CN101616682A - 用源自hiv-tat的多肽片段稳定的肉毒杆菌毒素的组合物及其局部施用和透皮递送的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用HIV－TAT片段或HIV－TAT片段的衍生物稳定的新的肉毒杆菌毒素组合物。该组合物可以用于多种治疗、美容和/或化妆目的。本发明还提供了使用HIV－TAT片段或HIV－TAT片段的衍生物稳定肉毒杆菌毒素的方法。

Description

用源自HIV-TAT的多肽片段稳定的肉毒杆菌毒素的组合物及其局部施用和透皮递送的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年12月29日提交的美国临时申请系列号60/882,632的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及新的肉毒杆菌毒素组合物，其可以局部施用以用于多种治疗、美容和/或化妆目的，并且其用源自HIV-TAT的多肽片段稳定。
发明背景
皮肤保护身体器官免受外部环境的威胁，并起保持体温的恒温器作用。其由几个不同的层组成，每层都具有特定的功能。主要的层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮是覆盖真皮的上皮细胞的分化层，真皮由结缔组织组成。表皮和真皮都受皮下组织的进一步支持，皮下组织是脂肪组织的内层。
表皮，皮肤的最上层，仅仅为0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。其由角质形成细胞组成，根据它们的的分化状态，其被分成几层。可以进一步将表皮分成角质层和有活力的表皮，该有活力的表皮由granularmelphigian和基细胞组成。角质层是吸湿性的，需要至少10％重量的水分以保持其弹性和柔软性。吸湿性部分归于角蛋白的持水能力。当角质层丧失其柔软性和弹性时，其变得粗糙且脆，产生干燥皮肤。
真皮，其紧位于表皮之下，为1.5至4毫米厚。其是皮肤的三个层中最厚的。另外，真皮还具有大部分皮肤结构，包括汗腺和脂腺(其通过皮肤中称为毛孔或痤疮的孔分泌物质)、毛囊、神经末梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。然而，真皮的主要组分是胶原和弹性蛋白。
皮下组织是皮肤的最深层。其起用于身体热量保存的绝缘体和用于器官保护的减震器作用(Inlander，Skin，New York，NY：People′sMedical Society，1-7(1998))。另外，皮下组织也贮藏用于能量储备的脂肪。皮肤的pH通常为5至6之间。该酸性是由于存在来自于皮脂腺分泌物的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸。术语“酸外膜(acidmantle)”指在皮肤的大多数区域存在水溶性物质。皮肤的缓冲能力部分由于储存在皮肤角质层中的这些分泌物。
皱纹，年龄的指示特征之一，可能是由皮肤受环境损害而蓄积的生物化学、组织学和生理学变化引起(Benedetto，InternationalJournal of Dermatology，38：641-655(1999))。另外，存在可能引起面部皱纹的皱褶、皱纹和皱痕(creases)的其他第二因子(Stegman等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis编著，MO：Mosby Year Book：5-15(1990))。这些第二因子包括重力的持续牵拉、皮肤上经常和持续的位置压力(例如，在睡眠期间)和由于面部肌肉收缩引起的反复面部运动(Stegman等人.，The Skin of the Aging Face Cosmetic DermatologicalSurgery，第2版，St.Louis编著，MO：Mosby Year Book：5-15(1990))。
为了可能缓和某些老化体征，已经使用了不同的技术。这些技术从包含α羟酸和视黄醇的面部增湿剂到外科手术方法和注射神经毒素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers，一对由眼整形外科医生和皮肤科医生组成的夫妻团队，研究了一种使用A型肉毒杆菌毒素治疗眉间区域与运动相关的皱纹的方法(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，New York：Academic Press，143-150(1981))。在1992年，Carruthers′使用A型肉毒杆菌毒素来治疗皱纹引起该方法最初公布(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，New York：Academic Press，143-150(1981))。直到1994年，同一团队报道了对于面部的其它运动相关的皱纹的经验(Scott，Ophthalmol，87：1044-1049(1980))。这依次引起使用A型肉毒杆菌毒素进行化妆处理的时代的诞生。
有趣地，据认为A型肉毒杆菌毒素是人类所知最致命的天然生物剂。肉毒杆菌(C.botulinum)的孢子可在土壤中找到，并可在不正确地杀菌和密封的食物容器中生长。摄入该细菌可导致肉毒中毒，其可能是致命的。肉毒杆菌毒素通过阻止乙酰胆碱穿过神经肌肉接点的突触传递或释放而导致产生肌肉麻痹，并且其被认为也以其它方式起作用。其作用主要是阻断通常引起肌肉痉挛或收缩的信号，导致麻痹。然而，已经将肉毒杆菌毒素的肌肉-麻痹效应用于治疗功效。已经使用控制施用肉毒杆菌毒素来提供肌肉麻痹以治疗病症，例如以骨骼肌活动过度为特征的神经肌肉失调。已经用肉毒杆菌毒素治疗的病症包括偏侧面肌痉挛、成年人发病的痉挛性斜颈、肛裂、眼睑痉挛、大脑性瘫痪、颈张力障碍、偏头痛、斜视、颞下颌关节障碍和各种类型的肌痛性痉挛和肌痉挛。近来，在治疗和化妆性面部应用中已经利用肉毒杆菌毒素的肌肉-麻痹效应，所述应用例如治疗皱纹、皱眉线(frownlines)及其它面部肌肉痉挛或收缩的后果。
除了A型肉毒杆菌毒素之外，存在七种其它的血清学不同形式的肉毒杆菌毒素，其也由革兰氏阳性菌肉毒杆菌产生。在这八种血清学不同类型的肉毒杆菌毒素中，可引起麻痹的七种被称为肉毒杆菌毒素血清型A、B、C(也称为C1)、D、E、F和G。这些中的每种以用特定类型的抗体中和为特征。肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量，对于所有七种这些活性肉毒杆菌毒素血清型，为约150kD。不同血清型的肉毒杆菌毒素在动物种类方面不同，它们影响它们引起的麻痹的严重性和持续时间。例如，已经确定A型肉毒杆菌毒素的功效为B型肉毒杆菌毒素的500倍以上，如通过在大鼠中产生的麻痹速率所测定。另外，已经确定B型肉毒杆菌毒素在灵长类中以480U/kg的剂量是无毒的，为A型的灵长类LD50的约12倍。由于肉毒杆菌毒素的分子尺寸和分子结构，其不能穿过角质层和多层皮下结构。
当由肉毒杆菌细菌释放时，肉毒杆菌毒素为毒素复合物的组分，所述毒素复合物包含约150kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子和缔合的非毒素蛋白。这些内源性的非毒素蛋白被认为包括血凝素蛋白家族和非血凝素蛋白家族。所述非毒素蛋白被认为稳定毒素复合物中的肉毒杆菌毒素分子和保护它防止变性，例如，当毒素复合物被摄取时被消化酸变性。因此，所述毒素复合物的非毒素蛋白保护肉毒杆菌毒素的活性和增加全身穿透，特别是当经由胃肠道施用所述毒素复合物时。更特别地，据认为某些非毒素蛋白特异性增加穿透胃肠上皮细胞，而其它非毒素蛋白稳定血液中的肉毒杆菌毒素分子。另外，非毒素蛋白在毒素复合物中的存在通常引起毒素复合物具有比单纯的肉毒杆菌毒素分子更大的分子量，所述单纯的肉毒杆菌毒素分子的分子量为约150kD，如之前指出的。例如，肉毒杆菌细菌可以产生A型肉毒杆菌毒素复合物，其具有约900kD、500kD或300kD的分子量。有趣地，B型和C型肉毒杆菌毒素显然产生仅为700kD或500kD的复合物。D型肉毒杆菌毒素产生300kD和500kD两种复合物。E型和F型肉毒杆菌毒素产生仅仅为约300kD的复合物。
为了向肉毒杆菌毒素提供另外的稳定性，通常通过在制备期间将毒素复合物与外源性稳定剂(例如明胶、多糖或最常见的另外的白蛋白)组合来稳定它们。所述稳定剂在不同的环境中起结合和稳定毒素复合物的作用，所述环境包括与制备、运输、贮藏和给药相关的那些。
通常，通过仔细地控制包含肉毒杆菌毒素复合物和白蛋白的组合物的注射，给患者施用肉毒杆菌毒素，但是存在与该方法相关的一些问题。例如，因为注射的毒素复合物包含非毒素蛋白和白蛋白，这二者稳定肉毒杆菌毒素，且增加所述毒素复合物的分子量，所以该毒素复合物在体内具有长半衰期，不易扩散进入组织，可能在患者中引起不想要的抗原应答。而且，因为所述非毒素蛋白和白蛋白稳定血液中的肉毒杆菌毒素，所以必须仔细地进行注射，以便他们不会将大量毒素释放到患者的血流中，导致致命的全身中毒。因此，通常必须由深入了解人体解剖学的受过高级训练的医学专业人员精确地注射。
鉴于前述讨论的所有问题，非常期望提供一种不使用白蛋白的稳定肉毒杆菌毒素的方法。另外，也非常希望这样的方法能降低肉毒杆菌毒素的抗原性和血液稳定性，同时增加肉毒杆菌毒素复合物在体内的扩散速率，从而使得肉毒杆菌毒素更安全地用于各种治疗、美容和/或化妆目的。还期望提供一种给药方法，其不会决定性地依赖医学专业人士精确地注射肉毒杆菌毒素，以便实现毒素的安全施用。
发明概述
本发明的一个方面是认识到，HIV-TAT的某些多肽片段、或源自HIV-TAT片段的多肽片段可以添加到肉毒杆菌毒素复合物、尤其是减少的肉毒杆菌毒素复合物中，以稳定它们。在一个特别优选的实施方案中，所述多肽片段具有与HIV-TAT的氨基酸残基49-57(RKKRRQRRR，SEQ ID NO.1)相对应的序列。在另一个优选的实施方案中，所述多肽片段具有与HIV-TAT的氨基酸残基49-57的反向序列(RRRQRRKKR，下文称作SEQ ID NO.2)相对应的序列。另外，本发明也涉及在功能上等价的SEQ ID NO 1和2序列的多肽类似物，例如其中已经进行保守置换的情况。如在本申请中使用的，术语“HIV-TAT片段衍生物”包含由SEQ ID NO.2定义的反向的HIV-TAT多肽、以及其中已经进行保守置换的SEQ ID NO 1或2的任何多肽类似物。
本发明的另一个方面是认识到，从肉毒杆菌细菌获得的肉毒杆菌毒素复合物中的内源性非毒素蛋白(即无毒的血凝素和非血凝素蛋白)会不希望地增加所述毒素复合物的稳定性和毒性，同时不希望地降低所述毒素扩散穿过皮肤上皮的能力。本发明进一步认识到，当在常规制备期间将外源性稳定剂例如白蛋白结合到肉毒杆菌毒素时，会加强这些作用。因此，本发明的一个方面是，提供肉毒杆菌毒素复合物，其中血凝素、非毒素非血凝素和/或外源性白蛋白的量与常规市售可得的肉毒杆菌毒素(例如
Figure G2007800486906D00051
或
Figure G2007800486906D00052
)相比选择性地且独立地减少。这样的肉毒杆菌毒素复合物下文称作“减少的肉毒杆菌毒素复合物”。
因此，本发明的一个目的是提供一种组合物，其包含用具有与SEQID NO.1或2相对应的序列的多肽稳定的肉毒杆菌毒素复合物(或减少的肉毒杆菌毒素复合物)。所述组合物任选地可包含加入的外源性稳定剂，例如白蛋白。
本文使用的术语“稳定”是指HIV-TAT片段(例如，SEQ ID NO.1)或HIV-TAT片段衍生物(例如，SEQ ID NO.2)防止肉毒杆菌毒素变性和保持毒素活性的能力，这可以通过SNAPtide测定或DigitalAbduction Scoring(DAS)测定来测量。在优选的实施方案中，本发明的肉毒杆菌毒素组合物被充分稳定，以在加工和患者给药步骤中保留基本上所有的生物学活性，所述步骤包括、但不限于，填充、冻干、储存和递送重构。
本发明还涉及一种产生生物学效应的方法，其中将本发明的稳定的肉毒杆菌复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物施用给患者。在某些优选实施方案中，所述稳定的肉毒杆菌复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物以有效量局部地施用于需要这种处理的受试者或患者的(优选)皮肤。所述生物学效应可以包括，例如，肌肉麻痹、减少分泌过多或出汗、治疗神经性疼痛或偏头痛、减少肌肉痉挛、预防或减少痤疮、减少或增加免疫应答、减少皱纹或预防或治疗各种其它病症。在其它实施方案中，所述稳定的肉毒杆菌毒素复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物通过肠胃外注射例如皮下注射来施用。
本发明还提供了试剂盒，其用于制备包含肉毒杆菌毒素复合物(或减少的肉毒杆菌毒素复合物)和具有根据SEQ ID NO.1或2的序列的多肽的制剂，或可用于产生这种制剂的预混物。还提供了试剂盒，其包含用于向受试者顺次施用肉毒杆菌毒素复合物(或减少的肉毒杆菌毒素复合物)和粘附分子的工具。
发明详述
本发明涉及新的组合物，其包含肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物，如本文所述，它们通过添加多肽而被稳定，所述多肽是HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物。在优选的实施方案中，所述起稳定作用的多肽具有根据SEQ ID NO 1或2的序列，或可以通过保守置换而与那些序列相关联。在某些实施方案中，根据本发明的稳定的肉毒杆菌毒素组合物能够穿过皮肤上皮运输或递送肉毒杆菌毒素(也称作“透皮递送”)，且具有提高的穿透性、减少的抗原性和血液稳定性。如本文所述，本发明的组合物可以用作向受试者提供肉毒杆菌毒素的局部施用剂，用于各种治疗、美容和/或化妆目的。本发明的组合物还具有比肉毒杆菌毒素的其它组合物和递送方法更高的安全特征。
本文使用的术语“肉毒杆菌毒素”指任一种已知类型的肉毒杆菌毒素(即，约150kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子)，无论是由细菌生成的还是通过重组技术生成的，和可能随后发现的任何这样的类型，包括新发现的血清型和工程改造的变体或融合蛋白。如上所述，目前已经表征了七种免疫上不同的肉毒杆菌神经毒素，即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，其各自以用特定类型的抗体中和为特征。所述肉毒杆菌毒素血清型为市售可得的，例如，得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)和Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)和其它来源。不同血清型的肉毒杆菌毒素随动物种类而不同，影响它们引起的麻痹的严重性和持续时间。至少两种肉毒杆菌毒素，A型和B型，是以用于治疗某些病症的制剂市售可得的。例如，A型包含在具有商标
Figure G2007800486906D00071
的Allergan制剂中和具有商标
Figure G2007800486906D00072
的Ipsen制剂中，B型包含在具有商标
Figure G2007800486906D00073
的Elan制剂中。
在本发明的组合物中使用的术语“肉毒杆菌毒素”可以可选地指肉毒杆菌毒素衍生物，即，具有肉毒杆菌毒素活性但相对于天然存在的或重组的天然肉毒杆菌毒素在任何部分或任何链上包含有一个或多个化学或功能改变的化合物。例如，所述肉毒杆菌毒素可以是修饰的神经毒素，即与天然的相比具有至少一个氨基酸被删除、修饰或替换的神经毒素，或者所述修饰的神经毒素可以是重组生成的神经毒素或其衍生物或片段。在本发明的一个特别优选的实施方案中，肉毒杆菌毒素衍生物是具有序列GDSCSVEAETAGK(SEQ ID NO.3)的多肽。该序列与A型肉毒杆菌毒素分子负责所述毒素在人体中的生物学活性的部分相对应。肉毒杆菌毒素也可以是已经以一种方式修饰的毒素，所述方式例如增加其性质或减少不想要的副作用，但仍然保持希望的肉毒杆菌毒素活性。所述肉毒杆菌毒素可以来自由细菌生成的任一种肉毒杆菌毒素复合物，如上所述。可选地，本发明所用的肉毒杆菌毒素可以是使用重组或合成化学技术制备的毒素，例如重组肽、融合蛋白、或杂种神经毒素，例如从不同肉毒杆菌毒素血清型的亚基或域制备(例如，参见美国专利6,444,209)。所述肉毒杆菌毒素也可以是整个分子的一部分，其已经显示具有必需的肉毒杆菌毒素活性，并且在这种情况下，可以单独使用或作为组合或缀合分子例如融合蛋白的一部分使用。或者，所述肉毒杆菌毒素可以是肉毒杆菌毒素前体的形式，其本身可以是无毒的，例如无毒的锌蛋白酶，在蛋白酶剪切后其变成有毒的。
本文使用的术语“肉毒杆菌毒素复合物”或“毒素复合物”是指肉毒杆菌毒素(例如，属于肉毒杆菌毒素血清型A-G的任一种的约150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子或SEQ ID NO.3的肉毒杆菌毒素片段)连同结合的内源性非毒素蛋白(即，由肉毒杆菌细菌生成的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)一起。然而，应当注意，所述肉毒杆菌毒素复合物不必作为一种单一毒素复合物来源于肉毒杆菌细菌。例如，可以首先重组制备肉毒杆菌毒素或修饰的肉毒杆菌毒素，然后将其与非毒素蛋白混合。重组的肉毒杆菌毒素还可以是购买的(例如，购自ListBiological Laboratories，Campbell，CA)，然后将其与非毒素蛋白混合。
本发明还涉及“减少的肉毒杆菌毒素复合物”，其中所述肉毒杆菌毒素复合物(包括含有肉毒杆菌毒素衍生物、例如SEQ ID NO.3中的多肽序列的那些)具有与在由肉毒杆菌细菌生成的肉毒杆菌毒素复合物中天然发现的数量相比减少量的非毒素蛋白。在一个实施方案中，使用任何常规蛋白分离方法，从来源于肉毒杆菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中提取一部分血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，从而制备减少的肉毒杆菌毒素复合物。例如，减少的肉毒杆菌毒素复合物可以通过将其暴露在pH 7.3下的红细胞以分离肉毒杆菌毒素复合物来产生(例如参见EP 1514556 A1，其通过引用并入本文)。可以使用HPLC、透析、柱、离心及其它方法来从蛋白中提取蛋白。或者，当通过混合合成产生的肉毒杆菌毒素与非毒素蛋白来产生减少的肉毒杆菌毒素复合物时，人们可仅仅向该混合物中加入比天然存在的肉毒杆菌毒素复合物中所含的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白。根据本发明，可以独立地以任何量减少在减少的肉毒杆菌毒素复合物中的任何非毒素蛋白(例如血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或两者)。在某些示例性的实施方案中，一种或多种非毒素蛋白相对于在肉毒杆菌毒素复合物中通常发现的量减少了至少约0.5％、1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。MYOBLOC含有5000U的B型肉毒杆菌毒素/ml和0.05％的人血清白蛋白、0.01M丁二酸钠和0.1M氯化钠。DYSPORT含有500U的A型肉毒杆菌毒素-血凝素复合物与125mcg的白蛋白和2.4mg的乳糖。在一个特别感兴趣的实施方案中，从所述肉毒杆菌毒素复合物中除去了基本上所有通常在来源于肉毒杆菌细菌的肉毒杆菌毒素复合物中发现的非毒素蛋白(例如＞95％的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。此外，尽管在某些情况下可以以相同的数量减少内源性非毒素蛋白的量，本发明还涉及以不同的量减少每种内源性非毒素蛋白，和减少至少一种内源性非毒素蛋白，但不减少其它的。
除了(或代替)减少使肉毒杆菌毒素复合物不稳定的内源性非毒素蛋白的量之外，本发明还涉及减少通常在制备期间加入的外源性稳定剂的量。这种外源性稳定剂的一个实例是白蛋白，其在制备肉毒杆菌毒素复合物期间通常加入的量等于在天然存在的肉毒杆菌毒素复合物的内源性非毒素、非血凝素组分中发现的白蛋白量的1000倍。根据本发明，加入的外源性白蛋白的量可以是少于常规千倍过量的外源性白蛋白的任何量。在本发明的某些示例性的实施方案中，加入仅仅约500x、400x、300x、200x、100x、50x、10x、5x、1x、0.5x、0.1x或0.01x在天然存在的肉毒杆菌毒素复合物中的白蛋白的量。在一个实施方案中，不向本发明的组合物加入作为稳定剂的外源性白蛋白。在其它实施方案中，将除了(或代替)白蛋白之外的外源性稳定剂加入本发明的治疗用局部组合物中。例如，本发明涉及的其它稳定剂包括乳糖、明胶和多糖。
尽管所述稳定的肉毒杆菌毒素复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物可以从任一种肉毒杆菌毒素血清型(即，类型A-G)得到或衍生，但在本发明的优选实施方案中，它们从A型血清型肉毒杆菌毒素得到或衍生。
在优选的实施方案中，本发明的肉毒杆菌毒素组合物通过添加非天然多肽来稳定，所述非天然多肽是HIV-TAT片段(例如，SEQ ID NO.1)或源自HIV-TAT片段(例如，SEQ ID.NO 2，它是SEQ ID NO.1多肽的反向序列)。HIV-TAT片段或其衍生物可以与肉毒杆菌毒素分子共价地或非共价地结合，以稳定肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物。在一个优选的实施方案中，HIV-TAT片段或其衍生物与肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌复合物物理地结合，从而非共价地使它们稳定。HIV-TAT片段或其衍生物的相对量取决于希望的稳定程度。例如，当起稳定作用的HIV-TAT片段或其衍生物与SEQ IDNO.1或2的多肽相对应时，起稳定作用的肽的有用的浓度范围是约0.1ng-约1.0mg/单位的肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物。更优选地，SEQ ID NO.1或2的起稳定作用的肽的范围可以是约0.1mg-0.5mg/单位的肉毒杆菌毒素。
可选地，使用本领域已知的连接化学，可以将起稳定作用的HIV-TAT片段或其衍生物共价连接至肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物中的肉毒杆菌毒素分子。作为实例，通过偶联剂或缀合剂，可以实现2个组分的偶联。可以使用多种分子间交联剂(参见，例如，Means，G.E.和Feeney，R.E.，Chemical Modificationof Proteins，Holden-Day，1974，pp.39-43)。这些试剂是，例如，J-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)二马来酰亚胺(二者都是对巯基高度特异性的，并形成不可逆连接)；N，N′-亚乙基-二-(碘代乙酰胺)或具有6至11个碳亚甲基桥的其它此类试剂(它们对巯基是相对特异性的)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(它与氨基和酪氨酸基团形成不可逆连接)。可用于该目的的其它交联剂包括：p，p′二氟-m，m′-二硝基二苯基砜(它与氨基和和酚基形成不可逆的交联)；二亚胺代己二酸二甲酯(它是氨基特异性的)；苯酚-1，4-二磺酰氯(它主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫代氰酸酯，或偶氮苯-对二异氰酸酯(它主要与氨基反应)；戊二醛(它与几种不同的侧链反应)和disdiazobenzidine(它主要与酪氨酸和组氨酸反应)。
交联剂可以是同双功能的，即具有2个经历相同反应的官能团。优选的同双功能交联剂是双马来酰亚胺基己烷(“BMH”)。BMH含有2个马来酰亚胺官能团，它们在温和条件(pH 6.5-7.7)下与含有巯基的化合物特异性地反应，所述2个马来酰亚胺基团由烃链连接。因此，BMH可以用于不可逆地交联含有半胱氨酸残基的多肽。
交联剂也可以是异双功能的。异双功能交联剂具有2个不同的官能团，例如胺反应性基团和巯基反应性基团，它们分别交联具有游离胺基和巯基的2种蛋白。异双功能交联剂的实例是琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(“MBS”)，和琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(“SMPB”)，MBS的延伸的链类似物。这些交联物的琥珀酰亚胺基与伯胺反应，巯基反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的巯基形成共价键。
交联剂在水中的溶解度通常较低。可以将亲水基团例如磺酸酯基团添加到交联剂上，以提高它的水溶解度。磺基-MBS和磺基-SMCC是为水溶解度而改良的交联剂的实例。
许多交联剂产生在细胞条件下基本上不可切割的缀合物。但是，有些交联剂含有在细胞条件下可切割的共价键，例如二硫化物，例如，二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(“DSP”)。Traut氏试剂和N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(“SPDP”)是众所周知的可切割的交联物。可切割的交联剂的应用，允许在递送进靶区域后将起稳定作用的HIV-TAT片段或其衍生物与肉毒杆菌毒素分子分离。直接的二硫键也可能是有用的。
有些新的交联剂例如n-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(“GMBS”)和磺基-GMBS具有降低的免疫原性。在本发明的一些实施方案中，这样的降低的免疫原性可能是有利的。
许多交联剂，包括上面讨论的那些，可商业上得到。关于它们的使用的详细说明，可以容易地从商业供应商得到。关于蛋白交联和缀合物制备的一般参考文献是：S.S.Wong，Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking，CRC Press(1991)。
化学交联可以包括间隔臂的应用。间隔臂提供分子内柔性或调节缀合的部分之间的分子内距离，从而可以辅助保持生物学活性。间隔臂可以是包含间隔氨基酸的多肽部分形式，可选地，间隔臂可以是交联剂的一部分，例如在“长链SPDP”(Pierce Chem.Co.，Rockford，I11.，cat.No.21651H)中的间隔臂。
除了通过化学连接来生产稳定的肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物以外，本发明也涉及使用基因融合技术来生产这些稳定的毒素复合物。例如，使用众所周知的基因工程技术，可以将编码融合的肉毒杆菌毒素/HIV-TAT片段或肉毒杆菌毒素/HIV-TAT片段衍生物的核酸序列植入细胞，使细胞表达所述稳定的毒素复合物。
在本发明的特别优选的实施方案中，将HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物共价连接到肉毒杆菌毒素分子或其衍生物的末端，形成线性分子。在这样的实施方案中，经常有利地在肉毒杆菌毒素(或其衍生物)和HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物之间使用甘氨酸间隔物。例如，当肉毒杆菌毒素衍生物是根据SEQ ID NO.3的多肽时，所述稳定的肉毒杆菌毒素可以具有形式RRRQRRKKR-GG-GDSCSVEAETAGK(SEQID NO.4)。当希望向毒素分子添加超过一个的起稳定作用的多肽时，所述稳定的肉毒杆菌毒素可以具有形式RRRQRRKKR-GG-毒素氨基酸-GG-RRRQRRKKR。但是，应当注意到，本发明也涉及HIV-TAT片段或其衍生物的重复单元(例如，RRRQRRKKR RRRQRRKKR)用于稳定的应用，无论是通过共价还是非共价连接。
稳定肉毒杆菌毒素分子所需的起稳定作用的多肽链(无论它们是HIV-TAT片段还是其衍生物)的数目取决于多种因素，例如具体的目标血清型，和考虑的肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素片段或衍生物的大小和化学组成。例如，当使用肉毒杆菌毒素衍生物且其是相对较小的多肽(例如，根据SEQ ID NO.3的多肽)时，需要共价连接更少的起稳定作用的多肽链，一个共价连接的起稳定作用的多肽链(例如，SEQID NO 1或2的多肽，或其衍生物)可能足够某些应用。
本发明的组合物优选地是用于需要特别治疗的受试者或患者(即人类或其它哺乳动物)的皮肤或上皮的产品形式。术语“需要”包括药物或健康相关的需要，例如治疗涉及不希望的面部肌肉痉挛的病症，及化妆和主观需要，例如，改变或改善面部组织的外观。通常，本发明的组合物可以通过本领域已知的任何方式来施用，其非限制性实例包括肠胃外注射(例如，皮下注射)，局部施用于皮肤上，或通过位于皮下或皮上的贴剂。
SEQ ID NO.1的HIV-TAT片段以前被认为促进不同“货物分子”的细胞内递送(参见，例如，美国专利No.5,804,604)。因而，当已经用SEQ ID NO.1的HIV-TAT片段稳定的肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物接触患者组织时(例如，在局部给药过程中)，会发生肉毒杆菌毒素的增强的细胞穿透。另外，具有序列SEQ ID NO.2的HIV-TAT衍生的多肽也促进细胞内穿透以及跨膜穿透。因此，当已经用SEQ ID NO.2的多肽稳定的肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物接触患者组织时，会发生肉毒杆菌毒素的增强的细胞内和/或跨膜运输。
通常，本发明的组合物通过混合所述稳定的肉毒杆菌毒素复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物与一种或多种附加的药学可接受的载体或者赋形剂来制备。在它们的最简单的形式中，它们可包含单一的水性药学可接受的载体或稀释剂，例如缓冲盐水。当要注射施用本发明的组合物时，这样的实施方案是特别优选的。然而，当要局部施用本发明的组合物时，它们可包含在局部药用或化妆用组合物中常见的其它成分，即，皮肤用或药学可接受的载体、媒介物或介质，即与它们所要施用的组织相容的载体、媒介物或介质。本文使用的术语“皮肤用或药学可接受的”指如此描述的适于与这些组织接触使用或用于患者而没有异常毒性、不相容性、不稳定性、变态反应等的组分或成分。视情况而定，本发明的组合物可包括通常在本领域，特别是在化妆和皮肤病学中考虑使用的任何成分。
关于它们的形式，本发明的组合物可包括溶液剂、乳剂(包括微乳剂)、混悬液、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂或其它用于施用到皮肤及其中可使用所述组合物的其它组织的典型的固体或液体组合物。这样的组合物除了包含肉毒杆菌毒素和HIV-TAT片段或其衍生物之外，可包含通常在这样的产品中使用的其它成分，例如抗微生物剂、增湿剂和水化剂、渗透剂、防腐剂、乳化剂、天然油或合成油、溶剂、表面活性剂、清洁剂、胶凝剂、润肤剂、抗氧化剂、芳香剂、填充剂、增稠剂、蜡、去味剂、染料、着色剂、散剂、粘度调节剂和水，且任选地包括麻醉药、抗痒活性剂、植物提取物、调节剂、染黑或光亮剂、闪光剂(glitter)、湿润剂、云母、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、防晒剂(sunblocks)、维生素和phytomedicinals。
根据本发明的组合物可以是控释或缓释组合物的形式，其中所述稳定的肉毒杆菌毒素复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物被封装或者另外包含在物质内，使得它们以受控的方式随着时间推移释放在皮肤上。可以将所述包含肉毒杆菌毒素和HIV-TAT片段或其衍生物的组合物包含在基质、脂质体、囊泡、微胶囊、微球等之内，或者包含在固体颗粒物质之内，所有这些选择和/或构建的物质能释放所述稳定的肉毒杆菌毒素一段时间。
可以以产生麻痹、产生松弛、缓解收缩、预防或缓解痉挛、减少腺排出或其它预期效果的有效量，将肉毒杆菌毒素递送至皮肤下的肌肉或皮肤内的腺结构。相对于可注射的或可植入的物质，用这种方式局部递送肉毒杆菌毒素可以提供减少的剂量、降低的毒性和得到用于预期效果的更精确的剂量最佳化。
施用本发明的组合物以便施用有效量的肉毒杆菌毒素。本文使用的术语“有效量”指如上定义的肉毒杆菌毒素的量，其足够产生希望的肌肉麻痹或其它生物学或美容效应，但无疑是安全量，即，能避免严重副作用的足够低的量。预期效果包括松弛某些肌肉，其目的是例如减少细纹线和/或皱纹的出现，特别是在脸上，或者以其它方式调整面部外观例如增宽眼睛、提升嘴角或使从上唇散开的纹线平滑或一般性缓解肌紧张。最后提及的功效，一般性缓解肌紧张可以在面部或其它地方实现。本发明的组合物可包含用作单剂量治疗的适当有效量的肉毒杆菌毒素，或者可以是更浓缩的，用于在给药部位稀释或者用于多种应用。所述稳定的肉毒杆菌毒素复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物可以透皮施用给受试者，以治疗病症例如不想要的面部肌肉或其它肌痉挛、多汗、痤疮或其中想要缓解肌肉疼痛或痉挛的体内其它地方的病症。局部施用肉毒杆菌毒素，用于透皮递送至肌肉或其它皮肤相关结构。可以施用至例如腿、肩部、背部(包括腰部)、腋下、掌心、足部、颈、腹股沟、手背或足背、肘、上肢、膝、大腿、臀、躯干、骨盆或其中希望施用肉毒杆菌毒素的身体的任何其它部分。
也可以施用肉毒杆菌毒素以治疗其它的病症，包括但不限于治疗神经性疼痛、预防或减轻偏头痛或其它的头痛、预防或减轻痤疮、预防或减轻张力障碍或张力障碍收缩(无论是主观的或临床的)、预防或减轻与主观或临床上的多汗相关的症状、减少分泌过多或出汗、减少或增加免疫应答、或治疗已经建议或执行通过注射施用肉毒杆菌毒素的其它病症。
最优选地，由医师或其它卫生保健专业人员或在其指导下施用所述组合物。它们可以按单一的治疗或在随时间的一系列周期性治疗中施用。为了透皮递送肉毒杆菌毒素用于上述的目的，局部施用如上所述的组合物至其中希望该作用的部位的皮肤。因为其性质，最优选应当以一定的施用速率和施用频率慎重地施用一定量的所施用的肉毒杆菌毒素，所述速率和频率将产生希望的结果而不会引起任何不良的或不希望的结果。因此，例如，本发明的局部组合物应当以如下速率施用：从约1U至约20,000U，优选从约1U至约2,000U的肉毒杆菌毒素/cm2的皮肤表面。例如，在这些范围内的较高剂量可以优选地与控释物质组合，或在除去之前在皮肤上停留较短的时间。
本发明还包括用于递送如上所述的包含肉毒杆菌毒素的组合物透过皮肤的透皮递送装置。这样的装置可以象皮肤贴剂一样结构简单，或者可以是更复杂的装置，其包括用于施用和监测组合物施用的工具，和任选的用于从一个或多个方面监测受试者病症包括监测受试者对正在施用的物质的反应的工具。
本发明的组合物适用于pH为约4.5至约6.3的生理环境，因此，其可具有这样的pH。根据本发明的组合物可以贮藏在室温下或者冷冻条件下。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅仅是用于阐述的目的，根据它们的各种改良和变化将容易地由本领域技术人员提出，并且这些改良和变化包括在本申请的精神和范围及附加的权利要求的范围内。将所有本文引用的出版物、专利和专利申请以其全文通过引用并入本文用于所有的目的。

Claims (13)

1.一种稳定肉毒杆菌毒素的方法，所述方法包括，
提供肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物；
提供一种多肽，其为HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物，和
将所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物与所述多肽组合。
2.根据权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物共价连接至所述多肽。
3.权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物被所述多肽非共价地稳定。
4.权利要求1的方法，其中所述HIV-TAT片段具有根据SEQ IDNO.1的序列。
5.权利要求1的方法，其中所述HIV-TAT片段具有根据SEQ IDNO.2的序列。
6.权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物包含具有根据SEQ ID NO.3的序列的多肽。
7.权利要求1的方法，其中所述减少的肉毒杆菌毒素复合物包含与直接从肉毒杆菌中提取的肉毒杆菌毒素复合物中天然存在的量相比减少量的血凝素蛋白或非毒素、非血凝素蛋白或两者。
8.根据权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物含有白蛋白作为外源性稳定剂。
9.权利要求6的方法，其中所述白蛋白的存在量等于在天然存在的肉毒杆菌毒素复合物中的白蛋白的量的约500、400、300、200、100、50、10、5、1、0.5、0.1或0.01倍。
10.权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物包含选自下述的肉毒杆菌毒素：肉毒杆菌毒素衍生物、重组的肉毒杆菌毒素、修饰的肉毒杆菌毒素、A型肉毒杆菌毒素、B型肉毒杆菌毒素、C型肉毒杆菌毒素、D型肉毒杆菌毒素、E型肉毒杆菌毒素、F型肉毒杆菌毒素和G型肉毒杆菌毒素。
11.一种稳定的肉毒杆菌毒素组合物，其中所述稳定的肉毒杆菌毒素包含
肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物；和
具有根据SEQ ID NO.2的序列的多肽。
12.根据权利要求8的稳定的肉毒杆菌毒素组合物，其中所述多肽非共价地结合所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物。
13.根据权利要求8的稳定的肉毒杆菌毒素组合物，其中所述多肽共价地连接所述肉毒杆菌毒素复合物或减少的肉毒杆菌毒素复合物。
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