ES2699432T3 - Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de polipéptidos de neurotoxinas en células - Google Patents

Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de polipéptidos de neurotoxinas en células Download PDF

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Abstract

Un método para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina en células, que comprende las etapas de: a) incubar células susceptibles a la intoxicación con neurotoxinas con un polipéptido de neurotoxina durante un tiempo y bajo condiciones que permiten que el polipéptido de neurotoxina ejerza su actividad biológica; b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente; c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos; d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección con dicho primer anticuerpo de captura, formando así unos primeros complejos de detección, y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección con dicho segundo anticuerpo de captura, formando así unos segundos complejos de detección, en el que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección están conjugados con diferentes enzimas; e) determinar la cantidad de los primeros y los segundos complejos de detección de la etapa d); y f) calcular la cantidad de sustrato roto por dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células por medio de los segundos complejos de detección, determinando con ello la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células.

Description

DESCRIPCIÓN
Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de polipéptidos de neurotoxinas en células La presente invención se refiere a un método para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina en células, que comprende las etapas de: a) incubar células susceptibles a la intoxicación con neurotoxinas con un polipéptido de neurotoxina durante un tiempo y bajo unas condiciones que permiten que el polipéptido de neurotoxina ejerce su actividad biológica; b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente; c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente con el sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente con el sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos; d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección con dicho primer anticuerpo de captura, formando así unos primeros complejos de detección, y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección con dicho segundo anticuerpo de captura, formando así unos segundos complejos de detección, en el que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección están conjugados con diferentes enzimas; e) determinar la cantidad de los primeros y segundos complejos de detección de la etapa d), y f) calcular la cantidad de sustrato roto por dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células por medio de los segundos complejos de detección, determinando con ello la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células. La invención proporciona además un kit para realizar el método de la invención.
Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, concretamente las toxinas botulínicas (BoNT) y la toxina del tétanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales (CNT) se unen específicamente a células neuronales y alteran la liberación de neurotransmisores. Cada toxina se sintetiza como una proteína monocatenaria de aproximadamente 150 kDa no procesada inactiva. El procesamiento postraduccional implica la formación de puentes disulfuro y una proteolisis limitada (melladura, "nicking") por una o más proteasas bacterianas. La neurotoxina activa consiste en dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las c Nt consisten, desde el punto de vista estructural y funcional, en tres dominios, concretamente la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que incluye el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio de unión al receptor (mitad C-terminal); véase, por ejemplo, Krieglstein, 1990, Eur. J. Biochem., 188, 39; Krieglstein, 1991, Eur. J. Biochem., 202, 41; Krieglstein, 1994, J. Protein Chem., 13, 49. Las neurotoxinas botulínicas se sintetizan como complejos moleculares que comprenden la proteína de neurotoxina de 150 kDa y proteínas no tóxicas asociadas. Los tamaños de los complejos se diferencian según la cepa clostridial y el serotipo de neurotoxina concreto, y varían de 300 kDa, más de 500 kDa, y 900 kDa. Las proteínas no tóxicas en estos complejos estabilizan la neurotoxina y la protegen frente a la degradación; véase Silberstein, 2004, Pain Practice, 4, S19-S26.
Clostridium botulinum segrega siete serotipos antigénicamente diferenciados denominados A a G de la neurotoxina botulínica (BoNT). Todos los serotipos junto con la neurotoxina del tétanos (TeNT) relacionada segregada por Clostridium tetani son Zn2+-endoproteasas que bloquean la exocitosis sináptica rompiendo las proteínas SNARE; véase Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Las CNT provocan la parálisis muscular flácida observada en el botulismo y el tétanos; véase Fischer, 2007, PNAS, 104, 10447.
A pesar de sus efectos tóxicos, el complejo de la toxina botulínica se ha empleado como agente terapéutico en un gran número de enfermedades. La toxina botulínica de serotipo A ha sido aprobada para un uso humano en EE. UU. en 1989 para el tratamiento del estrabismo, el blefaroespasmo, y otros trastornos. Está disponible en el mercado como una preparación de proteínas de la toxina botulínica A (BoNT/A), por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan, Inc.) o bajo el nombre comercial DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd). Una preparación de toxina botulínica A sin complejos mejorada está disponible en el mercado con el nombre comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals, LLC). Para aplicaciones terapéuticas, la preparación se inyecta directamente en el músculo que se va a tratar. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo de proteínas y se produce el efecto farmacológico deseado. El efecto de la toxina botulínica solo es temporal, lo cual constituye la razón de que puede ser necesaria la administración repetida de la toxina botulínica para mantener un efecto terapéutico.
Las neurotoxinas clostridiales debilitan la fuerza de los músculos voluntarios y son una terapia eficaz para el estrabismo, la distonía focal, incluyendo la distonía cervical, y el blefaroespasmo esencial benigno. También se ha demostrado que alivian el espasmo hemifacial y la espasticidad focal y, además, son eficaces en una amplia gama de indicaciones distintas, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección de arrugas cosmética; véase Jost, 2007, Drugs, 67, 669.
Durante el proceso de fabricación de las neurotoxinas clostridiales, la determinación cualitativa y cuantitativa de dichas neurotoxinas, así como el control de calidad de los polipéptidos de neurotoxinas biológicamente activos, tiene una importancia concreta. Además, las agencias gubernamentales aceptan solo ensayos de actividad de la toxina botulínica sencillos, fiables y validados. En la actualidad, el bioensayo de LD50 de ratón, un ensayo de la letalidad sigue siendo el "patrón oro" empleado por los fabricantes de productos farmacéuticos para analizar la potencia de sus preparaciones; véase Arnon et al. (2001), JAMA 285, 1059-1070. Sin embargo, en años recientes, se han realizado esfuerzos considerables para encontrar estrategias alternativas para aliviar la necesidad de emplear ensayos con animales y todas las desventajas, costes y problemas éticos asociados con este tipo de ensayos basados en animales. Además, las agencias reguladoras están urgiendo a las empresas farmacéuticas para que apliquen el principio de las tres "R" al ensayo de la potencia de las neurotoxinas botulínicas: "Reducir, Refinar, Reemplazar"; véase Straughan, Altern. Lab. Anim., (2006), 34, 305-313. Como consecuencia, se han desarrollado sistemas de ensayo basados en células para proporcionar alternativas razonables a los métodos que emplean animales vivos. No obstante, en la actualidad, solo están disponibles tres sistemas de ensayo celulares para la determinación de la actividad biológica de las neurotoxinas que han demostrado ser suficientemente sensibles a los polipéptidos de neurotoxinas. Estos sistemas de ensayo basados en células incluyen el uso de neuronas primarias aisladas de embriones de roedores que son diferenciadas in vitro (Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun., 404, 388-392), células madre pluripotentes inducidas diferenciadas neuronales (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci., 126, 426-35), y un subclón de la línea celular SiMa (documento WO 2010/105234 A1).
Sin embargo, el aislamiento de neuronas primarias requiere la muerte de animales y resulta laborioso y lleva mucho tiempo. Además, los sistemas de ensayo que emplean diferentes neuronas primarias muestran grandes discrepancias. De modo similar, la generación de células madre pluripotentes inducidas diferenciadas neuronales resulta difícil y lleva mucho tiempo. Además, el almacenamiento de dichas células es muy problemático. Los ensayos que emplean líneas de células tumorales con frecuencia no son lo suficientemente sensibles a BoNT. Además, son necesarios complejos protocolos de diferenciación para dichas líneas de células tumorales que provocan grandes discrepancias y/o altas tasas de fallos en los ensayos que emplean dichas líneas celulares.
Los ensayos para determinar la actividad biológica de las neurotoxinas clostridiales descritos en la técnica incluyen el análisis de transferencia Western en el que se cuantifica la actividad de las neurotoxinas por medio de la cantidad de sustrato de neurotoxina roto en lisados celulares. En otros ensayos, se mide la actividad de neurotoxinas clostridiales mediante un ELISA de "sandwich" de electroquimioluminiscencia (ECL); véase el documento WO 2009/114748 A1. Además, en este caso, la actividad biológica de la neurotoxina clostridial se determina mediante la detección del sustrato de neurotoxina clostridial roto después del aislamiento del lisado celular. Además, el sustrato de neurotoxina debe concentrarse en ambos ensayos.
El documento WO 2009/114748 A1 describe un ensayo de actividad de BoNT/A con base inmunológica.
El documento WO 2011/047265 A1 describe un ensayo de transferencia de energía de resonancia con un resto de sustrato de sinaptobrevina.
Pellet et al. describen la detección sensible y cuantitativa de la neurotoxina botulínica en neuronas derivadas de células madre embrionarias de ratón (Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 404, 2011, pp. 388-392).
Whitemarsh et al. describen una nueva aplicación de neuronas humanas derivada de células madre pluripotentes inducidas para la detección altamente sensible de neurotoxinas botulínicas (Toxicol. Sci., vol. 126, 2012, pp. 426­ 435).
Straughan describe el avance en la aplicación de las Tres R al ensayo de la potencia en la toxina botulínica de tipo A (ATLA Alternatives to Laboratory Animals 200606 GB, vol. 34, n.° 3, junio de 2006 (2006-06), pp. 305-313).
Shuowei et al. describen el diagnóstico del botulismo desde los síntomas clínicos a ensayos in vitro (Critical Reviews in Microbiology, CRC Press, vol. 33, n.° 2, 1 de enero de 2007 (01-01-2007), pp. 109-125).
El documento WO 2013/049508 A1 describe composiciones y métodos para ensayar la toxigenicidad.
A luz de lo anterior, son muy deseables otros sistemas de ensayo para la determinación de la actividad de polipéptidos de neurotoxinas aceptables por las agencias gubernamentales y/o para proporcionar una alternativa a los sistemas de ensayo basados en animales.
Así, el problema técnico que subyace a la presente invención puede considerarse como el suministro de medios y métodos que satisfacen las necesidades mencionadas. El problema técnico es resuelto por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y a continuación.
La presente invención se refiere, en un primer aspecto, a un método para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina en células, que comprende las etapas de:
a) incubar células susceptibles a la intoxicación con neurotoxinas con un polipéptido de neurotoxina durante un tiempo y bajo condiciones que permiten que el polipéptido de neurotoxina ejerza su actividad biológica;
b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente;
c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos;
d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección con dicho primer anticuerpo de captura, formando así unos primeros complejos de detección, y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección con dicho segundo anticuerpo de captura, formando así unos segundos complejos de detección, en el que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección están conjugados con diferentes enzimas;
e) determinar la cantidad de los primeros y los segundos complejos de detección de la etapa d); y
f) calcular la cantidad de sustrato roto por dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células por medio de los segundos complejos de detección, determinando con ello la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células.
El método de la invención permite la determinación directa de la actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina en células. Esto significa que ya no es necesario la lisis de las células ni el aislamiento o la concentración del sustrato de neurotoxina roto a partir de lisados de células, como sucede en los métodos descritos en la técnica. Por ejemplo, en el ensayo basado en el análisis de la transferencia Western, el sustrato de neurotoxina se concentra mediante la separación y la concentración de los componentes de la muestra respectiva en el gel de SDS poliacrilamida. En el ELISA de "sandwich" de ECL mencionado anteriormente descrito en la técnica, la concentración del sustrato de neurotoxina se realiza empleando anticuerpos que se unen específicamente al sustrato de neurotoxina roto sobre una placa de microtitulación al cual se añade el lisado de células. El sustrato de neurotoxina roto se aísla del lisado mediante la unión del anticuerpo mencionado que provoca la concentración de dicho sustrato de neurotoxina clostridial. Por contraste, el sustrato de neurotoxina roto, tal como se ejemplifica para SNAP-25, puede detectarse directamente en la célula en el método de la invención. A este fin, las células que son susceptibles a la intoxicación por neurotoxinas, según se definen con más detalle en otro punto en la presente, se incuban con un polipéptido de neurotoxina durante un tiempo y bajo condiciones que permiten que el polipéptido de neurotoxina ejerza su actividad biológica. En una siguiente etapa, las células se fijan, por ejemplo, mediante la adición de un agente de fijación, tal como metanol, etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los agentes de fijación mencionados. Opcionalmente, las células se permeabilizaron utilizando al menos un detergente, según se define en otro punto en la presente, tal como Triton X-100, Tween 20, saponina, digitonina o n-octil-p-glucopiranósido. El detergente puede estar comprendido en un tampón apropiado, tal como PBS. Después, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos. En la presente, el primer anticuerpo de captura es capaz de determinar el contenido total o la cantidad de sustrato de neurotoxina en las células uniéndose específicamente a un epitopo apropiado presente en el sustrato de neurotoxina roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas. El segundo anticuerpo de captura reconoce y se une específicamente a un epitopo presente solo en el sustrato roto por neurotoxinas, por ejemplo, mediante su unión específica al sitio roto por neurotoxinas en el sustrato de neurotoxina. Como alternativa, las células pueden ponerse en contacto con una mezcla de dicho primer y segundo anticuerpo de captura, es decir, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura y al menos un segundo anticuerpo de captura simultáneamente, bajo las condiciones mencionadas. En la siguiente etapa, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, formando así los primeros complejos de detección. En una etapa posterior, las células se ponen en contacto con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, formando así los segundos complejos de detección. Como alternativa, las células pueden ponerse en contacto con una mezcla de dicho primer y segundo anticuerpo de detección, es decir, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección y al menos un segundo anticuerpo de detección simultáneamente, bajo las condiciones mencionadas. Como alternativa, después de la permeabilización de las células, estas pueden ponerse en contacto con una mezcla de dicho primer y segundo anticuerpo de captura y dicho primer y segundo anticuerpo de detección simultáneamente, bajo las condiciones mencionadas. En la siguiente etapa, se determinan las cantidades de los primeros y segundos complejos de detección. Por último, la cantidad de sustrato roto por dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células se calcula por medio de los segundos complejos de detección. Con ello se determina la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina directamente en las células.
A continuación se describe el método de la invención con más detalle. Para un cultivo celular, las células susceptibles a una intoxicación con neurotoxinas según se definen en la presente, tales como células neuronales, células SiMa o neuronas derivadas de iPS, primero se siembran en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células SiMa se diferencian en un fenotipo neuronal, por ejemplo, según los procedimientos descritos en el documento WO 2010/105234, y las neuronas derivadas de iPS se diferencian en un fenotipo neuronal, por ejemplo, según los ensayos descritos en el documento WO 2012/135621. Después, las células se intoxican con un polipéptido de neurotoxina, tal como BoNT/A, durante aproximadamente 72 horas. En la posterior etapa, las células se fijan sobre la placa de microtitulación, antes del ensayo ELISA. Para fijar las células, por ejemplo, puede añadirse metanol enfriado en hielo (-20 °C) a las células durante 20 minutos a -20 °C.
Para realizar el ensayo ELISA, las células primero se lavan. Como tampón de lavado puede emplearse, por ejemplo, Triton X-100 al 0,1% en tampón PBS 10 mM (pH 7,4). Después de esto las proteasas endógenas se extinguen con un tampón de extinción, tal como H2O2 al 0,6% en PBS 10 mM (pH 7,4), seguido de otra etapa de lavado. En la siguiente etapa, los sitios de unión libres sobre la placa de microtitulación se bloquean mediante un tampón de bloqueo apropiado, tal como, por ejemplo, BSA al 2% en tampón PBS 10 mM (pH 7,4) y Triton X-100 al 0,05%. Después, las células se permeabilizan utilizando un detergente apropiado. Como tampón de permeabilización puede emplearse, por ejemplo, Triton X-100 al 0,5% en tampón PBS 10 mM. La permeabilización permite la difusión de los anticuerpos a través de los poros formados en las células. Después, las células se lavan mediante un tampón de lavado, tal como se mencionó anteriormente.
En la siguiente etapa, las células permeabilizadas se incuban, por ejemplo, con una mezcla de dos anticuerpos diferentes. La mezcla comprende un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas. Dichos primer y segundo anticuerpo de captura también pueden aplicarse posteriormente. Por ejemplo, el primer anticuerpo de captura puede unirse específicamente al sustrato SNAP-25 roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas, permitiendo con ello la cuantificación de la cantidad total o contenido de SNAP-25 en las células. Además, este primer anticuerpo de captura puede utilizarse para la normalización de la cantidad de SNAP-25 roto en las células, tras su evaluación como se describe en la presente. El segundo anticuerpo de captura se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas y, por tanto, permite la determinación y la detección del sustrato roto por neurotoxinas, tal como SNAP-25 roto con BoNT/A.
La siguiente detección del sustrato de neurotoxina total y del sustrato de neurotoxina roto por neurotoxinas en el método de la invención puede realizarse directamente sobre la placa de microtitulación o placa de cultivo celular, es decir, dentro de las células. De forma ventajosa, no es necesario, por tanto, preparar extractos de células y aislar y/o concentrar el sustrato de neurotoxina a partir del lisado de células en el método de la invención, como sucede en los métodos descritos en la técnica. Después, las células se lavan para eliminar el exceso de anticuerpo no unido al antígeno respectivo. En la posterior etapa, las células permeabilizadas se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección y al menos un segundo anticuerpo de detección. Dichos anticuerpos pueden aplicarse como una mezcla, es decir, de modo simultáneo, o posteriormente. El primer anticuerpo de detección se une específicamente al primer anticuerpo de captura. Con ello se forman los primeros complejos de detección. El primer anticuerpo de detección puede estar dirigido contra la especie de la cual se deriva el primer anticuerpo de captura. Por ejemplo, en el caso de que se emplee el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) como primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 roto por BoNT/A y no roto, puede usarse un anticuerpo anticonejo conjugado con fosfatasa alcalina como primer anticuerpo de detección. El segundo anticuerpo de detección se une específicamente al segundo anticuerpo de captura. Con ello, se forman los segundos complejos de detección. El segundo anticuerpo de detección puede estar dirigido contra la especie de la cual se deriva el segundo anticuerpo de captura. Por ejemplo, en el caso de que se emplee el anticuerpo monoclonal (mAb) de ratón 20-2-5 de la invención descrito en otro punto en la presente como segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 roto por BoNT/A y no roto, puede usarse un anticuerpo antirratón conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) como segundo anticuerpo de detección. Será evidente para los expertos en la técnica que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección están conjugados con diferentes enzimas para permitir la detección específica del respectivo primer y segundo anticuerpo de captura tal como se emplea en el método de la invención. Por ejemplo, puede usarse la detección basada en HRP según se describe en otro punto en la presente para la detección de SNAP-25 rota por BoNT/A y la detección basada en la fosfatasa alcalina para el SNAP-25 total (roto por BoNT/A y no roto). Después las células se vuelven a lavar. En una etapa posterior, se añade un sustrato de HRP fluorogénico a las células. Como sustrato de HRP puede usarse, por ejemplo, Amplex UltraRed (Invitrogen) que se excita a 540 nm y que emite a 600 nm. La incubación con el sustrato de HRP puede realizarse durante un tiempo suficiente para la conversión suficiente de un sustrato por la peroxidasa de rábano. Después de la incubación con el sustrato de HRP, por ejemplo, puede añadirse el sustrato de AP DiFMUP (6,8-difluoro-4-metilumbeliferil fosfato; excitación 360 nm; emisión 450 nm) al sustrato de HRP, y las células se incuban con una mezcla de dichos dos sustratos. La incubación con dicho sustrato de AP se realiza durante un tiempo que permite la conversión suficiente del sustrato por la fosfatasa alcalina. Tal como se conoce en la técnica, un sustrato debe convertirse en una cantidad que sea suficiente, de modo que la señal medida sea al menos tan alta como el valor promedio del blanco más tres desviaciones estándar del promedio, según la definición de límite de detección. El límite de detección puede determinarse como se describe en la bibliografía; véase, por ejemplo, Armbruster y Pry, Clinical Biochem. Rev., 2008, 29 (suplemento 1): S49-S52. Debido a que el pH óptimo de la fosfatasa alcalina se encuentra en la región alcalina, el correspondiente tampón de sustrato es muy alcalino. Si el sustrato de fosfatasa alcalina se añade al sustrato de HRP, la reacción de la peroxidasa de rábano se detiene por el pH alcalino y la fosfatasa alcalina se convierte en DiFMUP. El sustrato de HRP convertido no se ve influido por el pH alcalino. Por último, se mide la fluorescencia de los dos sustratos como sigue:
Amplex UltraRed: Excitación 540 nm; emisión 600 nm
DiFMUP: Excitación 360 nm; emisión 450 nm
Tal como como apreciarán los expertos en la técnica, los sustratos fluorogénicos que son apropiados para la detección del primer y segundo anticuerpo de captura en el método de la invención son solo los que muestran unas longitudes de onda de excitación/emisión diferentes de los sustratos usados. Solo en este caso se puede realizar la detección específica de cada antígeno, es decir, el sustrato de neurotoxina total (tal como SNAP-25 roto por neurotoxina y no roto) y el sustrato de neurotoxina roto (tal como SNAP-25 roto por neurotoxina). Con ello, es posible cuantificar el contenido total de sustrato de neurotoxina y el contenido de sustrato de neurotoxina roto en cada pocillo o placa de cultivo celular al mismo tiempo. A la luz de esto, es posible, de modo ventajoso, automatizar el método de la invención. Tal como se indica en otro punto en la presente, se contempla que los sustratos fluorogénicos elegidos para el método de la invención muestren un desplazamiento suficiente entre los espectros de excitación/emisión para permitir la detección específica del respectivo sustrato. Este requisito lo cumple, por ejemplo, el sustrato de HRP Amplex y sus derivados y el sustrato de AP DiFMUP. Mientras que, en un caso óptimo no existe solapamiento entre los espectros de excitación/emisión de los sustratos fluorogénicos usados, se ha visto que es tolerable un solapamiento de hasta 30% en el área del pico de los espectros de excitación de los sustratos fluorogénicos usados.
Tal como saben también los expertos en la técnica, el método de la presente invención permite la detección y cuantificación directas del sustrato de neurotoxina roto por el polipéptido de neurotoxina en las células, determinando con ello la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células. De forma ventajosa, el método de la invención no requiere la preparación de lisados o extractos celulares ni el aislamiento o concentración del sustrato de neurotoxina roto a partir de los lisados/extractos celulares, que resultan necesarios para los métodos conocidos en la técnica. Como consecuencia de esto, puede ahorrarse en material de muestra. Además, la preparación de la muestra y el número de muestras puede reducirse mediante el método de la invención, puesto que la cantidad de sustrato de neurotoxina total y la cantidad de sustrato de neurotoxina roto en la muestra pueden determinarse al mismo tiempo. En los ensayos descritos en la técnica, las muestras deben subdividirse para detectar ambos antígenos, es decir, el sustrato de neurotoxina total y el sustrato de neurotoxina roto, de modo separado. El método de la invención hace que sea innecesaria la subdivisión de la muestra. Con ello, puede evitarse la falta de homogeneidad que resulta de la subdivisión de las muestras y puede ahorrarse en material de muestra. Además, los antígenos pueden degradarse en los ensayos descritos en la técnica, que pueden falsificar la detección del sustrato de neurotoxina roto. Esto es debido a que, en los ensayos descritos en la técnica, las células se incuban con tampones de lisis que contienen detergente que, sin embargo, no son capaces de inactivar el polipéptido de neurotoxina u otras proteasas endógenas que provocan la degradación del sustrato de neurotoxina tras un almacenamiento prolongado de las muestras. No pueden emplearse tampones de lisis más fuertes en el ELISA de "sandwich" de ECL descrito en la técnica anterior debido al uso requerido del lisado de células en dicho ensayo. Esto es debido a que la agregación de los antígenos mencionados anteriormente puede producir una adsorción no específica de los antígenos sobre la superficie de plástico de las placas de cultivo celular o de microtitulación que, a su vez, altera la detección de los antígenos por los anticuerpos apropiados. Puesto que los anticuerpos para la detección de los antígenos también se ponen en contacto con el lisado, los anticuerpos también pueden agregarse. En este caso, ya no es posible una detección fiable y precisa del antígeno. Los presentes inventores han visto dichas reacciones de degradación empleando ensayos de la transferencia Western para la detección de la actividad biológica de la neurotoxina descritos en la técnica. Tras un almacenamiento prolongado de los lisados a -20 °C, en comparación con muestras de lisados frescas, se ha descubierto que la señal de detección del SNAP-25 total se ha reducido mucho y que la proporción de sustrato de neurotoxina SNAP-25 roto a sustrato de neurotoxina SNAP-25 no roto se ha desplazado hacia los procesos de degradación durante el congelamiento. Los presentes inventores han descubierto que la degradación del sustrato de neurotoxina y/o la inestabilidad de las muestras puede evitarse fijando directamente las células sobre la placa de cultivo celular, porque el sustrato de neurotoxina y la neurotoxina u otras proteasas endógenas son inactivadas inmediatamente por la agregación sobre la placa de cultivo celular. Esto puede lograrse empleando, por ejemplo, la fijación de las células con metanol u otros fijantes o agentes de fijación conocidos en la técnica, tal como etanol, acetona, formaldehído o sus mezclas, u otros agentes de fijación descritos en la presente. El análisis de la estabilidad, por ejemplo, de células SiMa parentales (células de neuroblastoma humanas; DSMZ n.° ACC 164) y neuronas derivadas de iPS (Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci., 126, 426-435) empleando este método de fijación no revela diferencias entre las placas de cultivo frescas y las placas de cultivo celular conservadas durante siete días en la nevera.
Tal como se emplean en la presente, las formas en singular "un/una" y "el/la" incluyen los referentes en singular y en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Como ejemplo, "una célula" se refiere a una célula o a más de una célula.
Tal como se emplea en la presente, el término "aproximadamente", cuando califica un valor de un objeto, número, porcentaje o término mencionado, se refiere a un intervalo de más o menos 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% del valor del objeto, número, porcentaje o término mencionado. Se prefiere un intervalo de más o menos 10%.
Los términos y expresiones "que comprende", "comprende" y "comprende de", tal como se emplean en la presente, son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o indefinidos y no excluyen otros miembros, elementos o etapas del método no mencionados. Evidentemente, el término "comprende" incluye la expresión "consiste en". De modo más específico, el término "comprende", tal como se emplea en la presente, significa que la reivindicación incluye todos los elementos o etapas del método listadas, pero también puede incluir elementos o etapas del método adicionales no nombradas. Por ejemplo, un método que comprende las etapas a), b) y c) incluye, en su sentido más estrecho, un método que consiste en las etapas a), b) y c). La expresión "que consiste en" significa que la composición (o dispositivo o método) tiene los elementos (o etapas) indicados y no más. Por contraste, el término "comprende" puede incluir también un método que incluya otras etapas, por ejemplo, las etapas d) y e), además de las etapas a), b) y c).
En el caso de que se empleen intervalos numéricos en la presente, tal como "en una concentración de entre 1 y 5 micromolar", el intervalo incluye no solo 1 y 5 micromolar, sino también cualquier valor numérico entre 1 y 5 micromolar, por ejemplo, 2, 3 y 4 micromolar.
La expresión "in vitro", tal como se emplea en la presente, indica fuera o externamente del cuerpo animal o humano. Debe entenderse que la expresión "in vitro", tal como se emplea en la presente, incluye "ex vivo”. La expresión "ex vivo" generalmente se refiere a tejidos o células extraídas de un cuerpo animal o humano y mantenidas o propagadas fuera del cuerpo, por ejemplo, en un recipiente de cultivo. La expresión "in vivo", tal como se emplea en la presente, indica dentro o internamente del cuerpo animal o humano.
La expresión "polipéptido de neurotoxina", tal como se emplea en la presente, indica las neurotoxinas de Clostridium botulinum y Clostridium tetani, es decir, toxinas botulínicas (BoNT) y toxina del tétanos (TeNT). De modo más específico, dicha expresión incluye BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, y la neurotoxina del tétanos (TeNT). El polipéptido de neurotoxina y, en particular, su cadena ligera y cadena pesada, pueden derivarse de uno de los serotipos antigénicamente diferentes de las neurotoxinas botulínicas indicadas anteriormente. En un aspecto, dicha cadena ligera y pesada del polipéptido de neurotoxina son la cadena ligera y pesada de una neurotoxina seleccionada del grupo que consiste en: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o TeNT. En otro aspecto, el polinucleótido que codifica dichos polipéptidos de neurotoxina comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO:1 (BoNT/A), SEQ ID NO:3 (BoNT/B), SEQ ID NO:5 (BoNT/C1), SEQ ID NO:7 (BoNT/D), SEQ ID NO:9 (BoNT/E), SEQ ID NO:11 (BoNT/F), SEQ ID NO:13 (BoNT/G) o SEQ ID NO:15 (TeNT). Además, se incluye, en un aspecto, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en una cualquiera de SEQ ID NO:2 (BoNT/A), SEQ ID NO:4 (BoNT/B), SEQ ID NO:6 (BoNT/Cl), SEQ ID NO:8 (BoNT/D), SEQ ID NO:10 (BoNT/E), SEQ ID NO:12 (BoNT/F), SEQ ID NO:14 (BoNT/G) o SEQ ID NO:16 (TeNT). En un aspecto de los medios y métodos de la presente descripción, también se incluye un polipéptido de neurotoxina que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:2 (BoNT/A), SEQ ID NO:4 (BoNT/B), SEQ ID NO:6 (BoNT/Cl), SEQ ID NO:8 (BoNT/D), SEQ ID NO:10 (BoNT/E), SEQ ID NO:12 (BoNT/F), SEQ ID NO:14 (BoNT/G) y SEQ ID NO:16 (TeNT).
En otro aspecto, dicho polinucleótido es un variante de los polinucleótidos mencionados anteriormente que comprenden una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos que, en otro aspecto, puede producir un polipéptido que tiene una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Además, un polipéptido variante de la descripción, en otro aspecto, comprenderá un variante de secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15 o un variante de secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en una cualquiera de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16. El término "idéntico", tal como se emplea en la presente, se refiere a la identidad de una secuencia caracterizada determinando el número de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de ácidos nucleicos o dos secuencias de aminoácidos, en las que las secuencias se alinean de modo que se obtenga el emparejamiento de orden mayor. Puede calcularse empleando técnicas o métodos publicados codificados en programas informáticos, tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul, 1990, J. Mol. Biol., 215, 403). Los valores de porcentaje de identidad, en un aspecto, se calculan a lo largo de la secuencia de aminoácidos completa. Para los expertos en la técnica están disponibles una serie de programas basados en una diversidad de algoritmos para comparar secuencias diferentes. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman producen resultados particularmente fiables. Para realizar los alineamientos de las secuencias, pueden emplearse los programas PileUp (Higgins, 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443; Smith, 1981, Adv. Appl. Math., 2, 482), que son parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group, 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711). Se determinan los valores de identidad de secuencia indicados anteriormente en porcentaje (%) empleando el programa GAP a lo largo de la región de secuencia completa con los siguientes ajustes: peso de hueco: 50, anchura de longitud: 3, apareamiento promedio: 10,000 y desapareamiento promedio: 0,000, que, a menos que se especifique lo contrario, siempre se utilizarán como ajustes estándar para los alineamientos de las secuencias. En un aspecto, cada uno de los variantes de polinucleótidos mencionados anteriormente codifica un polipéptido que conserva una o más de una y, en otro aspecto, todas las propiedades biológicas del respectivo polipéptido de neurotoxina, es decir, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o neurotoxina del tétanos (TeNT). Los expertos en la técnica apreciarán que la actividad biológica completa se mantiene solo después de la activación proteolítica, incluso aunque se concebible que el precursor no procesado pueda ejercer ciertas funciones biológicas o ser parcialmente activo. Las "propiedades biológicas", tal como se emplean en la presente, se refieren a (a) la unión al receptor, (b) la internalización, (c) la translocación a través de la membrana endosómica hacia el citosol y/o (d) la ruptura endoproteolítica de proteínas implicadas en la fusión de membranas de vesículas sinápticas. Los ensayos in vivo para evaluar la actividad biológica incluyen el ensayo de LD50 (LD: dosis letal) de ratón y el ensayo de hemidiafragma de ratón ex vivo según describen Pearce et al. (Pearce, 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol., 128: 69-77) y Dressler et al. (Dressler, 2005, Mov. Disord., 20:1617-1619, Keller, 2006, Neuroscience, 139: 629-637). La actividad biológica se expresa habitualmente en unidades de ratón ("Mouse Units", MU). Tal como se emplea en la presente, 1 MU es la cantidad de componente neurotóxico que mata 50% de una población de ratones especificada después de una inyección intraperitoneal, es decir la LD50 i.p. de ratón. En otro aspecto, los polinucleótidos variantes pueden codificar neurotoxinas que tienen propiedades biológicas mejoradas o alteradas, por ejemplo, pueden comprender sitios de ruptura que están mejorados para el reconocimiento de enzimas o que pueden mejorarse para la unión al receptor o cualquier otra propiedad especificada anteriormente.
Por consiguiente, la expresión "actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina", tal como se emplea en la presente, significa las propiedades biológicas características para un polipéptido de neurotoxina, concretamente, a) la unión al receptor, (b) la internalización, (c) la translocación a través de la membrana endosómica hacia el citosol y/o (d) la ruptura endoproteolítica de proteínas implicadas en la fusión de membranas de vesículas sinápticas. Se contempla que el polipéptido de neurotoxina, tal como se emplea en la presente, muestre al menos una de las propiedades a) a d) mencionadas anteriormente, preferiblemente la ruptura endoproteolítica de proteínas implicadas en la fusión de membranas de vesículas sinápticas, o dos o tres o las cuatro propiedades biológicas listadas en a) a d).
Los aspectos de la presente descripción comprenden, en parte, una célula procedente de una línea celular establecida. Tal como se emplea en la presente, el término "célula" se refiere a cualquier célula eucariota susceptible a una intoxicación por neurotoxinas tales como, por ejemplo, BoNT/A, o cualquier célula eucariota que pueda captar una neurotoxina. El término célula incluye células procedentes de una diversidad de organismos, tales como, por ejemplo, células murinas, de rata, porcinas, bovinas, equinas, de primate y humanas; procedentes de una diversidad de tipos celulares, tales como, por ejemplo, neuronales y no neuronales; y pueden aislarse de una población de células heterogéneas, tejidos u organismos o de partes de estos. Tal como se emplea en la presente, la expresión "línea celular establecida" es sinónima de "línea de células inmortales" o "línea de células transformadas" y se refiere a un cultivo celular de células seleccionadas para la propagación indefinida a partir de una población celular derivada de una fuente de un organismo, tejido u órgano. Por definición, una línea celular establecida excluye un cultivo celular de células primarias. Tal como se emplea en la presente, la expresión "células primarias" son células recolectadas directamente de tejidos u órganos frescos y que no tienen el potencial de propagarse indefinidamente. Por ejemplo, en el método de la invención pueden usarse células neuronales primarias. Una línea celular establecida puede comprender una población heterogénea de células o una población uniforme de células. Una línea de células establecida derivada de una única célula se denomina una línea de células clonal. Una línea celular establecida puede ser una línea cuyas células expresan endógenamente todos los componentes necesarios para las células para someterse al mecanismo celular global por el cual una neurotoxina, tal como BoNT/A, rompe proteolíticamente un sustrato, tal como SNAP-25, e incluye la unión de una neurotoxina a un receptor de neurotoxina, tal como BoNT/A, a un receptor de BoNT/A, la internalización del complejo de neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de neurotoxina desde una vesícula intracelular hacia el interior del citoplasma y la ruptura proteolítica de un sustrato de neurotoxina. Como alternativa, una línea celular establecida puede ser una línea en cuyas células se ha introducido, procedente de una fuente exógena, al menos un componente necesario para las células para someterse al mecanismo celular global por el cual una neurotoxina, tal como BoNT/A, rompe proteolíticamente un sustrato, tal como SNAP-25, e incluye la unión de una neurotoxina a un receptor, tal como BoNT/A a un receptor de BoNT/A, la internalización del complejo de neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de neurotoxina desde una vesícula intracelular hacia el interior del citoplasma y la ruptura proteolítica de un sustrato de neurotoxina. También denominada línea celular genéticamente modificada, las células de esta línea celular establecida, por ejemplo, pueden expresar un FGFR2 exógeno, un FGFR3 exógeno, un SV2 exógeno, un sustrato de neurotoxina exógeno, tal como SNAP-25, o cualquiera de sus combinaciones.
La expresión "una o más células susceptibles a la intoxicación por neurotoxinas", tal como se menciona en la presente, significa una célula que puede someterse al mecanismo celular global por el cual un polipéptido de neurotoxina (por ejemplo, BoNT/A) rompe un sustrato de neurotoxina (por ejemplo, el sustrato SNAP-25 de BoNT/A) e incluye la unión de una neurotoxina a su correspondiente receptor (por ejemplo, la unión de BoNT/A al receptor de BoNT/A), la internalización del complejo de neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de neurotoxina desde una vesícula intracelular hacia el interior del citoplasma y la ruptura proteolítica del sustrato de neurotoxina. Los ensayos para determinar la actividad biológica de los polipéptidos de neurotoxina son muy conocidos en la técnica y también se describen en otro punto en la presente; véase, por ejemplo, Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun., 404, 388-392; Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci., 126, 426-435. Por consiguiente, una "célula susceptible a la intoxicación por neurotoxinas", tal como se emplea en la presente, significa una célula sensible a neurotoxinas. El término mencionado comprende una célula o una línea celular, por ejemplo, una célula primaria aislada o una línea celular de células primarias, o una célula de una línea celular establecida o una línea celular establecida, por ejemplo, células tumorales o líneas de células tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales, tales como células de neuroblastoma o líneas de células de neuroblastoma, según se define en otro punto en la presente. Por ejemplo, dicha línea de células de neuroblastoma puede ser una línea celular SiMa que está disponible en el mercado en DSMZ (ACC 164). Además se describen clones de la línea celular SiMa en el documento WO 2010/105234. Otras líneas de células de neuroblastoma que pueden utilizarse en el método de la invención pueden obtenerse en ATCC o DSMZ, con los siguientes números de ATCC o DSMZ: línea celular N1E-115 con CRL-2263, línea celular Neuro2a con CCL-131, línea celular SH-SY5Y con CRL-2266, línea celular PC12 con CRL-1721, línea celular MHH-NB-11 con ACC 157 (DSMZ) y línea celular SK-N-BE(2) con CRL-2271. Otras células tumorales que son susceptibles a la intoxicación por neurotoxinas son las células P-19 (línea de células de carcinoma embrionario murino) (DSMZ n.° ACC 316). También se incluyen dentro de las células susceptibles a la intoxicación por neurotoxinas las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS), preferiblemente neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas; véase, por ejemplo, Whitemarsh et al. (2012), loc. cit. Dichas neuronas derivadas de iPS humanas también están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Cellular Dynamics. Se describen métodos para generar células iPS, por ejemplo, en Yu et al. (Science, 2009, 8 de mayo, 324(5928):797-801, Epub 2009), el documento WO 2011/056971 y el documento WO 2011/025852. En algunos aspectos, las iPS se diferencian en neuronas empleado métodos adecuados, por ejemplo, los descritos en el documento WO 2012/135621 y en las solicitudes de patente de EE. UU. US 2010/0279403 y US 2010/0216181.
La expresión "fijar las células" significa fijar las células empleando los métodos descritos en la técnica. En general, la fijación es un proceso químico por el cual los tejidos biológicos se conservan frente a la descomposición, evitando con ello la autolisis. La fijación pone fin a cualquier reacción bioquímica en curso y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados. La fijación conserva una muestra de material biológico, tal como un tejido o células, de una forma lo más parecida a su estado natural en el proceso de preparación de dicho tejido o células para su examen o análisis. Para este fin, un fijador habitualmente actúa para incapacitar a biomoléculas intrínsecas (en particular, enzimas proteolíticas), que de otra forma digerirían o dañarían a la muestra. Además, un fijador generalmente protege a la muestra de daños extrínsecos. Los fijadores son tóxicos para la mayoría de los microorganismos habituales, que incluyen las bacterias que pueden existir en un tejido o cultivo de células que de otra forma colonizarían el tejido o cultivo de células fijado. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material fijado provocando que tenga un sabor desagradable, sea indigerible o tóxico para los microorganismos oportunistas. Por último, los fijadores a menudo alteran las células o tejidos a nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o estabilidad. Esta resistencia y rigidez aumentada puede ayudar a conservar la morfología, tal como la forma y la estructura de la muestra cuando se procesa para un posterior análisis. A los expertos en la técnica les resultará evidente que la elección del fijador y del protocolo de fijación puede depender de etapas de procesamiento adicionales y de los análisis finales que se planeen. Por ejemplo, la inmunohistoquímica emplea anticuerpos que se unen específicamente a una proteína diana específica, el antígeno. Una fijación prolongada puede enmascarar químicamente a estas dianas y evitar la unión del anticuerpo. En estos casos, por ejemplo, puede usarse un método de fijación rápida empleando formaldehído frío. Como alternativa, las células pueden fijarse añadiendo metanol (-20 °C). Además de aldehídos, tales como formaldehído o glutaraldehído, y de alcoholes, tales como etanol o metanol, en los protocolos de fijación pueden utilizarse agentes oxidantes, fijador de efecto de protección de disolvente orgánico mediado por tampón ácido glutámico-Hepes (HOPE), acetona, o sus mezclas, tales como una mezcla de metanol y acetona, metanol y etanol, paraformaldehído y Triton X-100, o paraformaldehído y metanol. En un aspecto del método de la invención, la fijación de las células se realiza mediante la adición de un agente de fijación seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, acetona, formaldehído o sus mezclas. Para asegurar y/o soportar el acceso libre del anticuerpo a su antígeno, las células pueden permeabilizarse opcionalmente empleando un tampón de permeabilización apropiado que comprende al menos un detergente, tal como Triton X-100. Un tampón de permeabilización que puede emplearse en el método de la invención es, por ejemplo, Triton X-100 al 0,5% en tampón PBS 10 mM. En otros aspectos de los métodos de la descripción, las células pueden permeabilizarse utilizando un tampón de permeabilización, tal como PBS que comprende al menos un detergente seleccionado de Tween 20, saponina, digitonina o n-octil-p-glucopiranósido. En otros aspectos, pueden usarse mezclas de dos o más de los detergentes mencionados en la presente en dicho tampón de permeabilización. En general, la potencia y tiempo de fijación son considerablemente más cortos para células que para secciones de tejidos más espesas y estructuralmente complejas. Para la inmunocitoquímica, la preparación de la muestra fundamentalmente supone fijar las células diana al portaobjetos, placa de cultivo celular o placa de microtitulación. Una fijación perfecta inmovilizaría a los antígenos, al mismo tiempo que conservaría la arquitectura celular y subcelular auténtica y permitiría un acceso libre de los anticuerpos a todas las células y compartimentos subcelulares. Habitualmente se emplea una amplia gama de fijadores, según se ejemplificaron anteriormente, y la elección correcta del método dependerá de la naturaleza del antígeno que se está estudiando y de las propiedades del anticuerpo utilizado. Los métodos de fijación generalmente pertenecen a dos clases: disolventes orgánicos y reactivos de reticulación. Los disolventes orgánicos, tales como alcoholes y acetona, retiran los lípidos y deshidratan las células, al mismo tiempo que precipitan las proteínas sobre la arquitectura celular. Los reactivos de reticulación, tales como paraformaldehído, forman enlaces intermoleculares, normalmente a través de grupos amino libres, creando así una red de antígenos conectados. Los reticuladores conservan mejor la estructura celular que los disolventes orgánicos, pero pueden reducir la antigenicidad de algunos de los componentes celulares y a menudo requieren la adición de una etapa de permeabilización, tal como se indicó anteriormente, para permitir el acceso del anticuerpo al espécimen. La fijación con ambos métodos puede desnaturalizar los antígenos de proteínas y, por esta razón, los anticuerpos preparados contra proteínas desnaturalizadas pueden ser más útiles para la tinción de células. Debe elegirse el método de fijación apropiado según la aplicación pertinente. Los métodos de fijación de células están bien descritos en la técnica (véase, por ejemplo, Methods in cell biology, volumen 37: Antibodies in cell biology, editado por David J. Asai, 1993, Academic Press Inc.).
La expresión "poner en contacto", tal como se emplea según el método de la invención, significa poner en proximidad cercana las células y los respectivos anticuerpos para que se pueda producir una interacción física y/o química. Las condiciones adecuadas que permiten la interacción específica son muy conocidas por los expertos en la técnica. Evidentemente, dichas condiciones dependerán de los anticuerpos y de las células que se van a aplicar en el método de la presente invención y los expertos en la técnica pueden adaptarlos de la forma habitual. Además, los expertos en la técnica también pueden determinar sin más el tiempo que es suficiente para permitir la interacción. Se entenderá que, entre las etapas individuales de poner en contacto las células y los respectivos anticuerpos indicadas en el método de la presente invención, pueden realizarse etapas de lavado para obtener condiciones adecuadas para el contacto. Por ejemplo, después de poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas en la etapa c) del método de la invención, puede incorporarse una etapa de lavado para retirar la disolución remanente y/o el exceso del primer y segundo anticuerpo de captura, antes de aplicar el primer anticuerpo de detección y/o el segundo anticuerpo de detección. De forma similar, después de poner en contacto las células con el primer y/o el segundo anticuerpo de detección en el método de la invención, puede incluirse una etapa de lavado. Un tampón de lavado apropiado es, por ejemplo, Triton X-100 al 0,1% en tampón PBS 10 mM (pH 7,4). De modo más específico, la expresión "poner en contacto", tal como se emplea en la presente, se refiere a poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos en la etapa c) del método de la invención. El primer y el segundo anticuerpo de captura pueden aplicarse a las células de modo simultáneo, por ejemplo, como una mezcla, o posteriormente. "Poner en contacto" se refiere además a poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección con dicho primer anticuerpo de captura, y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección con dicho segundo anticuerpo de captura en la etapa d) del método de la invención. Con ello se forman los primeros y segundos complejos de detección. Como alternativa, el primer y segundo anticuerpo de detección también pueden aplicarse posteriormente.
Tal como se emplea en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula generada por un sistema inmunológico que se ha fabricado en respuesta a un antígeno concreto, que se une específicamente a ese antígeno, e incluye anticuerpos naturales y anticuerpos no naturales. Un "anticuerpo", tal como se emplea en la presente, incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario, un dímero o un multímero, un anticuerpo quimerizado, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo monocatenario específico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo sintético, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo bifuncional, un anticuerpo asociado a células, tal como un receptor de Ig, un anticuerpo lineal, un diacuerpo, un minicuerpo, o un fragmento de cualquiera de dichos anticuerpos. Los fragmentos de dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, Fv o scFv, o derivados químicamente modificados de cualquiera de estos fragmentos. Los anticuerpos pueden fabricarse empleando métodos que se describen en la técnica; véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales mediante técnicas descritas originariamente en Kohler, 1975, Nature, 256, 495, y Galfre, 1981, Meth. Enzymol., 73, 3. Dichas técnicas comprenden la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Los anticuerpos pueden mejorarse aún más mediante técnicas muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie, tal como se emplea en el sistema Biacore, puede emplearse para aumentar la eficacia de anticuerpos de fagos que se unen al epitopo; véase, por ejemplo, Schier, 1996, Human Antibodies Hybridomas, 7, 97; Malmborg, 1995, J. Immunol. Methods, 183, 7. Un anticuerpo, tal como se emplea en la presente, puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa que comprende dominios VH y VL, así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3, o un fragmento inmunológica activo de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fc, un fragmento Fd, o un fragmento Fv. Un anticuerpo puede derivarse de cualquier especie de vertebrado (por ejemplo, humano, de cabra, caballo, burro, murino, de rata, conejo o pollo), y puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, o IgA), clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM) o subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2). Para la descripción general de la estructura de los anticuerpos naturales, los anticuerpos no naturales y sus fragmentos de unión a compuestos antigénicos véase, por ejemplo, Plueckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering 2a ed. (Oxford University Press). Los anticuerpos naturales son habitualmente glicoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH), seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos aminoácidos concretos forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada.
El sitio de unión al antígeno y de reconocimiento del antígeno completo está contenido dentro de los dominios variables del anticuerpo, es decir, el fragmento Fv. Este fragmente incluye un dímero de un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) en asociación estrecha no covalente. Cada dominio comprende cuatro regiones de marco ("framework regions", FR), que en gran medida adoptan una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina beta. Cada región hipervariable comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde con una región determinante de la complementariedad (CDR). Colectivamente, la configuración tridimensional de las seis regiones de CDR es la que define un sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL que confiere la especificidad de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Cyrus Chothia, et al., Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature, 342(6252):877-883 (1989); Elvin A. Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Los dominios constantes del anticuerpo no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Una "unión selectiva" o "unión específica", tal como se emplea en la presente, incluye propiedades de unión tales como, por ejemplo, afinidad de unión, especificidad de unión y avidez de unión; véase, por ejemplo, David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, p. 240 (1998). La afinidad de unión se refiere a la longitud de tiempo que el anticuerpo reside en su sitio de unión al epitopo y puede considerarse como la fuerza con la que un anticuerpo se une a su epitopo. La afinidad de unión puede describirse como una constante de disociación en equilibrio (KD) del anticuerpo, que se define como la proporción de Kd/Ka en el equilibrio. Ka es la constante de tasa de asociación del anticuerpo y Kd es la constante de tasa de disociación del anticuerpo. La afinidad de unión se determina mediante la asociación y la disociación y, por sí solas, ni una asociación elevada ni una disociación baja pueden asegurar una alta afinidad. La constante de tasa de asociación (Ka), o constante de afinidad (Kon), mide el número de acontecimientos de unión por unidad de tiempo, o la propensión del anticuerpo y el antígeno para asociarse de modo reversible en su complejo de anticuerpo-antígeno. La constante de tasa de asociación se expresa en M-1 s-1, y se simboliza como sigue: [Ab] x [Ag] x Kon. Cuanto mayor sea la constante de tasa de asociación, con más rapidez se une el anticuerpo a su antígeno, o mayor es la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. La constante de tasa de disociación (Kd), o constante de disociación (Koff), mide el número de acontecimientos de disociación por unidad de tiempo, o la propensión de un complejo de anticuerpo-antígeno para separarse (disociarse) de modo reversible en sus moléculas componentes, concretamente el anticuerpo y el antígeno. La constante de tasa de disociación se expresa en s-1, y se simboliza como sigue: [Ab Ag] x Koff. Cuanto más pequeña sea la constante de tasa de disociación, más fuertemente se une el anticuerpo a su antígeno, o mayor es la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. La constante de disociación en equilibrio (KD) mide la tasa en la cual los complejos de anticuerpo-antígeno nuevos formados es igual a la tasa en la cual los complejos de anticuerpo-antígeno se disocian en equilibrio. La constante de disociación en equilibrio se expresa en M, y se define como Koff/Kon = [Ab] x [Ag]/[Ab+Ag], en la que [Ab] es la concentración molar del anticuerpo, [Ag] es la concentración molar del antígeno, y [Ab+Ag] es la concentración molar del complejo de anticuerpo-antígeno, en las que todas las concentraciones son de dichos componentes cuando el sistema está en equilibrio. Cuanto más pequeña sea la constante de disociación en equilibrio, más fuertemente se une el anticuerpo a su antígeno, o mayor es la afinidad de unión entre el anticuerpo y el antígeno. Así, en un aspecto del método de la descripción, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de asociación, por ejemplo, menor que 1 x 105 M-1 s-1, menor que 1 x 106 M-1 s-1, menor que 1 x 107 M-1 s-1 o menor que 1 x 108 M-1 s-1. En otro aspecto, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de asociación, por ejemplo, mayor que 1 x 105 M-1 s-1, mayor que 1 x 106 M-1 s-1, mayor que 1 x 107 M-1 s-1 o mayor que 1 x 108 M-1 s-1. En otro aspecto, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de disociación, por ejemplo, menor que 1 x 10-3 M-1 s-1, menor que 1 x 10-4 M-1 s-1, menor que 1 x 10-5 M-1 s-1 o menor que 1 x 10-6 M-1 s-1. En otro aspecto, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de disociación, por ejemplo, mayor que 1 x 10-3 M-1 s-1, mayor que 1 x 10-4 M-1 s-1, mayor que 1 x 10-5 M-1 s-1 o mayor que 1 x 10-6 M-1s-1. En otro aspecto, el segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de asociación, por ejemplo, menor que 1 x 105 M-1 s-1, menor que 1 x 106 M-1 s-1, menor que 1 x 107 M-1 s-1 o menor que 1 x 108 M-1 s-1. En otro aspecto, el segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de asociación, por ejemplo, mayor que 1 x 105 M-1 s-1, mayor que 1 x 106 M-1 s-1, mayor que 1 x 107 M-1 s-1 o mayor que 1 x 108 M-1 s-1. En otro aspecto, el segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de disociación, por ejemplo, menor que 1 x 10-3 M-1 s-1, menor que 1 x 10-4 M-1 s-1, menor que 1 x 10-5 M-1 s-1 o menor que 1 x 10-6 M-1 s-1. En otro aspecto, el segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas puede tener una constante de tasa de disociación, por ejemplo, mayor que 1 x 10-3 M-1 s-1, mayor que 1 x 10-4 M-1 s-1, mayor que 1 x 10-5 M-1 s-1 o mayor que 1 x 10-6 M-1 s-1.
Un antígeno diana, tal como los sustratos SNAP-25, VAMP/sinaptobrevina o sintaxina rotos por neurotoxinas o no rotos, en general presentan uno o más sitios de unión, también llamados epitopos, que son reconocidos por el sitio de unión al antígeno formado por CDR del anticuerpo. Tal como se emplea en la presente, un "epitopo" es sinónimo de "determinante antigénico", y se refiere al sitio sobre un antígeno diana, tal como, por ejemplo, un péptido, polipéptido, polisacárido o molécula que contiene un lípido, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T o de interaccionar de otra forma con una molécula. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epitopo diferente tiene una estructura diferente. Así, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente. La "unión específica", tal como se menciona en la presente, puede ensayarse mediante diversas técnicas muy conocidas que incluyen, por ejemplo, experimentos de competición y análisis de la transferencia Western. Un epitopo, tal como se emplea según la invención, se refiere al determinante antigénico en los sustratos de neurotoxina, por ejemplo, SNAP-25, VAMP/sinaptobrevina o sintaxina que es reconocido por el anticuerpo. Tal como se emplea en la presente, el término "específicamente" significa selectivamente y se refiere a que tiene un efecto o influencia exclusivo o que reacciona solo de una manera o solo con una cosa. Tal como se emplea en la presente, la expresión "se une específicamente" o "se une selectivamente", cuando se emplea en referencia con un anticuerpo o proteína de unión o dominio de unión, se refiere a la unión discriminatoria del anticuerpo o proteína/dominio de unión con el epitopo diana indicado, de modo que el anticuerpo o proteína/dominio de unión no presenta sustancialmente reacción cruzada con epitopos que no son la diana. El tamaño mínimo de un epitopo de péptido, tal como se define en la presente, es de aproximadamente cinco restos aminoácidos, y un epitopo de péptido generalmente comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, o al menos 30 restos aminoácidos. Un epitopo de péptido puede ser un epitopo lineal o discontinuo. Un epitopo discontinuo comprende restos aminoácidos que no están adyacentes en la estructura primaria del péptido, sino que se juntan para formar un epitopo por medio de la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del péptido. Además, también se advierte que un epitopo puede comprender una porción de una molécula distinta de una secuencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, un resto carbohidrato, un resto de lípido, tal como glicolípidos o lipoproteínas, o un resto aminoácido químicamente modificado, tal como un aminoácido fosforilado.
Según el método de la presente invención, el "primer anticuerpo de captura" se une específicamente a un epitopo formado por el sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas. Dichos sustratos de neurotoxinas pueden ser, por ejemplo, SNAP-25, VAMP/sinaptobrevina, o sintaxina. Por ejemplo, SNAP-25 es un sustrato conocido de BoNT/A, BoNT/C1 y BoNT/E. VAMP/sinaptobrevina es un sustrato de BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, mientras que la sintaxina es un sustrato de BoNT/C1. Dicho primer anticuerpo de captura permite la determinación de la cantidad total, es decir, del contenido completo del respectivo sustrato de neurotoxina en las células. Por ejemplo, en SNAP-25, que tiene una longitud total de 205 restos aminoácidos, el sitio de ruptura para BoNT/A está localizado entre los restos aminoácidos Gln 197 y Arg 198. Por consiguiente, puede utilizarse un anticuerpo que se une específicamente a un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoNT/A, es decir, un epitopo localizado entre los restos aminoácidos 1 y 198 de SNAP-25 como primer anticuerpo de captura. Por ejemplo, dicho anticuerpo puede unirse específicamente a un epitopo N-terminal o a un epitopo colocado en la parte intermedia de SNAP-25. Para BoNT/C1, puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoNT/C1 (Arg 198-Ala 199), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 199 de SNAP-25 como primer anticuerpo de captura. Para BoNT/E, puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoNT/E (Arg 180-Ile 181), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 181 de SNAP-25 como primer anticuerpo de captura. Si se emplea VAMP como sustrato de neurotoxina, puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de (Gln 76-Phe 77), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 77 de VAMP como primer anticuerpo de captura. Puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoNT/D (Lys 59-Leu 60), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 60 de VAMP2 como primer anticuerpo de captura. Puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoNt /F (Gln 58-Lys 59), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 59 de VAMP2 como primer anticuerpo de captura. Puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoN/G (Ala 81-Ala 82), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 82 de VAMP2 como primer anticuerpo de captura. Si se emplea sintaxina como sustrato, puede utilizarse un epitopo colocado N-terminal con respecto al sitio de ruptura de BoN/C1 (Lys 253-Ala 254), es decir, entre los restos aminoácidos 1 y 254 de sintaxina 1a como primer anticuerpo de captura.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/A, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNT/A. En un aspecto, dicha proteína es SNAP-25A humana o SNAP-25B o uno de sus homólogos, parálogos u ortólogos de rata, ratón, bovina, de Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea o Aplysia. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen, por ejemplo, en el documento Ep 1926744 B1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/B, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNT/B. En un aspecto, dicha proteína es VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas o de ratón, v Am P-2 bovina, VAMP-2 o vAm P-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD, o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o Va Mp-3 de Xenopus, Va Mp-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplysia o proteína similar a SNB1 de Caenorhabditis o cualquiera de sus ortólogos, parálogos u homólogos. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926 744 B1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/C1, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNt /C1. En un aspecto, dicha proteína es sintaxina 1A humana o de ratón, sintaxina 1B1, sintaxina 2-1, sintaxina 2-2, sintaxina 2-3, sintaxina 3A o sintaxina 1B2, sintaxina 1A bovina o de rata, sintaxina 1B1 o sintaxina 1B2, sintaxina 2 de rata o sintaxina 3 de rata, sintaxina 1A de ratón, sintaxina 1B1, sintaxina 1B2, sintaxina 2, sintaxina 3A, sintaxina 3B o sintaxina 3C, sintaxina 1A o sintaxina 2 de pollo, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Xenopus, sintaxina 1A, sintaxina IB o sintaxina 3 de Danio, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Torpedo, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Strongylocentrotus, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Drosophila, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Hirudo, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Loligo, sintaxina 1A o sintaxina 1B de Lymnaea o cualquiera de sus ortólogos, parálogos u homólogos. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926744 B1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/D, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNT/D. En un aspecto, dicha proteína es VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas o de ratón, v Am P-2 bovina, VAMP-2 o vAm P-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD, o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o Va Mp-3 de Xenopus, Va Mp-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplysia o proteína similar a SNB1 de Caenorhabditis o cualquiera de sus ortólogos, parálogos u homólogos. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926 744 B1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/E, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNT/E. En un aspecto, dicha proteína es SNAP-25A o B humana o uno de sus homólogos, parálogos u ortólogos procedentes de rata, ratón, bovina, de Danio, Carassius, Xenopus, Torpedo, Strongylocentrotus, Loligo, Lymnaea o Aplysia. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926744 b 1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/F, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNT/F. En un aspecto, dicha proteína es VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas o de ratón, v Am P-2 bovina, VAMP-2 o vAm P-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD, o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o Va Mp-3 de Xenopus, Va Mp-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplysia o proteína similar a SNB1 de Caenorhabditis o cualquiera de sus ortólogos, parálogos u homólogos. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926 744 B1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa BoNT/G, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por BoNT/G. En un aspecto, dicha proteína es VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas o de ratón, v Am P-2 bovina, VAMP-2 o vAm P-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD, o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o Va Mp-3 de Xenopus, Va Mp-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplysia o proteína similar a SNB1 de Caenorhabditis o cualquiera de sus ortólogos, parálogos u homólogos. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926 744 B1.
Un sitio de ruptura de neurotoxina reconocido y roto por la proteasa TeNT, en un aspecto de la invención, se deriva de una proteína que es sensible a la ruptura por TeNT. En un aspecto, dicha proteína es VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas o de ratón, vAm P-2 bovina, VAMP-2 o VAMP-3 de rata, VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo, VAMP-1 de Torpedo, VAMP de Strongylocentrotus, sybA, synB, synC, synD, o syn de Drosophila, VAMP de Hirudo, VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus, VAMP-1 o VAMP-2 de Danio, VAMP de Loligo, VAMP de Lymnaea, VAMP de Aplysia o proteína similar a SNB1 de Caenorhabditis o cualquiera de sus ortólogos, parálogos u homólogos. Los sitios de ruptura adecuados derivados de dichas proteínas se describen en el documento EP 1926744 B1.
Los ejemplos de anticuerpos apropiados que pueden utilizarse como primer anticuerpo de captura en el método de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) (Fernández-Salas E., Wang J., Molina Y., Nelson J.B., Jacky B.P.S., et al. (2012), Botulinum Neurotoxin Serotype a Specific Cell-Based Potency Assay to Replace the Mouse Bioassay, PLoS ONE, 7(11): e49516, doi:10.1371/journal.pone.0049516), el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies), el anticuerpo de VAMP/sinaptobrevina sc-13992 (Santa Cruz Biotechnology) o n.° 104203 (Synaptic Systems), o el anticuerpo de sintaxina ADI-VAM-SV013 (Enzo Life Sciences).
En un aspecto, para la normalización se emplea el primer anticuerpo de captura que reconoce el sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas para determinar la cantidad total de sustrato de neurotoxina en la célula, tal como se muestra en los siguientes ejemplos.
El "segundo anticuerpo de captura", tal como se emplea en la presente, se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas. Por consiguiente, dicho segundo anticuerpo de captura reconoce selectivamente el sustrato de neurotoxina roto por la neurotoxina, por ejemplo, el producto de SNAP-25 roto por BoNT/A. Por contraste, dicho segundo anticuerpo de captura no es capaz de unirse al sustrato no roto por neurotoxinas tal como, por ejemplo, SNAP-25 no roto. Los ejemplos de anticuerpos apropiados que pueden utilizarse como segundo anticuerpo de captura en el método de la invención incluyen, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ratón 20-2-5, tal como se indicó a continuación, el anticuerpo monoclonal de ratón MC-6053 (R&D Systems) que reconoce SNAP-25 roto por BoNT/A (Baldwin y Barbieri, 2007, Biochemistry, 46, 3200-3210), así como el anticuerpo monoclonal de ratón d Ma B4345 (Creative Diagnostics).
Se describen nuevos anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por neurotoxinas, es decir, solo a SNAP-25 roto por neurotoxinas, mientras que no se unen a SNAP-25 no roto. Dichos anticuerpos monoclonales han sido generados y caracterizados según se describe en los siguientes ejemplos y se ha demostrado que son particularmente adecuados como segundo anticuerpo de captura para el método de la invención, debido a su alta afinidad y especificidad por SNAP-25 roto por neurotoxinas. Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales reconocen y se unen específicamente al epitopo de SNAP-25 190-197 "TRIDEANQ" mostrado en SEQ ID NO:74 y/o a SNAP-25^7, concretamente SNAP-25 roto con neurotoxinas (por ejemplo, BoNT/A). Más preferiblemente, los anticuerpos monoclonales reconocen y se unen específicamente al epitopo de SNAP-25 191-197 "RIDEANQ" mostrado en SEQ ID NO:75 y/o a SNAP-25-197, al epitopo de SNAP-25 192-197 "IDeAnQ" con la secuencia mostrada en SEQ ID NO:76 y/o a SnAp-25197, o al epitopo SnAp-25193-197 "DEANQ" mostrado en SEQ ID NO:77 y/o a SNAP-25197.
Se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:18 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 19. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:20 a 22, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:23 a 25, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 20-2-5 tal como se muestra en los siguientes ejemplos. Además, se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:26 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 27. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:28 a 30, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:31 a 33, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 5-10-5 tal como se muestra en los siguientes ejemplos. También se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:34 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 35. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:36 a 38, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:39 a 41, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 1-10-4 tal como se muestra en los siguientes ejemplos. También se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:42 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 43. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:44 a 46, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:47 a 49, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 16-5-4 tal como se muestra en los siguientes ejemplos. Además, se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:50 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 51. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:52 a 54, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:55 a 57, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 6-3-8 tal como se muestra en los siguientes ejemplos. Se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:58 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 59. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:60 a 62, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:63 a 65, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 18-3-3 tal como se muestra en los siguientes ejemplos. Además, se describe un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A y que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:66 y/o una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 67. También se describen anticuerpos, o sus fragmentos, que comprenden una, dos, o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dicha región o regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada. Las correspondientes secuencias de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se muestran en SEQ ID NO:68 a 70, respectivamente, mientras que las correspondientes secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se muestran en SEQ ID NO:71 a 73, respectivamente. Las secuencias mencionadas se corresponden con el anticuerpo monoclonal de ratón 14-12-1 tal como se muestra en los siguientes ejemplos.
La expresión "primer anticuerpo de detección", tal como se emplea en la presente, es un anticuerpo que se une específicamente al primer anticuerpo de captura. Dicho primer anticuerpo de detección permite la detección específica del primer anticuerpo de captura. Midiendo la cantidad del primer anticuerpo de detección unido, la cantidad de los primeros complejos de detección puede determinarse puesto que la cantidad del primer anticuerpo de detección unido en el primer complejo de detección se correlaciona con la cantidad del primer anticuerpo de captura (y, por consiguiente, la cantidad del sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas, es decir, total) comprendido en el primer complejo de detección. Por ejemplo, puede emplearse un anticuerpo específico de especie apropiado como primer anticuerpo de detección: si se ha usado un anticuerpo de ratón como primer anticuerpo de captura, dicho primer anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo antirratón que se une específicamente al anticuerpo de ratón. El primer anticuerpo de detección puede ser, por ejemplo, un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano ("horseradishperoxidase", HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte fluorescente. La conjugación de las enzimas a anticuerpos, por ejemplo, empleando glutaraldehído es muy conocida en la técnica.
Se han empleado ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para cuantificar una amplia gama de compuestos y patógenos durante casi 40 años. Inicialmente, se empleó la radiactividad para cuantificar los ensayos, pero los radioinmunoensayos (RIA) han sido sustituidos por ensayos que emplean enzimas para obtener resultados colorimétricos. En fechas recientes se han desarrollado nuevos sustratos para producir productos fluorescentes y luminiscentes. El principio básico de los nuevos ensayos sigue siendo el mismo que los ensayos colorimétricos. El sustrato se convierte en un compuesto mensurable mediante la actividad enzimática de proteínas conjugadas con un anticuerpo, lo cual confiere especificidad.
Los conjugados de enzimas que se emplean habitualmente en ELISA son fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano. Por consiguiente, en un aspecto, el primer anticuerpo de detección puede, por ejemplo, conjugarse con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano. Otros ejemplos de conjugados de enzimas que pueden utilizarse como primer anticuerpo de detección en el método de la invención incluyen glucosa oxidasa, que emplea glucosa como substrato, tirosinasa, que convierte el sustrato 1-(4-metil-7-il)-3-(4-hidroxifenil)urea (PAP-AMC) (Stratis Avrameas, Immunochemistry, volumen 6, número 1, enero de 1969, pp. 43-48, IN9-IN11, 49-52) o p-galactosidasa, que convierte el sustrato 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil p-d-galactopiranósido (DiFMUG) (Gee et al., Analytical Biochemistry, volumen 273, número 1, agosto de 1999, pp. 41-48). Tras la adición de un sustrato, dicho sustrato es convertido por la enzima en una forma detectable. Por ejemplo, la fosfatasa alcalina cataliza la ruptura de ésteres del ácido fosfórico. Si se emplea un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) como primer anticuerpo de detección, un sustrato apropiado, tal como un derivado de 4-metilumbeliferil fosfato, por ejemplo, 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil fosfato (DífMu P), o fluoresceína difosfato (FDP), 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil fosfato (DiFMUP) es convertido por la AP en una forma detectable, es decir, el producto fluorogénico 6,8-difluoro-4-metilumbeliferona. Dicho sustrato puede adquirirse, por ejemplo, en Molecular Probes. Pueden medirse las intensidades de fluorescencia de este producto de reacción de DiFMUP empleando unos máximos de excitación/emisión de aproximadamente 358/450 nm. Otros sustratos que pueden utilizarse para este fin son 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona-7-il) fosfato (DDAO-fosfato; Invitrogen), fluoresceína difosfato (FDP; Sigma Aldrich) o 4-metilumbeliferil fosfato (MUP; Invitrogen). El DDAO-fosfato es convertido por la AP en el producto fluorogénico dimetilacridinona (DDAO), que tiene unos máximos de excitación/emisión de aproximadamente 646/659 nm. Si se emplea FDP como sustrato para la AP, el producto de la reacción es la fluoresceína, que tiene un máximo de excitación/emisión de aproximadamente 490/514 nm. Para MUP, el correspondiente producto de reacción es 4-metilumbeliferona (7-hidroxi-4-metilcumarina), que tiene un máximo de excitación/emisión de aproximadamente 360/449 nm. Además, estos sustratos pueden adquirirse, por ejemplo, en Molecular Probes. Como alternativa, puede emplearse la peroxidasa de rábano como conjugado de enzima en el primer anticuerpo de detección del método de la invención. La peroxidasa de rábano (HRP) cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) a agua (H2O). En presencia de sustratos específicos, que actúan como donantes de hidrógeno, la acción de HRP convierte moléculas incoloras o no fluorescentes en restos coloreados y/o fluorescentes, respectivamente. Por ejemplo, Amplex® Red (Life Technologies) es un sustrato para usar con los ensayos que contienen HRP. Amplex Red, en presencia de una enzima de peroxidasa, reacciona con H2O2 con una estequiometría de 1:1 para producir resorrufina, un compuesto fluorescente rojo que tiene unos máximos de absorción y emisión de fluorescencia de 563 nm y 587 nm, respectivamente. Otro ejemplo de sustrato de HRP es Amplex® UltraRed (Life Technologies). Se ha indicado que el reactivo Amplex® UltraRed (excitación/emisión de aproximadamente 570/585 nm) mejora tras la actuación del reactivo Amplex® Red, ofreciendo una fluorescencia más brillante y una sensibilidad potenciada sobre una base molar en ensayos de peroxidasa de rábano o de enzimas acopladas con peroxidasa de rábano. La fluorescencia del reactivo Amplex® UltraRed oxidado (reactivo Amplex® UltroxRed) también es menos sensible al pH, y el sustrato y su producto de oxidación muestran mayor estabilidad que el reactivo Amplex® Red en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) o tioles, tales como ditiotreitol (DTT). Otros sustratos apropiados de HRP que pueden usarse en el método de la invención incluyen, por ejemplo, 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP; AnaSpec) o ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico (HPPA; AnaSpec) (Tuuminen et al., 1991, J. Immunoassay, 12, 29-46).
Como alternativa, el primer anticuerpo de detección puede portar un marcador detectable apropiado que permita la detección del primer anticuerpo de captura. El marcaje puede realizarse por medios directos o indirectos. El marcaje directo implica la unión del marcador directamente (de modo covalente o no covalente) al primer anticuerpo de detección. El marcaje indirecto implica la unión (de modo covalente o no covalente) de un agente que se une específicamente al primer anticuerpo de detección y que porta un marcador detectable. Dicho agente puede ser, por ejemplo, un anticuerpo secundario (de orden mayor) que se une específicamente al primer anticuerpo de detección. El anticuerpo secundario, en este caso, se acoplará a un marcador detectable. Se entenderá que además pueden utilizarse otros anticuerpos de orden mayor para la detección del primer complejo de detección. A menudo se emplean anticuerpos de orden mayor para aumentar la señal. Los anticuerpos de mayor orden adecuados también pueden incluir el sistema de estreptavidina-biotina conocido (Vector Laboratories, Inc.), y Dako LSAB™2 y LSAB™+ (biotina-estreptavidina marcada), o Dako PAP (peroxidasa antiperoxidasa), muy conocidos. En otro aspecto, dicho marcador del primer anticuerpo de detección es un tinte fluorescente, es decir, el primer anticuerpo se conjuga con un tinte fluorescente. En este caso, la fluorescencia puede medirse directamente mediante un lector de fluorescencia. Los marcadores fluorescentes típicos incluyen proteínas fluorescentes, tales como GFP y sus derivados, tintes de Cy, tales como Cy3 o Cy5, rojo de Texas, fluoresceína, y tintes de Alexa, por ejemplo, Alexa 568.
El "segundo anticuerpo de detección", tal como se emplea en la presente, es un anticuerpo que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura. El segundo anticuerpo de detección puede conjugarse, por ejemplo, a una enzima tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, glucosa oxidasa o tirosinasa. Por consiguiente, en un aspecto, el segundo anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa, o un anticuerpo conjugado con tirosinasa. Dicho segundo anticuerpo de detección permite la detección específica del segundo anticuerpo de captura. Midiendo la cantidad del segundo anticuerpo de detección unido, la cantidad de los segundos complejos de detección puede determinarse puesto que la cantidad del segundo anticuerpo de detección unido en el segundo complejo de detección se correlaciona con la cantidad del segundo anticuerpo de captura (y, por consiguiente, la cantidad del sustrato roto por neurotoxinas) comprendido en el primer complejo de detección. Por ejemplo, en el caso de que se emplee un anticuerpo de conejo como segundo anticuerpo de captura, puede utilizarse un anticuerpo anticonejo como segundo anticuerpo de detección. El segundo anticuerpo de detección puede portar una enzima, tal como se indicó anteriormente, o un marcador, tal como un tinte fluorescente (es decir, el segundo anticuerpo de detección se conjuga con un tinte fluorescente), tal como se mencionó en otro punto de la presente con respecto al primer anticuerpo de detección. En el método de la invención, la enzima conjugada con el primer anticuerpo de detección se diferencia de la enzima conjugada con el segundo anticuerpo de detección para permitir la detección específica del respectivo primer y segundo anticuerpo de captura en el método de la invención. Por ejemplo, si el primer anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con AP, el segundo anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) o viceversa. Además, los espectros de excitación/emisión de los sustratos fluorogénicos de AP y HRP no se solapan sustancialmente, sino que se diferencian entre sí, concretamente muestran un claro desplazamiento para permitir la distinción de las intensidades de fluorescencia generadas por el producto respectivo. Por ejemplo, DiFMUP muestra una excitación/emisión a aproximadamente 358/450 nm, mientras que Amplex UltraRed muestra una excitación/emisión de aproximadamente 570/585 nm, permitiendo con ello lograr mediciones precisas de las intensidades de fluorescencia generadas por la conversión de dichos sustratos fluorogénicos por la respectiva enzima. En otro aspecto, se emplea un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) como primer anticuerpo de detección para el antígeno que está presente en exceso en la célula, es decir, para la medición de la cantidad del sustrato de neurotoxina total (no roto y roto), tal como SNAP-25 total, en la célula. El anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) se emplea como segundo anticuerpo de detección para el antígeno que está presente en la célula en una cantidad menor, es decir, para la medición de la cantidad del sustrato de neurotoxina roto, tal como SNAP-25 roto por BoNT/A, en la célula. Tal como se conoce en la técnica, los sustratos de HRP son más sensibles que los sustratos de AP, lo cual significa que pueden detectarse cantidades menores de analitos. Si se emplea un anticuerpo de HRP como anticuerpo secundario para la detección de SNAP-25 roto, pueden detectarse cantidades más bajas de SNAP-25 roto. A su vez, pueden determinarse cantidades menores de BoNT/A, aumentando con ello la sensibilidad del ensayo. Debido a que el anticuerpo de AP mide la cantidad total de SNAP-25 en la célula, no es necesaria una alta sensibilidad por el sustrato, debido al exceso de analito.
La expresión "al menos", tal como se emplea en la presente, por ejemplo, "al menos un primer anticuerpo de captura", significa que además de un anticuerpo que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas, pueden emplearse uno o más anticuerpos adicionales con la especificidad mencionada. De modo similar, "al menos un segundo anticuerpo de captura" significa que además de un anticuerpo que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, en el método de la invención pueden emplearse uno o más anticuerpos adicionales con la especificidad mencionada. Además, en el método de la invención pueden emplearse uno o más primeros anticuerpos de detección que se unen específicamente al primer anticuerpo de detección (o primeros anticuerpos de detección). De modo similar, en el método de la invención pueden emplearse uno o más segundos anticuerpos de detección que se unen específicamente al segundo anticuerpo de detección (o segundos anticuerpos de detección).
La expresión "primer complejo de detección" se refiere a un complejo que comprende un primer anticuerpo de captura y un primer anticuerpo de detección que se unen específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas, permitiendo con ello la determinación del contenido total del sustrato de neurotoxina en la célula. La cantidad del primer complejo de detección puede medirse mediante la determinación de la cantidad del primer anticuerpo de detección unido específicamente. Esto puede lograrse dependiendo de la naturaleza de la enzima o del marcador del primer anticuerpo de detección, por ejemplo, midiendo la intensidad de la fluorescencia.
La expresión "segundo complejo de detección" se refiere a un complejo que comprende el segundo anticuerpo de captura y el segundo anticuerpo de detección que se unen específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, permitiendo con ello la determinación del contenido del sustrato roto por neurotoxinas en la célula. La cantidad del segundo complejo de detección puede medirse mediante la determinación de la cantidad del segundo anticuerpo de detección unido específicamente. Esto se logra dependiendo de la naturaleza de la enzima o del marcador del segundo anticuerpo de detección, por ejemplo, midiendo la intensidad de la fluorescencia.
Se contempla que, en lugar del análisis inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), pueda emplearse cualquier sistema de detección para practicar aspectos del método de la invención, con la condición de que la proporción de señal a ruido pueda distinguir, en un grado estadísticamente significativo, la señal de los complejos de anticuerpoantígeno formados frente a la señal de fondo. Los ejemplos no limitantes de sistemas de detección con base inmunológica incluyen análisis de inmunotransferencias, tales como análisis de la transferencia Western y transferencia de puntos, análisis de inmunoprecipitación y ELISA de "sandwich". La detección de la señal puede lograrse empleando una autorradiografía con formación de imágenes o formación de fosfoimágenes (AU), bioluminiscencia (BL), fluorescencia, transferencia de energía de resonancia, polarización de planos, colorimetría o citometría de flujo (FC). Se ofrecen descripciones de sistemas de detección con base inmunológica, por ejemplo, en Commonly Used Techniques in Molecular Cloning, pp. A8.1-A8-55 (Sambrook y Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001); Detection Systems, pp. A9.1-A9-49 (Sambrook y Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001).
En otro aspecto, las células, anticuerpos, polipéptidos de neurotoxinas y sustratos de neurotoxinas o cualquier otro producto tal como se indica en la presente, son células, anticuerpos, polipéptidos de neurotoxinas, sustratos de neurotoxinas o productos aislados, respectivamente. Tal como se emplea en la presente, el término "aislado", tal como un anticuerpo aislado, se refiere a una molécula separada de su entorno natural a través de la intervención humana.
En un aspecto del método de la invención, el método es un método de fluorescencia.
En otro aspecto del método de la invención, el polipéptido de neurotoxina es un polipéptido de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G o un polipéptido de neurotoxina del tétanos (TeNT), un polipéptido de neurotoxina, tal como se define en detalle en otro punto de la presente.
En otro aspecto del método de la invención, el sustrato de neurotoxina es VAMP/sinaptobrevina, SNAP-25 o sintaxina.
A continuación, se indica el correspondiente número de registro del respectivo sustrato de neurotoxina que puede emplearse en el método de la invención: SNAP-25 humana P60880, sintaxina-1A humana Q16623, sintaxina-1B P61266, sintaxina-2 P32856, sintaxina-3 Q13277, sintaxina-4 Q12846, sintaxina-5 Q13190, sintaxina-6 O43752, sintaxina-7 015400, sintaxina-8 Q9UNK0, sintaxina-10 O60499, sintaxina-11 O75558, sintaxina-12 Q86Y82, sintaxina-16 014662, sintaxina-17 P56962, sintaxina-18 Q9P2W9, sintaxina-19 Q8N4C7; sinaptobrevina-1 humana P23763, sinaptobrevina-2 P63027, sinaptobrevina-3 Q15836; sinaptotagmina humana: sinaptotagmina-1 P21579, sinaptotagmina-2 Q8N9I0, sinaptotagmina-3 Q9BQG1, sinaptotagmina-4 Q9H2B2, sinaptotagmina-5 000445, sinaptotagmina-6 Q5T7P8, sinaptotagmina-8 Q8NBV8, sinaptotagmina-9 Q86SS6, sinaptotagmina-10 Q6XYQ8, sinaptotagmina-11 Q9BT88, sinaptotagmina-12 Q8IV01, sinaptotagmina-13 Q7L8C5, sinaptotagmina-14 Q8NB59, sinaptotagmina-15 Q9BQS2, sinaptotagmina-16 Q17RD7, sinaptotagmina-17 Q9BSW7, proteínas de membrana asociadas a vesículas (VAMP): proteína de membrana asociada a vesículas 1 P23763, proteína de membrana asociada a vesículas 2 P63027, proteína de membrana asociada a vesículas 3 Q15836, proteína de membrana asociada a vesículas 4 O75379, proteína de membrana asociada a vesículas 5 095183, proteína de membrana asociada a vesículas 7 P51809, proteína de membrana asociada a vesículas 8 Q9BV40; glicoproteínas de vesículas sinápticas (SV2): glicoproteína de vesículas sinápticas 2A Q7L0J3, glicoproteína de vesículas sinápticas 2B Q7L1I2, glicoproteína de vesículas sinápticas 2C.
En otro aspecto de la invención, las células son células neuronales o células diferenciadas neuronales seleccionadas del grupo que consiste en: células neuronales primarias, células tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales, tales como células de neuroblastoma o líneas celulares tal como se define en otro punto en la presente, células P19 o neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS), preferiblemente neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas.
En otro aspecto del método de la invención, la fijación de las células se realiza mediante la adición de un agente de fijación seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, acetona, formaldehído o sus mezclas. Preferiblemente, la fijación de las células se realiza mediante la adición de metanol enfriado en hielo (-20 °C) y una incubación durante aproximadamente 20 minutos a -20 °C.
En un aspecto del método de la invención, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas permite la determinación de la cantidad total del sustrato de neurotoxina en las células. En otro punto en la presente se han definido los epitopos y regiones de unión adecuados del primer anticuerpo de captura dentro del respectivo sustrato de neurotoxina.
En aspectos específicos del método de la invención, el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas es el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), o el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies).
En otros aspectos del método de la invención, el segundo anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal de ratón 20-2-5 o el clon de anticuerpo monoclonal de ratón MC-6053 (R&D Systems). Preferiblemente, el segundo anticuerpo de captura es el anticuerpo monoclonal de ratón 20-2-5. Las correspondientes secuencias de las regiones variables y las CDR del anticuerpo monoclonal 20-2-5 de ratón de la invención se han descrito en otro punto en la presente.
En aspectos específicos del método de la invención, el primer y/o segundo anticuerpo de captura está o están inmovilizados. Por ejemplo, dicho primer y/o segundo anticuerpo de captura está o están unidos a un soporte en fase sólida. Tal como se emplea en la presente, la expresión "soporte en fase sólida" es sinónima de "fase sólida" y se refiere a cualquier matriz que puede utilizarse para inmovilizar un primer y/o segundo anticuerpo de captura descrito en la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitantes de soportes en fase sólida incluyen, por ejemplo, un tubo; una placa; una columna; varillas o "dipsticks" (varillas graduadas); una partícula magnética, una esfera u otro medio cromatográfico esférico o fibroso, tal como, por ejemplo, agarosa, Sepharose, sílice y plástico; y láminas o membranas, tales como, por ejemplo, nitrocelulosa y poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF). El soporte en fase sólida puede construirse empleando una amplia variedad de materiales, tales como, por ejemplo, vidrio, carbono, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, diazocelulosa, o almidón. El soporte en fase sólida seleccionado puede tener una propiedad física que hace que pueda separarse con facilidad de los materiales solubles o no unidos y, en general, permite que los materiales no unidos, tales como, por ejemplo, el exceso de reactivos, los subproductos de la reacción o disolventes puedan separarse o retirarse de otro modo (por ejemplo, mediante lavado, filtración, centrifugación, etc.) del componente del ensayo unido al soporte en fase sólida. Se describen ejemplos no limitantes para fabricar y emplear soportes en fase sólida, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, supra (2001); y Current Protocols in Molecular Biology, supra (2004). En un aspecto, el primer y/o segundo anticuerpo de captura está conjugado a esferas. Se contempla que los conjugados de anticuerpo-esfera sean lo suficientemente pequeños como para que puedan entrar en las células a través de los poros provocados por la permeabilización de dichas células.
En aspectos específicos del método de la invención, el primer anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte fluorescente.
En otros aspectos específicos del método de la invención, el segundo anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa, un anticuerpo conjugado con tirosinasa o un anticuerpo conjugado con pgalactosidasa.
Preferiblemente, el anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) se emplea como primer anticuerpo de detección para la medición del sustrato de neurotoxina total (no roto y roto), tal como SNAP-25 total, en la célula, y el anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) se emplea como segundo anticuerpo de detección para la medición de la cantidad del sustrato de neurotoxina roto, tal como SNAP-25 roto por BoNT/A SNAP-25, en la célula. En ciertos aspectos del método de la invención, el sustrato de AP es un derivado de 4-metilumbeliferil fosfato, por ejemplo, 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil fosfato (DiFMUP), o fluoresceína difosfato (FDP).
En aspectos específicos del método de la invención, el sustrato de HRP es Amplex UltraRed, 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP) o ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico (HPPA).
En un aspecto más específico del método de la invención, el método se lleva a cabo como se ilustra en la figura 1. La invención, en otro aspecto, se refiere a un kit para realizar el método de la invención que comprende:
a) una disposición de un primer anticuerpo de captura, un segundo anticuerpo de captura, un primer anticuerpo de detección y un segundo anticuerpo de detección, en el que dicho segundo anticuerpo de captura es un anticuerpo que comprende una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO:20 a 22, y una CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO:23 y 25, y en el que dicha disposición permite realizar el método de la invención;
b) medios para calcular la cantidad de sustrato roto por dicha neurotoxina basados en las cantidades de los primeros y los segundos complejos de detección determinadas mediante la disposición según a); y
c) instrucciones para realizar dicho método.
El término "kit", tal como se emplea en la presente, se refiere a una colección de los medios o reactivos de la presente invención mencionados anteriormente que pueden o no estar envasados juntos. Los componentes del kit pueden estar formados por viales distintos (es decir, como un kit de partes separadas) o pueden proporcionarse en un único vial. Además, debe entenderse que el kit de la presente invención se empleará para practicar los métodos indicados en la presente anteriormente. En un aspecto, se contempla que todos los componentes se proporcionan de una manera lista para usar para practicar el método indicado en la presente. En otro aspecto, el kit contiene instrucciones para realizar dicho método. Las instrucciones pueden ser proporcionadas por un manual del usuario en forma electrónica o en papel. Por ejemplo, el manual puede comprender instrucciones para interpretar los resultados obtenidos cuando se realizan los métodos mencionados anteriormente empleando el kit de la presente invención. Por último, se describe un método para la fabricación de un producto de neurotoxina formulado para su uso en aplicaciones farmacéuticas o cosméticas, que comprende (i) determinar la actividad biológica de un producto de neurotoxina mediante el método de la invención, y (ii) formular el producto de neurotoxina para su uso en aplicaciones farmacéuticas o cosméticas. El producto de neurotoxina puede formularse por medio de diversas técnicas que dependen de los fines de aplicación deseados que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el producto de neurotoxina (biológicamente activo) puede emplearse en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables como composición farmacéutica. El vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de esta. El vehículo farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel, o un líquido. Los ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, sulfato de calcio dihidratado, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Los ejemplos de vehículos líquidos son glicerol, disolución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. Los vehículos adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros muy conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. En un aspecto, la composición farmacéutica puede disolverse en un diluyente, antes de la administración. El diluyente también se selecciona para que no afecte a la actividad biológica del producto de neurotoxina. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada o disolución salina fisiológica. Además, la composición farmacéutica o formulación también puede incluir otros vehículos o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Por tanto, el producto de neurotoxina formulado puede estar presente, en un aspecto, en una forma líquida o liofilizada. En un aspecto, puede estar presente junto con glicerol, estabilizantes de proteínas (HSA) o estabilizantes que no son proteínas, tales como polivinilpirrolidona (PVP), ácido hialurónico o aminoácidos libres. En un aspecto, se describen estabilizantes no proteicos adecuados en el documento WO 2005/007185 o el documento WO 2006/020208. En un aspecto, la actividad biológica determinada según la etapa (i) por el método de la invención se corresponde con una actividad de toxina botulínica de 25, 50, 75, 100, 125, 150 o 200 U (unidades LD50 de ratón). El producto de neurotoxina formulado puede usarse para terapia humana o animal de diversas enfermedades o trastornos en una dosis terapéuticamente eficaz o para fines cosméticos.
La enfermedad o trastorno, según se indica en la presente, se selecciona del grupo que consiste en trastornos de la fuerza de los músculos voluntarios, distonía focal, que incluye distonía cervical, craneal, y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial, y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y corrección de arrugas cosmética, blefaroespasmo, distonía oromandibular, del tipo de apertura de mandíbula, del tipo de cierre de mandíbula, bruxismo, síndrome de Meig, distonía lingual, apraxia del párpado, distonía cervical de apertura, antecollis, retrocollis, laterocollis, tortícolis, distonía faríngea, distoma laríngea, disfonía espasmódica/de tipo abductor, disnea espasmódica, distonía de extremidades, distonía del brazo, distonía específica de tareas, calambre del escritor, calambre del músico, calambre del golfista, distonía de pierna, abducción del muslo, abducción del muslo y flexión de la rodilla, extensión de la rodilla, flexión del tobillo, extensión del tobillo, equinovarus, distonía de deformidad del pie, dedo estriatal, flexión del dedo del pie, extensión del dedo del pie, distonía axial, síndrome de Pisa, distonía de la bailarina del vientre, distonía segmental, hemidistonía, distonía generalizada, distonía en el síndrome de Lubag, distonía en la degeneración corticobasal, distonía tardía, distonía en la ataxia espinocerebelar, distonía en la enfermedad de Parkinson, distonía en la enfermedad de Huntington, distonía en la enfermedad de Hallervorden-Spatz, disquinesias inducidas por DOPA/distonía inducida por DOPA, disquinesias tardías/distonía tardía, disquinesias/distonía paroxísmicas, mioclonus palatal inducido por la acción quinesiogénica no quinesiogénica, mioclonia mioquimia, rigidez, espasmos musculares benignos, temblor de la barbilla hereditario, actividad paradójica del músculo de la mandíbula, espasmos hemimasticatorios, miopatía branquial hipertrófica, hipertrofia masetérica, hipertrofia anterior tibial, nistagmo, oscilopsia, parálisis supranuclear progresiva, epilepsia, epilepsia partialis continua, planificación de una operación de tortícolis espasmódica, parálisis de las cuerdas vocales abductoras, disfonia mutacional recalcitante, disfunción del esfínter esofágico superior, granuloma de pliegue vocal, tartamudeo del síndrome de Gilles de la Tourette, mioclonus del oído medio, cierre protector de la laringe, postlaringectomía, fallos del habla, ptosis protectora, entropión de disfunción del esfínter de Odii, pseudoacalasia, no acalasia, trastornos motores esofágicos, vaginismo, temblor de inmovilización postoperatorio, disfunción de la vejiga, disinergía del esfínter detrusor, espasmo del esfínter y vejiga, espasmo hemifacial, disquinesias de reinervación, barbilla rocosa, síndrome de la persona rígida, hiperplasia de próstata por tétanos, adipositas, tratamiento del estrabismo por parálisis cerebral infantil, paralítico mixto concomitante, después de cirugía de desprendimiento de retina, después de cirugía de cataratas, en estrabismo miosítico por afaquia, estrabismo miopático, desviación vertical disociada, como adjunto a la cirugía por estrabismo, esotropía, exotropía, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glándulas exocrinas, síndrome de Frey, síndrome de las lágrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea plantar, palmar y axilar, hipersalivación relativa en el ictus, en la enfermedad de Parkinson, en la esclerosis amiotrófica lateral, trastornos espásticos, en procesos autoinmunológicos de la encefalitis y mielitis, esclerosis múltiple, mielitis transversal, síndrome de Devic, infecciones víricas, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fúngicas, en la paraparesis espástica hereditaria, síndrome postapoplético, infarto hemisférico, infarto del tronco cerebral, infarto de la médula espinal, en traumatismos del sistema nervioso central, lesiones hemisféricas, lesiones del tronco cerebral, lesiones de la médula espinal, en hemorragias del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, hemorragia intraespinal, en neoplasias, tumores hemisféricos, tumores del tronco cerebral, tumores de la médula espinal y vaginismo. Un uso cosmético se selecciona del tratamiento o la reducción de las arrugas, tales como las patas de gallo o GFL, ceño fruncido, asimetrías faciales.
Las figuras muestran:
Figura 1: Diagrama que representa el modo de acción del ensayo basado en células de la invención. Las células susceptibles a la intoxicación por neurotoxinas se siembran en placas de múltiples pocillos. Después, las células se intoxican con un polipéptido de neurotoxina y después de un periodo de intoxicación dado, las células se fijan. El anticuerpo específico para SNAP-25 roto por neurotoxinas y el anticuerpo específico para SNAP-25 no roto se une a los sitios de unión específica sobre SNAP-25. Empleando anticuerpos secundarios específicos antihospedante acoplados a enzimas, estos acontecimientos de unión pueden emplearse para generar señales mensurables que se correlacionan con la concentración de SNAP-25 roto por neurotoxinas y la cantidad total de SNAP-25 dentro del pocillo. A medida que aumenta la concentración de BoNT/A, aumenta la cantidad de SNAP-25 medido, lo cual produce una ganancia de la señal.
Figura 2: Las dos gráficas representan las curvas de calibración de BoNT/A resultantes para neuronas derivadas de iPS y células SiMa según el ejemplo 2. Muestran la dependencia, respectivamente, entre la concentración y la actividad de BoNT/A y la señal de fluorescencia determinada (RFU) para el sustrato de HRP y el contenido de SNAP-25 roto por BoNT/A normalizado a la cantidad total de SNAP-25 dentro del pocillo. Tras aumentar la concentración y la actividad, respectivamente, de BoNT/A, más SNAP-25 es convertido por la neurotoxina, provocando un aumento en el contenido del SNAP-25 roto.
Figura 3: La gráfica representa la curva de calibración resultante de BoNT/A para neuronas derivadas de iPS según el ejemplo 4. Muestra la dependencia, respectivamente, entre la concentración y la actividad de BoNT/A y la señal de fluorescencia determinada (RFU) para el sustrato de HRP y el contenido de SNAP-25 roto por BoNt /A y el contenido de SNAP-25 roto por BoNT/A normalizado a la cantidad total de SNAP-25 dentro del pocillo. Tras aumentar la concentración y la actividad, respectivamente, de BoNT/A, más SNAP-25 es convertido por la neurotoxina, provocando un aumento en el contenido del SNAP-25 roto.
La invención se ilustrará mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 : Generación de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al sitio de ruptura del sustrato SNAP-25 roto por neurotoxinas
Se generaron anticuerpos monoclonales de ratón que se unen específicamente al sitio de ruptura del sustrato SNAP-25 roto por neurotoxinas empleando la técnica convencional del hibridoma. Para este fin, ratones Balb/c (hembras, 8 semanas) fueron inmunizados con SNAP-25190-197 con un resto cisteína en el N-terminal, "C-TRIDEANQ" (SEQ ID NO:17). Dicho resto cisteína N-terminal no se deriva de la secuencia de aminoácidos de SNAP-25, sino que se ha introducido para unir el péptido SNAP-25190-197 (SEQ ID NO:74) a la hemocianina de lapa (KLH). Se obtuvieron células de hibridoma por la fusión de células de bazo de ratón con la línea de células de mieloma SP2/0-Ag14 (SP2/0) adquirida en the German Collection of Microorganisms and Cell Culture (DSMZ GmbH, Braunschweig, ACC 146); véase también Hemmerlein et al., Molecular Cancer, 2006, 5, 41. Se seleccionaron anticuerpos que se unen específicamente al sitio de ruptura del sustrato SNAP-25 roto por neurotoxinas en ELISA. Los clones obtenidos se seleccionaron con respecto a su especificidad y afinidad por SNAP-25 roto por BoNT/A. Como control negativo, los clones se han ensayado para su no unión al SNAP-25206 no roto. Como resultado, se ha descubierto que los anticuerpos monoclonales de ratón 20-2-5, 5-10-5, 1-10-4, 16-5-4, 6-3-8, 18-3-3, y 14-12-1 fueron muy específicos por SNAP-25197 roto por BoNT/A, sin presentar reactividad cruzada detectable con SNAP25206 en ELISA y transferencias Western. Se ha realizado la isotipificación de dichos anticuerpos monoclonales empleando el kit de ensayo de isotipificación de anticuerpos monoclonales de ratón (Serotec). Como resultado, se ha descubierto que los mAb 20-2-5, 14-12-1, 6-3-8, y 5-10-5 son anticuerpos IgG1, mientras que los mAb 18-3-3, 16-5-4, y 1-10-4 son anticuerpos IgG2a.
Las correspondientes secuencias de aminoácidos de las cadenas VH y VL y las correspondientes secuencias de CDR (regiones determinantes de la complementariedad) de los anticuerpos monoclonales de ratón mencionados se indican en el listado de secuencias.
Ejemplo 2: ELISA de actividad de doble fluorescencia-CB-BoNT/A
Fijación de las células
1. Retirar la disolución de medio/toxina. Añadir 100 pl/pocillo de metanol enfriado en hielo (-20 °C) e incubar durante 20 min a -20 °C.
Nota: Realizar todas las etapas posteriores a temperatura ambiente.
Después de la fijación de las células:
1. Retirar la disolución de metanol y añadir 100 pl/pocillo de tampón PBS. Para una conservación durante más tiempo (> 1 día), se deben añadir 300 pl//pocillo de tampón PBS y sellar las placas con parapelícula. Las placas deben conservarse en la nevera.
2. Retirar el tampón PBS y lavar las células 3 veces con 200 pl/pocillo en tampón de lavado. Cada etapa debe realizarse durante 1 minuto con agitación suave.
3. Retirar el tampón de lavado y añadir 100 pl/pocillo de tampón de extinción e incubar durante 20 minutos con agitación suave.
4. Retirar el tampón de extinción y lavar las células una vez con 300 pl/pocillo de tampón de lavado durante 5 minutos con agitación suave.
5. Retirar el tampón de lavado y añadir 200 pl/pocillo de tampón de bloqueo e incubar durante 1 hora con agitación suave.
6. Retirar el tampón de bloqueo y añadir 100 pl/pocillo de tampón de permeabilización e incubar durante 15 minutos con agitación suave.
7. Retirar el tampón de permeabilización y lavar las células una vez con 300 pl/pocillo de tampón PBS. Esta etapa debe realizarse durante 1 minuto con agitación suave.
8. Retirar el tampón PBS y añadir 100 pl de la mezcla de anticuerpos primarios (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo. Incubar durante la noche (16-18 h) con agitación suave. Las células se incuban simultáneamente con dos anticuerpos primarios: un anticuerpo de ratón específico para SNAP-25 roto por BoNT/A y un anticuerpo de conejo policlonal que reconoce a SNAP-25 (anticuerpo para determinar la cantidad total de SNAP-25 para la normalización).
9. Retirar la mezcla de anticuerpos primarios y lavar las células 4 veces con 200 pl de tampón de lavado. Cada etapa debe realizarse durante 5 minutos con agitación suave.
10. Retirar el tampón de lavado y añadir 100 pl de la mezcla de anticuerpo secundario: anticuerpos secundarios antirratón conjugados con HRP y anticonejo conjugados con AP (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo e incubar durante 2,5-3 horas con agitación suave.
11. Retirar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las células 5 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado, seguido por 1 etapa de lavado con 300 pl/pocillo de tampón HEPES. Cada etapa de lavado debe realizarse durante 5 minutos con agitación suave.
12. Retirar el tampón PBS de la placa y añadir 75 ^l de un sustrato fluorogénico para peroxidasa de rábano (sustrato de HRP) a cada pocillo. Incubar durante 50 minutos con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.
13. Añadir 75 ^l de un sustrato fluorogénico para fosfatasa alcalina (sustrato de AP) a cada pocillo e incubar durante 50 minutos más con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.
14. Leer las placas utilizando un lector de placas de fluorescencia:
excitación a 540 nm; emisión a 600 nm.
excitación a 360 nm; emisión a 450 nm.
15. Cálculo
Para la normalización, el valor de RFU para el SNAP-25 roto (fluorescencia a 600 nm) se normaliza a los RFU de SNAP-25 total (450 nm) en cada pocillo. Para ilustrar mejor los RFU en un diagrama, todos los valores se multiplican por un factor de 1000 utilizando la siguiente ecuación:
RFU (600 nm)
x 1000
RFU (450 nm)
Posteriormente, los valores de RFU resultantes se promedian para cada patrón o muestra.
Preparación de los reactivos
Tampón de lavado:
Triton X-100 al 0,1% en tampón PBS 10 mM (pH 7,4).
Tampón PBS (10 mM):
Disolución salina tamponada con fosfato (Sigma, n.° P5368) (pH 7,4)
Tampón de extinción:
H2O2 al 0,6% en tampón PBS 10 mM (pH 7,4)
Tampón de bloqueo:
BSA al 2% en tampón PBS en 10 mM (pH 7,4) Triton X-100 al 0,05%
Tampón de permeabilización:
Triton X-100 al 0,5% en tampón PBS 10 mM
Tampón HEPES:
HEPES 50 mM (pH 7,4)
Sustrato de HRP:
HEPES 50 mM (pH 7,4)
H2O2 al 0,007%
Amplex UltraRed 150 pM
Sustrato de AP:
Dietanolamina 25 mM (pH 9,8)
MgCl22 mM
100 |jl de M DiFMUP
Ejemplo 3: Ilustración de las curvas de calibración de BoNT/A en el CBA-ELISA según el ejemplo 2 de la presente invención
El cultivo y la intoxicación de las células con BoNT/A de células SiMa parentales se realizó según el manual del suministrador. De modo similar, el cultivo y la intoxicación de las células con BoNT/A de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas (Cellular Dynamics) se realizó según el manual del suministrador.
El ELISA se ha realizado según el ejemplo 2. Como primer anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 roto por BoNT/A y no roto, se utilizó el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma). Este anticuerpo permite la detección de la cantidad total de SNAP-25 dentro de las células. Como segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A, en la invención se ha utilizado el clon de anticuerpo monoclonal 20-2-5 (véase el ejemplo 1).
Las dos gráficas en la figura 2 muestran las curvas de calibración de BoNT/A obtenidas. Estas demuestran la dependencia, respectivamente, entre la concentración y la actividad de BoNT/A y la señal de fluorescencia determinada (RFU) para el sustrato de HRP y el contenido de SNAP-25 roto por BoNt /A (los valores de RFU no están corregidos al blanco para ilustrar los errores de los patrones de BoNT/A individuales). Tras aumentar la concentración y la actividad, respectivamente, de BoNT/A, más SNAP-25 es convertido por la neurotoxina, provocando un aumento en el contenido del SNAP-25 roto. La dependencia de la señal de la concentración de BoNT/A/actividad de BoNT/A se ilustra empleando una ecuación de 4 parámetros.
Ejemplo 4: ELISA de actividad de doble fluorescencia-CB-BoNT/A
Fijación de las células
1. Retirar la disolución de medio/toxina. Añadir 100 pl/pocillo de metanol enfriado en hielo (-20 °C) e incubar durante 20 min a -20 °C.
Nota: Realizar todas las etapas posteriores a temperatura ambiente.
Después de la fijación de las células:
1. Retirar la disolución de metanol y añadir 100 pl/pocillo de tampón PBS. Para una conservación durante más tiempo (> 1 día), se deben añadir 300 pl//pocillo de tampón PBS y sellar las placas con parapelícula. Las placas deben conservarse en la nevera.
2. Retirar el tampón PBS y lavar las células 3 veces con 200 pl/pocillo en tampón PBS. Cada etapa debe realizarse durante 1 minuto con agitación suave.
3. Retirar el tampón PBS y añadir 100 pl/pocillo de tampón de extinción e incubar durante 20 minutos con agitación suave.
4. Retirar el tampón de extinción y lavar las células una vez con 300 pl/pocillo de tampón PBS durante 3 minutos con agitación suave.
5. Retirar el tampón PBS y añadir 200 pl/pocillo de tampón de bloqueo e incubar durante 1 hora con agitación suave.
6. Retirar el tampón de bloqueo y añadir 100 pl de la mezcla de anticuerpos primarios (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo. Incubar durante la noche (16-18 h) con agitación suave. Las células se incuban simultáneamente con dos anticuerpos primarios: un anticuerpo de ratón específico para SNAP-25 roto por BoNT/A y un anticuerpo de conejo policlonal que reconoce a SNAP-25 (anticuerpo para determinar la cantidad total de SNAP-25 para la normalización).
7. Retirar la mezcla de anticuerpos primarios y lavar las células 4 veces con 200 pl de tampón PBS. Cada etapa debe realizarse durante 3 minutos con agitación suave.
8. Retirar el tampón PBS y añadir 100 pl de la mezcla de anticuerpos secundarios: anticuerpos secundarios antirratón conjugados con HRP y anticonejo conjugados con AP (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo e incubar durante 2,5-3 horas con agitación suave.
9. Retirar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las células 5 veces con 200 pl/pocillo de tampón PBS, seguido por 1 etapa de lavado con 300 pl/pocillo de tampón HEPES. Cada etapa de lavado debe realizarse durante 3 minutos con agitación suave.
10. Retirar el tampón HEPES de la placa y añadir 75 pl de un sustrato fluorogénico para peroxidasa de rábano (sustrato de HRP) a cada pocillo. Incubar durante 50 minutos con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.
11. Añadir 75 pl de un sustrato fluorogénico para fosfatasa alcalina (sustrato de AP) a cada pocillo e incubar durante 50 minutos más con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.
12. Leer las placas utilizando un lector de placas de fluorescencia:
excitación a 540 nm; emisión a 600 nm.
excitación a 360 nm; emisión a 450 nm.
13. Cálculo
Para la normalización, el valor de RFU para el SNAP-25 roto (fluorescencia a 600 nm) se normaliza a los RFU de SNAP-25 total (450 nm) en cada pocillo. Para ilustrar mejor los RFU en un diagrama, todos los valores se multiplican por un factor de 1000 utilizando la siguiente ecuación:
RFU (600 nm)
x 1000
RFU (450 nm)
Posteriormente, los valores de RFU resultantes se promedian para cada patrón o muestra.
Preparación de los reactivos
Tampón PBS (10 mM):
Disolución salina tamponada con fosfato (Sigma, n.° P5368) (pH 7,4)
Tampón de extinción:
H2O2 al 0,6% en tampón PBS 10 mM (pH 7,4)
Tampón de bloqueo:
BSA al 2% en tampón PBS en 10 mM (pH 7,4) Triton X-100 al 0,05%
Tampón HEPES:
HEPES 50 mM (pH 7,4)
Sustrato de HRP:
HEPES 50 mM (pH 7,4)
H2O2 al 0,007%
Amplex UltraRed 150 pM
Sustrato de AP:
Dietanolamina 25 mM (pH 9,8)
MgCl22 mM
100 |jl de M DiFMUP
Ejemplo 5: Ilustración de las curvas de calibración de BoNT/A en el CBA-ELISA según el ejemplo 4 de la presente invención
El cultivo y la intoxicación con BoNT/A de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS) humanas (Cellular Dynamics) se realizó según el manual del suministrador.
El ELISA se ha realizado según el ejemplo 4. Como primer anticuerpo de captura que se une específicamente al SNAP-25 roto por BoNT/A y no roto, se utilizó el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma). Este anticuerpo permite la detección de la cantidad total de SNAP-25 dentro de las células. Como segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura de SNAP-25 roto por BoNT/A, en la invención se ha utilizado el clon de anticuerpo monoclonal 20-2-5 (véase el ejemplo 1).
La gráfica mostrada en la figura 3 representa la curva de calibración de BoNT/A obtenida. Muestra la dependencia, respectivamente, entre la concentración y la actividad de BoNT/A y la señal de fluorescencia determinada (RFU) para el sustrato de HRP y el contenido de SNAP-25 roto por BoNT/A. Tras aumentar la concentración y la actividad, respectivamente, de BoNT/A, más SNAP-25 es convertido por la neurotoxina, provocando un aumento en el contenido del SNAP-25 roto. La dependencia de la señal de la concentración de BoNT/A/actividad de BoNT/A se ilustra empleando una ecuación de 4 parámetros.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. - Un método para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina en células, que comprende las etapas de:
a) incubar células susceptibles a la intoxicación con neurotoxinas con un polipéptido de neurotoxina durante un tiempo y bajo condiciones que permiten que el polipéptido de neurotoxina ejerza su actividad biológica;
b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente;
c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de ruptura del sustrato roto por neurotoxinas, bajo condiciones que permiten la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos;
d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección con dicho primer anticuerpo de captura, formando así unos primeros complejos de detección, y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, bajo condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección con dicho segundo anticuerpo de captura, formando así unos segundos complejos de detección, en el que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección están conjugados con diferentes enzimas;
e) determinar la cantidad de los primeros y los segundos complejos de detección de la etapa d); y
f) calcular la cantidad de sustrato roto por dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células por medio de los segundos complejos de detección, determinando con ello la actividad biológica de dicho polipéptido de neurotoxina en dichas células.
2. - El método de la reivindicación 1, en el que el método es un método de fluorescencia.
3. - El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido de neurotoxina es BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, o TeNT.
4. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato es VAMP/sinaptobrevina, SNAP-25 o sintaxina.
5. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células son células neuronales o células diferenciadas neuronales seleccionadas del grupo que consiste en: células neuronales primarias, células tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales, tales como células de neuroblastoma, células P19 o neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (IPS).
6. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la fijación de las células se realiza mediante la adición de un agente de fijación seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, acetona, formaldehído o sus mezclas.
7. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas permite la determinación de la cantidad total del sustrato de neurotoxina en las células.
8. - El método de la reivindicación 7, en el que dicho primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato roto por neurotoxinas y no roto por neurotoxinas es el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), o el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies).
9. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el segundo anticuerpo de captura es un anticuerpo que comprende una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 tal como se muestra en SEQ iD NO:20 a 22, y una CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO:23 a 25, o el anticuerpo monoclonal de ratón MC-6053 (R&D Systems).
10. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el primer y/o segundo anticuerpo de captura está inmovilizado.
11. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el primer anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte fluorescente.
12. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el segundo anticuerpo de detección es un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa, un anticuerpo conjugado con tirosinasa o un anticuerpo conjugado con p-galactosidasa.
13.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el sustrato de HRP es Amplex UltraRed, 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (ADHP) o ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico (HPPA).
14.- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el sustrato de AP es un derivado de 4-metilumbeliferil fosfato, tal como 6,8-difluoro-4-metilumbeliferil fosfato (DiFMUP), o fluoresceína difosfato (FDP).
15.- Un kit para realizar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende:
a) una disposición de un primer anticuerpo de captura, un segundo anticuerpo de captura, un primer anticuerpo de detección y un segundo anticuerpo de detección, en el que dicho segundo anticuerpo de captura es un anticuerpo que comprende una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO:20 a 22, y una CDRL1, CDRL2 y CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO:23 a 25, y en el que dicha disposición permite realizar los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;
b) medios para calcular la cantidad de sustrato roto por dicha neurotoxina basados en las cantidades de los primeros y los segundos complejos de detección determinadas mediante la disposición según a); y
c) instrucciones para realizar dicho método.
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