のアミノ末端側半分（ＨN）内に含有され、細胞内小胞から標的細胞の細胞質中へのＬＣの放出を促進する移行ドメイン；および（３）重鎖のカルボキシル末端側半分（ＨC）内に見出され、標的細胞の表面に位置する受容体への毒素の結合親和性および特異性を決定する結合ドメイン。結合ドメインは、Ｎ末端サブドメイン（ＨCN）およびＣ末端サブドメイン（ＨCC）と称されるほぼ等しいサイズの２つの異なる構造的特性を有する。
この毒素構造様式は、例えばボツリヌス神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、ＤＣ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＸおよびＪの種々の免疫学的に異なるボツリヌス神経毒に存在する。血清型に関わらず、全長１５０ｋＤａ毒素タンパク質およびそれらの中の個々のドメイン間に顕著な程度で構造的および機能的相同性が存在する。これに関連して、ＢｏＮＴは、互いにおよそ３５％のアミノ酸同一性を有し、同じ機能性ドメイン組織および全体的な構造的構造様式を共有している。各種類のクロストリジウム毒素内に、それらのアミノ酸配列においていくらか異なるサブタイプもある；しかし、種々のドメインのドメイン構造様式、例えば、エンドペプチダーゼ、移行および細胞結合ドメインは、個々のサブタイプ内でも保存されている。例えば、５個のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３ ＢｏＮＴ／Ａ４およびＢｏＮＴ／Ａ５が存在し；全体におよそ８９％のアミノ酸同一性を共有している。スーパーファミリーの他のメンバー、例えばＣ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）の均一な群によって産生される破傷風毒素（ＴｅＮＴ）ならびにクロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）によって産生される他の関連する毒素、例えば、ＢａＮＴ（Ｃ．バラチ（Ｃ．ｂａｒａｔｉｉ）によって産生される）およびＢｕＮＴ（Ｃ．ブチリクム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）によって産生される）も、前述のクロストリジウム毒素、例えばＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｅに、例えばアミノ酸配列同一性に関して構造的に類似している。
既存の医薬用製剤は、全長クロストリジウム毒素を含有する。クロストリジウム毒素全体と比較して治療プロファイルの改善、例えば、安全性の改善、安定性の増強および／またはさらに良好なｉｎ ｖｉｖｏ有効性をもたらす一方で、全長に勝るとも劣らない生物学的活性を有するクロストリジウム毒素断片および変種に対する必要性がある。
本開示のＢｏＮＴポリペプチドの種々の美容適用が本明細書に記載される。例えば、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）、その断片または変種を含有するポリペプチドを用いた初代ヒト皮膚線維芽細胞の処置は、多数の遺伝子の発現をモジュレートする。具体的には、本開示のポリペプチドを用いた処置は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのマトリックス分解酵素およびＴＰ６３（形質転換関連タンパク質６３、角膜および上皮性幹細胞を特定する転写因子）などのタンパク質をコードする遺伝子の発現を最初に増加させ、コラーゲンおよびエラスチンなどの主要なマトリックス構造タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加が続き、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングを示す。開示のポリペプチド、例えばＢｏＮＴ／Ａ（ＨC／Ａ）を用いた正常ヒト初代線維芽細胞の処置は、組織およびＥＣＭ恒常性、リモデリング、再生および修復に関与することが周知である遺伝子の発現を増加させた。
本開示のポリペプチドの断片、例えばＢｏＮＴの結合ドメインのＮ末端側半分を用いて行われた追加的研究も、正常ヒト初代線維芽細胞への同様の細胞効果をもたらした。具体的には、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）および結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）は、それぞれ線維芽細胞関連遺伝子；ＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７、ＴＰ６３、ＳＯＤ２、ＵＢＤ、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−３２、ＣＣＬ２およびＢＤＫＲＢ１の発現に影響を与えることに等しく有効であった。これらのデータは、本開示のポリペプチドによるヒト患者における皮膚真皮の構造的および機能的特性の潜在的モジュレーションを示している。
線維芽細胞でのさらなる研究は、本開示のポリペプチドがフィブロネクチン発現をモジュレートすることを示した。フィブロネクチンが皮膚のＥＣＭ構造および／または生体力学的特性の変化を介在することと関連していることから、データは、皮膚の物理的および／または力学的性状を変化させることへの本開示のポリペプチドの潜在的効果を示している。
初代線維芽細胞でのＢｏＮＴ／ＤＣ（ＨC／ＤＣ）を用いる並行研究は、遺伝子発現のモジュレーションに関して同様の結果を示した。例えば、ＨC／ＤＣ処置は、初代線維芽細胞において多数の遺伝子の発現をモジュレートした。ＨC／ＤＣは、ＨCN／Ａと比較して一部の遺伝子発現をモジュレートすることにさらに効果的であることが見出された。これらの発見は、他の追加的ＢｏＮＴ血清型が、ＢｏＮＴ／Ａ（ＨC／Ａ）およびＢｏＮＴ／ＤＣ（ＨC／ＤＣ）と類似である様式で皮膚の特性または性状に影響を与え得ることを示唆している。
脂腺細胞での機能研究は、本開示のポリペプチドが脂腺におけるオレイン酸誘導脂質生合成を顕著に阻害したことを明らかにした。脂腺細胞脂質生合成が皮膚の美容特性と関連していることから、これらのデータは、皮膚特性または性状をモジュレートすることにおける本開示のポリペプチドの応用可能性を示している。
したがって本開示は、次の非限定的態様に関する。
一態様では、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素の結合ドメイン配列を含む、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列、ならびにそのようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組成物が記載される。一実施形態では、細胞シグナル伝達に関与し、ならびに／または例えばフィブロネクチン、エラスチンおよび／もしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質の発現の増加ならびに細胞表現型における対応する変化を達成するように細胞性遺伝子発現をモジュレートするポリペプチド配列が記載される。一部の実施形態では、標的細胞、例えば、脂腺細胞において脂質生合成を顕著に低減するポリペプチド配列が記載される。
別の態様では、ボツリヌス毒素の結合ドメイン中のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、ポリペプチドの分子量は、約４ｋＤａ〜約６０ｋＤの間である。一実施形態では、ポリペプチドの分子量は、約１２ｋＤａ〜約５０ｋＤの間である。
別の態様では、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間のポリペプチドの分子量を有する。一実施形態では、ポリペプチドの分子量は、約４ｋＤａ〜約６０ｋＤの間である。一実施形態では、ポリペプチドの分子量は、約１２ｋＤａ〜約５０ｋＤの間である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の全長のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、毒性を欠いている。一実施形態では、ポリペプチドは、毒性を欠いたボツリヌス毒素の全長のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖におけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖のカルボキシルまたはＣ末端セグメント（ＨC）におけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのＮ末端側半分と同一のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、ボツリヌス毒素血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ／Ｃ1）、ボツリヌス毒素血清型Ｄ（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス毒素血清型Ｅ（ＢｏＮＴ／Ｅ）、ボツリヌス毒素血清型Ｆ（ＢｏＮＴ／Ｆ）、ボツリヌス毒素血清型Ｇ（ＢｏＮＴ／Ｇ）、ボツリヌス毒素血清型Ｈ（ＢｏＮＴ／Ｈ）、ボツリヌス毒素血清型Ｘ（ＢｏＮＴ／Ｘ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢｏＮＴ／Ｊ（ｅＢｏＮＴ／Ｊ）ならびにこれらのモザイクボツリヌス毒素および／または変種からなる群から選択される。モザイク毒素の例としてはＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／ＣＤおよびＢｏＮＴ／ＦＡが挙げられる。一実施形態では、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）ではない。
さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、線維芽細胞関連遺伝子の発現をモジュレートできる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＦＧＦＲ１（線維芽細胞増殖因子受容体１）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３（マトリックスメタロプロテイナーゼ）、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害物質１）、ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７）およびＴＰ６３（腫瘍タンパク質ｐ６３）から選択される遺伝子をモジュレートできる。
他の実施形態では、ポリペプチドは、ＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７、ＴＰ６３、ＳＯＤ２（スーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア）、ＵＢＤ（ユビキチンＤ）、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３（ヒアルロナン合成酵素）、ＡＤＡＭＴＳ１（トロンボスポンジンモチーフ１を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子１）、ＩＬ−６、ＩＬ−３２（インターロイキン）、ＣＣＬ２（Ｃケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２）およびＢＤＫＲＢ１（ブラジキニン受容体Ｂ１）から選択される遺伝子を含む遺伝子シグネチャーの発現をモジュレートできる。
他の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＣ５Ｒ、ＡＲ、ＨＳＤ３Ｂ１、ＨＳＤ１７Ｂ１およびＰＰＡＲδから選択される遺伝子を含む遺伝子シグネチャーの発現モジュレートできる。一実施形態では、ポリペプチドは、脂腺細胞においてＭＣ５Ｒ、ＡＲ、ＨＳＤ３Ｂ１、ＨＳＤ１７Ｂ１およびＰＰＡＲδから選択される少なくとも１つの遺伝子の誘導された発現をモジュレートできる。
他の実施形態では、ポリペプチドは、標的細胞においてフィブロネクチン発現または合成を上昇させることができる。一部の実施形態では、標的細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂腺細胞、脂肪細胞、ニューロンまたはこれらの組合せを含む。
別の実施形態では、ポリペプチドは、標的細胞の形態学的または機能的特性を変化させることができる。
別の実施形態では、ポリペプチドは、標的線維芽細胞の形態学的特性を変化させることができる。
別の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素エンドペプチダーゼ活性を欠いている。
さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素移行活性を欠いている。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖のアミノ末端（ＨN）におけるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を欠いている。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる。
さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８からなる群から選択される配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％相同性を有するアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％配列同一性を有する。
さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８に記載されるポリペプチド配列から本質的になる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドがポリペプチド配列中に１、２、３、４または５個の変異を含有するという条件で、配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８に記載されるポリペプチド配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。好ましくは、変異体ポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド配列中に１、２、３、４または５個の変異を含有する、例えば、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７に記載されるポリペプチド配列を含む、それから本質的になるまたはそれからなる変異体ポリペプチド。
別の態様では、本明細書に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。
別の態様では、医薬組成物は、本明細書に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含めて提供される。
一実施形態では、医薬組成物は、局所または経皮投与のために製剤化される。
さらに別の態様では、本明細書に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質を含むキットが記載される。一部の実施形態では、キットは、投与のための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のパッケージを含む。
さらに別の態様では、対象において皮膚の質特性（quality attribute）をモジュレートするための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の全長においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおいてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、皮膚の質特性をモジュレートすることは、顔面筋の麻痺を伴わない。一部の実施形態では、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、ボツリヌス毒素血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ／Ｃ1）、ボツリヌス毒素血清型Ｄ（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス毒素血清型Ｅ（ＢｏＮＴ／Ｅ）、ボツリヌス毒素血清型Ｆ（ＢｏＮＴ／Ｆ）、ボツリヌス毒素血清型Ｇ（ＢｏＮＴ／Ｇ）、ボツリヌス毒素血清型Ｈ（ＢｏＮＴ／Ｈ）、ボツリヌス毒素血清型Ｘ（ＢｏＮＴ／Ｘ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢｏＮＴ／Ｊ（ｅＢｏＮＴ／Ｊ）ならびにこれらのモザイクボツリヌス毒素および／または変種からなる群から選択される。モザイク毒素の例としてはＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／ＣＤおよびＢｏＮＴ／ＦＡが挙げられる。一実施形態では、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）ではない。
一実施形態では、皮膚の質特性が、透明感、潤い（hydration）、上皮および真皮の厚み（thickness）、感触（texture）、弾力、色、トーン、柔軟性、硬さ、タイトネス（tightness）、滑らかさ、厚み、輝き（radiance）、均一さ（evenness）、緩み（laxity）、顔色、小じわ、しわ、毛穴サイズおよび脂性からなる群から選択される。別の実施形態では、モジュレーションは、特性において少なくとも約２０％改善をもたらすことができる。
さらに別の態様では、対象においてコラーゲン産生を刺激するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の全長においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおいてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、コラーゲン産生を刺激することは、顔面筋の麻痺を伴わない。
さらに別の態様では、対象における皮脂調節不全および／または異常に関連する皮膚障害を処置するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の全長においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおいてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、皮脂調節不全および／または異常に関連する皮膚障害を処置することは、顔面筋の麻痺を伴わない。
さらに別の態様では、対象において皮脂調節不全および／または異常に関連する感染を処置するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の全長においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおいてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、皮脂調節不全および／または異常に関連する感染を処置することは、顔面筋の麻痺を伴わない。
さらに別の態様では、対象において皮脂調節不全および／または異常に関連する炎症を処置するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の全長においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおいてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、皮脂調節不全および／または異常に関連する炎症を処置することは、顔面筋の麻痺を伴わない。
さらに別の態様では、対象における皮脂調節不全および／または異常をモジュレートするための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の全長においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインにおいてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）においてアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間の分子量を有する。一実施形態では、皮脂調節不全および／または異常をモジュレートすることは、顔面筋の麻痺を伴わない。
他の実施形態では、組成物は、局所、経皮または皮内投与のために製剤化される。
一実施形態では、いずれかの方法における使用のためのポリペプチドは、配列番号１、１９、３〜１８および２５〜２７からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％配列同一性を有する。
他の態様では：
（ａ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間であるｃＤＮＡ；
（ｂ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードする合成ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間である合成ＤＮＡ；
（ｃ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間であるコドン最適化ＤＮＡ；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡに相補的であるＤＮＡ
からなる群から選択されるポリヌクレオチドが提供される。
他の態様では：
（ａ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が５０ｋＤａ未満であるｃＤＮＡ；
（ｂ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードする合成ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が５０ｋＤａ未満である合成ＤＮＡ；
（ｃ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が５０ｋＤａ未満であるコドン最適化ＤＮＡ；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡに相補的であるＤＮＡ
からなる群から選択されるポリヌクレオチドが提供される。
他の態様では：
（ａ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が１ｋＤａを超えるが１５ｋＤａ未満であるｃＤＮＡ；
（ｂ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードする合成ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が１ｋＤａを超えるが１５ｋＤａ未満である合成ＤＮＡ；
（ｃ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が１ｋＤａを超えるが１５ｋＤａ未満であるコドン最適化ＤＮＡ；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡに相補的であるＤＮＡ
からなる群から選択されるポリヌクレオチドが提供される。
さらに別の態様では、配列番号２のポリヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１、配列番号１２〜１８および配列番号２５〜２７からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸またはその縮重物またはそのＲＮＡ等価物と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはより大きい％配列同一性を含むポリヌクレオチドが提供される。
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の核酸配列、またはその縮重物またはそのＲＮＡ等価物から本質的になる。
別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。他の態様では、ベクターを含む宿主細胞が提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ボツリヌス菌ではない。
他の態様では、キット、組成物ならびにキットおよび組成物を使用する方法が提供される。一実施形態では、ベクターおよび好適な宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させるための説明書を１つまたは複数のパッケージ中に含むキットが提供される。別の実施形態では、ベクターまたは宿主細胞および医薬用賦形剤を含む組成物が提供される。さらに別の実施形態では、ポリペプチドの発現を達成するためのベクターまたは宿主細胞を含む組成物を対象に投与することを含む皮膚の質特性を改善するための方法が提供される。
配列の簡潔な記載
配列番号１は、ＢｏＮＴ／Ａ１の細胞結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列である。
ＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＣＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮＳＧＩＬＫＤＦＷＧＤＹＬＱＹＤＫＰＹＹＭＬＮＬＹＤＰＮＫＹＶＤＶＮＮＶＧＩＲＧＹＭＹＬＫＧＰＲＧＳＶＭＴＴＮＩＹＬＮＳＳＬＹＲＧＴＫＦＩＩＫＫＹＡＳＧＮＫＤＮＩＶＲＮＮＤＲＶＹＩＮＶＶＶＫＮＫＥＹＲＬＡＴＮＡＳＱＡＧＶＥＫＩＬＳＡＬＥＩＰＤＶＧＮＬＳＱＶＶＶＭＫＳＫＮＤＱＧＩＴＮＫＣＫＭＮＬＱＤＮＮＧＮＤＩＧＦＩＧＦＨＱＦＮＮＩＡＫＬＶＡＳＮＷＹＮＲＱＩＥＲＳＳＲＴＬＧＣＳＷＥＦＩＰＶＤＤＧＷＧＥＲＰＬ
配列番号１９は、Ｎ末端ｈｉｓタグ（Ｎ末端タグを構成するアミノ酸は下線を引かれている）をさらに含むＢｏＮＴ／Ａ１の細胞結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列である。
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＤＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＣＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮＳＧＩＬＫＤＦＷＧＤＹＬＱＹＤＫＰＹＹＭＬＮＬＹＤＰＮＫＹＶＤＶＮＮＶＧＩＲＧＹＭＹＬＫＧＰＲＧＳＶＭＴＴＮＩＹＬＮＳＳＬＹＲＧＴＫＦＩＩＫＫＹＡＳＧＮＫＤＮＩＶＲＮＮＤＲＶＹＩＮＶＶＶＫＮＫＥＹＲＬＡＴＮＡＳＱＡＧＶＥＫＩＬＳＡＬＥＩＰＤＶＧＮＬＳＱＶＶＶＭＫＳＫＮＤＱＧＩＴＮＫＣＫＭＮＬＱＤＮＮＧＮＤＩＧＦＩＧＦＨＱＦＮＮＩＡＫＬＶＡＳＮＷＹＮＲＱＩＥＲＳＳＲＴＬＧＣＳＷＥＦＩＰＶＤＤＧＷＧＥＲＰＬＱ
配列番号２は、ＢｏＮＴ／Ａ１の細胞結合ドメインのＤＮＡ配列である。
ａｃｃａｇｃａｔｔｃｔｇａａｃｃｔｇｃｇｔｔａｔｇａａａｇｃａａｃｃａｔｃｔｇａｔｔｇａｔｃｔｇａｇｃｃｇｔｔａｔｇｃｇａｇｃａａａａｔｔａａｃａｔｔｇｇｃａｇｃａａａｇｔｇａａｃｔｔｔｇａｔｃｃｇａｔｔｇａｔａａｇａａｃｃａｇａｔｔｃａｇｃｔｇｔｔｔａａｃｃｔｇｇａａａｇｃａｇｃａａａａｔｔｇａａｇｔｇａｔｔｃｔｇａａｇａａｃｇｃｇａｔｔｇｔｇｔａｔａａｃａｇｃａｔｇｔａｔｇａａａａｃｔｔｔａｇｃａｃｃａｇｃｔｔｔｔｇｇａｔｔｃｇｔａｔｔｃｃｇａａａｔａｔｔｔｔａａｃａｇｃａｔｔａｇｃｃｔｇａａｃａａｃｇａａｔａｔａｃｃａｔｔａｔｔａａｃｔｇｃａｔｇｇａａａａｃａａｃａｇｃｇｇｃｔｇｇａａａｇｔｇａｇｃｃｔｇａａｃｔａｔｇｇｃｇａａａｔｔａｔｔｔｇｇａｃｃｃｔｇｃａｇｇａｔａｃｃｃａｇｇａａａｔｔａａａｃａｇｃｇｔｇｔｇｇｔｇｔｔｔａａａｔａｔａｇｃｃａｇａｔｇａｔｔａａｃａｔｔａｇｃｇａｔｔａｔａｔｔａａｃｃｇｔｔｇｇａｔｃｔｔｔｇｔｇａｃｃａｔｔａｃｃａａｃａａｃｃｇｔｃｔｇａａｃａａｃａｇｃａａａａｔｔｔａｔａｔｔａａｃｇｇｃｃｇｔｃｔｇａｔｔｇａｔｃａｇａａａｃｃｇａｔｔａｇｃａａｃｃｔｇｇｇｃａａｃａｔｔｃａｔｇｃｇａｇｃａａｃａａｃａｔｔａｔｇｔｔｔａａａｃｔｇｇａｔｇｇｃｔｇｃｃｇｔｇａｔａｃｃｃａｔｃｇｔｔａｔａｔｔｔｇｇａｔｔａａａｔａｔｔｔｔａａｃｃｔｇｔｔｔｇａｔａａａｇａｇｃｔｃａａｃｇａｇａａａｇａａａｔｔａａａｇａｔｃｔｇｔａｔｇａｔａａｃｃａｇａｇｃａａｃａｇｃｇｇｃａｔｔｃｔｇａａａｇａｔｔｔｃｔｇｇｇｇｃｇａｔｔａｔｃｔｇｃａｇｔａｔｇａｔａａａｃｃｇｔａｔｔａｔａｔｇｃｔｇａａｃｃｔｇｔａｔｇａｔｃｃｇａａｃａａａｔａｔｇｔｇｇａｔｇｔｇａａｃａａｃｇｔｇｇｇｃａｔｔｃｇｔｇｇｃｔａｔａｔｇｔａｔｃｔｇａａａｇｇｃｃｃｇｃｇｔｇｇｃａｇｃｇｔｇａｔｇａｃｃａｃｃａａｃａｔｔｔａｔｃｔｇａａｃａｇｃａｇｃｃｔｇｔａｔｃｇｔｇｇｃａｃｃａａａｔｔｔａｔｔａｔｔａａｇａａｇｔａｔｇｃｇａｇｃｇｇｃａａｃａａａｇａｔａａｃａｔｔｇｔｇｃｇｔａａｃａａｃｇａｔｃｇｔｇｔｇｔａｔａｔｔａａｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇａａｇａａｃａａａｇａａｔａｔｃｇｔｃｔｇｇｃｇａｃｃａａｃｇｃｇａｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｃｇｔｇｇａａａａｇａｔｔｃｔｇａｇｃｇｃｇｃｔｇｇａａａｔｔｃｃｇｇａｔｇｔｇｇｇｃａａｃｃｔｇａｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｇａａａａｇｃａａｇａａｃｇａｔｃａｇｇｇｃａｔｔａｃｃａａｃａａａｔｇｃａａａａｔｇａａｃｃｔｇｃａｇｇａｔａａｃａａｃｇｇｃａａｃｇａｔａｔｔｇｇｃｔｔｔａｔｔｇｇｃｔｔｔｃａｔｃａｇｔｔｔａａｃａａｃａｔｔｇｃｇａａａｃｔｇｇｔｇｇｃｇａｇｃａａｃｔｇｇｔａｔａａｃｃｇｔｃａｇａｔｔｇａａｃｇｔａｇｃａｇｃｃｇｔａｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇｇｇａａｔｔｔａｔｔｃｃｇｇｔｇｇａｔｇａｔｇｇｃｔｇｇｇｇｃｇａａｃｇｔｃｃｇｃｔｇｔａａ
配列番号３は、ＢｏＮＴ／Ｂの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｂ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＡＥ４８２６４）。
ＮＩＩＬＮＬＲＹＫＤＮＮＬＩＤＬＳＧＹＧＡＫＶＥＶＹＤＧＶＥＬＮＤＫＮＱＦＫＬＴＳＳＡＮＳＫＩＲＶＴＱＮＱＮＩＩＦＮＳＶＦＬＤＦＳＶＳＦＷＩＲＩＰＫＹＫＮＤＧＩＱＮＹＩＨＮＥＹＴＩＩＮＣＭＫＮＮＳＧＷＫＩＳＩＲＧＮＲＩＩＷＴＬＩＤＩＮＧＫＴＫＳＶＦＦＥＹＮＩＲＥＤＩＳＥＹＩＮＲＷＦＦＶＴＩＴＮＮＬＮＮＡＫＩＹＩＮＧＫＬＥＳＮＴＤＩＫＤＩＲＥＶＩＡＮＧＥＩＩＦＫＬＤＧＤＩＤＲＴＱＦＩＷＭＫＹＦＳＩＦＮＴＥＬＳＱＳＮＩＥＥＲＹＫＩＱＳＹＳＥＹＬＫＤＦＷＧＮＰＬＭＹＮＫＥＹＹＭＦＮＡＧＮＫＮＳＹＩＫＬＫＫＤＳＰＶＧＥＩＬＴＲＳＫＹＮＱＮＳＫＹＩＮＹＲＤＬＹＩＧＥＫＦＩＩＲＲＫＳＮＳＱＳＩＮＤＤＩＶＲＫＥＤＹＩＹＬＤＦＦＮＬＮＱＥＷＲＶＹＴＹＫＹＦＫＫＥＥＥＫＬＦＬＡＰＩＳＤＳＤＥＦＹＮＴＩＱＩＫＥＹＤＥＱＰＴＹＳＣＱＬＬＦＫＫＤＥＥＳＴＤＥＩＧＬＩＧＩＨＲＦＹＥＳＧＩＶＦＥＥＹＫＤＹＦＣＩＳＫＷＹＬＫＥＶＫＲＫＰＹＮＬＫＬＧＣＮＷＱＦＩＰＫＤＥＧＷＴＥ
配列番号４は、ＢｏＮＴ／Ｃの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｃ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｐ１８６４０）。
ＳＫＩＬＳＬＱＮＲＫＮＴＬＶＤＴＳＧＹＮＡＥＶＳＥＥＧＤＶＱＬＮＰＩＦＰＦＤＦＫＬＧＳＳＧＥＤＲＧＫＶＩＶＴＱＮＥＮＩＶＹＮＳＭＹＥＳＦＳＩＳＦＷＩＲＩＮＫＷＶＳＮＬＰＧＹＴＩＩＤＳＶＫＮＮＳＧＷＳＩＧＩＩＳＮＦＬＶＦＴＬＫＱＮＥＤＳＥＱＳＩＮＦＳＹＤＩＳＮＮＡＰＧＹＮＫＷＦＦＶＴＶＴＮＮＭＭＧＮＭＫＩＹＩＮＧＫＬＩＤＴＩＫＶＫＥＬＴＧＩＮＦＳＫＴＩＴＦＥＩＮＫＩＰＤＴＧＬＩＴＳＤＳＤＮＩＮＭＷＩＲＤＦＹＩＦＡＫＥＬＤＧＫＤＩＮＩＬＦＮＳＬＱＹＴＮＶＶＫＤＹＷＧＮＤＬＲＹＮＫＥＹＹＭＶＮＩＤＹＬＮＲＹＭＹＡＮＳＲＱＩＶＦＮＴＲＲＮＮＮＤＦＮＥＧＹＫＩＩＩＫＲＩＲＧＮＴＮＤＴＲＶＲＧＧＤＩＬＹＦＤＭＴＩＮＮＫＡＹＮＬＦＭＫＮＥＴＭＹＡＤＮＨＳＴＥＤＩＹＡＩＧＬＲＥＱＴＫＤＩＮＤＮＩＩＦＱＩＱＰＭＮＮＴＹＹＹＡＳＱＩＦＫＳＮＦＮＧＥＮＩＳＧＩＣＳＩＧＴＹＲＦＲＬＧＧＤＷＹＲＨＮＹＬＶＰＴＶＫＱＧＮＹＡＳＬＬＥＳＴＳＴＨＷＧＦＶＰＶＳＥ
配列番号５は、ＢｏＮＴ／Ｄの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｄ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｐ１９３２１）。
ＳＫＩＬＳＬＱＮＫＫＮＡＬＶＤＴＳＧＹＮＡＥＶＲＶＧＤＮＶＱＬＮＴＩＹＴＮＤＦＫＬＳＳＳＧＤＫＩＩＶＮＬＮＮＮＩＬＹＳＡＩＹＥＮＳＳＶＳＦＷＩＫＩＳＫＤＬＴＮＳＨＮＥＹＴＩＩＮＳＩＥＱＮＳＧＷＫＬＣＩＲＮＧＮＩＥＷＩＬＱＤＶＮＲＫＹＫＳＬＩＦＤＹＳＥＳＬＳＨＴＧＹＴＮＫＷＦＦＶＴＩＴＮＮＩＭＧＹＭＫＬＹＩＮＧＥＬＫＱＳＱＫＩＥＤＬＤＥＶＫＬＤＫＴＩＶＦＧＩＤＥＮＩＤＥＮＱＭＬＷＩＲＤＦＮＩＦＳＫＥＬＳＮＥＤＩＮＩＶＹＥＧＱＩＬＲＮＶＩＫＤＹＷＧＮＰＬＫＦＤＴＥＹＹＩＩＮＤＮＹＩＤＲＹＩＡＰＥＳＮＶＬＶＬＶＱＹＰＤＲＳＫＬＹＴＧＮＰＩＴＩＫＳＶＳＤＫＮＰＹＳＲＩＬＮＧＤＮＩＩＬＨＭＬＹＮＳＲＫＹＭＩＩＲＤＴＤＴＩＹＡＴＱＧＧＥＣＳＱＮＣＶＹＡＬＫＬＱＳＮＬＧＮＹＧＩＧＩＦＳＩＫＮＩＶＳＫＮＫＹＣＳＱＩＦＳＳＦＲＥＮＴＭＬＬＡＤＩＹＫＰＷＲＦＳＦＫＮＡＹＴＰＶＡＶＴＮＹＥＴＫＬＬＳＴＳＳＦＷＫＦＩＳＲＤＰＧＷＶＥ
配列番号６は、ＢｏＮＴ／ＤＣの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／ＤＣ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＥＦ３７８９４７）。
ＳＫＩＬＳＬＱＮＫＫＮＴＬＭＤＴＳＧＹＮＡＥＶＲＶＥＧＮＶＱＬＮＰＩＦＰＦＤＦＫＬＧＳＳＧＤＤＲＧＫＶＩＶＴＱＮＥＮＩＶＹＮＡＭＹＥＳＦＳＩＳＦＷＩＲＩＮＫＷＶＳＮＬＰＧＹＴＩＩＤＳＶＫＮＮＳＧＷＳＩＧＩＩＳＮＦＬＶＦＴＬＫＱＮＥＮＳＥＱＤＩＮＦＳＹＤＩＳＫＮＡＡＧＹＮＫＷＦＦＶＴＩＴＴＮＭＭＧＮＭＭＩＹＩＮＧＫＬＩＤＴＩＫＶＫＥＬＴＧＩＮＦＳＫＴＩＴＦＱＭＮＫＩＰＮＴＧＬＩＴＳＤＳＤＮＩＮＭＷＩＲＤＦＹＩＦＡＫＥＬＤＤＫＤＩＮＩＬＦＮＳＬＱＹＴＮＶＶＫＤＹＷＧＮＤＬＲＹＤＫＥＹＹＭＩＮＶＮＹＭＮＲＹＭＳＫＫＧＮＧＩＶＦＮＴＲＫＮＮＮＤＦＮＥＧＹＫＩＩＩＫＲＩＲＧＮＴＮＤＴＲＶＲＧＥＮＶＬＹＦＮＴＴＩＤＮＫＱＹＳＬＧＭＹＫＰＳＲＮＬＧＴＤＬＶＰＬＧＡＬＤＱＰＭＤＥＩＲＫＹＧＳＦＩＩＱＰＣＮＴＦＤＹＹＡＳＱＬＦＬＳＳＮＡＴＴＮＲＬＧＩＬＳＩＧＳＹＳＦＫＬＧＤＤＹＷＦＮＨＥＹＬＩＰＶＩＫＩＥＨＹＡＳＬＬＥＳＴＳＴＨＷＶＦＶＰＡＳＥ
配列番号２０は、Ｎ末端ｈｉｓタグ（Ｎ末端タグを構成するアミノ酸は下線を引かれている）をさらに含む、ＢｏＮＴ／ＤＣの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＥＦ３７８９４７）。
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＤＳＫＩＬＳＬＱＮＫＫＮＴＬＭＤＴＳＧＹＮＡＥＶＲＶＥＧＮＶＱＬＮＰＩＦＰＦＤＦＫＬＧＳＳＧＤＤＲＧＫＶＩＶＴＱＮＥＮＩＶＹＮＡＭＹＥＳＦＳＩＳＦＷＩＲＩＮＫＷＶＳＮＬＰＧＹＴＩＩＤＳＶＫＮＮＳＧＷＳＩＧＩＩＳＮＦＬＶＦＴＬＫＱＮＥＮＳＥＱＤＩＮＦＳＹＤＩＳＫＮＡＡＧＹＮＫＷＦＦＶＴＩＴＴＮＭＭＧＮＭＭＩＹＩＮＧＫＬＩＤＴＩＫＶＫＥＬＴＧＩＮＦＳＫＴＩＴＦＱＭＮＫＩＰＮＴＧＬＩＴＳＤＳＤＮＩＮＭＷＩＲＤＦＹＩＦＡＫＥＬＤＤＫＤＩＮＩＬＦＮＳＬＱＹＴＮＶＶＫＤＹＷＧＮＤＬＲＹＤＫＥＹＹＭＩＮＶＮＹＭＮＲＹＭＳＫＫＧＮＧＩＶＦＮＴＲＫＮＮＮＤＦＮＥＧＹＫＩＩＩＫＲＩＲＧＮＴＮＤＴＲＶＲＧＥＮＶＬＹＦＮＴＴＩＤＮＫＱＹＳＬＧＭＹＫＰＳＲＮＬＧＴＤＬＶＰＬＧＡＬＤＱＰＭＤＥＩＲＫＹＧＳＦＩＩＱＰＣＮＴＦＤＹＹＡＳＱＬＦＬＳＳＮＡＴＴＮＲＬＧＩＬＳＩＧＳＹＳＦＫＬＧＤＤＹＷＦＮＨＥＹＬＩＰＶＩＫＩＥＨＹＡＳＬＬＥＳＴＳＴＨＷＶＦＶＰＡＳＥＱ
配列番号７は、ＢｏＮＴ／Ｅの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｅ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦＶ９１３４４）。
ＳＳＶＬＮＭＲＹＫＮＤＫＹＶＤＴＳＧＹＤＳＮＩＮＩＮＧＤＶＹＫＹＰＴＮＫＮＱＦＧＩＹＮＤＫＬＳＥＶＮＩＳＱＮＤＹＩＩＹＤＮＫＹＫＮＦＳＩＳＦＷＶＲＩＰＮＹＤＮＫＩＶＮＶＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＲＤＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＨＮＥＩＩＷＴＬＱＤＮＡＧＩＮＱＫＬＡＦＮＹＧＮＡＮＧＩＳＤＹＩＮＫＷＩＦＶＴＩＴＮＤＲＬＧＤＳＫＬＹＩＮＧＮＬＩＤＱＫＳＩＬＮＬＧＮＩＨＶＳＤＮＩＬＦＫＩＶＮＣＳＹＴＲＹＩＧＩＲＹＦＮＶＦＤＫＥＬＤＥＴＥＩＱＴＬＹＳＮＥＰＮＴＮＩＬＫＤＦＷＧＮＹＬＬＹＤＫＥＹＹＬＬＮＶＬＫＰＮＮＦＩＤＲＲＫＤＳＴＬＳＩＮＮＩＲＳＴＩＬＬＡＮＲＬＹＳＧＩＫＶＫＩＱＲＶＮＮＳＳＴＮＤＮＬＶＲＫＮＤＱＶＹＩＮＦＶＡＳＫＴＨＬＦＰＬＹＡＤＴＡＴＴＮＫＥＫＴＩＫＩＳＳＳＧＮＲＦＮＱＶＶＶＭＮＳＶＧＮＮＣＴＭＮＦＫＮＮＮＧＮＮＩＧＬＬＧＦＫＡＤＴＶＶＡＳＴＷＹＹＴＨＭＲＤＨＴＮＳＮＧＣＦＷＮＦＩＳＥＥＨＧＷＱＥＫ
配列番号８は、ＢｏＮＴ／Ｆの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｆ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＢＳ４１２０２）。
ＮＳＩＬＤＭＲＹＥＮＮＫＦＩＤＩＳＧＹＧＳＮＩＳＩＮＧＤＶＹＩＹＳＴＮＲＮＱＦＧＩＹＳＳＫＰＳＥＶＮＩＡＱＮＮＤＩＩＹＮＧＲＹＱＮＦＳＩＳＦＷＶＲＩＰＫＹＦＮＫＶＮＬＮＮＥＹＴＩＩＤＣＩＲＮＮＮＳＧＷＫＩＳＬＮＹＮＫＩＩＷＴＬＱＤＴＡＧＮＮＱＫＬＶＦＮＹＴＱＭＩＳＩＳＤＹＩＮＫＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＧＮＳＲＩＹＩＮＧＮＬＩＤＥＫＳＩＳＮＬＧＤＩＨＶＳＤＮＩＬＦＫＩＶＧＣＮＤＴＲＹＶＧＩＲＹＦＫＶＦＤＴＥＬＧＫＴＥＩＥＴＬＹＳＤＥＰＤＰＳＩＬＫＤＦＷＧＮＹＬＬＹＮＫＲＹＹＬＬＮＬＬＲＴＤＫＳＩＴＱＮＳＮＦＬＮＩＮＱＱＲＧＶＹＱＫＰＮＩＦＳＮＴＲＬＹＴＧＶＥＶＩＩＲＫＮＧＳＴＤＩＳＮＴＤＮＦＶＲＫＮＤＬＡＹＩＮＶＶＤＲＤＶＥＹＲＬＹＡＤＩＳＩＡＫＰＥＫＩＩＫＬＩＲＴＳＮＳＮＮＳＬＧＱＩＩＶＭＤＳＩＧＮＮＣＴＭＮＦＱＮＮＮＧＧＮＩＧＬＬＧＦＨＳＮＮＬＶＡＳＳＷＹＹＮＮＩＲＫＮＴＳＳＮＧＣＦＷＳＦＩＳＫＥＨＧＷＱＥＮ
配列番号９は、ＢｏＮＴ／Ｇの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｇ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ７４１６２）。
ＮＡＩＬＳＬＳＹＲＧＧＲＬＩＤＳＳＧＹＧＡＴＭＮＶＧＳＤＶＩＦＮＤＩＧＮＧＱＦＫＬＮＮＳＥＮＳＮＩＴＡＨＱＳＫＦＶＶＹＤＳＭＦＤＮＦＳＩＮＦＷＶＲＴＰＫＹＮＮＮＤＩＱＴＹＬＱＮＥＹＴＩＩＳＣＩＫＮＤＳＧＷＫＶＳＩＫＧＮＲＩＩＷＴＬＩＤＶＮＡＫＳＫＳＩＦＦＥＹＳＩＫＤＮＩＳＤＹＩＮＫＷＦＳＩＴＩＴＮＤＲＬＧＮＡＮＩＹＩＮＧＳＬＫＫＳＥＫＩＬＮＬＤＲＩＮＳＳＮＤＩＤＦＫＬＩＮＣＴＤＴＴＫＦＶＷＩＫＤＦＮＩＦＧＲＥＬＮＡＴＥＶＳＳＬＹＷＩＱＳＳＴＮＴＬＫＤＦＷＧＮＰＬＲＹＤＴＱＹＹＬＦＮＱＧＭＱＮＩＹＩＫＹＦＳＫＡＳＭＧＥＴＡＰＲＴＮＦＮＮＡＡＩＮＹＱＮＬＹＬＧＬＲＦＩＩＫＫＡＳＮＳＲＮＩＮＮＤＮＩＶＲＥＧＤＹＩＹＬＮＩＤＮＩＳＤＥＳＹＲＶＹＶＬＶＮＳＫＥＩＱＴＱＬＦＬＡＰＩＮＤＤＰＴＦＹＤＶＬＱＩＫＫＹＹＥＫＴＴＹＮＣＱＩＬＣＥＫＤＴＫＴＦＧＬＦＧＩＧＫＦＶＫＤＹＧＹＶＷＤＴＹＤＮＹＦＣＩＳＱＷＹＬＲＲＩＳＥＮＩＮＫＬＲＬＧＣＮＷＱＦＩＰＶＤＥＧＷＴＥ
配列番号１０は、ＢｏＮＴ／Ｘの重鎖内の結合ドメイン領域のアミノ酸配列である、ＨC／Ｘ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＢＡＱ１２７９０）。
ＶＬＮＬＧＡＥＤＧＫＩＫＤＬＳＧＴＴＳＤＩＮＩＧＳＤＩＥＬＡＤＧＲＥＮＫＡＩＫＩＫＧＳＥＮＳＴＩＫＩＡＭＮＫＹＬＲＦＳＡＴＤＮＦＳＩＳＦＷＩＫＨＰＫＰＴＮＬＬＮＮＧＩＥＹＴＬＶＥＮＦＮＱＲＧＷＫＩＳＩＱＤＳＫＬＩＷＹＬＲＤＨＮＮＳＩＫＩＶＴＰＤＹＩＡＦＮＧＷＮＬＩＴＩＴＮＮＲＳＫＧＳＩＶＹＶＮＧＳＫＩＥＥＫＤＩＳＳＩＷＮＴＥＶＤＤＰＩＩＦＲＬＫＮＮＲＤＴＱＡＦＴＬＬＤＱＦＳＩＹＲＫＥＬＮＱＮＥＶＶＫＬＹＮＹＹＦＮＳＮＹＩＲＤＩＷＧＮＰＬＱＹＮＫＫＹＹＬＱＴＱＤＫＰＧＫＧＬＩＲＥＹＷＳＳＦＧＹＤＹＶＩＬＳＤＳＫＴＩＴＦＰＮＮＩＲＹＧＡＬＹＮＧＳＫＶＬＩＫＮＳＫＫＬＤＧＬＶＲＮＫＤＦＩＱＬＥＩＤＧＹＮＭＧＩＳＡＤＲＦＮＥＤＴＮＹＩＧＴＴＹＧＴＴＨＤＬＴＴＤＦＥＩＩＱＲＱＥＫＹＲＮＹＣＱＬＫＴＰＹＮＩＦＨＫＳＧＬＭＳＴＥＴＳＫＰＴＦＨＤＹＲＤＷＶＹＳＳＡＷＹＦＱＮＹＥＮＬＮＬＲＫＨＴＫＴＮＷＹＦＩＰＫＤＥＧＷＤＥＤ
配列番号１１は、細胞結合ドメインのＮ末端断片と称され、ＨCN／Ａと略される、ＢｏＮＴ／Ａ１の細胞結合ドメインのアミノ酸配列の残基１〜２１８に対応するアミノ酸配列である（ＰＤＢ ＩＤ：３ＢＴＡ、４ＪＲＡ）。
ＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＣＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮ
配列番号２１は、Ｎ末端ヒスチジンタグおよび、細胞結合ドメインのＮ末端断片と称されＨCN／Ａと略されるＢｏＮＴ／Ａ１の細胞結合ドメインのアミノ酸配列の残基１〜２１８を含むアミノ酸配列である（Ｎ末端タグを構成するアミノ酸は下線を引かれている）：
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＤＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＣＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮ
配列番号１２は、ＢｏＮＴ／Ｂの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／Ｂ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＮＭ１）。
ＮＩＩＬＮＬＲＹＫＤＮＮＬＩＤＬＳＧＹＧＡＫＶＥＶＹＤＧＶＥＬＮＤＫＮＱＦＫＬＴＳＳＡＮＳＫＩＲＶＴＱＮＱＮＩＩＦＮＳＶＦＬＤＦＳＶＳＦＷＩＲＩＰＫＹＫＮＤＧＩＱＮＹＩＨＮＥＹＴＩＩＮＣＭＫＮＮＳＧＷＫＩＳＩＲＧＮＲＩＩＷＴＬＩＤＩＮＧＫＴＫＳＶＦＦＥＹＮＩＲＥＤＩＳＥＹＩＮＲＷＦＦＶＴＩＴＮＮＬＮＮＡＫＩＹＩＮＧＫＬＥＳＮＴＤＩＫＤＩＲＥＶＩＡＮＧＥＩＩＦＫＬＤＧＤＩＤＲＴＱＦＩＷＭＫＹＦＳＩＦＮＴＥＬＳＱＳＮＩＥＥＲＹＫＩＱＳＹＳＥＹ
配列番号１３は、ＢｏＮＴ／Ｃの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／Ｃ（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｒ４Ｕ）。
ＳＫＩＬＳＬＱＮＲＫＮＴＬＶＤＴＳＧＹＮＡＥＶＳＥＥＧＤＶＱＬＮＰＩＦＰＦＤＦＫＬＧＳＳＧＥＤＲＧＫＶＩＶＴＱＮＥＮＩＶＹＮＳＭＹＥＳＦＳＩＳＦＷＩＲＩＮＫＷＶＳＮＬＰＧＹＴＩＩＤＳＶＫＮＮＳＧＷＳＩＧＩＩＳＮＦＬＶＦＴＬＫＱＮＥＤＳＥＱＳＩＮＦＳＹＤＩＳＮＮＡＰＧＹＮＫＷＦＦＶＴＶＴＮＮＭＭＧＮＭＫＩＹＩＮＧＫＬＩＤＴＩＫＶＫＥＬＴＧＩＮＦＳＫＴＩＴＦＥＩＮＫＩＰＤＴＧＬＩＴＳＤＳＤＮＩＮＭＷＩＲＤＦＹＩＦＡＫＥＬＤＧＫＤＩＮＩＬＦＮＳＬＱＹＴＮ
配列番号１４は、ＢｏＮＴ／Ｄの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／Ｄ（ＰＤＢ ＩＤ：３Ｎ７Ｊ）。
ＳＫＩＬＳＬＱＮＫＫＮＡＬＶＤＴＳＧＹＮＡＥＶＲＶＧＤＮＶＱＬＮＴＩＹＴＮＤＦＫＬＳＳＳＧＤＫＩＩＶＮＬＮＮＮＩＬＹＳＡＩＹＥＮＳＳＶＳＦＷＩＫＩＳＫＤＬＴＮＳＨＮＥＹＴＩＩＮＳＩＥＱＮＳＧＷＫＬＣＩＲＮＧＮＩＥＷＩＬＱＤＶＮＲＫＹＫＳＬＩＦＤＹＳＥＳＬＳＨＴＧＹＴＮＫＷＦＦＶＴＩＴＮＮＩＭＧＹＭＫＬＹＩＮＧＥＬＫＱＳＱＫＩＥＤＬＤＥＶＫＬＤＫＴＩＶＦＧＩＤＥＮＩＤＥＮＱＭＬＷＩＲＤＦＮＩＦＳＫＥＬＳＮＥＤＩＮＩＶＹＥＧＱＩＬ
配列番号１５は、ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／ＤＣ（ＰＤＢ ＩＤ：４ＩＳＱ）。
ＳＫＩＬＳＬＱＮＫＫＮＴＬＭＤＴＳＧＹＮＡＥＶＲＶＥＧＮＶＱＬＮＰＩＦＰＦＤＦＫＬＧＳＳＧＤＤＲＧＫＶＩＶＴＱＮＥＮＩＶＹＮＡＭＹＥＳＦＳＩＳＦＷＩＲＩＮＫＷＶＳＮＬＰＧＹＴＩＩＤＳＶＫＮＮＳＧＷＳＩＧＩＩＳＮＦＬＶＦＴＬＫＱＮＥＮＳＥＱＤＩＮＦＳＹＤＩＳＫＮＡＡＧＹＮＫＷＦＦＶＴＩＴＴＮＭＭＧＮＭＭＩＹＩＮＧＫＬＩＤＴＩＫＶＫＥＬＴＧＩＮＦＳＫＴＩＴＦＱＭＮＫＩＰＮＴＧＬＩＴＳＤＳＤＮＩＮＭＷＩＲＤＦＹＩＦＡＫＥＬＤＤＫＤＩＮＩＬＦＮＳＬＱＹＴＮ
配列番号１６は、ＢｏＮＴ／Ｅの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／Ｅ（ＰＤＢ：４ＺＫＴ）。
ＳＳＶＬＮＭＲＹＫＮＤＫＹＶＤＴＳＧＹＤＳＮＩＮＩＮＧＤＶＹＫＹＰＴＮＫＮＱＦＧＩＹＮＤＫＬＳＥＶＮＩＳＱＮＤＹＩＩＹＤＮＫＹＫＮＦＳＩＳＦＷＶＲＩＰＮＹＤＮＫＩＶＮＶＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＲＤＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＨＮＥＩＩＷＴＬＱＤＮＡＧＩＮＱＫＬＡＦＮＹＧＮＡＮＧＩＳＤＹＩＮＫＷＩＦＶＴＩＴＮＤＲＬＧＤＳＫＬＹＩＮＧＮＬＩＤＱＫＳＩＬＮＬＧＮＩＨＶＳＤＮＩＬＦＫＩＶＮＣＳＹＴＲＹＩＧＩＲＹＦＮＶＦＤＫＥＬＤＥＴＥＩＱＴＬＹＳＮＥＰＮＴＮ
配列番号１７は、ＢｏＮＴ／Ｆの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／Ｆ（ＰＤＢ ＩＤ：３ＲＳＪ）。
ＮＳＩＬＤＭＲＹＥＮＮＫＦＩＤＩＳＧＹＧＳＮＩＳＩＮＧＤＶＹＩＹＳＴＮＲＮＱＦＧＩＹＳＳＫＰＳＥＶＮＩＡＱＮＮＤＩＩＹＮＧＲＹＱＮＦＳＩＳＦＷＶＲＩＰＫＹＦＮＫＶＮＬＮＮＥＹＴＩＩＤＣＩＲＮＮＮＳＧＷＫＩＳＬＮＹＮＫＩＩＷＴＬＱＤＴＡＧＮＮＱＫＬＶＦＮＹＴＱＭＩＳＩＳＤＹＩＮＫＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＧＮＳＲＩＹＩＮＧＮＬＩＤＥＫＳＩＳＮＬＧＤＩＨＶＳＤＮＩＬＦＫＩＶＧＣＮＤＴＲＹＶＧＩＲＹＦＫＶＦＤＴＥＬＧＫＴＥＩＥＴＬＹＳＤＥＰＤ
配列番号１８は、ＢｏＮＴ／Ｇの結合ドメインのＮ末端領域由来のアミノ酸配列である、ＨCN／Ｇ（ＰＤＢ ＩＤ：２ＶＸＲ）。
ＮＡＩＬＳＬＳＹＲＧＧＲＬＩＤＳＳＧＹＧＡＴＭＮＶＧＳＤＶＩＦＮＤＩＧＮＧＱＦＫＬＮＮＳＥＮＳＮＩＴＡＨＱＳＫＦＶＶＹＤＳＭＦＤＮＦＳＩＮＦＷＶＲＴＰＫＹＮＮＮＤＩＱＴＹＬＱＮＥＹＴＩＩＳＣＩＫＮＤＳＧＷＫＶＳＩＫＧＮＲＩＩＷＴＬＩＤＶＮＡＫＳＫＳＩＦＦＥＹＳＩＫＤＮＩＳＤＹＩＮＫＷＦＳＩＴＩＴＮＤＲＬＧＮＡＮＩＹＩＮＧＳＬＫＫＳＥＫＩＬＮＬＤＲＩＮＳＳＮＤＩＤＦＫＬＩＮＣＴＤＴＴＫＦＶＷＩＫＤＦＮＩＦＧＲＥＬＮＡＴＥＶＳＳＬＹＷＩＱＳＳＴＮＴ
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図／表および下の記載に記されている。本開示の他の特性、目的および有利点は、図／表および詳細な記載から、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
配列番号１９のアミノ酸配列を有する本開示の態様により提供される例示的ポリペプチド１μＭを用いた１、２または３日間の処置後の正常ヒト初代線維芽細胞における表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフであり、倍数変化は、未処置対照細胞に対して表されている。 配列番号１９の例示的ポリペプチド１０ｎＭ（塗りつぶしバー）、１００ｎＭ（空白バー）または１μＭ（斜線バー）を用いた２４時間処置後の正常ヒト初代線維芽細胞における表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフであり、倍数変化は、未処置対照細胞に対して表されている。 配列番号１９の例示的ポリペプチド１μＭ（塗りつぶしバー）または配列番号２１のアミノ酸配列を有する本開示の態様により提供される別の例示的ポリペプチド１μＭ（空白バー）を用いた処置後の正常ヒト初代線維芽細胞における表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフである。 フィブロネクチンに対する抗体を用いてフィブロネクチンについて免疫染色し、通常の増殖培地中またはステップダウン培地（２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む培地）のいずれかにおいて配列番号１９の例示的ポリペプチドの存在下（図４Ａ）または非存在下で（図４Ｂ）４８時間培養した線維芽細胞の画像である。 配列番号２０のアミノ酸配列を有する本開示の態様により提供される別の例示的ポリペプチド１００ｎＭもしくは１μＭを用いてまたは配列番号２１の例示的ポリペプチド１μＭを用いて１日処置した正常ヒト初代線維芽細胞における遺伝子発現変化を示す図である。 オレイン酸（ＯＡ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）、アセチルコリン（ＡＣｈ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）またはロシグリタゾンを含むさまざまな脂質生成刺激を用いた脂腺細胞（ＳＥＢ−１）の１日の処置での脂腺細胞脂質生合成における増加を示すグラフである。*は、対照と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 オレイン酸（ＯＡ）を用いた脂腺細胞（ＳＺ９５）の処置での脂腺細胞脂質生合成における増加および、２０ｐＭの配列番号１９の例示的ポリペプチドとの同時処置での脂腺細胞脂質生合成における低減を示すグラフである。*は、対照と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。＃は、ＯＡのみを用いた処置と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 ２０ｐＭの配列番号１９の例示的ポリペプチドのまたはオレイン酸（ＯＡ）を用いた脂腺細胞（ＳＥＢ−１）の処置での脂腺細胞脂質生合成における増加および、配列番号１９の例示的ポリペプチドとの同時処置でのＯＡ誘導脂腺細胞脂質生合成における低減を示すグラフである。*は、対照と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。＃は、ＯＡのみを用いた処置と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。 オレイン酸（ＯＡ）または２ｐＭ、２０ｐＭおよび２００ｐＭの配列番号１９の例示的ポリペプチドを用いた脂腺細胞（ＳＥＢ−１）の処置での脂腺細胞脂質生合成における増加ならびに、２ｐＭ、２０ｐＭおよび２００ｐＭの配列番号１９の例示的ポリペプチドとの同時処置でのＯＡ誘導脂腺細胞脂質生合成における低減を示すグラフである。*は、対照と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。＃は、ＯＡのみを用いた処置と比較したｐ＜０．０５の統計的有意性を示す。
種々の態様は、本明細書以下にさらに十分に記載される。しかし、そのような態様は、多数の異なる形態に具体化される場合があり、本明細書に記載される実施形態に限定されるとして解釈されるべきではなく、むしろこれらの実施形態は、本開示が詳細で完全になるように提供される。
定義
本開示において値の範囲が示される場合、範囲の上限と下限との間にある各値、および述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または間にある値が本開示内に包含されることは、意図される。例えば、１μＭ〜８μＭの範囲が述べられる場合、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭおよび７μＭならびに、１μＭ以上の値の範囲かつ８μＭ以下の値の範囲も明確に開示される。
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明白にそうでないと示す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって、例えば、「アミノ酸」を参照することは、単一のアミノ酸および２つ以上の同じまたは異なるアミノ酸を含む。
語「約」は、開示の内容がそうでないと示す、またはそのような解釈と矛盾しない限り、その値のプラスまたはマイナス１０％の範囲を意味する。例えば、「約５０」は４５〜５５を意味し、「約２５，０００」は２２，５００〜２７，５００を意味するなどである。例えば、「約４９、約５０、約５５などの数値の表において「約５０」は、先行する値と続く値との間隔の半分未満にわたる範囲を意味する。例えば、４９．５超、５２．５未満といった具合である。
「投与」または「に投与する」は、対象に医薬組成物を与える（すなわち、投与する）ステップ、または代替的に対象が医薬組成物を受けることを意味する。本明細書で開示される医薬組成物は、種々の方法によって局所的に投与され得る。例えば、筋肉内、皮内、皮下投与、くも膜下腔内投与、腹腔内投与、局所（経皮）、滴下注入およびインプラント（例えば、ポリマー性インプラントまたはミニ浸透圧ポンプなどの徐放デバイス）は、すべて投与の好適な経路になり得る。
「軽減する」は、状態または障害の疼痛、頭痛または任意の症状または原因の発症における低減を意味する。したがって、軽減することは、いくらかの低減、顕著な低減、ほぼ完全な低減および完全な低減を含む。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するまたは合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体、立体異性体およびアミノ酸模倣物を意味する。この定義に含まれるものは：（１）ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）（２）イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）（３）ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）（４）リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）（５）メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）（６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）（７）スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）（８）トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）（９）バリン（Ｖａｌ；Ｖ）（１０）アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）（１１）システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）（１２）グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）（１３）グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）（１４）プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）（１５）セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）（１６）チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）（１７）アラニン（Ａｌａ；Ａ）（１８）アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）（１９）アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）（２０）グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）（２１）セレノシステイン（Ｓｅｃ；Ｕ）などの天然アミノ酸：（ａ）シトルリン（Ｃｉｔ）；（ｂ）シスチン；（ｃ）ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）；（ｄ）オルニチン（Ｏｒｎ）；（ｆ）テアニン；（ｇ）ホモシステイン（Ｈｅｙ）；（ｈ）チロキシン（Ｔｈｘ）を含む非天然アミノ酸；およびベタイン；カルニチン；カルノシンクレアチン；ヒドロキシトリプトファン；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）；Ｎ−アセチルシステイン；Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ−ｅ）；タウリン；チラミンなどのアミノ酸誘導体である。
「アミノ酸残基」は、ポリペプチドに組み入れられている個々のアミノ酸単位を意味する。
「動物性タンパク質不含有」は、血液由来、プールされた血液および他の動物由来産生物または化合物の非存在を意味する。「動物」は、哺乳動物（ヒトなど）、トリ、は虫類、魚、昆虫、クモまたは他の動物種を意味する。「動物」は、細菌などの微生物を除外する。それにより、動物性タンパク質不含有医薬組成物は、ボツリヌス神経毒を含み得る。例えば、「動物性タンパク質不含有」医薬組成物は、血清由来アルブミン、ゼラチンおよび免疫グロブリンなどの他の動物由来タンパク質を実質的に不含有または本質的に不含有または完全に不含有である医薬組成物を意味する。動物性タンパク質不含有医薬組成物の例は、ボツリヌス毒素（活性成分として）および安定剤または賦形剤として好適な多糖類を含むまたはそれからなる医薬組成物である。
本明細書において使用される毒素の「結合ドメイン」は、野生型結合ドメイン、その変種および／または断片を包含する。
「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス菌によって産生された神経毒、および非クロストリジウム種によって組換え的に作製されたボツリヌス毒素（またはその軽鎖もしくは重鎖）を意味する。本明細書において使用される句「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＸならびにそれらのサブタイプ、ＢｏＮＴ／ＤＣおよびＢｏＮＴ／ＣＤなどのモザイク毒素、ならびにそれらのサブタイプの任意の他の型または、前述のいずれかの各場合での任意の再操作されたタンパク質、類似体、誘導体、ホモログ、一部分、サブパート、変種もしくはバージョンを包含する。本明細書において使用される「ボツリヌス毒素」は、「改変ボツリヌス毒素」も包含する。さらに本明細書において使用される「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素複合体、（例えば３００、６００および９００ｋＤａ複合体）、および複合体タンパク質と会合していないボツリヌス毒素（１５０ｋＤａ）の神経毒性構成成分も包含する。
「クロストリジウム毒素」は、それによりクロストリジウム毒素が細胞を中毒にし、低親和性または高親和性クロストリジウム毒素受容体へのクロストリジウム毒素の結合、毒素／受容体複合体の内部移行、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質への移行およびクロストリジウム毒素基質の酵素的改変を包含する細胞機構全体を実行できる、クロストリジウム毒素株によって産生される任意の毒素を指す。クロストリジウム毒素の非限定的例として、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ1、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＣＤ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ（ａｋａ型ＦＡまたはＨＡ）、ＢｏＮＴ／Ｘ、ＢｏＮＴ／Ｊなどのボツリヌス毒素、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）、バラチ毒素（Baratii toxin）（ＢａＮＴ）およびブチリクム毒素（ＢｕＮＴ）が挙げられる。神経毒ではないＢｏＮＴ／Ｃ2細胞毒およびＢｏＮＴ／Ｃ3細胞毒は、用語「クロストリジウム毒素」から除外される。用語クロストリジウム毒素は、およそ１５０ｋＤａのクロストリジウム毒素単独（すなわちＮＡＰを含まない）も含む。クロストリジウム毒素は、例えば、クロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプなどの天然に存在するクロストリジウム毒素変種；例えば、保存的クロストリジウム毒素変種、非保存的クロストリジウム毒素変種、クロストリジウム毒素キメラ変種およびその活性クロストリジウム毒素断片などの天然に存在しないクロストリジウム毒素変種、またはこれらの任意の組合せを含む。クロストリジウム毒素は、例えば、ボツリヌス毒素複合体、破傷風毒素複合体、バラチ毒素複合体およびブチリクム毒素複合体などの、クロストリジウム毒素および非毒素関連タンパク質（ＮＡＰ）を含む複合体を指す、クロストリジウム毒素複合体も含む。クロストリジウム毒素複合体の非限定的例として、例えば、９００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ複合体、５００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ複合体、３００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ａ複合体、５００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ｂ複合体、５００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ｃ1複合体、５００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ｄ複合体、３００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ｄ複合体、３００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ｅ複合体および３００ｋＤａ ＢｏＮＴ／Ｆ複合体などのボツリヌス菌によって産生されるものが挙げられる。
「細胞表現型」は、遺伝子発現、タンパク質発現、因子の合成ならびに／またはタンパク質ならびに、細胞および／もしくは、細胞外マトリックス構造および皮脂を含む細胞がその一部である組織の構造および／もしくは機能に影響を与える因子の、分泌における任意の変化を指す。
生物活性成分に適用される場合「有効量」は、対象に所望の効果を与えるために一般に十分である成分の量を意味する。例えば、所望の効果が皮脂の低減である場合、成分の有効量は、顕著な毒性を生じることなく皮脂の少なくとも実質的な低減を生じる量である。
クロストリジウム毒素組成物に加えられる賦形剤または賦形剤の特定の組合せの量を参照して使用される場合「有効量」は、クロストリジウム毒素活性成分の所望の初期回復効力（initial recovered potency）を達成するために必要である各賦形剤の量を指す。本実施形態の態様では、賦形剤または賦形剤の組合せの有効量は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の初期回復効力をもたらす。本実施形態の他の態様では、クロストリジウム毒素活性成分の治療有効濃度は、処置される栄養（aliment）に関連する症状を、例えば、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％または最大１００％低減する。
「重鎖」は、ボツリヌス神経毒の重鎖を意味する。それは、約１００ｋＤａの分子量を有し、Ｈ鎖またはＨと称され得る。
ＨCは、Ｈ鎖のカルボキシル末端セグメントにほぼ相当するボツリヌス神経毒のＨ鎖由来の断片（約５０ｋＤａ）またはインタクトなＨ鎖中のその断片に対応する部分を意味する。運動ニューロンへの高親和性シナプス前結合に関与する天然または野生型ボツリヌス神経毒の部分を含有すると考えられている。
ＨNは、Ｈ鎖のアミノ末端セグメントにほぼ相当するボツリヌス神経毒のＨ鎖由来の断片（約５０ｋＤａ）またはＨ鎖中のインタクトなその断片に対応する部分を意味する。細胞内エンドソーム膜を越えるＬ鎖の移行に関与する天然または野生型ボツリヌス神経毒の部分を含有すると考えられている。
「ホモログ」は、同じ生物学的機能を実施するタンパク質の群中のタンパク質、例えば、同じクロストリジウム毒素ファミリーに属し、共通の活性、例えば受容体結合活性をもたらすタンパク質を意味する。ホモログは、相同遺伝子によって一般に発現される。
「単離された」は、それが天然に存在する野生もしくは天然配列から分離されている、または配列が天然に存在するところとは異なる環境にある核酸配列またはポリペプチド配列を意味する。
「軽鎖」は、クロストリジウム神経毒の軽鎖を意味する。それは、約５０ｋＤａの分子量を有し、ボツリヌス神経毒のＬ鎖、Ｌまたはタンパク質分解性ドメイン（アミノ酸配列）と称され得る。
ＬＨNまたはＬ−ＨNは、Ｌ鎖またはＨNドメインにカップルしたその機能性断片を含有するクロストリジウム神経毒由来の断片を意味する。それは、ＨCドメインを除去するまたは改変するためのタンパク質分解によってインタクトなクロストリジウム神経毒から得ることができる。
「インプラント」は、放出制御（例えば、パルス性または連続的）組成物または薬物送達系を意味する。インプラントは、例えばヒトの身体に注射、挿入またはインプラントされ得る。
「局所的投与」は、動物の身体上または内の医薬の生物学的効果が望ましい部位にまたは部位の近傍への、例えば、筋肉内もしくは皮内もしくは皮下注射または局所投与などを介する医薬の直接投与を意味する。局所的投与は、静脈内または経口投与などの全身性の投与経路を除外する。局所投与は、患者の皮膚に適用される医薬用剤の局所的投与の種類である。
「改変ボツリヌス毒素」は、天然ボツリヌス毒素と比較してそのアミノ酸の少なくとも１つが欠失された、改変されたまたは置き換えられたボツリヌス毒素を意味する。加えて、改変ボツリヌス毒素は、組換え的に産生された神経毒または、組換え的に作製された神経毒の誘導体もしくは断片であり得る。改変ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素受容体に結合する能力、またはニューロンからの神経伝達物質放出を阻害する能力などの天然ボツリヌス毒素の少なくとも１つの生物学的活性を保持している。改変ボツリヌス毒素の一例は、あるボツリヌス毒素血清型（血清型Ａなど）由来の軽鎖および異なるボツリヌス毒素血清型（血清型Ｂなど）由来の重鎖を有するボツリヌス毒素である。改変ボツリヌス毒素の別の例は、Ｐ物質などの神経伝達物質にカップルされたボツリヌス毒素である。
「変異」は、天然に存在するタンパク質または核酸配列の構造的改変を意味する。例えば、核酸変異の場合、変異は、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、付加または置換であってよい。タンパク質配列変異の場合、変異は、タンパク質配列中の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加または置換であってよい。例えば、特定のアミノ酸を含むタンパク質配列は、別のアミノ酸に、例えば、アミノ酸アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたは任意の他の天然のもしくは天然に存在しないアミノ酸または化学的に修飾されたアミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸に置換されてよい。タンパク質配列への変異は、転写され、生じたｍＲＮＡが翻訳された場合に、変異したタンパク質配列を産生するＤＮＡ配列への変異の結果であってよい。タンパク質配列への変異は、所望の変異を含有するペプチド配列を所望のタンパク質配列に融合することによっても創出され得る。
「患者」は、医学的または獣医学的ケアを受けるヒトまたは非ヒト対象を意味する。したがって、本明細書に開示される組成物は、任意の動物、例えば哺乳動物などを処置することに使用され得る。
「ペプチド」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖で作られた任意のポリマーを、そのサイズに関わらず指す。「タンパク質」は、比較的大きいポリペプチドを参照してしばしば使用され、「ペプチド」は、小さいポリペプチドを参照してしばしば使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複しており、変動する。それにより、簡潔さのために、当技術分野における一部の場合では同じポリマーを「タンパク質」として指す可能性がある場合でも本明細書において用語「ポリペプチド」が使用される。他に示さない限り、ポリペプチドについての配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順で示される。
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、アミノ配列またはヌクレオチド配列が所与の比較ウインドウにわたって参照配列と少なくとも８５％配列同一性を有する場合に、参照配列に「実質的に同一」、「実質的に同じ」または「実質的に類似」している。したがって、実質的な類似配列は、例えば、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するものを含む。互いに同一である２つの配列も実質的に類似している。比較ウインドウまたは比較配列の長さは、一般に少なくともボツリヌス毒素の結合ドメインまたはボツリヌス毒素断片、例えば、ボツリヌス毒素の結合ドメインの約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５個の近接アミノ酸を含む断片の結合ドメインの長さである。配列同一性は、参照配列に基づいて算出され、配列分析のためのアルゴリズムは、当技術分野において周知である。したがって、２つのアミノ酸配列の配列同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的（例えば、一方のポリペプチドの配列にギャップが、他方のポリペプチドとの最適なアライメントのために導入されてよい）のためにアラインされる。対応する酸位置のアミノ酸残基が比較される。一方の配列中の位置が、他方の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の配列同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、配列同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数ｘ１００）。２つのポリペプチド配列間の配列同一性パーセントは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアパッケージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定され得る。ギャップ開始ペナルティ１０およびギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）０．１は、２つのポリペプチドの同一性パーセントを決定するために使用され得る。すべての他のパラメーターは、初期設定で設定されてよい。配列相同を決定するための別のソフトウェアツールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）からのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）である。例えば、ＢＬＡＳＴは、タンパク質配列を比較でき、同一または類似のアミノ酸残基の百分率、相同、ギャップなどを算出できる。
「末梢に投与する」または「末梢投与」は、真皮下、皮内、経皮または皮下投与を意味するが、筋肉内投与を除外する。「末梢」は、真皮下位置を意味し、内臓部を除外する。
「医薬組成物」は、例えば、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素活性成分などの活性医薬的成分、および例えば安定剤または賦形剤などの少なくとも１つの追加的成分を含む組成物を意味する。したがって医薬組成物は、ヒト患者などの対象の診断または治療投与に好適である製剤である。医薬組成物は、例えば、凍結乾燥または真空乾燥状態、凍結乾燥または真空乾燥医薬組成物の復元後に形成された溶液、または復元を必要としない溶液もしくは個体であってよい。
「薬理学的に許容される賦形剤」は、「薬理学的賦形剤」または「賦形剤」と同義であり、哺乳動物に投与された場合に長期または持続性の有害作用を実質的に有さない任意の賦形剤を指し、例えば安定化剤、バルク剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤（lyo-protectant）、添加剤、ビヒクル、担体、希釈剤または補助剤などの化合物を包含する。賦形剤は、一般に活性成分と混合される、または活性成分を希釈または封入することができ、固体、半固体または液体剤であってよい。クロストリジウム毒素活性成分を含む医薬組成物が、薬学的に許容される組成物への活性成分の処理を促進する１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含み得ることも想定される。任意の薬理学的に許容される賦形剤は、クロストリジウム毒素活性成分と不適合でない限りにおいて、薬学的に許容される組成物におけるその使用は、検討される。薬理学的に許容される賦形剤の非限定的例は、例えば、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001);およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)に見出すことができ、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
医薬組成物の構成成分は、単一の組成物に（すなわち、任意の必要とされる復元用液を除いて、すべての構成成分が医薬組成物の最初の複合時に存在する）または２構成成分系として、例えば、医薬組成物の最初の複合時に存在しない成分を例えば含有し得る復元ビヒクルを用いて復元される真空乾燥組成物に、含まれてよい。２構成成分系は、２構成成分系の第１の構成成分との長期保存のために十分に適合性でない成分の組み込みを可能にするものを含む、数個の利益を提供できる。例えば、復元ビヒクルは、使用期間、例えば１週間の冷蔵保存のために微生物増殖に対する十分な防御を提供するが、毒素を分解する可能性がある２年間の冷凍庫保存期間の際には存在しない保存剤を含み得る。長期間についてボツリヌス毒素または他の成分と適合性でない可能性がある他の成分は、この様式で組み込まれてよい；すなわち、第２のビヒクルに（例えば復元ビヒクルに）使用の際に加えられる。医薬組成物は、ベンジルアルコール、安息香酸、フェノール、パラベンおよびソルビン酸などの保存剤も含んでよい。医薬組成物は、例えば、表面活性剤などの賦形剤；分散薬剤；不活性希釈剤；顆粒化および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；保存剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；注入剤；抗酸化物質；安定化剤；および薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料および当技術分野において周知ならびに、例えば、参照により本明細書に組み込まれるGenaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.に記載される他の成分を含み得る。
「多糖類」は、２個を超える糖類分子モノマーのポリマーを意味する。モノマーは、同一または異なっていてよい。
「安定化剤」、「安定化剤（stabilization agent）」または「安定剤」は、医薬組成物の効力が安定化されていない組成物と比較して増加するように、クロストリジウム毒素活性成分を安定化するように作用する物質を意味する。
「安定剤」は、賦形剤を含んでよく、タンパク質および非タンパク質分子を含んでよい。
「界面活性剤」は、天然または合成両親媒性化合物を指す。界面活性剤は、非イオン性、双性イオン性またはイオン性であってよい。界面活性剤の非限定的例として、ポロクサマー、ポリソルベートおよびこれらの組合せが挙げられる。
「治療用製剤」は、例えば、皮脂腺の機能亢進（すなわち脂漏症）によって特徴付けられる障害または疾患などの障害または疾患を処置し、それにより軽減するために使用され得る製剤を意味する。
「治療有効濃度」、「治療有効量」、「有効量」、「有効用量」および「治療有効用量」は、所望の治療効果を達成するために必要なクロストリジウム毒素活性成分の最小用量を指し、処置される栄養（aliment）に関連する症状を低減するために十分な用量を含む。
「局所投与」は、神経毒の全身性投与を除外する。言い換えると、従来の治療用経皮法とは異なり、ボツリヌス毒素の局所投与は、神経毒の大部分などの顕著な量の患者の循環系への移行を生じない。
「処置する」は、一過的または持続性のいずれかで、例えば、しわ、緩み、乾燥、斑点、むら、赤み、大きな毛穴、脂性などの状態または障害の少なくとも１つの症状を軽減すること（または除去すること）を意味する。
本明細書において使用される「変種」は、その配列が少なくとも１つの改変またはアミノ酸（もしくは核酸）置換によって親配列のものと異なっている生体分子（例えば、ポリペプチドまたは核酸）を指す。したがって、変種ポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも１つの改変または置換を含む。変種ポリペプチドに行われる改変の種類として、１つまたは複数のアミノ酸残基の例えば付加、欠失、置換、転位が挙げられる。
ポリペプチドおよびポリペプチドを含む組成物
上述のとおり、一態様では、クロストリジウム毒素の結合ドメインにおけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。一実施形態では、クロストリジウム毒素はボツリヌス毒素である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、毒性を欠いているボツリヌス毒素の全長のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、毒性を欠いているボツリヌス毒素の全長のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖におけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖のカルボキシルまたはＣ末端セグメント（ＨC）におけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）におけるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのＮ末端側半分と同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ボツリヌス毒素はＢｏＮＴ／Ａである。別の実施形態では、ボツリヌス毒素はモザイク毒素である。一実施形態では、ボツリヌス毒素はＢｏＮＴ／ＤＣである。代替的実施形態では、ボツリヌス毒素はＢｏＮＴ／Ａではない。
別の態様では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドの分子量は、約１ｋＤａ〜約９０ｋＤの間、または約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤの間、または約２２ｋＤａ〜約５０ｋＤの間である。
ボツリヌス毒素血清型およびサブタイプのアミノ酸配列は、周知であり、表１は、移行、エンドペプチダーゼおよび結合ドメインについてのおよその境界領域、およびそれらの例示的ＧＥＮＢＡＮＫ／ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号を示している。ＢｏＮＴ毒素の代表的な血清型、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型は、関連するメンバーを含めて米国特許第７，８９２，５６５号および第８，４８６，４２２号に開示されている。潜在的可能性がある８番目の型（「Ｈ型」）は、Dover et al., J Infect Dis., 209(2):192-202, 2014 (PMID: 24106295)に記載されている。近年の報告は、この新規神経毒をＢｏＮＴ／Ｈ、ＢｏＮＴ／ＦＡまたはＢｏＮＴ／ＨＡとして様々に記載している。Maslanka et al., J Infect Dis., 213(3): 379-385, 2016; Peck et al., Toxins (Review), 9(1): 38, 2017を参照されたい。モザイクボツリヌス毒素も、ＢｏＮＴ／ＤＣおよびＢｏＮＴ／ＣＤなどとして周知である。
一実施形態では、クロストリジウム毒素は、ＢｏＮＴ／Ａ由来である。代替的実施形態では、クロストリジウム毒素は、ＢｏＮＴ／Ａ由来ではなく、例えばクロストリジウム毒素は、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ1、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／ＣＤ、ＢｏＮＴ／ＦＡ、ＢｏＮＴ／ＨＡ、ＢｏＮＴ／Ｘ、ｅＢｏＮＴ／Ｊ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、ＢｕＮＴまたはこれらの組合せ由来のクロストリジウム毒素である。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素の種々のサブタイプ由来である。本明細書において使用される用語「サブタイプ」は、同一または類似のアミノ酸配列を有し、異なる遺伝子によって、または異なるエクソンが除去された同じ遺伝子からのＲＮＡ転写物によって、のいずれかでコードされている任意の２つ以上の機能的に類似するタンパク質を指す。「サブタイプ」は、成熟および未成熟配列を含むそのようなタンパク質をコードする配列のいずれかも指し得る。したがって「サブタイプ」は、どちらか一方だけを指すと述べられている、または文脈から他に理解されない限り、前述のクロストリジウム毒素の１つまたは複数をコードする遺伝子、および遺伝子のタンパク質産生物を含む。しばしばサブタイプと称される少なくとも４０個の固有のＢｏＮＴは、ＤＮＡ配列決定によって同定されており；一部は、ＢｏＮＴ機能に影響を有する（Rossetto et al., Nature Reviews Microbiol., 12, 535-49, 2014）。例えば、分子研究は、ＢｏＮＴ血清型ＣおよびＤの構造構成成分を含有する単一のＢｏＮＴの交差反応性血清学的観察の証拠を示した。Arndt et al. (J Mol Biol., 362(4):733-42, 2006)およびHill et al., (J Bacteriol., 189:818-32, 2007)を参照されたい。一部の場合では、ＢｏＮＴ／Ｆの配列は、特に変動性であることが見出され（Raphael et al., Appl Environ Microbiol., 76(14):4805-12, 2012）、ＶＡＭＰ−２などのシナプス小胞膜タンパク質の切断に関して機能的多様性をもたらしている（Kalb et al., Anal Chem., 86:3254-62, 2014）。
一実施形態では、クロストリジウム毒素は、種々のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ、例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ９、Ａ１０など；ＢｏＮＴ／Ｂサブタイプ、例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、ＢｎｐおよびＢｂｖなど；ＢｏＮＴ／Ｃサブタイプ、例えば、ＣおよびＣＤなど；ＢｏＮＴ／Ｄサブタイプ、例えば、ＤおよびＤＣなど；ＢｏＮＴ／Ｅサブタイプ、例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９など；ＢｏＮＴ／Ｆサブタイプ、例えばＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７など；ならびにＢｏＮＴ／Ｇサブタイプ、例えば、サブタイプＧなどの由来である。ＢｏＮＴサブタイプとしては、キメラＢｏＮＴ、例えば、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／ＣＤ、ＢｏＮＴ／ＦＡなどが挙げられる。Rossetto et al., Nature Reviews Microbiol., 12, 535-49, 2014; Montecucco et al., MBio 6:e02131-14, 2015；米国特許第８，８４１，１１１号および米国特許第８，６９７，４１３号を参照されたい。配列アライメントの分析は、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などのソフトウェアを介して実施され、個々のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ間の高度な配列同一性を明らかにしている。例えば、一実施形態では、全体に約７８．９％（例えば、アライメントソフトウェアに応じて７５％〜８０％の間）配列同一性があり、コンセンサス位置では約９９．３％（例えば、アライメントソフトウェアに応じて９５％〜９９．９％の間）のさらに大きい配列同一性がある。
一実施形態では、本開示は、クロストリジウム毒素のホモログに関する。用語「ホモログ」は、同じ生物学的機能を果たすタンパク質の群におけるタンパク質、例えば、同じクロストリジウム毒素ファミリーに属し、共通の活性を提供するタンパク質を意味する。ホモログは、一般に相同遺伝子によって発現される。相同遺伝子を参照して、ホモログは、オルソログ、例えば、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種において発現され、同じ機能を保持しているタンパク質をコードする遺伝子を含むが、パラログ、例えば、重複によって関連しているが異なる機能を有するタンパク質をコードするように進化した遺伝子を含まない。相同遺伝子は、天然に存在する対立遺伝子および人工的に創出された変種を含む。遺伝コードの縮重は、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基を用いて置換する可能性を提供する。最適にアラインされた場合、ホモログタンパク質は、対象タンパク質、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１または、ＨCドメイン、具体的にはＨCNドメイン、特にＨCNドメインのＮ末端側の半分を含むその断片と比較して、典型的には少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％またはこれより大きい％同一性または類似性を有する。本開示の別の態様では、ホモログタンパク質は、配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１、配列番号１２〜１８および配列番号２５〜２７のポリペプチドと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％またはこれより大きい％同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、相同性クロストリジウム毒素は、最大の配列相同性パーセントを達成するように配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後に、参照タンパク質配列と比較したタンパク質配列内の同一または類似のいずれかの残基（コンセンサス）を参照配列の長さで割ったパーセントとして定義される、相同性パーセントに基づいて分類される。コンセンサス置換は、類似のアミノ酸を用いて置換されたアミノ酸を許容する置換である。アミノ酸は、例えば、サイズ、形状、疎水性、親水性、電荷、等電点、極性、芳香性などのいくつかの特徴において類似している場合がある。アミノ酸配列相同性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当業者の通常の技術の範囲内である種々の方法において達成され得る。一部の場合では、アミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能であるコンピューターソフトウェアを使用してアラインされ得る。一実施形態では、相同性パーセントは、対でのアライメントを実施し、残基置換のマトリックスを使用して素スコアを提供する、ＮＣＢＩを介して利用可能であるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用して算出される。本明細書において、ＢＬＡＳＴによって算出されたビットスコアは、配列長およびギャップサイズを考慮して標準化されたスコアである。バイオインフォマティクスにおいて理解されているとおり、２８３ビットのスコアは、提示されているものよりも良いアライメントを見出すために、検索が２283（または２ｘ１０85）単位（例えば、アミノ酸または核酸）のスペースを包含する必要があることを意味する。したがって、ビットスコアが高いほど、高度に有意のマッチである。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定できる。次いで、配列相同性は、より長い配列と比較して算出される、すなわち、短い配列が長い配列の一部と１００％配列同一性を示しても、全体の配列同一性は１００％未満である。
代替的実施形態の下では、変種クロストリジウム毒素は、前述のクロストリジウム毒素の１つまたは複数と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超える程度の同一性を共有する配列を含み得る。例えば、一実施形態では、変種クロストリジウム毒素は、ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０ＤＰＩ１（例えば、Ａ型）；Ｐ１０８４４（例えば、Ｂ型）；Ｐ１８６４０（例えば、Ｃ1型）；Ｐ１９３２１（例えば、Ｄ型）；Ｑ００４９６（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＣＡＡ４４５５８）（例えば、Ｅ型）；Ｐ３０９９６（例えば、Ｆ型）；Ｑ６０３９３（例えば、Ｇ型）；Ｈ型についてＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ：ＫＧＯ１５６１７（ＵＮＩＰＡＲＣ ＩＤ：０００５２Ｃ１５２９）；Ｘ型についてＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ：ＢＡＱ１２７９０（ＵＮＩＰＡＲＣ ＩＤ：０００５８２２７９６）；ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０４９５８（例えば、ＴｅＮＴ）；Ｑ４５８５１（例えば、ＢａＮＴ）；またはＰ３０９９５（例えば、ＢｕＮＴ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超える、例えば約９９．９％の配列同一性を含み得る。
別の実施形態では、変種クロストリジウム毒素は、（ａ）ＢｏＮＴ／Ａ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦ４８８７４９（核酸）およびＡＡＱ０６３３１（タンパク質）；（ｂ）ＢｏＮＴ／Ｂ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＢ２３２９２７（核酸）もしくはＢＡＥ４８２６４（タンパク質）；（ｃ）ＢｏＮＴ／Ｃ１由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＣＡＡ４７０６０（核酸）；ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ１８６４０（タンパク質）；（ｄ）ＢｏＮＴ／Ｄ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号Ｘ５４２５４（核酸）；ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ１９３２１（タンパク質）；（ｅ）ＢｏＮＴ／ＤＣ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＥＦ３７８９４７（核酸）；ＡＢＰ４８７４７（タンパク質）；（ｆ）ＢｏＮＴ／Ｅ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＪＸ４２４５３９（核酸）；ＡＦＶ９１３４４（タンパク質）；（ｇ）ＢｏＮＴ／Ｆ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＡＢＳ４１２０２（タンパク質）；ＡＢＳ４１２０２をコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）；（ｈ）ＢｏＮＴ／Ｇ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号Ｘ７４１６２（核酸）；ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｑ６０３９３（タンパク質）；（ｉ）ＢｏＮＴ／Ｘ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ：ＢＡＱ１２７９０（タンパク質）；または（ｊ）ｅＢｏＮＴ／Ｊ由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＯＴＯ２２２４４；ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ａ０Ａ２４２ＤＩ２７（タンパク質）に記載の核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超える、例えば約９９．９％の配列同一性を含み得る。
さらに別の実施形態では、変種クロストリジウム毒素は、（１）ＢｏＮＴ／Ａ２ Ｃｈｉｂａ株由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＡＢ４４３５８０（核酸）；ＢＡＨ０３５５８（タンパク質）；（ｂ）Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号Ｘ７３４２３（核酸）；ＣＡＡ５１８２４（タンパク質））；（ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ株由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＤＱ１８５９００（核酸）；ＡＢＡ２９０１７（タンパク質）；（ｄ）ＢｏＮＴ／Ａ４ ６５７Ｂａ株由来の毒素について（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＥＵ３４１３０７（核酸）；ＡＢＹ５６３３８（タンパク質））；（ｅ）ＢｏＮＴ／Ａ５Ａ ６６１２２２株由来の毒素について（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＨＭ１５３７０５（核酸）；ＡＤＪ６８２３５（タンパク質）；（ｆ）ＢｏＮＴ／Ａ６ ＣＤＣ４１３７０株由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＦＪ９８１６９６（核酸）；ＡＣＷ８３６０２（タンパク質）；ＢｏＮＴ／Ａ７ ２００８−１４８株由来の毒素についてＧＥＮＢＡＮＫ番号ＪＱ９５４９６９（核酸）；ＡＦＶ１３８５４（タンパク質）に記載の核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれを超える、例えば約９９．９％の配列同一性を含み得る。
一部の実施形態では、変種クロストリジウム毒素は、変異体クロストリジウム毒素またはその断片を含む。典型的には、変異体クロストリジウム毒素は、コアクロストリジウム毒素ポリペプチド配列またはその断片、例えば、全長ＢｏＮＴ／Ａ配列または配列番号１のＨC断片中に少なくとも１、２、３、４、５またはそれ以上、例えば１０個に至る変異を含む。そのような変異体クロストリジウム毒素の代表的な例として、例えば、Ｗ１２６６ＬおよびＹ１２６７Ｓを含む第１のＢｏＮＴ／Ａ変異体もしくはその断片（例えば、配列番号１中にＷ３９１ＬおよびＹ３９２Ｓを含むＢｏＮＴ／Ａ変異体のＨC断片；配列番号２６に記載の変異体配列）、またはＴ１１４５ＡおよびＴ１１４６Ａを含む第２のＢｏＮＴ／Ａ変異体もしくはその断片（例えば、配列番号１中にＴ２７０ＡおよびＴ２７１Ａを含むＢｏＮＴ／Ａ変異体のＨC断片；配列番号２５に記載の変異体配列）、またはＧ１２９２Ｒを含む第３のＢｏＮＴ／Ａ変異体もしくはその断片（例えば、配列番号１中にＧ４１７Ｒを含むＢｏＮＴ／Ａ変異体のＨC断片；配列番号２７に記載の変異体配列）が挙げられる。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドまたはその断片は、弱められていないクロストリジウム毒素またはその断片と比較してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ活性をモジュレート、例えば低下し、それにより変異体ポリペプチドは、弱められていないクロストリジウム毒素またはその断片の薬理学的特性をモジュレートするために使用され得る。
非限定的に、グローバル法、ローカル法および例えばセグメントアプローチ法などのハイブリッド方法を含む、種々の配列アライメント法のいずれも同一性パーセントを決定するために使用され得る。同一性パーセントを決定するためのプロトコールは、当業者および本明細書の教示の範囲内の日常的手順である。
一実施形態では、変種クロストリジウム毒素は、変種クロストリジウム毒素の活性を保存するように選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。半保存的である残基は、電荷、極性および／またはサイズを保存する変化を許容できる。例えば、前述の受託されたＵＮＩＰＲＯＴおよび／またはＧＥＮＢＡＮＫ配列に記載されるアミノ酸配列を含む変種クロストリジウム毒素は、１つまたは複数の置換を有することができ、置換アミノ酸は、周知の２０アミノ酸のいずれか１つであってよく、変種クロストリジウム毒素は、その活性、例えば細胞結合活性または細胞シグナル伝達活性またはこれらの組合せ（実施例セクションを参照されたい）を維持する。好ましくは、アミノ酸は、保存的または半保存的様式で置換される。保存的アミノ酸置換の例示的な種類として、例えば、Ｉ、Ｖ、ＬもしくはＭの相互になど非極性（疎水性）残基の別の非極性（疎水性）残基での置換、ＮについてのＱ、ＳについてのＧもしくはその逆などの、ある極性（親水性）非荷電残基の別の極性非荷電残基での置換、あるいはＫ、ＲもしくはＨの相互にまたはＥについてのＤまたはその逆などの荷電残基の別の同様に荷電した残基での置換が挙げられる。一方、非保存的置換として、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｍなどの非極性（疎水性）残基のＣ、Ｑ、Ｄ、Ｋなどの極性（親水性）残基での置換および／またはその逆が挙げられる。一実施形態では、用語「保存的置換」は、次の「強い」群：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹおよび／またはＦＹＷの１つの中でのアミノ酸置換を示し；用語「半保存的置換」は、次の「弱い」群：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭおよび／またはＨＦＹの１つの中でのアミノ酸置換を示す。保存的または半保存的アミノ酸置換を行う方法は、当技術分野において周知である。例えば、Risler et al., J. Mol. Biol., 204:1019-1029, 1988; Niefind et al., J. Mol. Biol. 219:481-497, 1991およびOverington et al. Protein Science, 1:216-226, 1992などである。コアクロストリジウム毒素配列（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ配列）中の保存的および半保存的アミノ酸置換の例示的種類は、ＣＬＵＳＴＡＬ複数配列アライメントを介して観察可能であり、ここで、アスタリスク（*）は同一性を示し、セミコロン（：）は保存的置換を示し、ピリオド（．）は半保存的置換を示す。
本開示のクロストリジウム毒素変種は、天然に存在する変種または天然に存在しない変種であってよい。本明細書において使用される、用語「天然に存在するクロストリジウム毒素変種」は、いかなるヒトの操作の補助も用いずに産生される任意のクロストリジウム毒素を指し、非限定的に、別法でスプライスされた転写物から産生されるクロストリジウム毒素アイソフォーム、自然な変異によって産生されたクロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプを含む。本明細書において使用される、用語「天然に存在しないクロストリジウム毒素変種」は、ヒトの操作の補助を用いて産生される任意のクロストリジウム毒素を指し、非限定的に、無作為変異導入または合理的設計を使用する遺伝的操作によって産生されるクロストリジウム毒素および化学合成によって産生されたクロストリジウム毒素を含む。天然に存在しないクロストリジウム毒素変種の非限定的例として、例えば、保存的クロストリジウム毒素変種、非保存的クロストリジウム毒素変種および活性クロストリジウム毒素断片が挙げられる。非天然クロストリジウム毒素は、例えば、化学的成分、タグ、リガンドの付加などを介して翻訳後修飾された天然クロストリジウム毒素をさらに含む。
本明細書において使用される、用語「保存的クロストリジウム毒素変種」は、別のアミノ酸または、参照クロストリジウム毒素配列（例えば、表１を参照されたい）由来の元のアミノ酸のものと類似の少なくとも１つの特性を有するアミノ酸類似体による少なくとも１つのアミノ酸置換を有するクロストリジウム毒素を指す。そのような特性の例として、非限定的に、類似のサイズ、トポグラフィー、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能力、水素結合能力、物理化学的特性などまたは任意のこれらの組合せが挙げられる。保存的クロストリジウム毒素変種は、保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素と実質的に同じ様式で機能でき、本明細書の任意の態様において参照クロストリジウム毒素と置き換えられ得る。保存的クロストリジウム毒素変種は、保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素から１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００またはこれを超えるアミノ酸が置換されていてよい。保存的クロストリジウム毒素変種は、保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素から少なくとも５、１０、１５、２０または２５近接アミノ酸が置換されてもよい。保存的クロストリジウム毒素変種の非限定的例として、例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ1変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｈ変種、保存的ＢｏＮＴ／Ｘ変種、保存的ｅＢｏＮＴ／Ｊ変種、保存的ＴｅＮＴ変種、保存的ＢａＮＴ変種および保存的ＢｕＮＴ変種が挙げられる。
本明細書において使用される、用語「非保存的クロストリジウム毒素変種」は、（ａ）少なくとも１つのアミノ酸が、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素から欠失している；（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸が、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素に付加されている；または（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸が、参照クロストリジウム毒素配列由来の元のアミノ酸（例えば、表１を参照されたい）のものに類似のいかなる特性も共有していない別のアミノ酸またはアミノ酸類似体によって置換されている、クロストリジウム毒素を指す。非保存的クロストリジウム毒素変種は、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素と実質的に同じ様式で機能でき、本明細書の任意の態様において参照クロストリジウム毒素と置き換えられ得る。非保存的クロストリジウム毒素変種は、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素から１つまたは複数のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸を欠失し得る。非保存的クロストリジウム毒素変種は、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素に１つまたは複数のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸を付加し得る。非保存的クロストリジウム毒素変種は、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素から１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００もしくは５００またはそれを超えるアミノ酸を置換され得る。非保存的クロストリジウム毒素変種は、非保存的クロストリジウム毒素変種が基づく参照クロストリジウム毒素から少なくとも５、１０、１５、２０または２５近接アミノ酸も置換され得る。非保存的クロストリジウム毒素変種の非限定的例として、例えば、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ1変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｈ変種、非保存的ＢｏＮＴ／Ｘ変種、非保存的ｅＢｏＮＴ／Ｊ変種、非保存的ＴｅＮＴ変種、非保存的ＢａＮＴ変種および非保存的ＢｕＮＴ変種が挙げられる。種々のクロストリジウム毒素断片のいずれも、これらの活性断片が、それによりクロストリジウム毒素が結合パートナー、例えば、シナプス小胞糖タンパク質に結合する細胞機構全体を実行できるという条件で、本明細書の態様において有用であり得ることも想定される。したがって、本実施形態の態様は、例えば、少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、１１００または少なくとも１２００アミノ酸の長さを有するクロストリジウム毒素断片を含み得る。本実施形態の他の態様は、例えば、最大６００、７００、８００、９００、１０００、１１００または最大１２００アミノ酸の長さを有するクロストリジウム毒素断片を含み得る。
本開示の実施形態は、変種クロストリジウム毒素ポリペプチドにさらに関する。本明細書において使用される、用語「ポリペプチド」は、直鎖または分枝アミノ酸、ペプチド模倣薬およびそれらの薬学的に許容される塩を含む分子を含む。典型的には、ポリペプチドは、共有結合、例えばペプチド結合を介して互いに結合されている複数のアミノ酸残基、例えば、２、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはこれを超えるアミノ酸残基を含む。「アミノ酸残基」は、本開示のポリペプチドに組み込まれる個々のアミノ酸単位を意味する。本明細書において使用される、用語「アミノ酸」は、天然に存在するまたは合成のアミノ酸およびアミノ酸類似体、立体異性体および、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸模倣物を意味する。天然アミノ酸、例えば：（１）ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）（２）イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）（３）ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）（４）リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）（５）メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）（６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）（７）スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）（８）トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）（９）バリン（Ｖａｌ；Ｖ）（１０）アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）（１１）システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）（１２）グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）（１３）グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）（１４）プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）（１５）セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）（１６）チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）（１７）アラニン（Ａｌａ；Ａ）（１８）アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）（１９）アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）（２０）グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）（２１）セレノシステイン（Ｓｅｃ；Ｕ）であり、；非天然アミノ酸：（ａ）シトルリン（Ｃｉｔ）；（ｂ）シスチン；（ｃ）ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）；（ｄ）オルニチン（Ｏｒｎ）；（ｆ）テアニン；（ｇ）ホモシステイン（Ｈｅｙ）；（ｈ）チロキシン（Ｔｈｘ）；およびアミノ酸誘導体、例えばベタイン；カルニチン；カルノシンクレアチン；ヒドロキシトリプトファン；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）；Ｎ−アセチルシステイン；Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ−ｅ）；タウリン；チラミンが定義に含まれる。
一実施形態では、クロストリジウム毒素は、親クロストリジウム毒素の誘導体、例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０ＤＰＩ１（例えば、Ａ型）；Ｐ１０８４４（例えば、Ｂ型）；Ｐ１８６４０（例えば、Ｃ1型）；Ｐ１９３２１（例えば、Ｄ型）；Ｑ００４９６（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＣＡＡ４４５５８）（例えば、Ｅ型）；Ｐ３０９９６（例えば、Ｆ型）；Ｑ６０３９３（例えば、Ｇ型）；Ｈ型についてＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ：ＫＧＯ１５６１７（ＵＮＩＰＡＲＣ ＩＤ：０００５２Ｃ１５２９）；Ｘ型についてＧＥＮＢＡＮＫ ＩＤ：ＢＡＱ１２７９０（ＵＮＩＰＡＲＣ ＩＤ：０００５８２２７９６）；ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０４９５８（例えば、ＴｅＮＴ）；Ｑ４５８５１（例えば、ＢａＮＴ）；またはＰ３０９９５（例えば、ＢｕＮＴ）に記載のアミノ酸配列の誘導体を含む。本明細書において使用される、用語「誘導体」は、個々のアミノ酸または、その断片を含む前述のポリペプチドの塩、アミド、エステル、酸、塩基、溶媒和物、水和物、多形またはプロドラッグを含む。そのような誘導体は、このような誘導体化のために周知の方法を使用して当業者によって容易に調製され得る。本明細書に記載の方法における使用のために好適な誘導体は、実質的な毒性作用を伴うことなく動物またはヒトに投与され得、生物学的に活性である、またはプロドラッグである。
一例では、誘導体は、アミノ酸または毒素ポリペプチドの塩を含む。用語「塩」は、当技術分野において十分周知の任意の好適な有機および無機対イオン由来の塩を含み、例示の方法によって、前述のアミノ酸の塩酸塩または臭化水素酸塩またはアルカリもしくは酸性塩を含む。
所望により、誘導体は、付加的にまたは代替的に、溶媒付加形態、例えば、溶媒和物またはアルコラートであってよい。溶媒和物は、溶媒の化学量論量または非化学量論量を含有し、水、エタノールなど許容可能な溶媒を用いる結晶化工程の際に形成し得る。水和物は、溶媒が水である場合に形成される。アルコラートは、溶媒がアルコールである場合に形成される。本明細書に記載の化合物の溶媒和物は、日常的な技術を使用して簡便に調製または形成され得る。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素の多形が本明細書で開示される。多形は、本明細書に記載のクロストリジウム毒素の別の結晶形態を指す。タンパク質（またはポリペプチド）試料の多形性純度は、粉体Ｘ線回折、ＩＲ／ラマン分光法などの技術を使用して、および一部の場合ではそれらの光学的特性における差異を利用して（Thomas et al., Chemical Communications, 48: 10559-10561 (2012)）調べられる。
誘導体は、アミノ酸および／またはアミノ酸の異性体（例えば、互変異性体または立体異性体）のアミドまたはエステルを所望によりさらに含み得る。
ドメイン
本開示の実施形態は、前述のクロストリジウム毒素中に存在するドメインおよび部位、例えば、移行ドメイン（ＨN）、エンドペプチダーゼドメインまたは、細胞結合ドメインに、それらのサブドメイン、例えば、ＨCNサブドメインまたはＨCCサブドメインを含めて、さらに関する。一実施形態では、本開示は、クロストリジウム毒素中の１つまたは複数のドメインまたはサブドメイン内に位置する細胞結合部位を含むポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、例えば、クロストリジウム毒素細胞結合ドメインの１つまたは複数のアミノ酸モチーフを含み得る。例示的クロストリジウム毒素において見出される各ドメインおよびサブドメインについての境界領域は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６９７，４１３号に開示されている。種々のドメインの境界領域は、当技術分野において周知のバイオインフォマティクスツール（例えば、ＩＮＴＥＲＰＲＯまたはＰＲＯＳＩＴＥ）を使用して概算され得る。したがって、’４１３号特許において開示されている境界領域は、完全ではなく、例えば、個々のドメインの長さおよび／または分子量において１、２、３、４、５、７、１０、１５、２０またはこれを超えるアミノ酸の差異、それぞれ約５％、約４％、約３％、約２％、約１％またはこれより少ない％の変化を表す小さい差異は、許容可能であり、例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，８４１，１１１号および米国特許第８，５１２，９９２号に開示されている。
クロストリジウム毒素またはその断片の結合活性は、日常的な技術、例えば、放射標識アッセイ、競合的結合アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン（ＳＰＲ）技術などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、受容体リン酸化、二量体化またはシグナル伝達アッセイなどを使用してアッセイされ得る。クロストリジウム毒素断片に対応するポリペプチドの生物学的活性を評価するための代表的なアッセイは、例えば、実施例セクションに記載される複数の遺伝子のレベルを検出することを含むクロストリジウム毒素変種によって介在される遺伝子発現におけるモジュレーションを評価することを含む。別の実施形態では、生物学的活性は、例えば、フィブロネクチン合成および／または、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、ニューロンなどの標的細胞への効果の測定を介して機能的に評価され得る。線維芽細胞などの標的細胞の形態の微視的評価に関与する代表的な方法は、実施例に提供される。
一実施形態では、生物学的に活性断片は、クロストリジウム毒素の少なくとも１００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００またはこれを超える近接アミノ酸を含む。本明細書に記載のクロストリジウム毒素の断片は、当業者に周知の方法（例えば、組換え生物工学的技術）によって生成され得る。断片ポリペプチドは、当技術分野において周知の方法（例えば、免疫ブロット法もしくはＥＬＩＳＡなどの免疫原性技術または銀染色などのタンパク質染色技術）を使用して検出され得る。
ある特定の実施形態では、断片ポリペプチドは、好適な宿主、例えば、バキュロウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞において発現された場合に分泌され得る。本明細書において使用される、「分泌」は、発現されたポリペプチドが、従来の技術、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出可能であるレベルで宿主細胞から培養培地に分泌されることを意味する。分泌形態でタンパク質を合成するための方法は、当技術分野において周知である。一実施形態では、本開示は、標的細胞の表面に位置する受容体複合体への結合で、標的細胞の遺伝子発現および／または代謝活性をモジュレートする、クロストリジウム毒素結合ドメインを含む重鎖のカルボキシ末端領域（ＨC領域）を含む、クロストリジウム毒素断片に関する。クロストリジウム毒素の重鎖由来のＨC領域は、長さおよそ４００〜４４０アミノ酸であり、結合ドメインを含む（表１）。したがって、本実施形態の態様は、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００または４２５アミノ酸の長さを有する結合ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨC領域を含み得る。本実施形態の他の態様は、例えば、最大２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００または４２５アミノ酸の長さを有する結合ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨC領域を含み得る。
一実施形態では、本開示は、次の結合ドメイン断片：ＢｏＮＴ／Ａのアミノ酸Ｎ８７２〜Ｌ１２９６（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ０ＤＰＩ１）；ＢｏＮＴ／Ｂのアミノ酸Ｅ８５９〜Ｅ１２９１（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ１０８４４）；ＢｏＮＴ／Ｃ1のアミノ酸Ｎ８６７〜Ｅ１２９１（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ１８６４０）；ＢｏＮＴ／Ｄのアミノ酸Ｓ８６３〜Ｅ１２７６（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ１９３２１）；ＢｏＮＴ／Ｅのアミノ酸Ｒ８４６〜Ｋ１２５２（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｑ００４９６またはＧＥＮＢＡＮＫ番号ＣＡＡ４４５５８）；ＢｏＮＴ／Ｆのアミノ酸Ｋ８６５〜Ｅ１２７４（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ３０９９６）；ＢｏＮＴ／Ｇのアミノ酸Ｎ８６４〜Ｅ１２９７（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｑ６０３９３）；ＢｏＮＴ／Ｈのアミノ酸Ｙ８４４〜Ｌ１２８８（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＫＧＯ１５６１７）；ＴｅＮＴのアミノ酸Ｉ８８０〜Ｄ１３１５（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ０４９５８）；ＢａＮＴのアミノ酸Ｉ８５８〜Ｅ１２６８（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｑ４５８５１）；またはＢｕＮＴのアミノ酸Ｋ８４８〜Ｋ１２５１（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ３０９９５）に関する。
別の実施形態では、本開示は、毒性を欠いている、全長ボツリヌス毒素のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。一実施形態では、ポリペプチドは、毒性を欠いている、ボツリヌス毒素の全長と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
別の実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖のカルボキシルまたはＣ末端セグメント（ＨC）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖のＣ末端セグメントと少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのＮ末端側半分のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の結合ドメインのＮ末端側半分と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、ボツリヌス毒素血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ／Ｃ1）、ボツリヌス毒素血清型Ｄ（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス毒素血清型Ｅ（ＢｏＮＴ／Ｅ）、ボツリヌス毒素血清型Ｆ（ＢｏＮＴ／Ｆ）、ボツリヌス毒素血清型Ｇ（ＢｏＮＴ／Ｇ）、ボツリヌス毒素血清型Ｈ（ＢｏＮＴ／Ｈ）、ボツリヌス毒素血清型Ｘ（ＢｏＮＴ／Ｘ）、エンテロコッカス種ＢｏＮＴ／Ｊ（ｅＢｏＮＴ／Ｊ）ならびにこれらのモザイクボツリヌス毒素および／または変種からなる群から選択される。モザイク毒素の例としてはＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／ＣＤおよびＢｏＮＴ／ＦＡが挙げられる。一実施形態では、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）ではない。
別の実施形態では、本開示は、例えば、約１ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約６０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約７０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約９０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約１１０ｋＤａ、約１１０ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ〜約１３０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ〜約１４０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａまたはこれを超える、その間のすべての値、例えば約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤＡ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、３３ｋＤａ、３４ｋＤａ、３５ｋＤａ、３６ｋＤＡ、３７ｋＤａ、３８ｋＤａ、３９ｋＤａ、４０ｋＤａ、４１ｋＤａ、４２ｋＤａ、４３ｋＤａ、４４ｋＤａ、４５ｋＤａ、４６ｋＤａ、４７ｋＤａ、４８ｋＤａ、４９ｋＤａ、５０ｋＤａ、５１ｋＤａ、５２ｋＤａ、５３ｋＤａ、５４ｋＤａ、５５ｋＤａ、５６ｋＤａ、５７ｋＤａ、５８ｋＤａ、５９ｋＤａ、６０ｋＤａ、６１ｋＤａ、６２ｋＤａ、６３ｋＤａ、６４ｋＤａ、６５ｋＤａ、６６ｋＤａ、６７ｋＤａ、６８ｋＤａ、６９ｋＤａ、７０ｋＤａ、７１ｋＤａ、７２ｋＤａ、１７３ｋＤａ、７４ｋＤａ、７５ｋＤａ、７６ｋＤａ、７７ｋＤａ、７８ｋＤａ、７９ｋＤａ、８０ｋＤａ、８１ｋＤａ、８２ｋＤａ、８３ｋＤａ、８４ｋＤａ、８５ｋＤａ、８６ｋＤａ、８７ｋＤａ、８８ｋＤａ、８９ｋＤａ、９０ｋＤａ、９１ｋＤａ、９２ｋＤａ、９３ｋＤａ、９４ｋＤａ、９５ｋＤａ、９６ｋＤａ、９７ｋＤａ、９８ｋＤａ、９９ｋＤａ、１００ｋＤａ、１０１ｋＤａ、１０２ｋＤａ、１０３ｋＤａ、１０４ｋＤａ、１０５ｋＤａ、１０６ｋＤａ、１０７ｋＤａ、１０８ｋＤａ、１０９ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１１１ｋＤａ、１１２ｋＤａ、１１３ｋＤａ、１１４ｋＤａ、１１５ｋＤａ、１１６ｋＤａ、１１７ｋＤａ、１１８ｋＤａ、１１９ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１２１ｋＤａ、１２２ｋＤａ、１２３ｋＤａ、１２４ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１２６ｋＤａ、１２７ｋＤａ、１２８ｋＤａ、１２９ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１３１ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１３３ｋＤａ、１３４ｋＤａ、１３５ｋＤａ、１３６ｋＤａ、１３７ｋＤａ、１３８ｋＤａ、１３９ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１４１ｋＤａ、１４２ｋＤａ、１４３ｋＤａ、１４４ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１４６ｋＤａ、１４７ｋＤａ、１４８ｋＤａ、１４９ｋＤａ、１５０ｋＤａ、またはこれを超える値を含む、例えば、約１５５ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１６５ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１７５ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１９０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２２５ｋＤａ、約２５０ｋＤａ、約２７５ｋＤａまたはこれを超えるまでの範囲の平均分子量を有するクロストリジウム毒素断片に関する。一実施形態では、本開示は、例えば、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約２５ｋＤａまたは５０ｋＤａを超える、その間のすべての値、例えば約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、３３ｋＤａ、３４ｋＤａ、３５ｋＤａ、３６ｋＤａ、３７ｋＤａ、３８ｋＤａ、３９ｋＤａ、４０ｋＤａ、４１ｋＤａ、４２ｋＤａ、４３ｋＤａ、４４ｋＤａ、４５ｋＤａ、４６ｋＤａ、４７ｋＤａ、４８ｋＤａ、４９ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはこれを超える値を含む範囲の分子量を有するクロストリジウム毒素の結合ドメインのＮ末端サブドメイン（ＨCN）に関する。一実施形態では、本開示は、ボツリヌス毒素の結合ドメインのアミノまたはＮ末端側半分（ＨCN）と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。別の実施形態では、本開示は、クロストリジウム毒素の結合ドメインＮ末端側半分由来の最初の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０またはこれを超える数の近接アミノ酸を含む、クロストリジウム毒素の結合ドメインのアミノ末端（Ｎ末端）側半分と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。そのような実施形態では、ポリペプチドは、例えば、約１ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約１４ｋＤａ、約６ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約８ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、その間のすべての値、例えば、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、５．５ｋＤａ、６ｋＤａ、６．５ｋＤａ、７ｋＤａ、７．５ｋＤａ、８ｋＤａ、８．５ｋＤａ、９ｋＤａ、９．５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１０．５ｋＤａ、１１ｋＤａ、１１．５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１２．５ｋＤａ、１３ｋＤａ、１３．５ｋＤａ、１４ｋＤａ、１４．５ｋＤａ、１５ｋＤａ、１５．５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１６．５ｋＤａ、１７ｋＤａ、１７．５ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、またはこれを超える値を含む範囲の、分子量を有し得る。
関連する実施形態では、本開示は、例えば、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約３５ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約１５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約２５ｋＤａまたは５０ｋＤａを超える、その間のすべての値、例えば約１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ、１１ｋＤａ、１２ｋＤａ、１３ｋＤａ、１４ｋＤａ、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１７ｋＤａ、１８ｋＤａ、１９ｋＤａ、２０ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、２７ｋＤａ、２８ｋＤａ、２９ｋＤａ、３０ｋＤａ、３１ｋＤａ、３２ｋＤａ、３３ｋＤａ、３４ｋＤａ、３５ｋＤａ、３６ｋＤａ、３７ｋＤａ、３８ｋＤａ、３９ｋＤａ、４０ｋＤａ、４１ｋＤａ、４２ｋＤａ、４３ｋＤａ、４４ｋＤａ、４５ｋＤａ、４６ｋＤａ、４７ｋＤａ、４８ｋＤａ、４９ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはこれを超える値を含む範囲の、分子量を有するクロストリジウム毒素の結合ドメインのＣ末端サブドメイン（ＨCC）と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
別の実施形態では、本開示は、還元ゲル電気泳動によって決定された、前述の分子量、例えば約１ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの間、詳細には約５ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間、特に約１０ｋＤａ〜約７０ｋＤａの間を有するクロストリジウム毒素断片を提供する。
他の実施形態では、その断片を含むクロストリジウム毒素の分子量は、当技術分野において周知のバイオインフォマティクスツール（例えば、ＰＲＯＴＰＡＲＡＭまたはＣＯＭＰＵＴＥ ｐＩ／ＭＷ）を使用して理論的に算出される。例えば、ＰＲＯＴＰＡＲＡＭに基づいて、全長ＢｏＮＴ／Ａ（ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ０ＤＰＩ１）が約１４９．３ｋＤａの理論的分子量を有する一方で、アミノ酸４４９〜１２９６（８４８アミノ酸）を含むＨCドメインは、約９８．２ｋＤａの理論的ＭＷを有する。具体的な実施形態では、アミノ酸８７３〜１０９２にわたるＢｏＮＴ／ＡのＨCNドメイン（ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ０ＤＰＩ１９）は、ＰＲＯＴＰＡＲＡＭに基づいて約２６．１ｋＤａの理論的分子量を有する。さらにさらなる実施形態では、アミノ酸８７３〜９８０にわたるＢｏＮＴ／ＡのＨCNドメイン（ＵＮＩＰＲＯＴ番号Ｐ０ＤＰＩ１）の近位Ｎ末端断片は、約１２．６５ｋＤａの理論的分子量を有する。
同一およびコンセンサス配列の同定のために配列アライメント分析において使用された、ＢｏＮＴの種々の血清型由来のＢｏＮＴ ＨCドメインおよびＨCNドメインの代表的なアミノ酸配列は、本明細書において配列番号３〜９として同定されている。
改変
一部の場合では、クロストリジウム毒素（またはドメインもしくはそのサブドメイン）は、１つまたは複数の改変を含む。例えば、クロストリジウム毒素またはその断片は環化され得る。別の例として、クロストリジウム毒素またはその断片は、１つまたは複数のアミノ酸改変、例えば、１つまたは複数のＤ−アミノ酸の含有、を有し得る。一次配列を変更しない目的の改変として、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アセチル化またはカルボキシル化が挙げられる。グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセシングまたはさらなるプロセシングステップの際に；例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を与える酵素にポリペプチドを曝露することによってポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって作製されるものも含まれる。同様に利用されるのは、リン酸化アミノ酸残基、例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリンまたはリン酸化スレオニンを有するポリペプチドである。
タンパク質分解性分解へのそれらの抵抗性を改善するため、または溶解度特性を最適化するため、またはそれらを治療剤としてさらに好適にするために通常の分子生物学的技術および／または合成化学を使用して改変されているクロストリジウム毒素またはその断片も提供される。そのようなポリペプチドの類似体は、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものを含む。
毒素は、種々の目的のために多種多様な他のオリゴペプチドまたはタンパク質と連結され得る。対象ポリペプチドの発現を提供することによって、種々の翻訳後修飾が達成され得る。例えば、適切なコード配列を使用することによって、ファルネシル化またはプレニル化を提供できる。例えば、毒素は、リポソームなどの脂質膜に結合できるように、末端で脂質基に結合されていてよい。
クロストリジウム毒素またはその断片への他の好適な修飾として、例えば、（１）Ｃ末端のアミド化および／またはＮ末端のアセチル化もしくは脱アミノ化などのポリペプチドの末端のエンドキャッピング；（２）構造中へのペプチド模倣物要素の導入；および（３）ポリペプチドの環化が天然アミノ酸または天然に存在しない構成要素を通じて生じる、環化が挙げられる。
改変クロストリジウム毒素またはその断片は、例えば、アミノ酸側鎖がα−炭素の代わりにポリペプチド骨格の窒素に繋がれている、ペプトイド（Ｎ−置換オリゴグリシン）であり得る。例えば、Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 10646, 1992)を参照されたい。
対象毒素として、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸を含み得る。クロストリジウム毒素またはその断片は、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との組合せおよび、ポリペプチドに特別な特性を与える種々の「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸など）を含み得る。
融合タンパク質および連結タンパク質
本明細書で開示される改変クロストリジウム毒素またはその断片が、１つまたは複数の追加的構成成分を含んでよいことは理解される。任意の構成成分の非限定的例として、改変クロストリジウム毒素またはその断片は、可動性スペーサーを含む可動性領域をさらに含み得る。可動性スペーサーの非限定的例として、例えば、Ｇ−スペーサーＧＧＧＧＳ（配列番号２２）またはＡ−スペーサーＥＡＡＡＫ（配列番号２３）が挙げられる。可動性スペーサーを含む可動性領域は、ポリペプチドの特徴、性状または特性を最適化するためにポリペプチド領域の長さを調整するために使用され得る。そのような可動性領域は、融合タンパク質として改変クロストリジウム毒素またはその断片にインフレームで作動可能に連結される。非限定的例として、１つまたは複数の可動性スペーサーをタンデムで含むポリペプチド領域は、プロテアーゼ切断部位をさらに良好に露出するために使用でき、それによりプロテアーゼによるその部位の切断を促進する。別の非限定的例として、１つまたは複数の可動性スペーサーをタンデムで含むポリペプチド領域は、リガンドドメインをさらに良好に提示するために使用でき、それにより、受容体上のその結合ドメインへのリガンドドメインの結合を促進する。
したがって、一実施形態では、本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素またはその断片は、可動性スペーサーを含む可動性領域をさらに含み得る。別の実施形態では、本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素またはその断片は、複数の可動性スペーサーをタンデムで含む可動性領域をさらに含み得る。本実施形態の態様では、可動性領域は、例えば、少なくとも１個のＧ−スペーサー、少なくとも２個のＧ−スペーサー、少なくとも３個のＧ−スペーサー、少なくとも４個のＧ−スペーサーまたは少なくとも５個のＧ−スペーサーをタンデムで含み得る。本実施形態の他の態様では、可動性領域は、例えば、最大１個のＧ−スペーサー、最大２個のＧ−スペーサー、最大３個のＧ−スペーサー、最大４個のＧ−スペーサーまたは最大５個のＧ−スペーサーをタンデムで含み得る。本実施形態のさらに他の態様では、可動性領域は、例えば、少なくとも１個のＡ−スペーサー、少なくとも２個のＡ−スペーサー、少なくとも３個のＡ−スペーサー、少なくとも４個のＡ−スペーサーまたは少なくとも５個のＡ−スペーサーをタンデムで含み得る。本実施形態のさらに他の態様では、可動性領域は、例えば、最大１個のＡ−スペーサー、最大２個のＡ−スペーサー、最大３個のＡ−スペーサー、最大４個のＡ−スペーサーまたは最大５個のＡ−スペーサーをタンデムで含み得る。本実施形態の別の態様では、改変クロストリジウム毒素またはその断片は、同じ可動性スペーサーの１つまたは複数のコピー、異なる可動性スペーサー領域の１つまたは複数のコピーまたはこれらの任意の組合せを含む可動性領域を含み得る。
クロストリジウム毒素の特性
毒性プロファイルの欠失
一実施形態では、本開示は、毒性の低減されたもしくは毒性の欠如を含む毒性が改変されたクロストリジウム毒素（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）またはその断片を対象とした組成物および方法を検討する。当技術分野において周知のとおり、クロストリジウム毒素の毒性活性は、可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体（「ＳＮＡＲＥ」）タンパク質を選択的に切断する亜鉛（Ｚｎ2+）エンドペプチダーゼである軽鎖に特に含有されている。ＳＮＡＲＥタンパク質は、神経伝達物質含有小胞の細胞膜の細胞質側表面の認識およびドッキング、ならびに小胞の細胞膜との融合のために重要である。ＴｅＮＴ、ＢｏＮＴ／Ｂ ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇは、シナプトブレビン（小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）とも称される）、シナプトソーム膜タンパク質の分解を生じる。シナプス小胞の表面から伸びるＶＡＭＰの細胞質ドメインの大部分は、これらの切断事象のいずれか１つの結果として除去される。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは、細胞膜の細胞質表面に主に結合し存在する細胞膜関連タンパク質ＳＮＡＰ−２５を選択的に切断する。ＢｏＮＴ／Ｃは、シンタキシン、そのマスの大部分が細胞質に露出している複合タンパク質を切断する。シンタキシンは、シナプス前末端活性ゾーンでカルシウムチャネルと相互作用する。一部の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片の毒性は、神経筋麻痺の誘導の観点からアッセイされる（細胞に侵入し、次いで神経伝達物質放出を阻害する毒素分子の能力の指標である。一部の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片の毒性は、毒素構築物の腹腔内注射で検査動物、例えばマウスの群の５０％（半分）に死を誘導する毒素の量であるＬＤ50値を単位としてアッセイされる、米国特許第７，７４９，５１４号および第９，２８４，５４５号を参照されたい。
本実施形態の態様では、クロストリジウム毒素またはその断片は、天然に存在するクロストリジウム毒素の例えば、約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または＞９９％の毒性である。本実施形態の態様では、改変クロストリジウム毒素またはその断片は、天然に存在するクロストリジウム毒素の例えば、最大１０％の毒性であり、天然に存在するクロストリジウム毒素の最大１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または＜９５％の毒性である。好ましくは、本開示のクロストリジウム毒素断片または変種は、例えば従来の様式で対象に適用された場合に毒性を欠いている。
一実施形態では、本明細書で開示される毒性を改変されたクロストリジウム毒素またはその断片は、これだけに限らないが：（ａ）研究用（すなわち、例えば、その結合、移行および薬物動態を含むＢｏＮＴ／Ａの作用機構ならびに解毒剤を開発および検査するためのその使用）；（ｃ）屋内放出についてのリスクおよび診断を評価する；（ｄ）霊長類を含む哺乳動物における薬物動態を調べるため；（ｄ）ワクチン開発；（ｅ）抗体開発（治療および診断用）；ならびに（ｆ）臨床治療適用を含む適用を見出している。
クロストリジウム毒素の毒性は、日常的方法を使用して評価され得る。当技術分野において周知のとおり、複数ステップ機構がＢｏＮＴによる細胞中毒に関与している（Chaddock et al., Trends Biochem. Sci. 27, 552-558, 2002）。神経毒は、重鎖（Ｈ）を通じてニューロンのシナプス前神経末端に結合し、受容体介在エンドサイトーシスによって侵入する（Schiand et al., Physio. Rev. 80, 717-755, 2000）。エンドソームの低いｐＨは、ＨCNによるチャネル形成を誘導し、ＬＣの細胞質への移行を可能にすると考えられている（Li et al., Biochemistry 39, 6466-6474, 2000）。ＬＣは、シナプス小胞融合に不可欠な３種の異なるＳＮＡＲＥタンパク質の１つを特異的に切断する亜鉛エンドペプチダーゼとして作用すると考えられている（Montecucco et al., Trends Biochem. Sci. 18, 324-327, 1993; Li et al., Toxin Rev. 18, 95-112, 1999）。一実施形態では、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは、膜融合の特異性の主要因であり、シナプス小胞と細胞膜とを合わせて運ぶタイトな複合体を形成することによって直接融合を実行するトランス−ＳＮＡＲＥ複合体の構成成分、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ−２５）を独立に切断する。別の実施形態では、ＴｅＮＴおよび／またはＢｏＮＴ／Ｂ、／Ｄ、／Ｆおよび／Ｇは、セルブレビン、シナプス小胞のシナプス前膜とのドッキングおよび／または融合に関与するタンパク質を切断する。一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ｃ1は、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を切断する。ＳＮＡＲＥタンパク質が切断されると、神経伝達物質（すなわち、例えば、アセチルコリン）の放出は、妨げられ、最終的には弛緩性筋肉麻痺が生じる（Montecucco et al., Q. Rev. Biophys, 28:423-472 (1995)。ボツリヌス神経毒活性部位は、ＨＥＸＸＨ＋Ｅ亜鉛結合モチーフを含むと考えられている（Li et al., Biochemistry 39, 2399-2405, 2000）。一般的コンホメーションおよび活性部位残基は、すべてのクロストリジウム神経毒において保存されていると考えられている（Agarwal et al., Biochemistry 44, 8291-8302, 2005）。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ活性部位のアミノ酸残基は、すべてではないが大部分のＢｏＮＴサブタイプにおいて保存されているＨ２２３−Ｅ２２４−Ｌ２２５−Ｉ２２６−Ｈ２２７＋Ｅ２６２（「Ｈ２２３−Ｅ２２４−Ｌ２２５−Ｉ２２６−Ｈ２２７」は配列番号２４として開示されている）を含む。
したがって、本開示は、エンドペプチダーゼ活性もしくは移行活性またはエンドペプチダーゼ活性および移行活性の両方を欠失しているクロストリジウム毒素の無毒性形態に関する。一実施形態では、本明細書では、エンドペプチダーゼ活性を欠いているクロストリジウム毒素変種を提供する。そのような変種は、例えばエンドペプチダーゼ活性を付与する活性部位を形成する１つまたは複数のアミノ酸残基の変異または欠失を含み得る。別の実施形態では、エンドペプチダーゼ活性を欠いているクロストリジウム毒素変種は、相当な部分の欠失、例えば軽鎖（ＬＣ）ドメインを形成するアミノ酸の、例えば、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または＞９９％の欠失を含み得る。別の実施形態では、クロストリジウム毒素変種は、エンドペプチダーゼ活性および移行活性の両方を欠いている。本実施形態では、クロストリジウム毒素変種は、（ａ）軽鎖（ＬＣ）ドメインを形成するアミノ酸および（ｂ）移行ドメインを形成するアミノ酸の相当な部分の欠失を含む。
ＢｏＮＴ／Ａの文脈では、本開示は、ＳＮＡＰ−２５を切断しない断片を検討する。ＳＮＡＰ−２５切断活性を測定するための試薬およびアッセイは、当技術分野において周知である。例えば、Mizanur et al., PLoS One, 9(4), e95188, 2014を参照されたい。
本開示は、その断片を含む不活性クロストリジウム毒素にさらに関する。用語「不活性クロストリジウム毒素」は、細胞に毒性でないクロストリジウム毒素を意味する。例えば、不活性クロストリジウム毒素は、細胞または神経末端からの神経伝達物質の放出を妨げる能力をわずかに有するまたは有さない。一部の実施形態では、不活性クロストリジウム毒素は、活性である同一のクロストリジウム毒素の約５０％未満、例えば、約４０％、約２５％、約１０％、約５％またはそれより少ない％、例えば、約２％の神経毒作用（例えば、神経伝達物質の放出を阻害する能力）を有する。例えば、不活性ボツリヌス毒素（ｉＢｏＮＴ）は、活性である同一のＢｏＮＴ（例えば、全長ＢｏＮＴ）の約５０％未満、例えば、約４０％、約２５％、約１０％、約５％またはそれより少ない％、例えば、約２％の神経毒作用を有する。全長不活性ボツリヌス毒素は、例えば、米国特許第６，０５１，２３９号および米国特許第７，１７２，７６４号に開示されている。一部の実施形態では、不活性クロストリジウム毒素は、抗原性を低減するように改変（例えば、グリコシル化）されている重鎖を含む。一部の実施形態では、不活性クロストリジウム毒素は、１本鎖ポリペプチドである。好ましくは、本開示の不活性クロストリジウム毒素は、軽鎖（ＬＣ）ドメインおよび／または移行ドメインを欠いている全長クロストリジウム毒素の断片を含み、断片クロストリジウム毒素は、抗原性を低減するようにさらにグリコシル化されてよい。
本明細書において使用される用語「抗原性の低減」は、哺乳動物において抗体の産生を誘導する不活性クロストリジウム毒素の能力が、全長クロストリジウム毒素の抗原性作用に満たない、例えば、全長クロストリジウム毒素の抗原性作用の約１００％未満、約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、例えば、約４０％、約２５％、約１０％、約５％またはそれより少ない％、例えば約２％であることを意味する。例えば、グリコシル化された分子は、哺乳動物において抗体の産生のために免疫応答を誘導する能力がわずかである、または無いために、抗原性が低減されている場合がある。同様に、分子上のエピトープ領域は、哺乳動物における抗体の誘導に関与している。したがって、変異したエピトープ領域を有するまたはエピトープ領域を欠失している分子は、抗体産生を刺激するこれらの領域が分子上にもはや存在しないことから抗原性が低減している場合がある。米国特許第７，１７２，７６４号を参照されたい。例えば、その重鎖内のカルボキシ末端（Ｈｃ）に変異したエピトープ領域を含むまたはエピトープ領域が欠失しているｉＢｏＮＴは、全長クロストリジウム毒素と比較して抗原性が低減している。一部の実施形態では、哺乳動物へのグリコシル化ＢｏＮＴの投与は、グリコシル化されていない同一のＢｏＮＴの投与と比較して、約１／２、好ましくは１／４、より好ましくは１／８またはそれより少ない抗体の産生を誘導する。本開示のクロストリジウム毒素の抗原性は、当技術分野において周知の方法およびツールを使用して決定され得る。例えば、Atassi et al., Protein J., 23(1):39-52, 2004などである。
本明細書に開示される実施形態は、例えば、生化学アッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学的アッセイなどを含む、その断片および変種を含むクロストリジウム毒素の毒性についてアッセイするための方法にさらに関する。一実施形態では、クロストリジウム毒素断片または変種は、標準的エンドペプチダーゼアッセイにおいてエンドペプチダーゼ活性を欠いている（ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける変更について米国特許第８，６１８，２６１号；米国特許第８０６７２３１号；米国特許第８，１２４，３５７号；米国特許第７，６４５，５７０号を参照されたい）。別の実施形態では、クロストリジウム毒素断片または変種は、非致死性である。
細胞シグナル伝達のモジュレーション
関連する実施形態では、これだけに限らないが、例えばＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７、ＴＰ６３、ＳＯＤ２、ＵＢＤ、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−３２、ＣＣＬ２、ＢＤＫＲＢ１、ＭＣ５Ｒ、ＡＲ、ＨＳＤ３Ｂ１、ＨＳＤ１７Ｂ１およびＰＰＡＲδが挙げられる１つまたは複数の皮膚の質に関連する遺伝子の発現をモジュレートするクロストリジウム毒素、サブドメインまたはその断片またはその変種が本明細書で提供される。
これらの皮膚の質に関連する遺伝子の発現における変化は、細胞外マトリックス構造を含む、皮膚の質に関連する細胞、組織および／または器官の構造的および機能的特徴に影響を与え、例えば弾力および柔軟性などの皮膚の生体力学的特性に変化を生じる。「モジュレートする」によって、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種が、標的細胞、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂腺細胞、免疫細胞またはニューロンと接触すると、対照（例えば、ＢＳＡ処置）と比較して前述の遺伝子の１つまたは複数の発現に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍またはこれを超える変化を生じることを意味する。遺伝子発現を測定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、マイクロアレイ分析または定量的ＰＣＲアッセイなどである。代表的な方法は、実施例セクションに例示されている。
特に、標的細胞、例えば、線維芽細胞またはケラチノサイトと接触した場合にＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７およびＴＰ６３から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートするクロストリジウム毒素、サブドメインまたはその断片もしくは変種が本明細書で提供される。特にクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、前述の６個の遺伝子シグネチャーにおいて各遺伝子の発現を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍またはこれを超えて増加させる。これらの皮膚の質に関連する遺伝子の発現における変化は、細胞外マトリックス構造を含む、皮膚の質に関連する細胞、組織および／または器官の構造的および機能的特徴に影響を与え、例えば弾力および柔軟性などの皮膚の生体力学的特性において変化を生じる。
加えて、本開示は、フィブロネクチンの発現を増加させるクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種に関する。本明細書において使用される「フィブロネクチン」は、ＥＣＭ構成成分タンパク質、例えば、コラーゲン、フィブリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する細胞外マトリックスの高分子量（約４４０ｋＤａ）糖タンパク質を指す。一実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、細胞、例えば線維芽細胞またはケラチノサイトに接触した場合に、フィブロネクチンの発現を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍またはこれを超えて増加させる。フィブロネクチン発現の増加は、細胞外マトリックス構造を含む真皮の構造および機能に影響を与え、弾力および柔軟性を含む皮膚の生体力学的特性に変化を生じる。
標的細胞への効果
本開示は、標的細胞、例えばそれらが結合する細胞の１つまたは複数の特性を変化させるクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種にさらに関する。一実施形態では、特性は、サイズ、形状、密度および微絨毛の数／サイズなどの物理的性状である。別の実施形態では、特性は、増殖、遊走、分化、分泌（例えば、ＥＣＭ構成成分）ならびに癒着（互いにおよびマトリックスに）などの機能的性状である。さらに別の実施形態では、特性は、脂質、糖、ペプチドまたはホルモンなどの代謝物の差次的産生である。具体的な実施形態では、特性は、メディエーターの存在下での代謝物の産生の減弱、例えば脂腺細胞における皮脂のオレイン酸誘導産生の減弱である。実施例に示すとおり、標的細胞、例えば線維芽細胞と接触させると、クロストリジウム毒素断片は、細胞形態および／または機能において明らかな変化を実現する。追加的に、皮脂産生細胞、例えば脂腺細胞をクロストリジウム毒素断片を用いて処置すると、皮脂の過剰産生におけるオレイン酸の効果が顕著に減弱された。
クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の細胞効果は、実施例において詳細に記載される技術を使用してアッセイされ得る。種々の標的細胞、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、メラノサイト、脂腺細胞；ニューロン；細胞株；および組織は、細胞レベルでのクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の作用をアッセイするために使用され得る。
ポリヌクレオチド
本開示の態様は、一部において、ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド分子」は、「核酸分子」と同義であり、例えばリボヌクレオチドおよびデオキシリボ核酸などの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素をコードし得る任意のおよびすべてのポリヌクレオチド分子が、非限定的に天然に存在するおよび天然に存在しないＤＮＡ分子ならびに天然に存在するおよび天然に存在しないＲＮＡ分子を含めて有用であり得ることが想定される。天然に存在するおよび天然に存在しないＤＮＡ分子の非限定的例として、１本鎖ＤＮＡ分子、２本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ベクター構築物、例えばプラスミド構築物、ファージミド構築物、バクテリオファージ構築物、レトロウイルス構築物および人工染色体構築物などが挙げられる。天然に存在するおよび天然に存在しないＲＮＡ分子の非限定的例として、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡおよびｍＲＮＡが挙げられる。
一実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、１つまたは複数の前述のクロストリジウム毒素、その変異体または変種、そのドメインおよび／もしくはサブドメイン、その生物学的に活性なもしくは免疫原性断片、その多量体、そのキメラおよび融合構築物、そのタグ化構築物、その模倣物またはその操作されたもしくは合成誘導体の形態をコードする。具体的には、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ分子であり、特にポリヌクレオチドはｃＤＮＡ分子である。その変異体、変種または断片を含む、１つまたは複数の前述のクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドも含まれる。特に、ポリヌクレオチドは、そのホモログを含むＢｏＮＴ／Ａの細胞結合ドメインまたはその変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ1、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴまたはＢｕＮＴの細胞結合ドメインをコードするｃＤＮＡ分子である。特に好ましくは、ポリヌクレオチドは、そのホモログを含むＢｏＮＴ／Ａの細胞結合ドメインの重鎖Ｎ末端サブドメイン（ＨCN）またはその変異体、例えばＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ1、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ、ＢｏＮＴ／Ｘ、ｅＢｏＮＴ／Ｊ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴまたはＢｕＮＴのＨCNサブドメインをコードするｃＤＮＡ分子である。
本開示は、その断片を含む前述のクロストリジウム毒素の１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む合成核酸、例えば非天然核酸も提供する。
配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８に記載のクロストリジウム毒素断片配列、または１、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、２５、３０またはこれを超えるアミノ置換（好ましくは保存的もしくは半保存的アミノ酸置換）を有するその変種、またはそれに対する相補鎖を含むそのホモログ、またはそのＲＮＡ等価物、またはその相補性ＲＮＡ等価物をコードする核酸が本明細書に含まれる。
配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８のクロストリジウム毒素断片配列、または１、２、３、４、５、４〜１０、５〜１０または５〜１５個のアミノ酸置換（好ましくは保存的または半保存的アミノ酸置換）を有するその変種、または、それに対する相補鎖を含むそのホモログ、またはそのＲＮＡ等価物、またはその相補性ＲＮＡ等価物をコードする核酸も本明細書に含まれる。一部の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７に記載の配列を含む、からなるまたはからなるＢｏＮＴ／Ａ 変異体の断片をコードする。
本開示は、クロストリジウム毒素断片、例えば、ＨCドメイン、具体的にはＨCNドメイン、特にＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ1、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ＢｏＮＴ／Ｈ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｘ、ｅＢｏＮＴ／Ｊ、ＴｅＮＴ、ＢａＮＴ、ＢｕＮＴ、これらの前述のサブタイプを含む、からなる群から選択されるクロストリジウム毒素のＨCNドメインのＮ末端側半分をコードする断片の核酸ホモログにさらに関する。実質的な相同性を有する配列は、配列番号２に示す配列または配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１および配列番号１２〜１８をコードする核酸と少なくとも５０％、具体的には少なくとも６５％、特に少なくとも８０％同一性またはそれより大きい％同一性を有する核酸配列を含む。配列同一性は、当技術分野において周知の方法に従って、例えばＢＬＡＳＴ ｖ２．１を使用して算出され得る。Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang et al., Genome Res. 7:649-656, 1997も参照されたい。
本明細書に開示される実施形態は、上に開示されるポリヌクレオチドを作製する方法にさらに関する。これだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、制限酵素反応、アガロースゲル電気泳動、核酸ライゲーション、細菌形質転換、核酸精製、核酸配列決定および組換えに基づく技術に関する手順を含む、本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するために必要である場合がある十分に確立された分子生物学技術は、当業者および本明細書の教示の十分に範囲内の日常的手順である。改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するために必要な具体的なプロトコールの非限定的例は、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN Molecular Biology(Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004)に記載されている。追加的に、改変クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を作製するために有用な種々の商業的に入手できる製品は、広く利用可能である。これらのプロトコールは、当業者および本明細書の教示の十分に範囲内の日常的手順である。
本開示の別の態様は、例えば、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構築物を細胞に導入するステップ、および細胞において発現構築物を発現させるステップを含む、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を産生する方法を提供する。
本明細書において開示される方法は、一部において、本明細書において開示されるすべてのクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む。したがって、本実施形態の態様は、非限定的に、天然に存在するクロストリジウム毒素、例えばクロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプなどの天然に存在するクロストリジウム毒素変種、例えば、保存的または半保存的クロストリジウム毒素変種、非保存的クロストリジウム毒素変種、前述の毒素の１つまたは複数を含むキメラまたは融合構築物などの天然に存在しないクロストリジウム毒素変種、クロストリジウム毒素断片、例えば少なくとも１つのドメイン（例えば重鎖の結合ドメイン）またはクロストリジウム毒素のサブドメイン（例えば結合ドメインのＮ末端側半分）を含む生物学的に活性な断片または免疫原性断片、そのようなクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含むキメラまたは融合構築物、タグ化構築物、操作された構築物、合成構築物あるいはこれらの任意の組合せを産生することを含む。
本明細書において開示される方法は、一部において、ポリヌクレオチド分子を含む。具体的には、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む融合タンパク質を含む本明細書において開示される任意のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードする。本明細書において開示される任意のおよびすべてのポリヌクレオチド分子が使用され得ることが想定される。したがって、本実施形態の態様は、非限定的に、１本鎖ＤＮＡ分子、２本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ベクター構築物、例えばプラスミド構築物、ファージミド構築物、バクテリオファージ構築物、レトロウイルス構築物および人工染色体構築物などを含む天然に存在するおよび天然に存在しないＤＮＡ分子を含む。天然に存在するおよび天然に存在しないＲＮＡ分子の非限定的例として、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡおよびｍＲＮＡが挙げられる。
本明細書において開示される方法は、一部において、発現構築物を含む。発現構築物は、細胞または無細胞抽出物においてポリヌクレオチド分子を発現するために有用な発現ベクターに作動可能に連結された本明細書において開示されるポリヌクレオチド分子を含む。多種多様な発現ベクターは、改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子を発現するために使用でき、非限定的に、ウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；真核生物発現ベクター、例えば酵母発現ベクター、昆虫発現ベクターおよび哺乳動物発現ベクター；ならびに無細胞抽出物発現ベクターなどを含む。これらの方法の態様を実行するために有用な発現ベクターが、構成的、組織特異的、細胞特異的または誘導可能プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントまたは両方の調節下で改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を発現するものを含み得ることがさらに理解される。発現ベクターの非限定的例および、そのような発現ベクター由来の発現構築物を作製および使用する十分に確立された試薬および条件は、商業的供給者から容易に入手できる。好適な発現ベクターの選択、作製および使用は、当業者および本明細書の教示の十分に範囲内の日常的手順である。
したがって本実施形態の態様は、非限定的に、改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結されたウイルス発現ベクター；改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された原核生物発現ベクター；改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された酵母発現ベクター；改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された昆虫発現ベクター；および改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された哺乳動物発現ベクターを含む。本実施形態の他の態様は、非限定的に、改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された無細胞抽出物発現ベクターを含む無細胞抽出物を使用して、本明細書において開示される改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を発現するために好適な発現構築物を含む。
本明細書において開示される方法は、一部において、細胞を含む。任意のおよびすべての細胞が使用され得ることが想定される。それにより、本実施形態の態様は、非限定的に好気性、微好気性、カプノフィリック（capnophilic）、通性、嫌気的の株を含む原核細胞、例えば大腸菌、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クロストリジア・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジア・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ナイセリア・メニンギルルス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ）、髄炎球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）およびサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のものなどのグラム陰性およびグラム陽性細菌細胞；ならびに非限定的に、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・マタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のものなどの酵母株を含む真核細胞；昆虫細胞および昆虫由来細胞株など、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ Ｓｅｘｔａ）由来のものなど；フィルム・クニダリア（ｐｈｙｌｕｍ Ｃｎｉｄａｒｉａ）（例えば、ヒドラ、イソギンチャク、クラゲまたはサンゴ、例えば、アイプタシア種（Ａｉｐｔａｓｉａ ｓｐ．））に属する生物および／またはフィルム・クニダリアから遺伝的に形質転換された生物の刺胞細胞（具体的には、刺胞細胞、刺細胞（nematocyte）またはフィコサイト（ptychocyte））；米国特許第６，９２３，９７６号を参照されたい）ならびに哺乳動物細胞および例えば、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒトなどの哺乳動物細胞に由来する細胞系を非限定的に含む。細胞株は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（２００４）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（２２０４）；およびｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（２００４）から得ることができる。適切な細胞系を選択、作製および使用するための具体的なプロトコールの非限定的例は、例えば、INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al., eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL、上記(2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002);およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、上記(2004)に記載されている。細胞が刺胞動物細胞である場合、それは、電気穿孔法の日常的技術を使用してまたは２本鎖ＲＮＡを使用して形質転換され得る。Wittlieb et al., PNAS USA, 103(16):6208-11, 2006; Pankow et al., PLoS One, 2(9):e782, 2007; Khalturin et al., PLoS Biol., 6(11):e278, 2008を参照されたい。これらのプロトコールは、当業者および本明細書の教示の範囲内の日常的手順である。
本明細書において開示される方法は、一部において、ポリヌクレオチド分子を細胞に導入することを含む。細胞に導入されるポリヌクレオチド分子は、細胞によって一過的にまたは安定に維持され得る。安定に維持されるポリヌクレオチド分子は、染色体外にあり自律的に複製できる、またはそれらは細胞の染色体物質に組み込まれ、非自律的に複製する。本明細書において開示されるポリヌクレオチド分子を細胞に導入するための任意のおよびすべての方法が使用され得ることが想定される。核酸分子を細胞に導入するために有用な方法として、非限定的に、化学的介在トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム介在、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン介在、脂質介在、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在、ポリリジン介在およびポリブレン介在など；物理介在トランスフェクション、例えば、微粒子銃粒子送達、微量注入、プロトプラスト融合および電気穿孔法など；ならびにウイルス介在トランスフェクション、例えばレトロウイルス介在トランスフェクションなどが挙げられ、例えば、Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001)を参照されたい。当業者は、発現構築物を細胞に導入する具体的な方法の選択が、一部において、細胞が発現構築物を一過的に含有するか、または細胞が発現構築物を安定に含有するかどうかに依存することを理解する。これらのプロトコールは、当業者および本明細書の教示の範囲内の日常的手順である。
本実施形態の一態様では、トランスフェクションと呼ばれる化学物質介在法は、改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に形質導入するために使用される。トランスフェクションの化学物質介在法では、化学試薬は、細胞への取り込みを促進する複合体を核酸と形成する。そのような化学試薬として、非限定的に、リン酸カルシウム介在、例えばMartin Jordan & Florian Worm, Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium Phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004)を参照されたい；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン介在、脂質介在、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在およびポリリジン介在およびポリブレン介在などのカチオン性ポリマー介在が挙げられる。例えばChun Zhang et al., Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to Brain-Derived Cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)を参照されたい。そのような化学物質介在送達系は、標準的方法によって調製でき、商業的に入手できる。例えばＣＥＬＬＰＨＥＣＴ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）；Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ、（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）；ＥＸＧＥＮ ５００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｉｎｃ．、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＭＤ、ＵＳＡ）、およびＳＵＰＥＲＦＥＣＴ ａｎｄ ＥＦＦＥＣＴＩＮＥ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を参照されたい。
本実施形態の別の態様では、物理介在方法は、改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。物理的技術として、非限定的に、電気穿孔法、微粒子銃および微量注入が挙げられる。微粒子銃および微量注入技術は、核酸分子を細胞に導入するために細胞壁を穿孔する。例えばBiewenga et al., J. Neurosci. Methods, 71(1), 67-75 (1997);およびO'Brien et al., Methods 33(2), 121-125 (2004)を参照されたい。電気穿孔法は、電気透過処理（electro permeabilization）とも呼ばれ、それを通じて核酸分子が進入する一過的なポアを膜に創出するために短時間の高電圧電気的パルスを使用し、すべての細胞型の安定および一過性の形質移入のために有効に使用され得る、例えばM. Golzio et al., 33(2) Methods 126-135 (2004);およびGresch et al., 33(2) Methods 151-163 (2004)を参照されたい。
本実施形態の別の態様では、形質導入と呼ばれるウイルスが介在する方法は、改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチド分子を細胞に導入するために使用される。一過的な形質導入のウイルス介在法では、ウイルス粒子が宿主細胞に感染および増幅する工程は、核酸分子を細胞に導入するためにこの機構を使用するために操作されている。ウイルス介在法は、非限定的に、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルスおよびバキュロウイルスを含む多種多様なウイルスから開発されており、例えば、Blesch et al., 33(2) Methods 164-172 (2004);およびFederico et al., 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); Poeschla et al., 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Benihoud et al., 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); Bueler et al., 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Lai et al., 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Burton et al., 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Grandi et al., 33(2) Methods 179-186 (2004); Frolov et al., 93(21) PNAS USA 11371-11377 (1996); Ehrengruber et al., 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Kost et al., 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (2002);およびHuser et al., 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)を参照されたい。
無エンベロープ、２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、アデノウイルスが約３６ｋｂの比較的大きいポリヌクレオチド分子を扱い、高力価で産生され、多種多様な分裂および非分裂細胞の両方に効率的に感染できることから、哺乳動物細胞形質導入のためにしばしば選択される。例えば、Hermens et al., 71(1) J. Neurosci. Methods 85-98 (1997); and Mizuguchi et al., 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001)を参照されたい。アデノウイルスに基づく系を使用する形質導入は、核酸分子が、宿主細胞染色体に組み込まれるよりもむしろ細胞核中のエピソームから運ばれることから、長期にわたるタンパク質発現は支持しない。アデノウイルスベクター系およびそのようなベクターをどのように使用するかについての具体的なプロトコールは、例えば、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ ２５−０５４３ ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．；およびＡＤＥＡＳＹ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＡＤＥＡＳＹ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．に開示されている。
ポリヌクレオチド分子送達は、１本鎖ＲＮＡレトロウイルス、例えば、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスなども使用し得る。レトロウイルス介在形質導入は、１００％近くの形質導入効率をしばしばもたらし、感染効率（ＭＯＩ）を変更することによってプロウイルスコピー数を容易に調節でき、一過的にまたは安定にのいずれかで細胞を形質導入するために使用され得る。例えば、Tonini et al., 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Blesch et al., 33(2) Methods 164-172 (2004); Recillas-Targa et al., 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004);およびWolkowicz et al., 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)を参照されたい。レトロウイルス粒子は、脂質エンベロープに囲まれたタンパク質カプシド中にパッケージされたＲＮＡゲノムからなる。レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写酵素と共に細胞質に注入することによって宿主細胞に感染する。次にＲＮＡ鋳型は、直鎖、２本鎖ｃＤＮＡに逆転写され、宿主細胞ゲノムに組み込むことによってそれ自体が複製する。ウイルス粒子は、垂直に（プロウイルスを介して親細胞から娘細胞に）および水平に（ビリオンを介して細胞から細胞に）の両方で伝播される。この複製戦略は、目的の核酸分子が宿主細胞の染色体に安定に組み込まれ、それによりタンパク質の長期間の発現を可能にすることから、長期間の持続的な発現を可能にする。例えば、動物実験は、種々の組織に注入されたレンチウイルスベクターが１年を超えて維持されたタンパク質発現をもたらしたことを示した、例えばNaldini et al., 272(5259) Science 263-267 (1996)を参照されたい。例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）などのオンコレトロウイルス由来ベクター系は、広く使用され、多数のさまざまな非分裂細胞に感染する。レンチウイルスも分裂および非分裂細胞を含む多数のさまざまな細胞型に感染でき、高度に特異的な細胞標的化を可能にする複合体エンベロープタンパク質を有する。
レトロウイルスベクターおよびそのようなベクターをどのように使用するかについての具体的なプロトコールは、例えば、米国特許第５，４６４，７５８号；米国特許第５，８１４，６１８号；米国特許第５，５１４，５７８号；米国特許第５，３６４，７９１号；米国特許第５，８７４，５３４号；および米国特許第５，９３５，９３４号に開示されている。さらに、そのようなウイルス送達系は、標準的方法により調製でき、商業的に入手できる。例えばＢＤ（商標）ＴＥＴ−ＯＦＦ ａｎｄ ＴＥＴ−ＯＮ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＢＤ（商標）ＴＥＴ−ＯＦＦ ａｎｄ ＴＥＴ−ＯＮ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ Ａ Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ Ｄ，２５−０３１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（Ｎｏｖ．４，２００２）；ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．；およびＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
本明細書において開示される方法は、一部において、ポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を発現することを含む。種々の発現系のいずれも、本明細書において開示されるポリヌクレオチド分子から改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を発現するために有用であり得ることが想定され、非限定的に細胞ベース系および無細胞発現系を含む。細胞ベースの系として、非限定的に、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳動物発現系が挙げられる。無細胞系として、非限定的に、コムギ胚芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物および大腸菌抽出物が挙げられ、一般に本明細書に開示される方法と等価である。発現系を使用するポリヌクレオチド分子の発現は、非限定的に、誘導性発現、非誘導性発現、構成的発現、ウイルス介在発現、安定に組み込まれた発現および一過的発現が挙げられる種々の特徴のいずれも含み得る。十分に特徴付けられたベクター、試薬、条件および細胞を含む発現系は、十分に確立され、非限定的に、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．；ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆが挙げられる商業的供給者から容易に入手可能である。適切な異種発現系の選択および使用についての非限定的例は、例えば、PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S. J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999);およびRai et al., 80(9) Curr. Sci. 1121-1128, (2001)に記載されている。これらのプロトコールは、当業者および本明細書の教示の十分に範囲内の日常的手順である。
種々の細胞ベースの発現手順は、本明細書において開示されるポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を発現するために有用である。例として、非限定的に、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系および哺乳動物発現系が挙げられる。ウイルス発現系として、非限定的に、ｔｈｅ ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＡＤＥＡＳＹ（商標）ＸＬ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｔｈｅ ＶＩＲＡＰＯＲＴ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。原核細胞発現系の非限定的例として、ｔｈｅ ＣＨＡＭＰＩＯＮ（商標）ｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ｔｈｅ ＴＲＩＥＸ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ｔｈｅ ＱＩＡＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）およびｔｈｅ ＡＦＦＩＮＩＴＹ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。酵母発現系として、非限定的に、ｔｈｅ ＥＡＳＹＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＹＥＳ−ＥＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびｔｈｅ ＳＰＥＣＴＲＡ（商標）Ｓ．ｐｏｍｂｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。バキュロウイルス発現系の非限定的例として、ｔｈｅ ＢＡＣＵＬＯＤＩＲＥＣＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）およびｔｈｅ ＢＤ ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）が挙げられる。昆虫発現系として、非限定的に、ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＥＳ（登録商標））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．），ＩＮＳＥＣＴＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびＩＮＳＥＣＴＤＩＲＥＣＴ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ）が挙げられる。哺乳動物発現系の非限定的例として、ｔｈｅ Ｔ−ＲＥＸ（商標）（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＦＬＰ−ＩＮ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＰＣＤＮＡ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ｐＳｅｃＴａｇ２ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＥＸＣＨＡＮＧＥＲ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＮＴＥＲＰＬＡＹ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴＡＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（登録商標）ＩＩ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。
本明細書において開示されるポリヌクレオチド分子によってコードされる改変クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を発現する別の手順は、無細胞発現系、例えば、非限定的に、原核生物抽出物および真核生物抽出物などを使用する。原核細胞抽出物の非限定的例として、ｔｈｅ ＲＴＳ １００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、ｔｈｅ ＡＣＴＩＶＥＰＲＯ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、ｔｈｅ ＥＣＯＰＲＯ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ （ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびｔｈｅ ＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）Ｐｌｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。真核細胞抽出物として非限定的に、ｔｈｅ ＲＴＳ １００ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ ＣＥＣＦ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、ｔｈｅ ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）、ｔｈｅ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ ＩＶＴ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．），ｔｈｅ Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、ｔｈｅ ＰＲＯＴＥＩＮＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）およびｔｈｅ ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。
コドン最適化配列
前述の核酸配列およびベクターのコドン最適化配列が本明細書に含まれる。宿主細胞、例えば大腸菌などの細菌または昆虫Ｈｉ５細胞における発現のためのコドン最適化は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ、ＵＳＡから自由に入手可能であるコドン最適化ツール（ＣＯＤＯＮＯＰＴ）を使用して実施され得る。
組成物
本開示の実施形態は、その断片または変種を含む１つまたは複数のクロストリジウム毒素および担体を含有する組成物にさらに関する。さらなる実施形態は、その断片または変種を含む１つまたは複数のクロストリジウム毒素をコードする核酸、コドン最適化核酸、ベクターおよび産生系、例えば宿主細胞を含む組成物に関する。さらに、本開示の実施形態はその断片または変種を含む１つまたは複数のクロストリジウム毒素に、特異性を有して結合する抗体を含む組成物に関する。
一態様では本開示は、薬学的に許容される医薬組成物に関する。本明細書において使用される、用語「薬学的に許容される」は、個体に投与された場合に有害、アレルギー性または他の都合が悪いもしくは望ましくない反応を生じない任意の分子実体または組成物を指す。本明細書において使用される、用語「薬学的に許容される組成物」は、「医薬組成物」と同義であり、例えば、本明細書において開示されるクロストリジウム毒素、断片、変種またはキメラのいずれかなどの活性成分の治療有効濃度を指す。クロストリジウム毒素もしくはクロストリジウム毒素断片またはその変種を含む医薬組成物は、医学的および獣医学的適用のために有用である。医薬組成物は、患者に単独で、または他の補充活性成分、薬剤、薬物もしくはホルモンとの組み合わせで投与され得る。医薬組成物は非限定的に、従来の混合、溶解、顆粒化、粉末化、乳化、被包、封入および凍結乾燥を含む種々の工程のいずれかを使用して製造され得る。医薬組成物は、非限定的に、滅菌溶液、懸濁物、乳液、凍結乾燥物、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、粉剤、シロップ、エリキシル剤または投与のために好適な任意の他の投薬形態を含む種々の形態のいずれかを取り得る。
本明細書において開示されるクロストリジウム毒素またはクロストリジウム毒素断片または変種を含む医薬組成物が、薬学的に許容される組成物への活性成分の加工を促進する薬学的に許容される担体を含んでよいことも想定される。本明細書において使用される、用語「薬学的に許容される担体」は、投与された場合に、長期間または持続的な有害作用を実質的に有さない任意の担体を指し、「薬学的に許容されるビヒクル、安定剤、希釈剤、添加剤、補助剤または賦形剤」などの用語を包含する。そのような担体は、一般に、活性化合物と混合される、または活性化合物を希釈もしくは封入することを可能にし、固体、半固体もしくは液剤であってよい。活性成分が可溶性であり得る、または所望の担体もしくは希釈剤中の懸濁剤として送達され得ることは理解される。種々の薬学的に許容される担体のいずれも、非限定的に、例えば、水、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸などの水性媒体；例えば、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどの固体担体；溶媒；分散媒；コーティング剤；抗菌および抗真菌剤；等張および吸収遅延剤；または任意の他の不活性成分を含め、使用され得る。薬理学的に許容される担体の選択は、投与の様式に依存し得る。任意の薬理学的に許容される担体が活性成分と不適合性である場合を除いて、薬学的に許容される組成物におけるその使用は、検討される。そのような医薬用担体の具体的な使用の非限定的例はPHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); GOODMAN & GILMAN’S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001);およびHANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)に見出し得る。これらのプロトコールは、日常的手順であり、任意の変更は、当業者および本明細書の教示の十分に範囲内である。
本明細書において開示される医薬組成物が、非限定的に、緩衝剤、保存剤、浸透圧調整剤、塩、抗酸化物質、浸透圧調整剤、生理学的物質、薬理学的物質、バルク剤、乳化剤、湿潤剤、甘味剤または香味料剤などを含む、他の薬学的に許容される構成成分（または医薬用構成成分）を非限定的に含んでよいことがさらに想定される。種々の緩衝剤およびｐＨを調整するために参照されるものは、得られる調製物が薬学的に許容される限り、本明細書において開示される医薬組成物を調製するために使用され得る。そのような緩衝剤として、非限定的に、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水およびホウ酸緩衝剤が挙げられる。必要に応じて酸または塩基が組成物のｐＨを調整するために使用され得ることは理解される。薬学的に許容される抗酸化物質として、非限定的に、二亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチルヒドロキシアニソールおよびブチルヒドロキシトルエンが挙げられる。有用な保存剤として、非限定的に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安定化オキシクロロ組成物、例えばＰＵＲＩＴＥ（登録商標）ならびにケラント（chelant）、例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミド、カルシウムＤＴＰＡおよびＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなどが挙げられる。医薬組成物において有用な浸透圧調整剤として、非限定的に、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、マンニトールまたはグリセリンおよび他の薬学的に許容される浸透圧調整剤が挙げられる。医薬組成物は、塩として提供されてよく、これだけに限らないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸およびコハク酸を含む多数の異なる酸を用いて形成され得る。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基形態よりもさらに可溶性である傾向がある。薬理学の技術分野において周知のこれらおよび他の物質が、明細書において有用な医薬組成物に含まれ得ることは理解される。
一実施形態では、組成物は、クロストリジウム毒素またはクロストリジウム毒素断片もしくは変種および粘稠担体を含む。「粘稠担体」は、ボツリヌス神経毒と共に製剤化された場合に製剤のｉｎ ｖｉｖｏにおける局所的注射で、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種が、局所的注射の部位から離れたクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の拡散の程度および／または局所的注射の部位から離れて拡散するクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の量が、顕著に低減するような量で放出される、デポーを提供する生体適合性化合物を意味する。任意の好適な粘稠担体、例えば、眼科に（ophthalmically）許容可能な粘稠担体は、本開示により使用され得る。粘稠担体は、薬物送達系に所望の粘度をもたらすために有効な量で存在する。有利には、粘稠担体は、薬物送達系の約０．５質量％〜約９５質量％の範囲の量で存在する。使用される粘稠担体の具体的な量は、例えば非限定的に、使用される具体的な粘稠担体、使用される粘稠担体の分子量、産生されるおよび／または使用される本薬物送達系のために望ましい粘度などを含む多数の要因に依存する。
有用な粘稠担体の例として、これだけに限らないが、ヒアルロン酸、カルボマー、ポリアクリル酸、セルロース誘導体、ポリカルボフィル、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デキストリン、多糖、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ヘパリン、プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）、これらの誘導体およびこれらの混合物が挙げられる。粘稠担体の代表的な種類は、米国特許第９，０４４，４７７号；米国特許第９，６２２，９５７号；米国特許第９，０５０，３３６号に開示されている。
皮膚注入剤も粘稠担体として使用され得る。この目的のために好適な皮膚注入剤として、コラーゲン（滅菌コラーゲンは、商標ＺＹＤＥＲＭ、ＺＹＰＬＡＳＴ、ＣＯＳＭＯＤＥＲＭ、ＣＯＳＭＯＰＬＡＳＴおよびＡＵＴＯＬＧＥＮとして販売されている）、ＨＹＬＡＦＯＲＭ（登録商標）（ヒアルロン酸）、ＲＥＳＴＹＬＡＮＥ（登録商標）（ヒアルロン酸）、ＳＣＵＬＰＴＲＡ（商標）（ポリ乳酸）、ＲＡＤＩＥＳＳＥ（商標）（ヒドロキシルアパタイトカルシウム）およびＪＵＶＥＤＥＲＭ（商標）が挙げられる。Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手可能であるＪＵＶＥＤＥＲＭ（商標）は、生理的緩衝液中に２４ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化された、架橋ヒアルロン酸からなる滅菌、生分解性、非発熱性、粘弾性、透明、無色、均質化ゲルを含む。皮膚注入剤の代表的な種類は、米国特許第９，６２２，９５７号；米国特許第９，１６１，９７０号；米国特許第９，０５０，３３６号に開示されている。
現在有用な粘稠担体の分子量は、約１０，０００ダルトン以下〜約２００万ダルトン以上の範囲であり得る。特に有用な一実施形態では、粘稠担体の分子量は、約１００，０００ダルトンまたは約２００，０００ダルトン〜約１００万ダルトンまたは約１５０万ダルトンの範囲である。再度、本開示により有用な粘稠担体の分子量は、使用される粘稠担体の種類および課題の現在の薬物送達系の望ましい最終粘稠度、ならびに場合により他の要因に基づいて相当な範囲にわたって変動する場合がある。
非常に有用な一実施形態では、担体は、例えば、好ましくはアルカリ金属ヒアルロン酸塩、アルカリ土類金属ヒアルロン酸塩およびこれらの混合物から選択される金属ヒアルロン酸塩構成成分、ならびにさらにより好ましくはヒアルロン酸ナトリウムおよびその混合物から選択されるポリマー性ヒアルロン酸塩構成成分である。そのようなヒアルロン酸塩構成成分の分子量は、好ましくは約５０，０００ダルトンまたは約１００，０００ダルトン〜約１３０万ダルトンまたは約２００万ダルトンの範囲である。一実施形態では、本組成物は、約０．０５％〜約０．５％（ｗ／ｖ）の範囲の量のポリマー性ヒアルロン酸塩構成成分を含む。さらに有用な実施形態では、ヒアルロン酸塩構成成分は、組成物の約１％〜約４％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在する。後者の場合、非常に高いポリマー粘度は、薬物送達系の推定保存期間、例えば少なくとも約２年間にわたって再懸濁処置がしばしば必要ない程度に粒子沈降速度を遅らせるゲルを形成する。そのような薬物送達系は、ゲルがバルク容器から針およびシリンジによって容易に移すことができないことから、予め充填されたシリンジで市販され得る。
別の実施形態では、担体は、例えば、米国特許第９，１０７，８１５号に記載されているポロクサマー−４０７などの熱可逆性ゲル化剤である。熱可逆性ゲルを含むそのような組成物は、注射後に粘度が急速に増加する低粘度液体として投与（注射によって）され得る。得られる高粘度マトリックスは、粘着性、生分解性および生体適合性であり、投与されて、ボツリヌス毒素が放出され得るデポーを形成し、それにより徐放または持続放出薬物送達系を提供する。この様式では、低用量のボツリヌス毒素が使用され得る。そのような医薬組成物は、予め混合されて、または簡単な復元ビヒクルもしくは二重チャンバーシリンジの使用によって、投与時に合わせる数個のコンパートメントとして投与され得る。熱可逆性ゲル化剤の代表的な種類は、例えば、米国特許第８，１６８，２０６号；米国特許第８，６４２，０４７号；および米国特許第９，２７８，１４０号に開示されている。
一部の実施形態では、関節におけるクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の滞留時間を増加させるために、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を封入しているポリマー性マトリックスを含む放出制御系において提供され、ここで、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の一部の量は、ポリマー性マトリックスから長期間、調節された様式で放出される。放出制御神経毒系は、例えば米国特許第６，５８５，９９３号；米国特許第６，５８５，９９３号；米国特許第６，３０６，４２３号；および米国特許第６，３１２，７０８号に開示されている。
一実施形態では、本開示は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む局所組成物に関する。代表的な例として、商業的に入手可能なイオン性ナノ粒子技術、ＩＮＰＡＲＴ（登録商標）（Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＩ、ＵＳＡ）を介して送達される、ＢｏＮＴ／Ａ断片、例えば、クロストリジウム毒素またはその変種の全長重鎖（ＨC）もしくはそのＮ末端ドメイン（ＨCN）を含む局所クリームが例えば挙げられる。米国特許第７，８３８，０１１号；米国特許第７，７２７，５３７号；米国特許第８，５６８，７４０号を参照されたい。
局所投与のための医薬化合物および製剤として、軟膏、ローション（例えば、スキンケアローション）、クリーム、ゲル、滴下剤、座薬、スプレー、液剤および粉剤が挙げられる。従来の医薬用担体、水性、粉剤または油性基剤、増粘剤などは、使用され得る。好ましい局所製剤は、本発明の化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されるものを含む。好ましい脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本開示のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、リポソーム内に封入され得る、または具体的にはカチオン性リポソームに複合体形成できる。代替的に、化合物は、脂質と、具体的にはカチオン性脂質と複合体化できる。好ましい脂肪酸およびエステルは、これだけに限らないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン（dilaurin）、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ1-10アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはこれらの薬学的に許容される塩を含む。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されている。
別の実施形態では、本開示は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む経皮組成物に関し、より具体的には皮膚または上皮を通じたクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の輸送または送達を可能にする（「経皮送達」とも称される）組成物に関する。そのような組成物は、本明細書に記載のとおり種々の治療、審美および／または美容目的のためにボツリヌス毒素を対象に提供するための局所適用として使用され得る。例えば、局所送達用組成物は、毒素が筋肉および／または他の皮膚関連構造に経皮投与されるように、効率基（efficiency group）を有する正に荷電した担体分子を含んでよい。輸送は、ボツリヌス毒素の共有結合修飾を伴うことなく生じる。例示的組成物および送達系は、Ｒｅｖａｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって開発されたパッチに提供される。例えば、米国特許第８，５６８，７４０号；米国特許第８，５１８，４１４号；米国特許第９，１８０，０８１号；米国特許第８，４０４，２４９号；米国特許第８，９６２，５４８号；米国特許第９，２１１，２４８号；米国特許第８，３９８，９９７号；米国特許第８，９７４，７７４号；米国特許第８，９２６，９９１号；および米国特許第８，０９２，７８８号。米国特許第８，４０４，２４９号；米国特許第９，１４４，６９２号；および米国特許第７，７０４，５２４号も参照されたい。一実施形態では、経皮送達系は、パッチである。経皮パッチは、ヒトの皮膚に適用される粘着層、医薬用薬剤を保持するためのデポーまたはリザーバー、およびデポーからの医薬品の漏出を予防するための外側表面を有するとして一般に特徴付けられる。パッチの外側表面は、典型的には非粘着性である。本開示により、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、神経毒が長期にわたって安定なままであるようにパッチに組み入れられる。クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を安定化し、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をマトリックスおよびパッチから拡散するようにするポリマー性マトリックスに組み入れられてよい。本開示の一実施形態では、毒素および増強剤を含有する組成物は、粘着性パッチ中に提供される。クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、パッチが皮膚に適用されると、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種が皮膚を通じて拡散できるように、パッチの粘着層にも組み込まれ得る。タンパク質の送達のための粘着性パッチの例は、十分周知である。例えば、米国特許第２９６，００６号（意匠特許）；米国特許第６，０１０，７１５号；米国特許第５，５９１，７６７号；米国特許第５，００８，１１０号；米国特許第５，６８３，７１２号；米国特許第５，９４８，４３３号；および米国特許第５，９６５，１５４号を参照されたい。一部の実施形態では、パッチは、脂質小胞を含み得る（米国特許第６，１６５，５００号を参照されたい）。一部の実施形態では、パッチは、本開示のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードする核酸を含むベクターを用いて形質転換されたフィルム・クニダリア（例えば、アイプタシア種）に属する生物の刺胞細胞（具体的には、刺胞細胞、刺細胞またはフィコサイト）を含み得る。一部の実施形態では、パッチは、本開示のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を、分化した細胞、例えば刺胞細胞において発現するフィルム・クニダリアのトランスジェニック生物を含み得る。
キット
本開示の別の態様は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種をコードする核酸含むクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種、またはクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種に結合する抗体および手引き書を含むキットに関する。一実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、免疫原性組成物の一部である。別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、コンジュゲート、例えばタグ化タンパク質の一部である。本明細書において使用される「手引き書」は、対象における障害を診断、画像処理、処置、軽快、緩和、抑制、予防または低減することについての、または本明細書に記載の経路を介してそのような組成物を投与することについてのクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の有用性を伝えるために使用される、刊行物、記録、図表または任意の他の表現手段を含む。手引き書は、例えばクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の適切な用量も記載できる。本開示のキットの手引き書は、例えば、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含有する容器に添付され得る、あるいはクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含有する容器と共に輸送され得る。代替的に、手引き書は、手引き書および改変されるＢｏＮＴ／Ａポリペプチドが受取人によって協同的に使用される目的で容器とは別に輸送され得る。
本開示は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種およびポリペプチドを対象に送達するための送達デバイスを含むキットも含む。例示の方法によって、送達デバイスは、押しつぶし可能なスプレーボトル、定量スプレーボトル、エアロゾルスプレーデバイス、噴霧器、ドライパウダー送達デバイス、自己推進（self-propelling）溶媒／散剤調剤デバイス、シリンジ、針、タンポンまたは投薬量測定容器であり得る。キットは、本明細書に記載の手引き書をさらに含み得る。
典型的には、容器は、１つまたは複数の製剤ならびに復元および／または使用のための指示を示し得る容器の上または容器に伴うラベルを有し得る。例えば、ラベルは、製剤が上に記載の濃度に復元されることを指示できる。ラベルは、製剤が、例えば皮膚投与のために有用である、または皮膚投与用であることをさらに指示できる。一部の実施形態では、容器は、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含有する安定な製剤の単一用量を含有できる。種々の実施形態では、安定製剤の単一用量は、約０．５ｍｌ未満の体積で存在する。代替的に、製剤を保持する容器は製剤の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。キットまたは他の製造物品は、好適な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、生理食塩水、緩衝生理食塩水）を含む第２の容器をさらに含んでよい。希釈剤と製剤との混合において、復元された製剤中の最終ポリペプチド濃度は、一般に、少なくとも１ｐｇ／ｍｌ（例えば、少なくとも５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５００ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも３ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまたはこれを超える）である。キットまたは他の製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための説明書を含む添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでよい。一部の実施形態では、キットまたは他の製造物品は、投与のための説明書を含んでよい。
デバイスおよび系
本開示の実施形態は、その断片または変種を含むクロストリジウム毒素を含むデバイスおよび／または系にさらに関する。送達系の代表的例として、例えば、破傷風およびボツリヌス抗毒素を含む種々のタンパク質薬の封入および管理された送達のためのポリエーテルエステル共重合体ミクロスフェア（米国特許第５，９８０，９４８号を参照されたい）；ボツリヌス毒素を含有する別々の領域を含有する生分解性ポリマーの連続的マトリックスを含む球状微粒子（米国特許第５，９０２，５６５号）が挙げられる。別の実施形態では、送達系として、数日間から数年間の範囲の期間にわたる神経毒のパルス状または連続的ｉｎ ｖｉｖｏ放出のためのインプラントが挙げられる（例えば、米国特許第６，３８３，５０９号；米国特許第６，５０６，３９９号；米国特許第６，３１２，７０８号；米国特許第６，５８５，９９３号；および米国特許第６，３０６，４２３号を参照されたい）。本明細書において使用される「インプラント」は、放出制御（例えば、パルス状または連続的）組成物または薬物送達系全般に関する。インプラントは、例えば対象の身体に注射、挿入またはインプラントされ得る。インプラントは、数日間から１年間またはそれを超えて、例えば、７日間、１５日間、３０日間、１カ月、３カ月、６カ月、１年間またはそれを超えて投与され得る。
具体的な一実施形態では、本明細書は、クロストリジウム毒素を対象の皮膚に送達するための送達系が提供される。ヒトの皮膚は、２つの異なる層を有し、身体の領域に応じて厚さが約１．５〜約４ｍｍ以上に変化する。第１の層は、表皮と呼ばれる表層である。それは、比較的厚い上皮である。表皮深くは真皮と呼ばれる第２の層である。真皮は、線維性結合組織であり、汗腺および、汗腺を神経支配する神経または神経末端を含む。皮膚のすぐ下に、皮下層の一部とも考えられる場合がある皮下組織と呼ばれる脂肪層がある。皮下組織または皮下層の真下に、身体の特殊化した構造、例えば筋肉の深部筋膜外皮（deep fascial investment）がある。
したがって、一実施形態では、送達は、クロストリジウム毒素、またはクロストリジウム毒素をコードするＤＮＡを、動物またはヒト対象の組織に送達する。一実施形態では、クロストリジウム毒素は、神経末端が見出される皮膚の層に送達される。例えば、送達は、真皮層への送達である。別の実施形態では、送達は、皮膚の少なくとも１つの層に、実質的にはその真下の組織への送達である。例えば、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種は、皮膚の真皮層および皮下層に送達される。別の実施形態では、クロストリジウム毒素は、皮膚に、およびその真下の筋肉組織に送達される。さらに別の実施形態では、クロストリジウム毒素は、実質的に筋肉組織に送達される。
担体ならびにクロストリジウム毒素および／またはクロストリジウム毒素をコードするＤＮＡを含む組成物の部位への送達は、当技術分野において周知の任意の手段、例えば、針に基づく送達方法または無針送達方法を介して達成され得る。
一実施形態では、組成物は、無針送達を介して送達される。無針注射器およびそれらの使用は、当技術分野において十分周知である。例えば、無針注射器を開示する米国特許第６，０５３，８８９号；米国特許第６，０１３，０５０号；米国特許第６，０１０，４７８号；米国特許第６，００４，２８６号および米国特許第５，８９９，８８０号を参照されたい。一実施形態では、無針注射器は、細長い管状のノズルを含み、皮膚表面に向けておよび皮膚表面中に中速から高速に加速する超音速ガス流、例えばヘリウムのバーストを産生するための好適な活性化手段に連結されているまたは連結を可能にする。そのようなデバイスは、ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫから購入できる。一実施形態では、提供されるガス圧は、標的部位、例えば真皮に組成物を発射するために十分でなければならないが、標的を損傷するほど大きくない。別の実施形態では、提供されるガス圧は、標的部位、例えば真皮に組成物を送達するために十分であるが、皮膚表面、例えば上皮を損傷するほど大きくない。別の実施形態では、ガス圧は、真皮層に組成物を送達するためには十分であるが、その下の層、例えば皮下層および／または筋肉組織へは十分でない。別の実施形態では、提供されるガス圧は、標的部位、例えば真皮および／または実質的にその下の筋肉組織に薬物粒子を発射するために十分でなければならないが、皮膚表面を損傷するほど大きくない。
無針注射器を使用することの有利点として、例えば、特定の組織層、例えば真皮層への最適送達が挙げられる。さらに、送達が真皮への送達であり、筋肉組織への送達ではない場合、処置は、処置される領域での運動機能の喪失を生じない。同様に、無針注射器の使用は、針での事故による外傷から、または液体ジェット式注射器からの体液のスプラッシュバックの可能性からの感染のリスクを除外し、それによりＨＩＶおよび肝炎Ｂなどの血液媒介病原体の相互汚染の可能性を回避することによって臨床的安全性を改善する。無針注射器は、わずかな疼痛および、内出血または出血などの皮膚損傷を伴って状態を処置するために、薬物粒子の最適で特異的な送達も提供する。精製されたクロストリジウム毒素を含有する無針系は、米国特許第７，２５５，８６５号に開示されている。
別の実施形態では、本開示は、クロストリジウム毒素および担体を含む針に基づく系にさらに関する。注射系の代表的な種類は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第８，６０３，０２８号（角度を付けた先端部分を有する注射デバイスに関する）；米国特許第８，８０１，６５９号（軟部組織に粘稠剤を送達するための注射デバイスに関する）。特定の実施形態では、組成物は、伝統的送達系、例えばシリンジ、カテーテール、針および他のデバイスを介して部位に注射され得る。
投薬量
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、クロストリジウム毒素またはその断片の有効量を含有する。用語「有効量」は、状態を処置することに関して使用される場合、症状を、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％まで処置するために十分な用量であり得る。結合ドメイン（および／またはその断片、だけを含むクロストリジウム毒素の文脈では、投与される実際の量は、患者の年齢および体重、患者の全身健康状態および投与経路を含む関連環境を考慮して医師によって決定されて、用量は一般に０．１〜１０００ｍｇ／日の範囲内であり、例えば１〜５００ｐｇ／日、１００〜５０００ｐｇ／日、１〜５００ｎｇ／日、１００〜５０００ｎｇ／日、１〜５００μｇ／日、１００〜５０００μｇ／日、５〜１０００ｍｇ／日、１０〜５００ｍｇ／日、２０〜５００ｍｇ／日、５０〜５００ｍｇ／日、１０〜２００ｍｇ／日、１０〜１００ｍｇ／日または１００〜５００ｍｇ／日の範囲内である。繰り返し投与が使用される場合、投与の頻度は、一部において、医薬組成物の半減期に依存する。
別の実施形態では、製剤中のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の濃度は、毒素約１ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌ、毒素１ｎｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲、例えば、毒素約１０ｎｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、毒素１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、毒素２００ｎｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、毒素２００ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌまたは毒素１０００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであってよい。別の実施形態では、製剤中のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の濃度は、毒素約１ｐＭ〜５００ｐＭ、０．１ｎＭ〜５００μＭ、１．０ｎＭ〜５００μＭ、１．０ｎＭ〜１００μＭ、１．０ｎＭ〜５０μＭ、１．０ｎＭ〜１０μＭ、１．０ｎＭ〜５００ｎＭ、１．０ｎＭ〜１００ｎＭ、１．０ｎＭ〜１０ｎＭ、１０ｎＭ〜１００μＭ、１０ｎＭ〜５０μＭ、１０ｎＭ〜１０μＭ、１０ｎＭ〜５μＭ、１０ｎＭ〜１μＭ、５０ｎＭ〜５００μＭ、５０ｎＭ〜１００μＭ、５０ｎＭ〜１０μＭ、５０ｎＭ〜１μＭ、５０ｎＭ〜５００ｎＭ、５０ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜１０μＭ、１０ｎＭ〜１０μＭ、２０ｎＭ〜１０μＭ、１００ｎＭ〜１０μＭ、１μＭ〜１ｍＭ、１μＭ〜５００μＭ、１μＭ〜５００μＭ、５μＭ〜５００μＭ、１０μＭ〜１００μＭ、１ｎＭ〜５００μＭ、１０ｎＭ〜１００μＭ、１０ｎＭ〜１０μＭ、２０ｎＭ〜１μＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１０ｎＭ〜１００ｎＭ、２０ｎＭ〜５０ｎＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、３ｎＭ〜５０ｎＭの範囲であってよい。
投薬は、単一投薬または累積的（連続的投薬）であってよく、当業者によって容易に決定され得る。例えば、皮膚障害の処置は、本明細書に開示される組成物の有効用量の１回だけの投与を含み得る。非限定的例として、本明細書に開示される組成物の有効用量は、例えば、美容障害の症状を示している部位にまたはその近くに単回注射またはデポジション（deposition）として個体に１回投与され得る。代替的に、美容障害の処置は、例えば毎日、数日に１回、毎週、毎月または毎年などの期間の範囲にわたって実行される、本明細書に開示される組成物の有効用量の複数回投与を含み得る。非限定的例として、本明細書に開示される組成物は、個体に１年に１回または２回投与され得る。投与の時期は、個体の症状の重症度などの要因に応じて個体によって変動する場合がある。例えば、本明細書に開示される組成物の有効量は、不確定の期間についてまたは個体がもはや治療を必要としなくなるまで１カ月に１回個体に投与されてよい。当業者は、個体の状態は、処置の経過を通じてモニターされてよく、本明細書に開示される、投与される組成物の有効量はそれにより調整され得ることを認識する。
投与の経路
活性剤（例えば、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種）は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ方法、ならび全身性および局所性経路の投与を含む、薬物送達のために好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して個体に投与される。一実施形態では、その断片または変種を含むクロストリジウム毒素は、ボツリヌス毒素治療のために確立されたプロトコールにより投与される。用語「ボツリヌス毒素治療」は、非限定的に、ボツリヌス毒素またはそのドメインもしくは断片の任意の天然に存在する、または改変された、または操作された形態の、任意の製剤中、任意の担体または活性成分と組み合わされ、任意の投与経路によって投与される使用を包含する。
使用方法
美容適用
一実施形態では、本開示は、美容適用のためにクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を使用するための方法に関する。一実施形態では、組成物は、皮膚の特性または性状、例えば、透明感、潤い、上皮および真皮の厚み、感触、弾力、色、トーン、柔軟性、硬さ、タイトネス、滑らかさ、厚み、輝き、均一さ、緩み、顔色、小じわ、しわ、毛穴サイズまたは脂性を改善することに有用である。
別の実施形態では、組成物は、皮膚の前述の特性の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはすべてを改善することに有用である。
一実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、対象の皮膚の透明感を改善することに有用である。皮膚の透明感ならびに／または、そばかすおよび老人性色素斑の低減は、Ｍｉｎｏｌｔａ比色計を使用して評価され得る。測定は、顔の各側で行われ、左側および右側の顔の値として平均されてよい。皮膚の透明感も通常のＭｉｎｏｌｔａ Ｍｅｔｅｒを使用して測定され得る。測定値は、パラメーターの組合せであり、皮膚の明るさに関連し、皮膚の滑らかさおよび潤いと十分に相関する。Schwarb et al., Eur J Pharm Biopharm., 47(3): 261-7, 1999を参照されたい。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、皮膚の弾力および／または硬さを改善することに有用である。これらのパラメーターは、皮膚に小体を落とし、その最初の２回の跳ね返りピークを記録することによって皮膚の弾力および硬さを評価するデバイス、Ｈａｒｇｅｎｓバルリストメーターを使用して測定され得る。バルリストメーターは、比較的鈍い先端（４平方ｍｍ−接触面積）を有する小さく軽いプローブである。プローブは、皮膚にわずかに進入し、角質層および外表皮および真皮層の一部を含む皮膚の外側の層の特性に依存した測定値をもたらす。Hargens et al., Ballistometry, Handbook of Non-Invasive Methods and the Skin, 359-366, Cit-C Press, New York (1995)を参照されたい。代替的に、皮膚の弾力および／または硬さは、Bonaparte et al. (J Med Eng Technol., 37(3):208-12, 2013)に概説される方法を使用してＣｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ ５８０を用いて測定され得る。代表的な方法は、デバイス（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ）が、皮膚が変形した距離を経時的に測定し始める位置で皮膚に吸引圧を適用することを含む。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒは、弾性抵抗（Ｕｅ）および粘弾性抵抗（Ｕｖ）を提供する。いくらかの時間（例えば、３秒間）後、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ吸引圧は、除去され、皮膚の最大変形は、全体的な柔軟性（Ｕｆ）を算出するために測定される。次いで皮膚は反跳し、変化はＣｕｔｏｍｅｔｅｒによって測定される。吸引が適用されていない期間の終わりに、初期反跳弾性（Ｕｒ）および合計弾性反跳（Ｕａ）を測定し、それからＵｖ／Ｕｆ、Ｕａ／ＵｆおよびＵｒ／Ｕｆ比が算出される。Ｕｖ／Ｕｅ比は、吸引の際の皮膚の伸展に抵抗する２要素を表している。Bonaparte et al. (JAMA Facial Plast Surg., 17(4):256-63, 2015)
別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスケールを使用して日常的に評価され得る皮膚の色を改善することに有用である。Fitzpatrick et al., Archives of Dermatology, 124 (6): 869-871, 1988を参照されたい。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、皮膚の滑らかさおよび／または皮膚のトーンを改善することに有用である。これらのパラメーターは、臨床的分類技術を用いて評価され得る。皮膚の滑らかさの臨床的分類は、１０点アナログ数値スケール（ten-point analog numerical scale）を介して分析され得る。評価は、２名の医師によって独立に行われ、平均された。Sonti et al., Int J Cosmet Sci., 35(2), 156-162, 2013を参照されたい。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、当業者に周知の方法によって評価され得る皮膚の乾燥を低減することに有用である。例えば、皮膚乾燥の臨床的分類は、５点標準的クリグマンスケール（Kligman Scale）によって決定され得る（Kligman et al., J. Soc. Cosmet. Chem., 82, 171-177, 1987）。評価は、２名の医師によって独立に行われ、平均され得る。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、皮膚の滑らかさを改善するため、および／またはしわを低減することに有用である。これらのパラメーターもPackman et al. (J. Soc. Cosmetic Chem., 29:70, 1978)およびPackman et al. (J. Soc. Cosmetic Chem., 29:70, 1978)において開示される方法を使用することによって視覚的に評価され得る。例えば、各対象来診時に、各対象の顔表面の線（ＳＦＬ）の深さ、浅さおよび総数は、注意深くスコア化され、記録され得る。数値スコアは、数係数に深さ／幅／長さ係数を掛けることによって得られた。スコアは、目元および口元（左側および右側）について得られ、合計しわスコアとして合計される。
別の実施形態では、クロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含む組成物は、皮膚の柔らかさ／しなやかさ（suppleness）を改善することに有用である。これらのパラメーターは、ガスベアリング電流力計、皮膚のストレス／歪み特性を測定する装置を使用して評価され得る。Maes et al., Int J Cosmet Sci., 5(5):189-200, 1983を参照されたい。皮膚の粘弾性特性は、皮膚の保湿と相関する。測定は、予め決定された部位、例えば頬で、両面粘着テープを有するプローブを皮膚表面に付着させることによって得ることができる。およそ３．５グラムの力が皮膚表面に沿って適用され、皮膚の変位が正確に測定される。次いで皮膚のしなやかさを算出することができ、動ばね率（ＤＳＲ）として表される。
他の非限定的態様では、本開示の組成物の有効性は、例えば、ＥｐｉＤｅｒｍＦＴおよびＭＥＬＡＮＯＤＥＲＭ（商標）などの皮膚類似物を使用して評価され得る。類似物は、本開示の組成物を含有する種々の基剤を用いて、または対照としてビヒクルのみを用いて処置されてよい。本検査は、組成物の皮膚剥離能力を確認するためにも使用され得る。
前述の美容適用の実行において、顔面筋の麻痺を生じないクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を含有する組成物を使用することは有利である。
一部の実施形態では、本開示は、皮膚の脂性を低減するためにクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を使用するための方法に関する。本開示の方法の実行において、「脂性」の程度は、通常、対象の顔または毛髪での皮脂分泌の量の関数である。好ましくは、ＳＥＢＵＭＥＴＥＲ（登録商標）、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能なハンドヘルド電子診断用機器は、「グリーススポット測光法（grease spot photometry）」に基づいて「脂性」を測定するために使用される。さらに具体的には、一片のマットテープをホルダーから取り、皮膚または毛髪の表面に接触させて置く。指定時間接触させた後に、皮膚または毛髪での皮脂の量に応じてテープは透明になる。フォトセルを使用して、光の透過量は測定され、皮脂の量（すなわち、程度）と相関させる。Youn et al., Skin Res. Technol., 8(3), 168-72, 2002を参照されたい。（ＳＥＢＵＴＡＰＥ（登録商標）を含む皮脂レベルを算出するための他のデバイス、または同等の技術（例えば、ＳＥＢＵＦＩＸ（登録商標））も使用され得る。
代替的にまたはＳＥＢＵＭＥＴＥＲ（登録商標）を使用することに加えて、皮膚の「テカリ（shininess）」または光の反射（「脂性」を反映する）は、視覚的画像分析ソフトウェアを用いて測定され得る。本明細書において、皮膚の画像は、好ましくは洗浄の約２０分間後に捕捉され、画像は、画像化手段（例えば、ビデオまたは静止カメラ）を有する電子デバイスにアップロードまたは保存され、視覚的画像分析ソフトウェア（例えば、ＩＭＡＪＥＪ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用してスコア化される。
代替的に、皮膚の脂性は、ＳＥＢＵＴＡＰＥ（登録商標）（ＣｕＤｅｒｍ、Ｃｏｒｐ．、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して評価される。フィルムの一方の側は、サンプリング（すなわち、接触）期間中にフィルムが皮膚に添付されているようにする脂質多孔性接着剤がコートされている。皮脂が皮膚表面に達すると、それはフィルムに迅速に吸収される。マイクロキャビティ内の空気は、皮脂によって置き換えられる。皮脂で満たされたキャビティは、次いで透明になる。加えて、皮脂からの排出物は、液滴の体積に対応するサイズの「スポット」を形成する（Kligman et al., J. Soc. Cosmet. Chem., 37, 369-374, 1986）。Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚｋａ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能なＳＥＢＵＦＩＸ（登録商標）箔は、皮膚表面のマイクロポア内から皮脂を吸収し、皮脂をさまざまな「スポット」として示す。箔は、規定の期間にわたって皮脂産生を記録するビデオカメラに載せられる。
「脂性」は、体液（例えば、唾液もしくは口腔を覆う粘膜細胞）またはテープストリッピング法によって得られる角質層細胞の検体を採取すること、および皮脂産生の増加に関連する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを測定すること、ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または脂質含有量を評価する測定によっても評価され得る。
本開示の目的のために、「脂性」の程度は、好ましくは「わずかに脂性」または「非常に脂性」に識別され、「わずかに脂性」の皮膚は、有効な遮蔽バリア（occlusive barrier）、アレルゲンおよび刺激物の進入を妨げる保護コーティングを作るために最小限足りており、経皮的水分喪失を制限するが、テカリ、ざ瘡および／または不快な粘着性の感覚を生じる皮膚の表面上の皮脂の量ではない皮脂の量によって特徴付けられる。
好ましくは、皮脂含有量（好ましくは、ＳＥＢＵＭＥＴＥＲ（登録商標）を使用する）または皮膚のテカリ（視覚画像分析を使用する）の１つまたは両方の測定に加えて、脂性は、（ａ）双方向性電子デバイス、コンピューター処理デバイス（タブレットもしくはスマートフォンを含む）を使用して消費者によって自己管理され得る、または（ｂ）訓練を受けたスキンケアの専門家、であり得る臨床的に検証された評価ツール（例えば、質問票）を使用しても評価される。臨床的に検証された質問票の２つの非限定的例は、次の刊行物：Baumann, et al., Journal of Cosmetics, Dermatological Sciences and Applications, 4, 78-84, 2014；および米国特許第９，７２４，２８７号に記載されている（３４〜４４の間のスコアは、「非常に脂性」の皮膚であることを示し；２７〜３３の間のスコアは、「わずかに脂性」の皮膚を示す）。
代替的に本開示の文脈では、皮膚は、皮膚表面の潤いによる比誘電率の変化に基づいて測定され得る皮膚の潤い状態に基づいて「乾燥」として分類される場合がある。好ましくは、皮膚の潤いは、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲ（登録商標）、ハンドヘルドプローブを用いて測定される。
皮膚障害の処置
皮膚は、２つの主要な層、ケラチノサイトによって主に作られている外表皮層および線維芽細胞によって主に作られている真皮間層（inter dermis layer）を有する。表皮は、病原性細菌、真菌、寄生生物およびウイルス、熱、ＵＶ照射および水分喪失による環境ダメージに対する保護バリアを形成する。真皮は、ヒアルロンおよびプロテオグリカンに埋め込まれたコラーゲン細線維、細毛繊維および弾性繊維からなる細胞外マトリックスを通じて皮膚に抗張力および弾力を与える。
構造タンパク質（フィラグリン、ケラチン）、酵素（プロテアーゼ）、脂質および抗菌性ペプチド（デフェンシン）を産生し、角質層および皮膚付属器、例えば毛包および皮脂腺、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカンおよびマトリックス細胞タンパク質を含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分を産生および維持する線維芽細胞、分化したケラチノサイト由来である脂腺細胞を創出するように分化し、皮脂を分泌し皮膚、毛髪および眼を滑らかで水を通さないようにする皮脂腺およびマイボーム腺ならびに、皮膚および眼のメラニン色素を作るメラノサイトを作る、上皮細胞およびケラチノサイトを含む真皮細胞への効果は、透明感、潤い、上皮および真皮の厚み、感触、弾力、色、トーン、柔軟性、硬さ、タイトネス、滑らかさ、厚み、輝き、均一さ、緩み、顔色、小じわ、しわ、毛穴サイズまたは脂性を含む例えば皮膚の質特性に影響を与えることができる。
本開示は、皮膚の美容上の障害のための処置としてのクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種の使用のための方法にさらに関する。一実施形態では、美容上の皮膚障害は、皮脂腺の機能の変化によって生じる障害である。皮脂腺障害は、過活動皮脂腺、低活動性皮脂腺、皮脂腺の発達不全（mal-developed）、皮脂腺の閉塞、皮脂腺の感染、皮脂腺の炎症などによって生じ得る。皮脂腺障害の例として、これだけに限らないが：開いた面皰（ブラックヘッド）およびホワイトヘッドを含むざ瘡、面疱、深いざ瘡、集簇性ざ瘡、ざ瘡酒さ、面皰、嚢胞、ミクロ面皰（microcomedo）、丘疹、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）（Ｐ．ａｃｎｅｓ）感染、膿疱、尋常性ざ瘡、酒さ、口囲皮膚炎、皮脂腺嚢胞、原発性脂漏症（油性脂漏症）、二次脂漏症（乾性脂漏症）および脱毛症が挙げられる。同様にこの定義内であるのは、フケおよび乾燥皮膚ならびに、乾燥した毛髪、脂ぎった毛髪、毛髪および皮膚の光沢ならびに皮膚および／または顔色の他の軽度の美容上の障害を含む「美容上の」皮脂腺障害などの皮脂腺の機能を変化させることによって処置可能な障害である。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を使用して皮脂産生および／または皮脂組成をモジュレートするための方法に関する。一部の実施形態では、モジュレートすることは、皮脂産生および／または皮脂組成に変化を生じ、それにより皮膚の脂性／乾燥における変化を生じる。一実施形態では、モジュレートすることは、皮脂産生を低減し、それにより皮膚の脂性を低減する。別の実施形態では、モジュレートすることは、皮脂産生を増加させ、それにより皮膚の乾燥を低減する。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を使用する皮脂調節不全（産生の低減もしくは増加）および／または異常（皮脂組成の変更）に関連する皮膚障害を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、皮脂産生および／または皮脂組成をモジュレートするためにクロストリジウム毒素、その断片または変種をそれを必要とする対象に投与することを含み、それにより、皮脂調節不全および／または異常に関連する皮膚障害を処置する。皮脂調節不全および／または異常に関連する例示的皮膚障害として、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、紅斑、酒さ、乾癬、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、脱毛症、白斑、アレルギー、感染および炎症が挙げられる。
皮脂腺は、水喪失を防ぎ、例えば細菌、酵母、真菌、ウイルスおよびダニなどの病原体に対するバリアを提供する、ダームシジン、ｂ−デフェンシンおよびソリアシンを含む抗菌性ペプチドならびに、皮膚の表面上の微細でわずかに酸性（ｐＨ４．５〜ｐＨ６．０の間）のフィルム、酸マントルを形成する酸を含有する皮脂を分泌する。皮脂調節不全および／または異常は、このバリアを弱める場合があり、皮膚を病原体により感受性にする。皮脂の産生および／または組成のモジュレーションは、皮膚バリア機能が損なわれたことに関連する真皮疾患、感染および炎症の改善をもたらし得る。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のクロストリジウム毒素またはその断片もしくは変種を使用して皮脂調節不全および／または異常に関連する感染を処置するための方法に関する。本方法によって処置され得る例示的感染として、プロピオニバクテリウム・アクネス、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、ライ病（ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ））および蜂巣炎（連鎖球菌およびブドウ球菌）を含む細菌；帯状疱疹（水痘帯状疱疹）、疣贅（パピローマウイルス（ＨＰＶ））および単純ヘルペスを含むウイルス；白癬菌、表皮菌、小胞子菌およびビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）を含む真菌；マラセチア属を含む酵母、シラミ；ならびにニキビダニ属およびヒゼンダニを含むダニ、由来の感染が挙げられる。
本明細書に記載の構造、材料、組成物および方法は、本開示における代表的な例であることが意図され、本開示の範囲が、実施例の範囲によって限定されないことは理解される。当業者は、本開示が、開示される構造、材料、組成物および方法について変動を有して実行されてよく、そのような変動が本開示の領域内として見なされることを認識する。
（実施例１）
正常ヒト初代線維芽細胞における細胞性遺伝子発現への本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの効果
ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた１、２または３日間の正常ヒト初代線維芽細胞の処置は、ｑＰＣＲに基づいて１０個の線維芽細胞遺伝子の発現において顕著な時間依存的変化を生じた。簡潔には、ヒト皮膚線維芽細胞、成人（ＨＤＦａ）（ｃｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｐ Ｐｔｅ Ｌｔｄ）を２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地で、１μＭの配列番号１９を有するポリペプチドを用いた１、２または３日間の処置の前に２週間培養した。線維芽細胞において発現され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組織化または上皮自己再生に関与する（ケラチノサイト幹細胞因子）ことが周知である遺伝子の時間依存的発現を評価した。総ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎからのＲＮＡｑｕｅｏｕｓキットを使用して単離し、ｃＤＮＡを製造者のプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ試薬を用いて生成した。リアルタイムｑＰＣＲをＢｉｏ−Ｒａｄ ＰＣＲ Ａｒｒａｙを使用して実施した。遺伝子発現における変化を各時点での未処置緩衝液対照に対する倍数変化として算出した（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（遺伝子（検査）−ＧＡＰＤＨ（検査））−ΔＣＴ（遺伝子（未処置対照）−ＧＡＰＤＨ（未処置対照））；倍数変化＝２（−ΔΔＣＴ））。２を超えるまたは０．５未満の倍数変化（Ｐ値≦０．０５）を関連する有意な変化と見なした。時間依存的変化を示す例示的遺伝子を、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１μＭのポリペプチドを用いた１、２または３日間の処置後の、正常ヒト初代線維芽細胞における表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフである図１に示す、ここで倍数変化は、未処置対照細胞と比較して表す。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた初代ヒト皮膚線維芽細胞の処置が、時間依存的な遺伝子発現変化を生じたことを示している。具体的には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのマトリックス分解酵素およびＴＰ６３（形質転換関連タンパク質６３、角膜および上皮性幹細胞を特定する転写因子）などのタンパク質をコードする遺伝子の発現（１および２日目）の最初の増加（１〜３日目の倍数変化、ＭＭＰ１：１１〜３倍、ＭＭＰ３：５〜４倍、ＴＰ６３：４４〜２５倍）に続く（３日目）コラーゲンおよびエラスチンなどの主要マトリックス構造タンパク質をコードする遺伝子の発現の増加（１〜３日目の倍数変化、ＣＯＬ１Ａ１：２〜３倍、ＣＯＬ１Ａ２：２〜３倍、ＣＯＬ３Ａ１：２〜３倍、ＥＬＮ：２〜６倍）は、線維芽細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングを受けたことを示唆している。ＥＣＭのリモデリングは、皮膚真皮の構造的および機能的特徴に影響を与えると予測され、例えば弾力および柔軟性などの皮膚の生体力学的特性において変化を生じる。したがって結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドがヒト患者において皮膚真皮の構造および機能、具体的には細胞外マトリックス構造を含む皮膚真皮の構造的および機能的特徴に影響を与えることができ、例えば弾力および柔軟性などの、皮膚の生体力学的特性において変化を生じることを示唆している。
（実施例２）
正常ヒト初代線維芽細胞における細胞性遺伝子発現への配列番号１９の例示的ポリペプチドの効果
ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μＭのポリペプチドを用いた１日（２４時間）の正常ヒト初代線維芽細胞の処置は、ｑＰＣＲに基づいて１６個の線維芽細胞関連遺伝子の発現に顕著な用量依存的変化を生じた。簡潔には、ヒト皮膚線維芽細胞、成人（ＨＤＦａ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ０１３５Ｃ）を２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地で、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１μＭの配列番号１９を有するポリペプチドを用いた１日（２４時間）の処置の前に２週間培養した。線維芽細胞において発現されることが周知であり、ＥＣＭ組織化、炎症または上皮性自己再生に関与する遺伝子の発現を評価した。ｃＤＮＡをＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１１７５４０５０）を使用する逆転写によって生成し、さらにＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４１３２５９）の指定のウエルに移す前にＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃４４４４５５７）中に希釈した。リアルタイムｑＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。遺伝子発現における変化を各時点での未処置対照に対する倍数変化として算出した（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（遺伝子（検査）−ＧＡＰＤＨ（検査））−ΔＣＴ（遺伝子（未処置対照）−ＧＡＰＤＨ（未処置対照））；倍数変化＝２（−ΔΔＣＴ））。２を超えるまたは０．５未満の倍数変化（Ｐ値≦０．０５）を関連する有意な変化と見なした。用量依存的変化を示す例示的遺伝子を、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１０ｎＭ（塗りつぶしバー）、１００ｎＭ（空白バー）または１μＭ（斜線バー）のポリペプチドを用いた２４時間処置後の、正常ヒト初代線維芽細胞における表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフである図２に示す、ここで倍数変化は、未処置対照細胞と比較して表す。注目すべきことに、組織およびＥＣＭの恒常性、リモデリング、再生および修復に関与することが周知である遺伝子の発現は、増加した。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドが、ヒト患者における皮膚真皮の構造および機能、具体的には細胞外マトリックス構造を含む皮膚真皮の構造的および機能的特徴に影響を与えることができ、例えば弾力および柔軟性などの、皮膚の生体力学的特性において変化を生じることを示唆している。
（実施例３）
正常ヒト初代線維芽細胞における細胞性遺伝子発現への本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの効果
１μＭのＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはＢｏＮＴの結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた正常ヒト初代線維芽細胞の処置は、ｑＰＣＲに基づいて１６個の線維芽細胞関連遺伝子の発現に同様の顕著な変化を生じた。簡潔には、ヒト皮膚線維芽細胞、成人（ＨＤＦａ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ０１３５Ｃ）を２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地で、１μＭの配列番号１９を有するポリペプチドまたは配列番号２１を有するポリペプチドを用いた１日（２４時間）の処置の前に２週間培養した。ＥＣＭ組織化、炎症または上皮性自己再生に関与することが周知である線維芽細胞関連遺伝子の発現を評価した。ｃＤＮＡをＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１１７５４０５０）を使用する逆転写によって生成し、さらにＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４１３２５９）の指定のウエルに移す前にＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃４４４４５５７）中に希釈した。リアルタイムｑＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。遺伝子発現における変化を各時点での未処置対照に対する倍数変化として算出した（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（遺伝子（検査）−ＧＡＰＤＨ（検査））−ΔＣＴ（遺伝子（未処置対照）−ＧＡＰＤＨ（未処置対照））；倍数変化＝２（−ΔΔＣＴ））。２を超えるまたは０．５未満の倍数変化（Ｐ値≦０．０５）を関連する有意な変化と見なした。結果を、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１μＭのポリペプチドを用いた（塗りつぶしバー）またはＢｏＮＴの結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１μＭのポリペプチドを用いた（空白バー）処置後の正常ヒト初代線維芽細胞における表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフである図３に示す。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）および結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）にそれぞれ実質的に対応する両方のポリペプチドが、線維芽細胞関連遺伝子；ＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７、ＴＰ６３、ＳＯＤ２、ＵＢＤ、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−３２、ＣＣＬ２およびＢＤＫＲＢ１の発現に影響を与えることに等しく有効であったことを示している。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）または結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドが、ヒト患者において皮膚真皮の構造および機能、具体的には細胞外マトリックス構造を含む皮膚真皮の構造的および機能的特徴に影響を与えることができ、例えば弾力および柔軟性などの、皮膚の生体力学的特性において変化を生じることを示唆している。
（実施例４）
フィブロネクチンの細胞発現への配列番号１９の例示的ポリペプチドの効果
ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する６００ｐＭのポリペプチドを用いたケロイドヒト初代線維芽細胞の処置は、免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づいてフィブロネクチン糖タンパク質の発現を増加させた。簡潔には、ケロイド由来線維芽細胞を、ステップダウン培地（２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む培地、Ｓｉｇｍａ番号７０３０）中で６００ｐＭの配列番号１９を有するポリペプチドを用いた処置を伴ってまたは伴わずに４８時間（２日間）培養した。フィブロネクチンに対する抗体（Ａｂｃａｍ、番号ａｂ２４１３）を用いてフィブロネクチンについての免疫染色を実施した。代表的な画像を、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた（図４Ａ）または用いない（図４Ｂ）線維芽細胞の画像を示している、図４Ａ〜４Ｂに示す。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた線維芽細胞の処置がフィブロネクチン発現を増加させたことを示している。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドが、ヒト患者皮膚の真皮におけるフィブロネクチンの発現を増加させることができ、例えば弾力および柔軟性などの皮膚の細胞外マトリックス構造および生体力学的特性において変化を生じることを示唆している。
（実施例５）
線維芽細胞における遺伝子発現への本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの効果
ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメイン（ＨC／ＤＣ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１００ｎＭもしくは１μＭのポリペプチドまたはＢｏＮＴ／Ａの結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１μＭのポリペプチドを用いた正常ヒト初代線維芽細胞の処置は、ｑＰＣＲに基づいて６個の線維芽細胞関連遺伝子の発現に顕著な変化を生じた。簡潔には、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ０１３５Ｃ）を２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地で、１００ｎＭもしくは１μＭの配列番号２０のポリペプチドまたは１μＭの配列番号２１のポリペプチドを用いた１日（２４時間）の処置の前に２週間培養した。ＨC／ＡまたはＨCN／Ａを用いた処置後に発現の増加を示した６個の遺伝子の発現（上の実施例２および３を参照されたい）を評価した。ｃＤＮＡをＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１１７５４０５０）を使用する逆転写によって生成し、さらにＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ ｐｌａｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４１３２５９）の指定のウエルに移す前にＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃４４４４５５７）中に希釈した。リアルタイムｑＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。次の遺伝子の発現における変化を分析した：ＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７およびＴＰ６３。遺伝子発現における変化を各時点での未処置対照に対する倍数変化として表した（ΔΔＣＴ＝ΔＣＴ（遺伝子（検査）−ＧＡＰＤＨ（検査））−ΔＣＴ（遺伝子（未処置対照）−ＧＡＰＤＨ（未処置対照））；倍数変化＝２（−ΔΔＣＴ））。２を超えるまたは０．５未満の倍数変化（Ｐ値≦０．０５）を関連する有意な変化と見なした。結果を、ＢｏＮＴの結合ドメインのＮ末端側半分（ＨCN／Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１μＭのポリペプチド（空白）または、ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメイン（ＨC／ＤＣ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する１００ｎＭ（塗りつぶし（solid fill））もしくは１μＭ（斜線）のポリペプチドを用いた１日（２４時間）の処置後の、正常ヒト初代線維芽細胞での表示の遺伝子の発現における倍数変化を示す棒グラフである、図５に示す。結果は、ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメイン（ＨC／ＤＣ）に実質的に対応する１００ｎＭもしくは１μＭのポリペプチドを用いた処置が、正常ヒト皮膚線維芽細胞における遺伝子の発現に影響を与えることを示している。効果は、ＨC／ＡのＮ末端側半分の結合ドメイン（ＨCN／Ａ）に実質的に対応する１μＭのポリペプチドの効果と同様またはそれを超えており、ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメイン（ＨC／ＤＣ）に実質的に対応するポリペプチドが、ＨC／ＡのＮ末端側半分の結合ドメイン（ＨCN／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドと比較して線維芽細胞関連遺伝子の発現に影響を与えることに同等またはそれを超えて有効であることを示唆している。したがって結果は、ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメイン（ＨC／ＤＣ）に実質的に対応するポリペプチドが弾力および柔軟性を含む例えば皮膚の生体力学的特性を決定する細胞外マトリックス構造を含む、皮膚真皮の構造および機能にヒト患者において影響を与え得ることを示唆している。２つの異なるＢｏＮＴ血清型の結合ドメインに実質的に対応するポリペプチドが線維芽細胞に影響を与えるという観察は、他の追加的ＢｏＮＴ血清型がヒト皮膚に影響を与え得ることも示唆している。
配列アライメントソフトウェアツールを使用して、ペアワイズ配列アライメントをさまざまなＢｏＮＴ血清型間で実施した；ＢｏＮＴ／Ａ１の結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列（配列番号１）（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＡＦ４８８７４９）を次のＢｏＮＴタンパク質：ＢｏＮＴ／Ｂ１（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＢＡＥ４８２６４）：ＢｏＮＴ／Ｃ１（ＧＥＮＢＡＮＫ番号Ｐ１８６４０）；ＢｏＮＴ／Ｄ（ＧＥＮＢＡＮＫ番号Ｐ１９３２１）；ＢｏＮＴ／ＤＣ（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＥＦ３７８９４７）；ＢｏＮＴ／Ｅ（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＡＦＶ９１３４４）；ＢｏＮＴ／Ｆ（ＧＥＮＢＡＮＫ番号ＡＢＳ４１２０２）；およびＢｏＮＴ／Ｇ（ＧＥＮＢＡＮＫ番号Ｘ７４１６２）からの結合ドメインのアミノ酸配列とアラインした。表２に示す結果は、ＢｏＮＴ／Ａ１と他のＢｏＮＴ血清型、例えばＢ１、Ｃ１、ＤＣ、Ｅ、ＦおよびＧとの間のアミノ酸レベルでの同一性パーセントおよび相同性が、ＢｏＮＴ／Ａ１とＢｏＮＴ／ＤＣとの間の同一性パーセントおよび相同性と同様であることを明らかにした。具体的には、ＢＬＡＳＴアライメントにより、ＨC／ＡおよびＨC／ＤＣは、アミノ酸残基レベルでは３３％同一および５４％類似（コンセンサス）であり、すべての他の血清型と同様である（３１〜５１％同一および４９〜６７％類似（コンセンサス））。実施例５に示すとおり、ＢｏＮＴ／ＤＣの結合ドメイン（ＨC／ＤＣ）は、線維芽細胞関連遺伝子の発現に影響を与えることにおいてＢｏＮＴ／Ａの結合ドメインと同様に有効であった。したがって、ＢＬＡＳＴアライメントおよび実施例５から得られた結果は、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／ＤＣに加えて他のＢｏＮＴ血清型も、ヒト皮膚に影響を与え得ることを示唆している。
表２に示すとおり、さまざまなＢｏＮＴ血清型間のアライメントのレベルは、スコアによって示されるとおり非常に高い。スコアは、素スコアまたはビットスコアのいずれかの形態で提示されており、素スコアは残基置換のマトリックスを使用してツールから直接算出されており、ビットスコアは、標準化されたスコアであり、配列長およびギャップサイズを考慮している。バイオインフォマティクスにおいて理解されるとおり、２８３ビットのスコアは、示されているものより良いアライメントを見出すために、検索が２283（または２ｘ１０85）単位のアミノ酸スペースを包含する必要があることを意味する。したがって、ビットスコアが高いほど、マッチは高度に有意である。
（実施例６）
脂腺細胞へのさまざまな脂質生成刺激の検査
さまざまな脂質生合成増強刺激を用いた脂腺細胞（ＳＥＢ−１）の処置は、ナイルレッド染色に基づいて脂腺細胞脂質生合成を増加させた。簡潔には、ヒト不死化脂腺細胞（ＳＥＢ−１）を脂腺細胞増殖培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ（登録商標））中で培養した。種々の脂質生合成増強刺激を：オレイン酸（ＯＡ）（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）（２ｍＭ）、アセチルコリン（ＡＣｈ）（３００μＭ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）（１０もしくは１００μＭ）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）（１００ｎＭもしくは５００ｎＭ）、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）（５００ｎＭもしくは５μＭ）またはロシグリタゾン（１００μＭもしくは１ｍＭ）を含む増殖培地に加え１日置いた。ウエルあたりの皮脂脂質の総量は、細胞を１０％ホルマリンを用いて固定し、次にナイルレッド染色液を用いてインキュベートし、蛍光強度（ナイルレッド、ＦＩＴＣ、ｅｘ／ｅｍ ４８５／５３５ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ Ｐｌａｔｅ ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（商標）Ｖ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏｓｃａｎ、Ｉｎｃ）を使用して測定するナイルレッド脂質液滴蛍光アッセイ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号５００００１）を使用して測定した。結果を図６に示し、検査したすべての脂質生合成増強刺激が、次の順の脂質生成強度；ＤＨＴ（１００μＭ、５．５倍）＞ＯＡ（０．０２５ｍｇ／ｍＬ、４．５倍）＞ロシグリタゾン（１００μＭ、４倍）＞ＦＧＦ１（５００ｎＭ、３．５倍）＞ＣａＣｌ2（２ｍＭ、３倍）＞ＡＣｈ（３００μＭ、２．５倍）＞α−ＭＳＨ（５μＭ、２倍）（未処置対照と比較した倍数変化）で脂腺細胞脂質生合成を顕著に増加させたことを実証している。検査刺激の内、１ｍＭのロシグリタゾンは細胞死を生じ、５００ｎＭのＦＧＦ１（ＦＧＦＲについての天然リガンド）は脂腺細胞脂質生合成を刺激したことは注目されるべきである。
（実施例７）
皮脂脂質の産生を阻害するための本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
脂質生合成増強刺激オレイン酸（ＯＡ）およびＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する２０ｐＭのポリペプチドを用いた脂腺細胞（ＳＺ９５）の同時処置は、脂質生合成を誘導するＯＡの能力を低減した。簡潔には、ヒト不死化脂腺細胞（ＳＺ９５）を脂腺細胞増殖培地（ＺＥＮ−ＢＩＯ（登録商標））で培養した。次の処置を増殖培地に加え１日置いた：対照（処置なし）；オレイン酸（ＯＡ）（０．１２５ｍｇ／ｍＬまたは０．２５ｍｇ／ｍＬ）；配列番号１９の例示的ポリペプチド（２０ｐＭ）；オレイン酸（ＯＡ）（０．１２５ｍｇ／ｍＬまたは０．２５ｍｇ／ｍＬ）および配列番号１９のポリペプチド（２０ｐＭ）。皮脂脂質の合計量を、細胞を１０％ホルマリンを用いて固定し、次いでナイルレッド染色液と共にインキュベートする、ナイルレッド脂質液滴蛍光アッセイ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号５００００１）を使用して測定した。細胞数の測定として、ＤＡＰＩ染色（最終濃度１．５ｎｇ／ｍＬ）を並行して実施した。蛍光強度（ナイルレッド、ＦＩＴＣ、励起／発光４８５／５３５ｎｍ、ＤＡＰＩ、励起：３５８ｎｍ；発光：４６１ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ ２１０２、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。脂質値をＤＡＰＩ値に標準化し、「細胞あたりの脂質（ナイルレッド／ＤＡＰＩ）」としてグラフ化した。
図７に示す結果は、皮脂脂質生合成がオレイン酸（ＯＡ）処置によって顕著に増強された（６〜８倍、ＯＡの用量に依存）ことを実証している。しかし、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）の（配列番号１９の）アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する２０ｐＭの例示的ポリペプチドを用いた細胞の同時処置は、ＯＡの脂質生合成増強効果を顕著に低減した（およそ３０〜３５％の低減、ＯＡの用量に依存）。２０ｐＭの配列番号１９の例示的ポリペプチドのみを用いた細胞の処置は、皮脂脂質生合成に影響を与えなかった。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドが、脂腺細胞に影響を与えることができ、ヒト患者において皮脂脂質生合成および皮膚の脂性を低減する可能性があることを示唆している。
（実施例８）
小じわ、および緩みを改善するための本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
フォトタイプＩＩ皮膚を有する４５歳女性は、小じわ、および緩みを含む光老化した顔の皮膚の徴候を最少化するように求めている。彼女は、彼女の皮膚の質を改善するためのフラクショナルレーザー処置を、それに伴うダウンタイムのために拒否している。代わりに、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた皮内処置を求めている。処置前に、局所麻酔クリーム（２．５％リドカインおよび２．５％プリロカイン）を処置の３０分前に皮膚に適用し、次いで完全に除去する。
ポリペプチド粉剤を生理食塩水に溶解（真空乾燥粉末４．５ｎｇを９ｍＬの滅菌０．９％生理食塩水で復元した）して、溶液を０．５ｎｇ／ｍＬで復元し、彼女の顔の皮膚にマルチニードル皮膚注射システムを使用して注射する。各注射部位（合計１３００部位）に２μＬ（０．００１ｎｇ）を用いて、合計１．３ｎｇを注射する。注射深さは、顔の上側は０．８ｍｍ、顔の中央および下側は１．０ｍｍであり、２ｍｍの間隔を有する。
評価は、ベースライン時および処置後１２週間で実施する。
ベースラインと比較して、処置後１２週間で、彼女の顔の皮膚は、荒れ、潤い、皮膚の弾力、および経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）における顕著な改善を伴ってより高い医師包括的評価および対象満足度スコアを示す。この改善は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に対応するポリペプチドを用いて処置した線維芽細胞が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）真皮構造を適正に維持、再生および修復するように機能するフィブロネクチン、コラーゲンおよびエラスチンを含むタンパク質ならびに因子の発現を増加させたことが示された、実施例１および２に記載される実験データと一致する。
（実施例９）
脂性、皮脂および毛穴サイズを低減するための本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
フォトタイプＩＩＩ皮膚を有する３５歳男性は、脂性前頭部（脂漏症）を有し、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた皮内処置を受ける。
ポリペプチド粉剤を生理食塩水に溶解（真空乾燥粉末４．５ｎｇを０．２５ｍＬの滅菌０．９％生理食塩水に溶解する）して、溶液を１．８ｎｇ／０．１ｍＬで復元し、彼の前頭部に注射する。合計１．８ｎｇを注射する。１０ヵ所の注射部位を選択し、０．１８ｎｇのＨC／Ａポリペプチドを各位置に３０Ｇ針を使用して皮内注射（ＩＤ）する。処置後に氷嚢を適用する。
評価は、ベースライン時および処置後１２週間で実施し、皮脂の量をｓｅｂｕｍｅｔｅｒを使用して測定する。
ベースラインと比較して、処置後１２週間で、彼の前頭部は、高い医師包括的評価を示し、患者は、脂性、皮脂および毛穴のサイズにおける顕著な低減を有して結果に満足したと報告した、皮脂の低減百分率（％）は、ｓｅｂｕｍｅｔｅｒによって測定する。この改善は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に対応するポリペプチドを用いて処置した脂腺細胞が、皮膚の脂性の低減を生じるオレイン酸誘導皮脂脂質生合成の低減を有することが示された、実施例６および７に記載される実験データと一致する。
（実施例１０）
皮脂脂質の産生をモジュレートするための本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた脂腺細胞（ＳＥＢ−１）の処置は、脂質生合成をモジュレートする。簡潔には、ヒト不死化脂腺細胞（ＳＥＢ−１）を脂腺細胞増殖培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ（登録商標））で培養した。次の処置を増殖培地に加え１日置いた：対照（処置なし）；配列番号１９の例示的ポリペプチド（２０ｐＭ）；オレイン酸（ＯＡ）（０．０５ｍｇ／ｍＬ）；オレイン酸（ＯＡ）（０．０５ｍｇ／ｍＬ）および配列番号１９のポリペプチド（２０ｐＭ）。皮脂脂質の合計量を、細胞を１０％ホルマリンを用いて固定し、次いでナイルレッド染色液と共にインキュベートする、ナイルレッド脂質液滴蛍光アッセイ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号５００００１）を使用して測定した。蛍光強度（ナイルレッド、ＦＩＴＣ、励起／発光４８５／５３５ｎｍ、ＤＡＰＩ、励起：３５８ｎｍ；発光：４６１ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ Ｐｌａｔｅ ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（商標）Ｖ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏｓｃａｎ、Ｉｎｃ）を使用して測定した。脂質値をＤＡＰＩ値に標準化し、「細胞あたりの脂質（ナイルレッド／ＤＡＰＩ）」としてグラフ化した。
図８に示す結果は、皮脂脂質生合成が２０ｐＭの配列番号１９のポリペプチド（約５倍）またはオレイン酸（ＯＡ）処置（約１５倍）によって顕著に増強されたことを実証している。しかし、２０ｐＭの配列番号１９のポリペプチドを用いた細胞の同時処置は、ＯＡの脂質生合成増強効果を顕著に低減した（およそ３０〜２５％の低減）。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏ皮脂腺内で、例えば皮膚皮脂産生および／または組成をモジュレートすることによって脂腺細胞に影響を与えることができ、それによりヒト患者において皮膚の脂性／乾燥に影響を与えることを示唆している。
（実施例１１）
用量依存的様式で皮脂脂質の産生をモジュレートする本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた脂腺細胞（ＳＥＢ−１）の処置は、脂質生合成を用量依存的様式でモジュレートする。簡潔には、ヒト不死化脂腺細胞（ＳＥＢ−１）を脂腺細胞増殖培地（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ（登録商標））で培養した。次の処置を増殖培地に加え１日置いた：対照（処置なし）；オレイン酸（ＯＡ）（０．０５ｍｇ／ｍＬ）；２ｐＭ、２０ｐＭまたは２００ｐＭの配列番号１９の例示的ポリペプチド；オレイン酸（ＯＡ）（０．０５ｍｇ／ｍＬ）および２ｐＭ、２０ｐＭまたは２００ｐＭの配列番号１９のポリペプチド。皮脂脂質の合計量を、細胞を１０％ホルマリンを用いて固定し、次いでナイルレッド染色液と共にインキュベートする、ナイルレッド脂質液滴蛍光アッセイ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号５００００１）を使用して測定した。蛍光強度（ナイルレッド、ＦＩＴＣ、励起／発光４８５／５３５ｎｍ、ＤＡＰＩ、励起：３５８ｎｍ；発光：４６１ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ Ｐｌａｔｅ ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（商標）Ｖ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏｓｃａｎ、Ｉｎｃ）を使用して測定した。脂質値をＤＡＰＩ値に標準化し、「細胞あたりの脂質（ナイルレッド／ＤＡＰＩ）」としてグラフ化した。
図９に示す結果は、皮脂脂質生合成がオレイン酸（ＯＡ）処置によって（約１１倍）または配列番号１９のポリペプチドによって（約４〜５倍）のいずれでも用量依存的様式で顕著に増強されたことを実証している。しかし、２０ｐＭまたは２００ｐＭの配列番号１９のポリペプチドを用いた細胞の同時処置は、ＯＡの脂質生合成増強効果を顕著に低減した（およそ３５〜４５％の低減）。結果は、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）に実質的に対応するポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで皮脂腺内の脂腺細胞に、例えば皮膚皮脂産生および／または組成をモジュレートすることによって影響を与えることができ、それによりヒト患者において皮膚の脂性／乾燥に影響を与えることを示唆している。
（実施例１２）
ざ瘡を処置するための本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
フォトタイプＩＩ皮膚を有する２０歳非喫煙男性は、顔面に３０ヵ所のざ瘡病変を有してざ瘡重症度についての調査者の包括的評価（ＩＧＡ）に基づいて、軽度−中等度の顔面の尋常性ざ瘡を呈し、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いる皮内処置を受ける。
ポリペプチド粉剤を生理食塩水に溶解（真空乾燥粉末４．５ｎｇを０．２５ｍＬの滅菌０．９％生理食塩水に溶解する）して、溶液を１．８ｎｇ／０．１ｍＬで復元し、彼の前頭部に注射する。合計３．６ｎｇを注射する。２０ヵ所の注射部位、前頭部に５ヵ所、各頬に４ヵ所および顔の下部、口および顎の周辺に６ヵ所を選択し、；０．３６ｎｇのＨC／Ａポリペプチドを３０Ｇ針を使用して各部位に皮内注射（ＩＤ）する。処置後に氷嚢を適用する。
ざ瘡重症度についての調査者の包括的評価（ＩＧＡ）による評価およびざ瘡病変の数の計数をベースラインおよび処置１２週間後に実施する。
ベースラインと比較して、処置１２週間後に、彼のざ瘡は、５ヵ所だけのざ瘡病変を有して、ざ瘡重症度についてのＩＧＡに基づいて軽度−中等度から軽度〜ほぼ消失に改善し、患者は結果に満足していると報告している。
（実施例１３）
ざ瘡を処置するための本開示の態様により提供される例示的ポリペプチドの使用
フォトタイプＩＩ皮膚を有する２０歳非喫煙男性は、顔面に３０ヵ所のざ瘡病変を有してざ瘡重症度についての調査者の包括的評価（ＩＧＡ）に基づいて、軽度−中等度の顔面の尋常性ざ瘡を呈し、ＢｏＮＴ／Ａの結合ドメイン（ＨC／Ａ）と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する溶解型マイクロニードルパッチ（dissolving microneedle patche）を用いた処置を受ける。
パッチあたり２．５ｎｇの封入されたポリペプチドを含有する経皮薬物送達のための溶解型マイクロニードルパッチを、アプリケーターを用いて罹患した領域に適用する。合計６個のパッチ（１５ｎｇ）、２個を前頭部、２個を各頬ならびに２個を顔の下部、口および顎の周辺に適用する。ニードルを溶解させるためにパッチを５分間適用し、次いで残った裏当てを除く。
ざ瘡重症度についての調査者の包括的評価（ＩＧＡ）による評価およびざ瘡病変の数の計数をベースラインおよび処置１２週間後に実施する。
ベースラインと比較して、処置１２週間後に、彼のざ瘡は、５ヵ所だけのざ瘡病変を有して、ざ瘡重症度についてのＩＧＡに基づいて軽度−中等度から軽度〜ほぼ消失に改善し、患者は、結果に満足すると報告する。
他に定める場合を除いて、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に記載のものと同様または等価の方法および材料は、本開示の実行または検査において使用され得るが、好適な方法および材料は、前述の項に記載されている。加えて、材料、方法および例は、例示的なだけであり、限定されることを意図しない。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が、支配する。
本明細書において引用するすべての米国特許および公開されたまたは非公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書において引用するすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用するすべての刊行された参照文献、文書、原稿、科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において参照する、科学データベースに関係するすべての識別子および受託番号（例えば、ＰＵＢＭＥＤ、ＮＣＢＩ、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＢＩ）は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (37)

  1. ボツリヌス毒素の結合ドメイン中のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間である、ポリペプチド。
  2. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むポリペプチドであって、分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間である、ポリペプチド。
  3. ポリペプチドの分子量が約１０ｋＤａ〜約６０ｋＤの間である、または約１２ｋＤａ〜約５０ｋＤの間である、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
  4. ボツリヌス毒素が、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、ボツリヌス毒素血清型Ｃ1（ＢｏＮＴ／Ｃ1）、ボツリヌス毒素血清型Ｄ（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス毒素血清型Ｅ（ＢｏＮＴ／Ｅ）、ボツリヌス毒素血清型Ｆ（ＢｏＮＴ／Ｆ）、ボツリヌス毒素血清型Ｆ（ＢｏＮＴ／ＦＡ）、ボツリヌス毒素血清型Ｇ（ＢｏＮＴ／Ｇ）、ボツリヌス毒素血清型Ｈ（ＢｏＮＴ／Ｈ）、ボツリヌスＤ／Ｃモザイク（ＢｏＮＴ／ＤＣ）、ボツリヌスＣ／Ｄモザイク（ＢｏＮＴ／ＣＤ）、ボツリヌス毒素血清型Ｘ（ＢｏＮＴ／Ｘ）またはエンテロコッカス種ＢｏＮＴ／Ｊ（ｅＢｏＮＴ／Ｊ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  5. ボツリヌス毒素がボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）ではない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  6. 結合ドメインがボツリヌス毒素の重鎖の結合ドメイン領域（ＨC）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  7. 結合ドメインがボツリヌス毒素の重鎖の結合ドメイン領域のアミノ末端（ＨCN）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  8. ＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７およびＴＰ６３から選択される複数の遺伝子を含む遺伝子シグネチャーの発現をモジュレートできる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  9. ＦＧＦＲ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＦＧＦ７、ＴＰ６３、ＳＯＤ２、ＵＢＤ、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−３２、ＣＣＬ２およびＢＤＫＲＢ１から選択される複数の遺伝子の発現をモジュレートできる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  10. 標的細胞においてフィブロネクチン発現または合成を上昇させることができる、請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
  11. 線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂腺細胞、免疫細胞またはニューロンからなる群から選択される標的細胞においてフィブロネクチン発現または合成を上昇させることができる、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
  12. 標的細胞の形態学的または機能的特性を変化させることができる、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
  13. 改変ボツリヌス毒素エンドペプチダーゼ活性を有するまたはボツリヌス毒素エンドペプチダーゼ活性を欠いている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  14. 重鎖のアミノ末端（ＨN）を含むボツリヌス毒素移行ドメインを欠いている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  15. 配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１、配列番号１２〜１８および配列番号２５〜２７からなる群から選択される配列と少なくとも３０％相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチド。
  16. 配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１、配列番号１２〜１８および配列番号２５〜２７からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％配列同一性を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
  18. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１７に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  19. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１７に記載の融合タンパク質、およびそれらの局所または経皮送達のために許容される担体を含む局所または経皮用医薬組成物。
  20. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１７に記載の融合タンパク質および投与のための説明書を１つまたは複数のパッケージ中に含むキット。
  21. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において皮膚の質特性をモジュレートするための方法であって、ポリペプチドの分子量が約４ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間であり、皮膚の質特性をモジュレートすることが顔面筋の麻痺を伴わない、方法。
  22. 皮膚の質特性が、透明感、潤い、上皮および真皮の厚み、感触、弾力、色、トーン、柔軟性、硬さ、タイトネス、滑らかさ、厚み、輝き、均一さ、緩み、顔色、小じわの少なさ、より少ないしわ、および脂性の低減からなる群から選択され；モジュレーションが特性に少なくとも約２０％の改善をもたらす、請求項２１に記載の方法。
  23. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む、対象においてコラーゲン産生を刺激する方法であって、ポリペプチドの分子量が約４ｋＤａ〜約６０ｋＤａであり、前記投与が筋肉麻痺を生じない、方法。
  24. （ａ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間であるｃＤＮＡ；
    （ｂ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードする合成ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間である合成ＤＮＡ；
    （ｃ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が約１ｋＤａ〜約９０ｋＤａの間であるコドン最適化ＤＮＡ；および
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡに相補的であるＤＮＡ
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
  25. （ａ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が５０ｋＤａ未満であるｃＤＮＡ；
    （ｂ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードする合成ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が５０ｋＤａ未満である合成ＤＮＡ；
    （ｃ）ボツリヌス毒素の結合ドメインを含むポリペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡであって、ポリペプチドの分子量が５０ｋＤａ未満であるコドン最適化ＤＮＡ；および
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡに相補的であるＤＮＡ
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
  26. 配列番号２のポリヌクレオチド配列または配列番号１、配列番号１９、配列番号３〜５、配列番号６、配列番号２０、配列番号７〜１０、配列番号１１、配列番号２１、配列番号１２〜１８および配列番号２５〜２７をコードする核酸と少なくとも５０％配列相同性を含む、ポリヌクレオチド。
  27. 請求項２４、請求項２５または請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  28. 請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  29. ボツリヌス菌ではない、請求項２８に記載の宿主細胞。
  30. 請求項２７に記載のベクターおよび好適な宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現するための説明書を１つまたは複数のパッケージ中に含むキット。
  31. 請求項２７のベクターまたは請求項２８に記載の宿主細胞または請求項２９に記載の宿主細胞および医薬用賦形剤を含む組成物。
  32. ポリペプチドの発現を達成するために請求項３１に記載の組成物を対象に投与することを含む、皮膚の質特性を改善する方法。
  33. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において皮膚の脂性または乾燥をモジュレートするための方法であって、ポリペプチドの分子量が約４ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間であり、皮膚の脂性または乾燥をモジュレートすることが顔面筋の麻痺を伴わない、方法。
  34. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において皮脂産生および／または皮脂組成をモジュレートするための方法であって、ポリペプチドの分子量が約４ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間であり、皮脂産生および／または皮脂組成をモジュレートすることが顔面筋の麻痺を伴わない、方法。
  35. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において皮脂調節不全または異常に関連する感染を処置するための方法であって、ポリペプチドの分子量が約４ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間であり、皮脂調節不全および／または異常に関連する感染を処置することが顔面筋の麻痺を伴わない、方法。
  36. ボツリヌス毒素の結合ドメインと少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む、対象において皮脂調節不全および／または異常に関連する皮膚障害を処置するための方法であって、ポリペプチドの分子量が約４ｋＤａ〜約６０ｋＤａの間であり、皮脂異常および／または調節不全に関連する皮膚障害を処置することが顔面筋の麻痺を伴わない、方法。
  37. 皮膚障害が、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、紅斑、酒さ、乾癬、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、脱毛症、白斑、アレルギー、感染および炎症からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
JP2020534267A 2017-12-20 2018-12-20 ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび皮膚の若返りのための使用方法 Pending JP2021508453A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762608119P 2017-12-20 2017-12-20
US62/608,119 2017-12-20
US201862727640P 2018-09-06 2018-09-06
US62/727,640 2018-09-06
PCT/US2018/066800 WO2019126502A1 (en) 2017-12-20 2018-12-20 Botulinum toxin cell binding domain polypeptides and methods of use for skin rejuvenation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2021508453A true JP2021508453A (ja) 2021-03-11

Family

ID=65024111

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020534268A Pending JP2021506899A (ja) 2017-12-20 2018-12-20 ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび線維症関連障害の処置のための使用方法
JP2020534267A Pending JP2021508453A (ja) 2017-12-20 2018-12-20 ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび皮膚の若返りのための使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020534268A Pending JP2021506899A (ja) 2017-12-20 2018-12-20 ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび線維症関連障害の処置のための使用方法

Country Status (14)

Country Link
US (3) US20190185837A1 (ja)
EP (2) EP3728296A1 (ja)
JP (2) JP2021506899A (ja)
KR (2) KR20200100755A (ja)
CN (2) CN112351992A (ja)
AU (2) AU2018389121A1 (ja)
BR (2) BR112020012652A2 (ja)
CA (2) CA3086184A1 (ja)
CL (1) CL2020001654A1 (ja)
IL (1) IL275452A (ja)
MX (1) MX2020006424A (ja)
RU (2) RU2020123343A (ja)
SG (1) SG11202005757SA (ja)
WO (2) WO2019126502A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023243447A1 (ja) * 2022-06-16 2023-12-21 株式会社 資生堂 環状コラーゲンの形成を制御する美容方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019025402A2 (pt) * 2017-05-31 2020-06-23 Allergan, Inc. Neurotoxina botulínica para tratamento de distúrbios associados a hiperatividade de melanócito e/ou melanina em excesso
US11707510B2 (en) * 2018-02-16 2023-07-25 Preclinics Discovery Gmbh Nucleic acid-based botulinum neurotoxin for therapeutic use
US10960061B1 (en) 2019-10-18 2021-03-30 Penland Foundation Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using botulinum toxin
US10967052B1 (en) 2019-10-18 2021-04-06 Penland Foundation Treatment of dyslexia using botulinum toxin
WO2023287728A1 (en) 2021-07-12 2023-01-19 Penland Foundation Treatment of diabetes and chronic pancreatitis using botulinum toxin
WO2023287729A1 (en) * 2021-07-12 2023-01-19 Penland Foundation Treatment of acute and chronic kidney disease
WO2023068485A1 (ko) * 2021-10-22 2023-04-27 비피메드(주) 보툴리눔 유래 펩타이드를 포함하는 탈모개선용 조성물

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US296006A (en) 1884-04-01 John hoefleb
USD296006S (en) 1985-06-20 1988-05-31 Ciba-Geigy Corporation Multicompartmentalized transdermal patch for administering drugs to the skin
US5008110A (en) 1988-11-10 1991-04-16 The Procter & Gamble Company Storage-stable transdermal patch
EP0517805B1 (en) 1990-02-26 2002-07-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and expression of insect steroid receptor dna sequences
US6165500A (en) 1990-08-24 2000-12-26 Idea Ag Preparation for the application of agents in mini-droplets
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
CA2135644C (en) 1992-05-14 2009-01-27 Elisabetta Vegeto Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5464758A (en) 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
IT1261849B (it) 1993-09-02 1996-06-03 Avantgarde Spa Dispositivo medico per la somministrazione di principi attivi o farmaci a bassissimo dosaggio, in particolare di farmaci omeopatici.
US5902565A (en) 1993-12-24 1999-05-11 Csl Limited Spray dried vaccine preparation comprising aluminium adsorbed immunogens
US5899880A (en) 1994-04-08 1999-05-04 Powderject Research Limited Needleless syringe using supersonic gas flow for particle delivery
GB9502879D0 (en) 1995-02-14 1995-04-05 Oxford Biosciences Ltd Particle delivery
US6013050A (en) 1995-10-20 2000-01-11 Powderject Research Limited Particle delivery
GB9605690D0 (en) 1996-03-19 1996-05-22 Oxford Biosciences Ltd Particle delivery
EP0907718B1 (en) 1996-06-14 2004-12-29 Powderject Vaccines, Inc. Sample delivery module for particle acceleration apparatus
US5980948A (en) 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
JP2002510319A (ja) 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
US6051239A (en) 1997-10-20 2000-04-18 Thomas Jefferson University Compositions and methods for systemic delivery of oral vaccines and therapeutic agents
US5965154A (en) 1998-03-17 1999-10-12 Plc Holding, L.L.C. Adhesive matrix type transdermal patch and method of manufacturing same
AU4641299A (en) * 1998-07-22 2000-02-14 Agricultural Research Council Vaccine comprising a non-toxic immunogenic derivative of (clostridium botulinum)type d neurotoxin
US6776990B2 (en) 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
AU783450B2 (en) * 1999-05-12 2005-10-27 United States Army Medical Research Materiel Command (Usamrmc) Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin
EP2267010B1 (en) 1999-08-25 2014-05-07 Allergan, Inc. Activatable recombinant neurotoxins
US6306423B1 (en) 2000-06-02 2001-10-23 Allergan Sales, Inc. Neurotoxin implant
WO2002026191A2 (en) 2000-09-28 2002-04-04 Nanocyte Inc. Methods, compositions and devices utilizing stinging cells/capsules for delivering a therapeutic or a cosmetic agent into a tissue
US7255865B2 (en) 2000-12-05 2007-08-14 Allergan, Inc. Methods of administering botulinum toxin
PT1411978E (pt) * 2001-07-27 2008-11-28 Univ Louisiana State Toxina botulínica no tratamento ou prevenção do acne
US20040009180A1 (en) 2002-07-11 2004-01-15 Allergan, Inc. Transdermal botulinum toxin compositions
US7172764B2 (en) 2003-11-17 2007-02-06 Allergan, Inc. Rescue agents for treating botulinum toxin intoxications
DK1718756T3 (da) 2004-02-24 2012-02-27 Allergan Inc Botulinumtoksinscreeningassays
JP2007527431A (ja) 2004-03-03 2007-09-27 ルバンス セラピュティックス 局所的診断及び治療用の輸送のための組成物及び方法
US9211248B2 (en) 2004-03-03 2015-12-15 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
WO2005084410A2 (en) 2004-03-03 2005-09-15 Essentia Biosystems, Inc. Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins
AU2005279741B2 (en) 2004-09-01 2011-10-06 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
US9724287B2 (en) 2004-11-19 2017-08-08 Metabeauty, Inc. Optimized skincare regimens for changing the genetic skin type to the ideal skin type—oily, resistant, non-pigmented and tight skin
US7727537B2 (en) 2005-02-14 2010-06-01 Dpm Therapeutics Corp. Stabilized compositions for topical administration and methods of making same
US7838011B2 (en) 2005-02-14 2010-11-23 Pankaj Modi Stabilized protein compositions for topical administration and methods of making same
BRPI0608249A2 (pt) 2005-03-03 2009-12-08 Revance Therapeutics Inc formulação, método para aplicação tópica e kit para distribuição transdérmica de toxina botulìnica
EP1920248B1 (en) 2005-04-05 2010-09-29 Allergan, Inc. Clostridial toxin activity assays
PT1869459E (pt) 2005-04-05 2010-08-10 Allergan Inc Ensaios fret à base de corantes lipofílicos para a actividade da toxina de clostrídeo
US8926991B2 (en) 2005-06-14 2015-01-06 Botulinum Toxin Research Associates, Inc. Botulinum toxin and the treatment of primary disorders of mood and affect
US8137677B2 (en) 2005-10-06 2012-03-20 Allergan, Inc. Non-protein stabilized clostridial toxin pharmaceutical compositions
US8168206B1 (en) 2005-10-06 2012-05-01 Allergan, Inc. Animal protein-free pharmaceutical compositions
AU2006315117A1 (en) 2005-11-17 2007-05-24 Revance Therapeutics, Inc. Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins
US8486422B2 (en) 2007-07-26 2013-07-16 Allergan, Inc. Methods of activating clostridial toxins
US20120003241A1 (en) * 2007-08-09 2012-01-05 University Of Rochester Vaccine against botulism
US8445650B2 (en) * 2007-09-25 2013-05-21 Thomas Jefferson University Mutant botulinum neurotoxin serotype A polypeptide and uses thereof
US9044477B2 (en) 2007-12-12 2015-06-02 Allergan, Inc. Botulinum toxin formulation
US9161970B2 (en) 2007-12-12 2015-10-20 Allergan, Inc. Dermal filler
US9107815B2 (en) 2008-02-22 2015-08-18 Allergan, Inc. Sustained release poloxamer containing pharmaceutical compositions
KR101604515B1 (ko) 2008-03-14 2016-03-17 알러간, 인코포레이티드 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정
CN102105187A (zh) 2008-05-30 2011-06-22 阿勒根公司 用于液体或凝胶形式的软组织扩增填充物、生物活性剂和其他生物相容性材料的注射装置
JP2013501771A (ja) * 2009-08-12 2013-01-17 メディカル リサーチ カウンシル 複合体形成系
ES2813650T3 (es) 2010-05-20 2021-03-24 Allergan Inc Toxinas clostridiales degradables
WO2012103415A1 (en) * 2011-01-28 2012-08-02 Allergan, Inc. Dosage regimen for the treatment of multiple disorders with botulinum toxins
US8603028B2 (en) 2011-11-18 2013-12-10 Allergan, Inc. Injection device having an angled tip portion
WO2013180799A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 President And Fellows Of Harvard College Engineered botulinum neurotoxin
WO2017063743A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Improvements to ultrasound-based therapy of photoaged tissue
RS62832B1 (sr) * 2016-05-27 2022-02-28 Ipsen Biopharm Ltd Tečna neurotoksin formulacija stabilizovana sa triptofanom ili tirozinom
KR101824321B1 (ko) * 2016-06-07 2018-01-31 국방과학연구소 보툴리눔 독소 a형의 중쇄 c말단 도메인 돌연변이로 독성활성이 제거된 보툴리눔 독소 a형을 포함하는 보툴리눔 독소 a형 백신 및 이의 제조방법
GB201621111D0 (en) * 2016-12-12 2017-01-25 Univ Of Sheffield The Neurotoxins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023243447A1 (ja) * 2022-06-16 2023-12-21 株式会社 資生堂 環状コラーゲンの形成を制御する美容方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019126502A1 (en) 2019-06-27
BR112020012652A2 (pt) 2020-12-01
EP3728296A1 (en) 2020-10-28
CN112351992A (zh) 2021-02-09
US20190185523A1 (en) 2019-06-20
CA3086185A1 (en) 2019-06-27
CA3086184A1 (en) 2019-06-27
CN112351991A (zh) 2021-02-09
BR112020012641A2 (pt) 2020-12-01
KR20200100755A (ko) 2020-08-26
RU2020123343A (ru) 2022-01-20
MX2020006424A (es) 2021-01-08
KR20200101953A (ko) 2020-08-28
RU2020123346A3 (ja) 2022-01-20
US11149262B2 (en) 2021-10-19
US20190185837A1 (en) 2019-06-20
CL2020001654A1 (es) 2020-10-30
RU2020123346A (ru) 2022-01-20
US20210277377A1 (en) 2021-09-09
AU2018389121A1 (en) 2020-07-30
RU2020123343A3 (ja) 2022-01-20
IL275452A (en) 2020-08-31
AU2018389104A1 (en) 2020-07-30
EP3728295A1 (en) 2020-10-28
WO2019126542A1 (en) 2019-06-27
JP2021506899A (ja) 2021-02-22
SG11202005757SA (en) 2020-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021508453A (ja) ボツリヌス毒素細胞結合ドメインポリペプチドおよび皮膚の若返りのための使用方法
JP7434263B2 (ja) 陽イオン性神経毒
KR101561709B1 (ko) 올리고펩티드 티로시나제 억제제 및 그의 용도
EP2337790B1 (en) Clostridial neurotoxins with altered persistency
US20240018196A1 (en) Topical compositions and uses
KR101830926B1 (ko) 피부 노화를 방지 및/또는 개선하기 위해 사용되는 pedf-유도 폴리펩티드의 용도
ES2784911T3 (es) Nuevas neurotoxinas costridiales recombinantes con mayor duración del efecto
KR101938581B1 (ko) 보툴리눔 독소에 대한 마이크로 구조체 제형화 기술
TWI810228B (zh) 自主神經系統障礙之治療
KR20200011499A (ko) 멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 치료를 위한 보툴리눔 신경독소
RU2800604C2 (ru) Терапевтическое и косметическое применение нейротоксина ботулина серотипа e
US12102705B2 (en) Peptides having inhibitory activity on muscarinic receptor M3
KR101955510B1 (ko) 주름 개선 활성 및 피부 개선 효과를 가지는 펩타이드, 및 이의 용도
JP2022502446A (ja) ボツリヌス神経毒血清型ｅの治療的及び美容的使用
AU2021212352A1 (en) Treatment of skin conditions