JP6050401B2 - 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ - Google Patents
免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP6050401B2 JP6050401B2 JP2015028972A JP2015028972A JP6050401B2 JP 6050401 B2 JP6050401 B2 JP 6050401B2 JP 2015028972 A JP2015028972 A JP 2015028972A JP 2015028972 A JP2015028972 A JP 2015028972A JP 6050401 B2 JP6050401 B2 JP 6050401B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- snap
- bont
- antibody
- less
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims description 797
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 99
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims description 49
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 82
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 title description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 408
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 405
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 241
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 234
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 171
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 171
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 156
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 85
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 77
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 62
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 58
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 52
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 37
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 37
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 36
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 34
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 28
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 claims description 27
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 claims description 27
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 23
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 23
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 21
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 102000004183 Synaptosomal-Associated Protein 25 Human genes 0.000 claims 9
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 claims 9
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 776
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 548
- 239000000047 product Substances 0.000 description 202
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 136
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 136
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 135
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 82
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 68
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 67
- 239000000306 component Substances 0.000 description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 56
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 47
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 33
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 33
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 33
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 30
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 30
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 30
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 27
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 27
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 27
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 26
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 26
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 25
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 24
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 24
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 24
- 101000584505 Homo sapiens Synaptic vesicle glycoprotein 2A Proteins 0.000 description 24
- 102100030701 Synaptic vesicle glycoprotein 2A Human genes 0.000 description 24
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 24
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 24
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 24
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 23
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 23
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 23
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 23
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 22
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 22
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 22
- 231100001102 clostridial toxin Toxicity 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 21
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 19
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 19
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 19
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 19
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 19
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 18
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 17
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 17
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 16
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 15
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 14
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 13
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 13
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 13
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 13
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 12
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 12
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 12
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 12
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 12
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 12
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 11
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 11
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 11
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 11
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 10
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- -1 saponins Sapogenin glycosides Chemical class 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 9
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 9
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000006384 Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010019040 Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 8
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 102000005917 R-SNARE Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010005730 R-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 7
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 7
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 6
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 6
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 6
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 6
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 6
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 6
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 6
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 6
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 6
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 6
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 5
- 101000652315 Homo sapiens Synaptosomal-associated protein 25 Proteins 0.000 description 5
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 5
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 5
- 102000053886 human SNAP25 Human genes 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 4
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 4
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 4
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 4
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 4
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 4
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 4
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 108010024001 incobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 210000003568 synaptosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- 230000024033 toxin binding Effects 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 229940018272 xeomin Drugs 0.000 description 4
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 230000011215 vesicle docking Effects 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 2
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003737 chromaffin cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000018197 inherited torticollis Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 2
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.OCC(N)(CO)CO CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108700027766 Listeria monocytogenes hlyA Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010028836 Neck pain Diseases 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N O.O.O.[Al] Chemical compound O.O.O.[Al] MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710084143 Synaptic vesicle glycoprotein 2C Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000251735 Torpedo marmorata Species 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 102000036861 Zinc-dependent endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091006982 Zinc-dependent endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 1
- 230000036617 axillary hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010069038 botulinum toxin type F Proteins 0.000 description 1
- 229940094657 botulinum toxin type a Drugs 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012512 bulk drug substance Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940073579 ethanolamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000012953 feeding on blood of other organism Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- LEZNRPFLOGYEIO-QSEDPUOVSA-N ganglioside GT1b Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@]4(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C4)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 LEZNRPFLOGYEIO-QSEDPUOVSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091008147 housekeeping proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 229960003248 mifepristone Drugs 0.000 description 1
- VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N mifepristone Chemical compound C1([C@@H]2C3=C4CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(C2)C)(O)C#CC)=CC=C(N(C)C)C=C1 VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N monoethanolamine hydrochloride Natural products NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 229940112646 myobloc Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000004007 neuromodulation Effects 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000003322 phosphorimaging Methods 0.000 description 1
- 210000003105 phrenic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108010074523 rimabotulinumtoxinB Proteins 0.000 description 1
- YAYGSLOSTXKUBW-UHFFFAOYSA-N ruthenium(2+) Chemical compound [Ru+2] YAYGSLOSTXKUBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001590 sorbitan monolaureate Substances 0.000 description 1
- 235000011067 sorbitan monolaureate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000008280 toxic mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
- C07K14/10—Hepatitis A virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/952—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
Description
〔1〕a.確立された細胞株からの細胞をBoNT/Aを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞は500pM以下のBoNT/AによるBoNT/A中毒に感受性が高い;
b.処理された細胞からBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなるSNAP−25構成要素を単離すること;
c.SNAP−25構成要素を固相支持体に連結されたα−SNAP−25抗体と接触させること、
ここでα−SNAP−25抗体はSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、α−SNAP−25抗体はインタクトなSNAP−25に関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そしてα−SNAP−25抗体はエピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有し、かつ
(i)該α−SNAP−25抗体は配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:80もしくは配列番号:82に示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなるか、または
(ii)該α−SNAP−25抗体は配列番号:100、配列番号:101もしくは配列番号:102に示されるアミノ酸配列からなるVHCDR3を含んでなる;
d.α−SNAP−25抗体およびBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること、
ここで抗体−抗原複合体による検出はBoNT/A活性を示す;
の工程を含んでなるBoNT/A活性を検出する方法、
〔2〕a.α−BoNT/A中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にBoNT/Aを添加すること;
b.確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はBoNT/A中毒に感受性が高い;
c.処理された細胞からBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなるSNAP−25構成要素を単離すること;
d.SNAP−25構成要素を固相支持体に連結されたα−SNAP−25抗体に接触させること、
ここでα−SNAP−25抗体はSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、α−SNAP−25抗体はインタクトなSNAP−25に関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そしてα−SNAP−25抗体はそのエピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有し、かつ
(i)該α−SNAP−25抗体は配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:80もしくは配列番号:82に示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなるか、または
(ii)該α−SNAP−25抗体は配列番号:100、配列番号:101もしくは配列番号:102に示されるアミノ酸配列からなるVHCDR3を含んでなる;
e.α−SNAP−25抗体およびBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること;
f.被験試料の代わりに陰性対照試料で工程b−eを繰り返すこと、ここで陰性対照試料はBoNT/A、およびα−BoNT/A中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる;ならびに
g.工程eで検出された抗体−抗原複合体の量を工程fで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、
ここで工程fで検出された抗体−抗原複合体の量に対して工程eで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−BoNT/A中和抗体の存在を示す;
の工程を含んでなる哺乳動物におけるBoNT/A免疫抵抗性を決定する方法、
〔3〕SNAP−25切断生成物がSNAP−25197である〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔4〕抗体−抗原複合体の存在がサンドイッチELISAを使用して検出される〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕検出の下限で方法において検出されるシグナル:バックグラウンドシグナルが少なくとも3:1であり、検出の上限で方法において検出されるシグナル:バックグラウンドシグナルが少なくとも10:1である〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔6〕試料が多くても100pMのBoNT/Aを含んでなる〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法、
〔7〕確立された細胞株からの細胞が100pM以下のBoNT/AによるBoNT/A中毒に感受性が高い〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法、
〔8〕方法がシングルプレックス様式またはマルチプレックス様式で実施される〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法、
〔9〕担体、可動性リンカーおよびSNAP−25抗原を含んでなる組成物であって、ここで、該担体、該可動性リンカーおよび該SNAP−25抗原は前述の順序で連結されており、可動性リンカーは少なくとも3個のアミノ酸を含んでなり、SNAP−25抗原は配列番号:148、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、または配列番号:37に示されるアミノ酸配列を含んでなる、組成物、
〔10〕可動性リンカーおよびSNAP−25抗原のアミノ酸配列が配列番号:38に示されるアミノ酸配列からなる、〔9〕に記載の組成物、
〔11〕BoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物に対する免疫応答の誘発における使用のための、〔9〕または〔10〕に記載の組成物、
〔12〕単離されたα−SNAP−25抗体がSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し;
α−SNAP−25抗体がインタクトなSNAP−25に関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そして
α−SNAP−25抗体がそのエピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有する、
単離されたα−SNAP−25抗体、
〔13〕エピトープが配列番号:32に示されるアミノ酸配列を含んでなる、〔12〕に記載の単離されたα−SNAP−25抗体、
〔14〕配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:80または配列番号:82に示されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる、単離されたα−SNAP−25抗体、
〔15〕配列番号:100、配列番号:101または配列番号:102に示されるアミノ酸配列からなるVHCDR3を含んでなる単離されたα−SNAP−25抗体、
〔16〕〔12〕〜〔15〕のいずれかに記載の単離されたα−SNAP−25抗体を含んでなる、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法における使用のための組成物
に関する。
本明細書は試料中の活性なBoNT/Aの存在または不在を決定するため、およびBoNT/A調製物の活性/効力を決定するための新規アッセイを提供する。本明細書にて開示される新規の細胞基盤のアッセイは、アッセイが試料中のピコモル濃度量のBoNT/Aを検出することを可能にする細胞、試薬および検出方法に頼る。本明細書に開示される細胞基盤のアッセイは動物毒性研究に関する必要性を低減し、しかも多機能BoNT/A、すなわち毒素の結合および細胞取り込み、細胞サイトゾルへの転位置、およびプロテアーゼ活性を分析するのに役立つ。さらに後記で論じるように、新規方法および組成物は粗製およびバルク試料ならびに高度に精製された二鎖毒素および処方された毒素生成物を分析するために使用することができ、そしてさらに自動ハイスループットアッセイ形式で扱いやすい。
1. BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に連結された可動性リンカーに連結された担体を含んでなる組成物。
以下の実施例はBoNT/A中毒に感受性が高い、または本明細書に開示されるBoNT/A活性を検出する方法に必要なBoNT/A取り込み受容力を有する確立された細胞株を同定する仕方を例証する。
1. 候補細胞株のストック培養物の成長
細胞株を成長させるために、試験中の細胞株からの適当な密度の細胞を適当な成長培地30mL(表1参照)を含有する162cm2の組織培養フラスコに蒔き、そして37℃のインキュベーター中5%または10%二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで成長させた。
細胞基盤のアッセイの感度を改善するために試験される1つのパラメーターは、クロストリジウム神経毒を取り込み、そして基質表面に接着する良好な受容力を呈する適当な細胞株を同定することであった。最初に細胞株を、1nM BoNT/Aを取り込むその能力および表面に付着するその能力に関して試験した。細胞株が1nM BoNT/Aを取り込むことができるかどうかを決定するために、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、適切な血清成長培地(表1)1mLを含有する24ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた播種した。細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで成長させた(およそ18から24時間)。成長培地を各ウェルから吸引し、そして1)毒素を含有しない新鮮成長培地(未処理細胞株)または2)1nM BoNT/A複合体を含有する新鮮成長培地(処置細胞株)のいずれかで置き換えた。一晩インキュベートした後、成長培地を吸引し、そして各ウェルを1×PBS 200μLで濯ぐことにより細胞を洗浄した。細胞を採取するために、1×PBSを吸引し、2×SDS負荷バッファー50μLを添加することにより細胞を溶解し、ライゼートを清浄な試験管に移し、そして試料を95℃まで5分間加熱した。
以下の実施例は、BoNT/A中毒に感受性が高いかまたはBoNT/A取り込み受容力を有していることを最大化する確立された細胞株のための成長条件の決定の仕方を例証する。
1. 候補細胞株の神経毒取り込みに及ぼす細胞分化の効果
細胞分化が神経毒取り込みを改善したかどうかを決定するために、1nM BoNT/Aの取り込みを呈する細胞株を血清不含培地に移して分化を誘起した。試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを伴う最小必須培地を含有する血清不含培地1mLを含有する24ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ2から3日)インキュベートした。対照として、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を適切な成長培地(表1)1mLを含有する24ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの未分化対照細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、細胞が望ましい密度に到達するまで(およそ18から24時間)成長させた。分化型および未分化型対照培養物の双方からの培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)、0.1nM、0.3nMまたは1nM BoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩インキュベートした後、実施例1に記載されるように細胞を洗浄し、そして採取した。
神経毒の低アフィニティー結合を改善する処理が神経毒取り込みを改善するかどうかを決定するために、1nM BoNT/Aの取り込みを呈する分化型細胞株をガングリオシドGT1bで処理した。試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、25μg/mL GT1b(Alexis Biochemicals, San Diego, CA)を伴うかまたは伴わない前記されたような血清不含培地を含有する24ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、前記されたような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまでインキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)、1.9pM、3.7pM、7.4pM、14.8pM、29.7pM、59.4pM、118.8pM、237.5pM、574pM、950pMおよび1900pMのBoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮血清不含培地で置き換えた。細胞株を24時間および48時間の2つの異なる時間でインキュベートした。毒素のインキュベーションの後、実施例1に記載されるように細胞を洗浄し、そして採取した。
細胞分化を誘起する処置改善が神経毒取り込みを改善できるかどうかを決定するために、SiMa、Neuro−2aおよびPC12細胞株を種々の血清不含培地中で成長させて分化を誘起した。試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、種々の被験血清不含培地1mLを含有する24ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。試験されたパラメーターは1)BoNT/A取り込みに及ぼす異なる基礎培地の効果(MEMおよびRPMI1649);2)BoNT/A取り込みに及ぼす神経栄養因子の存在または不在の効果(N2サプリメントおよびB27サプリメント);3)BoNT/A取り込みに及ぼす分化因子の存在または不在の効果(レチノイン酸および神経成長因子);および4)BoNT/A取り込みに及ぼす血清の存在または不在の効果(血清不含培地および血清使用量低減培地)であった。対照として、試験中の細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を対照血清不含培地(最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン)1mLを含有する24ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ2から3日)インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)、0.005pM、0.015pM、0.05pM、0.14pM、0.42pM、1.2pM、3.7pM、11pM、33pM、100pMおよび300pMのBoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮血清不含培地で置き換えた。加えて、分化型細胞をBoNT/Aで24時間処理し、続いて培地交換し、そして新鮮培地中毒素を伴わずに48時間インキュベートしてSNAP−25切断生成物の蓄積を可能にした。次いで実施例1に記載されるように細胞を洗浄し、そして採取した。
以下の実施例はBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25エピトープに選択的に結合することができるα−SNAP−25モノクローナル抗体の作成の仕方を例証する。
1. α−SNAP−25モノクローナル抗体の作成
SNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合からのP1残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するモノクローナルα−SNAP−25抗体を開発するために、13−残基ペプチドCDSNKTRIDEANQCOOH(配列番号:38)をSNAP−25切断生成物抗原として設計した。このペプチドは可動性リンカー領域ならびにKLHおよびカルボキシル化されたC末端グルタミン(配列番号:38)を伴うヒトSNAP−25(配列番号:5)のアミノ酸186−197に抱合するためのN末端システイン残基を含んでなる。選び抜かれた、独特なペプチド配列に対するモノクローナル抗体の作成により、密接に関係するアイソフォームのプールの中でタンパク質の特定の亜集団の同定を可能にするエピトープが制御される。Blast検索により、このペプチドがSNAP−25に対してのみ高い相同性を有し、そしてニューロン細胞においてその他のタンパク質との交差反応性の可能性がほとんどないことが示された。またコンピューターアルゴリズムを利用することにより配列を注意深く精査して、疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可動性の領域および好ましい二次構造、続いて選ばれたペプチド配列の相応しい配向および提示を決定した。ペプチドを合成し、そしてキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に抱合させて免疫原性を増大した。6匹のBalb/cマウスをこのペプチドで免疫し、そして約8週のうちに3回の免疫の後、マウスを試験のために出血させた。4℃で60分間インキュベートすることにより血液を凝固させた。凝固した血液を10,000×g、4℃で10分間遠心して細胞デブリをペレット化した。得られた血清を50μLアリコートに分注し、そして必要になるまで−20℃で保存した。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25モノクローナル抗体の存在を決定するために、抽出されたマウス血清を使用して比較ELISAおよび細胞基盤の切断アッセイを実施した。比較ELISAのために、2つの融合タンパク質を構築した:配列番号:48のBirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−197および配列番号:49のBirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−206。BirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−197は、配列番号:5のアミノ酸134−197を含んでなるSNAP−25ペプチドにアミノ末端で連結された配列番号:50の天然ビオチン化16アミノ酸BirAペプチドを含んでなった。BirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−206は配列番号:5のアミノ酸134−206を含んでなるSNAP−25ペプチドにアミノ末端で連結された配列番号:50の天然ビオチン化16アミノ酸BirAペプチドを含んでなった。これらの2つの基質を1×PBSに10μg/mL BirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−197およびBirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−206の濃度で懸濁した。適切な基質溶液およそ100μLを添加することにより、BirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−197およびBirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−206を別個のプレートにコーティングし、そしてプレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄されたプレートを、6匹の免疫マウス(マウス1、マウス2、マウス3、マウス4、マウス5およびマウス6)のうちの1匹から誘導された抗体含有血清の1:10から1:100希釈を含有する1×TBS中0.5%BSA中、37℃で1時間インキュベートした。一次抗体でプロービングされたプレートをTBS、0.1%TWEEN−20(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレアート)200μL中、各回5分間で4回洗浄した。洗浄されたプレートを、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合されたヤギポリクローナル抗マウスIgG抗体(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)の1:10,000希釈を含有する1×TBS中、37℃で1時間インキュベートした。二次抗体でプロービングされたプレートをTBS、0.1%TWEEN−20(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレアート)200μL中4回洗浄した。標識SNAP−25生成物の発色検出をImmunoPure TMB基質キット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を使用する発色検出により可視化した。BirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−197コーティングされたプレートは黄色を発色したが、BirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−206コーティングされたプレートは発色せず、それによりα−SNAP−25抗体がSNAP−25197切断生成物を優先的に認識することが示された。結果により、免疫に使用された6匹のマウスのうち3匹のマウス(マウス2、マウス3およびマウス4)がより高い力価およびBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に対するさらなる特異性を有した。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを作成するために、最終の「ブースター」免疫に引き続いて3日にマウス2から脾臓を採取し、そして標準的なハイブリドーマプロトコールを用いて脾臓細胞を骨髄腫細胞P3−X63 Ag8.653と融合させた。これらの細胞を5つの96ウェルプレートに蒔き、そしてHAT培地を使用してハイブリッドを選択した。融合後8−14日内に2つの別個のプレートにコーティングされたBirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−197およびBirA−HisTag(登録商標)−SNAP−25134−206ペプチドを伴う比較ELISAを用いておよそ480の親クローンの最初のスクリーニングを実施した。比較ELISAにより、切断されたSNAP−25197に特異的な抗体を生成するハイブリドーマを同定するための迅速なスクリーニング方法が提供された。上位18個のクローンを、前記された細胞基盤の切断アッセイを用いるさらなるスクリーニングおよびLC/Aトランスフェクトされた細胞の免疫染色に供した(表7)。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25モノクローナル抗体の結合特異性を評価するために、クローン1D3B8、1G10A12、2C9B10、2E2A6、2F11B6、3C1A5および3C3E2由来の腹水を使用して、細胞基盤の活性アッセイ、免疫細胞化学および免疫沈降を用いてSNAP−25切断生成物を検出した。
SNAP−25197切断生成物またはSNAP−25206未切断基質のいずれかに関して高い結合特異性を示すα−SNAP−25モノクローナル抗体の結合アフィニティーを決定するために、BIAcore 3000装置でカルボキシメチルデキストラン(CM5)センサーチップ(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用して結合アフィニティーアッセイを実施した。10mM HEPES(pH7.4)、150mM塩化ナトリウム、3mM EDTA、0.005%(容量/容量)界面活性剤P20を含んでなるHBS−EPバッファーで、25℃、流速10μL/分で実行した。配列番号:5のアミノ酸134−197(SNAP−25134−197)または配列番号:5のアミノ酸134−206(SNAP−25134−206)を含んでなるSNAP−25ペプチドを標準的なアミン結合を用いてCM5センサーチップの表面に共有結合により付着させた。簡単には、0.2M 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドおよび0.05M N−ヒドロキシスクシイミドの混合物の7分注入によりCM5チップを活性化し;次いでSNAP−25ペプチドを10mM酢酸ナトリウム(pH4.0)中、流速10μL/分で20分注入し;そして未反応のスクシイミドエステルを1M塩酸エタノールアミン(pH8.5)の7分注入により遮断した。チップ上に固定されたSNAP−25134−197またはSNAP−25134−206の量は応答単位の100−150増大(約0.10−0.15ng/mm2)により反映された。クローン1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5および3C3E2から生成された腹水または精製されたモノクローナル抗体のいずれかを含んでなる抗体試料、ならびに市販により入手可能なα−SNAP−25抗体を、CM5チップの表面上を通過させて、会合時間10分および解離時間20分を可能にした。10mMグリシン−HCl(pH2.5)の流速15μL/分の1分注入による実行の間に表面を再生した。センサーグラム曲線はBIAevaluation3.0ソフトウェアを用いて1:1動力学的結合モデルに適合した。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができる、単離されたα−SNAP−25モノクローナル抗体のエピトープを決定するために、ハイブリドーマ1D3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5および3C3E2により生成されるα−SNAP−25モノクローナル抗体の可変重(VH)および可変軽(VL)鎖をコードするポリヌクレオチド分子をシークエンシングした。標準的なプロトコールを用いて各ハイブリドーマからmRNAを抽出および精製し、そしてオリゴdTアンチセンスプライマーまたは遺伝子特異的(ネズミIgG1 CHおよびカッパCL)アンチセンスプライマーのいずれかを使用してcDNAに逆転写した。cDNA生成の後、特異的なネズミおよびヒト定常ドメインプライマーを使用してPCRによりcDNAを増幅して抗体のアイソタイプを決定した。VHおよびVL縮重プライマーを使用してcDNAから可変ドメインを増幅した。5’RACEのために、ホモポリマーdCTPテールをcDNAの3’末端に付加した。次いでオリゴdGセンスプライマーおよび遺伝子特異的(CH/KC)アンチセンスプライマーを用いて重および軽鎖を増幅した。PCR生成物にはアンチセンスプライマーまでにシグナルペプチド、可変ドメインおよび定常ドメインの配列が含まれた。PCR生成物をゲル精製して小型フラグメントを除去し、そしてシークエンシングのためにブラントまたはTAベクターにクローン化した。各鎖に関して5つの独立したクローンをシークエンシングし、そしてVHおよびVL鎖のアラインメントおよびコンセンサス配列を決定した(表10)。VHおよびVLアミノ酸配列を決定するために用いられた方法は例えば「新規生理活性脂質誘導体ならびに同一物を作成および使用する方法」Roger A. Sabbadiniら、米国特許出願公開第2007/0281320号;および「ファージ抗体ライブラリーを使用することにより評価されるようなボツリヌス神経毒A型結合ドメインに対するネズミ体液性免疫応答の分子特徴付け」Peter Amersdorfer, et al., Infect. Immun. 65(9):3743−3752(その各々をその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする)に記載される。加えて抗体の可変重(VH)および可変軽(VL)鎖をシークエンシングし、そしてCDR領域を同定するために商業用サービスを利用でき、例えばFusion Antibodies Ltd., Northern Irelandを参照されたい。
以下の実施例はBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25エピトープに選択的に結合することができるα−SNAP−25ポリクローナル抗体の作成の仕方を例証する。
SNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合からのP1残基でカルボキシル末端を含んでなるエピトープに結合するα−SNAP−25ポリクローナル抗体を開発するために、10−残基ペプチドCGGGRIDEANQ(配列番号:46)をSNAP−25切断生成物抗原として設計した。このペプチドはKLHに抱合するためのN末端システイン残基、ヒトSNAP−25(配列番号:5)のアミノ酸191−197に連結された可動性スペーサーであるGスペーサー(GGG)を含んでなり、そしてカルボキシル化されたC末端グルタミンを有する。Blast検索により、このペプチドがSNAP−25に対してのみ高い相同性を有し、そしてニューロン細胞においてその他のタンパク質との交差反応性の可能性がほとんどないことが示された。またコンピューターアルゴリズムを利用することにより配列を注意深く精査して、疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可動性の領域および好ましい二次構造、続いて選ばれたペプチド配列の相応しい配向および提示を決定した。ペプチドを合成し、そしてキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に抱合させて免疫原性を増大した。動物を免疫する前に、細胞ライゼートに存在するタンパク質に対して免疫反応性を有さなかった動物を同定するために、ナイーブなウサギを最初に候補細胞株からの細胞ライゼートに対してウェスタンブロットでスクリーニングした。2匹のプレスクリーニングされたウサギをこのペプチドで免疫し、そして約8週のうちに3回の免疫の後、ウサギを試験のために出血させた。4℃で60分間インキュベートすることにより血液を凝固させた。凝固した血液を10,000×g、4℃で10分間遠心して細胞デブリをペレット化した。得られた血清試料を50μLアリコートに分注し、そして必要になるまで−20℃で保存した。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25ポリクローナル抗体の存在を決定するために、実施例3に記載されるように抽出されたウサギ血清を使用して比較ELISAおよび細胞基盤の切断アッセイを実施した。双方のウサギからの血清はBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25ポリクローナル抗体を含有した。α−SNAP−25ウサギポリクローナル抗体をNTP22およびNTP23と称した。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25ポリクローナル抗体を精製するために、配列番号:46のSNAP−25抗原を含有するアフィニティーカラムを使用して、ウサギ血清からNTP22およびNTP23抗体を精製した。
BoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25抗原に選択的に結合することができるα−SNAP−25ポリクローナル抗体の結合特異性を評価するために、実施例3に記載されるように細胞基盤の活性アッセイ、免疫細胞化学および免疫沈降を用いて精製されたNTP22およびNTP23 α−SNAP−25ポリクローナル抗体を使用して切断生成物を検出した。細胞基盤の切断アッセイ、免疫細胞化学分析および免疫沈降分析全てにより、NTP22およびNTP23 α−SNAP−25ポリクローナル抗体が未切断SNAP−25と交差反応しないことが示された。故にNTP22およびNTP23の双方がSNAP−25197切断生成物に関して高い結合特異性を有し、SNAP−25206未切断基質に相対してこの切断生成物の優先的な認識を可能にする。実施例3に記載されるようにBiAcoreにおいてSPRを用いて抗原に関するアフィニティーを決定することができる。
以下の実施例はBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25に特異的なα−SNAP−25モノクローナル抗体を使用してSNAP−25切断生成物を検出することにより、BoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法を行うために有用なサンドイッチELISAを実施するために必要な構成要素および条件を同定および調製する仕方を例証する。
1. BoNT/Aで処理された細胞からの細胞ライゼートの調製
分析用のBoNT/A処理された細胞ライゼートを得るために、Neuro−2aのストック培養物から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESを含有する血清不含培地50mLを含有するT175フラスコに播種した。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ2から3日)インキュベートした。対照として、Neuro−2aのストック培養物から適当な密度の細胞を適切な成長培地(表1)50mLを含有するT175フラスコに播種した。これらの未分化対照細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、細胞が50%コンフルエンスに到達するまで(およそ18時間)成長させた。分化型および未分化型対照培養物の双方からの培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)または10nM BoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄し、そして新たに調製されたTriton X−100溶解バッファー(50mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%Triton X−100)中4℃で30分間一定の攪拌を行いながら溶解することにより細胞を採取した。溶解した細胞を4000rpm、4℃で20分間遠心して、ベンチトップ遠心を使用してデブリを排除した。細胞ライゼートのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定した。
適切な捕捉抗体−検出抗体対を同定するために、11個の異なるα−SNAP−25捕捉抗体および7個の異なるα−SNAP−25検出抗体を含んでなる26個の異なる組み合わせの捕捉および検出抗体対でECLサンドイッチELISA分析を行った(表12)。使用したα−SNAP−25抗体は、本明細書において開示される2E2A6および3C1A5 α−SNAP−25マウスモノクローナル抗体、本明細書において開示されるSMI−81、MC−6050およびMC−6053 α−SNAP−25マウスモノクローナル抗体、本明細書において開示されるNTP23 α−SNAP−25ウサギポリクローナル抗体、S9684 α−SNAP−25ウサギポリクローナル抗体(Sigma, St. Louis, MO)、H−50 α−SNAP−25ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)、C−18 α−SNAP−25ヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)、N−19 α−SNAP−25ヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)、ならびにSP12 α−SNAP−25マウスポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)であった。
サンドイッチELISA検出系を用いる場合にBoNT/A中毒に感受性が高い細胞を含んでなる細胞株に関する最適な分化条件を決定するために、種々の細胞培養培地および分化時間の長さの双方を試験した。
最適な分化培地を決定するために、SiMa細胞株から適当な密度の細胞を、以下の培地および分化サプリメント:1)RPMI1640、10%ウシ胎仔血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、2mM L−グルタミンおよび25μg/mL GT1b);2)RPMI−1640、1×B27サプリメント、1×N2サプリメントおよび25μg/mL GT1b;3)最小必須培地、1×B27サプリメント、1×N2サプリメントおよび25μg/mL GT1b;ならびに4)RPMI−1640、10%BSA、1×N2サプリメント、1×NGFサプリメントおよび25μg/mL GT1b;のうちの1つを1mL含有する、IV型コラーゲンでコーティングされた24ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ3日)インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)、0.2pM、2pMまたは20pM BoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。一晩処理した後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに2日間インキュベートしてSNAP−25基質の切断を可能にし、そしてセクション1にて前記されたように採取した。細胞ライゼートのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより測定した。ECLサンドイッチELISA分析によるSNAP−25切断生成物の存在の検出を、第1抗体対を使用して前記されたように実施した。実施例1にて論じられたように、未分化型細胞は分化型細胞ほど効果的に毒素を取り込まなかった。BoNT/A取り込みおよび結果的にSNAP−25切断を増大するために最も効果的な分化培地は培地3(MEM+N2+B27)、続いて培地2(RPMI−1640+N2+B27)、および培地4(RPMI−1640+N2+NGF+BSA)(図3)。培地2中で培養された細胞は、その他の培地と比較して、SNAP−25のさらなる切断を招いた。
BoNT/Aで処理される必要のある細胞株からの細胞に最適な時間の長さを決定するために、種々の長さのBoNT/A処理時間を試験した。SiMa細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESおよび25μg/mL GT1bを含有する血清不含培地100μLを含有する、ポリ−D−リジンコーティングされた96ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を蒔き、そして37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ3日)インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そしてRPMI1640成長培地中0(未処理試料)、0.1pM、0.2pM、0.4pM、0.8pM、1.6pM、3.1pM、6.3pM、12.5pMまたは25pM BoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮培地で3検体ずつ置き換えて、全用量−応答を作成した。5つの異なる長さのBoNT/A処理計画を実施した:1)BoNT/A 6時間処理、細胞の除去および洗浄、BoNT/Aを伴わずに18時間の細胞のインキュベーション、ならびにセクション1にて前記されたような細胞の採取;2)BoNT/A 24時間処理、細胞の除去および洗浄、ならびにセクション1にて前記されたような細胞の採取;3)BoNT/A 24時間処理、細胞の除去および洗浄、BoNT/Aを伴わずに24時間の細胞のインキュベーション、ならびにセクション1にて前記されたような細胞の採取;4)BoNT/A 24時間インキュベーション、細胞の除去および洗浄、BoNT/Aを伴わずに48時間の細胞のインキュベーション、ならびにセクション1にて前記されたような細胞の採取;ならびに5)BoNT/A 24時間インキュベーション、細胞の除去および洗浄、BoNT/Aを伴わずに72時間の細胞インキュベーション、ならびにセクション1にて前記されたような細胞の採取。採取した後、細胞ライゼートのタンパク質濃度、ECLサンドイッチELISAによるSNAP−25切断生成物の検出を実施し、そして前記されたようにEC50を計算した。結果により、試験されたいずれかのBoNT/A処理で2pM未満のEC50値を達成できることが示される(図5)。興味深いことに、24時間+24時間、24時間+48時間および24時間+73時間のBoNT/A処理計画により本質的に同じEC50値、各々1.0pM、1.1pMおよび0.9pMを生じた。6時間+18時間および24時間+0時間のBoNT/A処理計画に関して生じたEC50値は各々1.7pMおよび1.6pMであった。得られたシグナルの量は低いが、これらの結果により、6時間から24時間の間のBoNT/A処理時間、加えて1日から3日の処理後インキュベーションを用いて、BoNT/A活性を検出するために十分であるEC50を生じ、そしてアッセイの全体的な時間経過において柔軟性を与えることができることが示される。
本明細書において開示されるBoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法の感度を評価するために、BoNT/A中毒に感受性が高い細胞によるBoNT/A取り込みのタイミングを決定した。SiMa細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESおよび20μg/mL GT1bを含有する血清不含培地100μLを含有する、ポリ−D−リジンコーティングされた96ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ3日)インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、1nM BoNT/A複合体を含有する新鮮培地で置き換え、そしてBoNT/A処理細胞を、0分(神経毒を添加し、そして次に即座に除去した)、5分、10分、20分、30分および60分の6つの異なる時点でインキュベートした。BoNT/Aを伴わない(0nM)培地の陰性対照を使用した。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、そしてセクション1にて前記されたように採取した。採取の後、細胞ライゼートのタンパク質濃度、ECLサンドイッチELISAによるSNAP−25切断生成物の検出を実施し、そして前記されたようにEC50を計算した。結果により、バックグラウンドを超える有意な量のSNAP−25切断生成物を生成する前に、細胞によるBoNT/Aの取り込みに1分未満しかかからないことが示された(図6)。
本明細書において開示されるBoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法の特異性を評価するために、部分的に不活化されたBoNT/Aを除外してBoNT/Aを正確に区別する、BoNT/A中毒に感受性が高い細胞の受容力を決定した。SiMa細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESおよび25μg/mL GT1bを含有する血清不含培地100μLを含有する、ポリ−D−リジンコーティングされた96ウェル細胞培養プレートのウェルに蒔いた。細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ3日)インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして1)0(未処理試料)、0.03pM、0.1pM、0.31pM、0.93pM、2.78pM、8.33pMおよび25pM BoNT/A複合体;2)0、0.14nM、0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.11nM、33.33nMおよび100nM 不活性BoNT/A(iBoNT/A);または3)0、0.14nM、0.41nM、1.23nM、3.7nM、11.11nM、33.33nMおよび100nM LHN/Aフラグメントのいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。iBoNT/Aは神経毒のメタロプロテアーゼ活性を完全に不活化する軽鎖の亜鉛結合ドメインに変異を含有し、例えば「ボツリヌス神経毒Aの軽鎖の発現および精製:単一の変異が重鎖との再構成後のSNAP−25のその切断および神経毒性を無効にする」Liqing Zhou, et al., Biochemistry 34:15175−15181(1995)(その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。LHN/Aフラグメントは結合ドメインを欠如するが、インタクトな転位置ドメインおよび軽鎖を含有し、例えば「組換え毒素フラグメント」Clifford C. Shoneら、米国特許第6461617号(その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。24時間の処理の後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに2日間インキュベートしてSNAP−25基質の切断を可能にし、そしてセクション1にて前記されたように採取した。採取した後、細胞ライゼートのタンパク質濃度、ECLサンドイッチELISAによるSNAP−25切断生成物の検出を実施し、そして前記されたようにEC50を計算した。結果により、iBoNT/AおよびLHN/A(EC50>100nM)に関する細胞の結合アフィニティーはBoNT/A(EC50=1.6pM)に関する結合アフィニティーよりも少なくとも60,000低いことが示される(図7)。試験された全濃度のiBoNT/Aで処理された細胞においてSNAP−25切断生成物は検出されなかった。最高用量のLHN/Aフラグメントで処理された細胞において低量のSNAP−25切断生成物が検出されたが、この活性は転位置ドメインの活性によるこのフラグメントの非特異的取り込みによるものである。故に結果により、本明細書において開示されるBoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法は、それによりBoNT/Aがタンパク質分解によりSNAP−25基質を切断し、そしてBoNT/AのBoNT/A受容体への結合、神経毒/受容体複合体の内部移行、BoNT/A軽鎖の細胞内小胞から細胞質への転位置およびSNAP−25のタンパク質分解による切断を包含する中毒過程に関与する全ての工程を測定できることが示される。
以下の実施例は、ECLサンドイッチELISAを用いてBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25切断生成物に特異的なα−SNAP−25モノクローナル抗体を使用してSNAP−25切断生成物を検出することによりBoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法を例証する。
BoNT/Aで処理された細胞からライゼートを調製するために、確立された細胞株から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESおよび25μg/mL GT1bを含有する血清不含培地100μLを含有する96ウェル組織培養プレートのウェルに蒔いた(実施例1および2参照)。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ3日)インキュベートした。分化型細胞からの培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)、0.03pM、0.1pM、0.3pM、0.9pM、2.8pM、8.3pMおよび25pM BoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。24時間の処理の後、細胞を洗浄し、そして毒素を伴わずにさらに2日間インキュベートした。実施例5に記載されるように細胞を採取した。
以下の実施例はCLサンドイッチELISAによるBoNT/A切断部位切断可能結合のP1残基でカルボキシル末端を有するSNAP−25に特異的なα−SNAP−25モノクローナル抗体を使用してSNAP−25切断生成物を検出することによりBoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法を例証する。
細胞からのライゼートをBoNT/Aで処理し、そしてα−SNAP−25捕捉抗体溶液を実施例6に記載されるように調製した。
α−SNAP−25検出抗体溶液を調製するために、α−SNAP−25ポリクローナル抗体S9684(Sigma, St. Louis, MO)を製造者の説明書に従って(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に抱合させた。1mg/mL α−SNAP−25ポリクローナル抗体500μLを、凍結乾燥活性化ペルオキシダーゼを含有するバイアルに添加し、構成要素を混合し、そして次にシアノ水素化ホウ素ナトリウム10μLを添加することにより抱合反応を実施した。この反応混合物をドラフト内で室温で1時間インキュベートした。反応をクエンチした後、標準的なスピンカラムプロトコールを用いて標識された抗体を精製し、そして標準的な比色タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。分光光度計を使用してα−SNAP−25ポリクローナル抗体/HRP抱合体の吸光度を455nmで測定してリットルあたりのモル濃度を決定した。α−SNAP−25検出抗体溶液を必要になるまで4℃で保存した。
以下の実施例はSNAP−25切断生成物に特異的なα−SNAP−25モノクローナル抗体および異なるタンパク質に関する第2の抗体対を使用してSNAP−25切断生成物を検出することによりBoNT/A活性を検出するマルチプレックス免疫基盤の方法を例証する。
分析のための未処理細胞ライゼートを得るために、SiMa細胞のストック培養物から適当な密度の細胞を、1×RPMI1640、10%FBS、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウムおよび100単位/100μgペニシリン−ストレプトマイシンを含有する成長培地40mLを含有するT175フラスコに播種した。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、細胞がおよそ70−90%コンフルエントになるまでインキュベートした。細胞を洗浄し、そして新たに調製されたTriton X−100溶解バッファー(20mM Tris(pH7.5)、150mM塩化ナトリウム、0.001M EDTA、1mM EGTAおよび1%Triton−X−100)中4℃でおよそ30分間一定の攪拌を行いながら溶解することにより細胞を採取した。溶解した細胞を3300−3330×g、8℃で40分間遠心して、ベンチトップ遠心を用いてデブリを排除した。
分析のためのBoNT/A処理細胞ライゼートを得るために、SiMa細胞株のストック培養物から適当な密度の細胞を、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESを含有する血清不含培地を含有するポリ−D−リジン96−ウェルプレートに播種した。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ3日)インキュベートした。培地を各ウェルから吸引し、そして0(未処理試料)、0.67単位/mL、2.35単位/mL、8.23単位/mL、28.82単位/mL、101単位/mL、353単位/mL BoNT/A複合体のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。24時間の処理の後、細胞を洗浄し、毒素を伴わずにさらに2日間インキュベートした。細胞を洗浄し、採取し、そしてセクション1にて前記されたように加工した。
以下の実施例はSNAP−25切断生成物に特異的なα−SNAP−25モノクローナル抗体および異なるタンパク質に関する第2の抗体対を使用してSNAP−25切断生成物を検出することによりBoNT/A活性を検出するマルチプレックス免疫基盤の方法を例証する。
以下の実施例はピコモル濃度量の、例えばBOTOX(登録商標)、DYSPORT(登録商標)/RELOXIN(登録商標)、PURTOX(登録商標)、XEOMIN(登録商標)、NEURONOX(登録商標)またはBTX−AのようなBoNT/A医薬品を検出することができるBoNT/A活性を検出する免疫基盤の方法を実施する仕方を例証する。
1. ECLサンドイッチELISAを用いてBoNT/Aを検出する免疫基盤の方法
BoNT/Aで処理された細胞からライゼートを調製するために、確立された細胞株からおよそ50,000から150,000セルを、最小必須培地、アール塩を伴う2mM GlutaMAX(商標)I、1×B27サプリメント、1×N2サプリメント、0.1mM非必須アミノ酸、10mM HEPESおよび25μg/mL GT1bを含有する血清不含培地100μLを含有する96ウェル組織培養ポリ−D−リジンプレートのウェルに蒔いた(実施例1および2参照)。これらの細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、成長抑止および神経突起伸長のような標準的および日常的な形態学基準により評価されるように細胞が分化するまで(およそ2から3日)インキュベートした。分化型細胞からの培地を各ウェルから吸引し、そして塩化ナトリウム不含溶液で再構成された0(未処理試料)、0.03pM、0.1pM、0.3pM、0.9pM、2.8pM、8.3pMもしくは25pM BoNT/A医薬品;または塩化ナトリウム不含溶液で再構成された0(未処理試料)、0.7単位/mL、2.1単位/mL、6.2単位/mL、18.5単位/mL、55.6単位/mL、166.7単位/mLもしくは500単位/mL BoNT/A医薬品のいずれかを含有する新鮮培地で置き換えた。BoNT/A医薬品は塩化ナトリウムを含有するので、培養培地へのその添加は、細胞生存性に有害である高張培地を招いた。高張の問題を免れるために、塩化ナトリウムを伴わずに作成されたMEM培地200μLを使用してBoNT/A医薬品を再構成して、最終濃度25pM BoNT/A(500単位/mL)が得られた。希釈を、用いられた最高濃度(25pMまたは500単位/mL)で存在する賦形剤の量に対応させるために、使用された培地に塩化ナトリウムを添加することにより、全濃度に関して用量−応答曲線に沿ってマトリックスを一定に保った。24時間の処理の後、細胞を洗浄し、そして毒素を伴わずにさらに2日間インキュベートした。細胞を採取するために培地を吸引し、1×PBSで洗浄し、そして50mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%Triton X−100を含んでなる溶解バッファーを各ウェルに添加することにより溶解し、そしてプレートを500rpmで回転している振盪機上で4℃で30分間インキュベートした。プレートを4000rpm、4℃で20分間遠心して、細胞デブリをペレット化し、そして上澄を捕捉抗体コーティングされた96ウェルプレートに移して検出工程を実施した。
BoNT/Aで処理された細胞からのライゼートおよびα−SNAP−25捕捉抗体溶液を実施例6に記載されるように調製する。α−SNAP−25検出抗体溶液およびSNAP−25切断生成物に特異的である捕捉抗体を含んでなる固相支持体を実施例7に記載されるように調製する。
以下の実施例はα−BoNT/A中和抗体の存在を検出することができる免疫基盤の方法を実施する仕方を例証する。
BoNT/Aは現在、筋肉運動亢進、眼科、胃腸管、泌尿器科および化粧品を含む広範囲の医療適用に使用されている。BoNT/Aの長期間処置を繰り返すと、患者は毒素に対するα−BoNT/A中和抗体を発達させて、免疫抵抗性に至り得る。α−BoNT/A中和抗体はBoNT/Aの結合ドメイン(HC)および/または転位置ドメイン(HN)に結合することにより、毒素のニューロン細胞への取り込みを停止させることによりBoNT/A活性を阻止する。いくつかの研究により、ジストニアに関してBoNT/Aの処方で繰り返し処置された患者の5−10%までが、α−BoNT/A中和抗体を発達させることによる免疫抵抗性を有することが示唆されている。患者の血液中のα−BoNT/A中和抗体の存在を決定するための確立されたアッセイは、マウス保護アッセイ(MPA)である。現在はBoNT/Aはマウスへの注射の前に患者の血清と共にインキュベートされる。抗体の存在は、動物における神経毒に対する応答の低下により顕在化される。MPAはビボ基盤のアッセイであるので、それが細胞基盤のアッセイで置き換えられると、費用および時間がさらに効率的になるであろう。
以下の実施例はBoNT/A受容体をコードするポリヌクレオチド分子を確立された細胞株からの細胞に導入して、BoNT/A中毒に対する感受性をさらに改善するか、またはBoNT/A取り込み受容力を改善する仕方を例証する。
外因性BoNT/A受容体を確立された細胞株を含んでなる細胞に導入するために、カチオン性脂質法により配列番号:59のFGFR2をコードする配列番号:130のポリヌクレオチド分子、または配列番号:25のFGFR3をコードする配列番号:139のポリヌクレオチド分子を含んでなる発現構築物を確立された細胞株からの細胞にトランスフェクトした。適当な密度(約5×106セル)の確立された細胞株からの細胞を、完全培養培地5mLを含有する100mm組織培養皿に蒔き、そして37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下で、細胞がトランスフェクションに適切な密度に到達するまで成長させる。室温で5分間インキュベートされたLipofectAmine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)60μLを含有するOPTI−MEM還元型血清培地1.5mLを、FGFR2もしくはFGFR3をコードする発現構築物24μg、または緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする対照発現構築物を含有するOPTI−MEM還元型血清培地1.5mLに添加することによりトランスフェクション溶液3mLを調製する。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ30分間インキュベートした。完全培地をトランスフェクション溶液3mLで置き換え、そして細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下でおよそ8時間インキュベートする。トランスフェクション培地を新鮮完全培地3mLで置き換え、そして細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下でおよそ24時間インキュベートする。培地を、およそ1mM G418(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含有する新鮮完全培地3mLで置き換える。細胞を37℃のインキュベーター中5%二酸化炭素下でおよそ1週間インキュベートし、古い培地を、0.5mM G418を含有する新鮮完全培養培地で置き換える。一度抗生物質抵抗性コロニーが確立されると、抵抗性コロニーを、およそ0.5mM G418を補充した新鮮完全培養培地を含有する新しい100mm培養プレートに、これらの細胞が6から20×105セル/mLの密度に到達するまで再度蒔く。
[1]担体、少なくとも3個のアミノ酸を含んでなる可動性リンカーおよび配列番号:148を含んでなるSNAP−25抗原を含んでなる組成物。
[2]可動性リンカーおよびSNAP−25抗原アミノ酸配列が配列番号:38である[2]に記載の組成物。
[3]単離されたα−SNAP−25抗体がSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し;
α−SNAP−25抗体がSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないエピトープに関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そして
α−SNAP−25抗体がそのエピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有する;
単離されたα−SNAP−25抗体。
[4]エピトープが配列番号:32である[3]に記載の単離されたα−SNAP−25抗体。
[5]a)配列番号:72、配列番号:74、配列番号:76、配列番号:80または配列番号:82を含んでなる重鎖可変領域;および
b)配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90または配列番号:92を含んでなる軽鎖可変領域;
を含んでなる単離されたα−SNAP−25抗体。
[6]a)配列番号:93、配列番号:121または配列番号:100を含んでなる重鎖可変領域;および
b)配列番号:105、配列番号:110または配列番号:115を含んでなる軽鎖可変領域;
を含んでなる単離されたα−SNAP−25抗体。
[7]少なくとも配列番号:100のVHCDR3、配列番号:101のVHCDR3または配列番号:102のVHCDR3を含んでなる単離されたα−SNAP−25抗体。
[8]a)確立された細胞株からの細胞をBoNT/Aを含んでなる試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞は約500pM以下のBoNT/AによるBoNT/A中毒に感受性が高い;
b)処理された細胞からBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなるSNAP−25構成要素を単離すること;
c)SNAP−25構成要素を固相支持体に連結されたα−SNAP−25抗体と接触させること、
ここでα−SNAP−25抗体はSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、α−SNAP−25抗体はSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないSNAP−25からのエピトープに関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そしてα−SNAP−25抗体はエピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有する;
d)α−SNAP−25抗体およびBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること、
ここで抗体−抗原複合体による検出はBoNT/A活性の指標である;
の工程を含んでなるBoNT/A活性を検出する方法。
[9]SNAP−25切断生成物がSNAP−25197である[8]に記載の方法。
[10]抗体−抗原複合体の存在がサンドイッチELISAを使用して検出される[8]に記載の方法。
[11]方法が下の漸近線で少なくとも3:1のシグナル対ノイズ比および上の漸近線で少なくとも10:1のシグナル対ノイズ比を有する[8]に記載の方法。
[12]試料が多くても100pMのBoNT/Aを含んでなる[8]に記載の方法。
[13]確立された細胞株からの細胞が約100pM以下のBoNT/AによるBoNT/A中毒に感受性が高い[8]に記載の方法。
[14]方法がシングルプレックス様式またはマルチプレックス様式で実施される[8]に記載の方法。
[15]a)α−BoNT/A中和抗体の存在または不在に関して試験中の哺乳動物から得られた被験試料にBoNT/Aを添加すること;
b)確立された細胞株からの細胞を被験試料で処理すること、ここで確立された細胞株からの細胞はBoNT/A中毒に感受性が高い;
c)処理された細胞からBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなるSNAP−25構成要素を単離すること;
d)SNAP−25構成要素を固相支持体に連結されたα−SNAP−25抗体に接触させること、ここでα−SNAP−25抗体は;
ここでα−SNAP−25抗体はSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、α−SNAP−25抗体はSNAP−25切断生成物からのBoNT/A切断部位切断可能結合のカルボキシル末端グルタミンを含まないSNAP−25からのエピトープに関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そしてα−SNAP−25抗体はそのエピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有する;
e)α−SNAP−25抗体およびBoNT/A切断部位切断可能結合からのカルボキシル末端グルタミンを有するSNAP−25切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること;
f)被験試料の代わりに陰性対照試料で工程b−eを繰り返すこと、陰性対照試料はBoNT/A、およびα−BoNT/A中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる;ならびに
g)工程eで検出された抗体−抗原複合体の量を工程fで検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、
ここで工程fで検出された抗体−抗原複合体の量に相対して工程eで検出された抗体−抗原複合体のより少ない検出量はα−BoNT/A中和抗体の存在の指標である;
の工程を含んでなる哺乳動物におけるBoNT/A免疫抵抗性を決定する方法。
Claims (5)
- a.哺乳動物から得られた被験試料に既知の量のBoNT/Aを添加すること、ここで該哺乳動物は、抗BoNT/A活性中和抗体の存在または不在に関して試験されており、該被験試料は、該哺乳動物由来の血液試料または血清試料である;
b.SNAP−25を発現する確立された細胞株からの細胞を被験試料に接触させること、ここで確立された細胞株からの細胞はBoNT/A中毒に感受性が高い;
c.該細胞から配列番号:38のカルボキシル末端グルタミンを含むSNAP−25切断生成物を単離すること;
d.SNAP−25切断生成物を固相支持体に連結された抗SNAP−25抗体に接触させること、
ここで抗SNAP−25抗体は配列番号:38のカルボキシル末端グルタミンを含んでなるエピトープに結合し、抗SNAP−25抗体はインタクトなSNAP−25に関して1×101M−1s−1未満の会合速度定数を有し;そして抗SNAP−25抗体は該エピトープに関して0.450nM未満の平衡解離定数を有する;
e.抗SNAP−25抗体および配列番号:38のカルボキシル末端グルタミンを含むSNAP−25切断生成物を含んでなる抗体−抗原複合体の存在を検出すること;
f.被験試料の代わりに陰性対照試料で工程a−eを行うこと、ここで陰性対照試料は、既知の量のBoNT/A、および抗BoNT/A活性中和抗体を含有しないことが解っている血清を含んでなる;ならびに
g.工程eで検出された抗体−抗原複合体の量を陰性対照試料において検出された抗体−抗原複合体の量と比較すること、
ここで陰性対照試料に比べての工程eにおける抗体−抗原複合体の検出の減少は被験試料における抗BoNT/A活性中和抗体の存在を示す;
の工程を含んでなる、哺乳動物における抗BoNT/A活性中和抗体を検出する方法。 - 既知の量のBoNT/Aが10pMである、請求項1記載の方法。
- 抗体−抗原複合体の存在の検出がサンドイッチイムノアッセイの使用により行われる請求項1または2に記載の方法。
- サンドイッチイムノアッセイが電気化学発光基質または化学発光基質を含む、請求項3記載の方法。
- (i)該抗SNAP−25抗体が、配列番号:95(CDR1)、配列番号:99(CDR2)および配列番号:101(CDR3)のアミノ酸配列を含む相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:103(CDR1)、配列番号:108(CDR2)および配列番号:113(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む軽鎖可変領域を含む、
(ii)該抗SNAP−25抗体が、配列番号:93(CDR1)、配列番号:96(CDR2)および配列番号:100(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:105(CDR1)、配列番号:110(CDR2)および配列番号:115(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む軽鎖可変領域を含む、
(iii)該抗SNAP−25抗体が、配列番号:93(CDR1)、配列番号:97(CDR2)および配列番号:101(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:104(CDR1)、配列番号:109(CDR2)および配列番号:114(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む軽鎖可変領域を含む、
(iv)該抗SNAP−25抗体が、配列番号:94(CDR1)、配列番号:98(CDR2)および配列番号:102(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:107(CDR1)、配列番号:112(CDR2)および配列番号:117(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む軽鎖可変領域を含む、
(v)該抗SNAP−25抗体が、配列番号:94(CDR1)、配列番号:98(CDR2)および配列番号:102(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:106(CDR1)、配列番号:111(CDR2)および配列番号:116(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む軽鎖可変領域を含む、または
(vi)該抗SNAP−25抗体が、配列番号:93(CDR1)、配列番号:97(CDR2)および配列番号:100(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:106(CDR1)、配列番号:111(CDR2)および配列番号:116(CDR3)のアミノ酸配列を含むCDRを含む軽鎖可変領域を含む、
請求項1〜4いずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3672308P | 2008-03-14 | 2008-03-14 | |
US61/036,723 | 2008-03-14 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010550881A Division JP5766954B2 (ja) | 2008-03-14 | 2009-03-13 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015137157A Division JP6227597B2 (ja) | 2008-03-14 | 2015-07-08 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015143689A JP2015143689A (ja) | 2015-08-06 |
JP2015143689A5 JP2015143689A5 (ja) | 2015-09-17 |
JP6050401B2 true JP6050401B2 (ja) | 2016-12-21 |
Family
ID=40677745
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010550881A Active JP5766954B2 (ja) | 2008-03-14 | 2009-03-13 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
JP2012279973A Withdrawn JP2013100304A (ja) | 2008-03-14 | 2012-12-21 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
JP2015028972A Active JP6050401B2 (ja) | 2008-03-14 | 2015-02-17 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
JP2015137157A Active JP6227597B2 (ja) | 2008-03-14 | 2015-07-08 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
JP2017197729A Active JP6522075B2 (ja) | 2008-03-14 | 2017-10-11 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010550881A Active JP5766954B2 (ja) | 2008-03-14 | 2009-03-13 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
JP2012279973A Withdrawn JP2013100304A (ja) | 2008-03-14 | 2012-12-21 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015137157A Active JP6227597B2 (ja) | 2008-03-14 | 2015-07-08 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
JP2017197729A Active JP6522075B2 (ja) | 2008-03-14 | 2017-10-11 | 免疫基盤ボツリヌス毒素血清a型活性アッセイ |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (11) | US8198034B2 (ja) |
EP (5) | EP3851451A1 (ja) |
JP (5) | JP5766954B2 (ja) |
KR (1) | KR101609894B1 (ja) |
CN (2) | CN102937653B (ja) |
AU (1) | AU2009223161B2 (ja) |
BR (2) | BRPI0908578A2 (ja) |
CA (1) | CA2715033C (ja) |
CO (1) | CO6311001A2 (ja) |
CY (2) | CY1115771T1 (ja) |
DK (2) | DK3031825T3 (ja) |
ES (2) | ES2755505T3 (ja) |
HK (2) | HK1151298A1 (ja) |
HR (1) | HRP20191886T1 (ja) |
HU (1) | HUE046037T2 (ja) |
IL (2) | IL208097A (ja) |
LT (1) | LT3031825T (ja) |
MX (1) | MX2010010137A (ja) |
MY (2) | MY165032A (ja) |
NZ (1) | NZ588029A (ja) |
PL (2) | PL3031825T3 (ja) |
PT (2) | PT3031825T (ja) |
RU (2) | RU2491293C2 (ja) |
SG (1) | SG2014009112A (ja) |
SI (2) | SI3031825T1 (ja) |
UA (1) | UA102247C2 (ja) |
WO (1) | WO2009114748A1 (ja) |
Families Citing this family (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7563874B2 (en) * | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
US8497081B2 (en) * | 2004-02-24 | 2013-07-30 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin screening assays |
EP2134749B1 (en) | 2007-03-22 | 2013-11-06 | The Regents of the University of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
US8540987B2 (en) * | 2008-01-29 | 2013-09-24 | Institute For Antibodies Co., Ltd. | Composition for neutralizing botulinus toxin type-A, and human anti-botulinus toxin type-A antibody |
SI3031825T1 (sl) | 2008-03-14 | 2019-12-31 | Allergan, Inc. | Preizkusi aktivnosti serotipa A botulin toksina na podlagi imunosti |
KR101604515B1 (ko) * | 2008-03-14 | 2016-03-17 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 a 활성 검정 |
CA2732003A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | James D. Marks | Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
KR101923847B1 (ko) | 2009-03-13 | 2018-11-29 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역 기반 재표적화된 엔도펩티다제 활성 검정 |
PL2406371T3 (pl) | 2009-03-13 | 2018-11-30 | Allergan, Inc. | Komórki pomocne w testach do oznaczania aktywności toksyny botulinowej o serotypie a, opartych na immunologii |
AU2015203359A1 (en) * | 2009-03-13 | 2015-07-02 | Allergan, Inc. | Cells useful for immuno-based Botulinum toxin serotype A activity assays |
US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
WO2011022438A2 (en) * | 2009-08-18 | 2011-02-24 | Us Army Medical Research And Materiel Command | Cleavage sensitive antibodies and methods of use thereof |
CN102639054B (zh) * | 2009-11-18 | 2015-02-18 | 梅斯制药两合股份有限公司 | 梭菌神经毒素的定量检测方法 |
US9243057B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-01-26 | The Regents Of The University Of California | Antibodies for botulinum neurotoxins |
US10908146B2 (en) | 2011-06-01 | 2021-02-02 | Biomadison, Inc. | Compositions and methods for improving sensitivity in cell based assays |
JP5815852B2 (ja) | 2011-06-01 | 2015-11-17 | バイオマジソン・インコーポレイテッドBiomadison, Inc. | 非fretボツリヌスアッセイ |
US9303285B2 (en) | 2012-01-04 | 2016-04-05 | Biomadison, Inc. | Methods and compounds for increasing sensitivity of botulinum assays |
RU2616281C2 (ru) | 2011-09-29 | 2017-04-13 | СЕЛЛСНЭП, ЭлЭлСи | Композиции и способы испытаний на токсикогенность |
KR20140107195A (ko) * | 2011-11-25 | 2014-09-04 | 프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우 | Snap/clip 태그의 검출용 단일클론 항체 |
EP2798077A2 (en) * | 2011-12-31 | 2014-11-05 | Allergan, Inc. | Highly Sensitive Cell-Based Assay to Detect the Presence of Active Botulinum Neurotoxin Serotype-A |
KR102168506B1 (ko) * | 2012-01-04 | 2020-10-21 | 바이오메디슨, 인코퍼레이티드 | 보툴리눔 분석 감도를 증진시키기 위한 방법 및 화합물 |
CN104736697B (zh) | 2012-10-16 | 2018-06-01 | 莫茨制药有限及两合公司 | 用于测定神经毒素多肽的生物学活性的细胞测试系统 |
CA2880897C (en) * | 2012-11-21 | 2020-01-14 | Syntaxin Limited | Methods for the manufacture of proteolytically processed polypeptides |
WO2014100019A1 (en) | 2012-12-18 | 2014-06-26 | Allergan, Inc. | Prophylactic treatment of herpes recurrence |
ES2699432T3 (es) * | 2013-06-28 | 2019-02-11 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Medios y métodos para la determinación de la actividad biológica de polipéptidos de neurotoxinas en células |
KR102349256B1 (ko) | 2013-08-09 | 2022-01-07 | 바이오메디슨, 인코퍼레이티드 | 개선된 민감성을 지닌 보툴리눔 독소 검정 |
WO2015088477A1 (en) * | 2013-12-09 | 2015-06-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Peptide substrates recognizable by type e botulinum neurotoxin |
EP3137053B1 (en) | 2014-04-30 | 2020-06-17 | Allergan, Inc. | Formulations of biologics for intravesical instillation |
PL2952205T3 (pl) | 2014-06-06 | 2018-01-31 | Kleiner Fisman Galit | Toksyna botulinowa do zastosowania do leczenia paratonii |
CN107001451A (zh) | 2014-07-07 | 2017-08-01 | 阿勒根公司 | 检测组织样品中裂解的snap25的方法 |
SG10201913979VA (en) | 2014-07-07 | 2020-03-30 | Allergan Inc | Method of detecting cleaved snap25 in tissue samples |
WO2016019180A1 (en) | 2014-07-31 | 2016-02-04 | Allergan, Inc. | Formulations of biologics for intravesical instillation |
US10634683B2 (en) | 2014-11-21 | 2020-04-28 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Methods for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides |
AU2015367329B2 (en) * | 2014-12-19 | 2021-02-18 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Means and methods for the determination of the biological activity of BoNT/E in cells |
SG11201705019PA (en) | 2014-12-23 | 2017-07-28 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Botulinum toxin prefilled container |
US9527922B2 (en) | 2014-12-31 | 2016-12-27 | Development Center For Biotechnology | Humanized alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy |
JP6585721B2 (ja) * | 2014-12-31 | 2019-10-02 | ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジー | ヒト化α−エノラーゼ特異的抗体及びがん治療におけるその使用方法 |
TWI704156B (zh) * | 2015-03-04 | 2020-09-11 | 德商曼茲法瑪股份有限公司 | 用於增進肉毒桿菌神經毒素進入細胞之特定攝取的方法 |
JP6412471B2 (ja) | 2015-07-15 | 2018-10-24 | 富士フイルム株式会社 | 含窒素複素環化合物の製造方法およびその中間体 |
RU2748401C2 (ru) * | 2015-09-18 | 2021-05-25 | Арч Онколоджи, Инк. | Терапевтические антитела к CD47 |
WO2017063743A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Improvements to ultrasound-based therapy of photoaged tissue |
JP2019507118A (ja) | 2016-03-02 | 2019-03-14 | メルツ ファルマ ゲーエムベーハー ウント コンパニー カーゲーアーアー | ボツリヌス毒素を含む組成物 |
TWI737742B (zh) | 2016-06-22 | 2021-09-01 | 德商梅茲製藥有限兩合公司 | 肉毒桿菌毒素的預填充式注射器系統、具有其之套組以及其之使用 |
CN106442969B (zh) * | 2016-08-23 | 2018-08-31 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种用于检测肉毒毒素的试剂盒 |
EP3290437A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-07 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant clostridial neurotoxins with decreased duration of effect |
CN109803673A (zh) | 2016-09-13 | 2019-05-24 | 阿勒根公司 | 非蛋白质梭菌毒素组合物 |
EP3312193A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-25 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum neurotoxins with accelerated onset of effect |
WO2018075960A1 (en) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Tioma Therapeutics, Inc. | Therapeutic cd47 antibodies |
EP3333179A1 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-13 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum toxin with accelarated onset of effect |
EP3335719A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-20 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum neurotoxins with a stabilized light chain |
EP3600384A1 (en) | 2017-03-24 | 2020-02-05 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Improved use of botulinum neurotoxin in the treatment of sialorrhea |
EP3642222A1 (en) | 2017-06-20 | 2020-04-29 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect |
WO2019007509A1 (en) | 2017-07-06 | 2019-01-10 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM NEUROTOXINS WITH INCREASED DURATION |
WO2019081022A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | NOVEL RECOMBINANT BOTULINUM NEUROTOXINS WITH INCREASED DURATION |
EP3713595A1 (en) | 2017-11-22 | 2020-09-30 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect |
WO2019158745A1 (de) * | 2018-02-16 | 2019-08-22 | Bontana Therapies Gmbh | Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung |
JP6544669B1 (ja) | 2018-03-16 | 2019-07-17 | ディヴェロップメント センター フォー バイオテクノロジー | アルファエノラーゼに特異的な抗体及びその使用 |
EP3860640A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-08-11 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Novel uses of botulinum neurotoxin for treating lipoedema |
KR101983216B1 (ko) * | 2018-11-29 | 2019-05-29 | 주식회사 에이비바이오 | 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체, 및 이를 이용한 활성 측정방법 |
EP3825689A3 (en) | 2018-11-29 | 2021-09-15 | Hugel Inc. | A cell-based method for determining an activity of botulinum toxin |
KR102251096B1 (ko) * | 2018-12-12 | 2021-05-13 | 휴젤(주) | 보툴리눔 독소 활성을 결정하는 세포 기반 방법 |
JP2022521237A (ja) | 2019-02-21 | 2022-04-06 | メルツ ファーマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディト ゲゼルシャフト アウフ アクティーン | 振戦治療のためのボツリヌス神経毒素の新規用途 |
KR102274841B1 (ko) * | 2019-10-16 | 2021-07-12 | 주식회사 하울바이오 | Snare 복합체를 억제하는 항-snap 25 항체 및 이의 용도 |
CA3177835A1 (en) | 2020-06-05 | 2021-12-09 | Susanna ROLL | High dose and low volume botulinum toxin treatment of facial wrinkles |
EP4349992A1 (en) * | 2021-05-24 | 2024-04-10 | ATGC Co., Ltd. | Cells sensitive to botulinum toxin into which specific gene has been inserted by lentivirus |
TW202400223A (zh) | 2022-02-15 | 2024-01-01 | 德商梅茲製藥有限兩合公司 | 液體製劑及其製備方法與用途 |
TW202348248A (zh) | 2022-02-15 | 2023-12-16 | 德商梅茲製藥有限兩合公司 | 液體製劑及其製備方法與用途 |
TW202400122A (zh) | 2022-02-28 | 2024-01-01 | 德商梅茲製藥有限兩合公司 | 肉毒桿菌毒素用於降低皮膚毛孔尺寸及/或皮脂產生之用途、以及降低皮膚毛孔尺寸及/或皮脂產生的方法 |
WO2023205355A1 (en) * | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Biomadison, Inc. | Cell based assays for botulinum neurotoxin |
WO2024102345A1 (en) | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Allergan, Inc. | Prevention of post-operative atrial fibrillation with a botulinum toxin |
Family Cites Families (105)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3672308A (en) | 1970-11-06 | 1972-06-27 | Westinghouse Electric Corp | Roadway switching arrangement for transportation system having center guiderail below track level |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
US5955584A (en) * | 1986-03-31 | 1999-09-21 | Charter Ventures | Atherosclerotic plaque specific antigens, antibodies thereto, and uses thereof |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5804604A (en) | 1989-12-21 | 1998-09-08 | Biogen, Inc. | Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins |
US5652122A (en) | 1989-12-21 | 1997-07-29 | Frankel; Alan | Nucleic acids encoding and methods of making tat-derived transport polypeptides |
ES2180529T3 (es) | 1990-02-26 | 2003-02-16 | Univ Leland Stanford Junior | Identificacion y expresion de secuencias de adn de un receptor de esteroides de insectos. |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9206318D0 (en) | 1992-03-24 | 1992-05-06 | Cambridge Antibody Tech | Binding substances |
US5962255A (en) | 1992-03-24 | 1999-10-05 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing recombinant vectors |
PT1024191E (pt) | 1991-12-02 | 2008-12-22 | Medical Res Council | Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos |
EP0745121B1 (en) | 1992-05-14 | 2007-06-20 | Baylor College Of Medicine | Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy |
US5364791A (en) | 1992-05-14 | 1994-11-15 | Elisabetta Vegeto | Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations |
CA2138020C (en) | 1992-06-23 | 1999-02-16 | Eric A. Johnson | Pharmaceutical composition containing botulinum b complex |
WO1994013804A1 (en) | 1992-12-04 | 1994-06-23 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use |
US5464758A (en) | 1993-06-14 | 1995-11-07 | Gossen; Manfred | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
US5814618A (en) | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
SE9304060D0 (sv) | 1993-12-06 | 1993-12-06 | Bioinvent Int Ab | Sätt att selektera specifika bakteriofager |
GB9411138D0 (en) * | 1994-06-03 | 1994-07-27 | Microbiological Res Authority | Toxin assay |
US5962637A (en) | 1994-06-03 | 1999-10-05 | Microbiological Research Authority | Toxin assay |
US5807746A (en) | 1994-06-13 | 1998-09-15 | Vanderbilt University | Method for importing biologically active molecules into cells |
US6495518B1 (en) | 1994-06-13 | 2002-12-17 | Vanderbilt University | Method for importing biologically active molecules into cells |
GB9500851D0 (en) | 1995-01-17 | 1995-03-08 | Bionvent International Ab | Method of selecting specific bacteriophages |
JP4423680B2 (ja) * | 1995-06-07 | 2010-03-03 | オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド | Cdr−グラフト化抗組織因子抗体及びその使用 |
FR2739621B1 (fr) | 1995-10-05 | 1997-12-05 | Centre Nat Rech Scient | Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives |
US6072041A (en) | 1996-06-03 | 2000-06-06 | Case Western Reserve University | Fusion proteins for protein delivery |
GB9617671D0 (en) | 1996-08-23 | 1996-10-02 | Microbiological Res Authority | Recombinant toxin fragments |
JP2002502376A (ja) | 1997-05-21 | 2002-01-22 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法 |
US6248558B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity |
PL343322A1 (en) * | 1998-04-03 | 2001-08-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanized antibody against human tissue factor (tf) and process for constructing humanized antibody |
US7563874B2 (en) | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
JP2002531113A (ja) | 1998-12-10 | 2002-09-24 | ワシントン大学 | 蛋白質の形質導入システムおよびその使用法 |
US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
DE19925739A1 (de) * | 1999-06-07 | 2000-12-21 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Therapeutikum mit einem Botulinum-Neurotoxin |
WO2001014570A1 (en) | 1999-08-25 | 2001-03-01 | Allergan Sales, Inc. | Activatable recombinant neurotoxins |
US20030008813A1 (en) | 1999-12-17 | 2003-01-09 | Felgner Philip L. | Intracellular protein delivery compositions and methods of use |
GB9930519D0 (en) | 1999-12-24 | 2000-02-16 | Phogen Limited | Uses of transport proteins |
US7034121B2 (en) | 2000-01-27 | 2006-04-25 | Genetics Institue, Llc | Antibodies against CTLA4 |
US6294553B1 (en) | 2000-02-15 | 2001-09-25 | Allergan Sales, Inc. | Method for treating ocular pain |
US6325899B1 (en) | 2000-03-10 | 2001-12-04 | Action Caps, Llc | Disposable and recyclable intermediates for use in electrostatic coating processes |
US20040220100A1 (en) | 2000-07-21 | 2004-11-04 | Essentia Biosystems, Inc. | Multi-component biological transport systems |
US20030219462A1 (en) | 2000-07-21 | 2003-11-27 | Allergan Sales, Inc | Clostridial neurotoxin compositions and modified clostridial neurotoxins |
CA2416289C (en) | 2000-07-21 | 2012-12-04 | Essentia Biosystems, Inc. | Multi-component biological transport systems |
US7491799B2 (en) | 2000-07-21 | 2009-02-17 | Allergan, Inc. | Modified botulinum neurotoxins |
US6841535B2 (en) | 2000-07-31 | 2005-01-11 | Active Motif | Peptide-mediated transfection agents and methods of use |
US6678651B2 (en) * | 2000-09-15 | 2004-01-13 | Mindspeed Technologies, Inc. | Short-term enhancement in CELP speech coding |
AU2888702A (en) * | 2000-11-06 | 2002-05-15 | Us Army Med Res Mat Command | Recombinant light chains of botulinum neurotoxins and light chain fusion proteins for use in research and clinical therapy |
US7223577B2 (en) | 2000-11-17 | 2007-05-29 | Allergan, Inc. | Post-translational modifications and Clostridial neurotoxins |
US20080064054A1 (en) * | 2001-08-28 | 2008-03-13 | Ester Fernandez-Salas | Fluorescence resonance energy transfer (fret) assays for clostridial toxin activity |
US7332567B2 (en) | 2001-08-28 | 2008-02-19 | Allergan, Inc. | Fret protease assays for clostridial toxins |
US7374896B2 (en) * | 2001-08-28 | 2008-05-20 | Allergan, Inc. | GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum neurotoxin protease activity |
US7208285B2 (en) | 2001-08-28 | 2007-04-24 | Allergan, Inc. | Fret protease assays for botulinum serotype A/E toxins |
US8022172B2 (en) | 2001-08-28 | 2011-09-20 | Allergan, Inc. | Luminescence resonance energy transfer (LRET) assays for clostridial toxin activity |
WO2003040347A2 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-15 | The Ohio State University Research Foundation | Baalc expression as a diagnostic marker for acute leukemia |
WO2003072049A2 (en) | 2002-02-21 | 2003-09-04 | Essentia Biosystems, Inc. | Induction of hair growth with vascular endothelial growth factor |
CA2492671C (en) | 2002-03-22 | 2012-04-17 | Aprogen, Inc. | Humanized antibody and process for preparing same |
US20040057958A1 (en) | 2002-05-17 | 2004-03-25 | Waggoner David W. | Immunogenicity-enhancing carriers and compositions thereof and methods of using the same |
RU2230325C2 (ru) * | 2002-08-15 | 2004-06-10 | Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а |
US7183066B2 (en) | 2002-09-27 | 2007-02-27 | Allergan, Inc. | Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins |
US7166692B2 (en) | 2003-03-04 | 2007-01-23 | Canbrex Bio Science Walkersville, Inc. | Intracellular delivery of small molecules, proteins, and nucleic acids |
WO2005030119A2 (en) * | 2003-04-11 | 2005-04-07 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin a peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy |
CA2550401C (en) * | 2003-12-19 | 2015-12-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin |
US7598027B2 (en) | 2004-02-24 | 2009-10-06 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin screening assays |
US8497081B2 (en) * | 2004-02-24 | 2013-07-30 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin screening assays |
CA3031270A1 (en) | 2004-03-03 | 2005-12-22 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical diagnostic and therapeutic transport |
PT1729821E (pt) | 2004-03-03 | 2013-10-23 | Revance Therapeutics Inc | Composições e métodos para aplicação tópica e administração transdérmica de toxinas botulínicas |
AU2011253597B2 (en) | 2004-03-03 | 2014-12-04 | Revance Therapeutics, Inc. | Multi-component biological transport systems |
US9211248B2 (en) | 2004-03-03 | 2015-12-15 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins |
WO2005118582A1 (ja) | 2004-06-03 | 2005-12-15 | Senju Pharmaceutical Co., Ltd. | アミド化合物を含有する角膜知覚回復剤 |
US7514088B2 (en) | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
US7906276B2 (en) * | 2004-06-30 | 2011-03-15 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Enzymatic detection techniques |
US7399607B2 (en) | 2004-09-22 | 2008-07-15 | Allergan, Inc. | Fluorescence polarization assays for determining clostridial toxin activity |
WO2006042149A2 (en) * | 2004-10-06 | 2006-04-20 | Allergan, Inc. | Determining and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy using botulinum toxin a peptides |
GB0426394D0 (en) | 2004-12-01 | 2005-01-05 | Health Prot Agency | Fusion proteins |
EP1861112A4 (en) | 2005-03-03 | 2009-07-22 | Revance Therapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TOPICAL APPLICATION AND TRANSDERMAL DELIVERY OF BOTULINUM TOXINS |
EP1861419B1 (en) | 2005-03-15 | 2011-06-29 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced targeting capabilities for endogenous clostridial toxin receptor systems |
ES2351942T3 (es) | 2005-04-05 | 2011-02-14 | Allergan Inc | Analisis de la actividad de una toxina clostridial. |
ATE470857T1 (de) * | 2005-04-05 | 2010-06-15 | Allergan Inc | Lipophile, farbstoffbasierte fret-assays für die clostridientoxinaktivität |
EP2131195B1 (en) | 2005-10-12 | 2012-04-25 | Allergan, Inc. | Assays of molecular or subcellular proximity using depolarization after resonance energy transfer (DARET) |
KR101423272B1 (ko) | 2005-11-17 | 2014-07-30 | 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨. | 감소된 비-독소 단백질을 갖는 보툴리눔 독소의 국소 적용및 경피 전달을 위한 조성물 및 방법 |
GB2437311A (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-24 | Mologic Ltd | A protease detection product |
US8796429B2 (en) | 2006-05-31 | 2014-08-05 | Lpath, Inc. | Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same |
AU2007254942B2 (en) * | 2006-06-02 | 2011-10-27 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Hepatocyte growth factor (HGF) binding proteins |
US7993656B2 (en) | 2006-07-11 | 2011-08-09 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells |
MY142256A (en) | 2006-09-14 | 2010-11-15 | Revance Therapeutics Inc | Compositions and methods for topical diagnostic and therapeutic transport |
CN100577149C (zh) * | 2006-12-21 | 2010-01-06 | 北京民海生物科技有限公司 | 一种治疗用a型肉毒毒素冻干粉针剂新型冻干保护剂配方 |
CN101616682A (zh) | 2006-12-29 | 2009-12-30 | 雷文斯治疗公司 | 用源自hiv-tat的多肽片段稳定的肉毒杆菌毒素的组合物及其局部施用和透皮递送的方法 |
EP2109363A4 (en) | 2006-12-29 | 2014-07-09 | Revance Therapeutics Inc | TRANSPORT MOLECULES USING HIV TAT POLYPEPTIDES WITH REVERSE SEQUENCE |
US8753831B2 (en) * | 2007-06-05 | 2014-06-17 | City Of Hope | Methods for detection of botulinum neurotoxin |
CN101842107B (zh) | 2007-07-26 | 2014-04-23 | 雷文斯治疗公司 | 抗微生物肽,组合物和使用方法 |
WO2009039356A1 (en) | 2007-09-20 | 2009-03-26 | Allergan, Inc. | Treatment methods with brimonidine |
SI3031825T1 (sl) * | 2008-03-14 | 2019-12-31 | Allergan, Inc. | Preizkusi aktivnosti serotipa A botulin toksina na podlagi imunosti |
KR101604515B1 (ko) | 2008-03-14 | 2016-03-17 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 a 활성 검정 |
KR101753242B1 (ko) | 2008-12-31 | 2017-07-20 | 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨. | 주사용 보툴리눔 독소 제제 |
KR101923847B1 (ko) * | 2009-03-13 | 2018-11-29 | 알러간, 인코포레이티드 | 면역 기반 재표적화된 엔도펩티다제 활성 검정 |
PL2406371T3 (pl) * | 2009-03-13 | 2018-11-30 | Allergan, Inc. | Komórki pomocne w testach do oznaczania aktywności toksyny botulinowej o serotypie a, opartych na immunologii |
LT5982B (lt) * | 2012-04-24 | 2013-12-27 | Uab Friday Lab | Su planšetiniu kompiuteriu arba išmaniuoju telefonu suderintas žuvų ieškiklis |
CN104736697B (zh) * | 2012-10-16 | 2018-06-01 | 莫茨制药有限及两合公司 | 用于测定神经毒素多肽的生物学活性的细胞测试系统 |
CN104837862A (zh) * | 2012-11-21 | 2015-08-12 | 莫茨制药有限及两合公司 | 测定肉毒杆菌神经毒素的生物活性的手段和方法 |
CN107001451A (zh) * | 2014-07-07 | 2017-08-01 | 阿勒根公司 | 检测组织样品中裂解的snap25的方法 |
AU2015367329B2 (en) * | 2014-12-19 | 2021-02-18 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Means and methods for the determination of the biological activity of BoNT/E in cells |
TWI704156B (zh) * | 2015-03-04 | 2020-09-11 | 德商曼茲法瑪股份有限公司 | 用於增進肉毒桿菌神經毒素進入細胞之特定攝取的方法 |
-
2009
- 2009-03-13 SI SI200932003T patent/SI3031825T1/sl unknown
- 2009-03-13 NZ NZ588029A patent/NZ588029A/xx unknown
- 2009-03-13 EP EP21156222.8A patent/EP3851451A1/en active Pending
- 2009-03-13 MX MX2010010137A patent/MX2010010137A/es active IP Right Grant
- 2009-03-13 WO PCT/US2009/037046 patent/WO2009114748A1/en active Application Filing
- 2009-03-13 PT PT161538194T patent/PT3031825T/pt unknown
- 2009-03-13 ES ES16153819T patent/ES2755505T3/es active Active
- 2009-03-13 EP EP16153819.4A patent/EP3031825B1/en active Active
- 2009-03-13 SI SI200931075T patent/SI2271670T1/sl unknown
- 2009-03-13 KR KR1020107022989A patent/KR101609894B1/ko active IP Right Grant
- 2009-03-13 DK DK16153819T patent/DK3031825T3/da active
- 2009-03-13 ES ES09719709.9T patent/ES2524312T3/es active Active
- 2009-03-13 BR BRPI0908578-5A2A patent/BRPI0908578A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-03-13 CN CN201210442740.1A patent/CN102937653B/zh active Active
- 2009-03-13 US US12/403,531 patent/US8198034B2/en active Active
- 2009-03-13 PT PT97197099T patent/PT2271670E/pt unknown
- 2009-03-13 UA UAA201012168A patent/UA102247C2/ru unknown
- 2009-03-13 EP EP19175389.6A patent/EP3556770A1/en not_active Withdrawn
- 2009-03-13 RU RU2010140478/10A patent/RU2491293C2/ru active
- 2009-03-13 SG SG2014009112A patent/SG2014009112A/en unknown
- 2009-03-13 DK DK09719709.9T patent/DK2271670T3/en active
- 2009-03-13 CN CN200980117157XA patent/CN102356091A/zh active Pending
- 2009-03-13 PL PL16153819T patent/PL3031825T3/pl unknown
- 2009-03-13 HU HUE16153819A patent/HUE046037T2/hu unknown
- 2009-03-13 EP EP20120187775 patent/EP2578601A1/en not_active Withdrawn
- 2009-03-13 AU AU2009223161A patent/AU2009223161B2/en active Active
- 2009-03-13 EP EP09719709.9A patent/EP2271670B1/en active Active
- 2009-03-13 MY MYPI2014000107A patent/MY165032A/en unknown
- 2009-03-13 PL PL09719709T patent/PL2271670T3/pl unknown
- 2009-03-13 MY MYPI2010004276A patent/MY155049A/en unknown
- 2009-03-13 LT LTEP16153819.4T patent/LT3031825T/lt unknown
- 2009-03-13 BR BRBR122012027456-9A patent/BR122012027456A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-03-13 CA CA2715033A patent/CA2715033C/en active Active
- 2009-03-13 JP JP2010550881A patent/JP5766954B2/ja active Active
-
2010
- 2010-09-12 IL IL208097A patent/IL208097A/en active IP Right Grant
- 2010-10-11 CO CO10126241A patent/CO6311001A2/es active IP Right Grant
-
2011
- 2011-05-26 HK HK11105247.7A patent/HK1151298A1/xx unknown
-
2012
- 2012-05-18 US US13/475,553 patent/US9249216B2/en active Active
- 2012-10-11 US US13/649,923 patent/US20130040368A1/en not_active Abandoned
- 2012-10-28 IL IL222737A patent/IL222737A/en active IP Right Grant
- 2012-11-01 RU RU2012146463/10A patent/RU2012146463A/ru not_active Application Discontinuation
- 2012-12-21 JP JP2012279973A patent/JP2013100304A/ja not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-11-21 CY CY20141100972T patent/CY1115771T1/el unknown
-
2015
- 2015-02-17 JP JP2015028972A patent/JP6050401B2/ja active Active
- 2015-07-08 JP JP2015137157A patent/JP6227597B2/ja active Active
-
2016
- 2016-12-12 HK HK16114127A patent/HK1225746A1/zh unknown
-
2017
- 2017-01-06 US US15/400,618 patent/US10703806B2/en active Active
- 2017-10-11 JP JP2017197729A patent/JP6522075B2/ja active Active
-
2019
- 2019-10-17 HR HRP20191886TT patent/HRP20191886T1/hr unknown
- 2019-10-23 CY CY20191101100T patent/CY1122328T1/el unknown
-
2020
- 2020-07-02 US US16/920,031 patent/US20200392212A1/en not_active Abandoned
- 2020-07-02 US US16/920,098 patent/US20200369749A1/en not_active Abandoned
- 2020-12-17 US US17/124,747 patent/US11261240B2/en active Active
-
2021
- 2021-07-15 US US17/376,416 patent/US11332518B2/en active Active
-
2022
- 2022-01-11 US US17/573,096 patent/US20220144925A1/en not_active Abandoned
- 2022-08-17 US US17/889,919 patent/US20230235031A1/en not_active Abandoned
- 2022-09-29 US US17/936,691 patent/US20230279083A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11332518B2 (en) | Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays | |
US8618261B2 (en) | Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays | |
ES2770033T3 (es) | Ensayos de actividad de endopeptidasa redirigida basados en inmunología | |
AU2017210625B9 (en) | Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays | |
AU2012250281B2 (en) | Immuno-based botulinum toxin serotype A activity assays |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150709 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160524 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160725 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161018 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161101 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161124 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6050401 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |