BR112019025402A2

BR112019025402A2 - Neurotoxina botulínica para tratamento de distúrbios associados a hiperatividade de melanócito e/ou melanina em excesso

Info

Publication number: BR112019025402A2
Application number: BR112019025402-1A
Authority: BR
Inventors: P.S. Jacky Birgitte; Birgitte P.S. Jacky; Z. Malik Shizazh; Shizazh Z. Malik; Wang Joanne; Joanne Wang; Liu Yi; Yi Liu; Brideau-Andersen Amy; Amy BRIDEAU-ANDERSEN; E. Steward Lance; Lance E. Steward; Q. Le Linh; Linh Q. Le; C. Hsia Edward; Edward C. Hsia
Original assignee: Allergan, Inc.
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2020-06-23
Also published as: CL2019003484A1; JP2020522492A; US20210162027A1; CA3065542A1; AU2018277754A1; US20180344820A1; US10912823B2; CO2019014592A2; KR20200011499A; MX2019014349A; PH12019502721A1; US20230302103A1; CN110891594A; RU2019143639A3; EP3630298A1; WO2018222652A1; JP7096845B2; ZA201907916B; IL270986A; RU2019143639A

Abstract

Trata-se de métodos para tratar tribulações relacionadas à hipermelanose da pele, como hiperpigmentação. Os métodos compreendem administrar uma composição que compreende BoNT/DC.

Description

“NEUROTOXINA BOTULÍNICA PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS ASSOCIADOS A HIPERATIVIDADE DE MELANÓCITO E/OU MELANINA EM EXCESSO” REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício disposto no Pedido Provisório sob o Número de Série U.S. 62/512,792, depositado em 31 de maio de 2017, que é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

[0002] A matéria descrita no presente documento refere-se a métodos para tratamento de atribulações da pele associadas à melanina, em particular, à hipermelanose relacionadas a atribulações tais como hiperpigmentação, pela administração de uma composição que compreende uma toxina clostrídica, como uma neurotoxina botulínica, e em particular o mosaico BoNT/DC de neurotoxina botulínica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Os melanócitos são células especializadas presentes na pele que produzem e distribuem o pigmento de melanina para os queratinócitos circulantes, outro tipo de célula da pele. A cor da pele, cabelos e íris dos olhos é determinada principalmente pela presença ou ausência de melanina. O metabolismo dos melanócitos, o que inclui a produção de melanina (isto é, cor do cabelo e cor da pele) é regulado pelo menos em parte por várias substâncias liberadas principalmente pelos queratinonitos em resposta a hormônios e exposição aos raios UV.

[0004] Os distúrbios dos pigmentos da pele e do cabelo, também conhecidos como atribulações relacionadas à melanina, incluem melasma, perda de pigmento após danos na pele, vitiligo, sardas, manchas incluindo lipomasmoles (nevos) e manchas atípicas (nevos displásicos), dermatofibromas, cisto dermoide, queloides , queratoacantomas, granulomas piogênicos, queratoses seborreicas, queratose actínica, marcas na pele, melanoma e lentigos solares.

[0005] Certas proteínas, tais como as proteínas receptoras (SNARE) de SNAP (proteína solúvel de ligação a NSF), que inclui a sintaxe-3 (Stx-3), a proteína 23 sinaptossomal associada (SNAP-23) e a proteína de membrana associada à vesícula (VAMP, também chamada sinaptobrevina) pode afetar o teor de melanina nos melanócitos (Yatsu et al., J Invest Dermatol, 133(9), 2.237 a 2.246, 2013). A clivagem, ligação e/ou sequestro de proteínas de membrana associadas à vesícula, como o VAMP-2, pode interromper o tráfego vesicular intracelular dos melanócitos e bloquear a melanogênese (formação de pigmentos) em melanossomas (pigmentos especializados que contém vesículas) e/ou liberar ou transferir de vesículas, por exemplo melanossomos, que contém melanina. O VAMP-2 é expressado em melanócitos e talvez associado a melanossomas e SNAP-23 (Scott e Zhao, J Invest Dermatol, 116(2), 296 a 304, 2001; Van Den Bossche et al., Traffic, 7(7), 769 a 778 2006; Wade et al., J. Biol. Chem., 276(23), 19.820 a 19.827, 2001).

[0006] A hiperpigmentação, uma cor de pele irregular e aberrante com manchas de pontos escuros, está associada aos vários distúrbios da pele, o que inclui melasma e lentigos solares, comumente conhecidos como "manchas da idade" ou "manchas no fígado". Os tratamentos para hiperpigmentação incluem: (1) prescrição de agentes clareadores tópicos, como hidroquinona a 4% (HQ), Tri-Luma (combinação de hidroquinona, tretinoína e fluocinolona), retinoides (por exemplo, treninoide, adaptaleno e trazaroteno); (2) procedimentos médicos para remover ou destruir pigmentos, tais como esfoliação química e terapia a laser; e (3) além dos fármacos de venda livre e cosméticos, tais como 2% de HQ e vários extratos de ervas. Os tratamentos atuais para hiperpigmentação têm vários efeitos colaterais, que incluem irritação e inflamação da pele, que é um fator determinante para hiperpigmentação adicional, pois pode levar à hiperpigmentação pós-inflamatória.

[0007] Agentes e métodos para o tratamento de atribulações relacionadas à hipermelanose e, mais particularmente, de atribulações relacionadas à hipermelanose são necessários. As presentes composições e métodos atuais são direcionados para atender a essa necessidade.

BREVE SUMÁRIO

[0008] Em um aspecto, a presente divulgação fornece métodos de tratamento de uma atribulação relacionada à melanina, os métodos compreendem fornecer ou administrar um mosaico de neurotoxina botulínica (BoNT), tal como o mosaico BoNT/DC.

[0009] Em uma modalidade, a atribulação relacionada à melanina é um distúrbio ou doença associada à hiperatividade de melanócito e/ou melanina em excesso. Em uma modalidade, a hiperatividade de melanócito resulta em hiperpigmentação e/ou pigmentação aberrante. Em outras modalidades, a atribulação é, por exemplo, melasma, lentigo solar (lentiginos solares), nevos ou melanoma.

[0010] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica, líquida ou sólida, que compreende o mosaico de neurotoxina botulínica, é fornecida. Em uma modalidade, o mosaico de neurotoxina botulínica é mosaico de BoNT/DC.

[0011] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma composição líquida e é administrada por meio de injeção. Em modalidades, a injeção é intramuscular, intracutânea, intradérmica ou subcutânea. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma composição líquida ou uma composição sólida, e é administrada por via transdérmica ou tópica.

[0012] Em um aspecto, um método de clivagem do VAMP-2 é fornecido, o método compreende o fornecimento ou a administração de uma neurotoxina botulínica (BoNT). Em algumas modalidades, a neurotoxina botulínica é um mosaico de BoNT. Em uma modalidade, o BoNT é um mosaico BoNT/DC.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] A Figura 1A mostra um Western Blot de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; banda superior, controle de carregamento) e proteína de membrana associada à vesícula (VAMP-2, banda inferior) em células de melanócitos de camundongo após tratamento com tampão (controle negativo ou não tratado), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/DC ou uma variante de BoNT/D sem a porção do domínio de ligação, LHn/D;

[0014] A Figura 1B é um gráfico que mostra a quantidade de VAMP-2, normalizada com a quantidade de GAPDH e mostrada como porcentagem do controle não tratado, com base nas intensidades da banda de Western Blot mostradas na Figura 1A, em células de melanócitos de camundongo após tratamento com tampão (controle negativo ou não tratado, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/DC ou uma variante de BoNT/D sem a porção do domínio de ligação, LHn/D;

[0015] A Figura 2A é um gráfico de barras que mostra o nível de melanina nas células de melanócitos de camundongo, em µg/ml por 5 x 105 células, após o tratamento com BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, ou BoNT/DC;

[0016] A Figura 2B é um gráfico de barras que mostra o teor de melanina em células de melanócitos em camundongos, em µg/ml por 106 células, após o tratamento com tampão (controle negativo ou não tratado), BoNT/A, BoNT/D, ou BoNT/DC;

[0017] A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra o teor de melanina, em µg por amostra tecidual, em um modelo equivalente à pele humana, após 14 dias tanto de tratamento tópico com ácido kójico a 2% (controle positivo) quanto tratamento com BoNT/DC a 5 nM e 10 nM, LHn/D a 5 nM e 10 nM, ou BoNT/A (10 nM); e

[0018] A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra a quantidade de melanina na camada basal, mensurada como porcentagem da área da camada basal com manchas positivas para melanina, com base na histologia e uso da coloração Fontana de Masson, de explantes de pele humana seis dias após tanto tratamento tópico, com aplicação, em dias alternados, de 0,3% de ácido kójico (controle positivo, barras com preenchimento horizontal listrado) quanto injeção intradérmica no dia 0 tanto com BoNT/DC nativo (barras com preenchimento pontilhado) quanto com tampão (controle negativo ou não tratado, barras abertas), quando as amostras não foram expostas a UV ou foram expostas a UV.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. DEFINIÇÕES

[0019] Os termos "cerca de" ou "aproximadamente", conforme usado no presente documento significam uma faixa de erro aceitável para o valor específico, como determinado por um versado na técnica, o que dependerá, em parte, de como o valor é mensurado ou determinado (isto é, as limitações do sistema de medição). Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão, por prática na técnica. Quando valores particulares são descritos no pedido e reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de" significa uma faixa de erro aceitável para o valor específico.

[0020] Os termos "administração" ou "administrar" significam a etapa de ministrar (isto é, fazer a administração) uma composição farmacêutica para um indivíduo ou, alternativamente, um indivíduo que recebe uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas divulgadas no presente documento podem ser administradas localmente por vários métodos. Por exemplo, intramuscular, intradérmica, administração subcutânea, administração intratecal, administração intraperitoneal, tópica (transdérmica), instilação e implantação (por exemplo, de um dispositivo de liberação lenta, tal como implante polimérico ou bomba osmótica) podem todas ser vias apropriadas de administração.

[0021] O termo "aliviar" significa uma redução na ocorrência de um sintoma ou condição ou distúrbio. Portanto, o alívio inclui alguma redução, redução significativa, redução quase total e redução total.

[0022] Os termos "toxina botulínica" e "neurotoxina botulínica" (BoNT) são usados de forma intercambiável. Eles significam uma neurotoxina produzida por Clostridium botulinum, além de uma toxina botulínica (ou sua cadeia leve ou cadeia pesada) produzida de forma recombinante por uma espécie não clostrídica. A expressão "toxina botulínica", como usada no presente documento, abrange a toxina botulínica com os sorotipos A, B, C, D, E, F, G e X (Stenmark, dados não publicados), e seus subtipos e quaisquer outros tipos de subtipos da mesma, e mosaico, incluindo DC, CD (Moriishi et al., 1996, Webb et al., 2007, Nakamura et al., 2010, Peng et al., 2012, Rossetto et al., 2014, Berntsson et al., 2013) e FA (também conhecido como H, Yao et al., 2017) ou quaisquer proteínas reprojetadas, análogas, derivadas, homólogas, partes, subpartes, variantes, ou versões, em cada caso, de qualquer dos acima mencionados. "Toxina botulínica", como usado no presente documento, também abrange uma "toxina botulínica modificada". Além disso, "toxina botulínica", como usado no presente documento, também abrange um complexo de toxina botulínica (por exemplo, os complexos 300, 550 (BoNT/DC, Moura et al., 2011), complexos 600 e 900 kDa, além de o componente neurotóxico da toxina botulínica (150 kDa) que não é associado às proteínas complexas. A toxina botulínica com os sorotipos A, B, C, D, E, F, G e mosaicos como DC podem ser observados como BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, e BoNT/DC, respectivamente.

[0023] O termo "toxina clostrídica" refere-se a qualquer toxina produzida por uma cepa de toxina clostrídica que pode executar o mecanismo celular geral pelo qual uma toxina clostrídica intoxica uma célula e engloba a ligação de uma toxina clostrídica a um receptor de toxina clostrídica de baixa ou alta afinidade, a internalização do complexo toxina/receptor, a translocação da cadeia leve da toxina clostrídica no citoplasma e a modificação enzimática de um substrato da toxina clostrídica.

Exemplos não limitativos de toxinas clostrídicas incluem uma toxina botulínica como uma BoNT/A, uma BoNT/B, uma BoNT/C1, uma BoNT/D, uma BoNT/E, uma BoNT/F, uma BoNT/G, um mosaico BoNT/DC, uma toxina tetânica (TeNT), uma toxina Baratii (BaNT) e uma toxina butírica (BuNT). A citotoxina BoNT/C2 e citotoxina BoNT/C3, que não são neurotoxinas, estão excluídas do termo "toxina clostrídica". Uma toxina clostrídica divulgada no presente documento inclui, porém sem limitação, a variantes de toxina clostrídica que ocorrem naturalmente, como, por exemplo, isoformas de toxina clostrídica e subtipos de toxina clostrídica; variantes de toxina clostrídica de ocorrência não natural, como, por exemplo, variantes de toxina clostrídica conservativas, variantes de toxina clostrídica não conservativas, variantes quiméricas de toxina clostrídica e seus fragmentos ativos de toxina clostrídica, ou qualquer combinação das mesmas.

Uma toxina clostrídica divulgada no presente documento também inclui um complexo de toxina clostrídica, além de o componente neurotóxico da toxina clostrídica que não está associado às proteínas complexas.

Como usado no presente documento, o termo "complexo de toxina clostrídica" refere-se a um complexo que compreende uma toxina clostrídica e proteínas associadas a não toxina (NAPs), como, por exemplo, um complexo de toxina botulínica, um complexo de toxina tetânica, um complexo de toxina Baratii, e um complexo de toxina butírica. Exemplos não limitativos de toxinas clostrídicas incluem aqueles produzidos por um Clostridium botulinum, como, por exemplo complexo de BoNT/A de 900 kDa, complexo de BoNT/A de 500 kDa, complexo de BoNT/A de 300 kDa, complexo de BoNT/B de 500 kDa, complexo de BoNT/C1 de 500 kDa, complexo de BoNT/D de 500 kDa, complexo de BoNT/D de 300 kDa, complexo de BoNT/E de 300 kDa, complexo de BoNT/F de 300 kDa, complexo de BoNT/DC de 500 kDa e complexo de BoNT/DC de 300 kDa.

[0024] O termo "ingrediente ativo da toxina clostrídica" refere-se a uma molécula que contém qualquer parte de uma toxina clostrídica que exerce um efeito sobre ou após a administração a um indivíduo ou paciente. Como usado no presente documento, o termo "ingrediente ativo da toxina clostrídica" abrange um complexo de toxina clostrídica que compreende a toxina clostrídica de aproximadamente 150 kDa e outras proteínas chamadas coletivamente de proteínas associadas a não toxina (NAPs), a toxina clostrídica de aproximadamente 150 kDa sozinha, ou a toxina clostrídica modificada, como, por exemplo, toxinas clostrídicas redirecionadas.

[0025] O termo "quantidade eficaz", como aplicado ao ingrediente biologicamente ativo, significa a quantidade do ingrediente que geralmente é suficiente para efetuar uma alteração desejada no indivíduo. Por exemplo, onde o efeito desejado é uma redução em um sintoma associado a um distúrbio relacionado à melanina, uma quantidade eficaz do ingrediente é aquela que causa pelo menos uma redução substancial do sintoma, e sem resultar em toxicidade significativa.

[0026] O termo "quantidade eficaz", quando usado em referência à quantidade de um excipiente ou combinação específica de excipientes adicionados a uma composição de toxina clostrídica, refere-se à quantidade de cada excipiente necessária para obter uma composição de um ingrediente ativo de toxina clostrídica que possua uma estabilidade desejada e/ou atividade. Em outros aspectos desta modalidade, uma concentração terapeuticamente eficaz de um ingrediente ativo da toxina clostrídica reduz um sintoma associado a um elemento como, por exemplo, atribulações relacionadas à melanina, em, por exemplo, no máximo 10%, no máximo 20%, no máximo 30%, no máximo 40%, no máximo 50%, no máximo 60%, no máximo 70%, no máximo 80%, no máximo 90% ou no máximo 100%.

[0027] O termo "cadeia pesada" ou "HC" significa a cadeia pesada de uma neurotoxina botulínica. Tem um peso molecular de cerca de 100 kDa e também pode ser chamado de cadeia H.

[0028] HC significa um fragmento (cerca de 50 kDa) derivado da cadeia pesada de uma neurotoxina botulínica que é aproximadamente equivalente ao segmento terminal carboxila da cadeia pesada, ou a porção correspondente a esse fragmento na cadeia pesada intacta. Acredita-se que contenha a porção da neurotoxina botulínica do tipo natural ou selvagem envolvida em alta afinidade, ligação pré- sináptica a uma célula alvo como, por exemplo, melanócitos.

[0029] HN significa um fragmento (cerca de 50 kDa) derivado da cadeia pesada de uma neurotoxina botulínica que é aproximadamente equivalente ao segmento terminal amina da cadeia pesada, ou a porção correspondente a esse fragmento intacto na cadeia pesada. Acredita-se que contenha a porção da neurotoxina botulínica do tipo natural ou selvagem envolvida na translocação da cadeia leve através de uma membrana endossômica intracelular.

[0030] O termo "cadeia leve" ou "LC" significa a cadeia leve de uma neurotoxina clostrídica. Ela tem um peso molecular de cerca de 50 kDa, e pode ser chamada de cadeia L, L, ou como domínio proteolítico (sequência de aminoácidos) de uma neurotoxina botulínica.

[0031] LC-HN/LHN significa fragmento de BoNT (cerca de 100 kDa) constituído pelo domínio da cadeia leve e de translocação. Da mesma forma, LC-HN de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, mosaico DC pode ser referido como LC-HN/A, LC-HN/B, LC-HN/C, LC-HN/D, LC-HN/E, LC-HN/F, LC-HN/G, e LC-HN/DC, respectivamente.

[0032] LHN ou L-HN significa um fragmento derivado de uma neurotoxina clostrídica que contém a cadeia L ou um fragmento funcional do mesmo acoplado ao domínio HN. Pode ser obtido a partir da neurotoxina clostrídica intacta por proteólise, para remover ou modificar o domínio HC. Da mesma forma, LHN de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, mosaico DC pode ser referido como LHN /A, LHN /B, LHN /C, LHN /D, LHN /E, LHN /F, LHN /G, e LHN /DC, respectivamente.

[0033] O termo "administração local" significa administração direta de um fármaco ou a uma região próxima de um local dentro do corpo animal, no local em que é desejado um efeito biológico do fármaco, tal como via, por exemplo, intramuscular ou intra- ou injeção subdérmica ou administração tópica. A administração local exclui vias sistêmicas de administração, como administração endovenosa ou oral. A administração tópica é um tipo de administração local na qual um agente farmacêutico é aplicado à pele do paciente.

[0034] O termo "toxina botulínica modificada" significa uma toxina botulínica que teve pelo menos um de seus aminoácidos excluídos, modificados ou substituídos, em comparação com uma toxina botulínica original. A toxina botulínica modificada pode ser uma neurotoxina produzida de forma recombinante, ou um derivado ou fragmento de uma neurotoxina produzida de forma recombinante. Uma toxina botulínica modificada retém pelo menos uma atividade biológica da toxina botulínica original, como a capacidade de se ligar a um receptor de toxina botulínica ou a capacidade de inibir a liberação de neurotransmissores de um neurônio. Um exemplo de toxina botulínica modificada é uma toxina botulínica que possui uma cadeia leve de um sorotipo de toxina botulínica (tal como o sorotipo A) e uma cadeia pesada de um sorotipo diferente de toxina botulínica (tal como o sorotipo B). Outro exemplo de uma toxina botulínica modificada é uma toxina botulínica acoplada a um neurotransmissor, tal como a substância P.

[0035] O termo "mutação" significa uma modificação estrutural que ocorre naturalmente em uma sequência de proteína ou ácido nucleico. Por exemplo, no caso de mutações de ácidos nucleicos, uma mutação pode ser uma deleção, adição ou substituição de um ou mais nucleotídeos na sequência de DNA. No caso de uma mutação de sequência proteica, a mutação pode ser uma deleção, adição ou substituição de um ou mais aminoácidos em uma sequência proteica. Por exemplo, um aminoácido específico que compreende uma sequência de proteínas pode ser substituído por outro aminoácido, por exemplo, um aminoácido selecionado de um grupo que inclui os aminoácidos alanina, aspargina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptofano, tirosina ou qualquer outro aminoácido natural ou não natural ou aminoácidos quimicamente modificados. Mutações em uma sequência de proteínas podem ser o resultado de mutações em sequências de DNA que, quando transcritas, e o mRNA resultante traduzido, produzem a sequência de proteínas mutadas. Mutações em uma sequência de proteína também podem ser criadas pela fusão de uma sequência de peptídeo que contém a mutação desejada em uma sequência de proteína desejada.

[0036] O termo "paciente" significa um indivíduo humano ou não humano que recebe cuidados médicos, cosméticos ou veterinários. Consequentemente, as composições divulgadas no presente documento podem ser usadas no tratamento de qualquer animal, como, tais como, mamíferos, ou semelhantes.

[0037] O termo "composição farmacêutica" significa uma composição que compreende um ingrediente farmacêutico ativo, tal como, por exemplo, um ingrediente ativo da toxina clostrídica, como uma toxina botulínica, e pelo menos um ingrediente adicional, tal como, por exemplo, um estabilizador ou excipiente ou semelhante. Uma composição farmacêutica é, portanto, uma formulação adequada para administração diagnóstica, terapêutica ou cosmética a um indivíduo, tal como um paciente humano. A composição farmacêutica pode estar, por exemplo, em uma condição liofilizada ou seca a vácuo, uma solução formada após a reconstituição da composição farmacêutica liofilizada ou seca a vácuo, ou como uma solução ou sólido que não requer reconstituição.

[0038] O termo "excipiente farmacologicamente aceitável" é sinônimo de "excipiente farmacológico" ou "excipiente" e refere-se a qualquer excipiente que tenha substancialmente nenhum efeito prejudicial permanente ou de longo prazo quando administrado ao mamífero e engloba compostos como, por exemplo, agente estabilizador, um agente de volume, um crioprotetor, um tioprotetor, um aditivo, um veículo, um transportador, um diluente ou um auxiliar. Um excipiente geralmente é misturado com um ingrediente ativo, ou é permitido diluir ou incluir o ingrediente ativo e pode ser um agente sólido, semissólido ou líquido. Também está previsto que uma composição farmacêutica que compreende um ingrediente ativo da toxina clostrídica, pode incluir um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis que facilitam o processamento de um ingrediente ativo em composições farmacêuticas aceitáveis. Qualquer excipiente farmacologicamente aceitável, desde que não seja incompatível com o ingrediente ativo da toxina clostrídica, é contemplado o seu uso em composições farmacêuticas aceitáveis. Exemplos não limitativos de excipientes farmacologicamente aceitáveis podem ser encontrados em, por exemplo Pharmaceutical Dosage Forms e Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins

Publishers, 7a edição 1999); Remington: The Science e Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro edição, Lippincott, Williams & Wilkins, 20a edição 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., edições, McGraw-Hill Professional, 10a edição 2001); e Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4a edição 2003), cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0039] Os ingredientes que constituem uma composição farmacêutica podem ser incluídos em uma única composição (ou seja, todos os ingredientes que a constituem, exceto qualquer fluido de reconstituição necessário, estão presentes no momento da composição inicial da composição farmacêutica) ou como um sistema de dois componentes, por exemplo uma composição seca a vácuo reconstituída com um veículo de reconstituição que pode, por exemplo, conter um ingrediente não presente na composição inicial da composição farmacêutica. Um sistema de dois componentes pode fornecer vários benefícios, o que inclui o de permitir a incorporação de ingredientes que não são suficientemente compatíveis para armazenamento em prateleira a longo prazo com o primeiro componente do sistema de dois componentes. Por exemplo, o veículo de reconstituição pode incluir um conservante que fornece proteção suficiente contra o crescimento microbiano durante o período de uso, por exemplo, uma semana de armazenamento refrigerado, mas não está presente durante o período de armazenamento de dois anos no freezer, durante o qual pode degradar a toxina. Outros ingredientes, que podem não ser compatíveis com uma toxina botulínica ou outros ingredientes por longos períodos de tempo, podem ser incorporados dessa maneira; isto é, adicionado em um segundo veículo (por exemplo, no veículo de reconstituição) no momento aproximado do uso. Uma composição farmacêutica também pode incluir agentes conservantes, como álcool benzílico, ácido benzoico, fenol, parabenos e ácido sórbico. As composições farmacêuticas podem incluir, por exemplo, excipientes, como agentes tensoativos; agentes dispersantes; diluentes inertes; agentes de granulação e desintegração; agentes ligantes; agentes lubrificantes; conservantes; composições fisiologicamente degradáveis, como gelatina; veículos aquosos e solventes; veículos oleosos e solventes; agentes de suspensão; agentes dispersantes ou umectantes; agentes emulsificantes, demulcentes; tampões; sais; agentes espessantes; enchimentos; antioxidantes; agentes estabilizadores; os materiais poliméricos ou hidrofóbicos farmaceuticamente aceitáveis e outros ingredientes conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Genaro, edição, 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., que é incorporado no presente documento por referência.

[0040] O termo "agente de tonicidade" significa um excipiente de baixo peso molecular que é incluído em uma formulação para fornecer isotonicidade. Dissacarídeos, como trealose ou sacarose, poliálcoois, como sorbitol ou manitol, monossacarídeos, como glicose e sal, como cloreto de sódio, podem servir como agente de tonicidade.

[0041] O termo "polissacarídeo" significa um polímero de mais de dois monômeros de moléculas de sacarídeo. Os monômeros podem ser idênticos ou diferentes.

[0042] O termo “agente estabilizador”, “agente de estabilização” ou “estabilizador” significa uma substância que atua para estabilizar um ingrediente ativo da toxina clostrídica, de modo que a potência da composição farmacêutica seja aumentada em relação a uma composição não estabilizada.

[0043] "Estabilizadores" podem incluir excipientes, e podem incluir proteínas e moléculas não proteicas.

[0044] O termo "formulação terapêutica" significa que uma formulação pode ser usada para tratar e, assim, aliviar um distúrbio ou uma doença, como, por exemplo, um distúrbio ou uma doença associada a uma atribulação relacionada à melanina.

[0045] O termo "administração tópica" exclui administração sistêmica. Em outras palavras, e ao contrário dos métodos transdérmicos terapêuticos convencionais, a administração tópica de toxina botulínica não resulta em quantidades significativas da neurotoxina que passa para o sistema circulatório do paciente.

[0046] O termo "tratar" significa aliviar (ou eliminar) pelo menos um sintoma de uma condição ou distúrbio, tal como, por exemplo, melanina em excesso, tanto temporária quanto permanentemente.

[0047] "VAMP" significa proteína de membrana associada à vesícula ou sinaptobrevina, que inclui VAMP-1, VAMP-2 e VAMP-3.

[0048] O termo "variante" significa uma neurotoxina clostrídica, como o sorotipo A, B, C, D, E, F, G ou mosaico DC que foi modificada para substituir, modificar, adicionar ou excluir pelo menos um aminoácido em relação ao tipo selvagem da toxina botulínica, que é reconhecido por uma célula alvo, internalizada pela célula alvo, e clivam cataliticamente uma proteína SNARE (receptor de proteína solúvel de ligação a NSF) na célula alvo. Um exemplo de um componente variante de neurotoxina pode compreender uma cadeia leve variante de uma toxina botulínica que tem um ou mais aminoácidos substituídos, modificados e excluídos e/ou adicionados. Essa cadeia leve variante pode ter a mesma ou melhor capacidade de prevenir a exocitose, por exemplo, a liberação de vesículas de neurotransmissores. Além disso, o efeito biológico de uma variante pode ser diminuído em comparação com a entidade química parental. Por exemplo, uma cadeia leve variante de uma toxina botulínica tipo A com uma sequência de aminoácidos removida pode ter uma persistência biológica mais curta do que a da cadeia leve parental da toxina botulínica tipo A (ou original). II. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0049] Em um aspecto, é fornecido um método para o tratamento de uma atribulação relacionada à melanina em um paciente. O método compreende administrar ao paciente uma dose ou uma quantidade de toxina clostrídica, como uma neurotoxina botulínica (BoNT), que é eficaz para reduzir o teor de melanina. Em algumas modalidades, as neurotoxinas botulínicas são um mosaico BoNT, BoNT/DC. Em outros aspectos relacionados, métodos para o tratamento de uma atribulação da hipermelanina, como a hiperpigmentação, são fornecidos pela administração de uma composição que compreende um BoNT. Como será demonstrado no presente documento, em modalidades, a composição compreende um mosaico BoNT, BoNT/DC.

[0050] Em um primeiro estudo, detalhado no

Exemplo 1, as células de melanócitos de camundongo foram tratadas com a mesma quantidade de BoNT/A nativo, BoNT/B nativo, BoNT/D recombinante, BoNT/D recombinante, BoNT/DC nativo ou LHn/D recombinante variante de BoNT/D sem a parte do domínio de ligação. Após o tratamento com as toxinas, VAMP-2 e GAPDH foram detectados pelo Western Blot, e o teor de melanina foi medido. Os resultados são mostrados nas Figuras 1A a 1B.

[0051] A Figura 1A mostra a Western Blot das proteínas GAPDH (banda superior, controle de carregamento) e VAMP-2 (banda inferior) nas células de melanócitos de camundongo não tratadas (controle negativo) ou toxinas. A Figura 1B é um gráfico de barras que mostra a quantidade de VAMP-2, normalizada com a quantidade de GAPDH, e mostrada como porcentagem do controle não tratado (com base nas intensidades da banda Western Blot mostradas na Figura 1A). O tratamento de células de melanócitos com BoNT/DC, mas não com BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D ou LHn/D, resultou em diminuição de >90% no VAMP-2. Consequentemente, em um aspecto, é contemplado um método para clivar o VAMP-2 em células de melanócitos da pele, pela administração, a um indivíduo, de uma quantidade de BoNT/DC. A redução do VAMP-2 intacto nos melanócitos da pele resulta em uma diminuição do teor de melanina. Em outro aspecto, é contemplado um método para diminuir o teor de melanina nas células de melanócitos da pele, pela administração, a um indivíduo, de uma quantidade de BoNT/DC para diminuir os níveis de VAMP-2 na pele ou nas células e, assim, diminuir o teor de melanina na pele e/ou melanócitos.

[0052] Nos estudos também detalhados no Exemplo

1, as células de melanócitos de camundongos foram tratadas com BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C ou BoNT/DC. Após um tratamento de 20 horas, o teor de melanina foi medido e os resultados são mostrados na Figura 2A. Para os resultados mostrados na Figura 2B, as células de melanócitos de camundongo foram tratadas com tampão (controle negativo), BoNT/A, BoNT/D ou BoNT/DC. Após um tratamento de 24 horas, o teor de melanina nas células foi medido. O gráfico de barras na Figura 2B mostra o nível de melanina em células de melanócitos em camundongos, em µg/ml por 106 células, após o tratamento com tampão, BoNT/A, BoNT/D ou BoNT/DC. Os dados nas Figuras 2A e 2B mostram que o tratamento de células de melanócitos com BoNT/DC, mas não com BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C ou BoNT/D, resulta em diminuição dos níveis de melanina. O tratamento com BoNT/DC alcançou uma redução de pelo menos cerca de 50% no teor de melanina em relação ao tratamento com outro sorotipo BoNT, como BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, ou BoNT/D, ou em relação a melanócitos não tratados. Nesse sentido, é contemplado um método de tratamento de uma atribulação relacionada à melanina, em que o BoNT/DC é administrado em uma quantidade que fornece pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% de redução no teor de melanina em melanócitos em relação a melanócitos não tratados ou em relação a melanócitos tratados com BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/C ou BoNT/D.

[0053] Em outro estudo, conforme estabelecido no Exemplo 2, foi obtido um modelo de tecido cutâneo humano com base em queratinócitos epidérmicos e melanócitos normais, derivados de humanos, cultivados para formar um modelo altamente diferenciado e multicamada da epiderme humana. As amostras técnicas foram tratadas em duas concentrações (5 nM ou 10 nM) com BoNT/DC nativo ou LHn/D ou com 10 nM de BoNT/A nativo nos dias 1, 4, 8 e 12 e avaliadas quanto ao teor de melanina nos dias 5, 8, 11 e 15. Como controle, alguns amostras técnicas foram testadas em paralelo com a água (controle negativo ou não tratado) ou com 2% de ácido kójico (controle positivo), aplicado topicamente. Dados representativos nos quais o teor de melanina no tecido modelo medido no dia 15 são mostrados na Figura 3. O tratamento com BoNT/DC, mas não com BoNT/A, proporcionou uma redução substancial nos níveis de melanina. Os dados mostram que o tratamento com 10 nM de BoNT/DC alcançou uma redução de cerca de 40% no teor de melanina em comparação com o tratamento na mesma concentração de BoNT/A. Neste estudo, a viabilidade das células no tecido modelo após o tratamento foi medida usando o ensaio MTT (MatTek Corp., MTT-100) para confirmar que o tratamento com BoNT/DC não afetou a viabilidade celular (dados não mostrados).

[0054] Outro estudo é descrito no Exemplo 3. Neste estudo, amostras de pele humana foram mantidas por 10 dias com ou sem exposição diária a UV. O BoNT/DC foi injetado por via intradérmica no dia 0 e o ácido kójico foi aplicado topicamente a cada dois dias. Os explantes foram avaliados por histologia para avaliar a morfologia geral (tricrômico de Masson) e o teor de melanina (Fontana de Masson) no dia 6 do estudo. Todas as doses de BoNT/DC (2,5 a 10 nM) foram bem toleradas com base na histologia (dados não mostrados). A Figura 4 mostra o teor de melanina nos explantes de tecidos no dia 6 do estudo, medido como porcentagem da área da camada basal que ficou positiva para melanina, com base na histologia usando a coloração Fontana de Masson. Explantes de tecidos tratados com BoNT/DC nativo (barras com preenchimento pontilhado) e exposição a UV tiveram uma redução de 50% no teor de melanina em comparação com explantes de tecidos não tratados (controle negativo, barras abertas). Explantes de tecidos tratados com BoNT/DC nativo (barras com preenchimento pontilhado) e sem exposição a UV tiveram uma redução de 30% no teor de melanina em comparação com explantes de tecidos não tratados (controle negativo, barras abertas). Como visto, o efeito de clareamento de 10 nM de BoNT/DC é semelhante ao efeito de clareamento de 0,3% de ácido kójico (controle positivo, barras com preenchimento listrado horizontal).

[0055] Com base nesses estudos, são fornecidos métodos para o tratamento de distúrbios e/ou doenças associadas à hiperatividade de melanócito e/ou melanina em excesso. Os métodos compreendem a administração a um paciente com necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente BoNT que é (i) absorvido por melanócitos e (ii) cliva, liga-se ao sequenciador de VAMP. Em algumas modalidades, VAMP é VAMP-2. Em algumas modalidades, o agente é uma toxina de mosaico BoNT/DC.

[0056] "BoNT/DC" e "mosaico BoNT/DC" pretendem uma toxina original ou recombinante que compreende uma cadeia leve homóloga à cadeia leve e o domínio de translocação do BoNT/D e o domínio de ligação BoNT/D e o domínio de ligação homólogo ao domínio de ligação do BoNT/C.

[0057] Exemplos de BoNT/DC que produzem cepas incluem, por exemplo BoNT/DC VPI 5995 (ACESSO: EF378947); BoNT/DC D 4947 (ACESSO: AB037920); BoNT/DC África do sul

(ACESSO: D38442); BoNT/DC África do sul (ACESSO: BAA07477); BoNT/DC OFD04, OFD05, OFD08, OFD09, OFD12, OFD13, OFD16, e OFD17 (ACESSO: AB461914, AB461915, AB461916, AB461917, AB461918, AB461919, AB461920, e AB461921); BoNT/DC It1 (Cedric Woudstra (ANSES, França) (ACESSO: CM003329 JENO01000000); BoNT/DC DC5 (ACESSO: NZ_JDRY01000170).

[0058] Em algumas modalidades, o mosaico de toxinas é produzido a partir de uma fonte não clostrídica. Exemplos de mosaico de toxinas não clostrídica incluem, por exemplo, Weissella oryzae SG25T.

[0059] Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de mosaico BoNT/DC para clivar VAMP-2 e, assim, reduzir ou diminuir o teor de melanina na célula, a fim de tratar a atribulação relacionada à melanina.

[0060] Enquanto os exemplos ilustram uma BoNT preferida, um versado na técnica entenderá que os métodos podem ser alcançados pelo uso de outros BoNTs, como outros mosaicos de BoNTs, ou uma neurotoxina modificada que tenha pelo menos um de seus aminoácidos excluídos, modificados ou substituídos, em comparação com uma toxina original, ou a neurotoxina botulínica modificada pode ser uma neurotoxina botulínica produzida recombinante ou um derivado ou seu fragmento. Em certas modalidades, a toxina modificada tem uma capacidade de direcionamento celular alterada para uma célula neuronal ou não neuronal de interesse. Essa capacidade alterada é alcançada pela substituição do domínio de direcionamento que ocorre naturalmente de uma toxina botulínica por um domínio de direcionamento que mostra uma atividade de ligação seletiva para um receptor de toxina não-botulínica presente em uma célula-alvo de toxina não- botulínica. Tais modificações em um domínio de direcionamento resultam em uma toxina modificada que é capaz de se ligar seletivamente a um receptor de toxina não botulínica (receptor alvo) presente em uma célula alvo de toxina não botulínica (redirecionada). Uma toxina botulínica modificada com uma atividade de direcionamento para uma célula-alvo da toxina não-botulínica pode se ligar a um receptor presente na célula-alvo da toxina não botulínica, translocar-se no citoplasma e exercer seu efeito proteolítico na célula-alvo. Em essência, uma cadeia leve da toxina botulínica que compreende um domínio enzimático é entregue intracelularmente a qualquer célula desejada, pela seleção de domínio de direcionamento apropriado.

[0061] A toxina clostrídica, como uma toxina botulínica, para uso de acordo com os métodos descritos no presente documento, pode ser armazenada na forma liofilizada, seca a vácuo, em recipientes sob pressão a vácuo ou como líquidos estáveis. Antes da liofilização, a toxina botulínica pode ser combinada com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, estabilizadores e/ou transportadores, tais como, por exemplo, albumina, ou similares. Excipientes ou estabilizadores aceitáveis incluem excipientes de proteínas, como albumina ou gelatina, ou similares, ou excipientes não proteicos, que incluem poloxâmeros, sacarídeos, polietilenoglicol ou similares. Em modalidades contendo albumina, a albumina pode ser, por exemplo, albumina sérica humana ou albumina humana recombinante, ou similares. O material liofilizado pode ser reconstituído com um líquido adequado, como, por exemplo, solução salina, água ou similar, para criar uma solução ou composição contendo a toxina botulínica a ser administrada ao paciente.

[0062] Em algumas modalidades, o derivado de clostrídica é fornecido em um sistema de liberação controlada, que compreende uma matriz polimérica que encapsula o derivado de clostrídica, em que a quantidade fracionária do derivado de clostrídica é liberada da matriz polimérica por um período prolongado de tempo de maneira controlada. Os sistemas de neurotoxina de libertação controlada foram divulgados, por exemplo, nas patentes U.S.

6.585.993; 6.585.993; 6.306.423 e 6.312.708, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.

[0063] A quantidade de uma toxina clostrídica selecionada para administração local em um tecido alvo pode ser variada com base em critérios como a gravidade da atribulação relacionada à melanina sendo tratada, características de solubilidade da toxina neurotoxina escolhida, bem como idade, sexo, peso e saúde do paciente. Por exemplo, acredita-se que a extensão da área de pele influenciada seja proporcional ao volume de neurotoxina injetada, enquanto a quantidade do efeito supressor de atribulação relacionado à melanina é, para a maioria das faixas de doses, considerada proporcional à concentração da toxina clostrídica administrada. Os métodos para determinar a via de administração apropriada e a dosagem são geralmente determinados caso a caso pelo médico assistente. Tais determinações são rotineiras para os versados na técnica (ver, por exemplo, Harrison's Principles of Internal

Medicine (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14a edição, publicado por McGraw Hill).

[0064] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que é suficiente para reduzir o teor de melanina de um paciente. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 1pg (0,001ng) a cerca de 100 µg. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 0,01 ng a cerca de 10 µg. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 0,1 ng a cerca de 1 µg (1000 ng). Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 1ng a cerca de 500ng. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 10 ng a cerca de 100 ng. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 0,1 ng a cerca de 10 ng. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz varia de cerca de 0,01 ng a cerca de 0,1 ng.

[0065] Em algumas modalidades, o mosaico de toxina botulínica BoNT/DC é administrado como um complexo de toxinas que compreende o componente neurotóxico e proteínas associadas a não toxinas (NAPs). Em algumas modalidades, o mosaico BoNT DC é administrado como um complexo de 550 kD ou um complexo de 300 kD. Em modalidades alternativas, o BoNT/DC é administrado como o componente neurotóxico.

[0066] A quantidade terapeuticamente eficaz de toxina clostrídica, tal como a toxina botulínica, o que inclui um mosaico de BoNT, é administrada por, por exemplo, injeção, como intramusclular, intracutânea, intradérmica, subcutânea, ou similar, instilação, endovenosa,

transdérmica, e tópico. Além disso, por exemplo, a via de administração pode ser injeções dérmicas, fazendo-se uso de micro agulhas ou laser fracionário.

[0067] Em algumas modalidades, os métodos de administração permitem que a neurotoxina seja administrada localmente em um tecido alvo selecionado. Os métodos de administração incluem a injeção de uma solução ou composição contendo a neurotoxina, como descrito acima, e incluem a implantação de um sistema de liberação controlada que libera controladamente a neurotoxina no tecido alvo. Tais sistemas de liberação controlada reduzem a necessidade de injeções repetidas. A difusão da atividade biológica de uma toxina botulínica dentro de um tecido parece ser uma função da dose e pode ser graduada. Jankovic J., et al. Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc., (1994), página 150. Por exemplo, a neurotoxina pode ser administrada de modo que a neurotoxina afete principalmente células dérmicas que se acredita estarem envolvidas na geração de uma atribulação relacionada à melanina.

[0068] A administração local de uma toxina botulínica, de acordo com a presente invenção, por injeção ou aplicação tópica em um tecido alvo, fornece uma alternativa superior à administração sistêmica de fármacos à pacientes para aliviar uma atribulação relacionada à melanina.

[0069] Os distúrbios e/ou doenças associadas à hiperatividade do melanócito e/ou melanina em excesso incluem, por exemplo, hipermelanogênese, hiperpigmentação associada ao melasma, lentigos solares (manchas da idade), nevos na pele e melanoma.

[0070] Em algumas modalidades, é fornecido um método de clivagem de VAMP. O método compreende o contato de uma toxina com o VAMP. Em algumas modalidades, a toxina é uma toxina clostrídica, como uma toxina botulínica, fragmentos ou variantes. Em algumas modalidades, a toxina é um mosaico de toxina botulínica, fragmentos ou variantes das mesmas. Em modalidades alternativas, a toxina é um mosaico de toxinas não clostrídica, fragmentos ou variantes das mesmas. Em algumas modalidades, a toxina botulínica é BoNT/D, fragmentos ou variantes da mesma. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da cadeia leve BoNT/D (LC/D) com o VAMP. Em outras modalidades, a toxina botulínica é BoNT/DC. Em algumas modalidades, VAMP é VAMP-2 ou VAMP-3. Em algumas modalidades, o método compreende o contato da cadeia leve BoNT/DC ou BoNT/D (LC/D), com VAMP-2 ou VAMP-3.

[0071] Em algumas modalidades, um método de clivagem de VAMP-2 é fornecido. O método compreende o contato de uma toxina botulínica, seus fragmentos ou variantes do mesmo com o VAMP-2. Em algumas modalidades, a toxina botulínica, seus fragmentos ou variantes da mesma é fornecida em uma quantidade que atinge pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos pelo menos 90% ou clivagem substancialmente completa (por exemplo, 100%) do VAMP-2. Em algumas modalidades, a toxina botulínica, seus fragmentos ou variantes da mesma compreendem a cadeia leve BoNT/D, BoNT/D (LC/D), cadeia leve BoNT/B ou BoNT/B (LC/B). Nestas modalidades, o VAMP pode ser VAMP recombinante ou de melanócitos lisados ou de melanócitos in vivo.

[0072] Em algumas modalidades, é fornecido um método de clivagem de VAMP-2 e redução do teor de melanina em melanócitos. O método compreende o contato de melanócitos com uma toxina botulínica, fragmentos ou variantes dos mesmos. Em algumas modalidades, a toxina botulínica é um mosaico de BoNT/DC. Em algumas modalidades, o mosaico BoNT/DC é fornecido em uma quantidade que atinge pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou clivagem substancialmente completa (por exemplo, 100%) de VAMP-2 em células de melanócitos. III. EXEMPLOS

[0073] Sem pretender limitar o escopo da divulgação, modalidades de exemplo são estabelecidas pelos Exemplos que se seguem. EXEMPLO 1 TRATAMENTO DE MELANÓCITOS COM BONT/DC PARA REDUÇÃO DE TEOR

DE MELANINA

[0074] As células normais de melanócitos de camundongo (Melan-a) foram cultivadas em meio de crescimento em placas de 6 poços até ~ 80% de confluência. As células foram tratadas em duplicata com 10 nM de tampão (controle negativo ou não tratado), BoNT/A nativo, BoNT/B nativo, BoNT/D recombinante, BoNT/D recombinante, BoNT/DC nativo ou LHn/D recombinante em meio isento de soro. As células foram tratadas por 24 horas com as toxinas e depois incubadas em meio sem soro por 96 horas.

[0075] Após incubação por 96 horas, VAMP-2 e GADPH foram detectados por Western Blot com uso de anti- VAMP-2 e anti-GAPDH. O teor de melanina foi medido com uso de o ensaio de melanina SOLVABLE™ (PerkinElmer). Os resultados são mostrados nas Figuras 1A a 1B.

[0076] Em um estudo semelhante, as células normais de melanócitos de camundongo (Melan-a) foram cultivadas em meio de crescimento em placas de 6 poços até ~ 65-75% de confluência e tratadas em triplicata 10 nM de BoNT/A, BoNT/B nativo , BoNT/C, ou BoNT/DC em meio sem soro por 20 horas, seguido de incubação em meio sem soro por mais 96 horas. O teor de melanina foi medido com uso de ensaio de melanina SOLVABLE™ (PerkinElmer). Os resultados são mostrados na Figura 2A.

[0077] Em um estudo semelhante, células normais de melanócitos de camundongo (Melan-a) foram cultivadas em meio de crescimento em placas de 6 poços até ~ 80% de confluência e tratadas em triplicata com tampão (controle negativo ou não tratado), 10 nM de BoNT/A, BoNT/D recombinante, ou BoNT/DC nativo em meio sem soro por 24 horas, seguido de incubação em meio sem soro por mais 96 horas. O teor de melanina foi medido com uso de ensaio de melanina SOLVABLE™ (PerkinElmer). Os resultados são mostrados na Figura 2B. EXEMPLO 2 BONT/DC REDUZ TEOR DE MELANINA EM MODELO EQUIVALENTE À PELE

HUMANA

[0078] Um modelo de tecido de pele humana, MELANODERM™ (MatTek Corporation) foi obtido. Este modelo é tem, como base, os queratinócitos epidérmicos normais derivados de humanos e melanócitos, cultivados para formar um modelo multicamada e altamente diferenciado da epiderme humana. Os tecidos são coculturas tridimensionais com os melanócitos e queratinócitos na proporção 1:10. As amostras técnicas foram tratadas em duplicata com tampão (controle não tratado), 5 nM ou 10 nM de BoNT/DC nativo, BoNT/A nativo ou LHN/D como controle negativo para captação inespecífica, por entrega basal na mídia nos dias 1, 4, 8 e 12 e avaliados quanto ao teor de melanina nos dias 5, 8, 11 e 15. Como controles, algumas amostras técnicas foram testadas em paralelo com a água (controle não tratado) ou com 2% de ácido kójico (controle positivo), aplicado topicamente.

[0079] As amostras teciduais foram tratadas nos dias 1, 4, 8 e 12 e avaliadas quanto ao teor de melanina nos dias 5, 8, 11 e 15 com uso do ensaio de melanina SOLVABLE™ (PerkinElmer). A viabilidade celular foi avaliada com uso do ensaio MTT (MatTek Corp., MTT-100). O tratamento com BoNT/DC não afetou a viabilidade celular com base no ensaio MTT (dados não mostrados). O teor das melaninas avaliado no dia 15 é mostrado na Figura 3. EXEMPLO 3 BONT/DC REDUZ TEOR DE MELANINA EM EXPLANTE DE PELE HUMANA

[0080] Explantes de pele humana de plastia abdominal de uma mulher branca de 45 anos foram mantidos por 10 dias com ou sem exposição diária a UV (dias 0 a 8). O BoNT/DC foi injetado por via intradérmica (50 µl) no dia 0 e o ácido kójico foi aplicado topicamente a cada dois dias. Os explantes foram avaliados por histologia para avaliar a morfologia geral (tricrômico de Masson) e o teor de melanina (Fontana de Masson) no dia 6 do estudo.

[0081] Todas as doses de BoNT/DC (2,5-10 nM) foram bem toleradas com base na histologia (dados não mostrados). A porcentagem de melanina nos explantes de tecidos é mostrada na Figura 4, onde as barras correspondem ao tratamento da seguinte forma: explantes de tecidos seis dias após a injeção intradérmica com BoNT/DC nativo (barras com preenchimento pontilhado), com o ácido kójico aplicado topicamente como controle positivo (barras com preenchimento listrado horizontal) e não tratado (controle, barras abertas). O efeito clareador de 10 nM de BoNT/DC é semelhante ao efeito clareador de 0,3% de ácido kójico. EXEMPLO 4 TRATAMENTO DE LENTIGOS SOLARES POR BONT/DC

[0082] Uma mulher de 45 anos com pele do fototipo II mostra descoloração marrom desigual hiperpigmentada, manchas escuras de tamanho variável no rosto, diagnosticadas como lentiginas solares. Ela recebe tratamento intraepidérmico com uma formulação de toxina BoNT/DC. Um creme anestésico tópico é aplicado sobre a pele por 30 minutos e completamente removido antes do tratamento.

[0083] A dosagem de 1,5 µg de pó seco a vácuo da toxina BoNT/DC é dissolvido em 1 ml de solução salina a 0,9% estéril para constituir uma solução 10nM que é injetada na derme superior de suas manchas na pele facial através do uso de uma agulha 30-G. A toxina é injetada a 50 µl por local de injeção, com injeções a cada 1 cm2 de distância. A profundidade da injeção é de cerca de 0,5 mm. Um total de cerca de 1,5 µg é injetado no rosto da paciente.

[0084] A avaliação é realizada na linha de base e 3 semanas após o tratamento. A avaliação quantitativa da pigmentação é feita com uso da tecnologia de imagem Canfield RBX. Comparada à linha de base, três semanas após o tratamento, a pele facial da paciente mostra iluminação significativa dos pontos com base na imagem; e ela obtém uma avaliação global mais alta do médico e uma pontuação de satisfação do indivíduo, de pigmentação geral grave a leve. EXEMPLO 5 TRATAMENTO DE MELASMA POR BONT/DC

[0085] Uma gestante de 37 anos com pele com fototipo III apresenta descoloração hiperpigmentada, manchas irregulares marrons nas bochechas, nariz, lábio superior e testa, diagnosticadas como Melasma. Ela recebe tratamento intraepidérmico com uma formulação de toxina BoNT/DC.

[0086] Uma quantidade de 4,5 µg de pó seco a vácuo da toxina BoNT/DC é dissolvida em 3 ml de solução salina a 0,9% estéril para constituir uma solução 10nM que é injetada na epiderme de sua pele facial com uso de um sistema injetor dérmico de múltiplas agulhas. As áreas que mostram descoloração são injetadas com a solução de toxina em vários locais de injeção, os locais de injeção estão separados por cerca de 2 mm, a 2 µl por ponto de injeção. A profundidade da injeção é de cerca de 0,1 mm. Um total de cerca de 4,5 µg é injetado na face da paciente.

[0087] A avaliação é realizada na linha de base e 3 semanas após o tratamento. A avaliação quantitativa da pigmentação é feita com uso da tecnologia de imagem Canfield RBX. Comparada à linha de base, três semanas após o tratamento, pele da face da paciente mostra menos descoloração significativa; e ela obtém uma avaliação global mais alta do médico e uma pontuação de satisfação do indivíduo, de pigmentação geral grave a leve. Embora vários aspectos e modalidades exemplares tenham sido discutidos acima, os versados na técnica reconhecerão certas modificações, permutações, adições e subconjuntos. Pretende-

se, portanto, que as seguintes reivindicações anexas e reivindicações apresentadas a seguir sejam interpretadas para incluir todas as modificações, permutações, adições e subconjuntos que estejam dentro de seu verdadeiro espírito e escopo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar um distúrbio associado a hiperatividade de melanócito ou produção de melanina em excesso caracterizado por compreender: administrar a um paciente que necessita da mesma uma quantidade terapeuticamente eficaz de BoNT/DC.

2. Método para tratar uma atribulação relacionada à hipermelanose da pele caracterizado por compreender: administrar à pele de um paciente com uma atribulação relacionada à hipermelanose uma composição que compreende BoNT/DC.

3. Método para tratar hiperpigmentação da pele caracterizado por compreender: administrar à pele de um paciente que necessita da mesma uma composição que compreende BoNT/DC.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o distúrbio ou atribulação ser selecionado a partir do grupo que consiste em hiper-melanogênese, hiperpigmentação, melasma, lentigos solares, nevos e melanoma.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a dita administração compreender administrar uma composição líquida que compreende BoNT/DC.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a composição líquida compreender um ou mais dentre um agente de tonicidade e um tensoativo.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a dita administração ser por meio de injeção dérmica.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a dita administração compreender administrar uma composição sólida que compreende

BoNT/DC.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 8, caracterizado por a dita administração ser administrada de modo tópico.