BRPI0720730A2 - Composições e métodos de aplicação tópica e liberação transdérmica de toxinas botulínicas estabilizadas com fragmentos de polipeptídeo derivados de hiv-tat. - Google Patents

Composições e métodos de aplicação tópica e liberação transdérmica de toxinas botulínicas estabilizadas com fragmentos de polipeptídeo derivados de hiv-tat. Download PDF

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Jae Hoon Lee
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E MÉTODOS DE APLICAÇÃO TÓPICA E LIBERAÇÃO TRANS- DÉRMICA DE TOXINAS BOTULÍNICAS ESTABILIZADAS COM FRAG- MENTOS DE POLIPEPTÍDEO DERIVADOS DE HIV-TAT".
Referências Remissivas aos Pedidos de Depósito Correlatos Esse pedido reivindica a prioridade ao Pedido Provisório U.S. N0 de Série 60/882.632, depositado em 29 de dezembro de 2006, cujos conteú- dos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a novas composições de toxina botulínica que podem ser topicamente aplicadas para diversos propósitos terapêuticos, estéticos e/ou cosméticos e que são estabilizadas por fragmen- tos de polipeptídeo derivados de HTV-TAT.
Antecedentes da Invenção
A pele protege os órgãos do corpo de ameaças ambientais ex- ternas e atua como um termostato para manter a temperatura do corpo. Es- sa consiste em diversas camadas diferentes, cada uma com funções espe- cializadas. As camadas principais incluem a epiderme, a derme e a hipo- derme. A epiderme é uma camada de estratificação de células epiteliais que cobre a derme, essa consiste no tecido conjuntivo. Tanto a epiderme como a derme são ainda sustentadas pela hipoderme, uma camada interna de teci- do adiposo.
A epiderme, a camada superior da pele, possui apenas 0,1 a 1,5 milímetros de espessura (lnlander, Skin, New York, NY: People’s Medicai Society, 1-7 (1998)). Essa consiste em queratinócitos e é dividida em várias camadas com base no seu estado de diferenciação. A epiderme pode ser ainda classificada dentro do estrato córneo e a epiderme viável, que consiste nas células melfigianas granulares e basais. O estrato córneo é higroscópico e requer pelo menos 10% de umidade por peso para manter sua flexibilidade e maciez. A higroscopicidade é atribuível em parte à capacidade de retenção de água de queratina. Quando a camada córnea perde sua maciez e flexibi- lidade essa se torna áspera e quebradiça, resultando em pele seca. A derme, que se situa logo abaixo da epiderme, possui de 1,5 a
4 milímetros de espessura. Essa é a mais grossa das três camadas da pele. Ademais, a derme também é interna à maioria das estruturas da pele, inclu- sive glândulas sudoríparas e oleosas (que secretam substâncias através de 5 aberturas na pele chamadas de poros, ou comedões), folículos capilares, terminações nervosas, e vasos sanguíneos e linfáticos (lnlander, Skin, New York, NY: PeopIe1S Medicai Society, 1 -7 (1998)). Entretanto, os componen- tes principais da derme são colágeno e clastina.
A hipoderme é a camada mais profunda da pele. Essa atua tanto 10 como um isolante para conservação do calor corporal e um amortecedor pa- ra proteção dos órgãos (lnlander, Skin, New York, NY: People’s Medicai So- ciety, 1-7 (1998)). Ademais, a hipoderme também armazena gordura para reservas de energia. O pH da pele é normalmente entre 5 e 6. Essa acidez se deve à presença de aminoácidos anfotéricos, ácido láctico e ácidos gra- 15 xos das secreções das glândulas sebáceas. O termo "manto ácido" refere-se à presença das substâncias solúveis em água na maioria das regiões da pele. A capacidade de tamponamento da pele se deve em parte a essas se- creções armazenadas na camada córnea da pele.
As rugas, um dos sinais reveladores de envelhecimento, podem ■ 20 ser causadas por alterações bioquímicas, histológicas e fisiológicas que se acumulam provenientes de dano ambiental à pele. (Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)). Ademais, há outros fatores se- cundários que podem causar pregas, sulcos e dobras características de ru- gas faciais (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermato- Iogical Surgery, 2nd cd., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)). Es- ses fatores secundários incluem a força constante de gravidade, pressão posicionai freqüente e constante sobre a pele (por exemplo, durante o sono), e movimentos faciais repetidos causados pela contração de músculos faciais (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetie Dermatologieal Sur- gery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)).
Diferentes técnicas foram utilizadas para atenuar potencialmente alguns dos sinais do envelhecimento. Essas técnicas variam de hidratantes faciais contendo ácidos alfa-hidróxi e retinol a procedimentos cirúrgicos e injeções de neurotoxinas. Por exemplo, em 1986, Jean e Alastair Carruthers, um casal que consiste em um cirurgião ocuplástico e uma dermatologista, desenvolveu um método de utilização da forma de toxina botulínica tipo A 5 para o tratamento de rugas associadas ao movimento na área da glabela (Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)). O uso do método dos Carruthers da forma de toxina botulínica tipo A para o tratamento de rugas resultou na pu- blicação seminal dessa abordagem em 1992 (Schantz and Scott, Tn Lewis 10 GE (Ed) Biomedical Aspeets of Botulinum, New York: Academic Press, 143- 150 (1981)). Já em 1994, o mesmo casal relatou experiências com outras rugas associadas ao movimento no rosto (Scott, Ophthalmol, 87: 1044-1049 (1980)). Isso, por sua vez, resultou no nascimento da era de tratamento cosmético que utiliza a forma de toxina botulínica tipo A.
De forma interessante, diz-se que a forma de toxina botulínica
tipo A é o agente biológico natural mais letal conhecido pelo homem. Os es- poros de C. botulinum são encontrados no solo e podem se desenvolver em recipientes de alimentos impropriamente esterilizados e vedados. A ingestão das bactérias causa botulismo, que pode ser fatal. A toxina botulínica atua 20 para produzir paralisia dos músculos impedindo a transmissão ou liberação sináptica de acetilcolina através da junção neuromuscular, e acredita-se que essa atua de outras maneiras também. Sua ação essencialmente bloqueia os sinais que normalmente poderiam causar espasmos ou contrações mus- culares, resultando em paralisia. Entretanto, os efeitos paralisantes muscula- 25 res da toxina botulínica foram usados para efeitos terapêuticos. A adminis- tração controlada da toxina botulínica foi usada para proporcionar paralisia muscular de modo a tratar condições, por exemplo, distúrbios neuromuscula- res caracterizados por músculos esqueléticos hiperativos. As condições que foram tratadas com toxina botulínica incluem espasmo hemifacial, torcicolo 30 espasmódico em adultos, fissura anal, blefarospasmo, paralisia cerebral, distonia cervical, enxaquecas, estrabismo, disfunção da articulação tempo- romandibular, e vários tipos de cãibra e espasmos musculares. Mais recen- temente, os efeitos paralisantes musculares da toxina botulínica tiraram van- tagem em aplicações faciais terapêuticas e cosméticas, tal como, tratamento de rugas, linhas de expressão, e outros resultados de espasmos ou contra- ções de músculos faciais.
5 Além da forma de toxina botulínica tipo A, há sete outras formas
sorologicamente distintas de toxina botulínica que também são produzidas pelas bactérias gram-positivas Clostridium botulinum. Desses oito tipos soro- logicamente distintos de toxina botulínica, os sete que podem causar parali- sia foram designados sorotipos de toxina botulínica A, B, C (também conhe- 10 cidos como C-ι), D, E, F e G. Cada um desses é distinguido por neutralização com anticorpos tipo-específicos. O peso molecular da molécula proteica da toxina botulínica, de todos esses sete sorotipos da toxina botulínica ativa, é cerca de 150 kD. Os diferentes sorotipos de toxina botulínica variam nas es- pécies animais que esses afetam e na gravidade e duração da paralisia que 15 provocam. Por exemplo, foi determinado que a toxina botulínica tipo A é 500 vezes mais potente do que a toxina botulínica tipo B, como medido pela taxa de paralisia produzida em ratos. Adicionalmente, a toxina botulínica tipo B foi determinada como não-tóxica em primatas em uma dose de 480 U/kg, cerca de 12 vezes o LD50 em primatas para tipo A. Devido ao tamanho de molécu- 20 Ia e estrutura molecular da toxina botulínica, essa não atravessa o estrato córneo e as múltiplas camadas da arquitetura cutânea subjacente.
À medida que é liberada pelas bactérias Clostridium botulinum, a toxina botulínica é um componente de um complexo de toxinas que contém a molécula proteica de toxina botulínica de aproximadamente 150 kD junta- 25 mente com as proteínas de não-toxina associadas. Acredita-se que essas proteínas não-toxina endógenas incluem uma família de proteínas hemaglu- tinina, bem como proteína não-hemaglutinina. Acredita-se que as proteínas não-toxina estabilizam a molécula da toxina botulínica no complexo de toxi- nas e a protege contra desnaturação, por exemplo, por ácidos digestivos 30 quando o complexo de toxinas for ingerido. Assim, as proteínas não-toxina do complexo de toxinas protegem a atividade da toxina botulínica e aumen- tam a penetração sistêmica, particularmente quando o complexo de toxinas é administrado através do trato gastrointestinal. Mais especificamente, acre- dita-se que algumas das proteínas não-toxina aumentam especificamente a penetração através do epitélio gastrointestinal enquanto outras proteínas não-toxina estabilizam a molécula da toxina botulínica no sangue. Adicio- nalmente, a presença de proteínas não-toxina nos complexos de toxinas faz tipicamente com que os complexos de toxinas possuam pesos moleculares que sejam maiores que aqueles da molécula da toxina botulínica exposta, que é cerca de 150 kD, como anteriormente observado. Por exemplo, as bactérias Clostridium botulinum podem produzir complexos de toxina botulí- nica tipo A que possuem pesos moleculares de cerca de 900 JcD1 500 kD ou 300 kD. De maneira interessante, as toxinas botulínicas tipos BeC são apa- rentemente produzidas apenas como um complexo de 700 IcD ou 500 kD. A toxina botulínica tipo D é produzida tanto como complexos de 300 kD como 500 kD. As toxinas botulínicas tipos EeF são produzidas apenas como complexos de aproximadamente 300 kD.
Para fornecer estabilidade adicional à toxina botulínica, os com- plexos de toxinas são geralmente estabilizados ao se combinar com estabili- zantes exógenos (por exemplo, gelatina, polissacarídeos ou mais comumen- te de maneira adicional albumina) durante a fabricação. Os estabiliza ntes 20 servem para ligar e estabilizar os complexos em ambientes distintos, inclusi- ve aqueles associados com fabricação, transporte, armazenamento e admi- nistração.
Tipicamente, a toxina botulínica é administrada a pacientes por injeções cuidadosamente controladas de composições que contêm o com- 25 plexo da toxina botulínica e albumina, porém já vários problemas associados com essa abordagem. Por exemplo, devido ao fato de os complexos de toxi- nas injetados conterem proteínas não-toxina e albumina, esses estabilizam a toxina botulínica e aumentam o peso molecular do complexo de toxinas, os complexos de toxinas possuem uma meia-vida longa no corpo, são lentos 30 para se espalhar pelo tecido, e podem causar uma resposta antigênica inde- sejada no paciente. Também, uma vez que as proteínas não-toxina e albu- mina estabilizam a toxina botulínica no sangue, as injeções devem ser cui- dadosamente colocadas de modo que não liberem uma grande quantidade de toxina na corrente sanguínea do paciente, isso poderia causar envene- namento sistêmico fatal. Assim, as injeções devem ser tipicamente realiza- das de maneira precisa por profissionais médicos altamente capacitados 5 com um conhecimento detalhado da anatomia humana.
Devido a todos os problemas discutidos dispostos acima, deve ser altamente desejado possuir um método para estabilizar a toxina botulíni- ca que não utilize albumina. Também deve ser altamente desejado que tal método reduza a antigenicidade e estabilidade sanguínea da toxina botulíni- 10 ca, ao mesmo tempo em que aumente a taxa de difusão dos complexos da toxina botulínica dentro do corpo, tornando assim mais seguro utilizar a toxi- na botulínica para diversos propósitos terapêuticos, estéticos e/ou cosméti- cos. Também deve ser desejado possuir um método de administração que não dependa criticamente da injeção precisa da toxina botulínica por um pro- 15 fissional médico para obter uma administração segura da toxina.
Sumário da Invenção
Um aspecto dessa invenção é o reconhecimento que alguns fragmentos de polipeptídeo de HTV-TAT, ou fragmentos de polipeptídeo de- rivados de fragmentos de HTV-TAT, podem ser adicionados aos complexos 20 da toxina botulínica, e em particular complexos da toxina botulínica reduzi- dos, para estabilizá-los. Em uma modalidade particularmente preferida, o fragmento de polipeptídeo possui uma seqüência correspondente aos resí- duos de aminoácido 49-57 de HIV-TAT (RKKRRQRRR, SEQ ID N0 1). Em outra modalidade preferida, o fragmento de polipeptídeo possui uma se- 25 quência correspondente à seqüência reversa de resíduos de aminoácido 49- 57 de HTV-TAT (RRRQRRKKR, mais adiante neste documento referida co- mo SEQ ID N0 2.) Adicionalmente, essa invenção também contempla análo- gos de polipeptídeo das seqüências de SEQ DD NOS 1 e 2 que são funcio- nalmente equivalentes, tais como, casos onde substituições conservadoras 30 foram realizadas. Como usado ao longo desse pedido, o polipeptídeo HIV- TAT reverso definido por SEQ ID N0 2, bem como qualquer análogo de poli- peptídeo da SEQ ID NOS 1 ou 2 onde substituições conservadoras foram realizadas, é abrangido pelo termo "derivado de fragmento de HTV-TAT".
Outro aspecto dessa invenção é o reconhecimento que as prote- ínas não-toxina endógenas em um complexo de toxina botulínica obtidas a partir de bactérias Clostridium botulinum (viz., as proteínas hemaglutinina e não-hemaglutinina não-tóxicas) aumentam indesejavelmente a estabilidade e toxicidade do complexo de toxinas, enquanto reduz indesejavelmente a capacidade de a toxina se espalhar pelo epitélio cutâneo. Essa invenção reconhece ainda que esses efeitos são exacerbados quando um estabilizan- te exógeno, tal como, albumina, se liga à toxina botulínica durante processos de fabricação convencionais. Assim, um aspecto dessa invenção serve para proporcionar complexos de toxina botulínica onde as quantidades de hema- glutinina, não-hemaglutinina não-toxina e/ou albumina exógena são seletiva e independentemente reduzidas para toxina botulínica comercialmente dis- ponível convencional (por exemplo, BOTOX® ou MYOBLOC®). Tais com- plexos de toxina botulínica são mais adiante nesse documento referidos co- mo "complexos de toxina botulínica reduzida".
Consequentemente, um objetivo dessa invenção é proporcionar uma composição que compreende um complexo de toxina botulínica (ou um complexo de toxina botulínica reduzida) que é estabilizado por polipeptídeos 20 que possuem uma seqüência correspondente à SEQ TD N0 1 ou 2. A com- posição pode conter opcionalmente estabilizantes exógenos adicionados, tal como, albumina.
Como usado aqui, o termo "estabilizar" refere-se à capacidade de os fragmentos de HIV-TAT (por exemplo, SEQ ID N0 1) ou derivados de 25 fragmentos de HIV-TAT (por exemplo, SEQ ID N0 2) impedirem que a toxina botulínica seja desnaturada e preservarem a atividade da toxina, como me- dido por um ensaio SNAPtide, ou um ensaio de Abdução Digital (DAS). Em modalidades preferidas, as composições da toxina botulínica dessa invenção são suficientemente estabilizadas para manter substancialmente toda sua 30 atividade biológica durante as etapas de processamento e administração ao paciente, inclusive, porém sem caráter limitativo, preenchimento, liofilização, armazenamento, e reconstituição para liberação. A invenção refere-se ainda a um método para produzir um efeito biológico ao administrar os complexos de toxina botulínica estabilizada ou complexos de toxina botulínica reduzida e estabilizada da invenção a um paciente. Em algumas modalidades preferidas, os complexos de toxina botu- línica estabilizada ou complexos de toxina botulínica reduzida e estabilizada são topicamente aplicados em uma quantidade eficaz, de preferência, à pe- le, de um indivíduo ou paciente necessitado de tal tratamento. O efeito bioló- gico pode incluir, por exemplo, paralisia muscular, redução de hipersecreção ou suor, tratamento de dor neurológica ou enxaqueca, redução de espasmos musculares, prevenção ou redução de acne, redução ou aumento de uma resposta imune, redução de rugas, ou prevenção ou tratamento de vários outros distúrbios. Em outras modalidades, os complexos de toxina botulínica estabilizada ou complexos de toxina botulínica reduzida e estabilizada são administrados por injeção parenteral, tal como, por exemplo, injeção subcu- tânea.
Essa invenção também proporciona kits para preparar formula- ções que contêm um complexo de toxina botulínica (ou um complexo de to- xina botulínica reduzida) e polipeptídeos que possuem seqüências de acordo com SBQ ID N— 1 ou 2, ou uma pré-mistura que pode, por sua vez, ser usa- 20 da para produzir tal formulação. Também são proporcionados kits que con- têm meios para administrar seqüencialmente um complexo de toxina botulí- nica (ou um complexo de toxina botulínica reduzida) e moléculas de adesão a um indivíduo.
Descrição Detalhada da Invenção Essa invenção refere-se a novas composições que compreen-
dem complexos de toxina botulínica ou complexos de toxina botulínica redu- zida, como descrito aqui, essas são estabilizadas pela adição de polipeptí- deos que são fragmentos de HIV-TAT ou derivados de fragmentos de HTV- TAT. Em modalidades preferidas, os polipeptídeos estabilizantes possuem 30 uma seqüência de acordo com SEQ ID N— 1 ou 2, ou podem estar relacio- nados àquelas seqüências através de substituições conservadoras. Em al- gumas modalidades, as composições de toxina botulínica estabilizada de acordo com a invenção permitem o transporte ou liberação de uma toxina botulínica através do epitélio cutâneo (também referida como "liberação transdérmica") com penetração aumentada, antigenicidade e estabilidade sanguínea reduzidas. As composições da invenção podem ser usadas como 5 aplicações tópicas para fornecer uma toxina botulínica a um indivíduo, para vários propósitos terapêuticos, estéticos e/ou cosméticos, como descrito a- qui. As composições da invenção também possuem um perfil seguramente aprimorado sobre outras composições e métodos para liberação de toxina botulínica.
O termo "toxina botulínica" como usado aqui refere-se a qual-
quer tipo conhecido de toxina botulínica (ou seja, a molécula proteica de to- xina de aproximadamente 150 kD), seja produzida pela bactéria ou por téc- nicas recombinantes, bem como quaisquer de tais tipos que podem ser sub- sequentemente descobertos inclusive sorotipos recentemente descobertos, 15 e variantes elaboradas ou proteínas de fusão. Como mencionado acima, atualmente sete neurotoxinas de toxina botulínica imunologicamente distin- tas foram caracterizadas, ou seja, sorotipos de neurotoxinas de toxina botu- línica A, B, C, D, E1 F e G1, sendo que cada um é distinguido por neutraliza- ção com anticorpos tipo-específicos. Os sorotipos de toxina botulínica estão 20 comercialmente disponíveis, por exemplo, junto à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ande junto à Metabiologics, Inc. (Madison, Wisconsin), bem como junto a outras fontes. Os diferentes sorotipos de toxina botulínica variam nas es- pécies animais que esses afetam e na gravidade e duração da paralisia que provocam. Pelo menos dois tipos de toxina botulínica, tipos AeB, estão co- 25 mercialmente disponíveis em formulações para o tratamento de algumas condições. O tipo A, por exemplo, está contido em preparações de Allergan que possui a marca registrada BOTOX® e de Ipsen que possui a marca re- gistrada DYSPORT®, e o tipo B está contido em preparações de Elan que possui a marca registrada MYOBLOO®.
O termo "toxina botulínica" usado nas composições dessa inven-
ção pode referir-se alternativamente a um derivado de toxina botulínica, ou seja, um composto que possui atividade de toxina botulínica, porém contém uma ou mais alterações químicas ou funcionais sobre qualquer parte ou so- bre qualquer cadeia relativa às toxinas botulínicas naturalmente ocorrentes ou nativas recombinantes. Por exemplo, a toxina botulínica pode ser uma neurotoxina modificada que é uma neurotoxina que possui pelo menos um 5 de seus aminoácidos deletados, modificados ou substituídos, como compa- rado com uma neurotoxina nativa, ou a neurotoxina modificada pode ser uma neurotoxina recombinantemente produzida ou um derivado ou fragmen- to da mesma. Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, o derivado de toxina botulínica é um polipeptídeo que possui a seqüência 10 GDSCSVEAETAGK (SEQ ID N0 3). Essa seqüência corresponde à parte da molécula de toxina botulínica tipo A que é responsável pela atividade bioló- gica da toxina em seres humanos. A toxina botulínica também pode ser uma que foi modificada de uma maneira que, por exemplo, aumenta suas propri- edades ou reduz efeitos colaterais indesejados, porém que ainda mantém a 15 atividade da toxina botulínica desejada. A toxina botulínica pode ser proveni- ente de qualquer um dos complexos de toxina botulínica produzidos pela bactéria, como descrito acima. Alternativamente, a toxina botulínica usada nessa invenção pode ser uma toxina preparada utilizando técnicas químicas recombinantes ou sintéticas, por exemplo, um peptídeo recombinante, uma 20 proteína de fusão, ou uma neurotoxina hibrida, por exemplo, preparada a partir de subunidades ou domínios de diferentes sorotipos de toxina botulíni- ca (vide, patente U.S. 6.444.209, por exemplo). A toxina botulínica também pode ser uma parte da molécula total que foi mostrada com a atividade de toxina botulínica necessária, e em tal caso, pode ser usada individualmente 25 ou como parte de uma combinação ou molécula conjugada, por exemplo, uma proteína de fusão. Alternativamente, a toxina botulínica pode estar sob a forma de um precursor de toxina botulínica, que pode ser por si só não- tóxico, por exemplo, uma zinco protease não-tóxica que se torna tóxica me- diante clivagem proteolítica.
O termo "complexo de toxina botulínica" ou "complexo de toxi-
na", como usado aqui, refere-se a uma toxina botulínica (por exemplo, a mo- lécula proteica de toxina botulínica de aproximadamente 150 kD que perten- ce a qualquer um dos sorotipos de toxina botulínica A-G1 ou o fragmento de toxina botulínica da SEQ ID N0 3), juntamente com proteínas não-toxina en- dógenas associadas (ou seja, proteína de hemaglutinina e não- hemaglutinina não-toxina produzida por bactérias Clostridium botulinum).
5 Nota-se, entretanto, que o complexo de toxina botulínica não precisa ser de- rivado de bactérias Clostridium bondinum como um complexo de toxinas uni- tário. Por exemplo, a toxina botulínica ou toxina botulínica modificada, pri- meiro, pode ser recombinantemente preparada e, então, subsequentemente combinada com as proteínas não-toxina. A toxina botulínica recombinante 10 também pode ser adquirida (por exemplo, junto à List Biological Laboratori- es, Campbell, CA) e, então, combinada com proteínas não-toxina.
Essa invenção também contempla "complexos de toxina botulí- nica reduzida", em que os complexos de toxina botulínica (inclusive aqueles que contêm derivados de toxina botulínica, tal como, a seqüência de polipep- 15 tídeo na SEQ ID N0 3) possuem quantidades reduzidas de proteína não- toxina comparadas com as quantidades naturalmente encontradas em com- plexos de toxina botulínica produzidos por bactérias Clostridium botulinum. Em uma modalidade, os complexos de toxina botulínica reduzida são prepa- rados utilizando qualquer método de separação de proteínas convencionais 20 para extrair uma fração da proteína hemaglutinina ou proteína não- hemaglutinina não-toxina de complexos de toxina botulínica derivados de bactérias Clostridium botulinum. Por exemplo, os complexos de toxina botu- línica reduzida podem ser produzidos ao dissociar complexos de toxina botu- línica através da exposição a eritrócitos em um pH de 7,3 (por exemplo, vide 25 EP 1514556 A1, incorporado aqui a título de referência). Podem ser usados HPLC, diálise, colunas, centrifugação, e outros métodos para extrair proteí- nas de proteínas. Alternativamente, quando os complexos de toxina botulíni- ca reduzida forem produzidos ao combinar a toxina botulínica sinteticamente produzida com proteínas não-toxina, alguém pode simplesmente adicionar 30 menos proteína hemaglutinina ou não-hemaglutinina não-toxina à mistura do que poderia estar presente para complexos de toxina botulínica naturalmen- te ocorrentes. Qualquer uma das proteínas não-toxina (por exemplo, proteí- na hemaglutinina ou proteína não-hemaglutinina não-toxina ou ambas) nos complexos de toxina botulínica reduzida de acordo com a invenção pode ser reduzida independentemente em qualquer quantidade. Em algumas modali- dades exemplificativas, uma ou mais proteínas não-toxinas são reduzidas em pelo menos cerca de 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80% ou 90% comparadas com as quantidades normalmente en- contradas em complexos de toxina botulínica. MYOBLOC possui 5000 U de toxina botulínica tipo B por ml com 0,05% de albumina do soro humano, suc- cinato de sódio a 0,01 M, e cloreto de sódio a 0,1 M. DYSPORT possui 500 U de complexo hemaglutinina de toxina botulínica tipo A com 125 mcg de albumina e 2,4 mg de lactose. Em uma modalidade particularmente interes- sante, substancialmente toda a proteína não-toxina (por exemplo, > 95% da proteína hemaglutinina e proteína não-hemaglutinina não-toxina) que pode- ria ser normalmente encontrada em complexos de toxina botulínica deriva- dos de bactérias Clostridium botulinum é removida do complexo de toxina botulínica. Ademais, embora a quantidade de proteínas não-toxina endóge- nas possa ser reduzida pela mesma quantidade em alguns casos, essa in- venção também contempla reduzir cada proteína não-toxina endógena em quantidades diferentes, bem como reduzir pelo menos uma das proteínas não-toxina endógenas, porém não as outras.
Além de (ou em vez de) reduzir a quantidade de proteína não- toxina endógena para desestabilizar o complexo da toxina botulínica, essa invenção também contempla reduzir a quantidade de estabilizantes exóge- nos que são normalmente adicionados durante a fabricação. Um exemplo de 25 tal estabilizante exógeno é albumina, que é normalmente adicionada durante a fabricação aos complexos de toxina botulínica em uma quantidade igual a 1000 vezes a quantidade de albumina encontrada no componente de não- hemaglutinina não-toxina endógeno de um complexo de toxina botulínica naturalmente ocorrente. De acordo com essa invenção, a quantidade de al- 30 bumina exógena adicionada pode ser qualquer quantidade menor que o ex- cesso de mil vezes convencional de albumina exógena. Em algumas moda- lidades exemplificativas da invenção, são adicionados apenas cerca de 500x, 400x, 300χ, 200χ, 100χ, 50χ, 10χ, 5χ, 1 χ, 0,5χ, 0,1χ, ou 0,01 χ a quan- tidade da albumina em complexos de toxina botulínica naturalmente ocorren- tes. Em uma modalidade, albumina exógena não é adicionada como um es- tabilizante às composições da invenção. Em outras modalidades, os estabili- zantes exógenos além de (ou em vez de) albumina são adicionados às com- posições tópicas terapêuticas da invenção. Por exemplo, outros estabilizan- tes contemplados pela invenção incluem lactose, gelatina e polissacarídeos.
Embora os complexos de toxina botulínica estabilizada ou com- plexos de toxina botulínica reduzida e estabilizada possam ser obtidos ou derivados de qualquer um dos sorotipos de toxina botulínica (ou seja, tipos A-G), em modalidades preferidas dessa invenção, esses são obtidos ou de- rivados do sorotipo tipo A de toxina botulínica.
Em modalidades preferidas, as composições de toxina botulínica da invenção são estabilizadas pela adição de polipeptídeos não-nativos que são um fragmento de HTV-TAT (por exemplo, SEQ ID N0 1) ou derivados de um fragmento de HTV-TAT (por exemplo, SEQ ID. NO 2, que é a seqüência reversa do polipeptídeos da SEQ ID N0 1). O fragmento de HTV-TAT ou de- rivado desse pode ser combinado com a molécula de toxina botulínica de maneira covalente ou não-covalente para estabilizar o complexo da toxina botulínica ou complexo da toxina botulínica reduzida. Em uma modalidade preferida, o fragmento de HIV-TAT ou derivado do mesmo é fisicamente combinado com complexos de toxina botulínica ou complexos de toxina bo- tulínica reduzida para estabilizá-los de maneira não-covalente. A quantidade relativa de fragmento de HIV-TAT ou derivado desse irá depender do grau de estabilidade desejado. Por exemplo, quando o fragmento de HTV-TAT estabilizante ou derivado desse corresponde aos polipeptídeos da SEQ ID NOs. 1 ou 2, uma faixa de concentração útil para o peptídeo estabilizante é cerca de 0,1 ng a cerca de 1,0 mg por unidade do complexo de toxina botu- línica ou complexo de toxina botulínica reduzida. Com mais preferência, os peptídeos estabilizantes da SEQ ID NOs. 1 ou 2 podem estar na faixa de cerca de 0,1 mg a 0,5 mg por unidade de toxina botulínica.
Alternativamente, o fragmento de HTV-TAT estabilizante ou de- rivado do mesmo pode estar covalentemente ligado à molécula de toxina botulínica em um complexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botu- línica reduzida utilizando química de ligação conhecida na técnica. A título de exemplo, o acoplamento dos dois constituintes pode ser realizado através 5 de um agente de acoplamento ou conjugação. Há diversos reagentes de reticulação intermolecular que podem ser utilizados (vide, por exemplo, Me- ans, G. E. and Feeney, R. E., Chemical Modification of Proteins, Holden- Day, 1974, pp. 39-43). Entre esses reagentes estão, por exemplo, propiona- to de J-succinimidil 3-(2-piridilditio) (SPDP) ou bismaleimida de N, N’-(1,3- 10 fenileno) (sendo que ambos são altamente específicos para grupos sulfidrila e formam ligações irreversíveis); N, Nl-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro tal reagente que possui de 6 a 11 pontes de carbono metileno (que são rela- tivamente específicas para grupos sulfidrila); e 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno (que forma ligações irreversíveis com grupos amino e tirosi- 15 na). Outros reagentes de reticulação úteis para esse propósito incluem: p,p’- difluoro-m,m’-dinitrodifenilsulfona (que forma reticulações irreversíveis com grupos amino e fenólicos); dimetil adipimidato (que é específico para grupos amino); fenol-1,4-dissulfonilcloreto (que reage principalmente com grupos amino); hexametilenodi-isocianato ou di-isotiocianato, ou azofenil-p-di- 20 isocianato (que reage principalmente com grupos amino); glutaraldeído (que reagem com diversas cadeias laterais diferentes) e disdiazobenzidina (que reage principalmente com tirosina e histidina).
Os reagentes de reticulação podem ser homobifuncionais, ou seja, que possuem dois grupos funcionais que se submetem à mesma rea- 25 ção. Um reagente de reticulação homobifuncional preferido é bismaleimido- hexano ("BMH"). BMH contém dois grupos funcionais maleimida, que rea- gem especificamente com compostos contendo sulfidrila sob condições mo- deradas (pH 6,5-7,7). Os dois grupos maleimida são conectados por uma cadeia de hidrocarboneto. Portanto, o BMH é útil para reticulação irreversível 30 de polipeptídeos que contêm resíduos de cisteína.
Os reagentes de reticulação também podem ser heterobifuncio- nais. Os agentes de reticulação heterobifuncionais possuem dois grupos funcionais diferentes, por exemplo, um grupo reativo amina e um grupo rea- tivo tiol, que irão reticular duas proteínas que possuem aminas e tióis livres, respectivamente. Exemplos de agentes de reticulação heterobifuncionais são succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato ("SMCC"), 5 éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida ("MBS"), e butirato de succinimida 4-(p-maleimidofenil) ("SMPB"), um análogo de cadeia estendida de MBS. O grupo succinimidil desses reticuladores reage com uma amina primária, e a maleimida reativa tiol forma uma ligação covalente com o tiol de um resíduo de cisteína.
Os reagentes de reticulação geralmente possuem baixa solubili-
dade em água. Uma porção hidrofílica, tal como, um grupo sulfonato, pode ser adicionada ao reagente de reticulação para aumentar sua solubilidade em água. SuIfo-MBS e sulfo-SMCC são exemplos de reagentes de reticula- ção modificados para solubilidade em água.
Muitos reagentes de reticulação produzem um conjugado que é
essencialmente não-clivável sob condições celulares. Entretanto, alguns re- agentes de reticulação contêm uma ligação covalente, tal como, um dissulfe- to, que é clivável sob condições celulares. Por exemplo, ditio- bis(succinimidilpropionato) ("DSP"), reagente de Traut e propionato de N- 20 succinimidil 3-(2-piridilditio) ("SPDP") são reticuladores cliváveis bem- conhecidos. O uso de um reagente de reticulação clivável permite a estabili- zação do fragmento de HIV-TAT ou derivado do mesmo para separação da molécula de toxina botulínica após a liberação na área almejada. A ligação dissulfeto direta também pode ser útil.
Alguns novos reagentes de reticulação, tais como, éster η-γ-
maleimidobutirilóxi-succinimida ("GMBS") e sulfo-GMBS, possuem imunoge- nicidade reduzida. Em algumas modalidades da presente invenção, tal imu- nogenicidade reduzida pode ser vantajosa.
Inúmeros reagentes de reticulação, inclusive aqueles discutidos acima, estão comercialmente disponíveis. Instruções detalhadas de seu uso estão facilmente disponíveis junto aos fornecedores comerciais. Uma refe- rência geral sobre reticulação de proteínas e preparação de conjugado é: S. S. Wong1 Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking1 CRC Press (1991).
A reticulação química pode incluir o uso de braços espaçadores. Os braços espaçadores fornecem flexibilidade intramolecular ou ajustam as 5 distâncias intramoleculares entre porções conjugadas e, desse modo, po- dem ajudar a preservar a atividade biológica. Um braço espaçador pode es- tar sob a forma de uma porção polipeptídica que compreende aminoácidos espaçadores. Alternativamente, um braço espaçador pode ser parte do rea- gente de reticulação, tal como, em "SPDP de cadeia longa" (Pierce Chem. 10 Co., Rockford, 111., cat. N0 21651 H).
Além de a ligação química produzir complexos de toxina botulí- nica estabilizada ou complexos de toxina botulínica reduzida, essa invenção também contempla a utilização de técnicas de fusão genética para produzir esses complexos de toxina estabilizada. Por exemplo, ao utilizar técnicas de 15 engenharia genética bem-conhecidas, as seqüências de ácido nucleico que codificam uma toxina botulínica fundida/fragmento de HIV-TAT ou uma toxi- na botulínica/derivado de fragmento de HIV-TAT podem ser implantadas dentro das células, para fazer com que as células expressem os complexos de toxina estabilizada.
Em modalidades particularmente preferidas dessa invenção, o
fragmento de HIV-TAT ou derivado de fragmento de HTV-TAT é covalente- mente ligado à extremidade da molécula da toxina botulínica ou derivado da mesma para formar uma molécula linear. Em tais modalidades, é geralmente vantajoso utilizar espaçadores de glicina entre a toxina botulínica (ou deriva- 25 do dessa) e o fragmento de HTV-TAT ou derivado de fragmento de HIV-TAT. Por exemplo, quando o derivado de toxina botulínica for o polipeptídeo de acordo com a SEQ ID N0 3, a toxina botulínica estabilizada poderá possuir a forma RRRQRRKKR-GG-GDSCSVEAETAGK (SEQ ID N0 4). Quando for desejado adicionar mais de um polipeptídeo estabilizante a uma molécula de 30 toxina, a toxina botulínica estabilizada poderá possuir a forma RRRQRRK- KR-GG-toxina aminoácidos-GG- RRRQRRKKR. Nota-se, entretanto, que essa invenção também contempla o uso de unidades de repetição de frag- mentos de HIV-TAT ou derivados dos mesmos (por exemplo, RRRQRRKKR RRRQRRKKR) para estabilização, por ligação covalente ou não-covalente.
Inúmeras cadeias de polipeptídeo estabilizante (se essas forem fragmentos de HIV-TAT ou derivados desses) que são necessárias para es- 5 tabilizar uma molécula de toxina botulínica irão depender de fatores, tais como, o sorotipo particular em questão, e o tamanho e composição química da toxina botulínica ou fragmento de toxina botulínica ou derivado sob consi- deração. Por exemplo, quando um derivado de toxina for usado e for um po- lipeptídeo relativamente pequeno (por exemplo, o polipeptídeo de acordo 10 com SEQ ID N0 3), cadeias polipeptídicas menos estabilizantes precisam ser covalentemente ligadas, e uma cadeia polipeptídica estabilizante covalente- mente ligada (por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NOs 1 ou 2, ou deri- vados desse) pode ser suficiente para algumas aplicações.
As composições dessa invenção estão, de preferência, sob a forma de produtos que serão aplicados à pele ou epitélio de indivíduos ou pacientes, ou seja, seres humanos ou outros mamíferos necessitados do tratamento particular. O termo "necessitado" se destina a incluir necessida- des farmacêuticas ou relacionadas à saúde, por exemplo, tratar condições que envolvem espasmos dos músculos faciais indesejáveis, bem como ne- cessidades cosméticas e subjetivas, por exemplo, alterar ou aprimorar a a- parência do tecido facial. Geralmente, as composições dessa invenção po- dem ser aplicadas através de qualquer método conhecido na técnica, cujos exemplos não-limitadores incluem injeção parenteral (por exemplo, injeção subcutânea), administração tópica sobre a pele, ou através de um emplastro que pode ser situado de maneira subdérmica ou supradérmica.
O fragmento de HIV-TAT da SEQ ID N0 1 foi anteriormente iden- tificado como promotor de liberação intracelular de várias "moléculas de car- ga" (veja, por exemplo, Patente N0 U.S. 5.804.604). Assim, quando os com- plexos de toxina botulínica ou complexos de toxina botulínica reduzida forem 30 estabilizados com o fragmento de HIV-TAT da SEQ ED N0 1, esses entram em contato com os tecidos de um paciente (por exemplo, durante a adminis- tração tópica), ocorrendo penetração celular aumentada de toxina botulínica. Ademais, o polipeptídeo derivado de HIV-TAT que possui a seqüência da SEQ ID N0 2 também promove penetração intracelular, bem como penetra- ção transmembrana. Consequentemente, o transporte intracelular e/ou transmembrana aprimorado de toxina botulínica ocorre quando os comple- 5 xos de toxina botulínica ou complexos de toxina botulínica reduzida que fo- ram estabilizados com o polipeptídeo da SEQ ID N0 2 entram em contato com os tecidos de um paciente.
Em geral, as composições da invenção são preparadas ao mis- turar os complexos de toxina botulínica estabilizada ou complexos de toxina botulínica reduzida e estabilizada com um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. Em sua forma mais simples essas podem conter um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável aquoso e simples, tal como, solução salina tamponada. Tais modalidades são particu- larmente preferidas quando as composições da invenção forem administra- das por injeção. Entretanto, quando as composições da invenção forem apli- cadas de maneira tópica, essas podem conter outros ingredientes típicos em composições farmacêuticas ou cosmecêuticas tópicas, ou seja, um veículo dermatológica ou farmaceuticamente aceitável, veículo ou meio, ou seja, veículo, veículo ou meio que é compatível aos tecidos aos quais esses serão aplicados. O termo "dermatológica ou farmaceuticamente aceitável", como usado aqui, significa que as composições ou componentes então descritos são adequados para uso em contato com esses tecidos ou para uso em pa- cientes em geral sem toxicidade, incompatibilidade, instabilidade, respostas alérgicas indevidas, e similares. Como apropriado, as composições da in- venção podem compreender qualquer ingrediente convencionalmente usado nos campos sob consideração, e particularmente em cosmética e dermato- logia.
Em termos de sua forma, as composições dessa invenção po- dem incluir soluções, emulsões (inclusive microemulsões), suspensões, cremes, loções, gels, pós, ou outras composições sólidas ou líquidas típicas usadas para aplicação à pele e outros tecidos onde as composições podem ser usadas. Tais composições podem conter, além da toxina botulínica e fragmentos de HIV-TAT ou derivados desses, outros ingredientes tipicamen- te usados em tais produtos, tais como, agentes antimicrobianos, umectantes e de hidratação, agentes de penetração, conservantes, emulsificantes, óleos naturais ou sintéticos, solventes, tensoativos, detergentes, agentes gelifican- 5 tes, emolientes, antioxidantes, fragrâncias, cargas, espessantes, ceras, ab- sorventes de odor, corantes, agentes de coloração, pós, agentes de controle de viscosidade e água, e inclusive opcionalmente anestésicos, ativos anti- coceira, extratos botânicos, agentes de condicionamento, agentes de escu- recimento ou clareamento, brilho, umectantes, mica, minerais, polifenóis, 10 silicones ou derivados desses, protetores solares, vitaminas e produtos fito- medicinais.
As composições de acordo com essa invenção podem estar sob a forma de composições de liberação controlada ou liberação sustentada, onde os complexos de toxina botulínica estabilizada ou complexos de toxina 15 botulínica reduzida e estabilizada são encapsulados ou, de outro modo, con- tidos dentro de um material de modo que esses sejam liberados sobre a pele de maneira controlada ao longo do tempo. A composição que compreende a toxina botulínica e fragmentos de HTV-TAT ou derivados desses pode estar contida dentro de matrizes, lipossomas, vesículas, microcápsulas, microesfe- 20 ras e similares, ou dentro de um material particulado sólido, sendo que toda essa é selecionada e/ou construída para proporcionar a liberação da toxina botulínica estabilizada ao longo do tempo.
A toxina botulínica pode ser liberada em músculos subjacentes à pele, ou em estruturas glandulares dentro da pele, em uma quantidade efi- 25 caz para produzir paralisia, produzir relaxamento, aliviar contrações, prevenir ou aliviar espasmos, reduzir a produção glandular, ou outros efeitos deseja- dos. A liberação local da toxina botulínica dessa maneira poderia produzir reduções de dosagem, reduzir a toxicidade e permitir otimização de dosa- gem mais precisa para efeitos desejados relativos a materiais injetáveis ou 30 implantáveis.
As composições da invenção são aplicadas para administrar uma quantidade eficaz da toxina botulínica. O termo "quantidade eficaz", como usado aqui, significa uma quantidade de uma toxina botulínica como definido acima que é suficiente para produzir a paralisia muscular desejada ou outro efeito biológico ou estético, porém que implicitamente é uma quan- tidade segura, ou seja, uma que é baixa o suficiente para evitar efeitos cola- 5 terais graves. Os efeitos desejados incluem o relaxamento de alguns múscu- los com o auxílio, por exemplo, da redução da aparência de linhas finas e/ou rugas, especialmente no rosto, ou ajuste da aparência facial de outras ma- neiras, tal como, aumento dos olhos, suspensão dos cantos da boca, ou su- avização das linhas que se espalham a partir do lábio superior, ou o alívio 10 geral de tensão muscular. O efeito mencionado por último, alívio geral de tensão muscular, pode ser obtido no rosto ou em outro lugar. As composi- ções da invenção podem conter uma quantidade eficaz apropriada da toxina botulínica para aplicação como um tratamento de dose única, ou podem ser mais concentradas, para diluição no local de administração ou para uso em 15 múltiplas aplicações. Os complexos de toxina botulínica estabilizada ou complexos de toxina botulínica reduzida e estabilizada podem ser adminis- trados de maneira transdérmica a um indivíduo para tratar condições, tais como, espasmos dos músculos faciais ou outros espasmos musculares in- desejáveis, hiperidrose, acne, ou condições em outro lugar no corpo onde o 20 alívio de dor ou espasmos musculares é desejado. A toxina botulínica é ad- ministrada de maneira tópica para liberação transdérmica aos músculos ou outras estruturas associadas à pele. A administração pode ser feita, por e- xemplo, às pernas, ombros, dorso (inclusive costas), axila, palmas das mãos, pés, pescoço, virilha, dorso de mãos ou pés, cotovelos, membros su- 25 periores, joelhos, coxas, nádegas, torso, pélvis, ou qualquer outra parte do corpo onde se deseja administrar a toxina botulínica.
A administração da toxina botulínica também pode ser realizada para tratar outras condições, inclusive, porém sem caráter limitativo, tratar dor neurológica, prevenção ou redução de enxaqueca ou outra dor de cabe- 30 ça, prevenção ou redução de acne, prevenção ou redução de distonia ou contrações distônicas (sejam subjetivas ou clínicas), prevenção ou redução de sintomas associados com hiperidrose subjetiva ou clínica, redução de hipersecreção ou suor, redução ou aumento de resposta imune, ou trata- mento de outras condições para as quais a administração de toxina botulíni- ca por injeção foi sugerida ou realizada.
Com mais preferência, as composições são administradas por ou sob a orientação de um médico ou outro profissional de cuidados com a saúde. Essas podem ser administradas em um único tratamento ou em uma série de tratamentos periódicos ao longo do tempo. Para liberação trans- dérmica de toxina botulínica para os propósitos mencionados acima, uma composição, como descrito acima, é aplicada de maneira tópica à pele em um local ou locais onde se deseja o efeito. Devido a sua natureza, mais pre- ferivelmente, a quantidade de toxina botulínica aplicada deveria ser aplicada cuidadosamente, em uma taxa de aplicação e frequência de aplicação que irá produzir o resultado desejado sem produzir qualquer resultado adverso ou indesejado. Consequentemente, por exemplo, as composições tópicas da invenção deveriam ser aplicadas em uma taxa de cerca de 1 U a cerca de 20.000 U, de preferência, de cerca de 1 U a cerca de 2.000 U de toxina botu- línica por cm2 de superfície cutânea. Dosagens maiores dentro dessas faixas poderiam ser, de preferência, empregadas em conjunto com materiais de liberação controlada, por exemplo, ou deixadas um tempo de contato mais curto sobre a pele antes da remoção.
Essa invenção também inclui dispositivos de liberação transdér- mica para transmitir composições contendo toxina botulínica descritas aqui através da pele. Tais dispositivos podem ser tão simples em construção co- mo um emplastro, ou podem ser um dispositivo mais complicado que inclui 25 meios para aplicar e monitorar a aplicação da composição, e opcionalmente meios para monitorar a condição do indivíduo em um ou mais aspectos, in- clusive monitorar a reação do indivíduo às substâncias que estão sendo a- plicadas.
As composições dessa invenção são adequadas para uso em ambientes fisiológicos com pH que varia de cerca de 4,5 a cerca de 6,3, e podem possuir, desse modo, tal pH. As composições de acordo com essa invenção podem ser armazenadas em temperatura ambiente ou sob condi- ções refrigeradas.
Entende-se que os seguintes exemplos e modalidades descritos aqui servem apenas para propósitos ilustrativos e que diversas modificações ou alterações em consideração a esses serão sugeridas por elementos ver- 5 sados na técnica e serão incluídas dentro do caráter e âmbito desse pedido e escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui estão incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. Listagem de seqüência
<110> Waugh, Jacob M. Lee, Jae Hoon < 12 0 > Compositions and Methods of Topical Delivery of Botulinum Toxins Stabil: Fragments Derived from HIV-TAT <130> 13720-105128 < 14 0 > US 11/955,076 <141> 2007-12-12 < 15 0 > US 60/828,632 < 151 > 2006-12-29 <160> 7 < 17 0 > PatentIn version 3.4 <210> 1 <211 > 9 <212 > PRT < 213 > Vírus da imunodeficiência humana <4 0 0 > 1 Arg Lys : Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210 > 2 < 211 > 9 <212 > PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana <4 0 0 > 2 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 1 5 <210 > 3 <211> 13 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial <220> <223 > Clostridum Botulinum <4 0 0 > 3 Gly Asp I Ser Cys Ser Val Glu Ala Glu Thr I 5 10 <210 > 4 < 211 > 24 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial <220> < 223 > Sintético <4 0 0 > 4 Arg Arg ■ Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly I 5 10 Val Glu . Ala Glu Thr Ala Gly Lys 20 < 210 > 5 < 211 > 11 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 22 0 > <223 > Sintético <400> 5 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223> Vírus da imunodeficiência humana <400> 6 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Arg 15 10
Lys Arg
< 210 > 7 <211> 11 <212> PRT < 213 > Seqüência artificial < 22 0 > <223 > Sintético <4 0 0 > I Gly Gly ■ Arg Arg Arg Gln Arg 10

Claims (13)

1. Método para estabilizar toxina botulínica, sendo que o dito método compreende proporcionar um complexo de toxina botulínica ou um complexo de toxina botulínica reduzida; proporcionar um polipeptídeo que é um fragmento de HIV-TAT ou um derivado de fragmento de HIV-TAT, e combinar o dito complexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzida com o dito polipeptídeo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito com- plexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzida é cova- lentemente ligado ao dito polipeptídeo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito com- plexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzida é não- covalentemente estabilizado pelo dito polipeptídeo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito frag- mento de HTV-TAT possui uma seqüência de acordo com a SEQ ID N0 1.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito frag- mento de HIV-TAT possui uma seqüência de acordo com a SEQ ID N0 2.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito com- plexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzida com- preende um polipeptídeo que possui uma seqüência de acordo com a SEQ ID NO, 3.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o complexo de toxina botulínica reduzida contém uma quantidade reduzida de proteína hemaglutinina ou proteína não-hemaglutinina não-toxina ou ambas compa- rada com uma quantidade naturalmente ocorrente em complexos de toxina botulínica diretamente extraídos de Clostridium botulinum.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o complexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzida contém albu- mina como um estabilizante exógeno.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a albumina está presente em uma quantidade igual a cerca de 500, 400, 300, 200, 100 ,50, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, ou 0,01 vezes a quantidade da albumina em complexos de toxina botulínica naturalmente ocorrentes.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o comple- xo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzida contém uma toxina botulínica selecionada a partir do grupo que consiste em um de- rivado de toxina botulínica, uma toxina botulínica recombinante, uma toxina botulínica modificada, toxina botulínica tipo A, toxina botulínica tipo B, toxina botulínica tipo C, toxina botulínica tipo D, toxina botulínica tipo E, toxina botu- línica tipo F e toxina botulínica tipo G.
11. Composição de toxina botulínica estabilizada, em que a dita toxina botulínica estabilizada compreende um complexo de toxina botulínica ou um toxina botulínica redu- zida; e um polipeptídeo que possui uma seqüência de acordo com a SEQ ID N0 2.
12. Composição de toxina botulínica estabilizada, como definida na reivindicação 8, em que o dito polipeptídeo é não-covalentemente associ- ado com o dito complexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulí- nica reduzida.
13. Composição de toxina botulínica estabilizada, como definida na reivindicação 8, em que o dito polipeptídeo é covalentemente ligado ao dito complexo de toxina botulínica ou complexo de toxina botulínica reduzi- da.
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