KR102550756B1 - 세포로부터 신경전달물질 분비를 저해하는 펩티드, 및 그의 용도 - Google Patents

세포로부터 신경전달물질 분비를 저해하는 펩티드, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

세포로부터 신경전달물질 분비를 저해하는 펩티드, 및 그의 용도를 제공한다.

Description

세포로부터 신경전달물질 분비를 저해하는 펩티드, 및 그의 용도{Peptide inhibiting neurotransmitter release from a cell and use thereof}
세포로부터 신경전달물질 분비를 저해하는 펩티드, 및 그의 용도에 관한 것이다.
SNARE 복합체는 SNAP-25, 신탁신 및 VAMP2를 포함하는 복합체로서 신경전달물질의 배출에 관련된다. 시냅스에서 신경전달물질의 배출은 시냅스 베지클의 뉴론 세포막(neuronal plasma membrane)과의 융합과 관련되고 함께 거동하여 시냅스 융합 복합체를 형성하는 여러 단백질을 요구한다. 이들 단백질은 SNARE 단백질이라고 통칭하는데, SNAP-25, 신탁신, 및 시냅토브레빈(synaptobrevin)을 포함한다. 시냅토브레빈은 VAMP2라고도 한다. VAMP2는 시냅스 베지클 막에 위치하는 반면, SNAP-25 및 신탁신은 세포막과 결합되어 있다. 칼슘 배출은 복합체의 형성을 야기하고, 상기 시냅스 베지클이 상기 세포막에 근접하도록 끌어와서 상기 세포막들이 융합하도록 한다. 상기 융합에 의하여 상기 베지클 중에 포함된 신경전달물질이 시냅스로 배출된다. 상기 신경전달물질은 도파민, 아세틸콜린, 또는 노르에피네프린 등이 포함될 수 있다. VAMP2 유래의 펩티드로서 SNARE 복합체의 형성을 효율적으로 저해할 수 있는 펩티드가 여전히 요구되고 있으나 이러한 SNARE 단백질은 피부의 보호기능 때문에 효율적으로 피부에 작용하지 못하는 단점이 있다.
한편, 치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목적 단백질을 세포 안으로 운반시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 펩티드를 이용하여 세포 내로 약물 전달을 시도하고 있다.
그러나, 이러한 단백질 수송도메인에 융합되지 않더라도 세포 투과성을 갖는 펩티드에 대한 요구가 있다.
일 양상은 신경세포에서 신경전달물질의 분비를 저해하는 펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 양상은 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그를 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공한다.
다른 양상은 피부 미백 또는 주름 개선을 위해 사용하기 위한 상기 펩티드를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다.
다른 양상은 상기 펩티드를 개체에 투여하여 개체의 피부 미백 또는 주름 개선을 위한 방법을 제공한다.
일 양상은 신경세포에서 신경전달물질의 분비를 저해하는 펩티드 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 펩티드를 제공한다.
상기 펩티드의 아미노산은 D- 또는 L-아미노산일 수 있다. 상기 펩티드의 N 말단 또는 C 말단은 변형된 것일 수 있다. 상기 변형은 화학적 변형일 수 있다. 상기 변형은 상기 펩티드의 안정성, 안전성 또는 전달을 돕는 것일 수 있다. 상기 변형은 상기 펩티드의 생리적 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐메톡시카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 부톡시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기 (allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드의 C-말단은 아미노기 (amino group, -NH2), 삼차 알킬기 (tertiary alkyl group) 및 아자이드 (azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것일 수 있다. 상기 변형은 글루탐산 및 아스파르트산의 카르복실기의 에스테르화를 포함할 수 있다. 상기 변형에 의하여 아미노산의 음전하가 제거되고 소수성이 증가되어질 수 있다. 그에 따라 변형된 펩티드는 안정성 및 지방 용해성을 포함한 생체이용률을 증가시킬 수 있고 혈액-뇌 장벽 및/또는 상피 조직을 통하여 쉽게 통과할 수 있도록 하는 것일 수 있다. 상기 펩티드의 N 말단은 아세틸화된 것일 수 있다. 상기 펩티드의 C 말단은 아미노화된 것일 수 있다. 상기 변형은 체내에서 세포내 에스테라제 등에 의하여 가수분해될 수 있는 것일 수 있다.
상기 펩티드는 SNAP-25, 신탁신 및 VAMP2를 포함하는 SNARE 복합체의 형성을 저해하여 신경전달물질의 배출을 억제하는 것일 수 있다. 상기 SNARE 복합체는 예를 들면, SNAP-25, 신탁신1a 및 VAMP2를 포함하는 복합체일 수 있다. 시냅스에서 신경전달물질의 배출은 시냅스 베지클의 뉴론 세포막(neuronal plasma membrane)과의 융합과 관련되고 함께 거동하여 시냅스 융합 복합체를 형성하는 여러 단백질을 요구한다. 이들 단백질은 SNARE 단백질이라고 통칭하는데, SNAP-25, 신탁신, 및 시냅토브레빈(synaptobrevin)를 포함한다. 시냅토브레빈은 VAMP2라고도 한다. VAMP2는 시냅스 베지클 막에 위치하는 반면, SNAP-25 및 신탁신은 세포막과 결합되어 있다. 칼슘 배출은 복합체의 형성을 야기하고, 상기 시냅스 베지클이 상기 세포막에 근접하도록 끌어와서 상기 세포막들이 융합하도록 한다. 상기 융합에 의하여 상기 베지클 중에 포함된 신경전달물질이 시냅스로 배출된다. 상기 신경전달물질은 시냅스를 통하여 방출되는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 신경전달물질은 도파민, 아세틸콜린, 에피네프린, 노르에피네트린, 세로토닌, 히스타민, 글루타메이트, 글리신, 감마아미노부틸산 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 신경전달물질은 예를 들면, 도파민, 아세틸콜린, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 펩티드는 VAMP2를 모사하여 SNARE 복합체의 형성을 저해하여, 신경전달물질이 시냅스로 배출되는 것을 억제할 수 있다. 그에 따라서, 상기 펩티드는 상기 신경전달물질이 시냅스로 배출에 의하여 야기되는 여러 증상을 약화 또는 개선시킬 수 있다. 상기 펩티드는 상기 신경전달물질이 시냅스로 배출에 의하여 야기되는 여러 증상을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 증상은 안검경련, 안면경련, 반측성 안면경련, 사시, 요실금, 빈뇨, 소아뇌성마비로 인한 첨촉기형, 다한증, 두통, 편두통, 상지 근육 경직, 근육간대경련, 경련성 사경, 열항, 뇌성마비, 측두 하악장애, 신경통증, 근육통, 또는 근긴장성 이상증일 수 있다. 상기 펩티드는 피부 미백 또는 주름을 개선할 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 뉴론-엑소사이토시스 매개된 증상을 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 증상은 근긴장 질환(spastic ailments)일 수 있다. 상기 근긴장 질환은 신경통(dystonias), 사시(strabismus), 틱(tics), 안검연축(blepharospasm), 또는 안면 측만증(facial scoliosis)일 수 있다.
상기 펩티드는 고전적 고상 화학적 펩티드 합성법을 통하여 얻어질 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술에 기반을 둔 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 플라스미드 또는 벡터에 도입하고, 이를 숙주세포에 도입하고, 얻어진 세포를 배양하여 상기 펩티드가 배양물 중에 형성되도록 하고, 선택적으로 상기 펩티드를 정제하는 것을 포함할 수 있다.
상기 펩티드는 세포막 투과 펩티드와 융합되어 있거나 융합되어 있지 않은 것일 수 있다. 상기 세포막 투과 펩티드는 융합된 상기 펩티드가 세포막을 통과하는 것을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 세포막 투과 펩티드는 TD1, IMT-P8, Transkin, VP2-2, RBD-1, SN25-2, STX-1, 및 TDb-1로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 펩티드는 펩티드뿐만 아니라 이의 염을 포함하는 것으로 이해된다. 상기 염은 상기 펩티드의 약제학적으로 또는 화장품학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
다른 양상은 상기한 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위해 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약제학적으로 또는 화장품학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 희석제, 또는 부형제일 수 있다. 상기 담체는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등일 수 있다. 상기 희석제는 물, 버퍼, 또는 염수일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약제학적으로 또는 화장품학적으로 허용가능한 어주반트를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 화장료 또는 약제학적 또는 식품적 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 임의의 제형, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중 어느 하나의 제형일 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 및 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 및 산화아연 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 제형이 파우더 및 스프레이인 경우, 상기 담체는 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 파우더 중 하나 이상일 수 있다. 특히 스프레이인 경우, 상기 조성물은 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 및 디메틸 에테르와 같은 추진체를 더 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 및 유탁액인 경우, 상기 담체는 용매, 용해화제 및 유탁화제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 담체는 예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 중 하나 이상일 수 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우, 상기 담체는 물, 에탄올 및 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 및 트라칸트 중 하나 이상일 수 있다.
상기 펩티드의 함량은 피부 미백 또는 주름을 개선하기에 유효한 양일 수 있다. 상기 함량은 예를 들면, 상기 조성물 중량 기준으로 0.001 내지 95.0%, 0.001 내지 70.0%, 0.001 내지 50.0%, 또는 0.01 내지 50.0%일 수 있다.
다른 양상은 상기한 펩티드를 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위해 사용하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 담체, 및 어주반트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 펩티드를 피부 미백 또는 주름을 개선하는데 사용하는 과정을 기술한 설명서를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 피부 미백 또는 주름을 개선하기에 유효한 양의 상기한 펩티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 피부 미백 또는 주름을 개선하기 위한 방법을 제공한다.
상기 펩티드는 그 자체 또는 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 상기 투여는 임의의 경로로 투여되는 것일 수 있다. 상기 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 상기 투여는 비강, 점막 또는 피부에 적용하는 것일 수 있다. 상기 개체는 사람 또는 사람이 아닌 동물, 예를 들면 포유동물일 수 있다. 상기 방법은 화장하는 방법일 수 있다.
다른 양상은 상기한 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 전달하는데 사용되는 것이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 상기 벡터는 핵산 구조체, 플라스미드, 또는 바이러스 유래 벡터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터, 예를 들면 포유동물에서 발현 가능한 발현 벡터일 수 있다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 박테리아, 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 CHO(chinese hamster ovary cell)와 같은 알려진 동물 세포일 수 있다.
다른 양상은 상기한 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 SNAP-25, 신탁신 및 VAMP2를 포함하는 SNARE 복합체의 형성을 저해하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 담체 또는 어주반트를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 화장료, 약제학적, 또는 식품 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 뉴론-엑소사이토시스 매개된 증상을 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 증상은 안검경련, 안면경련, 반측성 안면경련, 사시, 요실금, 빈뇨, 소아뇌성마비로 인한 첨촉기형, 다한증, 두통, 편두통, 상지 근육 경직, 근육간대경련, 경련성 사경, 열항, 뇌성마비, 측두 하악장애, 신경통증, 근육통, 또는 근긴장성 이상증일 수 있다. 상기 증상은 근긴장 질환(spastic ailments)일 수 있다. 상기 근긴장 질환은 신경통(dystonias), 사시(strabismus), 틱(tics), 안검연축(blepharospasm), 또는 안면 측만증(facial scoliosis)일 수 있다.
상기 펩티드의 함량, 및 담체 또는 어주반트에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 상기한 펩티드를 포함하는 SNAP-25, 신탁신 및 VAMP2를 포함하는 SNARE 복합체의 형성을 저해하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 담체 및 어주반트 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기한 펩티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 SNARE 복합체의 형성을 저해하기 위한 방법을 제공한다.
상기 방법은 뉴론-엑소사이토시스 매개된 증상을 개선 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 증상은 안검경련, 안면경련, 반측성 안면경련, 사시, 요실금, 빈뇨, 소아뇌성마비로 인한 첨촉기형, 다한증, 두통, 편두통, 상지 근육 경직, 근육간대경련, 경련성 사경, 열항, 뇌성마비, 측두 하악장애, 신경통증, 근육통, 또는 근긴장성 이상증일 수 있다. 상기 증상은 근긴장 질환(spastic ailments)일 수 있다. 상기 근긴장 질환은 신경통(dystonias), 사시(strabismus), 틱(tics), 안검연축(blepharospasm), 또는 안면 측만증(facial scoliosis)일 수 있다.
상기 펩티드는 펩티드 또는 그를 포함하는 조성물의 형태일 수 있다. 투여되는 상기 펩티드의 양은 개체에서 SNARE 복합체의 형성을 저해하기에 유효한 양일 수 있다.
일 양상에 따른 펩티드에 의하면, 피부 미백 또는 주름 개선에 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 벡터, 및 숙주세포에 의하면, 상기 펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 상기 펩티드를 포함하는 조성물 또는 키트에 의하면, 피부 미백 또는 주름 개선, 또는 뉴론-엑소사이토시스 매개된 증상을 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 방법에 의하면, 개체의 피부 미백 또는 주름 개선, 또는 뉴론-엑소사이토시스 매개된 증상을 개선 또는 치료를 효율적으로 할 수 있다.
도 1은 P631 펩티드가 PC12 세포에서 도파민 분비에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 2는 P631 펩티드가 PC12 세포에서 아세틸콜린 분비에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 3은 P631 펩티드의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 P631 펩티드가 피부 자극에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 세포를 상기 FITC-P631(빨간색), 또는 FITC-대조군 펩티드(검은색)의 존재하에서 배양하고, FITC 발광에 해당하는 470 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1: 신경전달물질 분비 저해능을 갖는 펩티드의 선별 및 그 효능의 확인
신경세포에서 SNARE Complex가 형성되며 아세틸콜린과 같은 신경전달물질이 세포 외에 방출되고 근육세포의 수용체와 결합하면 자극이 전달된다. 이 자극은 근육세포들의 수축을 이끌어내고 이 결과로서 얼굴의 주름이 생긴다. 여기서 SNARE Complex의 형성을 막으면 근육 수축을 막아 주름을 제거할 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소는 SNARE Complex의 형성을 막아 근육 수축을 막아 주름을 제거하는 것으로 알려져 있다. 보툴리눔 독소는 SNARE Complex를 이루는 단백질의 특정 부위를 잘라내어, 정상적인 Complex 형성을 저해한다. 따라서 펩타이드를 이용하여 SNARE Complex의 형성을 저해한다면 주름 개선효과를 보일 수 있다.
본 실시예에서는 SNARE 복합체의 형성을 저해하는 펩티드를 선별하고, 신경전달물질 분비 저해능, 주름 개선 및 피부 미백에 미치는 효능을 확인하였다.
1. 후보 펩티드의 합성
본 실시예에서 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단은 아세틸기로 보호되어 있고, C-말단은 아미노기로 보호되어 있는 폴리펩티드를 합성하였다. 상기 폴리펩티드는 이하 'P631'이라고도 한다. 상기 폴리펩티드는 SNARE Complex를 이루는 VAMP2의 v-snare 코일드-코일 도메인(v-snare coiled-coil domain)의 일부 부분을 주형으로 삼고 이를 변형시켜 만들었다. 상기 폴리펩티드는 신경세포를 투과하여 신경전달물질 배출을 조절할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 화학 합성을 통해 준비하여 실험을 진행하였다. 상기 P631은 별도의 세포 투과성 펩티드에 연결되어 있지 않다.
2. 신경전달물질 분비 저해능 측정
P631 펩티드가 SNARE 복합체의 형성을 저해하여 신경전달물질의 분비를 저해하는지를 확인하였다. 상기 신경전달물질은 도파민과 아세틸콜린을 선택하였다.
(1) P631 펩티드가 신경세포에서 도파민 분비에 미치는 영향
PC12 세포 (한국세포주은행)를 마트리겔로 코팅한 48-웰 플레이트에 10% FBS와 NGF(2.5S; alomone labs, N-100) 50 mg/mL을 포함하는 RPMI1640 배지에서 37℃에서 7일간 배양하였다. 이후, 5% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 추가로 3일간 37℃로 배양하였다. PC12 세포는 랫트의 부신 수질(adrenal medulla)에 발생한 크롬친화세포종(pheochromocytoma)에서 유래된 세포주이다. 부신 수질에서 카테콜아민 분비기능을 하는 크롬친화세포(chromaffin cells)는 이미 분화되어 분열하지 않으므로, 크롬친화세포를 연구하기 위해 배양 가능한 PC12 세포가 흔히 사용된다.
배양이 끝난, PC-12 세포에 RPMI1640 배지 단독 (도 1에서 대조군1 및 대조군2) 또는 20 μM의 P631 펩티드를 함유하는 RPMI1640을 첨가하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 저 농도 칼륨 이온 함유 크렙 완충액 (118mM NaCl, 1.2mM MgSO4, 2.5mM CaCl2, 5mM KCl, 24mM NaHCO2, 2mM KH2PO4, 및 11mM 덱스트로스, pH 7.4)으로 모든 웰을 3번 세척하였다. 이후, 배지를 펩티드 미함유-탈분극 미진행 군(도 1에서 대조군1)에는 저농도 칼륨 이온 함유 크렙 완충액 0.1 mL/well을 첨가하고, 펩티드 미함유-탈분극 진행 군(도 1에서 대조군2) 및 P631 펩티드-함유 탈분극 진행 군(도 1에서 실험군)에는 고 칼륨 이온 함유 크렙 완충액 (56mM NaCl, 1.2 mM MgSO4, 2.5mM CaCl2, 68mM KCl, 24mM NaHCO3, 2mM KH2PO4, 및 11mM 덱스트로스, pH 7.4)을 0.1 mL/well 넣어주고 37℃에서 8분간 두어 탈분극(depolarization)을 유도하였다. 탈분극이 완료된 세포의 상등액을 0.315 mL/well씩 채취하여 새로운 48-웰로 옮기고 Dopamine ELISA kit (Abnova, KA1887)의 매뉴얼에 따라 ELISA를 진행하여 배지 중에 분비된 도파민의 양을 측정하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 P631 펩티드가 PC12 세포에서 도파민 분비에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 펩티드 무처리 및 탈분극을 진행한 군 즉, 대조군2 및 P631 펩티드 처리 및 탈분극 진행 군 즉, 실험군의 도파민 분비율은 각각 100% 및 11%이었다. 이는 P631 펩티드가 탈분극된 신경 세포에서 도파민 분비를 저해한다는 것을 나타낸다.
(2) P631 펩티드가 신경세포에서 아세틸콜린 분비에 미치는 영향
PC12 세포 (한국세포주은행)를 마트리겔로 코팅한 48-웰 플레이트에 10% FBS와 NGF(2.5S; alomone labs, N-100) 50 mg/mL을 포함하는 RPMI1640 배지에서 37℃에서 7일간 배양하였다.
배양이 끝난, PC-12 세포에 RPMI1640 배지 단독 (도 2에서 대조군1 및 대조군2) 또는 20 μM의 P631 펩티드를 함유하는 RPMI1640을 첨가하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 저 농도 칼륨 이온 함유 크렙 완충액 (118mM NaCl, 1.2mM MgSO4, 2.5mM CaCl2, 5mM KCl, 24mM NaHCO2, 2mM KH2PO4, 및 11mM 덱스트로스, pH 7.4)으로 모든 웰을 3번 세척하였다. 이후, 배지를 펩티드 미함유-탈분극 미진행 군(도 2에서 대조군1)에는 저농도 칼륨 이온 함유 크렙 완충액 0.1 mL/well을 첨가하고, 펩티드 미함유-탈분극 진행 군(도 2에서 대조군2) 및 P631 펩티드-함유 탈분극 진행 군(도 2에서 실험군)에는 고 칼륨 이온 함유 크렙 완충액 (56mM NaCl, 1.2 mM MgSO4, 2.5mM CaCl2, 68mM KCl, 24mM NaHCO3, 2mM KH2PO4, 및 11mM 덱스트로스, pH 7.4)을 0.1 mL/well 넣어주고 37℃에서 8분간 두어 탈분극(depolarization)을 유도하였다. 탈분극이 완료된 세포의 상등액을 0.07 mL/well씩 채취하여 새로운 48-웰로 옮기고 Acetylcholine ELISA kit (AAT bioquest, 111403)의 매뉴얼에 따라 ELISA를 진행하여 배지 중에 분비된 아세틸콜린의 양을 측정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 P631 펩티드가 PC12 세포에서 아세틸콜린 분비에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 펩티드 무처리 및 탈분극을 진행한 군 즉, 대조군2 및 P631 펩티드 처리 및 탈분극 진행 군 즉, 실험군의 아세틸콜린 분비율은 각각 100% 및 39%이었다. 이는 P631 펩티드가 탈분극된 신경 세포에서 아세틸콜린 분비를 저해한다는 것을 나타낸다.
2. P631 펩티드의 독성 확인
(1) 원료물질 독성실험: MTT 분석
한국 세포주 은행에서 구매한 HDF (Human Dermal Fibroblasts) 세포를 96-웰 플레이트에 8x103 cell/well의 농도로 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 100uL에 접종하고 24시간 배양하였다. HDF 세포는 사람으로부터 유래된 섬유아 세포이다. 그 후, P631 펩티드를 농도별 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 및 50uM로 DMEM 배양액에 희석하여 교체하여 24시간 배양하였다.
24시간 이후 상기 DMEM 배지에 MTT 용액을 20 μL를 첨가하여 최종적으로 MTT 농도가 0.5 mg/mL이 되도록 하였다. MTT 첨가 후 세포를 37℃ 5% CO2 배양기에서 4시간 배양하였다. 플레이트를 1,000rpm에서 10분간 원심분리를 한 뒤 MTT 용액을 제거하였다. 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 DMSO를 200ul 첨가하여 생산된 포르마잔을 녹였다. 상기 플레이트를 Spectra MAX i3 기기에 넣고, 각 웰 중의 시료에 대하여 590nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 P631 펩티드의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, P631 펩티드는 MTT 분석법에서 무처리군 (0 μM)에 비교하여 40 μM까지 세포 생존률이 약 80% 이상으로서 실험 농도인 20 μM에서 세포 독성이 없었다.
(2) 피부자극도 시험
테고사이언스에서 구매한 인공피부(Neoderm®-ED)에 1xPBS와 5% SDS를 인공피부에 골고루 도포하여 각각 음성 대조군과 양성 대조군을 만들었다. 실험군은 20 uM P631 펩티드 20ul를 골고루 도포하였다. 15분간 실온에서 반응시킨 후, 12-웰 배양 플레이트의 웰에 옮겨 37℃ 5% CO2 배양기에서 15분간 배양하였다. 반응이 끝난 인공피부는 PBS로 2회 세척하고 새로운 12-웰 배양 플레이트의 웰로 옮겨 42시간 배양하였다. 배양이 완료되면 0.3mg/ml MTT 용액 2ml를 넣고 세포를 3시간 배양하였다. 상기 플레이트의 각 웰 중의 시료를 0.04N HCl-이소프로판올을 첨가하여 탈색하고 Spectra MAX i3에 넣고, 각 웰 중의 시료에 580nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 P631 펩티드가 피부 자극에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, P631 펩티드는 세포 생존율이 약 103.6%로서 무자극성이었다. 여기서, 세포 생존율이 음성대조군 대비 50% 이상이면 무자극으로 판정하였다.
3. 세포 투과 시험
한국 세포주 은행에서 구매한 NTERA-2 세포주를 신경원 유사(neuron-like) 세포로 분화하였다. NTERA-2 세포주는 다능성(pluripotent)의 인간 배아 암종 세포주이다. 분화된 세포를 6-웰 플레이트에 1.5x106 cell/well의 농도로 FBS와 B-27이 함유된 DMEM/F12 배지 2 mL에 접종하고 24시간 배양하였다. P631 펩티드와 VAMP2의 자연형 펩티드의 N 말단에 FITC를 융합하였다. 상기 펩타이드들을 각각 'FITC-P631', 'FITC-대조군 펩티드'라 한다. 6-웰 플레이트의 기존 배지는 제거하고 DMEM/F12 배지에 두 펩타이드를 20 μM로 각각 준비하여 웰 당 2 mL을 첨가해준 뒤 24시간 배양하였다. 배양 후, 기존 배지를 제거하고 DPBS를 이용하여 세포를 세척해준다. 이후, 0.25 % trypsin EDTA와 DMEM/F12 배지를 이용하여 세포를 떨어뜨려준다. 이후, 세포를 2 % FBS가 첨가된 DPBS(FACS buffer)에 세포를 풀어주고 FACS 분석을 진행한다.
도 5는 세포를 상기 FITC-P631(빨간색), 또는 FITC-대조군 펩티드(검은색)의 존재하에서 배양하고, FITC 발광에 해당하는 470 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리펩티드-FITC는 스크램블 펩티드-FITC에 비하여 형광 강도가 현저하게 높았다. 여기서 'P2'로 표현된 부분을 FITC가 발견된 세포라고 판정하였다. 이는 대조군 펩티드와 달리 P631 펩티드가 세포에 더 잘 투과할 수 있다는 의미가 된다. 도 5에서, 세로 축은 세포수를 나타내고, 가로 축은 FITC의 세기를 나타낸다. P631-P1은 P631을 나타낸다.
서열정보
서열번호 1 (P631): NRRLRLTAAKLLDLLAIFR
서열번호 2-대조군 펩티드 (VAMP2 자연형 펩티드): NRRLQQTQAQVDEVVDIMR

Claims (10)

  1. 신경세포에서 신경전달물질의 분비를 저해하는 펩티드로서, 상기 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 것인 펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드의 N 말단은 아세틸기, 플루오레닐메톡시카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 부톡시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기 (allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인 펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드의 C-말단은 아미노기 (amino group, -NH2), 삼차 알킬기 (tertiary alkyl group) 및 아자이드 (azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인 펩티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 신경전달물질은 도파민, 아세틸콜린, 에피네프린, 노르에피네트린, 세로토닌, 히스타민, 글루타메이트, 글리신, 감마아미노부틸산 또는 이들의 조합인 것인 펩티드.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위해 사용하기 위한 조성물.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위해 사용하기 위한 키트.
  8. 청구항 7에 있어서, 희석제, 부형제, 담체, 및 어주반트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 키트.
  9. 피부 미백 또는 주름 개선에 유효한 양의 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 펩티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 피부 미백 또는 주름 개선을 위한 방법으로서, 상기 투여는 피부에 적용하는 것이고, 상기 방법은 화장하는 것인 방법.
  10. 삭제
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