KR101423272B1 - 감소된 비-독소 단백질을 갖는 보툴리눔 독소의 국소 적용및 경피 전달을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 국소로 적용될 수 있는 보툴리눔 독소의 신규한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 헤마글루티닌, 비-독소 비-헤마글루티닌 및/또는 외래 알부민의 양이 통상적인 상업적으로 이용가능한 보툴리눔 독소에 비해 선택적으로 및 독립적으로 감소된 것인 보툴리눔 독소 복합체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 보툴리눔 독소에 대해 원형이 아니고 보툴리눔 독소 복합체에 비공유적으로 결합하여, 상기 독소 복합체가 피부 상피에 부착되고 피부 상피를 투과하는 능력을 개선시키기 위해 피부-향성 "부착 분자"로 작용하는 분자들을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 피하로 주사되는 기존의 보툴리눔-함유 조성물에 비해 개선된 안전성 프로파일을 갖는다. 그와 같은 조성물을 이용하는 방법도 본 발명에 의해 고려된다.
보툴리눔, 보툴리눔 독소 복합체, 헤마글루티닌.

Description

감소된 비-독소 단백질을 갖는 보툴리눔 독소의 국소 적용 및 경피 전달을 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods of topical application and transdermal delivery of botulinum toxins with reduced non-toxin proteins}
본 발명은 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 국소로 적용될 수 있고 피하로 주사되는 기존의 보툴리눔-함유 조성물에 비해 개선된 안전성 프로파일을 갖는 보툴리눔 독소의 신규한 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부의 환경적 위협으로부터 신체의 기관을 보호하고 체온을 유지하기 위한 자동온도조절장치(thermostat)로서 작용한다. 피부는 수개의 상이한 층들로 구성되며, 각 층은 특화된 기능을 갖는다. 주요 층들은 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(hypodermis)을 포함한다. 표피는 결합 조직으로 구성되는 진피를 덮는 상피 세포들의 겹층(stratifying layer)이다. 표피 및 진피는 모두 지방 조직의 내부 층인 피하조직에 의해 더 지지된다.
피부의 최상층인 표피는 그 두께가 0.1 내지 1.5 밀리미터에 불과하다(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)). 표피는 케라티노사이트로 구성되며 그들의 분화 상태에 근거하여 수개의 층들로 분류된다. 표피는 각질층(stratum corneum) 및 과립(granular) 세포, 유극(melphigian) 세포 및 기저(basal) 세포로 구성된 생 표피층(viable epidermis)으로 더 분류될 수 있다. 각질층은 수분을 흡수하며 그 유연성 및 부드러움을 유지하기 위해 10 중량% 이상의 수분을 필요로 한다. 흡습성(hygroscopicity)은 부분적으로 케라틴의 수분-보유 능력에서 기인한다. 각질층이 그의 부드러움 및 유연성을 상실하면, 이는 거칠고 부서지기 쉬워져서, 건조한 피부를 초래한다.
표피 바로 하부에 존재하는 진피는 그 두께가 1.5 내지 4 밀리미터이다. 진피는 피부의 세 층들 중에서 가장 두껍다. 또한, 진피는 또는 한선 및 유선(면포 또는 모공이라 불리는 피부의 개구부들을 통해 물질들을 분비함), 모근, 신경 말단 및 혈관 및 림프관을 포함한 피부의 구조물들의 대부분이 존재하는 곳이다(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)). 그러나, 진피의 주요 성분들은 콜라겐 및 엘라스틴이다.
피하조직은 피부의 최심부 층이다. 피하조직은 체온 유지를 위한 절연층 및 기관 보호를 위한 충격 흡수층으로 작용한다(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7(1998)). 또한, 피하조직은 에너지 저장을 위해 지방을 저장한다. 피부의 pH는 정상 상태에서 5와 6 사이이다. 피부의 산성은 피지선의 분비물로부터 유래한 양쪽성(amphoteric) 아미노산, 젖산, 및 지방산의 존재 때문이다. "산성 맨틀(acid mantle)"이라는 용어는 피부의 대부분의 영역 상에 있는 수용성 물질들의 존재를 의미한다. 피부의 완충(buffering) 능력은 부분적으로는 피부의 각질층에 저장된 이 분비물들에서 기인한다.
노화의 자명한 징후들 중 하나인 주름은 피부에 대한 환경적 손상으로부터 축적되는 생화학적, 조직학적, 및 생리적 변화들에 의해 유발될 수 있다(Benedetto, International Journal of Dermatology, 38: 641-655(1999)). 또한, 안면 주름의 특징적인 접힘(fold), 골(furrow), 및 구겨짐(crease)을 유발할 수 있는 다른 이차 인자들이 있다(Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)). 이와 같은 이차적인 인자들은 피부에 대한 중력의 지속적인 인력, 빈번하고 지속적인 위치적 압력(positional pressure)(예를 들면, 수면 동안), 및 안면 근육의 수축에 의해 유발되는 반복적인 안면 운동을 포함한다(Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)).
노화의 징후들 중 일부를 잠재적으로 완화시키기 위해 상이한 기법들이 이용되고 있다. 이 기법들은 알파 히드록시산 및 레티놀을 포함하는 안면 보습제에서 외과적 수술 및 신경 독소의 주사에 이르기까지 다양하다. 예를 들면, 1986년에, 안과성형 전문의 및 피부과 전문의로 구성된 부부인 Jean 및 Alastair Carruthers는 미간 영역에 있는 운동과 연관된 주름들의 치료를 위해 타입 A형 보툴리눔 독소를 사용하는 방법을 개발했다(Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150(1981)). Carruther 부부에 의한 주름의 치료를 위한 타입 A형 보툴리눔 독소의 이용은 1992년에 이 방식의 중요한 발표로 이어졌다(Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York : Academic Press, 143-150(1981)). 1994년까지, 동일한 팀은 안면에서 다른 운동-연관된 주름들에 대한 경험을 보고했다(Scott, Ophthalmol, 87: 1044-1049(1980)). 이는 뒤이어 타입 A형 보툴리눔 독소를 이용한 미용 치료의 시대의 탄생을 가져왔다.
흥미롭게도, A형 보툴리눔 독소는 인간에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학적 작용제인 것으로 언급된다. 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 포자는 토양에서 발견되고 부적절하게 멸균되고 밀봉된 식품 용기에서 성장할 수 있다. 이 세균의 섭취는 치명적일 수 있는 보툴리누스 중독증을 유발할 수 있다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부(neuromuscular junction)를 통한 아세틸콜린의 시냅스 전달(synaptic transmission) 또는 방출을 방지하는 것에 의해 근육의 마비를 초래하도록 작용하고 또한 다른 방식으로도 작용하는 것으로 사료된다. 그들의 작용은 통상적으로 근육 경련 또는 수축을 유발하는 신호를 본질적으로 차단하여, 마비를 초래한다. 그러나, 보툴리눔 독소의 근육-마비 효과는 치료적 효과를 위해 이용되고 있다. 보툴리눔 독소의 제어 투여가 증상, 예를 들면, 과다활성의 골격근을 특징으로 하는 신경근 질환을 치료하기 위한 근육 마비를 제공하기 위해 이용되었다. 보툴리눔 독소에 의해 치료된 증상들은 반측안면경련, 성인 발병 경련성 사경(adult onset spasmodic torticollis), 열항, 안검경련, 뇌성마비, 경부 근긴장 이상증(cervical dystonia), 편두통, 사시, 측두하악관절장애(temperomandibular joint disorder), 및 다양한 종류의 근육 경련 및 발작을 포함한다. 보다 최근에는, 보툴리눔 독소의 근육-마비 효과가 주름, 찡그린 선(frown lines)과 같은 치료적 및 미용학적 적용, 및 안면 근육의 경련 또는 수축의 다른 결과들에서 이용되었다.
A형 보툴리눔 외에, 그람-양성 세균인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는, 혈청학적으로(serologically) 구별되는 7종의 다른 보툴리눔 독소가 있다. 이 8종의 혈청학적으로 구별되는 보툴리눔 독소 중에서,마비를 유발할 수 있는 7종이 보툴리눔 독소 혈청형, A형, B형, C형(또한, C형, D형, E형, F형 및 G형으로도 알려짐)로 지정되었다. 이들 각각은 혈청형-특이적 항체(type-specific antibody)에 의한 중화에 의해 구별된다. 이와 같은 7종의 활성 보툴리눔 독소 혈청형에 대한 보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은 약 150 kD이다. 보툴리눔 독소의 상이한 혈청형은 그들이 작용하는 동물 종 및 그들이 유발하는 마비의 심각도 및 지속기간이 다양하다. 예를 들면, A형 보툴리눔 독소는 랫트에서 생성된 마비율에 의해 측정된 바와 같이, B형 보툴리눔 독소보다 500배 더 강력하다. 또한, B형 보툴리눔 독소는 A형 보툴리눔 독소의 영장류 LD50의 약 12배인, 480 U/kg의 투여량에서 영장류에서 무독성인 것으로 확인되었다. 보툴리눔 독소의 분자 크기 및 분자 구조 때문에, 보툴리눔 독소는 각질층 및 그 하부의 피부 구조의 복수 층들을 통과할 수 없다.
클로스트리디움 보툴리눔 세균에 의해 분비되는, 보툴리눔 독소는 결합된 비-독소 단백질(non-toxin protein)과 함께 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 독소 복합체의 성분이다. 이 내생 비-독소 단백질은 헤마글루티닌 단백질 및 비-헤마글루티닌 단백질의 패밀리를 포함하는 것으로 생각된다. 상기 비- 독소 단백질은 독소 복합체에서 보툴리눔 독소 분자를 안정화시키고, 변성(denaturation)으로부터, 예를 들면, 독소 복합체가 섭취되는 경우, 소화 산(digestive acid)에 의한 변성으로부터 이를 보호하는 것으로 생각된다. 따라서, 상기 독소 복합체의 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소의 활성을 보호하고 특히, 상기 독소 복합체가 위장관을 통해 투여되는 경우 전신 투과(systemic penetration)를 증가시킨다. 보다 구체적으로, 비-독소 단백질의 일부는 특히 위장 상피를 통한 투과를 증가시키고, 다른 비-독소 단백질은 혈액 내의 보툴리눔 독소 분자를 안정화시킨다. 또한, 상기 독소 복합체 내에서 비-독소 단백질의 존재는 상기 독소 복합체가 전술된 바와 같이, 약 150 kD인 보툴리눔 독소 분자 자체의 분자량보다 더 큰 분자량을 갖게 한다. 예를 들면, 클로스트리디움 보툴리눔 세균은 약 900 kD, 500 kD 또는 300 kD의 분자량을 갖는 A형 보툴리눔 독소 복합체를 생성할 수 있다. 흥미롭게도, B형 및 C형 보툴리눔 독소는 700 kD 또는 500 kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. D형 보툴리눔 독소는 300 kD 및 500 kD 복합체로 생성된다. E형 및 F형 보툴리눔 독소는 약 300 kD 복합체로서만 생성된다.
보툴리눔 독소에 추가적인 안정성을 제공하기 위해, 독소 복합체는 제조 동안 종종 그들을 외래 안정제(예를 들면, 젤라틴, 폴리사카라이드, 또는 가장 일반적인 추가적 알부민)와 조합시키는 것에 의해 안정화된다. 안정화제는 제조, 수송, 보관, 및 투여와 관련된 환경을 포함한 별개의 환경들에서 독소 복합체에 결합하고 안정화시키는 작용을 한다.
일반적으로, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체와 알부민을 포함하는 조 성물의 세심한 제어 주사(controlled injection)에 의해 환자에게 투여되나, 이 접근방법과 관련된 여러 문제들이 있다. 주사가 고통스러울 뿐 아니라, 그들은 종종 원하는 치료 또는 미용 효과를 달성하기 위해, 주사 부위 주위에 국소로 대형 피하 웰(subdermal well of toxin)을 형성하기에 충분한 독소를 전달해야 한다. 훨씬 심각하게는, 치료대상 영역이 큰 경우 다수의 주사가 요구될 수 있다. 또한, 주사된 독소 복합체는 보툴리눔 독소를 안정화시키고 독소-단백질의 분자량을 증가시키는 비-독소 단백질 및 알부민을 포함하기 때문에, 상기 독소 복합체는 체내에서 긴 반감기를 가지며, 조직을 통해 서서히 확산되며, 환자에서 바람직하지 않은 항원성 반응을 유발할 수 있다. 또한, 비-독소 단백질 및 알부민은 혈액 내에서 보툴리눔 독소를 안정화시키기 때문에, 주사는 치명적인 전신 중독(systemic poisoning)을 초래할 수 있는 다량의 독소를 환자의 혈류로 방출하지 않도록 조심스럽게 적용되어야 한다. 따라서, 주사는 일반적으로 인체 해부학에 대해 깊은 이해를 가진 고도로 숙련된 의료 전문가에 의해 정확하게 수행되어야 한다.
전술에서 검토된 모든 문제들을 고려할 때, 고통이 없고 통상적인 주사-기반 방법보다 적은 양의 독소를 필요로 하는 것인 보툴리눔 독소를 투여하는 방법이 매우 바람직할 것이다. 또한, 그와 같은 방법이 보툴리눔 독소의 항원성 및 혈액 안정성을 감소시키고, 체내에서 보툴리눔 독소 복합체의 확산 속도를 증가시켜서, 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 보툴리눔 독소를 사용하는 것을 보다 안전하게 한다면 매우 바람직할 것이다. 상기 독소의 안전한 투여를 달성하기 위해 의료 전문가에 의한 보툴리눔 독소의 정확한 주사에 결정적으로 의존하지 않는 투여 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 피부 상피에 국소로 통증없이 용이하게 적용될 수 있는 치료용 보툴리눔 독소 조성물을 제공하여 전술된 문제에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명의 국소 조성물에서 보툴리눔 독소 복합체는 외래 알부민에 결합된 통상적인 상품화된(commercial) 보툴리눔 독소 복합체(예를 들면, BOTOX® 또는 MYOBLOC®)에 비해, 감소된 항원성, 보다 낮은 혈액 안정성, 보다 우수한 안전성 프로파일, 및 피부 상피를 통한 보다 높은 확산 속도를 갖는다. 또한, 본 발명의 조성물 및 그와 연관된 방법을 이용하면, 동일한 임상적 결과를 달성하기 위해 통상적인 주사-기반 투여 방법에 비해 더 낮은 수준의 보툴리눔 독소가 요구된다.
본 발명의 일 양태는 클로스트리디움 보툴리눔 세균으로부터 수득된 보툴리눔 독소 복합체 내의 내생의 비-독소 단백질(즉, 무독성 헤마글루티닌 및 비-헤마글루티닌 단백질(non-hemagglutinin protein))은 바람직하지않게 상기 독소 복합체의 안정성 및 독성을 증가시키고, 바람직하지않게 상기 독소가 피부 상피를 통해 확산하는 능력을 저하시킨다는 인식이다. 본 발명은 또한 알부민과 같은 외래 안정화제가 통상적인 제조 공정 동안 보툴리눔 독소에 결합하는 경우 이 효과들이 악화된다는 것을 인정한다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 헤마글루티닌, 비-독소 비-헤마글루티닌 및/또는 외래 알부민의 양이 통상적인 상업적으로 이용가능한 보툴리눔 독소(예를 들면, BOTOX® 또는 MYOBLOC®)에 비해 선택적으로 및 독립적으로 감소되는 것인 보툴리눔 독소 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 일부 비-원형(non-native) 분자(즉, 클로스트리디움 보툴리눔 세균으로부터 수득되는 보툴리눔 독소 복합체에서 발견되지 않는 분자)가 보툴리눔 독소 복합체가 피부 상피를 통해 확산되는 능력을 개선하기 위해 보툴리눔 독소 복합체, 및 특히 감소된 보툴리눔 독소 복합체(reduced botulinum toxin complex)에 첨가될 수 있다는 인식이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 비-원형 분자는 보툴리눔 독소 복합체에 비공유결합에 의해 결합되고 상기 독소 복합체가 피부 상피에 부착하여 이를 투과하는 능력을 개선하고 또한 혈액 내에서 보툴리눔 복합체의 안정성을 감소시키는 피부-향성의(skin-tropic) "부착 분자(adhesion molecule)"로 작용한다. 예로서, 상기 부착 분자는 특정 단백질, 예를 들면, 시알로프로테인(sialoprotein)일 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 보툴리눔 독소 복합체(또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체) 및 미용약학적(cosmeceutical) 또는 치유적 치료를 위한 조성물의 경피 투과를 증가시키는 피부-표적화(skin-targeting) 비-원형 부착 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 선택적으로 알부민과 같은 추가적인 외래 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 국소로 유효량의 본 발명에 따른 조성물을 치료를 필요로 하는 개체 또는 환자에서 바람직하게는 피부에 적용하는 것에 의해 생물학적 효과를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 생물학적 효과는 예를 들면, 근육 마비, 과다분비 또는 발한의 감소, 신경통증 또는 편두통의 치료, 근육경련의 경감, 여드름의 예방 또는 경감, 면역 반응의 감소 또는 강화, 주름의 감소 또는 다양한 기타 질환의 예방 또는 치료를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 복합체(또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체) 및 부착 분자를 포함하는 제제(formulation), 또는 그와 같은 제제를 생성하기 위해 이용될 수 있는 프리믹스(premix)를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 개체에게 순차적으로 보툴리눔 독소 복합체(또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체) 및 부착 분자를 투여하기 위한 수단을 포함하는 키트가 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 보툴리눔 독소를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이고, 보다 상세하게는 개선된 피부 부착 및 투과, 감소된 항원성 및 혈액 안정성을 가지며, 보툴리눔 독소의 피부 상피를 통한 수송 또는 전달("경피 전달(transdermal delivery)"로도 지칭됨)을 가능하게 하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 전술된 바와 같이, 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 개체에게 보툴리눔 독소를 제공하는 국소 적용을 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 보툴리눔 독소의 다른 조성물 및 전달 방법에 비해 개선된 안전성 프로파일을 갖는다. 또한, 이 조성물들은 보툴리눔 독소에 대한 면역 반응의 유용한 감소를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보툴리눔 독소(botulinum toxin)"는 세균 또는 재조합 기법에 의해 생성되는지 여부 및 새로 발견된 혈청형(serotype), 및 공학적으로 조작된 변이체 또는 융합 단백질을 포함한, 나중에 발견될 수 있는 임의의 그와 같은 종류에 관계없이, 임의의 공지된 종류의 보툴리눔 독소(즉, 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질 분자)를 의미한다. 전술된 바와 같이, 현재 7종류의 면역학적으로 구별되는 보툴리눔 신경독소, 각각 타입-특이적 항체(type-specific antibody)에 의한 중화에 의해 구별되는, 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G가 밝혀졌다. 보툴리눔 독소 혈청형은 예를 들면, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)와 Metabiologics, Inc. (Madison, Wisconsin) 및 기타 출처로부터 상업적으로 구매가능하다. 상이한 혈청형의 보툴리눔 독소는 그들이 영향을 미치는 동물 종 및 그들이 유발하는 마비의 심각도 및 지속기간이 다양하다. 적어도 두 타입의 보툴리눔 독소, A형 및 B형이 특정한 증상의 치료를 위한 제제로 상업적으로 구매가능하다. 예를 들면, A형은 상표명 BOTOX®를 갖는 알레르겐(Allergen) 및 상품명 DYSPORT®를 갖는 입센(Ipsen)의 제조에 포함되고, B형은 상품명 MYOBLOC®을 갖는 엘란(Elan)의 제조에 포함된다.
본 발명의 조성물에서 사용되는 용어 "보툴리눔 독소"는 대안적으로 보툴리눔 독소 유도체, 즉, 보툴리눔 독소 활성을 가지나 천연 보툴리눔 독소 또는 재조합 원형(recombinant native) 보툴리눔 독소에 대해 임의의 부분 또는 임의의 사슬 상에 하나 이상의 화학적 변형 또는 기능적 변형을 포함하는 보툴리눔 독소 유도체를 의미할 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소는 원형에 비해 결실, 변형 또는 치환된 하나 이상의 아미노산을 갖는 신경독소인 변형된 신경독소일 수 있거나, 또는 상기 변형된 신경독소는 재조합 기법에 의해 생산된 신경독소 또는 그의 유도체 또는 그의 단편일 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소는 그의 특성을 강화하거나 또는 바람직하지 않은 부작용을 감소시키나, 여전히 원하는 보툴리눔 독소 활성을 유지하는 방식으로 변형된 보툴리눔 독소일 수 있다. 보툴리눔 독소는 전술된 바와 같이, 세균에 의해 생성된 임의의 보툴리눔 독소 복합체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에서 사용된 보툴리눔 독소는 재조합 또는 합성 화학적 기법을 이용하여 생성된 독소, 예를 들면, 재조합 펩티드, 융합 단백질, 또는 예를 들면, 상이한 독소 혈청형의 서브유닛 또는 도메인으로부터 제조된 하이브리드 신경독소(예를 들면, 미국특허 제6,444,209호 참조)일 수 있다. 보툴리눔 독소는 또한 필요한 보툴리눔 독소 활성을 갖는 것으로 입증된 전체 분자의 일부일 수 있고, 그와 같은 경우에 그 자체로서, 또는 조합 또는 컨쥬게이트 분자, 예를 들면, 융합 단백질의 일부로서 이용될 수 있다. 대안적으로, 보툴리눔 독소는 그 자체로 무독성일 수 있는 보툴리눔 독소 전구체, 예를 들면, 단백질분해효소에 의한 절단시 독성을 갖게 되는 무독성 아연 프로테아제(zinc protease)의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보툴리눔 독소 복합체(botulinum toxin complex)" 또는 "독소 복합체"는 결합된 내생의 비-독소 단백질(즉, 클로스트리디움 보툴리눔 세균에 의해 생산된 헤마글루티닌 단백질 및 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질을 갖는, 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질(보툴리눔 독소 혈청형 A-G 중 하나에 속함)을 의미한다. 그러나, 보툴리눔 독소 복합체는 클로스트리디움 보툴리눔 세균으로부터 하나의 독소 복합체로서 유래되지 않아도 된다. 예를 들면, 보툴리눔 독소 또는 변형된 보툴리눔 독소가 먼저 재조합 기법에 의해 제조되고 뒤이어 비-독소 단백질과 조합될 수 있다. 또한, 재조합 보툴리눔 독소가 (예를 들면, List Biological Laboratories, Campbell, CA로부터) 구매되고 비-독소 단백질과 조합될 수 있다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 복합체가 클로스트리디움 보툴리눔 세균에 의해 생성된 보툴리눔 독소 복합체에서 자연적으로 발견되는 양에 비해 감소된 양의 비-독소 단백질을 갖는 것인 "감소된 보툴리눔 독소 복합체(reduced botulinum toxin complex)"를 고려한다. 일 구체예에서, 감소된 보툴리눔 독소 복합체는 클로스트리디움 보툴리눔 세균으로부터 유래된 보툴리눔 독소 복합체로부터 헤마글루티닌 단백질 또는 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질의 분획을 추출하기 위한 임의의 통상적인 단백질 분리 방법을 이용하여 제조된다. 예를 들면, 감소된 보툴리눔 독소 복합체는 보툴리눔 독소 복합체를 7.3의 pH에서 적혈구에 노출시켜 분리시키는 것에 의해 제조될 수 있다(참조에 의해 본 명세서에 포함된, EP 1514556 Al 참조). HPLC, 투석, 컬럼, 원심분리 및 단백질로부터 단백질을 추출하는 기타 방법이 이용될 수 있다. 대안적으로, 감소된 보툴리눔 독소 복합체가 합성에 의해 제조된 보툴리눔 독소를 비-독소 단백질과 조합시키는 것에 의해 제조되는 경우, 천연 보툴리눔 독소 복합체에 존재하는 것보다 적은 양의 헤마글루티닌 또는 비-독소 헤마글루티닌 단백질을 상기 조합물에 첨가할 수 있다. 본 발명에 따른 감소된 보툴리눔 독소 복합체에 담긴 임의의 비-독소 단백질(예를 들면, 헤마글루티닌 단백질 또는 무독성 비-헤마글루티닌 단백질 또는 양자 모두)은 독립적으로 임의의 양만큼 감소될 수 있다. 특정한 대표적인 구체예에서, 하나 이상의 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소 복합체에서 일반적으로 발견되는 양 대비 약 0.5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소될 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 세균은 7개의 상이한 혈청형의 독소를 생성하고 상이한 상대적 양의 비-독소 단백질과 함께 상용 제제로 제조된다(즉, 상이한 양의 독소 복합체). 예를 들면, Myobloc은 0.05% 인간 혈청 알부민, 0.01 M 소디움 숙시네이트, 및 0.1 M 염화나트륨과 함께 ml 당 5000 U의 B형 보툴리눔 독소를 갖는다. Dysport는 125 mcg 알부민 및 2.4 mg 락토오스와 함께 500 U의 A형 보툴리눔 독소-헤마글루티닌 복합체를 갖는다. 하나의 특히 흥미로운 구체예에서, 클로스트리디움 보툴리눔 세균으로부터 유래된 보툴리눔 독소 복합체에서 일반적으로 발견되는 실질적으로 모든 비-독소 단백질(예를 들면, 95%를 초과하는 양의 헤마글루티닌 단백질 및 무독성 비-헤마글루니틴 단배질)이 보툴리눔 독소 복합체로부터 제거된다. 또한, 일부 경우에 내생 비-독소 단백질이 동일한 양만큼 감소될 수 있으나, 본 발명은 또한 각각의 내생 비-독소 단백질이 상이한 양씩 감소되는 경우 및 내생 비-독소 단백질 중 하나 이상을 감소시키고 나머지는 감소시키지 않는 경우를 고려한다.
보툴리눔 독소 복합체를 불안정하게 하기 위해 내생 비-독소 단백질의 양을 감소시키는 것 외에(또는 대신에), 본 발명은 또한 제조 동안 일반적으로 첨가되는 내생 안정화제의 양을 감소시키는 것을 고려한다. 그와 같은 내생 안정화제의 예는 알부민이고, 알부민은 일반적으로 천연 보툴리눔 독소 복합체의 내생 비-독소, 비-헤마글루티닌 성분에서 발견되는 알부민의 양의 1000배에 해당하는 양으로 보툴리눔 독소 복합체의 제조 동안 첨가된다. 본 발명에 따르면, 첨가된 외래 알부민의 양은 통상적인 외래 알부민의 천배보다 적은 임의의 양일 수 있다. 본 발명의 특정한 대표적인 구체예에서, 천연 보툴리눔 독소 복합체 내의 알부민의 양의 약 50Ox, 40Ox, 30Ox, 20Ox, 10Ox, 50x, 10x, 5x, 1x, 0.5x, O.lx, 또는 O.Olx만이 첨가된다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물에 안정화제로서 외래 알부민이 전혀 첨가되지 않는다. 다른 구체예에서, 알부민에 더해(또는 대신에) 외래 안정화제가 본 발명의 치료용 국소 조성물에 첨가된다. 예를 들면, 본 발명에 의해 고려되는 다른 안정화제는 락토오스, 젤라틴 및 폴리사카라이드를 포함한다.
본 발명에 따른 "부착 분자(adhesion molecule)"는 적어도 하기의 특성을 갖는 단백질 또는 기타 분자일 수 있다: (1) 천연 보툴리눔 독소 복합체에서 발견되지 않는다(즉, "비-원형(non-native)"); (2) 보툴리눔 독소 복합체 또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체, 특히, 외래 알부민 또는 기타 안정화제와 전혀 또는 거의 조합되지 않은 보툴리눔 독소 복합체를 안정화시키기 위해 작용한다; 및 (3) 보툴리눔 독소 복합체 또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체와 혼합되는 경우, 보툴리눔 독소의 경피 투과를 촉진하여, 상기 독소가 원하는 치료 또는 미용 효과를 생성하기에 충분한 양으로 근육 및/또는 다른 피부-관련 구조로 투여될 수 있게 한다. 대체로, 수송이 보툴리눔 독소의 공유결합에 의한 변형 없이 일어날 수 있는 것이 바람직하다. 특정한 바람직한 구체예에서, 부착 분자는 피부의 특정한 성분들로 결합될 수 있고, 상기 특정한 성분들의 비한정적인 예는 케라티노사이트, 상피 세포 및 모낭을 포함한다. 예로서, 본 발명에 따른 부착 분자는 케라티노사이트 성장 인자, 케라티노사이트 결합 단백질, 표피 성장인자(EGF), EGF-유사 단백질, 및 신경 성장 인자, 뇌-유래 향신경성 인자(brain-derived neurotrophic factor), 뉴로트로핀-3 및 뉴로트로핀-4/5와 같은 뉴로트로핀(neurotrophin)에 결합할 수 있는 단백질일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 치료용 국소 조성물은 둘 이상(more than one)의 상이한 비-원형 부착 분자를 포함한다.
특히 흥미로운 구체예에서, 비-원형 부착 분자는 시알로프로테인이다. 임의의 특정한 과학 이론에 의해 구속되기를 원치않으면서, 시알로프로테인은 보툴리눔 독소의 피부 부착 및 경피 투과를 촉진하고, 피부 및 인 비트로에서 보툴리눔 독소의 안정화를 강화하고, 개선된 안전성 프로파일을 위해 혈액 및 전신 활성을 감소시키는 것으로 생각된다. 본 발명에 의해 고려되는 시알로프로테인의 비-한정적인 예는 골 시알로프로테인(bone sialoprotein) I(BSPI(bone sialoprotein), 오스테오폰틴, OPN, 분비된 포스포프로테인(secreted phosphoprotein) 1, Spp 1, 조기 T 림프구 활성화 단백질(early T lymphocyte activation protein)-1, ETA-I, 요로결석 단백질, 네프로폰틴(nephropontin)으로도 알려짐) 및 골 시알로프로테인 II(BSPII, 인테그린-결합 시알로프로테인, 세포 결합 시알로프로테인, BNSP로도 알려짐)을 포함한다. 시알로프로테인은 예를 들면, Chemicon International로부터 상업적으로 구매가능하다. 상피 세포, 특히 피부 및 방광 상피 세포에서 결합하고 내재화되는 다른 부착 분자가 이용될 수 있다. 카데린(cadhein), 인테그린, 면역글로불린 수퍼패밀리, 셀렉틴 및 포도칼릭신(podocalyxin)과 같은 다른 막관통 시알로프로테인(transmembrane sialoprotein)과 같은 부착 분자 패밀리가 첨가될 수 있다.
대체로, 본 발명에 따른 조성물에서 부착 분자의 농도는 보툴리눔 독소가 경피적으로 전달될 수 있게 하기에 충분해야 한다. 또한, 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 경피 수송 속도(transdermal transport rate)는 수용체-매개 동력학을 따라서 경피 수송은 수송 속도가 일정하게 되는 포화점(saturation point)까지 부착 분자의 양의 증가에 따라 증가되는 것으로 생각된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 첨가되는 부착 분자의 양은 포화 직전 경피 투과 속도를 최대화하는 양과 동일하다. 본 발명의 국소 조성물에서 부착 분자에 대한 통상적인 농도 범위는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 보툴리눔 독소 조성물의 유닛당 약 0.1 ng 내지 약 1.0 mg이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 국소 조성물에서 부착 분자는 보툴리눔 독소의 유닛당 약 0.1 mg 내지 0.5 mg의 범위이다. 예를 들면, 본 발명에 의해 고려되는 시알로프로테인의 일 예인 골 시알로프로테인 I의 경우, 통상적인 범위는 약 0.1 ng 내지 약 1.0 mg, 보다 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 약 0.5 mg이다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 개체 또는 환자, 즉, 특정한 치료를 필요로 하는 인간 또는 다른 포유동물의 피부 또는 상피로 적용될 제품의 형태로 존재한다. 용어 "필요로 하는(in need)"은 약학적 또는 건강-관련 필요성, 예를 들면, 바람직하지 않는 안면 근육 경련을 포함하는 증상을 치료할 필요성, 및 미용적 및 주관적 필요성, 예를 들면, 안면 조직의 외형을 변형시키거나 또는 개선할 필요성을 모두 포함하도록 의도된다. 일반적으로, 조성물은 보툴리눔 독소(결합된 비-독소 단백질 또는 감소된 양의 결합된 비-독소 단백질을 포함함)와 비-원형 부착 분자들, 및 통상적으로 하나 이상의 추가적인 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합하는 것에 의해 제조된다. 그들의 가장 간단한 형태에서, 그들은 완충 식염수와 같은, 단순한 수성의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 국소 약학적 또는 미용약학적 조성물에 전형적인 다른 성분들, 즉, 피부학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 배지, 즉, 그들이 적용될 조직과 융화될 수 있는 담체, 비히클 또는 매질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "피부학적으로 또는 약학적으로 허용가능한(The term "dermatologically or pharmaceutically acceptable)"은 그와 같이 기술된 조성물 또는 성분들이 과도한 독성, 불화합성(incompatibility), 불안정성, 알레르기 반응, 등 없이 조직들과 접촉에서의 사용 또는 환자에서의 사용을 위해 적합하다는 것을 의미한다. 적합한 경우, 본 발명의 조성물은 고려되는 분야 및 특히, 미용학 및 피부학 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 성분을 포함할 수 있다.
그들의 제형 측면에서, 본 발명의 조성물은 용액, 에멀젼(마이크로에멀젼 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 본 발명의 조성물이 이용될 수 있는 피부 또는 기타 조직으로의 적용을 위해 이용되는 기타 전형적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 보툴리눔 독소 및 비-원형 부착 분자 외에, 그와 같은 제품들에서 일반적으로 이용되는 다른 성분들, 예를 들면, 항균제(antimicrobial), 보습제 및 수화제, 투과제(penetration agent), 보존제, 유화제(emulsifier), 천연 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 디터전트, 겔화제, 연화제(emollient), 항산화제, 방향제, 충진제(filler), 증점제(thickner), 왁스, 탈취제(odor absorber), 염료, 착색제, 분말, 점도 조절제 및 물을 포함하고, 선택적으로 마취제, 항-소양증제(anti-itch actives), 식물 추출물, 컨디셔닝제(conditioning agent), 흑화제(darkening agent) 또는 미백제(lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 운모(mica), 미네랄, 폴리페놀, 실리톤 또는 그의 유도체, 차광제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 보툴리눔 독소 및 비-원형 부착 분자가 캡슐화되거나 또는 시간의 경과에 따라 제어되는 방식으로 피부로 방출되도록 물질 내에 담기는 것인 제어-방출형(controlled- release) 조성물 또는 지속-방출형(sustained-release) 조성물의 제형일 수 있다. 보툴리눔 독소 및 비-원형 부착 분자를 포함하는 조성물은 매트릭스, 리포좀, 소포(vesicle), 마이크로캡슐, 미소구체(microsphere) 및 그 등가물에 포함되거나, 또는 고체 입자형 물질(solid particulate material) 내에 포함되고, 이들 모두는 시간의 경과에 따라 보툴리눔 독소의 방출을 제공하도록 선택되고 및/또는 구축될 수 있다. 보툴리눔 독소 및 비-원형 부착 분자는 함께(예를 들면, 동일한 캡슐 내에) 또는 별개로(별개의 캡슐에) 캡슐화될 수 있다.
보툴리눔 독소는 마비를 일으키거나, 이완을 일으키거나, 수축을 경감시거나, 경련을 예방 또는 경감하거나, 선 배출량(glandular output)을 감소시키거나 또는 기타 원하는 효과를 생성하기 위한 유효량으로, 피부 아래의 근육, 또는 피부 내의 선 구조(glandular structure)에 전달될 수 있다. 이 방식에 의한 보툴리눔 독소의 국소 전달은 주사형 또는 이식형(implantable) 물질에 비해 원하는 효과를 위해 투여량을 감소시키고, 독성을 감소시키며 보다 정확한 투여량 최적화를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 보툴리눔 독소의 유효량이 투여되도록 적용된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유효량(effective amount)"은 원하는 근육 마비 또는 다른 생물학적 또는 심미적 효과를 생성하기에 충분하나, 내재적으로 안전한 양, 즉, 심각한 부작용을 방지할 정도로 충분히 낮은 양인 앞서 정의된 바와 같은 보툴리눔 독소의 양을 의미한다. 원하는 효과는 예를 들면, 미세 라인(fine lines) 및/또는 주름, 특히 안면의 미세 라인 및/또는 주름을 감소시키거나, 또는 눈을 넓히거나, 구각(corner of the mouth)을 높이거나 또는 윗 입술로부터 전개되는 라인을 평탄화하는 것과 같은 다른 방식으로 안면의 외형을 조정하거나, 또는 근육 긴장의 전반적인 완화(general relief)를 목적으로 한 일부 근육의 이완을 포함한다. 마지막에 언급된 효과, 근육 긴장의 전반적인 완화는 얼굴 또는 그 외의 부위에서 일어날 수 있다. 본 발명의 조성물은 단일-투여 치료제로서의 적용을 위한 보툴리눔 독소의 적합한 투여량을 포함하거나, 또는 투여 부위에서 희석을 위해, 또는 복수 적용으로의 사용을 위해 보다 농축된 것일 수 있다. 본 발명의 피부-표적화 비-원형 부착 분자의 이용을 통해, 보툴리눔 독소는 바람직하지 않은 안면 근육 또는 다른 근육 경련, 다한증, 여드름 또는 근육통과 같은 상태 또는 경련의 완화가 바람직한 신체 내의 부위에서의 상태를 치료하기 위해 개체에게 경피적으로 투여될 수 있다. 보툴리눔 독소는 근육 또는 기타 피부-관련 구조로의 경피 전달을 위해 국소로 투여된다. 투여는 예를 들면, 다리, 어깨, 등(허리 포함), 액와, 손바닥, 발, 목, 서혜부(groin), 손등 또는 발등, 팔꿈치, 상완, 무릎, 상지(upper leg), 둔부, 몸체(torso), 골반, 또는 보툴리눔 독소의 투여가 바람직한 신체의 기타 부위로 이루어질 수 있다.
보툴리눔 독소의 투여는 또한 신경통의 치료, 편두통 또는 기타 두통의 예방 또는 경감, 여드름의 예방 또는 경감, 근육긴장이상(dystonia) 또는 근육긴장이상 수축(자각적 또는 임상적)의 예방 또는 경감, 주관적 또는 임상적 다한증과 관련된 증상의 예방 또는 경감, 과다분비 또는 발한의 경감, 면역 반응의 감소 또는 강화, 또는 주사에 의한 보툴리눔 독소의 투여가 제안되거나 또는 수행되는 기타 상태의 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기타 상태를 치료하기 위해 수행될 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 의사 또는 기타 의료 전문가에 의해 또는 그들의 지시 하에 투여된다. 그들은 단일 치료로 또는 시간의 경과에 따라 일련의 정기적인 치료로 투여될 수 있다. 전술된 목적을 위한 보툴리눔 독소의 경피적 전달의 경우, 전술된 바와 같은 조성물은 그 효과가 바람직한 위치 또는 위치들에서 피부에 국소로 적용된다. 그의 속성 때문에, 가장 바람직하게는, 적용된 보툴리눔 독소의 양은 세심하게, 임의의 부작용 또는 바람직하지 않은 결과를 생성하지 않으면서 원하는 효과를 생성할 적용율 및 적용 빈도로 세심하게 적용되어야 한다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 국소 조성물은 피부 표면의 cm2 당 약 1 U 내지 약 20,000 U, 바람직하게는 약 1 U 내지 약 10,000 U 보툴리눔 독소의 비율로 적용되어야 한다. 이 범위 내에서 보다 높은 투여량은 바람직하게는 제어되는 방출 물질과 함께 이용될 수 있거나, 예를 들면, 또는 제거 전에 피부에 보다 짧은 체류 시간(dwell time)이 허용될 수 있다.
본 발명은 또한 피부를 통해 본 명세서에 기재된 보툴리눔 독소 함유 조성물을 전달하는 경피 전달 장치를 포함한다. 그와 같은 장치는 또한 피부 패치와 같이 단순한 구조일 수 있거나, 또는 조성물을 분배하고 조성물의 분배를 모니터링하는 수단, 및 선택적으로 분배되는 물질에 대한 개체의 반응을 모니터링하는 것을 포함한, 하나 이상의 양태에서 개체의 상태를 모니터링하는 수단을 포함하는 보다 복잡한 장치일 수 있다.
일반적으로 및 그와 같은 장치에 담긴 조성물은 그와 같이 미리-제제화되거나(pre-formulate) 또는 상기 장치에 미리-배치될 수 있거나(pre-install), 또는 예를 들면, 적용 시 또는 적용 전에 조합될 두 성분들(보툴리눔 독소 및 비-원형 부착 분자)을 포함하는 키트를 이용하여, 나중에 제조될 수 있다. 비-원형 부착 분자의 양 또는 보툴리눔 독소에 대한 그의 비는 대상이 되는 조성물에서의 사용을 위해 선택된 담체에 의존적일 것이다. 주어진 경우에 담체 분자의 적합한 양 또는 비는 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 실험을 수행하는 것에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 또한 필요로 하는 개체 또는 환자에게 보툴리눔 독소(바람직하게는 감소된 보툴리눔 독소 복합체로서)를 투여하는 방법으로서, 보툴리눔 독소의 유효량은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 부착 분자와 함께 국소로 투여되는 것인 방법을 고려한다. "함께(in conjunction with)"는 두 성분들(보툴리눔 독소 및 부착 분자)이 그들을 개체에 대한 국소 투여 전에 조합하거나 또는 별도로 투여하나, 그들이 유효량의 치료 단백질의 필요한 전달을 제공하기 위해 함께 작용하게 하는 방식으로 투여하는 것을 포함하는, 조합 절차로 투여된다. 예를 들면, 부착 분자를 포함하는 조성물이 개체의 피부에 먼저 적용되고, 뒤이어 보툴리눔 독소를 포함하는 피부 패치 또는 다른 장치가 적용될 수 있다. 보툴리눔 독소는 피부 패치 또는 다른 분배 장치(dispensing device)에 건조된 제형으로 내포될 수 있고 부착 분자는 상기 패치의 적용 전에 피부 표면에 적용되어, 상기 두 성분들이 함께 작용하여 원하는 경피 전달을 달성할 수 있다. 그와 같은 측면에서, 두 성분들(부착 분자 및 보툴리눔 독소)은 조합되어 작용하거나 또는 인 시투(in situ)로 조성물 또는 배합을 형성하기 위해 작용한다. 따라서, 본 발명은 또한 피부를 통해 보툴리눔 독소를 분배하는 장치 및 부착 분자를 포함하고 개체의 피부 또는 상피에 적용하기에 적합한 액체, 겔, 크림, 등을 포함하는 키트를 포함한다. 의료 전문가의 지시에 따라 또는 환자 또는 개체에 의해 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 키트는 또한 그 목적에 적합한 맞춤형 애플리케이터(custom applicator)를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약 4.5 내지 약 6.3 범위의 pH를 갖는 생리적 환경에서 사용하기에 적합하고 따라서 그와 같은 pH를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 실온 또는 냉장 조건 하에서 보관될 수 있다.
하기의 실시예 및 본 명세서에 기재된 구체예는 예시 목적만을 위한 것이고 그들에 근거하여 다양한 변형 또는 변화가 본 발명이 속하는 당업자에게 암시되고 본 출원의 발명 원리 및 범위와 첨부된 청구항의 범위 내에 포함될 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허, 및 특허출원은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예 1. 시알로프로테인을 이용한 인 비보 보툴리눔 독소의 수송.
본 실시예는 단회 투여 후 온전한(intact) 피부를 통해 온전한 표지된 단백질 보툴리눔 독소를 포함하는 큰 복합체를 수송하기 위한 시알로프로테인의 용도를 보여준다.
본 실시예를 위해 A형 보툴리눔 독소의 Botox® 브랜드(Allergan, Irvine, CA)를 선택하였다. 제조사의 설명서에 따라, 보툴리눔 독소를 재구성하였다. 상기 단백질의 분량(aliquot)을 계산된 12배 몰량의 술포-NHS-LC 비오틴(Pierce Chemical, Rockford, HL)으로 비오티닐화시켰다. 분량당 2.0 유닛의 보툴리눔 독소(즉, 총 20 U)와 시알로프로테인을 계산된 4:1의 분자량 비로 균일하게 혼합하고 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)로 200 마이크로리터까지 희석시켰다. 결과적으로 수득된 조성물을 1.8 ml의 Cetaphil® 로션과 균일하게 혼합하고 200 마이크로리터씩 분주하였다.
시알로프로테인을 포함하는 보툴리눔 독소 조성물에 의한 단회 치료 후 경피 전달 효율성을 결정하기 위한 동물 실험:
치료제의 적용 동안 이소플루란의 흡입을 통해 동물들을 마취시켰다. 마취 시킨 후에, C57BLK/6 마우스(n=10)를 대상으로 등 뒷쪽 피부의 두개부(cranial portion of dorsal back skin)(마우스가 입 또는 사지로 이 영역에 닿을 수 없기 때문에 선택됨)에 적용되는 적합한 치료제의 정량된 200 마이크로리터의 국소 적용을 수행하였다. 동물들은 제모시키지 않았다. 최초 치료 30분 후에, CO2의 흡입에 의해 마우스를 안락사시키고, 처리된 피부 세그먼트를 맹검 관찰자(blind obserber)에 의해 전층(full thickness)으로 채취하였다. 처리된 세그먼트들을 세개의 동일한 부분으로 나누었다; 두개부를 12-16시간 동안 10% 중성의 완충된 포르말린에서 고정시키고 파라핀 포매(paraffin embedding) 전까지 70% 에탄올에 보관하였다. 중앙 부분을 급속-동결(snap-frozen)시키고 하기에 요약된 바와 같이 맹검 관찰자에 의해 비오틴 가시화(biotin visualizaiton)를 위해 직접 이용하였다. 처리된 꼬리 세그먼트를 용해화(solubilization) 연구를 위해 급속-동결시켰다.
비오틴 가시화를 하기와 같이 수행하였다. 요약하면, 각 섹션을 1시간 동안 실온에서 NeutrAvidin® (Pierce Biotechnology, Rockford, EL) 완충액에 침지시켰다. 알칼리 포스파타아제 활성을 가시화시키기 위해, 단면을 식염수로 4회 세척하고 그 후 약 1시간 동안 NBT BCIP (Pierce Biotechnology)에 침지시켰다. 그 후, 단편들을 염수로 세정하고 플랜-아포크로매트(plan-apochromat) 렌즈로 Nikon E600 현미경에서 전체를 사진으로 촬영하였다. Image Pro Plus 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 이용한 배치 이미지 분석(batch image analysis)을 통해 맹검 관찰자에 의해 전체 양성 염색(total positive staining)을 결정하고, 총 단면적으로 정규화시켜 각각에 대해 퍼센트 양성 염색을 결정하였다. 뒤이어 각 그룹에 대해 Statview 소프트웨어(Abacus, Berkeley, CA)를 이용하여 일원 ANOVA(one way ANOVA) 반복 측정에서 95% 신뢰 수준의 유의성 분석으로 평균 및 표준편차를 결정하였다. 결과는 시알로프로테인이 온전한 피부의 마우스 모델에서 국소 투여 후 보툴리눔 독소의 효율적인 전달을 가능하게 한다는 것을 입증했다.
실시예 2. 안면 주름을 치료하기 위해 경피적으로 투여되는 보툴리눔 독소.
여성은 그녀의 윗 입술의 좌측으로부터 전개된 미세한 라인을 감소시키기를 원했다. 1 유닛의 A형 보툴리눔 독소, 0.01 mg의 시알로프로테인을 포함하고, 비-독소 단백질 및 알부민을 본질적으로 포함하지 않는 조성물을 함유한 경피 패치를 미세 라인을 포함하는 얼굴의 부위에 적용하였다. 상기 패치는 상기 개체가 수면하는 야간에만 적용하였다. 1-7일 내에, 미세 라인의 외양이 크게 감소되었다. 이 유용한 효과는 상기 패치의 연속적인 적용으로 지속되었다. 동물-유래 알부민 또는 젤라틴의 불포함의 결과 감소된 항원성은 보툴리눔 독소 조성물의 반복적인 사용을 가능하게 한다.

Claims (16)

  1. 보툴리눔 독소; 및 시알로프로테인(sialoprotein)을 포함하는 보툴리눔 독소의 경피 전달용 조성물로서,
    상기 시알로프로테인은 상기 보툴리눔 독소와 비-공유결합성 복합체를 형성하고,
    상기 시알로프로테인은 골 시알로프로테인 I, 골 시알로프로테인 II, 및 포도칼릭신으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 골 시알로프로테인 I, 골 시알로프로테인 II, 또는 포도칼릭신은 상기 조성물 내에 상기 보툴리눔 독소의 유닛당 0.1 ng 내지 1.0 mg의 양으로 존재하는 것인 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 안정제를 더 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 상기 보툴리눔 독소와 결합된 헤마글루티닌 단백질, 또는 비-독소, 비-헤마글루티닌 단백질(non-toxin, non-hemagglutinin protein)을 더 포함하고, 상기 헤마글루티닌 단백질 또는 비-독소, 비-헤마글루티닌 단백질은 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)으로부터 직접 추출된 천연 보툴리눔 독소 복합체에 존재하는 헤마글루티닌 단백질 또는 비-독소, 비-헤마글루티닌 단백질의 양보다 적은 양으로 존재하는 것인 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 안정제는 알부민인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 유도체, 재조합 보툴리눔 독소, 변형된 보툴리눔 독소, A형 보툴리눔 독소, B형 보툴리눔 독소, C형 보툴리눔 독소, D형 보툴리눔 독소, E형 보툴리눔 독소, F형 보툴리눔 독소, 및 G형 보툴리눔 독소로 구성된 군으로부터 선택된 보툴리눔 독소인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 필요로 하는 부위의 온전한 피부(intact skin)에 국소로 적용되는 것인 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 안면, 액와(auxilla), 손바닥, 발, 허리, 목, 다리, 서혜부(groin), 팔, 팔꿈치, 무릎, 골반, 둔부(buttocks) 및 몸체(torso)로 구성된 군으로부터 선택된 부위에 적용되는 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 시알로프로테인은 골 시알로프로테인 I인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 시알로프로테인은 골 시알로프로테인 II인 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 시알로프로테인은 포도칼릭신인 것인 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 근육 경련, 임상적 또는 주관적 다한증, 여드름, 통증, 임상적 또는 주관적 근육긴장이상, 과다분비, 주름, 및 원치않는 면역 반응(undesired immune response)으로 구성된 군으로부터 선택된 상태를 치료하기 위해 이용되는 것인 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 상태는 여드름인 것인 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 상태는 다한증인 것인 조성물.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 상태는 주름인 것인 조성물.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 상태는 통증인 것인 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 통증은 두통인 것인 조성물.
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