ES2755505T3 - Ensayos de actividad de serotipo A de toxina botulínica de base inmunológica - Google Patents

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Abstract

Método de detección de actividad de NTBo/A en un mamífero, que comprende las etapas de: a. tratar una célula de una línea celular establecida que expresa SNAP-25 con una muestra de prueba que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A en aproximadamente 500 pM o menos de una NTBo/A, y en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una línea celular SiMa, y una línea celular Neuro-2a; b. aislar de las células tratadas un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c. poner en contacto el producto de corte de SNAP-25 con un anticuerpo monoclonal anti-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo anti-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, en el que el anticuerpo anti-SNAP-25 tiene una constante de velocidad de asociación para un epítopo que no comprende una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 de menos de 1 x 101 M-1 s-1; y el anticuerpo anti-SNAP-25 tiene una constante de disociación de equilibrio para el epítopo de menos de 0,450 nM; d. detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo anti-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25 que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A del producto de corte de SNAP-25; en el que la detección del complejo antígeno-anticuerpo en la etapa d es indicativa de actividad de NTBo/A.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayos de actividad de serotipo A de toxina botulínica de base inmunológica
La capacidad de toxinas clostridiales, tales como, por ejemplo, las neurotoxinas botulínicas (NTBo), NTBo/A, NTBo/B, NTBo/C1, NTBo/D, NTBo/E, NTBo/F y NTBo/G, y la neurotoxina tetánica (NTTe), para inhibir la transmisión neuronal está aprovechándose en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase por ejemplo, William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004). Las toxinas clostridiales disponibles comercialmente como composiciones farmacéuticas incluyen, preparaciones de NTBo/A, tales como, por ejemplo, BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT®/RELOXIN®, (Ipsen Ltd., Slough, Inglaterra), PURTOX® (Mentor Corp., Santa Barbara, CA), XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur), BTX-A (Biogen-tech Ltd., University, Yantai, Shandong, China); y preparaciones de NTBo/B, tales como, por ejemplo, MYOBLOC®/NEUROBLOC® (Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, CA). Como ejemplo, BOTOX® está aprobado actualmente en los EE.UU. para el tratamiento de distonía cervical en adultos para disminuir la gravedad de la posición anómala de la cabeza y el dolor de cuello asociados con la distonía cervical; para el tratamiento de hiperhidrosis axilar primaria grave que se gestiona de manera inadecuada con agentes tópicos; y para el tratamiento de estrabismo y blefaroespasmo asociados con distonía, incluyendo blefaroespasmo esencial benigno o trastornos del nervio VII en pacientes de 12 años de edad y más.
En la actualidad, el bioensayo de DL50 de ratón, una prueba de letalidad, sigue siendo el método de referencia usado por todos los fabricantes farmacéuticos para expresar la potencia de sus preparaciones. S. S. Amon et al., JAMA 285: 1059-1070 (2001). De hecho, las unidades en las etiquetas de las preparaciones farmacéuticas son unidades de DL50 de ratón y el número de animales necesarios para producir datos de DL50 estadísticamente útiles es grande. La ventaja del bioensayo de DL50 de ratón es que mide todas las etapas necesarias para la captación de la toxina botulínica (por ejemplo, unión de la toxina a un receptor de superficie celular, internalización del complejo toxinareceptor, translocación de cadena ligera en el citoplasma, escisión de cadena ligera de sustrato), en vez de determinar meramente la actividad sólo para parte de este proceso de intoxicación, tal como, por ejemplo, ensayos in vitro que sólo miden la actividad enzimática de cadena ligera. Desafortunadamente, el bioensayo de DL50 de ratón presenta muchos inconvenientes incluyendo alto coste operativo debido a los grandes números de animales de laboratorio requeridos, una falta de especificidad puesto que todos los serotipos de NTBo producirán el mismo punto final medible y el potencial de inexactitud a menos que se usan grandes grupos de animales. Además, los grupos en defensa de los derechos de los animales han ejercido presión sobre las agencias normativas en los Ee .UU. (FDA/NICEATM/ICCVAM) y Europa (MHRA y EDQM), y sobre las empresas farmacéuticas que fabrican productos de neurotoxina botulínica para reducir las pruebas con animales y de manera más importante reemplazar el bioensayo de DL50 de ratón para la liberación del producto. Las agencias normativas están involucrando a las empresas farmacéuticas para que aplique el principio de las “R” a las pruebas de potencia de neurotoxinas botulínicas: Reducir, Refinar, Reemplazar. D. Straughan, Progress in Applying the Three Rs to the Potency Testing of Botulinum Toxin Type A, Altern. Lab. Anim. 34(3): 305-313 (2006). En los últimos años, se han adoptado varias medidas ya para reducir y refinar el bioensayo de DL50 de ratón con el fin de normalizar el protocolo y producir datos más sistemáticos usando menos animales por ensayo.
El documento US 2008/064054 da a conocer una línea celular Neuro2a o SH-SY5Y que es susceptible de intoxicación por NTBo/A, y un ensayo relacionado en el que un anticuerpo anti-SNAP-25 no se une a un soporte sólido.
Por tanto, un ensayo de actividad de toxina botulínica sencillo, fiable, validado y aceptable por agencias gubernamentales que puede evaluar la integridad de todas las etapas necesarias en la captación de toxina botulínica sería de valor significativo debido a que un ensayo no basado en animales de ese tipo paliaría la necesidad de pruebas con animales y todas las desventajas, costes y problemas éticos asociados con este tipo de ensayo basado en animales. La presente memoria descriptiva proporciona composiciones, células y métodos novedosos para someter a ensayo la actividad de una toxina botulínica A útiles para diversas industrias, tales como, por ejemplo, las industrias farmacéutica y alimentaria, y proporciona también ventajas relacionadas. Tales composiciones, células y métodos no usan animales vivos ni tejidos tomados de animales vivos, pero puede evaluar todas las etapas necesarias para la acción de la neurotoxina.
Descripción detallada de los dibujos
La figura 1 muestra un esquema del paradigma actual de liberación de neurotransmisores e intoxicación por toxinas clostridiales en una neurona central y periférica. La figura 1A muestra un esquema para el mecanismo de liberación de neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de liberación puede describirse como que comprende dos etapas: 1) anclaje vesicular, en el que la proteína SNARE unida a vesículas de una vesícula que contiene moléculas de neurotransmisores se asocia con las proteínas SNARE unidas a la membrana ubicadas en la membrana plasmática; y 2) liberación de neurotransmisores, en la que la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas de neurotransmisores experimentan exocitosis. La figura 1B muestra un esquema del mecanismo de intoxicación para la actividad de toxina tetánica y botulínica en una neurona central y periférica. Este proceso de intoxicación puede describirse como que comprende cuatro etapas: 1) unión al receptor, en la que la toxina clostridial se une a un complejo de receptor clostridial e inicia el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, en la que tras la unión a la toxina, una vesícula que contiene un complejo de toxina/sistema de receptor experimenta endocitosis en la célula; 3) translocación de cadena ligera, en la que se cree que se producen múltiples acontecimientos, incluyendo cambios en el pH interno de una vesícula, formación de un poro de canal que comprende el dominio Hn de la cadena pesada de toxina clostridial, separación de la cadena ligera de toxina clostridial de la cadena pesada, y liberación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera de toxina clostridial escinde de manera proteolítica sus sustratos de SNARE diana, tales como, por ejemplo, SNAP-25, VAMP o sintaxina, impidiendo de ese modo el anclaje vesicular y la liberación de neurotransmisores.
La figura 2 muestra una comparación de la captación de NTBo/A en cuatro líneas celulares mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La figura 2A muestra un gráfico de producto de corte de SNAP-25 detectado basándose en la cantidad de NTBo/A usada para tratar la línea celular. Se analizaron los datos en SigmaPlot usando un modelo logístico de 4 parámetros y se obtuvieron los valores de CE50 para cada línea celular. La clasificación de las señales de producto de corte de SNAP-25 detectadas fue: SiMa >> Neuro-2a>LA1-55n> PC12. La figura 2B muestra las relaciones señal-ruido de las señales sin procesar a 300 pM frente a 0 pM y se calcularon a 1,2 pM frente a 0 pM para el ensayo. Las células SiMa generaron las mayores relaciones señal-ruido y los menores valores de CE50.
La figura 3 muestra la optimización de medios de diferenciación celular para líneas celulares establecidas útiles en un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.
La figura 4 muestra la optimización del tiempo de diferenciación celular para células que comprenden una línea celular establecida útil en un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.
La figura 5 muestra la optimización del tratamiento con NTBo/A de células que comprenden una línea celular establecida útil en un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva. Los resultados indican que se logró una CE50 de menos de 2 pM con cualquiera de los tratamientos con NTBo/A sometidos a prueba.
La figura 6 muestra la sensibilidad de un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva. Los resultados indicaron que la captación de NTBo/A por las células llevó menos de un minuto antes de producir cantidades significativas de producto de corte de SNAP-25 con respecto al fondo.
La figura 7 muestra la especificidad de un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva. Los resultados indican que los métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dados a conocer en la presente memoria descriptiva pueden medir todas las etapas implicadas en la intoxicación por NTBo/A.
La figura 8 muestra una curva de dosis-respuesta de células SiMa diferenciadas tratadas con un complejo de NTBo/A usando un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.
La figura 9 muestra los resultados de un ensayo de base inmunológica de actividad de NTBo/A para un producto farmacéutico de NTBo/A formulado usando un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.
La figura 10 muestra la detección de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A en suero humano usando un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.
Descripción detallada
La presente memoria descriptiva proporciona ensayos novedosos para determinar la presencia o ausencia de una NTBo/A activa en una muestra y para determinar la actividad/potencia de una preparación de NTBo/A. Los ensayos basados en células novedosos dados a conocer en la presente memoria descriptiva se basan en células, reactivos y métodos de detección que permiten que el ensayo detecte cantidades picomolares de NTBo/A en una muestra. El método de la invención se define en las reivindicaciones. Los ensayos basados en células dados a conocer en la presente memoria descriptiva reducen la necesidad de estudios de toxicidad en animales, aunque sirven para analizar múltiples funciones de NTBo/A, concretamente, unión y captación celular de toxina, translocación en el citosol celular y actividad proteasa. Tal como se comenta adicionalmente a continuación, las composiciones y los métodos novedosos pueden usarse para analizar muestras en bruto y a granel así como toxinas bicatenarias altamente purificadas y productos de toxina formulados y además son propicios para formatos de ensayo de alto rendimiento automatizados.
Por tanto, un aspecto de referencia dado a conocer en la presente memoria descriptiva proporciona composiciones para producir anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Las composiciones pueden comprender un adyuvante y una composición que incluye un antígeno de SNAP-25, un transportador unido a un antígeno de SNAP-25, o un transportador unido a un espaciador flexible unido a un antígeno de SNAP-25, en el que el ligador flexible es intermedio entre el antígeno de SNAP-25 y el transportador. Se prevé que todos y cada uno de los antígenos de SNAP-25 que desencadena una respuesta inmunitaria que produce un anticuerpo a-SNAP-25 que puede unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 puede ser útil como antígeno de SNAP-25, incluyendo, sin limitación, un antígeno de SNAP-25 derivado de una SNAP-25 que se produce de manera natural, un antígeno de SNAP-25 derivado de una SNAP-25 que no se produce de manera natural y un antígeno de SNAP-25 que comprende un fragmento inmunorreactivo de la SNAP-25, la SNAP-25 de una SNAP-25 que se produce de manera natural o una SNAP-25 que no se produce de manera natural. Antígenos de SNAP-25 útiles para producir anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 incluyen, sin limitación, antígenos de SNAP-25 que comprenden un péptido de SNAP-25 que tiene una glutamina C-terminal carboxilada unida a un péptido transportador, incluyendo, sin limitación SEQ ID NO: 38. Otras composiciones útiles para preparar anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 incluyen, sin limitación, una composición que comprende un transportador unido a un ligador flexible unido a un antígeno de SNAP-25 una glutamina C-terminal carboxilada, en el que el ligador flexible es intermedio entre el antígeno de SNAP-25 y el transportador. Se prevé que todos y cada uno de los adyuvantes puedan ser útiles en una composición de este tipo, incluyendo, sin limitación, polietilenglicol (PEG), monometoxipolietilenglicol (mPEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), adyuvante completo e incompleto de Freund.
Otro aspecto de referencia dado a conocer en la presente memoria descriptiva proporciona métodos de producción de un anticuerpo a-SNAP-25 que puede unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Aspectos de este método comprenden las etapas de (a) administrar a un animal una composición dada a conocer en la presente memoria descriptiva; (b) recoger del animal una muestra que contiene un anticuerpo a-SNAP-25 o célula productora de anticuerpos a-SNAP-25; y (c) aislar el anticuerpo a-SNAP-25 de la muestra. Los métodos dados a conocer son útiles para preparar o bien anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 o bien anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25.
Todavía otro aspecto de referencia dado a conocer en la presente memoria descriptiva proporciona anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Tales anticuerpos a-SNAP-25 incluyen anticuerpos tanto que se producen de manera natural como que no se producen de manera natural, así como, anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 o anticuerpos policlonales a-SNAP-25. Los anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 útiles como anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, incluyen, sin limitación, los anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 producidos a partir de las líneas celulares de hibridoma 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2.
Aún otro aspecto dado a conocer en la presente memoria descriptiva proporciona métodos de detección de actividad de NTBo/A, tal como se definen en las reivindicaciones. Aspectos de este método comprenden las etapas de (a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A; (b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; (c) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 que puede unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y (d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A. El anticuerpo a-SNAP-25 de la etapa c puede unirse opcionalmente a un soporte de fase sólida.
Aún otro aspecto dado a conocer en la presente memoria descriptiva proporciona métodos de detección de actividad de NTBo/A. Aspectos de este método comprenden las etapas de (a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar una NTBo/A; (b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; (c) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 que puede unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y (d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A. El anticuerpo a-SNAP-25 de la etapa c puede unirse opcionalmente a un soporte de fase sólida.
Un aspecto adicional de referencia dado a conocer en la presente memoria descriptiva proporciona métodos de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero. Aspectos de este método comprenden las etapas de (a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; (b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A; (c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; (d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 que puede unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; (e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; (f) repetir las etapas a-e con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba; y (g) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa (e) con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa (f), en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa (e) con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa (f) es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A. El anticuerpo a-SNAP-25 de la etapa d puede unirse opcionalmente a un soporte de fase sólida. La muestra de control en la etapa f también puede incluir una muestra de control positivo, además de la muestra de control negativo.
Las toxinas clostridiales producidas por Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii y Clostridium butyricum son las usadas más ampliamente en tratamientos terapéuticos y cosméticos de seres humanos y otros mamíferos. Las cepas de C. botulinum producen siete serotipos distintos antigénicamente de toxinas botulínicas (NTBo), que se han identificado investigando brotes de botulismo en el hombre (NTBo/A, NTBo/B, NTBo/E y NTBo/F), animales (NTBo/C1 y NTBo/D), o aislados de tierra (NTBo/G). Aunque los siete serotipos de toxina botulínica tienen estructura y propiedades biológicas similares, cada uno presenta también características heterogéneas, tales como, por ejemplo, diferentes propiedades farmacológicas. En cambio, la toxina tetánica (NTTe) se produce por un grupo uniforme de C. tetani. Otras dos especies de Clostridia, C. baratii y C. butyricum, también producen toxinas similares a NTBo/F y NTBo/E, respectivamente.
Las toxinas clostridiales se traducen cada una como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que se corta posteriormente mediante escisión proteolítica dentro de un bucle disulfuro por una proteasa que se produce de manera natural, tal como, por ejemplo, una proteasa de toxina clostridial endógena o una proteasa que se produce de manera natural, producida en el entorno. Este procesamiento postraduccional proporciona una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC, light chain) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC, heavy chain) de aproximadamente 100 kDa unidas entre sí por un único enlace disulfuro e interacciones no covalentes. Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios distintos funcionalmente: 1) un dominio enzimático ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad endopeptidasa dependiente de zinc que selecciona como diana específicamente componentes principales del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad aminoterminal de la HC (Hn) que facilita la liberación de la LC de vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión que se encuentra dentro de la mitad carboxilo-terminal de la HC (Hc) que determina la actividad de unión y especificidad de unión de la toxina al complejo de receptor ubicado en la superficie de la célula diana.
La actividad de unión, de translocación y enzimática de estos tres dominios funcionales son todas necesarias para la toxicidad. Aunque no se conoce aún con precisión todos los detalles de este proceso, el mecanismo de intoxicación celular global mediante el cual las toxinas clostridiales entran en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, independientemente del serotipo o subtipo. Aunque los solicitantes no desean limitarse por la siguiente descripción, el mecanismo de intoxicación puede describirse como que comprende al menos cuatro etapas: 1) unión al receptor, 2) internalización del complejo, 3) translocación de cadena ligera y 4) modificación de la diana enzimática (figura 1). Se inicia el proceso cuando el dominio HC de una toxina clostridial se une a un sistema de receptor específico de toxina ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la especificidad de unión de un complejo de receptor se logra, en parte, mediante combinaciones específicas de gangliósidos y receptores de proteína que parecen comprender de manera distinta cada complejo de receptor de toxina clostridial. Una vez unidos, los complejos toxina/receptor se internalizan mediante endocitosis y las vesículas internalizadas se dividen a rutas intracelulares específicas. La etapa de translocación parece desencadenarse mediante la acidificación del compartimento vesicular. Este proceso parece iniciar importantes redisposiciones estructurales dependientes del pH que aumentan la hidrofobicidad, promueven la formación de poros y facilitan la separación de las cadenas pesada y ligera de la toxina. Una vez separadas, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera de la vesícula intracelular en el citosol en el que parece seleccionar como diana específicamente componentes principales del aparato de liberación de neurotransmisores. Estas proteínas principales, proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)/sinaptobrevina, proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25) y sintaxina, son necesarias para la fusión y el anclaje vesicular sináptico en el terminal nervioso y constituyen miembros de la familia de receptores de proteínas de unión al factor sensible a N-etilmaleimida (SNARE) soluble. NTBo/A y NTBo/E cortan SNAP-25 en la región carboxilo-terminal, liberando un fragmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y NTBo/C1 también corta SNAP-25 cerca del extremo carboxilo-terminal liberando un fragmento de ocho aminoácidos. Los serotipos botulínicos NTBo/B, NTBo/D, NTBo/F y NTBo/G, y la toxina tetánica, actúan sobre la parte central conservada de VAMP, y liberan la parte amino-terminal de vAm P en el citosol. NTBo/C1 corta sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. La proteólisis selectiva de SNARE sinápticas explica el bloqueo de la liberación de neurotransmisores provocado por toxinas clostridiales in vivo. Las dianas de proteína SNARE de toxinas clostridiales son comunes para la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en neuronas, la actividad peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véanse, por ejemplo, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna LaIIi et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una composición para producir anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Otros aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una composición que induce respuesta inmunitaria para producir anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Tal como se usa en el presente documento, el término “composición que induce respuesta inmunitaria” se refiere a una composición que comprende un antígeno de SNAP-25 que, cuando se administra a un animal, estimula una respuesta inmunitaria contra el antígeno de SNAP-25, produciendo de ese modo anticuerpos a-SNAP-25 que pueden unirse a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. El término “respuesta inmunitaria” se refiere a cualquier respuesta por el sistema inmunitario de un animal a una composición que induce respuesta inmunitaria. A modo de ejemplo las respuestas inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, inmunidad celular así como humoral local y sistémica, tal como, por ejemplo, respuestas de CTL, incluyendo la inducción específica de antígeno de cTl CD8+, respuestas de células T auxiliares, incluyendo respuestas proliferativas de células T y liberación de citocinas, y respuestas de células B incluyendo, por ejemplo, una respuesta de producción de anticuerpos. El término “inducir una respuesta inmunitaria” se refiere a la administración de una composición que induce respuesta inmunitaria o un polinucleótido que codifica para la composición que induce respuesta inmunitaria, en la que se ve afectada una respuesta inmunitaria, es decir, estimulada, iniciada o inducida.
Una composición comprende un antígeno de SNAP-25. Tal como se usa en el presente documento, el término “antígeno” se refiere a una molécula que provoca una respuesta inmunitaria e incluye, sin limitación, péptidos, polisacáridos y conjugados de lípidos, tales como, por ejemplo, lipoproteínas y glicolípidos. Tal como se usa en el presente documento, el término “antígeno de SNAP-25” se refiere a cualquier antígeno que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A que puede provocar una respuesta inmunitaria. Un antígeno de SNAP-25 usado en una composición que induce respuesta inmunitaria debe ser lo suficientemente grande como para ser de secuencia sustancialmente única, reduciendo por tanto la posibilidad de producción de anticuerpos que dan reactividad cruzada contra antígenos distintos de SNAP-25. Además, un antígeno de SNAP-25 usado en una composición que induce respuesta inmunitaria debe ser lo suficientemente pequeño como para sólo desencadenar una respuesta inmunitaria sustancialmente contra una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, aumentando por tanto la posibilidad de producción de anticuerpos a-SNAP-25 que pueden distinguir una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de una SNAP-25 que carece de un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Además, también es muy deseable generar anticuerpos a-SNAP-25 de una única secuencia de aminoácidos con buen rendimiento que sean selectivos de manera reproducible y que se unan con avidez aceptable para permitir el diseño de un ensayo altamente sensible.
La secuencia que rodea un sitio de corte de NTBo/A presente en SNAP-25 se indica como P5-P4-P3-P2-P1-P1 -P2'-P3 -P4 -P5', representando P1-P1' el enlace escindible. Tras el corte mediante NTBo/A, los productos de corte resultantes producidos comprenden un fragmento que incluye la secuencia P5-P4-P3-P2-P1 y un fragmento que incluye la P-T-P2'-P3'-P4'-P5'. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, el término “SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A” se refiere a cualquier SNAP-25 que tiene el residuo Pi como su aminoácido carboxilo-terminal. Por ejemplo, Q197-R198 de SNAP-25 humana (s Eq ID NO: 5) representa el enlace escindible P1-P1' para el sitio de corte de NTBo/A. Como tal, “SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A” sería cualquier producto de corte de SNAP-25 que tenga una glutamina en su aminoácido carboxilo-terminal en el que la glutamina representa Q197 del enlace escindible. Como otro ejemplo, K204-H205 de SNAP-25 de Torpedo marmorata (SEQ ID NO: 16) representa el enlace escindible P1-P1' para el sitio de corte de NTBo/A. Como tal, “SNAP-25 que tiene una lisina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A” sería cualquier producto de corte de SNAP-25 que tenga una lisina en su aminoácido carboxilo-terminal en el que la lisina representa K204 del enlace escindible.
El antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A del sitio de corte de NTBo/A puede modificarse para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno de SNAP-25, un hapteno, o cualquier otro compuesto antigénico que es inmunogénico, no inmunogénico o débilmente inmunogénico cuando no está asociado con la modificación. En un aspecto de esta realización, el residuo P1 carboxilo-terminal del enlace escindible de un antígeno de SNAP-25 puede estar carboxilado. La carboxilación aumenta las propiedades inmunogénicas deseadas de un antígeno de SNAP-25 en dos aspectos. En primer lugar, dado que los aminoácidos cargados potencian la inmunogenicidad, añadir un grupo COO‘ al residuo carboxilo-terminal aumentará la inmunogenicidad global de un antígeno de SNAP-25. En segundo lugar, dado que el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A está en un estado cargado tras el corte, añadir un grupo COO‘ al residuo carboxilo-terminal imitará mejor al antígeno real al que están diseñados que se unan los anticuerpos a-SNAP-25 dados a conocer en la presente memoria descriptiva.
En un aspecto de esta realización, el residuo amino-terminal de un antígeno de SNAP-25 puede modificarse mediante la adición de un aminoácido adaptado para unir el antígeno de SNAP-25 a una proteína transportadora, tal como, por ejemplo, una hemocianina de lapa californiana (KLH), una ovoalbúmina (OVA), una tiroglobulina (THY), una albúmina sérica bovina (BSA), un inhibidor de tripsina de soja (STI), o un péptido de unión múltiple (MAP). Por ejemplo, un residuo de cisteína puede situarse en el extremo amino-terminal para conjugar la proteína transportadora KLH.
Por tanto, en una realización, un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede ser, por ejemplo, de al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, o al menos 30 aminoácidos de longitud. En otra realización, un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede ser, por ejemplo, de como máximo 5, como máximo 6, como máximo 7, como máximo 8, como máximo 9, como máximo 10, como máximo 11, como máximo 12, como máximo 13, como máximo 14, como máximo 15, como máximo 16, como máximo 17, como máximo 18, como máximo 19, como máximo 20, como máximo 25, o como máximo 30 aminoácidos de longitud. Todavía en otra realización, un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede ser, por ejemplo, de entre 7-12 aminoácidos, entre 10-15 aminoácidos, o entre 13-18 aminoácidos.
En otra realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A comprende SEQ ID NO: 32. En aspectos de esta realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A comprende SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. En una realización adicional, el antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A comprende SEQ ID NO: 38.
Aún en otra realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A comprende SEQ ID NO: 39. En aspectos de esta realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A comprende SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. En una realización adicional, el antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A comprende SEQ ID NO: 45.
Se prevé que todos y cada uno de los antígenos de SNAP-25 que desencadenan una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 puedan ser útiles como antígeno de SNAP-25. Por tanto, variantes de la secuencia de aminoácidos que comprenden SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148 pueden ser útiles como antígeno de SNAP-25 para desencadenar una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Por tanto, en una realización, un antígeno de SNAP-25 puede sustituir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido en los antígenos de SNAP-25 que comprenden SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. Todavía en otra realización, un antígeno de SNAP-25 puede tener una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% respecto a los antígenos de SNAP-25 que comprenden SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148.
Se prevé que uno o más transportadores puedan unirse a un antígeno de SNAP-25 para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno de SNAP-25 que es inmunogénico, no inmunogénico o débilmente inmunogénico cuando no está asociado con el transportador. Los ejemplos no limitativos, incluyen, por ejemplo, una hemocianina de lapa californiana (KLH), una ovoalbúmina (OVA), una tiroglobulina (THY), una albúmina sérica bovina (BSA), un inhibidor de tripsina de soja (STI) o un péptido de unión múltiple (MAP). Tal como se conoce bien en la técnica, un antígeno no antigénico o débilmente antigénico puede hacerse antigénico mediante acoplamiento del antígeno a un transportador. Otros transportadores diversos y métodos para acoplar un antígeno a un transportador se conocen bien en la técnica. Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente, 1998a; Harlow y Lane, citado anteriormente, 1998b; y David W. Waggoner, Jr. et al., Immunogenicity-enhancing carriers and compositions thereof and methods of using the same, publicación de patente estadounidense n.° 20040057958 (25 de marzo de 2004). Un epítopo también puede generarse expresando el epítopo como proteína de fusión. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para expresar fusiones de polipéptido tal como se describe, por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999). Como el extremo carboxilo-terminal del antígeno de SNAP-25 debe ser el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, un transportador debe unirse al extremo amino del antígeno de SNAP-25.
Se prevé que uno o más espaciadores flexibles puedan unirse a un antígeno de SNAP-25 para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno de SNAP-25 que es inmunogénico, no inmunogénico o débilmente inmunogénico cuando no está asociado con los ligadores flexibles. Un espaciador flexible aumenta la longitud de péptido global del antígeno de SNAP-25 y proporciona flexibilidad, facilitando de ese modo la presentación apropiada del antígeno de SNAP-25 a las células inmunitarias. Como ejemplo no limitativo, una composición puede comprender un antígeno de SNAP-25 unido a uno o más espaciadores flexibles en tándem para presentar mejor el antígeno de SNAP-25 a células inmunitarias, facilitando de ese modo la respuesta inmunitaria.
Un espaciador flexible que comprende un péptido es de al menos un aminoácido de longitud y comprende aminoácidos no cargados con pequeños grupos R de cadena lateral, tales como, por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina o serina. Por tanto, en una realización un espaciador flexible puede ser, por ejemplo, de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 aminoácidos de longitud. En otra realización, un espaciador flexible puede ser, por ejemplo, de al menos 1, como máximo 2, como máximo 3, como máximo 4, como máximo 5, como máximo 6, como máximo 7, como máximo 8, como máximo 9, o como máximo 10 aminoácidos de longitud. Todavía en otra realización, un espaciador flexible puede ser, por ejemplo, de entre 1-3 aminoácidos, entre 2-4 aminoácidos, entre 3-5 aminoácidos, entre 4-6 aminoácidos, o entre 5-7 aminoácidos. Los ejemplos no limitativos de un espaciador flexible incluyen, por ejemplo, espaciadores de G tales como GGG, GGGG (SeQ ID NO: 55) y GGGGS (SEQ ID NO: 56) o espaciadores de A tales como AAA, AAAA (SEQ ID NO: 57) y AAAAV (SEQ ID NO: 58). Un espaciador flexible se liga en marco al antígeno de SNAP-25 como proteína de fusión.
Tal como se comentó anteriormente, se usa un espaciador flexible, en parte, para aumentar la longitud de péptido global del antígeno de SNAP-25. Por ejemplo, un antígeno de 5-10 aminoácidos de SNAP-25 puede tener su longitud global aumentada mediante ligado a un espaciador flexible de 3-5 aminoácidos en el extremo amino del antígeno de SNAP-25. Como otro ejemplo, un antígeno de 5-10 aminoácidos de SNAP-25 puede tener su longitud global aumentada mediante ligado a un espaciador flexible de 4-6 aminoácidos en el extremo amino del antígeno de SNAP-25. Como otro ejemplo, un antígeno de 5-10 aminoácidos de SNAP-25 puede tener su longitud global aumentada mediante ligado a un espaciador flexible de 7-10 aminoácidos en el extremo amino del antígeno de SNAP-25. Como otro ejemplo, un antígeno de 7-12 aminoácidos de SNAP-25 puede tener su longitud global aumentada mediante ligado a un espaciador flexible de 1-3 aminoácidos en el extremo amino del antígeno de SNAP-25. Como otro ejemplo, un antígeno de 7-12 aminoácidos de SNAP-25 puede tener su longitud global aumentada mediante ligado a un espaciador flexible de 4-6 aminoácidos en el extremo amino del antígeno de SNAP-25. La longitud aumentada proporcionada por el espaciador flexible permite la selección de un antígeno de pequeño tamaño de SNAP-25, aumentando de ese modo la probabilidad de que el antígeno de SNAP-25 sólo desencadene una respuesta inmunitaria sustancialmente contra una SNAP-25 que tiene un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, aumentando por tanto la posibilidad de producción de anticuerpos contra a-SNAP-25 que pueden distinguir una SNAP-25 que tiene un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de una SNAP-25 que carece de un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
Se prevé que las composiciones dadas a conocer en la presente memoria descriptiva puedan comprender opcionalmente un antígeno de SNAP-25 dado a conocer en la presente memoria descriptiva y uno o más adyuvantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “adyuvante” cuando se usa en referencia a una composición de SNAP-25 se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias que aumenta o diversifica la respuesta inmunitaria frente a un antígeno de SNAP-25. Un adyuvante puede servir, por ejemplo, para reducir el número de inmunizaciones o la cantidad de antígeno requerido para inmunización protectora. El uso de adyuvantes en una composición que induce respuesta inmunitaria se conoce bien. El principal objetivo de estos adyuvantes es permitir un aumento en la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes no limitativos incluyen, por ejemplo, liposomas, fases oleosas, incluyendo, sin limitación, el tipo de adyuvantes de Freund, tales como, por ejemplo, adyuvante completo de Freund (FCA); adyuvante incompleto de Freund (FIA); glicósidos de sapogenina, tales como, por ejemplo, saponinas; carbopol; N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (conocido comúnmente como muramil dipéptido o “MDP”); y lipopolisacárido (LPS). Tales adyuvantes se usan generalmente en forma de una emulsión con una fase acuosa, o, más comúnmente, puede consistir en sales inorgánicas insolubles en agua. Estas sales inorgánicas pueden consistir, por ejemplo, en hidróxido de aluminio, sulfato de zinc, hidróxido de hierro coloidal, fosfato de calcio o cloruro de calcio. El hidróxido de aluminio (AI(OH)3) es un adyuvante usado comúnmente. Actualmente, el único adyuvante aprobado por la FDA para su uso en seres humanos son las sales de aluminio (Alum) que se usan para “depositar” antígenos mediante precipitación de los antígenos. Los adyuvantes proporcionados anteriormente son meramente a modo de ejemplo. De hecho, puede usarse cualquier adyuvante en una composición de SNAP-25 dada a conocer en la presente memoria descriptiva siempre que el adyuvante satisfaga las características requeridas para inducir una respuesta inmunitaria.
Un transportador dado a conocer en la presente memoria descriptiva también puede actuar como adyuvante. Se describen adyuvantes específicos y métodos de preparación y uso, por ejemplo, en Gupta et al. Vaccine, 11 : 993­ 306, 1993; Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines 1:83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, FIa., 1987; y David W. Waggoner, Jr. et al., Immunogenicity-Enhancing Carriers and Compositions Thereof and Methods of Using the Same, publicación de patente estadounidense n.° 20040057958 (25 de marzo de 2004). Adyuvantes adicionales incluyen cualquier compuesto descrito en el Capítulo 7 (págs. 141-227) de “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” (eds. Powell, M. F. y Newman, M. J.) Pharmaceutical Biotechnology, Volumen 6, Plenum Press (Nueva York). Los ejemplos de este compendio incluyen muramil dipéptido (MDP) y Montanide 720. Moléculas tales como poli-inosina:citosina (poli I:C) o a D n de plásmido que contiene motivos CpG también pueden administrarse como adyuvantes en combinación con antígenos encapsulados en micropartículas. En otro ejemplo, el adyuvante es un agente que facilita la entrada del compuesto antigénico en el citoplasma de una célula tal como listeriolisina, estreptolisina o una mezcla de las mismas.
Por tanto, en una realización, una composición de SNAP-25 comprende un antígeno de SNAP-25 que tiene una glutamina carboxilo-terminal carboxilada unida a un péptido transportador. En aspectos de esta realización, un antígeno de SNAP-25 que tiene una glutamina carboxilo-terminal carboxilada comprende SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. En otro aspecto de esta realización, un antígeno de SNAP-25 comprende SEQ ID NO: 38. En aspectos de esta realización, el péptido transportador es una hemocianina de lapa californiana (KLH), una ovoalbúmina (OVA), una tiroglobulina (THY), una albúmina sérica bovina (BSA), un inhibidor de tripsina de soja (STI) o un péptido de unión múltiple ( M a P ) .
En otra realización, una composición de SNAP-25 comprende un antígeno de SNAP-25 que tiene una lisina carboxilo-terminal carboxilada unida a un péptido transportador. En aspectos de esta realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene una lisina carboxilo-terminal carboxilada comprende SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, s E q ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. En otro aspecto de esta realización, un antígeno de SNAP-25 comprende SEQ ID NO: 45. En aspectos de esta realización, el péptido transportador es una hemocianina de lapa californiana (KLH), una ovoalbúmina (OVA), una tiroglobulina (THY), una albúmina sérica bovina (BSA), un inhibidor de tripsina de soja (STI) o un péptido de unión múltiple (MAP).
Aún en otra realización, una composición de SNAP-25 comprende un antígeno de SNAP-25 que tiene una glutamina C-terminal carboxilada unida a uno o más ligadores flexibles y un péptido transportador en el que los ligadores flexibles son intermedios entre el antígeno de SNAP-25 y el péptido transportador. En aspectos de esta realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene una glutamina carboxilo-terminal carboxilada comprende SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. En otra realización, un antígeno de SNAP-25 comprende SEQ ID NO: 46. En aspectos de esta realización, el péptido transportador es una hemocianina de lapa californiana (KLH), una ovoalbúmina (OVA), una tiroglobulina (THY), una albúmina sérica bovina (BSA), un inhibidor de tripsina de soja (STI) o un péptido de unión múltiple (MAP). En aspectos de esta realización, el ligador flexible es un espaciador de G o un espaciador de A.
Todavía en otra realización, una composición de SNAP-25 comprende un antígeno de SNAP-25 que tiene una lisina C-terminal carboxilada unida a un ligador flexible y un péptido transportador en el que el ligador flexible es intermedio entre el antígeno de SNAP-25 y el péptido transportador. En aspectos de esta realización, el antígeno de SNAP-25 que tiene una lisina carboxilo-terminal carboxilada comprende SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, s E q ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44. En otro aspecto de esta realización, un antígeno de SNAP-25 comprende SEQ ID NO: 47. En aspectos de esta realización, el péptido transportador es una hemocianina de lapa californiana (KLH), una ovoalbúmina (OVA), una tiroglobulina (THY), una albúmina sérica bovina (BSA), un inhibidor de tripsina de soja (STI) o un péptido de unión múltiple (MAP). En aspectos de esta realización, el ligador flexible es un espaciador de G o un espaciador de A.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, un método para producir anticuerpos contra a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 puede producirse mediante una amplia variedad de métodos que se conocen bien en la técnica. Se conocen en la técnica protocolos específicos para preparar y usar anticuerpos así como detectar y medir la especificidad de unión, afinidad de unión y avidez de unión de anticuerpos. Véanse, por ejemplo, ANTIBODIeS: A LABORATORY MANUAL (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1998a); y USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998b); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2001; y Current Protocols in Molecular Biology, 2004; David Anderson et al., Therapeutic Polypeptides, Nucleic Acids Encoding Same, and Methods of Use, patente estadounidense 7.034.132 (25 de abril de 2005); y Beatriz M. Carreno et al., Antibodies Against CTLA4, patente estadounidense 7.034.121 (25 de abril de 2006).
Como ejemplo no limitativo, pueden producirse anticuerpos policlonales contra a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 inyectando a un animal, tal como, por ejemplo, un conejo, una cabra, un ratón u otro mamífero, una o más inyecciones de una composición dada a conocer en la presente memoria descriptiva. Como otro ejemplo no limitativo, pueden producirse anticuerpos policlonales contra a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 inyectando en un huevo, tal como, por ejemplo, un huevo de gallina, una o más inyecciones de una composición dada a conocer en la presente memoria descriptiva. El título de anticuerpos en el animal inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo mediante técnicas convencionales, tales como con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usando un ensayo de actividad basado en células o antígeno inmovilizado. Si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales para un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de afinidad de proteína A para obtener la fracción de IgG, o mediante purificación de afinidad contra el péptido usado para producir los anticuerpos.
Como otro ejemplo no limitativo, puede producirse anticuerpo monoclonal contra a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 usando un método de hibridoma. Véanse por ejemplo, Capítulo 6 Monoclonal Antibodies, págs. 196-244, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a; y Capítulo 7 Growing Hybridomas, págs. 245-282, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a; y Goding, págs. 59-103, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986). En este método, un animal huésped, tal como, por ejemplo, un ratón, un hámster, u otro animal huésped apropiado, se expone normalmente a una o más inyecciones de un antígeno de SNAP-25 dado a conocer en la presente memoria descriptiva para provocar linfocitos que producen o que pueden producir anticuerpos contra a-SNAP-25 que se unirán específicamente a una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. El título de anticuerpos en el animal inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo mediante técnicas convencionales, tales como con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usando un ensayo de actividad basado en células o antígeno inmovilizado. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro usando una línea de cultivo celular adecuada. En un momento apropiado tras la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos son los más altos, las células productoras de anticuerpos se aíslan del animal. Generalmente, o bien se usan linfocitos de sangre periférica, si se desean células de origen humano, o bien se usan células de bazo o células de ganglio linfático, si no se desean fuentes de mamífero humano. Las células productoras de anticuerpos aisladas se fusionan con una línea celular inmortal usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Normalmente, se fusiona una línea celular de mieloma murino con esplenocitos recogidos de un ratón inmunizado de manera apropiada para producir el hibridoma. Líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (HAT). Puede usarse cualquiera de varias líneas celulares de mieloma como pareja de fusión según técnicas convencionales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8,653 o Sp2/O-Ag14. Entonces se seleccionan células de hibridoma que resultan de la fusión usando medio HAT, que destruye células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera improductiva (los esplenocitos no fusionados mueren tras varios días en cultivo porque no se transforman). El medio de cultivo en el que se hacen crecer las células de hibridoma puede someterse entonces a ensayo para detectar la presencia de anticuerpos contra a-SNAP-25 monoclonales que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Por ejemplo, pueden examinarse sobrenadantes de hibridoma usando medios positivos para a-SNAP-25 en un ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de unión in vitro, tal como, por ejemplo, un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), o en un ensayo de actividad basado en células. Tales técnicas y ensayos se conocen en la técnica. Véanse por ejemplo, Capítulo 11 Immunoprecipitation, págs. 421-470, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a; Capítulo 12 Immunoblotting, págs. 471-510, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a; Capítulo 14 Immunoassays, págs. 553-612, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a. Pueden realizarse estudios adicionales para determinar si el anticuerpo es también no reactivo frente a una SNAP-25 que carece de un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. La afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 monoclonal también puede determinarse, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard. Véanse, por ejemplo, Peter J. Munson y David Rodbard, Ligand: A Versatile Computerized Approach For Characterization of Ligand-Binding Systems, 107(1) Anal. Biochem. 220-239 (1980). Tras identificarse las células de hibridoma deseadas, se usan procedimientos de dilución limitante para aislar clones que se originan a partir de una única célula hasta que se obtiene una línea celular clonal que expresa el anticuerpo monoclonal deseado. Se eligen aquellos anticuerpos suficientemente selectivos para una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A y que se unen con avidez suficientemente alta, para su caracterización y estudio adicionales.
Otra alternativa para preparar un anticuerpo a-SNAP-25 monoclonal que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 es mediante el examen de una biblioteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante, tal como, por ejemplo, una biblioteca de presentación en fago de anticuerpos, con un péptido de SNAP-25 y aislando los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen a una SNAP-25 que tiene un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Están disponibles comercialmente kits para generar y examinar bibliotecas de presentación en fago, tales como, por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fago recombinantes (Amersham GE Healthcare, Piscataway, NJ); y el kit de presentación en fago SurfZAP™ (Stratagene, La JoIIa, CA). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos útiles en la generación y el examen de una biblioteca de presentación de anticuerpos, por ejemplo, en Ladner et al. patente estadounidense 5.223.409; Borrebaeck et al. patente estadounidense 5.712.089; Griffiths et al. patente estadounidense 5.885.793; Griffiths et al. patente estadounidense 5.962.255; McCafferty et al. patente estadounidense 5.969.108; Griffiths et al. patente estadounidense 6.010.884; Jespers et al. patente estadounidense 6.017.732; Borrebaeck et al. patente estadounidense 6.027.930; Johnson et al. patente estadounidense 6.140.471; McCafferty et al. patente estadounidense 6.172.197, cada una de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, recoger una muestra que contiene un anticuerpo a-SNAP-25 o células productoras de anticuerpos a-SNAP-25. Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra que contiene un anticuerpo a-SNAP-25 o célula productora de anticuerpos a-SNAP-25” se refiere a cualquier materia biológica que contiene o potencialmente contiene al menos un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Se prevé que todas y cada una de las muestras que pueden contener un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 puedan usarse en este método, incluyendo, sin limitación, sangre, plasma, suero y linfa. También se prevé que cualquier célula que puede producir un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 pueda usarse en este método, incluyendo, sin limitación, una célula CD8, una célula CTL, una célula T auxiliar y una célula B. Una variedad de métodos bien conocidos pueden usarse para recoger de un individuo una muestra que contiene el anticuerpo a-SNAP-25 o célula productora de anticuerpos a-SNAP-25, véanse, por ejemplo, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a; y Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998b. De manera similar, una variedad de métodos bien conocidos pueden usarse para el procesamiento de una muestra para aislar un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Un procedimiento para recoger una muestra puede seleccionarse basándose en el tipo de anticuerpo que va a aislarse. Como ejemplo no limitativo, cuando se aísla un anticuerpo policlonal a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, una muestra apropiada puede ser una muestra de sangre que contiene tal anticuerpo a-SNAP-25, mientras que cuando se aísla un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, una muestra apropiada puede ser una célula productora de anticuerpos a-SNAP-25 tal como una célula de bazo o hibridoma.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, aislar un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 de la muestra. Los expertos en la técnica conocen bien métodos de aislamiento de tales anticuerpos a-SNAP-25, tales como, por ejemplo, anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 o anticuerpos a-SNAP-25 monoclonales que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente, 1998a; y Harlow y Lane, citado anteriormente, 1998b. Por ejemplo, tales anticuerpos policlonales a-SNAP-25 pueden aislarse de la muestra mediante técnicas bien conocidas, tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando proteína A o proteína G, que proporcionan principalmente la fracción de IgG de suero inmunitario. Posteriormente, o de manera alternativa, un antígeno específico de SNAP-25 puede inmovilizarse sobre una columna o perlas magnéticas para purificar los anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 mediante cromatografía de inmunoafinidad. Un anticuerpo a-SNAP-25 monoclonal que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 puede aislarse del medio de cultivo o líquido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Por tanto, en una realización, un método de producción de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 comprende las etapas (a) administrar a un animal una composición que comprende un antígeno de SNAP-25 que tiene una glutamina C-terminal carboxilada unida a un péptido transportador; (b) recoger del animal una muestra que contiene un anticuerpo a-SNAP-25 o célula productora de anticuerpos a-SNAP-25; y (c) aislar el componente de anticuerpo a-SNAP-25 de la muestra. En un aspecto de esta realización, el anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 es un anticuerpo policlonal. En otro aspecto de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto adicional de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 monoclonal que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 producido es un subtipo de IgG. En otros aspectos de esta realización, la composición de SNAP-25 comprende además un adyuvante, tal como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), monometoxipolietilenglicol (mPEG) o poli(alcohol vinílico) (PVA).
En otra realización, un método de producción de anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 comprende las etapas (a) administrar a un animal una composición que comprende un péptido de SNAP-25 que tiene una glutamina C-terminal carboxilada unida a un ligador flexible y un péptido transportador en el que el ligador flexible es intermedio entre el péptido de SNAP-25 y el péptido transportador; (b) recoger del animal una muestra que contiene un anticuerpo a-SNAP-25 o célula productora de anticuerpos a-SNAP-25; y (c) aislar el anticuerpo a-SNAP-25 de la muestra. En un aspecto de esta realización, los anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 es un anticuerpo policlonal. En otro aspecto de esta realización, los anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 es un anticuerpo monoclonal. En un aspecto adicional de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 monoclonal que se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 producido en un subtipo de IgG. En otros aspectos de esta realización, la composición de SNAP-25 comprende además un adyuvante, tal como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), monometoxipolietilenglicol (mPEG) o poli(alcohol vinílico) (PVA).
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, un anticuerpo a-SNAP-25 aislado que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a separar una molécula de su entorno natural mediante el uso de intervención humana. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una molécula generada por un sistema inmunitario que se preparó en respuesta a un antígeno particular que se une específicamente a ese antígeno, e incluye tanto anticuerpos que se producen de manera natural como anticuerpos que no se producen de manera natural. Tal como se usa en el presente documento, el término “a-SNAP-25” es sinónimo de “anti-SNAP-25” y se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno de SNAP-25. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un dímero, un multímero, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, anticuerpo bifuncional, un anticuerpo asociado a célula como un receptor de Ig, un anticuerpo lineal, un diacuerpo o un minicuerpo, siempre que el fragmento muestre la actividad biológica deseada, y derivados de cadena sencilla de los mismos. Un anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina de longitud completa que comprende los dominios Vh y Vl, así como un dominio constante de cadena ligera (Cl) y dominios constantes de cadena pesada, Cm, Ch2 y Ch3 , o un fragmento inmunológicamente activo de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fc, un fragmento Fd, un fragmento Fv. Un anticuerpo puede derivarse de cualquier especie de vertebrado (por ejemplo, ser humano, cabra, caballo, burro, murino, rata, conejo o gallina), y puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) o subclase (IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2). Para una divulgación general sobre la estructura de anticuerpos que se producen de manera natural, anticuerpos que no se producen de manera natural, y fragmentos de unión a compuestos antigénicos de los mismos, véanse, por ejemplo, Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering, 2a ed. (Oxford University Press 1995), cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
Anticuerpos que se producen de manera natural son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
El sitio de unión a antígeno y reconocimiento de antígeno completo está contenido dentro de los dominios variables del anticuerpo, es decir, el fragmento Fv. Este fragmento incluye un dímero de un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl) en asociación no covalente, apretada. Cada dominio comprende cuatro regiones de entramado (FR), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectada mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Cada región hipervariable comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región de determinación de complementariedad (CDR). Colectivamente, la configuración tridimensional de las seis regiones CDR que definen un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl que confiere especificidad de unión a antígeno. Véanse por ejemplo, Cyrus Chothia, et al., Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature 342(6252): 877-883 (1989); Elvin A. Kabat, et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991), cada uno de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad. Los dominios constantes del anticuerpo no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Un antígeno diana tiene generalmente uno o más sitios de unión, también denominados epítopos, que se reconocen por el sitio de unión a antígeno formado por CDR. Tal como se usa en el presente documento, un “epítopo” es sinónimo de “determinante antigénico” y se refiere al sitio en un antígeno diana, tal como, por ejemplo, un péptido, polisacárido o molécula que contiene lípido, que puede dar unión específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T o interaccionar de otro modo con una molécula. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente.
Anticuerpos policlonales se refieren a una población heterogénea de moléculas de anticuerpo que contienen al menos dos especies de anticuerpo que pueden unirse a un antígeno particular. Por definición, un anticuerpo policlonal incluye dos anticuerpos diferentes que se unen a al menos dos epítopos diferentes. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo monoclonal” o “anticuerpos monoclonales” se refieren a una población sustancialmente homogénea de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de anticuerpo que puede unirse a un antígeno particular es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por definición, un anticuerpo monoclonal se une a un único epítopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, en contraposición a los anticuerpos policlonales, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no ha de interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente divulgación pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al (1975) Nature 256:495, o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véanse por ejemplo: patente estadounidense n.° 4.816.567; patente estadounidense n.° 5.807.715). Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fago usando las técnicas descritas en Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597; por ejemplo.
Por tanto, en una realización, un anticuerpo a-SNAP-25 comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl) que se une selectivamente a una SNAP-25 que tiene un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. En un aspecto de esta realización, el dominio variable de cadena pesada (Vh) es SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80 o SEQ ID NO: 82. En otro aspecto de esta realización, el dominio variable de cadena ligera (Vl) es SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90 o SEQ ID NO: 92.
En otra realización, un anticuerpo a-SNAP-25 comprende una región CDR1, una región CDR2, una región CDR3 de dominio variable de cadena pesada ( V h ) , o cualquier combinación de las mismas que se une selectivamente a una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. En un aspecto de esta realización, la región CDR1 de dominio variable de cadena pesada ( V h ) es SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 o SEQ ID NO: 120. En otro aspecto de esta realización, la región CDR2 de dominio variable de cadena pesada ( V h) es SEQ ID NO: 96, SEQ ID n O : 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123. Aún en otro aspecto de esta realización, la región CDR3 de dominio variable de cadena pesada ( V h ) es SEQ ID NO: 100, SEQ ID N o : 101, SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 124.
En otra realización, un anticuerpo a-SNAP-25 comprende una región CDR1, una región CDR2, una región CDR3 de dominio variable de cadena ligera ( V l), o cualquier combinación de las mismas que se une selectivamente a una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. En un aspecto de esta realización, la región CDR1 de dominio variable de cadena ligera ( V l) es SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128 o SEQ ID NO: 129. En otro aspecto de esta realización, la región CDR2 de dominio variable de cadena ligera ( V l) es SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. Aún en otro aspecto de esta realización, la región CDR3 de dominio variable de cadena ligera ( V l) es SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 o SEQ ID NO: 117.
Aún en otra realización, un anticuerpo a-SNAP-25 se une específicamente a un epítopo que comprende una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. En un aspecto de esta realización, el epítopo comprende SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, s E q ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. En un aspecto de esta realización, el epítopo comprende SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
Tal como se comentó anteriormente, la secuencia que rodea un sitio de corte de NTBo/A presente en SNAP-25 se indica como P5-P4-P3-P2-P1-P-T-P2’-P3’-P4’-P5’, representando P1-P1' el enlace escindible. Tras el corte mediante NTBo/A, los productos de corte resultantes producidos comprenden un fragmento que incluye la secuencia P5-P4-P3-P2-P1 y un fragmento que incluye la P1’-P2’-P3’-P4’-P5’. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpos a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25” se refiere a anticuerpos a-SNAP-25 que se unen selectivamente a cualquier fragmento de producto de corte de SNAP-25 que comprende la secuencia P5-P4-P3-P2-P1, pero no a cualquier fragmento de producto de corte de SNAP-25 que comprende la secuencia P1’-P2’-P3’-P4’-P5’ o a cualquier SNAP-25 que tiene un enlace escindible P1-P1’ intacto de un sitio de corte de NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo a-SNAP-25197” se refiere a un anticuerpo que se une selectivamente a una SNAP-25 que tiene un residuo P1 en el extremo carboxilo-terminal que corresponde a glutamina 197 de SEQ ID NO: 5. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo a-SNAP-25204” se refiere a un anticuerpo que se une selectivamente a una SNAP-25 que tiene un residuo P1 en el extremo carboxilo-terminal que corresponde a lisina 204 de SEQ ID NO: 16.
Tal como se usa en el presente documento, el término “selectivamente” se refiere a que tiene una influencia o un efecto único o que reacciona sólo de una manera y sólo con una cosa. Tal como se usa en el presente documento, el término “se une selectivamente a”, cuando se hace en referencia a un anticuerpo, se refiere a la unión discriminatoria del anticuerpo al epítopo diana indicado de tal manera que el anticuerpo no produce sustancialmente reacción cruzada con epítopos que no son diana. El tamaño mínimo de un epítopo peptídico, tal como se define en el presente documento, es de aproximadamente cinco aminoácidos, y un epítopo peptídico comprende normalmente al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, o al menos 20 aminoácidos. Un epítopo peptídico puede ser discontinuo, es decir, comprende residuos de aminoácido que no son adyacentes en la estructura primaria del péptido pero que se ponen juntos en un epítopo por medio de la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del péptido. Además, también se indica que un epítopo podría comprender una parte de una molécula distinta de una secuencia de aminoácidos, tal como, por ejemplo, un resto de hidrato de carbono, un resto de lípido como lipoproteínas o glicolípidos, o un resto de aminoácido modificado químicamente como un aminoácido fosforilado. En aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede unirse selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A que comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, o al menos 20 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede unirse selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A que comprende como máximo 5, como máximo 6, como máximo 7, como máximo 8, como máximo 9, como máximo 10, como máximo 15, o como máximo 20 aminoácidos.
Unión selectiva incluye propiedades de unión tales como, por ejemplo, afinidad de unión, especificidad de unión y avidez de unión. Véanse David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, págs. 240 (1998). Afinidad de unión se refiere a la duración de tiempo que el anticuerpo reside en su sitio de unión a epítopo, y puede considerarse como la fuerza con la que un anticuerpo se une a su epítopo. Afinidad de unión puede describirse como la constante de disociación de equilibrio (KD) de un anticuerpo, que se define como la razón Kd/Ka en el equilibrio, en la que Ka es la constante de velocidad de asociación del anticuerpo y kd es la constante de velocidad de disociación del anticuerpo. La afinidad de unión se determina mediante tanto la asociación como la disociación y solas ni una alta asociación ni una baja disociación pueden garantizar una alta afinidad. La constante de velocidad de asociación (Ka), o constante de asociación (Kon), mide el número de acontecimientos de unión por unidad de tiempo, o la propensión del anticuerpo y el antígeno a asociarse de manera reversible en su complejo antígenoanticuerpo. La constante de velocidad de asociación se expresa en M-1 s-1, y se simboliza de la siguiente manera:
[Ab] x [Ag] x Kon. Cuanto mayor es la constante de velocidad de asociación, más rápidamente se une el anticuerpo a su antígeno, o mayor es la afinidad de unión entre anticuerpo y antígeno. La constante de velocidad de disociación (Kd), o constante de disociación (Koff), mide el número de acontecimientos de disociación por unidad de tiempo, propensión de un complejo antígeno-anticuerpo a separarse (disociarse) de manera reversible en sus moléculas componentes, concretamente el anticuerpo y el antígeno. La constante de velocidad de disociación se expresa en s-1, y se simboliza de la siguiente manera: [Ab Ag] x Koff. Cuanto menor es la constante de velocidad de disociación, de manera más apretada está unido el anticuerpo a su antígeno, o mayor es la afinidad de unión entre anticuerpo y antígeno. La constante de disociación de equilibrio (KD) mide la velocidad a la que se forman los nuevos complejos antígeno-anticuerpo es igual a la velocidad a la que se disocian los complejos antígeno-anticuerpo en el equilibrio. La constante de disociación de equilibrio se expresa en M, y se define como Koff/Kon=[Ab] x [Ag]/[Ab Ag], en la que [Ab] es la concentración molar del anticuerpo, [Ag] es la concentración molar del antígeno, y [Ab Ag] es la concentración molar del complejo antígeno-anticuerpo, cuando tales concentraciones son de tales componentes cuando el sistema está en el equilibrio. Cuanto menor es la constante de disociación de equilibrio, de manera más apretada está unido el anticuerpo a su antígeno, o mayor es la afinidad de unión entre anticuerpo y antígeno.
Por tanto, en una realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, menos de 1 x 105 M’1 s-1, menos de 1 x 106 M’1 s-1, menos de 1 x 107 M’1 s-1, o menos de 1 x 108 M’1 s-1. En otra realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxiloterminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, más de 1 x 105 M’1 s-1, más de 1 x 106 M’1 s-1, más de 1 x 107 M’1 s-1, o más de 1 x 108 M’1 s-1. En otros aspectos, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de asociación entre 1 x 105 M’1 s’1 y 1 x 108 M’1 s-1, de 1 x 106 M-1 s-1 a 1 x 108 M-1 s-1, de 1 x 105 M’1 s’1 a 1 x 107 M’1 s-1, o de 1 x 106 M’1 s’1 a 1 x 107 M’1 s-1.
En otra realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de disociación de menos de 1 x 10’3 s-1, menos de 1 x 10’4 s-1, o menos de 1 x 10’5 s-1. En otros aspectos de esta realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de disociación de, por ejemplo, menos de 1,0 x 10’4 s-1, menos de 2,0 x 10’4 s-1, menos de 3,0 x 10’4 s-1, menos de 4,0 x 10’4 s-1, menos de 5,0 x 10’4 s-1, menos de 6,0 x 10’4 s-1, menos de 7,0 x 10’4 s-1, menos de 8,0 x 10’4 s-1, o menos de 9,0 x 10’4 s-1. En otra realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de disociación de, por ejemplo, más de 1 x 10’3 s-1, más de 1 x 10’4 s-1, o más de 1 x 10’5 s-1. En otros aspectos de esta realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de disociación de, por ejemplo, más de 1,0 x 10’4 s-1, más de 2,0 x 10’4 s-1, más de 3,0 x 10’4 s-1, más de 4,0 x 10’4 s-1, más de 5,0 x 10’4 s-1, más de 6,0 x 10’4 s-1, más de 7,0 x 10’4 s-1, más de 8,0 x 10’4 s-1, o más de 9,0 x 10’4 s-1.
En otra realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de disociación de equilibrio de menos de 0,500 nM. En aspectos de esta realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de disociación de equilibrio de, por ejemplo, menos de 0,500 nM, menos de 0,450 nM, menos de 0,400 nM, menos de 0,350 nM, menos de 0,300 nM, menos de 0,250 nM, menos de 0,200 nM, menos de 0,150 nM, menos de 0,100 nM, o menos de 0,050 nM. En otra realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de disociación de equilibrio de más de 0,500 nM. En aspectos de esta realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de disociación de equilibrio de, por ejemplo, más de 0,500 nM, más de 0,450 nM, más de 0,400 nM, más de 0,350 nM, más de 0,300 nM, más de 0,250 nM, más de 0,200 nM, más de 0,150 nM, más de 0,100 nM, o más de 0,050 nM.
La afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de asociación para la SNAP-25 intacta de, por ejemplo, menos de, menos de 1 x 101 M'1 s-1. En otra realización, la afinidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede tener una constante de velocidad de asociación para la SNAP-25 intacta de, por ejemplo, como máximo 1 x 100 M_1 s-1, como máximo 1 x 101 M_1 s-1, como máximo 1 x 102 M_1 s-1, como máximo 1 x 103 M_1 s-1, o como máximo 1 x 104 M-1 s-1.
Especificidad de unión es la capacidad de un anticuerpo para discriminar entre una molécula que contiene su epítopo y una molécula que no contiene ese epítopo. Una manera de medir la especificidad de unión es comparar la velocidad de asociación Kon del anticuerpo para una molécula que contiene su epítopo con relación a la velocidad de asociación Kon del anticuerpo para una molécula que no contiene ese epítopo. Por ejemplo, comparar la constante de velocidad de asociación (Ka) de un anticuerpo a-SNAP-25 para un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo, tal como, por ejemplo, un epítopo de SNAP-25 que carece de un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A o un epítopo de SNAP-25 que tiene un enlace escindible P1-P1' intacto de un sitio de corte de NTBo/A. En aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una constante de velocidad de asociación (Ka) para una SNAP-25 que no comprende su(s) epítopo(s) de, por ejemplo, menos de 1 x 100 M_1 s-1, menos de 1 x 101 M_1 s-1, menos de 1 x 102 M_1 s-1, menos de 1 x 103 M_1 s_1 o menos de 1 x 104 M_1 s-1. En otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una constante de velocidad de asociación (Ka) para una SNAP-25 que no comprende su(s) epítopo(s) de, por ejemplo, como máximo 1 x 100 M_1 s-1, como máximo 1 x 101 M_1 s-1, como máximo 1 x 102 M_1 s-1, como máximo 1 x 103 M_1 s_1 o como máximo 1 x 104 M_1 s_1
Aún en aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una constante de velocidad de asociación (Ka) para su epítopo con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo de, por ejemplo, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más, al menos 6 veces más, al menos 7 veces más, al menos 8 veces más, o al menos 9 veces más. En aspectos adicionales de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una constante de velocidad de asociación (Ka) para su epítopo con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo de, por ejemplo, al menos 10 veces más, al menos 100 veces más, al menos 1.000 veces más o al menos 10.000 veces más. Aún en otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una constante de velocidad de asociación (Ka) para su epítopo con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo de, por ejemplo, como máximo 1 vez más, como máximo 2 veces más, como máximo 3 veces más, como máximo 4 veces más, como máximo 5 veces más, como máximo 6 veces más, como máximo 7 veces más, como máximo 8 veces más, o como máximo 9 veces más. Aún en otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una constante de velocidad de asociación (Ka) para su epítopo con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo de, por ejemplo, como máximo 10 veces más, como máximo 100 veces más, como máximo 1.000 veces más o como máximo 10.000 veces más.
La especificidad de unión de un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A también puede caracterizarse como una razón que tal anticuerpo a-SNAP-25 puede discriminar su epítopo de SNAP-25 con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo, tal como, por ejemplo, un epítopo de SNAP-25 que carece de un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A o un epítopo de SNAP-25 que tiene un enlace escindible P1-P1' intacto de un sitio de corte de NTBo/A. En aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una razón de especificidad de unión para su epítopo de SNAP-25 con relación a una SNAP-25 que no comprende ese epítopo de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 64:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1, o al menos 40:1. Aún en otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una razón de especificidad de unión para su epítopo de SNAP-25 con relación a una SNAP-25 que carece de un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1, o al menos 40:1. Todavía en otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A tiene una razón de especificidad de unión para su epítopo de SNAP-25 con relación a una SNAP-25 que tiene una captación de enlace escindible P1-P1' de un sitio de corte de NTBo/A de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 64:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1, o al menos 40:1.
Avidez de unión, también conocida como avidez funcional, se refiere a la suma total de la fuerza de unión funcional entre un anticuerpo multivalente y su antígeno. Las moléculas de anticuerpo pueden tener más de un sitio de unión (por ejemplo, 2 para IgG, 10 para IgM), y muchos antígenos contienen más de un sitio antigénico. Aunque la avidez de unión de un anticuerpo depende de las afinidades de unión de los sitios de unión del anticuerpo individual, la avidez de unión es mayor que la afinidad de unión ya que deben romperse todas las interacciones entre antígenoanticuerpo simultáneamente para que el anticuerpo se disocie por completo. Se prevé que un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A pueda unirse selectivamente a todos y cada uno de los epítopos para ese anticuerpo.
Por tanto, en una realización, un anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. En aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal o un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene una lisina en el extremo carboxilo-terminal. En otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un residuo P1 en el extremo carboxilo-terminal que corresponde a glutamina 197 de SEQ ID NO: 5 o un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un residuo P1 en el extremo carboxilo-terminal que corresponde a lisina 204 de SEQ ID NO: 16. Todavía en otros aspectos de esta realización, un anticuerpo a-SNAP-25 es un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene una secuencia de aminoácidos en el extremo carboxiloterminal de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A. Los métodos de base inmunológica dados a conocer en la presente memoria descriptiva pueden evaluarse mediante varios parámetros incluyendo, por ejemplo, exactitud, precisión, límite de detección (LOD), límites de cuantificación (LOQ), intervalo, especificidad, selectividad, linealidad, robustez e idoneidad del sistema. La exactitud de un método es la medida de la potencia de un método analítico, o el grado de coincidencia entre el valor medido y el valor que se acepta como un valor verdadero convencional o un valor de referencia aceptado. La precisión de un método es el grado de concordancia entre resultados de prueba individuales, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. Como tal, la precisión evalúa 1) la variabilidad dentro del ensayo; 2) la variabilidad dentro de un día (repetibilidad); y 3) la variabilidad entre días (precisión intermedia); y 4) la variabilidad entre laboratorios (reproducibilidad). El coeficiente de variación (%CV) es una medida cuantitativa de la precisión expresada con relación al valor medio teórico u observado.
Un método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva debe poder detectar, con respecto al fondo, la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo a-SNAP-25 que comprende una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. El límite de detección (LOD) de un método se refiere a la concentración de analito que da lugar a una señal que es significativamente diferente del control negativo o blanco y representa la menor concentración de analito que puede distinguirse del fondo.
Por tanto, en una realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva puede detectar el LOD de NTBo/A una cantidad que es significativamente diferente de un control negativo o blanco. En un aspecto de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 10 ng o menos, 9 ng o menos, 8 ng o menos, 7 ng o menos, 6 ng o menos, 5 ng o menos, 4 ng o menos, 3 ng o menos, 2 ng o menos, 1 ng o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 900 pg o menos, 800 pg o menos, 700 pg o menos, 600 pg o menos, 500 pg o menos, 400 pg o menos, 300 pg o menos, 200 pg o menos, 100 pg o menos de una NTBo/A. En aspectos adicionales de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 90 pg o menos, 80 pg o menos, 70 pg o menos, 60 pg o menos, 50 pg o menos, 40 pg o menos, 30 pg o menos, 20 pg o menos, 10 pg o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 9 pg o menos, 8 pg o menos, 7 pg o menos, 6 pg o menos, 5 pg o menos, 4 pg o menos, 3 pg o menos, 2 pg o menos, 1 pg o menos de una NTBo/A. Aún en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 0,9 pg o menos, 0,8 pg o menos, 0,7 pg o menos, 0,6 pg o menos, 0,5 pg o menos, 0,4 pg o menos, 0,3 pg o menos, 0,2 pg o menos, 0,1 pg o menos de una NTBo/A.
En otro aspecto de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 10 nM o menos o menos, 9 nM o menos, 8 nM o menos, 7 nM o menos, 6 nM o menos, 5 nM o menos, 4 nM o menos, 3 nM o menos, 2 nM o menos, o 1 nM o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 900 pM o menos, 800 pM o menos, 700 pM o menos, 600 pM o menos, 500 pM o menos, 400 pM o menos, 300 pM o menos, 200 pM o menos, o 100 pM o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 100 pM o menos, 90 pM o menos, 80 pM o menos, 70 pM o menos, 60 pM o menos, 50 pM o menos, 40 pM o menos, 30 pM o menos, 20 pM o menos, o 10 pM o menos de una NTBo/A. Aún en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 10 pM o menos de una NTBo/A, 9 pM o menos, 8 pM o menos, 7 pM o menos, 6 pM o menos, 5 pM o menos, 4 pM o menos, 3 pM o menos, 2 pM o menos, o 1 pM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 1000 fM o menos, 900 fM o menos, 800 fM o menos, 700 fM o menos, 600 fM o menos, 500 fM o menos, 400 fM o menos, 300 fM o menos, 200 fM o menos, o 100 fM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 100 fM o menos, 90 fM o menos, 80 fM o menos, 70 fM o menos, 60 fM o menos, 50 fM o menos, 40 fM o menos, 30 fM o menos, 20 fM o menos, o 10 fM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOD de, por ejemplo, 10 fM o menos, 9 fM o menos, 8 fM o menos, 7 fM o menos, 6 fM o menos, 5 fM o menos, 4 fM o menos, 3 fM o menos, 2 fM o menos, o 1 fM o menos de a neurotoxina botulínica A.
Los límites de cuantificación (LOQ) son las concentraciones menor y mayor de analito en una muestra o espécimen que puede medirse con un nivel aceptable de exactitud y precisión. El límite de cuantificación inferior se refiere a la menor dosis que puede medir un método de detección sistemáticamente con respecto al fondo. El límite de cuantificación superior es la mayor dosis que puede medir un método de detección sistemáticamente antes de que se produzca la saturación de la señal. El intervalo lineal del método es el área entre los límites de cuantificación inferior y superior. El intervalo lineal se calcula restando el límite de cuantificación inferior del límite de cuantificación superior. Tal como se usa en el presente documento, el término “relación señal-ruido para la asíntota inferior” se refiere a la señal detectada en el método en el límite de detección inferior dividido entre la señal del fondo. Tal como se usa en el presente documento, el término “relación señal-ruido para la asíntota superior” se refiere a la señal detectada en el método en el límite de detección superior dividido entre la señal del fondo.
Por tanto, en una realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva puede detectar el LOQ de NTBo/A a una cantidad que es significativamente diferente de un control negativo o blanco. En un aspecto de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 10 ng o menos, 9 ng o menos, 8 ng o menos, 7 ng o menos, 6 ng o menos, 5 ng o menos, 4 ng o menos, 3 ng o menos, 2 ng o menos, 1 ng o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 900 pg o menos, 800 pg o menos, 700 pg o menos, 600 pg o menos, 500 pg o menos, 400 pg o menos, 300 pg o menos, 200 pg o menos, 100 pg o menos de una NTBo/A. En aspectos adicionales de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 90 pg o menos, 80 pg o menos, 70 pg o menos, 60 pg o menos, 50 pg o menos, 40 pg o menos, 30 pg o menos, 20 pg o menos, 10 pg o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 9 pg o menos, 8 pg o menos, 7 pg o menos, 6 pg o menos, 5 pg o menos, 4 pg o menos, 3 pg o menos, 2 pg o menos, 1 pg o menos de una NTBo/A. Aún en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 0,9 pg o menos, 0,8 pg o menos, 0,7 pg o menos, 0,6 pg o menos, 0,5 pg o menos, 0,4 pg o menos, 0,3 pg o menos, 0,2 pg o menos, 0,1 pg o menos de una NTBo/A.
En otro aspecto de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 10 nM o menos, 9 nM o menos, 8 nM o menos, 7 nM o menos, 6 nM o menos, 5 nM o menos, 4 nM o menos, 3 nM o menos, 2 nM o menos, o 1 nM o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 900 pM o menos, 800 pM o menos, 700 pM o menos, 600 pM o menos, 500 pM o menos, 400 pM o menos, 300 pM o menos, 200 pM o menos, o 100 pM o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 100 pM o menos, 90 pM o menos, 80 pM o menos, 70 pM o menos, 60 pM o menos, 50 pM o menos, 40 pM o menos, 30 pM o menos, 20 pM o menos, o 10 pM o menos de una NTBo/A. Aún en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 10 pM o menos de una NTBo/A, 9 pM o menos, 8 pM o menos, 7 pM o menos, 6 pM o menos, 5 pM o menos, 4 pM o menos, 3 pM o menos, 2 pM o menos, o 1 pM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 1000 fM o menos, 900 fM o menos, 800 fM o menos, 700 fM o menos, 600 fM o menos, 500 fM o menos, 400 fM o menos, 300 fM o menos, 200 fM o menos, o 100 fM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 100 fM o menos, 90 fM o menos, 80 fM o menos, 70 fM o menos, 60 fM o menos, 50 fM o menos, 40 fM o menos, 30 fM o menos, 20 fM o menos, o 10 fM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, el método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene un LOQ de, por ejemplo, 10 fM o menos, 9 fM o menos, 8 fM o menos, 7 fM o menos, 6 fM o menos, 5 fM o menos, 4 fM o menos, 3 fM o menos, 2 fM o menos, o 1 fM o menos de una NTBo/A.
Un ensayo de base inmunológica útil para poner en práctica un aspecto de los métodos dados a conocer debe tener una precisión de no más del 50%. En aspectos de esta realización, un ensayo de base inmunológica tiene una precisión de no más del 50%, no más del 40%, no más del 30%, o no más del 20%. En otros aspectos de esta realización, un ensayo de base inmunológica tiene una precisión de no más del 15%, no más del 10%, o no más del 5%. En otros aspectos de esta realización, un ensayo de base inmunológica tiene una precisión de no más del 4%, no más del 3%, no más del 2%, o no más del 1 %.
Un ensayo de base inmunológica útil para poner en práctica un aspecto de los métodos dados a conocer debe tener una exactitud de al menos el 50%. En aspectos de esta realización, un ensayo de base inmunológica tiene una exactitud de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, o al menos el 80%. En otros aspectos de esta realización, un ensayo de base inmunológica tiene una exactitud de al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95%. En otros aspectos de esta realización, un ensayo de base inmunológica tiene una exactitud de al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%.
Un método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva debe tener una relación señalruido para la asíntota inferior que es estadísticamente significativa y una relación señal-ruido para la asíntota superior que es estadísticamente significativa. En aspectos de esta realización, un método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva tiene una relación señal-ruido para la asíntota inferior de, por ejemplo, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1 o al menos 20:1. En otros aspectos de esta realización, un método de base inmunológica tiene una relación señal-ruido para la asíntota superior de, por ejemplo, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1, al menos 40:1, al menos 45:1, al menos 50:1, al menos 60:1, al menos 70:1, al menos 80:1, al menos 90:1, o al menos 100:1, al menos 150:1, al menos 200:1, al menos 250:1, al menos 300:1, al menos 350:1, al menos 400:1, al menos 450:1, al menos 500:1, al menos 550:1, o al menos 600:1.
La especificidad de un método define la capacidad del método para medir el analito de interés en exclusión de otros componentes relevantes, tales como, por ejemplo, analito parcialmente activo o inactivo. La selectividad de un método describe la capacidad de un método analítico para diferenciar diversas sustancias en una muestra. La linealidad de un método es su capacidad para provocar resultados que son directamente, o mediante una transformación matemática bien definida, proporcionales a la concentración de analito en la muestra. Por tanto en una realización, un método de base inmunológica dado a conocer en la presente memoria descriptiva puede distinguir una NTBo/A totalmente activa de una NTBo/A parcialmente activa que tiene, por ejemplo, el 70% o menos, el 60% o menos, el 50% o menos, el 40% o menos, el 30% o menos, el 20% o menos, o el 10% o menos de la actividad de una NTBo/A totalmente activa.
La reproducibilidad del método es la reproducibilidad de los resultados de prueba obtenidos para muestras idénticas en condiciones de prueba normales (pero variables). La robustez de un procedimiento es una medida de su capacidad para permanecer inafectado por variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros del método y proporciona una indicación de su fiabilidad en el uso normal. Por tanto, mientras que la reproducibilidad evalúa cambios inevitables, la robustez evalúa cambios deliberados. Los parámetros típicos evaluados mediante la reproducibilidad y la robustez incluyen los efectos de congelación/descongelación, tiempos de incubación, temperatura de incubación, longevidad del reactivo, preparación de muestras, almacenamiento de muestras, número de pases celulares, lotes de toxina, variabilidad entre purificaciones y variabilidad entre reacciones de mellado. Los parámetros de robustez para ensayos basados en células incluyen el banco de células (comienzo, parte intermedia y final de la congelación), nivel de pase celular, densidad de siembra de células, densidad de disolución madre celular (cuántos días en cultivo), edad de las células en el matraz (tiempo de espera hasta la siembra), tiempo de incubación, diferentes placas, cantidades en exceso de suero y fuente de reactivos. La idoneidad del sistema del método es la determinación del rendimiento del ensayo, incluyendo el rendimiento de reactivos e instrumentos, a lo largo del tiempo mediante análisis de un patrón de referencia. Se hace hincapié en la idoneidad del sistema en la orientación de la FDA referente al hecho de que el equipo, la electrónica, el rendimiento del ensayo y las muestras que van a analizarse, constituyen un sistema integrado. La idoneidad del sistema puede evaluarse mediante pruebas para establecer un paralelismo, que es cuando al representar gráficamente el log de dosis frente a la respuesta, diluciones en serie de la referencia y diluciones en serie de las muestras deben dar lugar a curvas paralelas.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una célula de una línea celular establecida. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula” se refiere a cualquier célula eucariota susceptible de intoxicación por NTBo/A mediante una NTBo/A o cualquier célula eucariota que puede captar una NTBo/A. El término célula engloba células de una variedad de organismos, tales como, por ejemplo, células murinas, de rata, porcinas, bovinas, equinas, de primates y humanas; de una variedad de tipos de célula tales como, por ejemplo, neuronales y no neuronales; y pueden aislarse de o parte de una población de células heterogéneas, tejido u organismo. Tal como se usa en el presente documento, el término “línea celular establecida” es sinónimo de “línea celular inmortal”, o “línea celular transformada” y se refiere a un cultivo celular de células seleccionadas por propagación indefinida a partir de una población celular derivada de una fuente de órgano, tejido u organismo. Por definición, una línea celular establecida excluye un cultivo celular de células primarias. Tal como se usa en el presente documento, el término “células primarias” son células recogidas directamente de órganos o tejidos frescos y no tienen el potencial de propagarse indefinidamente. Una línea celular establecida puede comprender una población heterogénea de células o una población uniforme de células. Una línea celular establecida derivada de una única célula se denomina una línea celular clonal. Una línea celular establecida puede ser una cuyas células expresan de manera endógena todos los componentes necesarios para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25 y engloba la unión de una NTBo/A a un receptor de NTBo/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de NTBo/A desde una vesícula intracelular en el citoplasma y el corte proteolítico de una SNAP-25. Alternativamente, una línea celular establecida puede ser una a cuyas células se les había introducido a partir de una fuente exógena al menos un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25 y engloba la unión de una NTBo/A a un receptor de NTBo/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de NTBo/A desde una vesícula intracelular en el citoplasma y el corte proteolítico de una SNAP-25. También denominada una línea celular modificada mediante ingeniería genética, las células de una línea celular establecida de este tipo pueden expresar, por ejemplo, un FGFR2 exógeno, un FGFR3 exógeno, una SV2 exógena, una SNAP-25 exógena, o cualquier combinación de los mismos.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una célula de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, los términos “célula(s) susceptible(s) de intoxicación por NTBo/A”, “célula(s) susceptible(s) de intoxicación por NTBo/A mediante una NTBo/A”, o “célula(s) de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A mediante una NTBo/A” se refieren a célula(s) que puede(n) experimentar el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25 y engloba la unión de una NTBo/A a un receptor de NTBo/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de NTBo/A desde una vesícula intracelular en el citoplasma y el corte proteolítico de una SNAP-25. Por definición, célula(s) susceptible(s) de intoxicación por NTBo/A debe(n) expresar, o modificarse mediante ingeniería genética para expresar, al menos un receptor de NTBo/A y al menos un sustrato de SNAP-25. Tal como se usa en el presente documento, los términos “célula(s) que puede(n) captar NTBo/A” o “célula(s) que comprende(n) una línea celular establecida que puede(n) captar NTBo/A” se refieren a células que pueden experimentar el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25 y engloba la unión de una NTBo/A a un receptor de NTBo/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de NTBo/A desde una vesícula intracelular en el citoplasma y el corte proteolítico de una SNAP-25. Por definición, célula(s) que puede(n) captar NTBo/A debe(n) expresar, o modificarse mediante ingeniería genética para expresar, al menos un receptor de NTBo/A y al menos un sustrato de SNAP-25.
Las células de la invención de una línea celular establecida son susceptibles de intoxicación por NTBo/A. Las células de una línea celular establecida son susceptibles de intoxicación por NTBo/A mediante, aproximadamente 500 pM o menos, aproximadamente 400 pM o menos, aproximadamente 300 pM o menos, aproximadamente 200 pM o menos, o aproximadamente 100 pM o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida son susceptibles de intoxicación por NTBo/A mediante, por ejemplo, aproximadamente 90 pM o menos, aproximadamente 80 pM o menos, aproximadamente 70 pM o menos, aproximadamente 60 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 40 pM o menos, aproximadamente 30 pM o menos, aproximadamente 20 pM o menos A, o aproximadamente 10 pM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos, células de una línea celular establecida son susceptibles de intoxicación por NTBo/A mediante, por ejemplo, aproximadamente 9 pM o menos, aproximadamente 8 pM o menos, aproximadamente 7 pM o menos, aproximadamente 6 pM o menos, aproximadamente 5 pM o menos, aproximadamente 4 pM o menos, aproximadamente 3 pM o menos, aproximadamente 2 pM o menos, o aproximadamente 1 pM o menos de una NTBo/A. Aún en otros aspectos, células de una línea celular establecida son susceptibles de intoxicación por NTBo/A mediante, por ejemplo, aproximadamente 0,9 pM o menos, aproximadamente 0,8 pM o menos, aproximadamente 0,7 pM o menos, aproximadamente 0,6 pM o menos, aproximadamente 0,5 pM o menos, aproximadamente 0,4 pM o menos, aproximadamente 0,3 pM o menos, aproximadamente 0,2 pM, o aproximadamente 0,1 pM o menos de una NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” cuando califica un valor de un elemento, número, porcentaje o término establecido se refiere a un intervalo de más o menos el diez por ciento del valor del elemento, porcentaje, parámetro o término establecido.
En otra realización, células que comprenden una línea celular establecida pueden captar una NTBo/A. En aspectos de esta realización, células que comprenden una línea celular establecida pueden captar, por ejemplo, aproximadamente 500 pM o menos, aproximadamente 400 pM o menos, aproximadamente 300 pM o menos, aproximadamente 200 pM o menos, o aproximadamente 100 pM o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, células que comprenden una línea celular establecida presentan la capacidad para captar aproximadamente 90 pM o menos, aproximadamente 80 pM o menos, aproximadamente 70 pM o menos, aproximadamente 60 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 40 pM o menos, aproximadamente 30 pM o menos, aproximadamente 20 pM o menos, o aproximadamente 10 pM o menos de una NTBo/A. Todavía en otros aspectos, células que comprenden una línea celular establecida presentan la capacidad para captar aproximadamente 9 pM o menos, aproximadamente 8 pM o menos, aproximadamente 7 pM o menos, aproximadamente 6 pM o menos, aproximadamente 5 pM o menos, aproximadamente 4 pM o menos, aproximadamente 3 pM o menos, aproximadamente 2 pM o menos, o aproximadamente 1 pM o menos de una NTBo/A. Aún en otros aspectos, células que comprenden una línea celular establecida presentan la capacidad para captar aproximadamente 0,9 pM o menos, aproximadamente 0,8 pM o menos, aproximadamente 0,7 pM o menos, aproximadamente 0,6 pM o menos, aproximadamente 0,5 pM o menos, aproximadamente 0,4 pM o menos, aproximadamente 0,3 pM o menos, aproximadamente 0,2 pM o menos, o aproximadamente 0,1 pM o menos de una NTBo/A.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “NTBo/A” es sinónimo de “neurotoxina botulínica serotipo A” o “neurotoxina botulínica tipo A” y se refiere tanto a una NTBo/A que se produce de manera natural como a una NTBo/A que no se produce de manera natural de la misma, e incluye complejo de NTBo/A que comprende la neurotoxina NTBo/A de aproximadamente 150 kDa y proteínas no asociadas a toxina asociadas (NAP), así como la neurotoxina NTBo/A de aproximadamente 150 kDa sola. Los ejemplos no limitativos de complejos de NTBo/A incluyen, por ejemplo, el complejo de NTBo/A de 900 kDa, el complejo de NTBo/A de 500 kDa, el complejo de NTBo/A de 300 kDa. Los ejemplos no limitativos de la neurotoxina NTBo/A de aproximadamente 150 kDa incluyen, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4.
Tal como se usa en el presente documento, el término “NTBo/A que se produce de manera natural ” se refiere a cualquier NTBo/A producida mediante un proceso que se produce de manera natural, incluyendo, sin limitación, isoformas de NTBo/A producidas a partir de una modificación postraduccional, un transcrito sometido a corte y empalme de manera alternativa o una mutación espontánea, y subtipos de NTBo/A, tales como, por ejemplo, un subtipo NTBo/A1, subtipo NTBo/A2, subtipo NTBo/A3, subtipo NTBo/A4 y subtipo NTBo/A5. Una NTBo/A que se produce de manera natural incluye, sin limitación, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID n O : 4, o una que sustituye, deleciona o añade, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Composiciones farmacéuticas disponibles comercialmente de una NTBo/A que se produce de manera natural incluyen, sin limitación, BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA), DYSPORT®/RELOXIN®, (Ipsen Ltd., Slough, Inglaterra), PURTOX® (Mentor Corp., Santa Barbara, CA), XEOMIN® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania), NEURONOX® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur), BTX-A.
Tal como se usa en el presente documento, el término “NTBo/A que no se produce de manera natural” se refiere a cualquier NTBo/A cuya estructura se modificó con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, sin limitación, una NTBo/A con una secuencia de aminoácidos alterada producida mediante ingeniería genética usando mutagénesis al azar o diseño racional y una NTBo/A producida mediante síntesis química in vitro. Los ejemplos no limitativos de NTBo/A que no se producen de manera natural se describen en, por ejemplo, Steward, L. E. et al., Post-translational Modifications and Clostridial Neurotoxins, patente estadounidense 7.223.577; Dolly, J. O. et al., Activatable Clostridial Toxins, patente estadounidense n.° 7.419.676; Steward, L. E. et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, US 2004/0220386; Steward, L. E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, publicación de patente estadounidense n.° 2008/0096248; Steward, L. E. et al., Modified Clostridial Toxins With Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente estadounidense n.° 2008/0161543; Steward, L. E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells, publicación de patente estadounidense n.° 2008/0241881, cada una de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.
Por tanto en una realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una NTBo/A que se produce de manera natural. En aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una isoforma de NTBo/A o un subtipo de NTBo/A. En aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de la NTBo/A de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una NTBo/A que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de BOTOX®, DYSPORT®/RELOXIN®, PURTOX®, XEOMIN®, NEURONOX®, o BTX-A.
En otra realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una NTBo/A que no se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una variante de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una variante de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Aún en otros aspectos de esta realización, la actividad de NTBo/A que está detectándose procede de una variante de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una SNAP-25. Tal como se usa en el presente documento, el término “SNAP-25” se refiere a una SNAP-25 que se produce de manera natural o una SNAP-25 que no se produce de manera natural que se corta preferentemente mediante una NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “cortado preferentemente” se refiere a que la tasa de corte de sustrato de NTBo/A por una NTBo/A es al menos un orden de magnitud mayor que la tasa de corte de cualquier otro sustrato por NTBo/A. En aspectos de esta realización, la tasa de corte de sustrato de NTBo/A por una NTBo/A es al menos dos órdenes de magnitud mayor, al menos tres órdenes de magnitud mayor, al menos cuatro órdenes de magnitud mayor, o al menos cinco órdenes de magnitud mayor que la de la tasa de corte de cualquier otro sustrato por NTBo/A.
Tal como se usa en el presente documento, el término “SNAP-25 que se produce de manera natural” se refiere a cualquier SNAP-25 producida mediante un proceso que se produce de manera natural, incluyendo, sin limitación, isoformas de SNAP-25 producidas a partir de una modificación postraduccional, un transcrito sometido a corte y empalme de manera alternativa o una mutación espontánea, y subtipos de SNAP-25. Una SNAP-25 que se produce de manera natural incluye, sin limitación, SEQ ID N o : 5, SEQ ID n O : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, o una que sustituye, deleciona o añade, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
Tal como se usa en el presente documento, el término “SNAP-25 que no se produce de manera natural” se refiere a cualquier SNAP-25 cuya estructura se modificó con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, sin limitación, una SNAP-25 producida mediante ingeniería genética usando mutagénesis al azar o diseño racional y una SNAP-25 producida mediante síntesis química in vitro. Los ejemplos no limitativos de SNAP-25 que no se producen de manera natural se describen en, por ejemplo, Steward, L. E. et al., FRET Protease Assays for Clostridial Toxins, patente estadounidense 7.332.567; Fernandez-Salas et al., Lipohilic Dye-based FRET Assays for Clostridial Toxin Activity, publicación de patente estadounidense 2008/0160561, cada una de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Una SNAP-25 que no se produce de manera natural puede sustituir, delecionar o añadir, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
Por tanto en una realización, una SNAP-25 es una SNAP-25 que se produce de manera natural. En aspectos de esta realización, la SNAP-25 es una isoforma de SNAP-25 o un subtipo de SNAP-25. En aspectos de esta realización, la SNAP-25 que se produce de manera natural es la SNAP-25 que se produce de manera natural de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En otros aspectos de esta realización, la SNAP-25 es una SNAP-25 que se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
En otra realización, una SNAP-25 es una SNAP-25 que no se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, la SNAP-25 es una SNAP-25 que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, la SNAP-25 es una SNAP-25 que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. Aún en otros aspectos de esta realización, la SNAP-25 es una SNAP-25 que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
Una SNAP-25 puede ser una SNAP-25 endógena o una SNAP-25 exógena. Tal como se usa en el presente documento, el término “SNAP-25 endógena” se refiere a una SNAP-25 presente de manera natural en la célula porque está codificada de manera natural dentro del genoma de la célula, de tal manera que la célula expresa inherentemente la SNAP-25 sin la necesidad de una fuente externa de SNAP-25 o una fuente externa de material genético que codifica para una SNAP-25. La expresión de una SNAP-25 endógena puede ser con o sin estimulación ambiental tal como, por ejemplo, diferenciación celular. Por definición, una SNAP-25 endógena puede ser sólo una SNAP-25 que se produce de manera natural o variantes de la misma. Por ejemplo, las siguientes líneas celulares establecidas expresan una SNAP-25 endógena: BE(2)-M17, Kelly, LA1-55n, N1E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa y SK-N-BE(2)-C.
Tal como se usa en el presente documento, el término “SNAP-25 exógena” se refiere a una SNAP-25 expresada en una célula a través de la introducción de una fuente externa de SNAP-25 o una fuente externa de material genético que codifica para una SNAP-25 mediante manipulación humana. La expresión de una SNAP-25 exógena puede ser con o sin estimulación ambiental tal como, por ejemplo, diferenciación celular. Como ejemplo no limitativo, células de una línea celular establecida pueden expresar una SNAP-25 exógena mediante transfección transitoria o de manera estable de una SNAP-25. Como otro ejemplo no limitativo, células de una línea celular establecida pueden expresar una SNAP-25 exógena mediante transfección de proteína de una SNAP-25. Una SNAP-25 exógena puede ser una SNAP-25 que se produce de manera natural o variantes de la misma, o una SNAP-25 que no se produce de manera natural o variantes de la misma.
Por tanto en una realización, células de una línea celular establecida expresan una SNAP-25 endógena. En aspectos de esta realización, la SNAP-25 endógena expresada por células de una línea celular establecida es una SNAP-25 que se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, la SNAP-25 endógena expresada por células de una línea celular establecida es SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. Aún en aspectos de esta realización, la SNAP-25 endógena expresada por células de una línea celular establecida es una SNAP-25 que se produce de manera natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de SNAP-25 o un subtipo de SNAP-25. En otros aspectos de esta realización, la SNAP-25 endógena expresada por células de una línea celular establecida es una SNAP-25 que se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
En otra realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 exógena. En un aspecto de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar la SNAP-25 que se produce de manera natural de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que se produce de manera natural, tal como, por ejemplo, una isoterma de SNAP-25 o un subtipo de SNAP-25. Todavía en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
En otro aspecto de la realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que no se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% con SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar una SNAP-25 que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
Pueden usarse ensayos que detectan el corte de un sustrato de NTBo/A tras la exposición a una NTBo/A para evaluar si una célula está expresando una SNAP-25 endógena o exógena. En estos ensayos, la generación de un producto de corte de SNAP-25 se detectaría en células que expresan una SNAP-25 tras tratamiento con NTBo/A. Los ejemplos no limitativos de análisis de inmunotransferencia de tipo Western específico, así como reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL; Promega Corporation, Madison, Wl, y Stratagene, Inc., La JoIIa, CA. Se entiende que estos ensayos y similares para detectar el corte de SNAP-25 pueden ser útiles en la identificación de células que expresan una SNAP-25 endógena o una exógena.
Como los ejemplos no limitativos, puede usarse análisis de inmunotransferencia de tipo Western que usa un anticuerpo que reconoce producto cortado de SNAP-25 por NTBo/A o las formas tanto cortadas como no cortadas de SNAP-25 para someter a ensayo la captación de NTBo/A. Los ejemplos de anticuerpos a-SNAP-25 útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 SMI-81 (Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD), anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 Cl 71.1 (Synaptic Systems, Gotinga, Alemania), anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 Cl 71.2 (Synaptic Systems, Gotinga, Alemania), anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 SP12 (Abcam, Cambridge, MA), antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 (Synaptic Systems, Gotinga, Alemania), antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 (Abcam, Cambridge, MA), y antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 S9684 (Sigma, San Luis, MO).
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, un receptor de NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “receptor de NTBo/A” se refiere o bien a un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural o bien a un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que interacciona preferentemente con NTBo/A de manera que provoca una respuesta de intoxicación por NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “interacciona preferentemente” se refiere a que la constante de disociación de equilibrio (KD) de NTBo/A para un receptor de NTBo/A es al menos un orden de magnitud inferior a la de NTBo/A para cualquier otro receptor en la superficie celular. La constante de disociación de equilibrio, un tipo específico de constante de equilibrio que mide la propensión de un complejo NTBo/A-receptor de NTBo/A separarse (disociarse) de manera reversible en sus moléculas componentes, concretamente la NTBo/A y el receptor de NTBo/A, se define como KD=Ka/Kd en el equilibrio. La constante de asociación (Ka) se define como Ka=[C]/[L][R] y la constante de disociación (Kd) se define como Kd=[L][R]/[C], en la que [L] es igual a la concentración molar de NTBo/A, [R] es la concentración molar de un receptor de NTBo/A y [C] es la concentración molar del complejo de NTBo/a-receptor de NTBo/A, y en la que todas las concentraciones son de tales componentes cuando el sistema está en el equilibrio.
Cuanto menor es la constante de disociación, de manera más apretada está unida la NTBo/A su receptor, o mayor es la afinidad de unión entre la NTBo/A y el receptor de NTBo/A. En aspectos de esta realización, la constante de disociación de NTBo/A para un receptor de NTBo/A es al menos dos órdenes de magnitud inferior, al menos tres órdenes de magnitud inferior, al menos cuatro órdenes de magnitud inferior, o al menos cinco órdenes de magnitud inferior a la de NTBo/A para cualquier otro receptor. En otros aspectos de esta realización, la afinidad de unión de una NTBo/A que interacciona preferentemente con un receptor de NTBo/A puede tener una constante de disociación de equilibrio (KD) de, por ejemplo, de 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM, o menos 100 nM o menos. En otros aspectos de esta realización, la afinidad de unión de una NTBo/A que interacciona preferentemente con un receptor de NTBo/A puede tener una constante de disociación de equilibrio (KD) de, por ejemplo, de 90 nM o menos, 80 nM o menos, 70 nM o menos, 60 nM, 50 nM o menos, 40 nM o menos, 30 nM o menos, 20 nM, o menos 10 nM o menos. Tal como se usa en el presente documento, el término “provoca una respuesta de intoxicación por NTBo/A” se refiere a la capacidad de un receptor de NTBo/A para interaccionar con una NTBo/A para formar un complejo neurotoxina/receptor y la posterior internalización de ese complejo en el citoplasma de la célula.
Tal como se usa en el presente documento, el término “receptor de NTBo/A que se produce de manera natural” se refiere a cualquier receptor de NTBo/A producido mediante un proceso que se produce de manera natural, incluyendo, sin limitación, isoformas de receptor de NTBo/A producidos a partir de una modificación postraduccional, un transcrito sometido a corte y empalme de manera alternativa o una mutación espontánea, y subtipos de receptor de NTBo/A. Un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural incluye, sin limitación, un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGFR2), un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 3 (FGFR3), una glicoproteína de vesícula sináptica 2 (SV2), y un gangliósido complejo como GT1b, tales como los descritos en Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, publicación de patente estadounidense 2008/0003240;
Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, publicación de patente estadounidense 2008/0182799; Min Dong et al., SV2 is the Protein Receptor for Botulinum Neurotoxin A, Science (2006); S.
Mahrhold et al, The Synaptic Vesicle Protein 2C Mediates the Uptake of Botulinum Neurotoxin A into Phrenic Nerves, 580(8) FEBS Lett. 2011-2014 (2006), cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Un FGFR2 que se produce de manera natural incluye, sin limitación, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO:
60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:
67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, o uno que sustituye, deleciona o añade, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70. Un FGFR3 que se produce de manera natural incluye, sin limitación, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, o uno que sustituye, deleciona o añade, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27. Una SV2 que se produce de manera natural incluye, sin limitación, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, o una que sustituye, deleciona o añade, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:
30 y SEQ ID NO: 31.
Tal como se usa en el presente documento, el término “variante de receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural” se refiere a cualquier receptor de NTBo/A producido con la ayuda de manipulación o diseño humano, incluyendo, sin limitación, un receptor de NTBo/A producido mediante ingeniería genética usando mutagénesis al azar o diseño racional y un receptor de NTBo/A producido mediante síntesis química. Los ejemplos no limitativos de variantes de NTBo/A que no se producen de manera natural incluyen, por ejemplo, variantes de receptor de NTBo/A conservativas, variantes de receptor de NTBo/A no conservativas, variantes quiméricas de receptor de NTBo/A y fragmentos de receptor de NTBo/A activos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural” se refiere a cualquier receptor de NTBo/A cuya estructura se modificó con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, sin limitación, un receptor de NTBo/A producido mediante ingeniería genética usando mutagénesis al azar o diseño racional y un receptor de NTBo/A producido mediante síntesis química in vitro. Los ejemplos no limitativos de receptores de NTBo/A que no se producen de manera natural se describen en, por ejemplo, Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, publicación de patente estadounidense 2008/0003240;
Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, publicación de patente estadounidense 2008/0182799 Un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural puede sustituir, delecionar o añadir, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más aminoácidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70.
Por tanto en una realización, un receptor de NTBo/A es un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural tal como, por ejemplo, FGFR2, FGFR3 o SV2. En aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A es una isoterma de receptor de NTBo/A o un subtipo de receptor de NTBo/A. En aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A que se produce de manera natural es el receptor de NTBo/A que se produce de manera natural de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. En otros aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A es un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70.
En otra realización, un receptor de NTBo/A es un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural, tal como, por ejemplo, un FGFR2 modificado mediante ingeniería genética, un FGFR3 modificado mediante ingeniería genética o una SV2 modificada mediante ingeniería genética. En otros aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A es un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% con SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. En otros aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A es un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. Aún en otros aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A es un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70.
Un receptor de NTBo/A puede ser un receptor de NTBo/A endógeno o un receptor de NTBo/A exógeno. Tal como se usa en el presente documento, el término “receptor de NTBo/A endógeno” se refiere a un receptor de NTBo/A presente de manera natural en la célula porque está codificado de manera natural dentro del genoma de la célula, de tal manera que la célula expresa inherentemente el receptor de NTBo/A sin la necesidad de una fuente externa de receptor de NTBo/A o una fuente externa de material genético que codifica para un receptor de NTBo/A. La expresión de un receptor de NTBo/A endógeno puede ser con o sin estimulación ambiental tal como por ejemplo, diferenciación celular o activación de promotores. Por ejemplo, las siguientes líneas celulares establecidas expresan al menos un receptor de NTBo/A endógeno: BE(2)-M17, Kelly, LA1-55n, N1E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa y SK-N-BE(2)-C. Un receptor de NTBo/A endógeno puede ser sólo un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural o variantes que se producen de manera natural del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “receptor de NTBo/A exógeno” se refiere a un receptor de NTBo/A expresado en una célula a través de la introducción de una fuente externa de receptor de NTBo/A o una fuente externa de material genético que codifica para un receptor de NTBo/A mediante manipulación humana. La expresión de un receptor de NTBo/A exógeno puede ser con o sin estimulación ambiental tal como, por ejemplo, diferenciación celular o activación de promotores. Como ejemplo no limitativo, células de una línea celular establecida pueden expresar uno o más receptores de NTBo/A exógenos mediante transfección transitoria o de manera estable de una molécula de polinucleótido que codifica para un receptor de NTBo/A, tal como, por ejemplo, un FGFR2, un FGFR3 o una SV2. Como otro ejemplo no limitativo, células de una línea celular establecida pueden expresar uno o más receptores de NTBo/A exógenos mediante transfección de proteína de los receptores de NTBo/A, tales como, por ejemplo, un FGFR2, un FGFR3 o una SV2. Un receptor de NTBo/A exógeno puede ser un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural o variantes que se producen de manera natural del mismo, o un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural o variantes que no se producen de manera natural del mismo.
Por tanto en una realización, células de una línea celular establecida expresan un receptor de NTBo/A endógeno. En aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A endógeno expresado por células de una línea celular establecida es un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A endógeno expresado por células de una línea celular establecida es SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. Aún en aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A endógeno expresado por células de una línea celular establecida es un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural, tal como, por ejemplo, una isoterma de receptor de NTBo/A o un subtipo de receptor de NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, el receptor de NTBo/A endógeno expresado por células de una línea celular establecida es un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70.
En otra realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A exógeno. En un aspecto de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar el receptor de NTBo/A que se produce de manera natural de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural, tal como, por ejemplo, una isoforma de receptor de NTBo/A o un subtipo de receptor de NTBo/A. Todavía en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70.
En otro aspecto de la realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, una identidad de aminoácidos de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, o al menos el 95% con SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos no contiguos con relación a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un receptor de NTBo/A que no se produce de manera natural que tiene, por ejemplo, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, o 100 o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos contiguos con relación a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 o SEQ ID NO: 70
En otra realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un FGFR2 exógeno, un FGFR3 exógeno, una SV2 exógena, o cualquier combinación de los mismos. En aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un FGFR2 que se produce de manera natural, un FGFR3 que se produce de manera natural, una SV2 que se produce de manera natural, o cualquier combinación de los mismos. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar un FGFR2 que no se produce de manera natural, un FGFR3 que no se produce de manera natural, una SV2 que no se produce de manera natural, o cualquier combinación de los mismos. Todavía en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida se modifican mediante ingeniería genética de manera transitoria o de manera estable para expresar o bien un FGFR2 que se produce de manera natural o bien un FGFR2 que no se produce de manera natural, o bien un FGFR3 que se produce de manera natural o bien un FGFR3 que no se produce de manera natural, o bien una SV2 que se produce de manera natural o bien una SV2 que no se produce de manera natural, o cualquier combinación de los mismos.
Pueden identificarse células que expresan uno o más receptores de NTBo/A endógenos o exógenos mediante métodos de rutina incluyendo ensayos directos e indirectos para determinar la captación de toxina. Pueden usarse ensayos que determinan propiedades de unión a o captación de NTBo/A para evaluar si una célula está expresando un receptor de NTBo/A. Tales ensayos incluyen, sin limitación, ensayos de reticulación usando NTBo/A marcada, tal como, por ejemplo, [125I]-NTBo/A, [125I], véanse, por ejemplo, Noriko Yokosawa et al., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); Noriko Yokosawa et al., Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29(2) Toxicon 261-264 (1991); y Tei-ichi Nishiki et al., Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes, 269(14) J. Biol. Chem. 10498-10503 (1994). Otros ensayos no limitativos incluyen ensayos inmunocitoquímicos que detectan la unión a NTBo/A usando anticuerpos marcados o no marcados, véanse, por ejemplo, Atsushi Nishikawa et al., The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells, 319(2) Biochem. Biophys. Res. Commun. 327-333 (2004) y ensayos de inmunoprecipitación, véanse, por ejemplo, Yukako Fujinaga et al., Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes, 150(Pt 5) Microbiology 1529-1538 (2004), que detectan toxina unida usando anticuerpos marcados o no marcados. Los anticuerpos útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, anticuerpos seleccionados contra NTBo/A, anticuerpos seleccionados contra un receptor de NTBo/A, tal como, por ejemplo, FGFR2, FGFR3 o SV2, y/o anticuerpos seleccionados contra un gangliósido, tal como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b. Si el anticuerpo está marcado, la unión de la molécula puede detectarse mediante diversos medios, incluyendo análisis de inmunotransferencia de tipo Western, observación directa al microscopio de la ubicación celular del anticuerpo, medición de anticuerpo unido a sustrato o célula tras una etapa de lavado, citometría de flujo, electroforesis o electroforesis capilar, empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Si el anticuerpo no está marcado, puede emplearse un anticuerpo secundario marcado para la detección indirecta de la molécula unida, y la detección puede proceder como para un anticuerpo marcado. Se entiende que estos ensayos y similares que determinan propiedades o características de captación de NTBo/A pueden ser útiles en la identificación de células que expresan receptores de NTBo/A endógenos o exógenos.
También pueden usarse ensayos que monitorizan la liberación de una molécula tras la exposición a NTBo/A para evaluar si una célula está expresando uno o más receptores de NTBo/A endógenos o exógenos. En estos ensayos, la inhibición de la liberación de la molécula se produciría en células que expresan un receptor de NTBo/A tras tratamiento con NTBo/A. Los ensayos bien conocidos incluyen métodos que miden la inhibición de la liberación de catecolamina radiomarcada desde neuronas, tal como, por ejemplo, la liberación de [3H]-noradrenalina o [3H]-dopamina, véanse por ejemplo, A Fassio et al., Evidence for calcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F, 90(3) Neuroscience 893-902 (1999); y Sara Stigliani et al., The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin C1 and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool, 85(2) J. Neurochem. 409-421 (2003), o mide la liberación de catecolamina usando un procedimiento fluorométrico, véanse, por ejemplo, Anton de Paiva et al., A role for the interchain disulfide or its participating thiols in the internalization of botulinum neurotoxin A revealed by a toxin derivative that binds to ectoacceptors and inhibits transmitter release intracellularly, 268(28) J. Biol. Chem. 20838-20844 (1993); Gary W. Lawrence et al., Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25-kDa synaptosomal-associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, 236(3) Eur. J. Biochem.
877-886 (1996); y Patrick Foran et al., Botulinum neurotoxin C1 cleaves both syntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation with its blockade of catecholamine release, 35(8) Biochemistry 2630-2636 (1996). Otros ejemplos no limitativos incluyen ensayos que miden la inhibición de la liberación de hormonas desde células endocrinas, tales como, por ejemplo, células de la adenohipófisis o células de ovario. Se entiende que estos ensayos y similares para determinar la liberación de moléculas pueden ser útiles en la identificación de células que expresan receptores de NTBo/A endógenos o exógenos.
También pueden usarse ensayos que detectan el corte de un sustrato de NTBo/A tras la exposición a una NTBo/A para evaluar si una célula está expresando uno o más receptores de NTBo/A endógenos o exógenos. En estos ensayos, la generación de un producto de corte de sustrato de NTBo/A, o la desaparición del sustrato de NTBo/A intacto, se detectaría en células que expresan un receptor de NTBo/A tras tratamiento con NTBo/A. Los ejemplos no limitativos de análisis de inmunotransferencia de tipo Western específico, así como reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL; Promega Corporation, Madison, Wl, y Stratagene, Inc., La JoIIa, CA. Se entiende que estos ensayos y similares para determinar el corte de sustrato de NTBo/A pueden ser útiles en la identificación de células que expresan receptores de NTBo/A endógenos o exógenos.
Como ejemplos no limitativos, puede usarse análisis de inmunotransferencia de tipo Western que usa un anticuerpo que reconoce producto cortado de SNAP-25 por NTBo/A o las formas tanto cortadas como no cortadas de SNAP-25 para someter a ensayo la captación de NTBo/A. Los ejemplos de anticuerpos a-SNAP-25 útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 SMI-81 (Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD), anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 de ratón Cl 71.1 (Synaptic Systems, Gotinga, Alemania), anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 Cl 71.2 (Synaptic Systems, Gotinga, Alemania), anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 SP12 (Abcam, Cambridge, MA), antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 (Synaptic Systems, Gotinga, Alemania), antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 S9684 (Sigma, San Luis, MO), y antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25 (Abcam, Cambridge, MA).
Aspectos de la presente divulgación proporcionan células que se preparan a través de manipulación genética o ingeniería genética recombinante para expresar una SNAP-25 exógena y/o uno o más receptores de NTBo/A exógenos. Células útiles para expresar una SNAP-25 exógena y/o uno o más receptores de NTBo/A exógenos a través de manipulación genética o ingeniería genética recombinante incluyen células neuronales y células no neuronales que pueden expresar o no una SNAP-25 endógena y/o uno o más receptores de NTBo/A endógenos. Se entiende además que tales células manipuladas genéticamente o modificadas mediante ingeniería genética de manera recombinante pueden expresar una SNAP-25 exógena y uno o más receptores de NTBo/A exógenos bajo el control de un elemento potenciador, elemento promotor constitutivo, específico de tejido, específico de célula o inducible o ambos. Se entiende que cualquier célula es útil siempre que la célula pueda manipularse genéticamente o modificarse mediante ingeniería genética de manera recombinante para expresar una SNAP-25 exógena y/o uno o más receptores de NTBo/A exógenos y pueda experimentar intoxicación por NTBo/A.
Métodos útiles para introducir en una célula una molécula de polinucleótido exógena que codifica para un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25, tal como, por ejemplo, una SNAP-25, un FGFR2, un FGFR3 o una SV2, incluyen, sin limitación, métodos de suministro mediados químicamente, tales como, por ejemplo, métodos de suministro mediados por fosfato de calcio, mediados por dietil-aminoetil (DEAE)-dextrano, mediados por lípidos, mediados por polietileneimina (PEI), mediados por polilisina y mediados por Polybrene; métodos de suministro mediados físicamente, tales como, por ejemplo, suministro de partículas biolísticas, microinyección, fusión de protoplastos y electroporación; y métodos de suministro mediados de manera viral, tales como, por ejemplo, transfección mediada de manera retroviral, véanse por ejemplo, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, págs. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a ed. 2001); Alessia Colosimo et al., Transfer and Expression of Foreign Genes in Mammalian Cells, 29(2) Biotechniques 314­ 318, 320-322, 324 (2000); Philip Washbourne & A. Kimberley McAllister, Techniques for Gene Transfer into Neurons, 12(5) Curr. Opin. Neurobiol. 566-573 (2002); y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, págs.
9.16.4-9.16.11 (2000). Un experto en la técnica entiende que la selección de un método específico para introducir una molécula de polinucleótido en una célula dependerá, en parte, de si la célula contendrá de manera transitoria o de manera estable un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25. Los ejemplos no limitativos de molécula de polinucleótido que codifica para un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25 son los siguientes: molécula de polinucleótido de FGFR2 de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 138; molécula de polinucleótido de FGFR3 de SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 141; molécula de polinucleótido de SV2 de SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 144; y molécula de polinucleótido de SNAP-25 de SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146.
Un experto habitual en la técnica conoce bien métodos de suministro mediados químicamente y se describen en, por ejemplo, Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium Phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); Chun Zhang et al., Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to Brain-Derived Cells, 33(2) Methods 144-150 (2004). Tales métodos de suministro mediados químicamente pueden prepararse mediante procedimientos convencionales y están disponibles comercialmente, véanse, por ejemplo, kit de transfección CellPhect (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); kit de transfección en mamíferos, fosfato de calcio y DEAE-dextrano, (Stratagene, Inc., La JoIIa, CA); reactivo de transfección Lipofectamine™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); kit de transfección ExGen 500 (Fermentas, Inc., Hanover, MD), y kits de transfección SuperFect y Effectene (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Un experto habitual en la técnica conoce bien métodos de suministro mediados físicamente y se describen en, por ejemplo, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-Mediated Gene Transfer in Neurons using the Biolistics Technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and Diolistic Transfection: Using the Gene Gun to Deliver DnA and Lipophilic Dyes into Mammalian Cells, 33(2) Methods 121-125 (2004); M. Golzio et al., In vitro and In vivo Electric Field-Mediated Permeabilization, Gene Transfer, and Expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); y Oliver Gresch et al., New Non-Viral Method for Gene Transfer into Primary Cells, 33(2) Methods 151-163 (2004).
Un experto habitual en la técnica conoce bien métodos de suministro mediados de manera viral y se describen en, por ejemplo, Chooi M. Lai et al., Adenovirus and Adeno-Associated Virus Vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); llya Frolov et al., Alphavirus-Based Expression Vectors: Strategies and Applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Roland Wolkowicz et al., Lentiviral Vectors for the Delivery of DNA into Mammalian Cells, 246 Methods MoI. Biol. 391-411 (2004); A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus Vectors: Novel Mammalian Cell Gene-Delivery Vehicles and Their Applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003); Tiziana Tonini et al., Transient Production of Retroviral- and Lentiviral-Based Vectors for the Transduction of Mammalian Cells, 285 Methods MoI. Biol. 141-148 (2004); Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight Control of Gene Expression in Eukaryotic Cells by Tetracycline-Responsive Promoters, patente estadounidense n.° 5.464.758; Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for Regulating Gene Expression, patente estadounidense n.° 5.814.618; David S. Hogness, Polynucleotides Encoding Insect Steroid Hormone Receptor Polypeptides and Cells Transformed With Same, patente estadounidense n.° 5.514.578; David S. Hogness, Polynucleotide Encoding Insect Ecdysone Receptor, patente estadounidense 6.245.531; Elisabetta Vegeto et al., Progesterone Receptor Having C. Terminal Hormone Binding Domain Truncations, patente estadounidense n.° 5.364.791; Elisabetta Vegeto et al., Mutated Steroid Hormone Receptors, Methods for Their Use and Molecular Switch for Gene Therapy, patente estadounidense n.° 5.874.534. Tales métodos de suministro mediados de manera viral pueden prepararse mediante procedimientos convencionales y están disponibles comercialmente, véanse, por ejemplo, sistema de expresión adenoviral ViraPower™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y manual de instrucciones 25-0543 versión A del sistema de expresión adenoviral ViraPower™, Invitrogen, Inc., (15 de julio de 2002); y sistema de vector adenoviral AdEasy™ (Stratagene, Inc., La JoIIa, CA) y manual de instrucciones 064004f del sistema de vector adenoviral AdEasy™, Stratagene, Inc. Además, tales sistemas de suministro viral pueden prepararse mediante métodos convencionales y están disponibles comercialmente, véanse, por ejemplo, sistemas de expresión génica BDTM Tet-Off y Tet-On (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) y manual de usuario PT3001-1 de los sistemas de expresión génica BDTM Tet-Off y Tet-On, BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo de 2003), sistema GeneSwitch™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y un sistema de expresión regulada por mifepristona para el sistema GeneSwitch™ para células de mamífero, versión D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de noviembre de 2002); sistema de expresión lentiviral ViraPower™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y manual de instrucciones 25-0501 versión E del sistema de expresión lentiviral ViraPower™, Invitrogen, Inc., (8 de diciembre de 2003); y sistema de expresión en mamíferos inducible de manera retroviral Complete Control® (Stratagene, La JoIIa, CA) y manual de instrucciones 064005e del sistema de expresión en mamíferos inducible de manera retroviral Complete Control®.
Por tanto, en una realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria una molécula de polinucleótido que codifica para un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25. En otra realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria una molécula de polinucleótido que codifica para una pluralidad de componentes necesarios para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25. En aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria una molécula de polinucleótido que codifica para FGFR2, FGFR3, SV2 o SNAP-25. En aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria la molécula de polinucleótido que codifica para FGFR2 de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 138. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria la molécula de polinucleótido que codifica para Fg FR3 de SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 141. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria la molécula de polinucleótido que codifica para SV2 de SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 144. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera transitoria la molécula de polinucleótido que codifica para SNAP-25 de SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146.
En otra realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable una molécula de polinucleótido que codifica para un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25. En otra realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable una molécula de polinucleótido que codifica para una pluralidad de componentes necesarios para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25. En aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable una molécula de polinucleótido que codifica para FGFR2, FGFR3, SV2 o SNAP-25. En aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable la molécula de polinucleótido que codifica para FGFR2 de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 138. En otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable la molécula de polinucleótido que codifica para FGFR3 de SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 141. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable la molécula de polinucleótido que codifica para SV2 de SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 o SEQ ID NO: 144. Aún en otros aspectos de esta realización, células de una línea celular establecida susceptible de intoxicación por NTBo/A contienen de manera estable la molécula de polinucleótido que codifica para SNAP-25 de SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146.
Tal como se mencionó anteriormente, un componente exógeno necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25, tal como, por ejemplo, una SNAP-25, un FGFR2, un FGFR3 o una SV2 dado a conocer en la presente memoria descriptiva puede introducirse en una célula. Todos y cada uno de los métodos útiles para introducir un componente exógeno de este tipo con un agente de suministro en una población celular pueden ser útiles con la condición de que este método introduzca de manera transitoria el componente exógeno dado a conocer en la presente memoria descriptiva en al menos el 50% de las células dentro de una población celular dada. Por tanto, aspectos de esta realización pueden incluir una población celular en la que, por ejemplo, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos el 90% de la población celular dada contiene de manera transitoria un componente exógeno necesario para que las células experimenten el mecanismo celular global mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25, tal como, por ejemplo, una SNAP-25, un FGFR2, un FGFR3 o una SV2 dado a conocer en la presente memoria descriptiva. Tal como se usa en el presente documento, el término “agente de suministro” se refiere a cualquier molécula que permite o potencia la internalización de un polipéptido unido de manera covalente, unido de manera no covalente o asociado de cualquier otra manera con la misma en una célula. Por tanto, el término “agente de suministro” engloba, sin limitación, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, moléculas de polinucleótido, liposomas, lípidos, virus, retrovirus y células que, sin limitación, transportan una molécula unida de manera covalente o de manera no covalente a la membrana celular, citoplasma o núcleo de la célula. Además, se entiende que el término “agente de suministro” engloba moléculas que se internalizan mediante cualquier mecanismo, incluyendo agentes de suministro que funcionan mediante endocitosis mediada por receptor y los que son independientes de endocitosis mediada por receptor.
Un agente de suministro también puede ser un agente que permite o potencia la captación celular de un componente unido de manera covalente, como FGFR2, FGFR3, SV2 o SNAP-25, tal como, por ejemplo, mediante conjugación química o mediante proteínas de fusión producidas genéticamente. Métodos que ligan de manera covalente agentes de suministro y métodos de uso de tales agentes se describen en, por ejemplo, Steven F. Dowdy, Protein Transduction System and Methods of Use Thereof, publicación internacional n.° WO 00/34308; Gerard Chassaing & Alain Prochiantz, Peptides which can be Used as Vectors for the Intracellular Addressing of Active Molecules, patente estadounidense n.° 6.080.724; Alan Frankel et al., Fusion Protein Comprising TAT-derived Transport Moiert, patente estadounidense n.° 5.674.980; Alan Frankel et al., TAT-derived Transport Polypeptide Conjugates, patente estadounidense n.° 5.747.641; Alan Frankel et al., TAT-derived Transport Polypeptides and Fusion Proteins, patente estadounidense n.° 5.804.604; Peter F. J. O'Hare et al., Use of Transport Proteins, patente estadounidense n.° 6.734.167; Yao-Zhong Lin & Jack J. Hawiger, Method for Importing Biologically Active Molecules into Cells, patente estadounidense n.° 5.807.746; Yao-Zhong Lin & Jack J. Hawiger, Method for Importing Biologically Active Molecules into Cells, patente estadounidense n.° 6.043.339; Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, patente estadounidense n.° 6.248.558; Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, patente estadounidense n.° 6.432.680; Jack J. Hawiger et al., Method for Importing Biologically Active Molecules into Cells, patente estadounidense n.° 6.495.518; Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, patente estadounidense n.° 6.780.843; Jonathan B. Rothbard & Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, patente estadounidense n.° 6.306.993; Jonathan B. Rothbard & Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, patente estadounidense n.° 6.495.663; y Pamela B. Davis et al., Fusion Proteins for Protein Delivery, patente estadounidense n.° 6.287.817.
Un agente de suministro también puede ser un agente que permite o potencia la captación celular de un componente asociado de manera no covalente, como FGFR2, FGFR3, SV2c o SNAP-25. Métodos que funcionan en ausencia de unión covalente y métodos de uso de tales agentes se describen en, por ejemplo, Gilles Divita et al, Peptide-Mediated Transfection Agents and Methods of Use, patente estadounidense n.° 6.841.535; Philip L Felgner y Olivier Zelphati, Intracellular Protein Delivery Compositions and Methods of Use, publicación de patente estadounidense n.° 2003/0008813; y Michael Karas, Intracellular Delivery of Small Molecules, Proteins and Nucleic Acids, publicación de patente estadounidense 2004/0209797. Tales agentes de suministro de péptidos pueden prepararse y usarse mediante métodos convencionales y están disponibles comercialmente, véanse, por ejemplo el reactivo CHARIOT™ (Active Motif, Carlsbad, CA); el reactivo BIO-PORTER® (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA), el reactivo de suministro de proteínas BIO TREKTM (Stratagene, La JoIIa, CA), y el reactivo de transfección de proteínas PRO-JECT™ (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL).
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, una muestra que comprende una NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra que comprende una NTBo/A” se refiere a cualquier materia biológica que contiene o potencialmente contiene una NTBo/A activa. Puede someterse a ensayo una variedad de muestras según un método dado a conocer en la presente memoria descriptiva incluyendo, sin limitación, NTBo/A purificada, parcialmente purificada o no purificada; toxina recombinante monocatenaria o bicatenaria con una secuencia que se produce de manera natural o que no se produce de manera natural; NTBo/A recombinante con una especificidad de proteasa modificada; NTBo/A recombinante con una especificidad celular alterada; NTBo/A granel; un producto de NTBo/A formulado, incluyendo, por ejemplo, BOTOX®, DYSPORT®/RELOXIN®, XEOMIN®, PURTOX®, NEURONOX®, BTX-A y; células o lisados celulares en bruto, fraccionados o parcialmente purificados de, por ejemplo, fuentes de bacterias, levaduras, insectos o mamíferos; sangre, plasma o suero; alimentos crudos, parcialmente cocinados, cocinados o procesados; bebidas; pienso para animales; muestras de suelo; muestras de agua; sedimentos de estanques; lociones; cosméticos; y formulaciones clínicas. Se entiende que el término muestra engloba muestras de tejido, incluyendo, sin limitación, muestras de tejido de mamíferos, muestras de tejido de ganado tales como muestras de tejido de ovejas, vacas y cerdos; muestras de tejido de primates; y muestras de tejido humano. Tales muestras engloban, sin limitación, muestras intestinales tales como muestras intestinales de lactantes, y muestras de tejido obtenidas de una herida. Como ejemplos no limitativos, un método de detección de cantidades picomolares de actividad de NTBo/A puede ser útil para determinar la presencia o actividad de una NTBo/A en una muestra de alimentos o bebidas; para someter a ensayo una muestra de un ser humano o animal, por ejemplo, expuesta a una NTBo/A o que tiene uno o más síntomas de botulismo; para seguir la actividad durante la producción y purificación de NTBo/A a granel; para someter a ensayo un producto de NTBo/A formulado usado en aplicaciones farmacéuticas o cosméticas; o para someter a ensayo el suero sanguíneo de un sujeto para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
Por tanto, en una realización, una muestra que comprende una NTBo/A es una muestra que comprende cualquier cantidad de una NTBo/A. En aspectos de esta realización, una muestra que comprende una NTBo/A comprende aproximadamente 100 ng o menos, aproximadamente 10 ng o menos, aproximadamente 1 ng o menos, aproximadamente 100 pg o menos, aproximadamente 10 pg o menos, o aproximadamente 1 pg o menos de una NTBo/A. En otros aspectos de esta realización, una muestra que comprende una NTBo/A comprende aproximadamente 1 |iM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 10 pM o menos, aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 fM o menos, aproximadamente 10 fM o menos, o aproximadamente 1 fM o menos de una NTBo/A.
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “componente de SNAP-25 que comprende una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A” se refiere a un componente celular que contiene el producto de corte de SNAP-25. Se prevé que cualquier método adecuado para enriquecer o aislar un componente de SNAP-25 pueda ser útil, incluyendo, sin limitación, protocolos de lisis celular, protocolos de purificación en columna de centrifugación, inmunoprecipitación, purificación de afinidad y cromatografía de proteínas.
El anticuerpo a-SNAP-25 del método de la invención se une a un soporte de fase sólida. Tal como se usa en el presente documento, el término “soporte de fase sólida” es sinónimo de “fase sólida” y se refiere a cualquier matriz que pueda usarse para inmovilizar un anticuerpo a-SNAP-25 dado a conocer en la presente memoria descriptiva. Los ejemplos no limitativos de soportes de fase sólida incluyen, por ejemplo, un tubo; una placa; una columna; pasadores o “tiras reactivas”; una partícula magnética, una perla u otros medios cromatográficos fibrosos o esféricos, tales como, por ejemplo, agarosa, Sepharose, sílice y plástico; y láminas o membranas, tales como, por ejemplo, nitrocelulosa y poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF). El soporte de fase sólida puede construirse usando una amplia variedad de materiales tales como, por ejemplo, vidrio, carbono, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, diazocelulosa o almidón. El soporte de fase sólida seleccionado puede tener una propiedad física que lo hace que sea fácilmente separable de material soluble o no unido y permite generalmente que materiales no unidos, tales como, por ejemplo, reactivos en exceso, subproductos de reacción o disolventes, se separen o se retiren de otro modo (mediante, por ejemplo, lavado, filtración, centrifugación, etc.) del componente de ensayo unido al soporte de fase sólida. Los ejemplos no limitativos de cómo preparar y usar un soporte de fase sólida se describen en, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, citado anteriormente, (2001); y Current Protocols in Molecular Biology, citado anteriormente, (2004).
Aspectos de la presente divulgación comprenden, en parte, detectar la presencia de un complejo antígenoanticuerpo que comprende un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A y un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Se prevé que pueda usarse cualquier sistema de detección para poner en práctica aspectos de este método de base inmunológica dado a conocer, con la condición de que la relación señal-ruido pueda distinguir en un grado estadísticamente significativo la señal del complejo antígeno-anticuerpo con respecto a la señal de fondo. Los ejemplos no limitativos de sistemas de detección de base inmunológica incluyen análisis de inmunotransferencia, como inmunotransferencia de tipo Western y transferencia puntual, análisis de inmunoprecipitación, análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y ELISA de tipo sándwich. La detección de la señal puede lograrse usando autorradiografía con obtención de imágenes o detección y cuantificación de la radiactividad con Phosphorimager (AU), quimioluminiscencia (CL), electroquimioluminiscencia (ECL), bioluminiscencia (BL), fluorescencia, transferencia de energía por resonancia, polarización plana, colorimetría o citometría de flujo (FC).
Descripciones de sistemas de detección de base inmunológica se dan a conocer en, por ejemplo, Michael M. Rauhut, Chemiluminescence, en Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology (Ed. Grayson, 3a ed, John Wiley and Sons, 1985); A. W. Knight, A Review of Recent Trends in Analytical Applications of Electrogenerated Chemiluminescence, Trends Anal. Chem. 18(1): 47-62 (1999); K. A. Fahnrich, et al., Recent Applications of Electrogenerated Chemiluminescence in Chemical Analysis, Talanta 54(4): 531-559 (2001); Commonly Used Techniques in Molecular Cloning, págs. A8.1-A8-55 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a ed. 2001); Detection Systems, págs. A9.1-A9-49 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3a ed. 2001); Electrogenerated Chemiluminescence, (Ed. Allen J. Bard, Marcel Dekker, Inc., 2004).
Un ELISA de tipo sándwich (o inmunoensayo de tipo sándwich) es un método basado en dos anticuerpos, que se unen a diferentes epítopos en el antígeno. Un anticuerpo de captura que tiene una alta especificidad de unión por el antígeno de interés, se une a una superficie sólida. El antígeno se añade entonces seguido por la adición de un segundo anticuerpo denominado el anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección se une al antígeno en un epítopo diferente que el anticuerpo de captura. El antígeno se “intercala” por tanto entre los dos anticuerpos. La afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno es habitualmente el principal determinante de sensibilidad del inmunoensayo. A medida que aumenta la concentración de antígeno, aumenta la cantidad de anticuerpo de detección conduciendo a una mayor respuesta medida. Para cuantificar el grado de unión, pueden usarse diferentes sistemas de indicador, tales como, por ejemplo, una enzima unida al anticuerpo secundario y un sustrato indicador en el que la reacción enzimática forma una lectura como la señal de detección. La señal generada es proporcional a la cantidad de antígeno diana presente en la muestra. El sustrato indicador usado para medir el acontecimiento de unión determina el modo de detección. Se usa un lector de placas espectrofotométrico para la detección colorimétrica. Se han desarrollado sustratos quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes que amplifican adicionalmente la señal y pueden leerse en un lector de luminiscencia. El indicador también puede ser una lectura de fluorescencia en la que se reemplaza la etapa enzimática del ensayo por un fluoróforo y entonces se mide la lectura usando un lector de fluorescencia. Los reactivos y protocolos necesarios para realizar un ELISA de tipo sándwich ECL están disponibles comercialmente, incluyendo, sin excepción, la plataforma de detección de ELISA de tipo sándwich-ECL MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD).
Por tanto, en una realización, detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende un anticuerpo a-SNAP-25 que se une selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A y un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A puede realizarse usando un análisis de inmunotransferencia, un análisis de inmunoprecipitación, un ELISA o un ELISA de tipo sándwich. En aspectos de esta realización, la detección se realiza usando un análisis de inmunotransferencia AU, CL, ECL o BL, un análisis de inmunoprecipitación AU, CL, ECL, BL o FC, un ELISA AU, CL, ECL, BL o FC o un ELISA de tipo sándwich AU, CL, ECL, BL o FC.
Aspectos de la presente divulgación pueden ponerse en práctica en un modo monoplex o múltiplex. Un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A puesto en práctica en un modo monoplex es uno que sólo detecta la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende un anticuerpo a-SNAP-25 y un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A puesto en práctica en un modo múltiplex es uno que detecta de manera concurrente la presencia de dos o más complejos antígeno-anticuerpo; uno de los cuales es el complejo antígeno-anticuerpo que comprende un anticuerpo a-SNAP-25 y un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; y el/los otro(s) de los cuales es/son un complejo antígeno-anticuerpo para una proteína segunda, tercera, cuarta, etc. diferente. Puede usarse una segunda proteína, por ejemplo, como control interno para minimizar la variabilidad de una muestra a otra mediante la normalización de la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo a-SNAP-25/SNAP-25 detectado con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado para la segunda proteína. Como tal, la segunda proteína es habitualmente una que se expresa sistemáticamente por la célula, tal como una proteína de mantenimiento. Los ejemplos no limitativos de una segunda proteína útil, incluyen, por ejemplo, una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), sintaxina, citocinas. Métodos de realización de un ensayo de base inmunológica en un modo múltiplex se describen en, por ejemplo, U. B. Nielsen y B. H. Geierstanger, Multiplexed Sandwich Assays in Microarray Format, J. Immunol. Methods. 290(1-2): 107-1202004); R. Barry y M, Soloviev, Quantitative Protein Profiling using Antibody Arrays, Proteomics, 4(12): 3717-3726 (2004); M. M. Ling et al., Multiplexing Molecular Diagnostics and Immunoassays using Emerging Microarray Technologies, Expert Rev MoI Diagn. 7(1): 87-98 (2007); S. X. Leng et al., ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research, J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63(8): 879-884 (2008).
Por tanto, en una realización, un método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A puesto en práctica en un modo monoplex mediante sólo la detección de la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende un anticuerpo a-SNAP-25 y un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. En otra realización, el método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A puesto en práctica en un modo múltiplex mediante la detección concurrente de la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende un anticuerpo a-SNAP-25 y un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo Pi del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A y al menos otro complejo antígeno-anticuerpo para una proteína distinta de SNAP-25, tal como, por ejemplo, GAPDH o sintaxina.
Aspectos de la presente divulgación proporcionan, en parte, un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunorresistencia a NTBo/A” significa un mamífero que no responde totalmente a una terapia con NTBo/A, o muestra un efecto beneficioso reducido de una terapia con NTBo/A porque la respuesta inmunitaria de ese mamífero, o bien directa o bien indirectamente, reduce la eficacia de la terapia. Un ejemplo no limitativo de eficacia reducida sería la presencia en un mamífero de al menos un anticuerpo neutralizante a-NTBo/A que se une a una toxina NTBo/A de manera que reduce o previene la especificidad o actividad de la toxina. Tal como se usa en el presente documento, el término “terapia con NTBo/A” significa un tratamiento, remedio, cura, cicatrización, rehabilitación o cualquier otro medio de contrarrestar algo no deseado en un mamífero que requiere neuromodulación usando una toxina NTBo/A o administrar a un mamífero una o más dosis controladas de una medicación, preparación o mezcla de una toxina NTBo/A que tiene efecto farmacéutico, terapéutico, curativo, cosmético, como remedio o cualquier otro efecto beneficioso. La terapia con NTBo/A engloba, sin limitación, el uso de cualquier fragmento que se produce de manera natural o modificado de la misma, en cualquier formulación, combinado con cualquier transportador o principio activo y administrado por cualquier vía de administración. Una terapia con NTBo/A modo de ejemplo, muy conocida es una terapia con BOTOX®.
Aspectos de la presente divulgación proporcionan, en parte, una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra de prueba” se refiere a cualquier materia biológica que contiene o potencialmente contiene al menos un anticuerpo a-NTBo/A. Un anticuerpo a-NTBo/A puede ser un anticuerpo anti-NTBo/A neutralizante o un anticuerpo anti-NTBo/A no neutralizante. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpos anti-NTBo/A neutralizantes” significa cualquier anticuerpo a-NTBo/A que se unirá, en condiciones fisiológicas, a una región de una toxina NTBo/A de tal manera que reduzca o prevenga que la toxina ejerza su efecto en una terapia con NTBo/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpos a-NTBo/A no neutralizantes” significa cualquier anticuerpo a-NTBo/A que se unirá, en condiciones fisiológicas, a una región de una toxina NTBo/A, pero que no prevendrá que la toxina ejerza su efecto en una terapia con NTBo/A. Se prevé que todas y cada una de las muestras que pueden contener anticuerpos a-NTBo/A puedan usarse en este método, incluyendo, sin limitación, sangre, plasma, suero y linfa. Además, todos y cada uno de los organismos que pueden producir anticuerpos a-NTBo/A contra una toxina NTBo/A pueden servir como fuente para una muestra incluyendo, pero sin limitarse a, aves y mamíferos, incluyendo ratones, ratas, cabras, ovejas, caballos, burros, vacas, primates y seres humanos. Los ejemplos no limitativos de protocolos específicos para la recogida de sangre y la preparación de suero se describen en, por ejemplo, Marjorie Schaub Di Lorenzo & Susan King Strasinger, BLOOD COLLECTION IN HEALTHCARE (F.A. Davis Company, 2001); y Diana Garza & Kathleen Becan-McBride, PHLEBOTOMY HANDBOOK: BLOOD COLLECTION ESSENTIALS (Prentice Hall, 6a ed., 2002). Estos protocolos son procedimientos de rutina muy dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas en el presente documento. Una muestra de prueba puede obtenerse de un organismo antes de la exposición a una toxina NTBo/A, tras un único tratamiento con NTBo/A, tras múltiples tratamientos con toxina NTBo/A, antes de la aparición de resistencia a una terapia con NTBo/A, o tras la aparición de resistencia a una terapia con NTBo/A.
Aspectos de la presente divulgación proporcionan, en parte, una muestra de control. Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra de control” significa cualquier muestra en que la presencia o ausencia de la muestra de prueba se conoce e incluye muestras de control tanto negativo como positivo. Con respecto a anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A, una muestra de control negativo puede obtenerse de un individuo que nunca se había expuesto a NTBo/A y puede incluir, sin limitación, una muestra del mismo individuo que suministra la muestra de prueba, pero tomada antes de someterse a terapia con NTBo/A; una muestra tomada de un individuo diferente que nunca se ha expuesto a NTBo/A; una muestra reunida tomada de una pluralidad de diferentes individuos que nunca se han expuesto a NTBo/A. Con respecto a anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A, una muestra de control positivo puede obtenerse de un individuo que manifiesta inmunorresistencia a NTBo/A e incluye, sin limitación, un individuo que da positivo en la prueba en un ensayo de pruebas basado en pacientes; un individuo que da positivo en la prueba en un bioensayo in vivo; y un individuo que muestra hiperinmunidad, por ejemplo, un individuo vacunado contra NTBo/A.
Se prevé además que los anticuerpos a-NTBo/A puedan purificarse de una muestra. Pueden purificarse anticuerpos anti-NTBo/A de una muestra, usando una variedad de procedimientos incluyendo, sin limitación, cromatografía de proteínas A/G y cromatografía de afinidad. Los ejemplos no limitativos de protocolos específicos para purificar anticuerpos de una muestra se describen en, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1998); USING ANTIBo DiES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998); y MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, citado anteriormente, (2001).
Además, los ejemplos no limitativos de métodos de purificación de anticuerpos así como reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL; y Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA. Estos protocolos son procedimientos de rutina muy dentro del alcance de un experto en la técnica.
Por tanto, en una realización, una muestra comprende sangre. En un aspecto de esta realización, la muestra comprende sangre de ratón, sangre de rata, sangre de cabra, sangre de oveja, sangre de caballo, sangre de burro, sangre de vaca, sangre de primate o sangre humana. En otra realización, una muestra comprende plasma. En un aspecto de esta realización, una muestra de prueba comprende plasma de ratón, plasma de rata, plasma de cabra, plasma de oveja, plasma de caballo, plasma de burro, plasma de vaca, plasma de primate o plasma humano. En otra realización, una muestra comprende suero. En un aspecto de esta realización, la muestra comprende suero de ratón, suero de rata, suero de cabra, suero de oveja, suero de caballo, suero de burro, suero de vaca, suero de primate y suero humano. En otra realización, una muestra comprende linfa. En un aspecto de esta realización, una muestra comprende linfa de ratón, linfa de rata, linfa de cabra, linfa de oveja, linfa de caballo, linfa de burro, linfa de vaca, linfa de primate o linfa humana. Aún en otra realización, una muestra es una muestra de prueba. Aún en otra realización, una muestra es una muestra de control. En aspectos de esta realización, una muestra de control es una muestra de control negativo o una muestra de control positivo.
Aspectos de la presente divulgación proporcionan, en parte, comparar la cantidad de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A detectada en la etapa (d) con la cantidad de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A detectada en la etapa (e). En una realización, la cantidad de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de prueba es mayor en comparación con la cantidad de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de control. En un aspecto de esta realización, una mayor cantidad de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de prueba en comparación con una muestra de control positivo indica una reducción en o carencia de inmunorresistencia a NTBo/A en el mamífero. En otro aspecto de esta realización, una cantidad equivalente de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de prueba en comparación con una muestra de control negativo indica una reducción en o carencia de inmunorresistencia a NTBo/A en el mamífero. En otra realización, la cantidad de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de prueba es menor en comparación con la cantidad de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de control. En un aspecto de esta realización, una cantidad menor o equivalente de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de prueba en comparación con una muestra de control positivo indica un aumento en o presencia de inmunorresistencia a NTBo/A en el mamífero. En otro aspecto de esta realización, una menor cantidad de producto de corte de SNAP-25 en la muestra de prueba en comparación con una muestra de control negativo indica un aumento en o presencia de inmunorresistencia a NTBo/A en el mamífero.
Se prevé que todas y cada una de las condiciones de ensayo adecuadas para detectar la presencia de un anticuerpo neutralizante a-NTBo/A en una muestra sean útiles en los métodos dados a conocer en la presente memoria descriptiva, tales como, por ejemplo, condiciones de ensayo lineal y condiciones de ensayo no lineal. En una realización, las condiciones de ensayo son lineales. En un aspecto de esta realización, la cantidad de ensayo de una NTBo/A está en exceso. En otro aspecto de esta realización, la cantidad de ensayo de una NTBo/A es limitante de la velocidad. En otro aspecto de esta realización, la cantidad de ensayo de una muestra de prueba es limitante de la velocidad.
También pueden describirse aspectos de la presente divulgación de la siguiente manera:
1. Una composición que comprende un transportador unido a un ligador flexible unido a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
2. La composición del punto 1, en la que el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A es glutamina o lisina.
3. La composición del punto 1, en la que el antígeno de SNAP-25 comprende SEQ ID NO: 147.
4. La composición del punto 1, en la que el ligador flexible y la secuencia de aminoácidos del antígeno de SNAP-25 es SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 46.
5. Un anticuerpo a-SNAP-25 aislado, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25.
6. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una constante de velocidad de asociación para un epítopo que no comprende una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 de menos de 1 x 101 M'1 s-1; y en el que el anticuerpo a-SNAP-25 tiene una constante de disociación de equilibrio para el epítopo de menos de 0,450 nM.
7. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 82; y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90 y SEQ ID NO: 92.
8. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende al menos la CDR1 de Vh de SEQ ID NO: 93, la CDR1 de Vh de SEQ ID NO: 94, la CDR1 de Vh de SEQ ID NO: 95, la CDR1 de Vh de SEQ ID NO: 118, la CDR1 de Vh de SEQ ID NO: 119 o la CDR1 de Vh de SEQ ID NO: 120.
9. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende al menos la CDR2 de VH de SEQ ID NO: 96, la CDR2 de VH de SEQ ID NO: 97, la CDR2 de VH de SEQ ID NO: 98, la CDR2 de Vh de SEQ ID NO: 99, la CDR2 de Vh de SEQ ID NO: 121, la CDR2 de Vh de SEQ ID NO: 122 o la CDR2 de Vh de SEQ ID NO: 123.
10. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende al menos la CDR3 de Vh de SEQ ID NO: 100, la CDR3 de Vh de SEQ ID NO: 101, la CDR3 de Vh de SEQ ID NO: 102 o la CDR3 de Vh de SEQ ID NO: 124.
11. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende al menos la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 103, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 104, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 105, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 106, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 107, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 125, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 126, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 127, la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 128 o la CDR1 de Vl de SEQ ID NO: 129.
12. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende al menos la CDR2 de Vl de SEQ ID NO: 108, la CDR2 de Vl de SEQ ID NO: 109, la CDR2 de Vl de SEQ ID NO: 110, la CDR2 de Vl de SEQ ID NO: 111 o la CDR2 de Vl de SEQ ID NO: 112.
13. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende al menos la CDR3 de Vl de SEQ ID NO: 113, la CDR3 de Vl de SEQ ID NO: 114, la CDR3 de Vl de SEQ ID NO: 115, la CDR3 de Vl de SEQ ID NO: 116 o la CDR3 de Vl de SEQ ID NO: 117.
14. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 93, SEQ iD NO: 121 y SEQ ID NO: 100; y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110 y SeQ ID NO: 115.
15. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado se une selectivamente al epítopo de SNAP-25 de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148.
16. El anticuerpo a-SNAP-25 aislado del punto 5, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 aislado se une selectivamente al epítopo de SNAP-25 de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
17. Un método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de: a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A mediante una NTBo/A; b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de nTBo/a de un producto de corte de SNAP-25; y d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.
18. Un método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de: a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A mediante una NTBo/A; b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.
19. Un método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de: a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A mediante una NTBo/A; b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c) fijar el componente de SNAP-25 a un soporte de fase sólida; d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.
20. Un método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de: a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar NTBo/A; b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.
21. Un método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de: a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar NTBo/A; b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y d) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígeno-anticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.
22. Un método de detección de actividad de NTBo/A, comprendiendo el método las etapas de: a) tratar una célula de una línea celular establecida con una muestra que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar NTBo/A; b) aislar de la célula tratada un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; c) fijar el componente de SNAP-25 a un soporte de fase sólida; d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; y e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; en el que la detección mediante el complejo antígenoanticuerpo es indicativa de actividad de NTBo/A.
23. Un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de: a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A; c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; e) detectar la presencia de un complejo antígenoanticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; f) repetir las etapas b-e con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; y g) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f, en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
24. Un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de: a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A; c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; f) repetir las etapas b-e con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; y g) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f, en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
25. Un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de: a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A; c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; d) fijar el componente de SNAP-25 a un soporte de fase sólida; e) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de nTBo/a de un producto de corte de SNAP-25; f) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; g) repetir las etapas b-f con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; y h) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa g, en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa g es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
26. Un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de: a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar NTBo/A; c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; f) repetir las etapas b-e con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; y g) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f, en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
27. Un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de: a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar NTBo/A; c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; d) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; e) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; f) repetir las etapas b-e con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; y g) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa e con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f, en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígenoanticuerpo detectado en la etapa e con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
28. Un método de determinación de inmunorresistencia a NTBo/A en un mamífero que comprende las etapas de: a) añadir una NTBo/A a una muestra de prueba obtenida de un mamífero que está sometiéndose a prueba para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; b) tratar una célula de una línea celular establecida con la muestra de prueba, en el que la célula de una línea celular establecida puede captar NTBo/A; c) aislar de las células tratadas un componente de SNAP-25 que comprende un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A; d) fijar el componente de SNAP-25 a un soporte de fase sólida; e) poner en contacto el componente de SNAP-25 con un anticuerpo a-SNAP-25, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25; f) detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo a-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25; g) repetir las etapas b-f con una muestra de control negativo en vez de una muestra de prueba, comprendiendo la muestra de control negativo una NTBo/A y un suero que se sabe que no contiene anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A; y h) comparar la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f con la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa g, en el que la detección de una menor cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa f con relación a la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo detectado en la etapa g es indicativa de la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
29. El método de los puntos 17-22 y 23-25, en el que la célula es susceptible de intoxicación por NTBo/A mediante aproximadamente 500 pM o menos, mediante aproximadamente 400 pM o menos, mediante aproximadamente 300 pM o menos, mediante aproximadamente 200 pM o menos, mediante aproximadamente 100 pM o menos de una NTBo/A.
30. El método de los puntos 20-22 y 26-28, en el que la célula puede captar aproximadamente 500 pM o menos, mediante aproximadamente 400 pM o menos, mediante aproximadamente 300 pM o menos, mediante aproximadamente 200 pM o menos, mediante aproximadamente 100 pM o menos de NTBo/A.
31. El método de los puntos 17-22, en el que la muestra comprende aproximadamente 100 ng o menos, aproximadamente 10 ng o menos, aproximadamente 1 ng o menos, 100 fg o menos, 10 fg o menos, o 1 fg o menos de una NTBo/A.
32. El método de los puntos 17-22, en el que la muestra comprende aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 10 pM o menos, aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 fM o menos, aproximadamente 10 fM o menos, o aproximadamente 1 fM o menos de una NTBo/A.
33. El método de los puntos 17-28, en el que el anticuerpo a-SNAP-25 es el anticuerpo a-SNAP-25 aislado de los puntos 5-16.
34. El método de los puntos 17-28, en el que la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo se detecta mediante un análisis de inmunotransferencia, un análisis de inmunoprecipitación, un ELISA o un ELISA de tipo sándwich. 35. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica tiene una relación señal-ruido para la asíntota inferior de al menos 3:1, al menos 5:1, al menos 10:1, al menos 20:1, al menos 50:1, o al menos 100:1. 36. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica tiene una relación señal-ruido para la asíntota superior de al menos 10:1, al menos 20:1, al menos 50:1, al menos 100:1, al menos 200:1, al menos 300:1, al menos 400:1, al menos 500:1, o al menos 600:1.
37. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica puede detectar la actividad de CE50 de, por ejemplo, al menos 100 ng, al menos 50 ng, al menos 10 ng, al menos 5 ng, al menos 100 pg, al menos 50 pg, al menos 10 pg, al menos 5 pg, al menos 100 fg, al menos 50 fg, al menos 10 fg, o al menos 5 fg.
38. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica puede detectar la actividad de CE50 de, por ejemplo, al menos 10 nM, al menos 5 nM, al menos 100 pM, al menos 50 pM, al menos 10 pM, al menos 5 pM, al menos 100 fM, al menos 50 fM, al menos 10 fM, al menos 5 fM, o al menos 1 fM.
39. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica tiene un LOD de, por ejemplo, 10 pg o menos, 9 pg o menos, 8 pg o menos, 7 pg o menos, 6 pg o menos, 5 pg o menos, 4 pg o menos, 3 pg o menos, 2 pg o menos, 1 pg o menos de una NTBo/A.
40. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica tiene un LOD de, por ejemplo, 100 fM o menos, 90 fM o menos, 80 fM o menos, 70 fM o menos, 60 fM o menos, 50 fM o menos, 40 fM o menos, 30 fM o menos, 20 fM o menos, o 10 fM o menos de una NTBo/A.
41. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica tiene un LOQ de, por ejemplo, 10 pg o menos, 9 pg o menos, 8 pg o menos, 7 pg o menos, 6 pg o menos, 5 pg o menos, 4 pg o menos, 3 pg o menos, 2 pg o menos, 1 pg o menos de una NTBo/A.
42. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica tiene un LOQ de, por ejemplo, 100 fM o menos, 90 fM o menos, 80 fM o menos, 70 fM o menos, 60 fM o menos, 50 fM o menos, 40 fM o menos, 30 fM o menos, 20 fM o menos, o 10 fM o menos de una NTBo/A.
43. El método de los puntos 17-28, en el que el método de base inmunológica pueden distinguir una NTBo/A totalmente activa de una NTBo/A parcialmente activa que tiene el 70% o menos, el 60% o menos, el 50% o menos, el 40% o menos, el 30% o menos, el 20% o menos, o el 10% o menos de la actividad de una NTBo/A totalmente activa.
Ejemplos
Ejemplo I
Examen de líneas celulares candidatas
El siguiente ejemplo ilustra cómo identificar líneas celulares establecidas susceptibles de intoxicación por NTBo/A o que tienen capacidad de captación de NTBo/A requerida para un método de detección de actividad de NTBo/A dado a conocer en la presente memoria descriptiva.
1. Crecimiento de cultivo madre para líneas celulares candidatas.
Para hacer crecer las líneas celulares, se sembró en placa una densidad adecuada de células de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en un matraz de cultivo tisular de 162 cm2 que contenía 30 ml de un medio de crecimiento adecuado (véase la tabla 1) y se hizo crecer en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% o al 10% hasta que las células alcanzaron la densidad deseada.
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2. Examen de dosis única de líneas celulares candidatas usando NTBo/A 1 nM.
Un parámetro sometido a prueba para mejorar la sensibilidad de un ensayo basado en células fue identificar líneas celulares adecuadas que mostraban buena capacidad para la captación de una neurotoxina clostridial y para adherirse a una superficie de sustrato. Inicialmente, se sometieron a prueba las líneas celulares para determinar su capacidad para la captación de NTBo/A 1 nM y su capacidad para unirse a una superficie. Para determinar si una línea celular podía captar NTBo/A 1 nM, se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de un medio de crecimiento en suero apropiado (tabla 1). Se hicieron crecer las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzaron la densidad deseada (aproximadamente de 18 a 24 horas). Se aspiraron los medios de crecimiento de cada pocillo y se sustituyeron por o bien 1) medios de crecimiento recién preparados que no contenían toxina (línea celular no tratada) o 2) medios de crecimiento recién preparados que contenían 1 nM de un complejo de NTBo/A (línea celular tratada). Tras una incubación durante la noche, se lavaron las células mediante la aspiración de los medios de crecimiento y el aclarado de cada pocillo con 200 |il de PBS 1 x. Para recoger las células, se aspiró el PBS 1 x, se lisaron las células mediante la adición de 50 |il de tampón de carga de SDS 2 x, se transfirió el lisado a un tubo de ensayo limpio y se calentó la muestra hasta 95°C durante 5 minutos.
Para detectar la presencia tanto del sustrato de SNAP-25 no cortado como de los productos de SNAP-25 cortados, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western. En este análisis, se separó una alícuota de 12 |il de la muestra recogida mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - MOPS usando geles de poliacrilamida prefabricados de Bis-Tris al 12% NuPAGE® Novex (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) en condiciones reductoras, de desnaturalización. Se transfirieron los péptidos separados desde el gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un aparato celular de transferencia electroforética semiseca Trans-Blot® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bloquearon las membranas de PVDF mediante incubación a temperatura ambiente durante 2 horas en una disolución que contenía solución salina tamponada con Tris (TBS) (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol-clorhídrico 25 mM (Tris-HCI) (pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano), albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y leche desnatada en polvo al 5%. Se incubaron las membranas bloqueadas a 4°C durante la noche en TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano), BSA al 2% y leche desnatada en polvo al 5% que contenía o bien 1) una dilución 1:5.000 de un anticuerpo monoclonal de ratón a-SNAP-25 como anticuerpo primario (SMI-81; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD); o 2) una dilución 1:5.000 de antisuero policlonal de conejo a-SNAP-25, S9684, como anticuerpo primario (Sigma, San Luis, MO). Tanto los anticuerpos policlonales de conejo como los monoclonales de ratón a-SNAP-25 pueden detectar tanto el sustrato de SNAP-25 no cortado como el producto cortado de SNAP-25, permitiendo la evaluación de la expresión global de SNAP-25 en cada línea celular y el porcentaje de SNAP-25 cortado tras el tratamiento con NTBo/A como parámetro para evaluar la cantidad de captación de NTBo/A. Se lavaron las inmunotransferencias tratadas con sonda de anticuerpo primario tres veces durante 15 minutos cada vez en TBS, TWEEN-20® (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se incubaron las membranas lavadas a temperatura ambiente durante 2 horas en TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano), BSA al 2% y leche desnatada en polvo al 5% que contenía o bien 1) una dilución 1:10.000 de anticuerpo policlonal de cabra anti-cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina G (IgG, H+L) de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Zymed, South San Francisco, CA) como anticuerpo secundario; o 2) una dilución 1:10.000 de anticuerpo policlonal de cabra anti-cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina G (IgG, H+L) de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Zymed, South San Francisco, CA) como anticuerpo secundario. Se lavaron las inmunotransferencias tratadas con sonda de anticuerpo secundario tres veces durante 15 minutos cada vez en TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se visualizó la detección de señales de los productos de SNAP-25 marcados usando el sistema de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL Plus™ (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se obtuvieron imágenes de la membrana y el porcentaje de producto cortado cuantificado con un software de análisis de generador de imágenes y generador de imágenes en modo variable Typhoon 9410 (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La elección del tamaño de píxeles (de 100 a 200 píxeles) y los ajustes de tensión de PMT (de 350 a 600, normalmente 400) dependieron de la inmunotransferencia individual. La tabla 2 indica las líneas celulares en las que se detectó un producto de corte de SNAP-25 cuando se trataron con NTBo/A 1 nM. Las siguientes líneas celulares mostraron tanto una captación de NTBo/A 1 nM como la unión apropiada a una superficie de sustrato: BE(2)-M17, IMR-32, Kelly, LA1-55n, N1E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa y SK-N-BE(2)-C.
Para determinar si una línea celular podía unirse a una superficie, se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de un medio de crecimiento apropiado (tabla 1). Se hicieron crecer las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzaron la densidad deseada (aproximadamente de 18 a 24 horas). Se evaluó la unión celular mediante el porcentaje de células que se adherían a la superficie del pocillo inferior de la placa tisular con relación al número total de células sembradas. Las líneas celulares CHP-126, IMR-32, LA-N-1, MC-IXC, NG115-401L, SK-N-BE(2)-C, SK-N-F1 y SK-N-MC se consideraron no adecuadas porque cada línea celular mostró una unión de menos del 50% (tabla 2). El resto de las líneas celulares mostraron características de unión celular adecuadas (tabla 2).
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Ejemplo Il
Evaluación de las condiciones de crecimiento sobre la captación de neurotoxina en líneas celulares candidatas El siguiente ejemplo ilustra cómo determinar las condiciones de crecimiento para líneas celulares establecidas que maximizan la condición de ser susceptibles de intoxicación por NTBo/A o tener la capacidad de captación de NTBo/A.
1. Efectos de la diferenciación celular sobre la captación de neurotoxina de líneas celulares candidatas.
Para determinar si la diferenciación celular mejoraba la captación de neurotoxina, se transfirieron líneas celulares que mostraban captación de NTBo/A 1 nM a medio libre de suero para inducir la diferenciación. Se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo con GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina 100 |ig/ml. Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente de 2 a 3 días). Como control, se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de un medio de crecimiento apropiado (tabla 1). Se hicieron crecer estas células control no diferenciadas en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzaron la densidad deseada (aproximadamente de 18 a 24 horas). Se aspiraron los medios de los cultivos control tanto diferenciados como no diferenciados de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada), 0,1 nM, 0,3 nM o bien 1 nM de un complejo de NTBo/A. Tras una incubación durante la noche, se lavaron las células y se recogieron tal como se describe en el ejemplo I.
Para detectar la presencia de productos de SNAP-25 cortados, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo I, excepto porque se separan las muestras recogidas mediante SDS-PAGE usando geles Criterion de 26 pocillos al 12% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se usó el suero de anticuerpo policlonal de conejo a-SNAP-25-ig7 como anticuerpo primario (véase el ejemplo IV). La tabla 3 indica las líneas celulares que mostraron un producto de corte de SnAP-25 cuando se trataron con NTBo/A 0,1 nM. De las líneas celulares sometidas a prueba, sólo las líneas celulares SiMa y Neuro-2a mostraron una captación de NTBo/A 0,1 nM en el estado no diferenciado. Sin embargo, además de SiMa y Neuro-2a, las líneas celulares N18, LA1-55n, PC12 y SH-SY5Y mostraron todas ellas una captación de NTBo/A 0,1 nM en el estado diferenciado.
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2. Efectos del tratamiento con gangliósido sobre la captación de neurotoxina de líneas celulares candidatas diferenciadas.
Para determinar si tratamientos que mejoran la unión de baja afinidad de la neurotoxina podrían mejorar la captación de neurotoxina, se trataron con gangliósido GT1b líneas celulares diferenciadas que mostraban la captación de NTBo/A 1 nM. Se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían medio libre de suero tal como se describió anteriormente, con o sin GT1b 25 |ig/ml (Alexis Biochemicals, San Diego, CA). Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina tal como se describió anteriormente. Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios libres de suero recién preparados que contenían cualquiera de 0 (muestra no tratada), 1,9 pM, 3,7 pM, 7,4 pM, 14,8 pM, 29,7 pM, 59,4 pM, 118,8 pM, 237,5 pM, 574 pM, 950 pM y 1900 pM de un complejo de NTBo/A. Se incubaron las líneas celulares en dos momentos diferentes, a las 24 horas y a las 48 horas. Tras la incubación con toxina, se lavaron las células y se recogieron tal como se describe en el ejemplo I.
Para detectar la presencia de productos de SNAP-25 cortados, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo I, excepto porque se separan las muestras recogidas mediante SDS-PAGE usando geles Criterion de 26 pocillos al 12% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se usó el suero de anticuerpo policlonal de conejo a-SNAP-25-ig7 como anticuerpo primario (véase el ejemplo IV). La tabla 4 indica los efectos del tratamiento con gangliósidos sobre la capacidad de las líneas celulares diferenciadas para captar NTBo/A. Estos resultados indican la menor concentración de NTBo/A que producirá una banda detectable de producto de corte de SNAP-25 en la inmunotransferencia de tipo Western.
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3. Desarrollo de medios libres de suero con propiedades de diferenciación celular que potenciaban la captación de neurotoxina de líneas celulares candidatas.
Para determinar si las mejoras de tratamiento que inducen diferenciación celular podrían mejorar la captación de neurotoxina, se hicieron crecer las líneas celulares SiMa, Neuro-2a y PC12 en diversos medios libres de suero para inducir diferenciación. Se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de diversos medios libres de suero de prueba. Los parámetros sometidos a prueba fueron 1) el efecto de diferentes medios basales sobre la captación de NTBo/A (MEM y RPMI 1649); 2) el efecto de la presencia o ausencia de factores neurotróficos sobre la captación de NTBo/A (suplemento N2 y suplemento B27); 3) el efecto de la presencia o ausencia de factores de diferenciación sobre la captación de NTBo/A (ácido retinoico y factor de crecimiento nervioso); y 4) el efecto de la presencia o ausencia de suero sobre la captación de NTBo/A (medios libres de suero y medios con suero reducido). Como control, se sembró en placa una densidad adecuada de células de un cultivo madre de la línea celular que estaba sometiéndose a prueba en los pocillos de placas de cultivo tisular de 24 pocillos que contenían 1 ml de medios libres de suero control (medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, 100 unidades/ml de penicilina y estreptomicina 100 |ig/ml). Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente de 2 a 3 días). Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios libres de suero recién preparados que contenían cualquiera de 0 (muestra no tratada), 0,005 pM, 0,015 pM, 0,05 pM, 0,14 pM, 0,42 pM, 1,2 pM, 3,7 pM, 11 pM, 33 pM, 100 pM y 300 pM de un complejo de NTBo/A. Además, se trataron las células no diferenciadas con NTBo/A durante 24 h seguido por un cambio de medio e incubación de 48 h en medios recién preparados sin toxina para permitir la acumulación de producto de corte de SNAP-25. Entonces se lavaron las células y se recogieron tal como se describe en el ejemplo I.
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Para detectar la presencia de un producto de corte de SNAP-25, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo I, excepto porque se separan las muestras recogidas mediante SDS-PAGE usando geles Criterion de 26 pocillos al 12% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se usó un suero de anticuerpo policlonal de conejo a-SNAP-25 (véase el ejemplo IV). Los medios más optimizados determinados para cada línea celular se muestran en la tabla 5. La tabla 6 indica la cantidad inferior de un producto de corte de SNAP-25 detectado cuando se hicieron crecer las líneas celulares en este medio libre de suero optimizado. El uso del medio libre de suero optimizado dio como resultado la detección de señales de actividad de NTBo/A con relaciones señal-ruido aceptables en las líneas celulares LA1-55n, Neuro-2a, PC-12 y SiMa (figura 2). Por ejemplo, las condiciones de diferenciación optimizadas dieron como resultado un aumento de 5 veces en la detección del producto de corte de SNAP-25 en comparación con los medios libres de suero control para las células Neuro-2a y PC12, y casi de 50 veces para las células SiMa. Además, se requiere una relación señal-ruido mínima de 3:1 para la asíntota inferior y de 10:1 para la asíntota superior para desarrollar un ensayo robusto susceptible de validación. Con la excepción de LA-1-55n, todas las líneas celulares optimizadas proporcionaron una relación señal-ruido para la asíntota inferior de al menos 3:1 cuando se comparó la señal detectada a partir de la dosis de 1,2 pM con la señal del fondo de NTBo/A 0 pM (figura 2). Además, todas las líneas celulares optimizadas proporcionaron una relación señal-ruido para la asíntota superior de al menos 100:1 cuando se comparó la señal procedente de la dosis de 300 pM con la señal del fondo de NTBo/A 0 pM (figura 2). Estos resultados indican que podría usarse cualquiera de estas líneas celulares para desarrollar un método de base inmunológica para detectar actividad de NTBo/A tal como se da a conocer en la presente memoria descriptiva porque el ensayo estaba detectando la presencia de cantidades pM de NTBo/A.
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Ejemplo III
Desarrollo de anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 que se unen selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal libre en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A
El siguiente ejemplo ilustra cómo obtener anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 que pueden unirse selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
1. Generación de anticuerpos monoclonales a-SNAP-25.
Para desarrollar anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo Pi del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, se diseñó el péptido CDSNKTRIDEANQcooh (SEQ ID NO: 38) de 13 residuos como un antígeno de producto de corte de SNAP-25. Este péptido comprende una región de ligador flexible y un residuo de cisteína N-terminal para la conjugación con KLH y los aminoácidos 186-197 de SNAP-25 humana (SEQ ID NO: 5) con una glutamina C-terminal carboxilada (SEQ ID NO: 38). La generación de anticuerpos monoclonales frente a secuencias peptídicas únicas, bien elegidas, proporciona control con respecto a la especificidad de epítopo, permitiendo la identificación de una subpoblación particular de proteínas entre un conjunto de isoformas estrechamente relacionadas. Las búsquedas en Blast revelaron que este péptido tiene alta homología sólo con SNAP-25 y casi no es posible la reactividad cruzada con otras proteínas en células neuronales. La secuencia también se inspeccionó cuidadosamente mediante la utilización de algoritmos informáticos para determinar el índice de hidropatía, la probabilidad de superficie de proteína, las regiones de flexibilidad y la estructura secundaria favorable, seguido por la orientación y presentación apropiadas de la secuencia peptídica elegida. Se sintetizó el péptido y se conjugó con hemocianina de lapa californiana (KLH) para aumentar la inmunogenicidad. Se inmunizaron seis ratones Balb/c con este péptido y tras tres inmunizaciones en aproximadamente ocho semanas, se extrajo sangre de los ratones para someterla a prueba. Se permitió que la sangre coagulara mediante incubación a 4°C durante 60 minutos. Se centrifugó la sangre coagulada a 10.000 x g a 4°C durante 10 minutos para sedimentar los residuos celulares. Se dispensó la muestra de suero resultante en alícuotas de 50 |il y se almacenaron a -20°C hasta que se necesitaron.
Se usa una estrategia similar basada en otros antígenos de SNAP-25 dados a conocer en la presente memoria descriptiva para desarrollar anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Por ejemplo, el antígeno de SNAP-25 de SEQ ID NO: 45 puede conjugarse con KlH en vez del antígeno de SNAP-25 de s Eq ID NO: 38. Como otro ejemplo, los aminoácidos 186-197 de SNAP-25 humana del antígeno de SNAP-25 de SEQ ID NO: 38 pueden sustituirse por SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
2. Examen para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales a-SNAP-25.
Para determinar la presencia de un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que puede unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, se realizaron ELISA comparativo y ensayo de corte basado en células usando el suero de ratón extraído. Para el ELISA comparativo, se construyeron dos proteínas de fusión: BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 de SEQ ID NO: 48 y BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 de SEQ ID NO: 49. BirA-HisTag®-SNAP-25134134-197 comprendía un péptido de BirA de 16 aminoácidos biotinilados de manera natural de SEQ ID NO: 50 unido en el extremo aminoterminal a un péptido de SNAP-25 que comprendía los aminoácidos 134-197 de SEQ ID NO: 5. BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 comprendía un péptido de Bir de 16 aminoácidos biotinilados de manera natural de SEQ ID NO: 50 unido en el extremo amino-terminal a un péptido de SNAP-25 que comprendía los aminoácidos 134-206 de SEQ ID NO: 5. Se suspendieron estos dos sustratos en PBS 1 x a una concentración de BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 10 |ig/ml y el BirA-HisTag®-SNAP-25134-206. Se recubrieron el BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 y el BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 sobre placas separadas mediante la adición de aproximadamente 100 |il de la disolución de sustrato adecuada y la incubación de las placas a temperatura ambiente durante una hora. Se incubaron las placas lavadas a 37°C durante una hora en BSA al 0,5% en TBS 1 x que contenía una dilución de 1:10 a 1:100 de un suero que contenía anticuerpos derivado de uno de los seis ratones inmunizados (ratón 1, ratón 2, ratón 3, ratón 4, ratón 5 y ratón 6 ). Se lavaron las placas tratadas con sonda de anticuerpo primario cuatro veces durante 5 minutos cada vez en 200 |il de TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se incubaron las placas lavadas a 37°C durante 1 hora en TBS 1 x que contenía una dilución 1:10.000 de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) como anticuerpo secundario. Se lavaron las placas tratadas con sonda de anticuerpo secundario cuatro veces en 200 |il de TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se visualizó la detección cromogénica de los productos de SNAP-25 marcados mediante detección cromogénica usando el kit de sustrato de TMB ImmunoPure (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). El desarrollo de un color amarillo en las placas recubiertas con BirA-HisTag®-SNAP-25134-197, pero no en las placas recubiertas con BirA-HisTag®-SNAP-25134-206, indicó que el anticuerpo a-SNAP-25 reconocía preferentemente el producto de corte de SNAP-25197. Los resultados indicaron que de los seis ratones usados para la inmunización, tres ratones (ratón 2, ratón 3 y ratón 4) tuvieron títulos superiores y más especificidad hacia un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
Estos resultados se confirmaron usando un ensayo de actividad de cadena ligera de ELISA. Se prepararon placas recubiertas con estreptavidina Reacti-Bind de 96 pocillos (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) mediante la adición de aproximadamente 100 |il de la siguiente disolución de sustrato: Se recubrieron las filas A-C con 100 |il de BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 a doce concentraciones diferentes; se recubrieron las filas D-H con 100 |il de BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 a 10 |ig/ml. Se lavaron las placas mediante la aspiración de la disolución de sustrato y el aclarado de cada pocilio tres veces con 200 |il de TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se redujeron previamente las diluciones de NTBo/A a 37°C durante 20 minutos en tampón de incubación de NTBo/A (HEPES 50 mM, pH 7,4, suero bovino fetal al 1%, ZnCh 10 |iM, ditiotreitol 10 mM) y se añadieron 100 |il de la NTBo/A reducida previamente a las placas recubiertas con sustrato y se incubaron a 37°C durante 90 minutos. Se lavaron las placas tratadas con NTBo/A mediante la aspiración del tampón de incubación de NTBo/A y el aclarado de cada placa tres veces con 200 |il de TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se incubaron las placas lavadas a 37°C durante una hora en BSA al 0,5% en TBS 1 x que contenía una dilución de 1:10 a 1:100 del suero que contenía anticuerpos que estaba sometiéndose a prueba. Se lavaron las placas tratadas con sonda de anticuerpo primario cuatro veces durante 5 minutos cada vez en 200 |il de TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se incubaron las placas lavadas a 37°C durante 1 hora en TBS 1 x que contenía una dilución 1:10.000 de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) como anticuerpo secundario. Se lavaron las placas tratadas con sonda de anticuerpo secundario cuatro veces en 200 |il de TBS, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Se visualizó la detección cromogénica de los productos de SNAP-25 marcados mediante detección cromogénica usando el kit de sustrato de TMB ImmunoPure (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Se detectó el desarrollo de un color amarillo, que se correlacionó con la presencia del producto de corte de SNAP-25197 en las muestras tratadas con NTBo/A, pero no en los controles no tratados, usando suero que contenía anticuerpos derivado de los seis ratones inmunizados (ratón 1, ratón 2, ratón 3, ratón 4, ratón 5 y ratón 6). Por tanto, el análisis de ELISA análisis comparativo indicó que de los ratones usados para la inmunización, tres ratones (ratón 2, ratón 3 y ratón 4) tuvieron títulos superiores y más especificidad hacia un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
Para el ensayo de corte basado en células, se sembró en placa una densidad adecuada de células PC12 en placas de cultivo tisular de 60 mm2 que contenían 3 ml de un medio de suero apropiado (tabla 1). Se hicieron crecer las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzaron la densidad apropiada. Se prepararon 500 |il de una disolución de transfección mediante la adición de 250 |il de medio con suero reducido OPTI-MEM que contenía 15 |il de LipofectAmine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos a 250 |il de medio con suero reducido OPTI-MEM que contenía 10 |ig de un constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC (SEQ ID NO: 51). El constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC comprende un vector de expresión pQBI-25 (Qbiogene Inc., Carlsbad, CA) cuyos elementos promotores están funcionalmente unidos a un polinucleótido que codifica para la cadena ligera de GFP-NTBo/A de SEQ ID NO: 52. Se incubó esta mezcla de transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se sustituyeron los medios por medios no suplementados recién preparados y se añadieron los 500 |il de disolución de transfección a las células. Entonces se incubaron las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente de 6 a 18 horas. Se lavaron las células y se recogieron tal como se describe en el ejemplo II. Para detectar la presencia del producto de SNAP-25197 cortado, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo II, excepto porque el anticuerpo primario usado fue una dilución 1:1.000 del suero que contenía anticuerpos y el anticuerpo secundario usado fue una dilución 1:20.000 de anticuerpo de ratón a-IgG conjugado con peroxidasa de rábano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Se detectó una única banda correspondiente al producto de corte de SNAP-25197 en las muestras tratadas con NTBo/A, pero no en los controles no tratados, usando suero que contenía anticuerpos derivado de tres ratones (ratón 2, ratón 3 y ratón 4). Por tanto, el ensayo de corte basado en células indicó que de los ratones usados para la inmunización, tres ratones (ratón 2, ratón 3 y ratón 4) tuvieron títulos superiores y más especificidad hacia un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
3. Producción de hibridomas.
Para obtener hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 que pueden unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, se recogió el bazo del ratón 2 tres días después de una inmunización “de refuerzo” final y se fusionaron las células de bazo con células de mieloma P3-X63 Ag8.653 usando protocolos de hibridoma convencionales. Se sembraron en placa estas células en cinco placas de 96 pocillos y se seleccionaron los híbridos usando medio HAT. En el plazo de 8-14 días tras la fusión, se llevó a cabo el primer examen de los aproximadamente 480 clones originales usando ELISA comparativo con los péptidos BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 y BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 recubiertos en dos placas separadas. El ELISA comparativo proporcionó un método de examen rápido para identificar los hibridomas que producen anticuerpos específicos para la SNAP-25197 cortada. Se sometieron los 18 clones superiores a examen adicional usando el ensayo de corte basado en células descrito anteriormente e inmunotinción de células transfectadas con LC/A (tabla 7).
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Los clones 1D3, 1G10, 2E2, 3C1, 3C3 y 3E8 se clonaron adicionalmente mediante dilución limitante porque los medios condicionados producidos por estos clones comprendían anticuerpos a-SNAP-25 con una especificidad de unión preferente que tenía una razóni97/206 de al menos 4:1 para el producto de corte de SNAP-25i97 con relación al sustrato no cortado de SNAP-25206 y el producto de corte de SNAP-25-197 detectado usando el ensayo de corte basado en células y la inmunotinción de células PC12 transfectadas con GFP-LC/A. De manera similar, los clones 2C9, 2F11, 3G2, 4D1 y 4G6 se clonaron adicionalmente mediante dilución limitante porque los medios condicionados producidos mediante estos clones comprendían anticuerpos a-SNAP-25 con una especificidad de unión preferente que tenía una razón206/197 de al menos 1,5:1 para el sustrato no cortado de SNAP-25206 con relación al producto de corte de SNAP-25-197 y el sustrato no cortado de SNAP-25206 usando el ensayo de corte basado en células. Se examinaron de nuevo estos clones derivados de células individuales usando ELISA comparativo, corte basado en células e inmunotinción para confirmar su afinidad y especificidad, y se obtuvo el isotipo de los anticuerpos usando procedimientos convencionales. Se produjeron líquidos ascíticos a partir de los clones 1D3B8 (IgM.k), 1G10A12 (lgG3.k), 2C9B10 (lgG3.k), 2E2A6 (lgG3.k), 2F11B6 (IgM.k), 3C1A5 (lgG2a.k) y 3C3E2 (lgG2a.k). El clon 3E8 dejó de producir anticuerpos durante el proceso de clonación y no pudo evaluarse adicionalmente.
4. Evaluación de la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales a-SNAP-25.
Para evaluar la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que puede unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, se usaron líquidos ascíticos de los clones 1D3B8, 1G10A12, 2C9B10, 2E2A6, 2F11B6, 3C1A5 y 3C3E2 para detectar el producto de corte de SNAP-25 usando el ensayo de actividad basado en células, inmunocitoquímica e inmunoprecipitación.
Para el ensayo de actividad basado en células, se determinó la especificidad de unión mediante el análisis de la capacidad de los líquidos ascíticos que contenían anticuerpos a-SNAP-25 para detectar el sustrato de SNAP-25206 no cortado y el producto de SNAP-25-197 cortado mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se sembró en placa una densidad adecuada de células PC12 en placas de cultivo tisular de 60 mm2 que contenían 3 ml de un medio de suero apropiado, se hicieron crecer en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se alcanzó una densidad de células apropiada y se transfectaron con o bien una disolución de transfección que carecía del constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC (células no transfectadas) o bien una disolución de transfección que contenía el constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC (células transfectadas) tal como se describió anteriormente. Se lavaron las células y se recogieron tal como se describe en el ejemplo I. Para detectar la presencia tanto del sustrato de SNAP-25206 no cortado como del producto de SNAP-25-197 cortado, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo I, excepto porque el anticuerpo primario usado fue una dilución 1:100 de los líquidos ascíticos que contenían anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 y el anticuerpo secundario usado fue una dilución 1:20.000 del anticuerpo a-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Además, se sometieron a prueba tres anticuerpos monoclonales de ratón a-SNAP-25 disponibles comercialmente. Se usó SMI-81 (Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD), un anticuerpo a-SNAP-25, que el fabricante indica que detecta tanto el sustrato de SNAP-25206 no cortado como el producto de SNAP-25-197 cortado, a una dilución de 15.000 según las recomendaciones del fabricante. Se usó m C-6050 (Research & Diagnostic Antibodies, Las Vegas, NV), un anticuerpo a-SNAP-25, que el fabricante indica que detecta tanto el sustrato de SNAP-25206 no cortado como el producto de SNAP-25-197 cortado, a una dilución 1:100 según las recomendaciones del fabricante. Se usó MC-6053 (Research & Diagnostic Antibodies, Las Vegas, NV), un anticuerpo a-SNAP-25 que el fabricante indica que detecta sólo el producto de SNAP-25-197 cortado, a una dilución 1:100 según las recomendaciones del fabricante.
La tabla 8 indica que los líquidos ascíticos que contenían anticuerpos a-SNAP-25 detectaban sólo el producto de corte de SNAP-25i97. El ensayo de corte basado en células indicó que los líquidos ascíticos producidos a partir de los clones 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2 sintetizan un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que tiene alta especificidad de unión por el producto de corte de SNAP-25197 que permite el reconocimiento selectivo de este producto de corte con relación al sustrato no cortado de SNAP-25206. El anticuerpo SMI-81 comercial detectó el sustrato no cortado de SNAP-25206, pero sólo reconoció escasamente el producto de corte de SNAP-25197 (tabla 8). De manera sorprendente, el anticuerpo MC-6050 comercial sólo detectó el sustrato no cortado de SNAP-25206 y no reconoció el producto de corte de SNAP-25197 (tabla 8). Incluso de manera más sorprendente, el anticuerpo MC-6050 comercial sólo detectó el sustrato no cortado de SNAP-25206 y no reconoció el producto de corte de SNAP-25197, aun cuando el fabricante anuncia que este anticuerpo detecta selectivamente el producto de corte de SNAP-25197 (tabla 8). Por tanto, este análisis indica que aunque 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2 muestran una selectividad adecuada por el producto de corte de SNAP-25197, 1G10A12 y 2F11B6 no lo hacen. Además, los anticuerpos SMI-81, MC-6050 y MC-6053 comerciales son todos ellos inadecuados para los métodos de base inmunológica dados a conocer en la presente solicitud porque ninguno detecta selectivamente el producto de corte de SNAP-25197.
Para el análisis de inmunocitoquímica, se determinó la especificidad de unión mediante el análisis de la capacidad de los líquidos ascíticos que contenían anticuerpos a-SNAP-25 para detectar el sustrato de SNAP-25206 no cortado y el producto de SNAP-25197 cortado mediante inmunotinción. Véanse por ejemplo, Ester Fernandez-Salas et al., Plasma Membrane Localization Signals in the Light Chain of Botulinum Neurotoxin, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A.
101(9): 3208-3213 (2004). Se sembró en placa una densidad adecuada de células PC12, se hicieron crecer y se transfectaron con o bien una disolución de transfección que carecía del constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC (células no transfectadas) o bien una disolución de transfección que contenía el constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC (células transfectadas) tal como se describió anteriormente. Se lavaron las células en PBS 1 x y se fijaron en 5 ml de PAF a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se lavaron las células fijadas en solución salina tamponada con fosfato, se incubaron en 5 ml de Triton® X-100 al 0,5% (éter de octilfenol de polietilenglicol) en PBS 1 x, se lavaron en PBS 1 x y se permeabilizaron en 5 ml de metanol a -20°C durante seis minutos. Se bloquearon las células permeabilizadas en 5 ml de glicina 100 mM a temperatura ambiente durante 30 minutos, se lavaron en PBS 1 x y se bloquearon en 5 ml de BSA al 0,5% en PBS 1 x a temperatura ambiente durante 30 minutos, Se lavaron las células bloqueadas en PBS 1 x y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas en BSA al 0,5% en PBS 1 x que contenía una dilución 1:10 de un líquido ascítico procedente de una línea celular de hibridoma clonal que estaba sometiéndose a prueba. Se lavaron las células tratadas con sonda de anticuerpo primario tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS 1 x. Se incubaron las células lavadas a temperatura ambiente durante 2 horas en PBS 1 x que contenía una dilución 1:200 de anticuerpo policlonal de cabra anti-cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina G (IgG, H+L) de ratón conjugado con ALEXA® FLUOR 568 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) como anticuerpo secundario. Se lavaron las células tratadas con sonda de anticuerpo secundario tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS 1 x. Se prepararon las células lavadas para el examen al microscopio mediante su montaje en medio de montaje VECTASHIELD® (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se colocaron en portaobjetos. Se obtuvieron imágenes de detección de señales con un microscopio confocal Leica usando ajustes de láser apropiados. La tabla 8 indica que los líquidos ascíticos que contenían anticuerpos a-SNAP-25 que detectaban específicamente el producto de corte de SNAP-25197. El análisis de inmunocitoquímica indicó que los líquidos ascíticos producidos a partir de los clones 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2 sintetizan un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que tiene alta especificidad de unión por el producto de corte de SNAP-25197 que permite el reconocimiento preferente de este producto de corte con relación al sustrato no cortado de SNAP-25206.
Para el análisis de inmunoprecipitación, se determinó la especificidad de unión mediante el análisis de la capacidad de la proteína A (columnas HP de proteína A HiTrap™, GE Healthcare, Amersham, Piscataway, NJ), anticuerpos monoclonales purificados a-SNAP-25, para precipitar el sustrato de SNAP-25206 no cortado y el producto de SNAP-25197 cortado. Véase por ejemplo, el capítulo 8 de Storing and Purifying Antibodies, págs. 309-311, Harlow & Lane, citado anteriormente, 1998a. Se sembró en placa una densidad adecuada de células PC12, se hicieron crecer y se transfectaron con o bien una disolución de transfección que contenía un constructo de expresión pQBI-25/GFP (células control; SEQ ID NO: 53) o una disolución de transfección que contenía el constructo de expresión pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC (células experimentales) tal como se describió anteriormente. El constructo de expresión pQBI-25/GFP comprende un vector de expresión cuyos elementos promotores están unidos funcionalmente a un polinucleótido que codifica para GFP de SEQ ID NO: 54. Tras una incubación durante la noche, se lavaron las células mediante la aspiración de los medios de crecimiento y el aclarado de cada pocillo con 200 |il de PBS 1 x. Para recoger las células, se aspiró el PBS, se lisaron las células mediante la adición de un tampón de lisis de inmunoprecipitación que comprendía HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgCh 1,5 mM, EGDT 1 mM, glicerol al 10%, Triton® X-100 (éter de octilfenol de polietilenglicol) al 1% y un cóctel de inhibidor de proteasa COMPLETE™ 1 x (Roche Applied Biosciences, Indianápolis, EN) y la incubación a 4°C durante una hora. Se centrifugaron las células lisadas a 3.000 x g a 4°C durante 10 minutos para eliminar los residuos celulares y se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se diluyó hasta obtener una concentración de proteína de aproximadamente 1 mg/ml. Se añadieron aproximadamente 5 |ig de anticuerpo monoclonal purificado a 0,5 ml de sobrenadante diluido y se incubó a 4°C durante dos horas. Tras la incubación con anticuerpo primario, se añadieron aproximadamente 50 |il de proteína G inmovilizada (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) al sobrenadante diluido y se incubó a 4°C durante una hora. Se lavó el sobrenadante incubado tres veces durante 30 minutos cada vez mediante la adición de 0,5 ml de tampón de lisis de inmunoprecipitación, la centrifugación a 300 x g a 4°C durante un minuto para sedimentar la proteína G inmovilizada y la decantación del sobrenadante. Tras el lavado, se resuspendió el sedimento en 30 |il de tampón de carga SDS 1 x y se calentó la muestra hasta 95°C durante 5 minutos. Para detectar la presencia tanto del sustrato de SNAP-25206 no cortado como del producto de SNAP-25i97 cortado, se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo I, excepto porque el anticuerpo primario usado fue una dilución 1:1.000 del suero con anticuerpo policlonal a-SNAP-25 (véase el ejemplo IV) y el anticuerpo secundario usado fue una dilución 1:20.000 de anticuerpo de conejo a-IgG - peroxidasa de rábano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). La tabla 8 indica los líquidos ascíticos que contienen anticuerpos a-SNAP-25 que extrajeron específicamente el producto de corte de SNAP-25-197 mediante análisis de inmunoprecipitación. El análisis de inmunoprecipitación indicó que los líquidos ascíticos producidos a partir de los clones 2E2A6 y 3C1A5 sintetizan un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que tiene alta especificidad de unión por el producto de corte de SNAP-25-197 que permite el reconocimiento preferente de este producto de corte con relación al sustrato no cortado de SNAP-25206.
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5. Evaluación de la afinidad de unión de anticuerpos monoclonales a-SNAP-25.
Para determinar la afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 que muestra alta especificidad de unión por o bien el producto de corte de SNAP-25-197 o bien el sustrato no cortado de SNAP-25206, se realizaron ensayos de afinidad de unión en un instrumento BIAcore 3000 usando chips sensores de carboximetildextrano (CM5) (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se realizaron series a 25°C con tampón HBS-EP que comprendía HEPES 10 mM (pH 7,4), cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005% (v/v) a una velocidad de flujo de 10 |il/min. Los péptidos de SNAP-25 que comprendían los aminoácidos 134-197 de SEQ ID NO: 5 (SNAP-25134-197) o los aminoácidos 134-206 de SEQ ID NO: 5 (SNAP-25134-206) se unieron de manera covalente a la superficie de los chips sensores de CM5 usando acoplamiento de amina convencional. Brevemente, se activaron los chips de CM5 mediante una inyección de 7 minutos de una mezcla de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida 0,2 M y N-hidroxisuccimida 0,05 M; entonces se inyectaron los péptidos de SNAP-25 en acetato de sodio 10 mM (pH 4,0) durante 20 min a una velocidad de flujo de 10 |il/min; y se bloquearon los ésteres de succinimida sin reaccionar mediante una inyección de 7 min de clorhidrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. Se reflejó la cantidad inmovilizada de SNAP-25134-197 o SNAP-25134-206 sobre el chip mediante un aumento de 100-150 en las unidades de respuesta (aproximadamente 0,10-0,15 ng/mm2). Se hicieron pasar muestras de anticuerpos que comprendían o bien líquidos ascíticos o bien anticuerpos monoclonales purificados producidos a partir de los clones 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2, así como, anticuerpos a-SNAP-25 disponibles comercialmente, sobre la superficie de los chips de CM5 permitiendo un tiempo de asociación de 10 min y un tiempo de disociación de 20 min. Se regeneraron las superficies entre series mediante una inyección de 1 minuto de glicina-HCl 10 mM (pH 2,5) a una velocidad de flujo de 15 |il/min. Se ajustaron las curvas del sensograma a un modelo de unión cinética 1:1 con el software BIAevaluation 3.0.
Los resultados indican que tanto 2E2A6 como 3C1A5 eran altamente específicos para el producto de SNAP-25-197 cortado con respecto al sustrato no cortado de SNAP-25 (tabla 9). Cuando se compararon las afinidades de unión de MC-6050 y MC-6053, 1D3B6 tenía una constante de disociación de equilibrio aproximadamente 10 veces superior para el producto de corte de SNAP-25 con relación a estos anticuerpos comerciales (tabla 9). Resulta interesante que, 2E2A6 sólo tenía una constante de disociación de equilibrio ligeramente inferior para el producto de corte de SNAP-25 con relación a estos anticuerpos comerciales (0,405 nM frente a 0,497 y 0,508) (tabla 9). Dado que ninguno de estos anticuerpos comerciales a-SNAP-25 reconocieron selectivamente el producto de corte de SNAP-25 (tabla 8), aparece una constante de disociación de equilibrio inferior a aproximadamente 0,5 nM, en parte, crítica para lograr tal selectividad. De manera similar, en comparación con las afinidades de unión de MC-6050 y MC-6053, 2E2A6 tuvo una constante de disociación/velocidad de disociación aproximadamente al menos una vez más lenta (6,74 x 10-5 frente a 8,82 x 10-4 s-1 y 1,18 x 103 s-1) (tabla 9). Esto sugiere además que aparece una constante de disociación/velocidad de disociación inferior a aproximadamente 8,82 x 10-4, en parte, crítica para lograr la unión selectiva para el producto de corte de SNAP-25. Este resultado concuerda con 1D3B8, que tuvo una constante de disociación/velocidad de disociación de 5,78 x 10-5 s-1 (tabla 9).
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6. Secuenciación del epítopo a partir de anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 aislados.
Para determinar el epítopo de un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 aislado que puede unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, se secuenció la molécula de polinucleótido que codifica para las cadenas pesada variable (Vh) y ligera variable (Vl) del anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 producido por los hibridomas 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2. Se extrajo el ARNm y se purificó a partir de cada hibridoma usando protocolos convencionales y se sometió a transcripción inversa para dar ADNc usando o bien un cebador antisentido de oligo dT o bien un cebador antisentido específico para el gen (Cl kappa y Ch de la IgG1 murina). Se usaron cebadores de dominio constante humano y murino específicos para amplificar el ADNc mediante PCR tras la producción del ADNc para determinar el isotipo del anticuerpo. Se usaron cebadores de Vh y Vl degenerados para amplificar los dominios variables del ADNC. Para realizar 5'RACE, se añadió una cola de dCTP homopolimérica al extremo 3' del ADNc. Entonces se amplificaron las cadenas pesada y ligera con un cebador sentido de oligo dG y un cebador antisentido específico para el gen (Ch/Kc) . Los productos de la PCR incluyeron la secuencia del péptido señal, los dominios variables y los dominios constantes hasta el cebador antisentido. Se purificaron en gel los productos de la PCR para eliminar los fragmentos pequeños y se clonaron en un vector romo o TA para la secuenciación. Se secuenciaron cinco clones independientes para cada cadena y se determinaron las alineaciones de cadenas Vh y Vl y las secuencias consenso (tabla 10). Los métodos usados para determinar las secuencias de aminoácidos de Vh y Vl se describen en, por ejemplo, Roger A. Sabbadini, et al., Novel Bioactive Lipid Derivatives and Methods of Making and Using Same, publicación de patente estadounidense 2007/0281320; y Peter Amersdorfer, et al., Molecular Characterization of Murine Humoral Immune Response to Botulinum Neurotoxin Type A Binding Domain as Assessed by Using Phage Antibody Libraries, 65(9) Infect. Immun. 3743-3752, cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Además, están disponibles servicios comerciales para secuenciar las cadenas pesada variable (VH) y ligera variable (VL) de un anticuerpo e identificar las regiones CDR, véase, por ejemplo, Fusión Antibodies Ltd., Irlanda del Norte.
La secuencia de polinudeótido que comprende las cadenas Vh y Vl del anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 producido por los hibridomas dados a conocer en la presente memoria descriptiva es tal como sigue: Vh de 1D3B8 (SEQ ID NO: 71), Vh de 2C9B10 (SEQ ID NO: 73), Vh de 2E2A6 (SEQ ID NO: 75), variante 1 de Vh de 3C1A5 (SEQ ID NO: 77), variante 2 de Vh de 3C1A5 (SEQ ID NO: 79), Vh de 3C3E2 (SEQ ID NO: 81); Vl de 1D3B8 (SEQ ID NO: 83), Vl de 2C9B10 (SEQ ID NO: 85), Vl de 2E2A6 (SEQ ID NO: 87), Vl de 3C1A5 (SEQ ID NO: 89) y Vl de 3C3E2 (SEQ ID NO: 91). La secuencia de aminoácidos que comprende las cadenas Vh y Vl del anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 producido por los hibridomas dados a conocer en la presente memoria descriptiva es tal como sigue: VH de 1D3B8 (SEQ ID NO: 72), Vh de 2C9B10 (SEQ ID NO: 74), Vh de 2E2A6 (SEQ ID NO: 76), variante 1 de Vh de 3C1A5 (SEQ ID NO: 78), variante 2 de Vh de 3C1A5 (SEQ ID NO: 80), Vh de 3C3E2 (SEQ ID NO: 82); Vl de 1D3B8 (SEQ ID NO: 84), Vl de 2C9B10 (SEQ ID NO: 86), Vl de 2E2A6 (SEQ ID NO: 88), Vl de 3C1A5 (SEQ ID NO: 90) y Vl de 3C3E2 (SEQ ID NO: 92). Las secuencias de aminoácidos que comprenden los dominios CDR de Vh y Vl del anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 producido por los hibridomas 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 y 3C3E2 se facilitan en la tabla 10.
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Los ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos que comprenden variantes del dominio de CDR de Vh del anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 producido por los hibridomas dados a conocer en la presente memoria descriptiva incluyen SEQ ID NO: 118 de variante de CDR1 de Vh para 1D3B8; SEQ ID NO: 119 de variante CDR1 de Vh para 2C9B10, 2E2A6 y variante 2 de Vh de 3C1A5; SEQ ID No : 120 de variante de CDR1 de Vh para variante 1 de Vh de 3C1A5 y 3C3E2; SEQ ID NO: 121 de variante de CDR2 de Vh para 1D3B8 y 2E2A6; SEQ ID NO: 122 de variante de CDR2 de Vh para 2C9B10 y variante 2 de Vh de 3C1A5; SeQ ID NO: 123 de variante de CDR2 de Vh para variante 1 de Vh de 3C1A5 y 3C3E2; variante MDY de CDR3 de Vh para 1D3B8 y 2C9B10; variante MGY de CDR3 de Vh para 2E2A6 y variante 2 de Vh de 3C1A5; y SEQ ID NO: 124 de variante de CDR3 de Vh para variante 1 de Vh de 3C1A5 y 3C3E2. Los ejemplos no limitativos de secuencias de aminoácidos que comprenden variantes del dominio de CDR de Vl del anticuerpo a-SNAP-25 monoclonal producido por los hibridomas dados a conocer en la presente memoria descriptiva incluyen SEQ ID NO: 125 de variante de Cd R1 de Vl para 1D3B8; SEQ ID NO: 126 de variante de CDR1 de Vl para 2c 9b 10; SEQ ID NO: 127 de variante de CDR1 de Vl para 2E2A6; SEQ ID NO: 128 de variante de CDR1 de Vl para 3C1A5; SEQ ID NO: 129 de variante de CDR1 de Vl para 3C3E2; variante KVS de CDR2 de Vl para 1D3B8; variante NAK de CDR2 de Vl para 2C9B10; variante LVS de CDR2 de Vl para 2E2A6; variante YAT de CDR2 de Vl para 3C1A5; y variante YAS de CDR2 de Vl para 3C3E2.
Ejemplo IV
Desarrollo de anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que se unen selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal libre en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A
El siguiente ejemplo ilustra cómo obtener anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que pueden unirse selectivamente a un epítopo de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
Para desarrollar anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, se diseñó el péptido CGGGRIDEANQ (SEQ ID NO: 46) de 10 residuos como un antígeno de producto de corte de SNAP-25. Este péptido que comprende un residuo de cisteína N-terminal para la conjugación con KLH, un espaciador flexible, espaciador de G (GGG) unido a los aminoácidos 191-197 de la SNAP-25 humana (SEQ ID NO: 5) y tiene una glutamina C-terminal carboxilada. Las búsquedas en Blast revelaron que este péptido tiene alta homología sólo con SNAP-25 y casi no es posible la reactividad cruzada con otras proteínas en células neuronales. La secuencia también se inspeccionó cuidadosamente mediante la utilización de algoritmos informáticos para determinar el índice de hidropatía, la probabilidad de superficie de proteína, las regiones de flexibilidad y la estructura secundaria favorable, seguido por la orientación y presentación apropiadas de la secuencia peptídica elegida. Se sintetizó el péptido y se conjugó con hemocianina de lapa californiana (KLH) para aumentar la inmunogenicidad. Antes de inmunizar a los animales, se examinaron en primer lugar conejos no tratados previamente frente a lisados celulares procedentes de las líneas celulares candidatas en una inmunotransferencia de tipo Western con el fin de identificar animales que no tenían inmunorreactividad con las proteínas presentes en los lisados celulares. Se inmunizaron con este péptido dos conejos examinados previamente y tras tres inmunizaciones en aproximadamente ocho semanas, se extrajo sangre de los conejos para someterla a prueba. Se permitió que la sangre coagulara mediante incubación a 4°C durante 60 minutos. Se centrifugó la sangre coagulada a 10.000 x g a 4°C durante 10 minutos para sedimentar los residuos celulares. Se dispensó la muestra de suero resultante en alícuotas de 50 |il y se almacenaron a -20°C hasta que se necesitaron.
Se usa una estrategia similar basada en otros antígenos de SNAP-25 dados a conocer en la presente memoria descriptiva para desarrollar anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que se unen a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25. Por ejemplo, el antígeno de SNAP-25 de SEQ ID NO: 47 puede conjugarse con KlH en vez del antígeno de SNAP-25 de s Eq ID NO: 46. Como otro ejemplo, los aminoácidos 191-197 de SNAP-25 humana del antígeno de SNAP-25 de SEQ ID NO: 38 pueden sustituirse por SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148.
2. Examen para determinar la presencia de anticuerpos policlonales a-SNAP-25.
Para determinar la presencia de anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que pueden unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, se realizaron ELISA comparativo y ensayos de corte basados en células usando el suero de conejo extraído tal como se describe en el ejemplo III. El suero de ambos conejos contenía anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que pueden unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A. Los anticuerpos policlonales de conejo a-SNAP-25 se designaron como NTP 22 y NTP 23.
3. Purificación de anticuerpos policlonales a-SNAP-25.
Para purificar anticuerpos policlonales a-SNAP-25 que pueden unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, NTP 22 y NTP 23, se purificaron anticuerpos de suero de conejo usando columnas de afinidad que contenían el antígeno de SNAP-25 de SEQ ID NO: 46.
4. Evaluación de la especificidad de unión de anticuerpos policlonales a-SNAP-25.
Para evaluar la especificidad de unión de un anticuerpo policlonal a-SNAP-25 que puede unirse selectivamente a un antígeno de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A, se usaron anticuerpos policlonales a-SNAP-25, NTP 22 y NTP 23 purificados, para detectar el producto de corte usando el ensayo de actividad basado en células, inmunocitoquímica e inmunoprecipitación tal como se describe en el ejemplo III. El ensayo de corte basado en células, el análisis de inmunocitoquímica y el análisis de inmunoprecipitación indicaron todos ellos que los anticuerpos policlonales a-SNAP-25, NTP 22 y NTP 23, no tenían reactividad cruzada con SNAP-25 no cortada. Por tanto, tanto NTP 22 como NTP 23 tienen alta especificidad de unión por el producto de corte de SNAP-25197 que permite el reconocimiento preferente de este producto de corte con relación al sustrato no cortado de SNAP-25206. La afinidad por los antígenos puede determinarse usando SPR en el instrumento BiAcore tal como se describe en el ejemplo III.
Ejemplo V
Preparación de componentes y condiciones para un ELISA de tipo sándwich
El siguiente ejemplo ilustra cómo identificar y preparar los componentes y condiciones necesarios para realizar un ELISA de tipo sándwich útil para llevar a cabo métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A mediante la detección de un producto de corte de SNAP-25 usando un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 específico para una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A.
1. Preparación de lisados celulares de células tratadas con NTBo/A.
Para obtener un lisado de células tratadas con NTBo/A para análisis, se sembró una densidad adecuada de células de un cultivo madre de Neuro-2a en un matraz T175 que contenía 50 ml de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N2 1 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM. Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente de 2 a 3 días). Como control, se sembró una densidad adecuada de células de un cultivo madre de Neuro-2a en un matraz T175 que contenía 50 ml de un medio de crecimiento apropiado (tabla 1). Se hicieron crecer estas células control no diferenciadas en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se alcanzó una confluencia del 50% (aproximadamente 18 horas). Se aspiraron de cada pocillo los medios de los cultivos control tanto diferenciados como no diferenciados y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada) o bien 10 nM de un complejo de NTBo/A. Tras una incubación durante la noche, se lavaron las células y se recogieron las células mediante lisis en tampón de lisis Triton X-100 recién preparado (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgCI2 1,5 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1%) a 4°C durante 30 minutos con agitación constante. Se centrifugaron las células lisadas a 4000 rpm durante 20 min a 4°C para eliminar los residuos usando una centrífuga de mesa. Se midieron las concentraciones de proteínas de los lisados celulares mediante el ensayo de Bradford.
2. Preparación e identificación de los componentes de ELISA de tipo sándwich.
Para identificar un par de anticuerpo de captura-anticuerpo de detección apropiado, se llevó a cabo un análisis de ELISA de tipo sándwich ECL en veintiséis combinaciones diferentes de pares de anticuerpos de captura y detección que comprendían once anticuerpos de captura a-SNAP-25 diferentes y siete anticuerpos de detección a-SNAP-25 diferentes (tabla 12). Los anticuerpos a-SNAP-25 usados eran anticuerpos monoclonales de ratón a-SNAP-25, 2E2A6 y 3C1A5, dados a conocer en la presente memoria descriptiva, anticuerpos monoclonales de ratón a-SNAP-25, SMI-81, MC-6050 y MC-6053, dados a conocer en la presente memoria descriptiva, anticuerpos policlonales de conejo a-SNAP-25, NTP 23, dados a conocer en la presente memoria descriptiva, anticuerpos policlonales de conejo a-SNAP-25 S9684 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpos policlonales de conejo a-SNAP-25 H-50 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anticuerpos policlonales de cabra a-SNAP-25 C-18 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anticuerpos policlonales de cabra a-SNAP-25 N-19 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) y anticuerpos policlonales de ratón a-SNAP-25 SP12 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA).
Para preparar la disolución de anticuerpo de captura, se purificaron los anticuerpos monoclonales a-SNAP-25 contenidos en los líquidos ascíticos de las líneas celulares de hibridoma 2E2A6 y 3C1A5 así como los anticuerpos monoclonales a-SNAP-25, MC-6050 y MC-6053, usando un protocolo de purificación de proteína A convencional. Todos los demás anticuerpos a-SNAP-25 se adquirieron como anticuerpos purificados.
Para preparar la disolución de anticuerpo de detección, se conjugó el anticuerpo a-SNAP-25 apropiado con el reactivo de marcado éster de NHS de tris-bipiridin-(4-metilsulfonato) de rutenio (ll) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Se realizó la reacción de conjugación mediante la adición de 30 |il de disolución madre de MSD SULFO-TAG™ reconstituida con agua destilada a 200 |il de anticuerpos policlonales a-SNAP-252 mg/ml y la incubación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad. Se purificaron los anticuerpos marcados usando un protocolo de columna de centrifugación convencional y se determinó la concentración de proteína usando un ensayo de proteínas colorimétrico convencional. Se midió la absorbancia del conjugado anticuerpo a-SNAP-25/MSD SULFO-TAG™ a 455 nm usando un espectrofotómetro para determinar la concentración en moles por litro. Se almacenó la disolución de anticuerpo a 4°C hasta que se necesitó.
Para preparar el soporte de fase sólida que comprende el anticuerpo de captura que es específico para un producto de corte de SNAP-25, se añaden aproximadamente 5 |il de la disolución de anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 apropiada (20 |ig/ml en PBS 1 x) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos MSD High Bind y se permite que se seque al aire la disolución en una cabina de seguridad biológica durante 2-3 horas con el fin de evaporar líquido de la disolución. Luego se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura unido mediante la adición de 150 |il de tampón de bloqueo que comprende reactivo de bloqueo de Amersham al 2% (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) y suero de cabra al 10% (VWR, West Chester, PA) a temperatura ambiente durante 2 horas. Se sellaron las placas bloqueadas y se almacenaron a 4°C hasta que se necesitaron.
Para detectar la presencia de un producto de corte de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL, se aspiró de los pocillos el tampón de bloqueo de las placas almacenadas, se añadieron 25 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A, tal como se describió anteriormente, a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante la noche. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 25 |il de la disolución 5 |ig/ml de anticuerpo de detección que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano) a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavaron los pocillos tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 150 |il de tampón de lectura 1 x (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se leyeron las placas usando un lector de imágenes SECTOR™ Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Md ). Se calculó una razón dividiendo la señal obtenida a la dosis de 10 nM para cada par de anticuerpos entre la señal obtenida a la dosis de 0 nM para cada par de anticuerpos (tabla 12). Estos resultados indicaron que entre las veintiséis combinaciones diferentes de pares de anticuerpos sometidos a prueba, sólo tres pares de anticuerpos tenían relaciones señal-ruido por encima de 10:1 para la mayor dosis sometida a prueba: n.° de par 1 (AcM de ratón 2E2A6 y AcP de conejo AS9684), n.° de par 4 (AcM de ratón 3C1A5 y AcP de conejo S9684) y n.° de par 18 (AcP de conejo S9684 y AcM de ratón 2E2A6). Se eligió el par de anticuerpos 1 para el desarrollo de ensayo adicional.
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3. Optimización de las condiciones de diferenciación celular.
Para determinar las condiciones de diferenciación óptimas para una línea celular que comprende células susceptibles de intoxicación por NTBo/A cuando se usa un sistema de detección de ELISA de tipo sándwich, se sometieron a prueba tanto diversos medios de cultivo celular como la duración del tiempo de diferenciación.
Para determinar un medio de diferenciación óptimo, se sembró en placa una densidad adecuada de células de una línea celular SiMa en los pocillos de placas de cultivo celular de 24 pocillos recubiertas con colágeno IV que contenían 1 ml de uno de los siguientes medios y suplementos de diferenciación: 1) RPMI 1640, suero bovino fetal al 10%, penicilina-estreptomicina al 1%, L-glutamina 2 mM y GT1b 25 |ig/ml; 2) RPMI-1640, suplemento B27 1 x, suplemento N2 1 x y GT1b 25 |ig/ml; 3) medio esencial mínimo, suplemento B27 1 x, suplemento N2 1 x y GT1b 25 |ig/ml; y 4) RPMI-1640, BSA al 10%, suplemento N21 x, suplemento NGF 1 x y GT1b 25 |ig/ml. Se incubaron las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente 3 días). Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada), 0,2 pM, 2 pM o bien 20 pM de un complejo de NTBo/A. Tras un tratamiento durante la noche, se lavaron las células, se incubaron durante unos dos días adicionales sin toxina para permitir el corte del sustrato de SNAP-25 y se recogieron tal como se describió anteriormente en la sección 1. Se midieron las concentraciones de proteínas de los lisados celulares mediante el ensayo de Bradford. Se realizó la detección de la presencia de producto de SNAP-25 de corte mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL tal como se describió anteriormente usando el par de anticuerpos 1. Tal como se comentó en el ejemplo I, las células no diferenciadas no captaban la toxina de manera tan eficaz como las células diferenciadas. El medio de diferenciación más eficaz para aumentar la captación de NTBo/A y por consiguiente el corte de SNAP-25 fue el medio 3 (MEM+N2+B27), seguido por el medio 2 (RPMI-1640+N2+B27) y el medio 4 (RPMI-1640+N2+NGF+BSA) (figura 3). Las células cultivadas en el medio 2 dieron como resultado más corte de la SNAP-25 en comparación con los otros medios.
Para determinar un tiempo de diferenciación óptimo, se sembró en placa una densidad adecuada de células de una línea celular SiMa en los pocillos de placas de cultivo celular de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina que contenían 100 |il de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N2 1 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM y GT1b 25 |ig/ml. Se sembraron en placa células en cuatro días diferentes para obtener pruebas del curso de tiempo de diferenciación a las 6 h, 24 h, 48 h y 72 h, y se incubaron en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5%. Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada), 0,1 pM, 0,2 pM, 0,4 pM, 0,8 pM, 1,6 pM, 3,1 pM, 6,25 pM, 12,5 pM o bien 25 pM de un complejo de NTBo/A. Tras un tratamiento durante la noche, se lavaron las células, se incubaron durante unos dos días adicionales sin toxina para permitir el corte del sustrato de SNAP-25 y se recogieron tal como se describió anteriormente en la sección 1. Tras la recogida, se obtuvieron las concentraciones de proteínas de los lisados celulares y la detección de la presencia de producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL tal como se describió anteriormente. Se transfirieron entonces los datos sin procesar obtenidos del generador de imágenes ECL a SigmaPlot v. 9.0 y se usó un ajuste de logística de 4 parámetros para definir las curvas de dosis-respuesta. No se usaron restricciones para la función logística de 4 parámetros cuando se representaron gráficamente los datos. Se generaron informes gráficos usando el siguiente análisis: R2 (coeficiente de correlación), a (Max para el ajuste de datos), b (pendiente) y X0 E.E. (valor de CE50 ± error estándar). Los resultados indicaron que podían lograrse valores de CE50 de menos de 2 pM con células diferenciadas durante 48­ 72 h (figura 4). El hallazgo de que podían usarse células diferenciadas entre 48 h y 72 h de diferenciación, sin cambios significativos sobre el rendimiento de las células, subraya la robustez del ensayo. Aunque periodos de tiempo de diferenciación de menos de 48 h pueden no ser adecuados para pruebas picomolares del producto formulado, estos tiempos de diferenciación menores son suficientemente sensibles para las pruebas de principios activos a granel.
4. Optimización del tiempo de tratamiento con NTBo/A.
Para determinar la duración de tiempo óptima en que las células forman una línea celular que es necesario tratar con NTBo/A, se sometieron a prueba diversas duraciones de tiempo de tratamiento con NTBo/A. Se sembró en placa una densidad adecuada de células de una línea celular SiMa en los pocillos de placas de cultivo celular de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina que contenían 100 |il de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N2 1 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM y GT1b 25 |ig/ml. Se sembraron en placa las células y se incubaron en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente 3 días). Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada), 0,1 pM, 0,2 pM, 0,4 pM, 0,8 pM, 1,6 pM, 3,1 pM, 6,3 pM, 12,5 pM o bien 25 pM de un complejo de NTBo/A en medio de crecimiento RPMI 1640 por triplicado para generar una respuesta de dosis completa. Se realizaron cinco regímenes de duración de tratamiento con NTBo/A diferentes: 1) un tratamiento con NTBo/A de 6 h, retirada y lavado de las células, una incubación de las células durante 18 h sin NTBo/A y recogida de las células tal como se describió anteriormente en la sección 1; 2) un tratamiento con NTBo/A de 24 h, retirada y lavado de las células, y recogida de las células tal como se describió anteriormente en la sección 1; 3) un tratamiento con NTBo/A de 24 h, retirada y lavado de las células, una incubación de las células durante 24 h sin NTBo/A, y recogida de las células tal como se describió anteriormente en la sección 1; 4) una incubación con NTBo/A de 24 h, retirada y lavado de las células, una incubación de las células durante 48 h sin NTBo/A, y recogida de las células tal como se describió anteriormente en la sección 1; y 5) una incubación con NTBo/A de 24 h, retirada y lavado de las células, una incubación de las células durante 72 h sin NTBo/A, y recogida de las células tal como se describió anteriormente en la sección 1. Tras la recogida, se obtuvieron las concentraciones de proteínas de los lisados celulares, la detección del producto de corte de SNAP-25 mediante ELISA de tipo sándwich ECL y se calculó la CE50 tal como se describió anteriormente. Los resultados indican que podían lograrse valores de CE50 de menos de 2 pM con cualquiera de los tratamientos con NTBo/A sometidos a prueba (figura 5). Resulta interesante que los regímenes de tratamiento con NTBo/A de 24 h 24 h, 24 h 48 h y 24 h 73 h generaron esencialmente los mismos valores de CE50, 1,0 pM, 1,1, pM y 0,9 pM, respectivamente. Los valores de CE50 generados para los regímenes de tratamiento con NTBo/A de 6 h 18 h y 24 h 0 h fueron de 1,7 pM y 1,6 pM, respectivamente. Aunque la cantidad de señal obtenida fue inferior, estos resultados indican que pueden usarse tiempos de tratamiento con NTBo/A de entre 6 h y 24 h más incubación tras el tratamiento de un día a tres días para generar una CE50 que es adecuada para detectar la actividad de NTBo/A y dar flexibilidad en el curso de tiempo global del ensayo.
5. Sensibilidad del método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A.
Para evaluar la sensibilidad de los métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dados a conocer en la presente memoria descriptiva, se determinó el momento de captación de NTBo/A por células susceptibles de intoxicación por NTBo/A. Se sembró en placa una densidad adecuada de células de una línea celular SiMa en los pocillos de placas de cultivo celular de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina que contenían 100 |il de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N21 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM y GT1b 20 |ig/ml. Se incubaron las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente 3 días). Se aspiraron los medios de cada pocillo, se sustituyeron por medios recién preparados que contenían 1 nM de un complejo de NTBo/A y se incubaron las células tratadas con NTBo/A en seis puntos de tiempo diferentes de 0 min (neurotoxina añadida y luego retirada inmediatamente), 5 min, 10 min, 20 min, 30 min y 60 min. Se usó un control negativo de medios sin NTBo/A (0 nM). Tras la incubación, se lavaron las células y se recogieron tal como se describió anteriormente en la sección 1. Tras la recogida, se obtuvieron las concentraciones de proteínas de los lisados celulares, la detección del producto de corte de SNAP-25 mediante ELISA de tipo sándwich ECL y se calculó la CE50 tal como se describió anteriormente. Los resultados indicaron que la captación de NTBo/A por las células llevó menos de un minuto antes de producir cantidades significativas de producto de corte de SNAP-25 con respecto al fondo (figura 6).
6. Especificidad del método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A.
Para evaluar la especificidad de los métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dados a conocer en la presente memoria descriptiva, se determinó la capacidad de células susceptibles de intoxicación por NTBo/A para distinguir de manera exacta NTBo/A para la exclusión de NTBo/A inactivada parcialmente. Se sembró en placa una densidad adecuada de células de una línea celular SiMa en los pocillos de placas de cultivo celular de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina que contenían 100 |il de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N21 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM y GT1b 25 |ig/ml. Se incubaron las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente 3 días). Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 1) 0 (muestra no tratada), 0,03 pM, 0,1 pM, 0,31 pM, 0,93 pM, 2,78 pM, 8,33 pM y 25 pM, de un complejo de NTBo/A; 2) 0, 0,14 nM, 0,41 nM, 1,23 nM, 3,7 nM, 11,11 nM, 33,33 nM y 100 nM de una NTBo/A inactiva (iNTBo/A); o bien 3) 0, 0,14 nM, 0,41 nM, 1,23 nM, 3,7 nM, 11,11 nM, 33,33 nM y 100 nM de un fragmento LHn/A. La iNTBo/A contiene una mutación en el dominio de unión a zinc de la cadena ligera que inactiva completamente la actividad metaloproteasa de la neurotoxina, véase, por ejemplo, Liqing Zhou, et al., Expression and Purification of the Light Chain of Botulinum Neurotoxin A: A Single Mutation Abolishes its Cleavage of SNAP-25 and Neurotoxiciy after Reconstitution with the Heavy Chain, Biochemistry 34: 15175-15181 (1995), que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. El fragmento LHn/A carece del dominio de unión, pero contiene un dominio de translocación intacto y la cadena ligera, véase, por ejemplo, Clifford C. Shone, et al., Recombinant Toxin Fragments, patente estadounidense 6.461.617, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Tras el tratamiento de 24 h, se lavaron las células, se incubaron durante unos dos días adicionales sin toxina para permitir el corte del sustrato de SNAP-25 y se recogieron tal como se describió anteriormente en la sección 1. Tras la recogida, se obtuvieron las concentraciones de proteínas de los lisados celulares, la detección del producto de corte de SNAP-25 mediante ELISA de tipo sándwich ECL y se calculó la CE50 tal como se describió anteriormente. Los resultados indican que la afinidad de unión de células por iNTBo/A y LHn/A (CE50 > 100 nM) es inferior en al menos 60.000 unidades a la afinidad de unión por NTBo/A (CE50= 1,6 pM) (figura 7). No se detectó ningún producto de corte de SNAP-25 en las células tratadas con iNTBo/A en ninguna de las concentraciones sometidas a prueba. Aunque se detectó una baja cantidad de producto de corte de SNAP-25 en las células tratadas con la mayor dosis del fragmento LHn/A, esta actividad se debe a la captación no específica de este fragmento debido a la actividad del dominio de translocación. Por tanto, los resultados indican que los métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A dados a conocer en la presente memoria descriptiva pueden medir todas las etapas implicadas en el proceso de intoxicación mediante el cual una NTBo/A corta de manera proteolítica un sustrato de SNAP-25 y engloba la unión de una NTBo/A a un receptor de NTBo/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de NTBo/A desde una vesícula intracelular en el citoplasma y el corte proteolítico de una SNAP-25.
Ejemplo Vl
Método de detección de base inmunológica de actividad de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich ECL
El siguiente ejemplo ilustra métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A mediante la detección de un producto de corte de SNAP-25 usando un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 específico para un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich ECL.
Para preparar un lisado de células tratadas con una NTBo/A, se sembró en placa una densidad adecuada de células de una línea celular establecida en los pocillos de placas de cultivo de 96 pocillos que contenían 100 |il de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N21 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM y GT1b 25 |ig/ml (véanse los ejemplos I y II). Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente 3 días). Se aspiraron los medios de las células diferenciadas de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían cualquiera de 0 (muestra no tratada), 0,03 pM, 0,1 pM, 0,3 pM, 0,9 pM, 2,8 pM, 8,3 pM y 25 pM de un complejo de NTBo/A. Tras un tratamiento de 24 h, se lavaron las células y se incubaron durante unos dos días adicionales sin toxina. Se recogieron las células tal como se describe en el ejemplo V.
Para preparar la disolución del anticuerpo de captura a-SNAP-25, se purificó el anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 contenido en los líquidos ascíticos de la línea celular de hibridoma 2 E2 A6 usando un protocolo de purificación de proteína A convencional. Para preparar la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25, se conjugó anticuerpo policlonal de conejo a-SNAP-25 S9684 (Sigma, San Luis, MO) con el reactivo de marcado éster de NHS de trisbipiridin-(4-metilsuífonato) de rutenio (II) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). La reacción de conjugación, la purificación del anticuerpo a-SNAP-25 marcado, la determinación de la concentración y el almacenamiento fueron tal como se describe en el ejemplo V.
Para preparar el soporte de fase sólida que comprende el anticuerpo de captura que es específico para un producto cortado de SNAP-25, se añadieron aproximadamente 5 |il de disolución de anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 2E2A6 (20 |ig/ml en PBS 1 x) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos MSD High Bind y se permitió que se secase al aire la disolución en una cabina de seguridad biológica durante 2-3 horas con el fin de evaporar líquido de la disolución. Luego se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura unido y se usaron directamente para detectar actividad de NTBo/A.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL, se aspiró de los pocillos el tampón de bloqueo de las placas almacenadas, se añadieron 25 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante la noche. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 25 |il de la disolución 5 |ig/ml de anticuerpo de detección que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano) a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavaron los pocillos tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 150 |il de tampón de lectura 1 x (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se leyeron las placas usando un lector de imágenes SECTOR™ Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Se analizaron los datos recogidos y se calculó la CE50 tal como se describe en el ejemplo V. En la figura 8 se muestra un resultado representativo. Estos resultados indicaron que en promedio se detectó 1,0 pM de NTBo/A a la CE50 (un intervalo de aproximadamente 0,3 pM a aproximadamente 2,0 pM) con una relación señal-ruido para la asíntota inferior de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1 y una relación señal-ruido para la asíntota superior de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 500:1.
Ejemplo VII
Método de detección de base inmunológica de actividad de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich CL
El siguiente ejemplo ilustra métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A mediante la detección de un producto de corte de SNAP-25 usando un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 específico para una SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A mediante ELISA de tipo sándwich CL.
Se prepararon el lisado de células tratadas con una NTBo/A y la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25 tal como se describe en el ejemplo Vl.
Para preparar la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25, se conjugó el anticuerpo policlonal a-SNAP-25 S9684 (Sigma, San Luis, MO) con peroxidasa de rábano (HRP) según las instrucciones del fabricante (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Se realizó la reacción de conjugación mediante la adición a 500 |il de anticuerpos policlonales 1 mg/ml a-SNAP-25 a un vial que contenía peroxidasa activada liofilizada, el mezclado de los componentes y luego la adición de 10 |il de cianoborohidruro de sodio. Se incubó esta mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora en una campana extractora. Tras extinguir la reacción, se purificaron los anticuerpos marcados usando un protocolo de columna de centrifugación convencional y se determinó la concentración de proteína usando un ensayo de proteínas colorimétrico convencional. Se midió la absorbancia del conjugado anticuerpo policlonal a-SNAP-25/HRP a 455 nm usando un espectrofotómetro para determinar la concentración en moles por litro. Se almacenó la disolución de anticuerpo a-SNAP-25 a 4°C hasta que se necesitó.
Para preparar el soporte de fase sólida que comprende el anticuerpo de captura a-SNAP-25 que es específico para el producto cortado de SNAP-25, se añadieron aproximadamente 100 |il de disolución de anticuerpo monoclonal a-SNAP-252E2A6 (1 mg/ml en PBS 1 x) a cada pocillo de una placa blanca Greiner de 96 pocillos y se incubaron las placas a 4°C durante la noche, y luego se desechó cualquier cantidad de disolución de anticuerpo en exceso. Entonces se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura unido mediante la adición de 150 |il de tampón de bloqueo que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) y suero de cabra al 10% (VWR, West Chester, PA) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se desechó el tampón de bloqueo y se secaron las placas sobre toallitas de papel mediante inversión y golpeo. Entonces se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura unido y se usaron directamente para detectar actividad de NTBo/A.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich CL, se añadieron 50 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada en un agitador que rotaba a 500 rpm a 4°C durante de 2-4 horas a toda la noche. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,05% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 100 |il de la disolución 1 mg/ml de anticuerpo policlonal a-SNAP-25/anticuerpo de detección-HRP que comprendía el reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano) a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada en un agitador que rotaba a 650 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavaron los pocillos tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,05% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 100 |il de mezcla 1:1 de SuperSignal ELISA Pico (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) a cada pocillo y se leyeron las placas usando un luminómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 395 nm. Se analizaron los datos recogidos y se calculó la CE50 tal como se describe en el ejemplo V. Estos resultados indicaron que en promedio se detectó 1,0 pM de NTBo/A a la CE50 (un intervalo de aproximadamente 0,3 pM a aproximadamente 2,0 pM) con una relación señal-ruido para la asíntota inferior de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1 y una relación señal-ruido para la asíntota superior de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 500:1.
Ejemplo VIII
Método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich ECL múltiplex
El siguiente ejemplo ilustra métodos de base inmunológica múltiplex de detección de actividad de NTBo/A mediante la detección de un producto de corte de SNAP-25 usando un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 específico para un producto de corte de SNAP-25 y un segundo par de anticuerpos para una proteína diferente.
1. Preparación e identificación del par anticuerpo de captura-anticuerpo de detección para una segunda proteína.
Para obtener un lisado celular no tratado para análisis, se sembró una densidad adecuada de células de un cultivo madre de células SiMa en un matraz T175 que contenía 40 ml de un medio de crecimiento que contenía RPMI 1640 1X, FBS al 10%, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 U/100 |ig de penicilina-estreptomicina. Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células fueron confluentes en aproximadamente el 70-90%. Se lavaron las células y se recogieron mediante lisis en tampón de lisis Triton-X recién preparado (Tris 20 mM pH 7,5, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 0,001 M, EGTA 1 mM y Triton-X-100 al 1%) a 4°C durante aproximadamente 30 minutos con agitación constante. Se centrifugaron las células lisadas a aproximadamente 3300-3330 x g durante 40 minutos a 8°C para eliminar los residuos usando una centrífuga de mesa.
Para identificar un par anticuerpo de captura-anticuerpo de detección apropiado para una segunda proteína, se llevó a cabo un análisis de ELISA de tipo sándwich ECL con 21 combinaciones diferentes de pares de anticuerpos de captura y detección que comprendían cinco proteínas diferentes (tabla 13). Los anticuerpos usados eran anticuerpo monoclonal de ratón a-sintaxina 1A-HPC S0664 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo monoclonal de ratón a-GAPDH MAB374 (Chemicon, Temecula, CA), anticuerpo policlonal de conejo a-sintaxina 1 S1172-1 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo policlonal de conejo a-GAPDH 2275-PC-1 (R & D Systems, Mineápolis, MN), anticuerpo policlonal de conejo a-sintaxina 2 S5687 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo monoclonal de ratónDa-sintaxina 2 humana MAB2936 (R & D Systems, Mineápolis, MN), anticuerpo policlonal de cabra a-sintaxina 2 de ratón AF2568 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo policlonal de conejo a-sintaxina 2 AB5596 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo policlonal de conejo a-sintaxina 1 S1172-2 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo policlonal de ovejaDa-h, m, r-actina AF4000 (R & D Systems, Mineápolis, MN), anticuerpo monoclonal de ratón a-beta-actina A1978 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo policlonal de ratón Da-beta-actina A2228 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo monoclonal de ratón a-GAPDH de ratón G8795 (Sigma, San Luis, MO), anticuerpo policlonal de conejo a-GAPDH G9595 (Sigma, San Luis, MO).
Para preparar la disolución de anticuerpo de captura de segunda proteína, se adquirieron los anticuerpos monoclonales como anticuerpos purificados. Para preparar la disolución de anticuerpo de detección de segunda proteína, se conjugó el anticuerpo apropiado con el reactivo de marcado éster de NHS de tris-bipiridin-(4-metilsulfonato) de rutenio (II) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Se realizó la reacción de conjugación mediante la adición de 30 |il de disolución madre de MSD SULFO-TAG™ reconstituida con agua destilada hasta 200 |il de anticuerpos policlonales 2 mg/ml y la incubación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad. Se purificaron los anticuerpos marcados usando un protocolo de columna de centrifugación convencional y se determinó la concentración de proteína usando un ensayo de proteínas colorimétrico convencional. Se midió la absorbancia del conjugado anticuerpo/MSD SULFO-TAG™ a 455 nm usando un espectrofotómetro para determinar la concentración en moles por litro. Se almacenó la disolución de anticuerpo de detección a 4°C hasta que se necesitó.
Para preparar el soporte de fase sólida que comprende el anticuerpo de captura que es específico para un producto cortado de SNAP-25, se añadieron aproximadamente 5 |il de disolución de anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 2E2A6 (20 |ig/ml en PBS 1 x) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos MSD High Bind y se permitió que se secase al aire la disolución en una cabina de seguridad biológica durante 2-3 horas con el fin de evaporar líquido de la disolución, y luego se sellaron las placas y se almacenaron a 4°C hasta que se necesitaron. Luego se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura secado unido mediante la adición de 150 |il de tampón de bloqueo que comprendía BSA al 3% (Pierce, Rockford, IL) suero de cabra al 10% (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), y leche desnatada al 1% de Difco (BD BioSciences Franklin Lakes, NJ) en Tween-20 PBS al 5% a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
Para detectar la presencia de proteína mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL, se aspiró de los pocillos el tampón de bloqueo de las placas almacenadas, se añadieron 25 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A, tal como se describió anteriormente, a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante la noche. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 25 |il de la disolución 5 |ig/ml de anticuerpo de detección de segunda proteína apropiada, resuspendida en el tampón de bloqueo tal como se describió anteriormente, a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora con agitación. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavaron los pocillos tres veces con 250 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 150 |il de tampón de lectura 1 x (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se leyeron las placas usando un lector de imágenes SECTOR™ Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Md ). Se calculó una razón dividiendo la señal obtenida de los lisados celulares no tratados para cada par de anticuerpos entre la señal obtenida para el control de tampón de lisis (dosis de 0 nM) para cada par de anticuerpos (tabla 13). Estos resultados indicaron que entre las veintiuna combinaciones diferentes de pares de anticuerpos sometidos a prueba, sólo dos pares de anticuerpos tenían relaciones señal-ruido por encima de 10:1 para la mayor dosis sometida a prueba: n.° de par 16: anticuerpo monoclonal de ratón a-GAPDH MAB374 y anticuerpo policlonal de conejo a-GAPDH RDS2275-PC-1; y par 21 : anticuerpo monoclonal de ratón a-GAPDH MAB374 y anticuerpo policlonal de conejoa-GAPDH G9545. Se seleccionó el par de anticuerpo monoclonal de ratón a-GAPDH MAB374 y el anticuerpo policlonal de conejo a-GAPDH G9545 como el par de anticuerpo de captura-anticuerpo de detección de segunda proteína para el ELISA de tipo sándwich ECL múltiplex.
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2. Método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/ A usando ELISA de tipo sándwich ECL múltiplex.
Para obtener un lisado de células tratadas con NTBo/A para análisis, se sembró una densidad adecuada de células de un cultivo madre de una línea celular SiMa en una placa de 96 pocillos con poli-D-lisina que contenía un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1 x, suplemento N21 x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM. Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y crecimiento de neuritas (aproximadamente 3 días). Se aspiraron los medios de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada), 0,67 U/ml, 2,35 U/ml, 8,23 U/ml, 28,82 U/ml, 101 U/ml, o bien 353 U/ml de un complejo de NTBo/A. Tras un tratamiento de 24 h, se lavaron las células, se incubaron durante unos dos días adicionales sin toxina. Se lavaron las células, se recogieron y se procesaron tal como se describió anteriormente en la sección 1.
Se prepararon la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25 y la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25, tal como se describe en el ejemplo VII. Para preparar la disolución de anticuerpo de captura a-GAPDH, se preparó el anticuerpo monoclonal de ratón a-GAPDH MAB374 (Chemicon, Temecula, CA) tal como se describe en la sección 1 anteriormente. Para preparar la disolución de anticuerpo de detección a-GAPDH, se conjugó el anticuerpo policlonal de conejo a-GAPDH G9545 (Sigma, San Luis, MO) con el reactivo de marcado éster de NHS de trisbipiridin-(4-metilsulfonato) de rutenio (II) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). La reacción de conjugación, la purificación del anticuerpo a-SNAP-25 marcado, la determinación de la concentración y el almacenamiento fueron tal como se describen en la sección 1 anteriormente.
Para preparar el soporte de fase sólida que comprende el anticuerpo de captura a-SNAP-25 y el anticuerpo de captura a-GAPDH, se añadieron aproximadamente 2,5 nl de la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25 (45 |ig/ml en PBS 1 x) y se añadieron 2,5 nl de la disolución de anticuerpo de captura a-GAPDH (120 |ig/ml en PBS 1 x) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos MSD High Bind en un formato múltiplex usando un sistema robótico. Se permitió que se secase al aire la disolución en una cabina de seguridad biológica durante al menos 2-3 horas para evaporar líquido de la disolución. Entonces se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura unido y se usaron directamente para detectar actividad de NTBo/A y la proteína GADPH.
Para detectar la presencia de producto de corte de SNAP-25 mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL múltiplex, se aspiró de los pocillos el tampón de bloqueo de las placas almacenadas, se añadieron 25 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A, tal como se describió anteriormente, a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante la noche. Se lavaron los pocilios de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 25 |il de la disolución 5 |ig/ml de anticuerpo de detección a-SNAP-25 y 25 |il de la disolución 5 |ig/ml de anticuerpo de detección a-GAPDH, tal como se describió anteriormente, a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora con agitación. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavaron los pocillos tres veces con 250 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 150 |il de tampón de lectura 1 x (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se leyeron las placas usando un lector de imágenes SECTOR™ Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). Se analizaron los datos recogidos y se calculó la potencia relativa a partir de los datos normalizados tal como se describe en el ejemplo V, excepto porque se usó software PLA 2.0 (Stegmann Systems, GmbH, Alemania).
Como comparación, también se realizó la detección de producto de corte de SNAP-25 usando el ELISA de tipo sándwich ECL monoplex tal como se describe en el ejemplo Vl.
Los resultados indicaron que los datos de SNAP-25 obtenidos del ELISA de tipo sándwich ECL monoplex, o a partir de los datos de SNAP-25 no normalizados obtenidos del ELISA de tipo sándwich ECL múltiplex, revelaron una dosis de muestra aberrante que no se ajustó en la curva de dosis-respuesta. Sin embargo, la normalización de los datos de SNAP-25 frente a los datos de GAPDH proporcionó un mejor ajuste de la curva y la potencia estaba más próxima al valor esperado.
Ejemplo IX
Método de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich EC múltiplex
El siguiente ejemplo ilustra métodos de base inmunológica múltiplex de detección de actividad de NTBo/A mediante la detección de un producto de corte de SNAP-25 usando un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 específico para un producto de corte de SNAP-25 y un segundo par de anticuerpos para una proteína diferente.
Se preparó el lisado de células tratadas con una NTBo/A tal como se describe en el ejemplo Vl. Se prepararon la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25, la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25 y el soporte de fase sólida de a-SNAP-25 tal como se describe en el ejemplo VII.
Para preparar la disolución de anticuerpo de captura a-GAPDH, se adquirió el anticuerpo monoclonal a-GAPDH MAB374 (Millipore, Billerica, MA) como anticuerpo purificado. Para preparar la disolución de anticuerpo de detección a-GAPDH, se conjugó un anticuerpo policlonal a-GAPDH G9545 (Sigma, San Luis, MO) con peroxidasa de rábano (HRP) según las instrucciones del fabricante (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). La reacción de conjugación, la determinación de la concentración y el almacenamiento fueron tal como se describen en el ejemplo VII.
Para preparar el soporte de fase sólida que comprende un segundo anticuerpo de captura específico para la segunda proteína, se añadieron aproximadamente 100 |il de disolución de anticuerpo monoclonal que comprendía 1 |ig/ml de anticuerpo monoclonal a-GAPDH MAB374 a cada pocillo de una placa blanca Greiner de 96 pocillos y se incubaron las placas a 4°C durante la noche, y luego se desechó cualquier cantidad de disolución de anticuerpo en exceso. Entonces se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura a-GAPDH unido mediante la adición de 150 |il de tampón de bloqueo que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) y suero de cabra al 10% (VWR, West Chester, PA) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se desechó el tampón de bloqueo y se secaron las placas sobre toallitas de papel mediante inversión y golpeo. Entonces se bloquearon los pocillos con anticuerpo de captura unido y se usaron directamente para detectar actividad de NTBo/A.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich CL múltiplex, se añadieron 50 |il de lisados celulares de células tratadas con NTBo/A a cada pocillo del soporte de fase sólida de anticuerpo de captura a-SNAP-25 y el soporte de fase sólida de anticuerpo de captura a-GAPDH, se selló la placa y se incubó la placa sellada en un agitador que rotaba a 500 rpm a 4°C durante de 2-4 horas a toda la noche. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,05% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 100 |il de la disolución de anticuerpo de detección que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano), y 1 mg/ml de anticuerpo policlonal a-SNAP-25/HRP a cada pocillo del soporte de fase sólida de anticuerpo de captura a-SNAP-25, se selló la placa y se incubó la placa sellada en un agitador que rotaba a 650 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. De manera similar, se añadieron 100 |il de una disolución de anticuerpo de detección que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano) y 0,25 mg/ml de anticuerpo policlonal a-GAPDH G9545/HRP (Sigma Co., San Luis, MO) a cada pocillo del soporte de fase sólida de anticuerpo de captura a-GAPDH, se selló la placa y se colocó la placa sellada en un agitador que rotaba a 650 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavaron los pocillos tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,05% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 100 |il de mezcla 1:1 de SuperSignal ELISA Pico (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) a cada pocillo y se leyeron las placas usando un luminómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 395 nm. Se analizaron los datos recogidos y se calculó la CE50 tal como se describe en el ejemplo V. Los resultados indicaron que los puntos de datos recogidos para las cantidades de complejo antígeno-anticuerpo a-SNAP-25 detectado fueron un mejor ajuste tras la normalización con las cantidades de complejo antígeno-anticuerpo a-GAPDH detectado, produciendo de ese modo una lectura más exacta. Estos resultados indicaron que en promedio se detectó 1,0 pM de NTBo/A a la CE50 (un intervalo de aproximadamente 0. 3 pM a aproximadamente 2,0 pM) con una relación señal-ruido para la asíntota inferior de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1 y una relación señal-ruido para la asíntota superior de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 500:1.
Puede usarse un diseño similar para métodos de base inmunológica múltiplex de detección de actividad de NTBo/A mediante la detección de un producto de corte de SNAP-25 usando un anticuerpo monoclonal a-SNAP-25 específico para un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich ECL con el mismo par de anticuerpos a-GAPDH.
Ejemplo X
Método de base inmunológica para detectar cantidades picomolares de NTBo/A
El siguiente ejemplo ilustra cómo realizar métodos de base inmunológica de detección de actividad de NTBo/A que pueden detectar cantidades picomolares del producto farmacéutico de NTBo/A, tal como, por ejemplo, BOTOX® DYSPORT®/RELOXIN®, PURTOX®, XEOMIN®, NEURONOX® o BTX-A.
1. Método de base inmunológica de detección de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich ECL.
Para preparar un lisado de células tratadas con una NTBo/A, se sembraron en placa aproximadamente de 50.000 a 150.000 células de una línea celular establecida en los pocillos de placas con poli-D-lisina de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían 100 |il de un medio libre de suero que contenía medio esencial mínimo, GlutaMAX™ I 2 mM con sales de Earle, suplemento B27 1x, suplemento N2 1x, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, HEPES 10 mM y GT1b 25 |ig/ml (véanse los ejemplos I y II). Se incubaron estas células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que se diferenciaron las células, tal como se evaluó mediante criterios morfológicos convencionales y de rutina, tales como detención del crecimiento y extensión de neuritas (aproximadamente de 2 a 3 días). Se aspiraron los medios de las células diferenciadas de cada pocillo y se sustituyeron por medios recién preparados que contenían o bien 0 (muestra no tratada), 0,03 pM, 0,1 pM, 0,3 pM, 0,9 pM, 2,8 pM, 8,3 pM o bien 25 pM de un producto farmacéutico de NTBo/A reconstituido en una disolución libre de cloruro de sodio; o 0 (muestra no tratada), 0,7 U/ml, 2,1 U/ml, 6,2 U/ml, 18,5 U/ml, 55,6 U/ml, 166,7 U/ml o 500 U/ml de un producto farmacéutico de NTBo/A reconstituido en un medio libre de cloruro de sodio. Dado que el producto farmacéutico de NTBo/A contiene cloruro de sodio, su adición al medio de cultivo dio como resultado un medio hipertónico que era perjudicial para la viabilidad celular. Para solventar el problema de la hipertonicidad, se usaron 200 |il de medio MEM preparado sin cloruro de sodio para reconstituir el producto farmacéutico de NTBo/A proporcionando una concentración final de NTBo/A 25 pM (500 U/ml). Se mantuvo constante la matriz para todas las concentraciones a lo largo de la curva de dosis-respuesta mediante la adición de cloruro de sodio en el medio usado para hacer que las diluciones concuerden con la cantidad de excipientes presentes a la mayor concentración usada (25 pM o 500 U/ml). Tras un tratamiento de 24 h, se lavaron las células y se incubaron durante unos dos días adicionales sin toxina. Para recoger las células, se aspiró el medio, se lavó con PBS 1 x, y se lisó mediante la adición de 30 |il de tampón de lisis que comprendía HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, MgCh 1,5 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1% a cada pocillo y se incubó la placa en un agitador que rotaba a 500 rpm durante 30 minutos a 4°C. Se centrifugó la placa a 4000 rpm durante 20 minutos a 4°C para sedimentar los residuos celulares y se transfirió el sobrenadante a una placa de 96 pocillos recubierta con anticuerpo de captura para realizar la etapa de detección.
Se prepararon la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25, la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25 y el soporte de fase sólida que comprendía el anticuerpo de captura que es específico para un producto cortado de SNAP-25 tal como se describe en el ejemplo Vl.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich ECL, se aspiró el tampón de bloqueo de las placas almacenadas, se añadieron 25 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A a cada pocillo y se incubaron las placas a 4°C durante o bien 2 h o bien 24 h. Se lavaron los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadieron 25 |il de la disolución 5 |ig/ml de anticuerpo de detección a-SNAP-25 que comprendía reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano) a cada pocillo, se selló la placa y se incubó la placa sellada a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación. Tras la incubación del anticuerpo de detección a-SNAP-25, se lavaron los pocillos tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se procesaron las placas, se analizaron los datos recogidos y se calculó la CE50 tal como se describe en el ejemplo V. Estos resultados indicaron que en promedio se detectó 1,0 pM de NTBo/A a la CE50 (un intervalo de aproximadamente 0,3 pM a aproximadamente 2,0 pM) con una relación señal-ruido para la asíntota inferior de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1 y una relación señal-ruido para la asíntota superior de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 500:1 (figura 9). Este método también puede realizarse en un modo múltiplex tal como se describe en el ejemplo VIII.
2. Método de base inmunológica de detección de NTBo/A usando ELISA de tipo sándwich CL.
Se prepararán el lisado de células tratadas con una NTBo/A y la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25 tal como se describe en el ejemplo Vl. Se prepararán la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25 y el soporte de fase sólida que comprende el anticuerpo de captura que es específico para un producto cortado de SNAP-25 tal como se describe en el ejemplo VII.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de ELISA de tipo sándwich CL, se añadirán 25 |il de un lisado de células tratadas con NTBo/A a cada pocillo, se sellará la placa y se incubará la placa sellada en un agitador que rota a 500 rpm a 4°C durante o bien 2 h o bien 24 h. Se lavarán los pocillos de las placas tres veces mediante la aspiración del lisado celular y el aclarado de cada pocillo tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,05% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadirán 100 |il de disolución 1 mg/ml de anticuerpo de detección de anticuerpo policlonal a-SNAP-25/HRP que comprende reactivo de bloqueo de Amersham al 2% en PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,1% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano) a cada pocillo, se sellará la placa y se incubará la placa sellada en un agitador que rota a 650 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación del anticuerpo de detección, se lavarán los pocillos tres veces con 200 |il de PBS 1 x, TWEEN-20® al 0,05% (monolaureato de polioxietileno (20) y sorbitano). Tras el lavado, se añadirán 100 |il de mezcla 1:1 de SuperSignal ELISA Pico (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) a cada pocillo y se leerán las placas usando un luminómetro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 395 nm. Se analizarán los datos recogidos y se calculará la CE50 tal como se describe en el ejemplo V. Este método también puede realizarse en un modo múltiplex tal como se describe en el ejemplo VIII.
Ejemplo Xl
Método de base inmunológica para detectar anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A
El siguiente ejemplo ilustra cómo realizar un método de base inmunológica que puede detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
NTBo/A, se usa actualmente para una amplia variedad de indicaciones médicas incluyendo de hiperactividad muscular, oftalmológicas, gastrointestinales, urológicas y cosméticas. Con el tratamiento a largo plazo repetido de NTBo/A, un paciente puede desarrollar anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A frente a la toxina que conducen a inmunorresistencia. Los anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A inhiben la actividad de NTBo/A mediante la detención de la captación de la toxina en células neuronales mediante la unión al dominio de unión (Hc) y/o el dominio de translocación (Hn) de NTBo/A. Algunos estudios han sugerido que hasta el 5-10% de los pacientes tratados repetidamente para distonía con formulaciones de NTBo/A tienen inmunorresistencia debido al desarrollo de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A. El ensayo establecido para determinar la presencia de los anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A en la sangre del paciente es el ensayo de protección de ratón (MPA). Actualmente, se incuba NTBo/A con el suero de un paciente antes de la inyección en ratones. La presencia de anticuerpos se manifiesta por una disminución de la respuesta a la neurotoxina en el animal. Puesto que el MPA es un ensayo basado in vivo, sería más rentable en cuanto a tiempo y coste si se sustituyera por un ensayo basado en células.
Para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A, pueden usarse los métodos de base inmunológica de determinación de actividad de NTBo/A dados a conocer en la presente memoria descriptiva. Una manera es determinar la cantidad de producto de corte de SNAP-25 presente tras el tratamiento con diversas concentraciones de NTBo/A usando un método de detección de inmunotransferencia de tipo Western, la otra manera era usar un método de detección de ELISA de tipo sándwich ECL.
Para preparar una muestra que comprendía anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A y una muestra de control negativo que se sabía que carecía de anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A, se aisló el suero de la sangre de diferentes individuos. Los individuos que declinaron las inmunizaciones se denominaron individuos no tratados previamente. Los individuos que aceptaron la inmunización se denominaron individuos inmunizados. Se extrajo la sangre en un tubo de suero con un activador de la coagulación (BD Biosciences, Bedford, MA). Se obtuvo el suero mediante centrifugación de la sangre a 1000 x g durante 10 minutos a 4°C. Se obtuvo el suero de dos donantes: se inmunizó un individuo frente a NTBo/A mientras que el otro no.
Para preparar un lisado de células tratadas con una muestra que comprendía NTBo/A, se sembraron células SiMa en una placa de 96 pocillos con poli-D-lisina y se diferenciaron tal como se describe en el ejemplo Vl. Se diluyeron los sueros humanos en serie 1 :100 -1 :152.000 mediante incrementos de 2,5 veces usando medios libres de suero. Se suspendió la NTBo/A en 0,5 ml de medios de cultivo SiMa a una concentración de 10 pM. Se mezclaron los medios que contenían NTBo/A y anticuerpos a-NTBo/A y se incubaron durante 15 min o 1 h a temperatura ambiente. Se trataron las células con NTBo/A con suero humano durante 2 h seguido por una incubación de 15 h en medios de crecimiento recién preparados. También se trataron las células durante 15 h sin tiempo de incubación adicional.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se aspiraron los medios de cada pocillo, se suspendieron las células en 50 |il de tampón de carga de SDS-PAGE, y luego se calentaron hasta 95°C durante 5 minutos. Se analizó una alícuota de cada muestra recogida mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el ejemplo I, excepto porque se separan las muestras recogidas mediante SDS-PAGE usando geles Criterion de 26 pocillos al 12% (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), y se usó el suero de anticuerpo policlonal de conejo a-SNAP-25197 como anticuerpo primario (véase el ejemplo IV). Los resultados indican que las muestras de prueba dieron como resultado un corte reducido de SNAP25 en comparación con la muestra de control negativo, demostrando que el suero del individuo inmunizado contenía anticuerpos neutralizantes a-NTBo/A.
Para detectar la presencia de un producto de SNAP-25 cortado mediante ELISA de tipo sándwich ECL, se retiraron los medios de cada pocillo y se lisaron las células tal como se describe en el ejemplo V. Se prepararon la disolución de anticuerpo de captura a-SNAP-25, la disolución de anticuerpo de detección a-SNAP-25 y el soporte de fase sólida de a-SNAP-25 tal como se describe en el ejemplo VII. Se transfirieron los sobrenadantes al soporte de fase sólida de a-SNAP-25 y se realizó un ensayo de ELISA de tipo sándwich ECL tal como se detalla en el ejemplo V. Se analizaron los datos recogidos y se calculó la CE50 tal como se describe en el ejemplo V, excepto porque se obtuvo la CE50 que es la dilución en suero necesaria para inhibir la actividad de la NTBo/A hasta A de su máximo y la razón de señal máxima (señalMáx.) con respecto a la señal mínima (señalMín.) dividiendo la señal del producto de corte de SNAP-25 obtenida con la mayor dilución de suero entre la señal obtenida con la menor dilución de suero.
Los resultados indican que podría detectarse la presencia de a-NTBo/A neutralizante en suero humano. La actividad del complejo de NTBo/A incubado en suero del individuo inmunizado disminuyó a medida que disminuyó la dilución del suero, mientras que la presencia de suero no tratado previamente no tuvo ningún impacto sobre el ensayo en cada dilución sometida a prueba. Este ensayo puede realizarse usando un producto farmacéutico de NTBo/A formulado, un complejo de NTBo/A a granel o una neurotoxina purificada.
Ejemplo XII
Método de base inmunológica para detectar actividad de NTBo/A usando células modificadas mediante ingeniería genética
El siguiente ejemplo ilustra cómo introducir una molécula de polinucleótido que codifica para un receptor de NTBo/A en células de una línea celular establecida para mejorar adicionalmente la susceptibilidad a la intoxicación por NTBo/A o mejorar la capacidad de captación de NTBo/A.
Para introducir un receptor de NTBo/A exógeno en células que comprendían una línea celular establecida, se transfectó un constructo de expresión que comprendía una molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 130 que codifica para el FGFR2 de SEQ ID NO: 59, o una molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 139 que codifica para el FGFR3 de SEQ ID NO: 25, en células de una línea celular establecida mediante un método con lípido catiónico. Se siembra en placa una densidad adecuada (aproximadamente 5 x106 células) de células de una línea celular establecida en una placa de cultivo tisular de 100 mm que contiene 5 ml de medios de cultivo completos y se hacen crecer en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad apropiada para la transfección. Se preparan 3 ml de disolución de transfección mediante la adición de 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 60 |il de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos a 1,5 ml de medio con suero reducido OPTI-MEM que contiene 24 |ig de un constructo de expresión que codifica para un FGFR2 o un FGFR3, o un constructo de expresión de control que codifica para una proteína fluorescente verde (GFP). Se incubó esta mezcla de transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Se sustituyen los medios completos por los 3 ml de disolución de transfección y se incuban las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 8 horas. Se sustituyen los medios de transfección por 3 ml de medios de cultivo completos recién preparados y se incuban las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 24 horas. Se sustituyen los medios por 3 ml de medios de cultivo completos recién preparados que contienen G418 aproximadamente 1 mM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se incuban las células en un incubador a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 1 semana, se sustituyen los medios antiguos por medios de cultivo completos recién preparados que contienen G4180,5 mM. Una vez que se establecen colonias resistentes a antibióticos, se vuelven a sembrar en placa clones resistentes en nuevas placas de cultivo de 100 mm que contienen medios de cultivo completos recién

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Método de detección de actividad de NTBo/A en un mamífero, que comprende las etapas de:
    a. tratar una célula de una línea celular establecida que expresa SNAP-25 con una muestra de prueba que comprende una NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A, en el que la célula de una línea celular establecida es susceptible de intoxicación por NTBo/A en aproximadamente 500 pM o menos de una NTBo/A, y en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una línea celular SiMa, y una línea celular Neuro-2a;
    b. aislar de las células tratadas un producto de corte de SNAP-25 que tiene un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A;
    c. poner en contacto el producto de corte de SNAP-25 con un anticuerpo monoclonal anti-SNAP-25 unido a un soporte de fase sólida, en el que el anticuerpo anti-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25, en el que el anticuerpo anti-SNAP-25 tiene una constante de velocidad de asociación para un epítopo que no comprende una glutamina en el extremo carboxilo-terminal del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A de un producto de corte de SNAP-25 de menos de 1 x 101 M' 1 s-1; y el anticuerpo anti-SNAP-25 tiene una constante de disociación de equilibrio para el epítopo de menos de 0,450 nM;
    d. detectar la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo que comprende el anticuerpo anti-SNAP-25 y el producto de corte de SNAP-25 que comprende un extremo carboxilo-terminal en el residuo P1 del enlace escindible del sitio de corte de NTBo/A del producto de corte de SNAP-25;
    en el que la detección del complejo antígeno-anticuerpo en la etapa d es indicativa de actividad de NTBo/A.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de prueba es una muestra de sangre, plasma, suero o linfa del mamífero.
  3. 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra de prueba es una muestra de sangre o suero del mamífero.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de corte de SNAP-25 tiene una glutamina en el extremo carboxilo-terminal de SEQ ID NO:38.
  5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo anti-SNAP-25 se une a un epítopo que comprende una glutamina en el extremo carboxilo terminal de SEQ ID NO:38.
  6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de control negativo no comprende NTBo/A.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección de la presencia de un complejo antígeno-anticuerpo es a través del uso de un inmunoensayo de tipo sándwich.
  8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que el inmunoensayo de tipo sándwich usa una etapa de método de detección de electroquimioluminiscencia o quimioluminiscencia.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que
    (i) el anticuerpo anti-SNAP-25 comprende una región variable de cadena pesada que comprende regiones de determinación de complementariedad (CDR) que comprenden las secuencias de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 95, 99 y 101 y una región variable de cadena ligera que comprende las CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 103, 108 y 113 o
    (ii) el anticuerpo anti-SNAP-25 comprende una región variable de cadena pesada que comprende las CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 93, 96 y 100 y una región variable de cadena ligera que comprende las CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 105, 110 y 115.
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