KR20100139022A - 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정 - Google Patents

면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SNAP-25 조성물, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 제조하는 방법, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체, BoNT/A 활성을 검출하는 방법, 및 중화 α-BoNT/A 항체를 검출하는 방법을 개시한다.

Description

면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 Ａ 활성 검정{Immuno-Based Botulinum Toxin Serotype A Activity Assays}
본 발명은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 2008년 3월 14일 출원된 미국 가특허 출원 제61/036,723호의 우선권을 주장하며, 이들은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
클로스트리듐 독소, 예를 들어, 보툴리늄 신경독 (BoNT), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 파상풍 신경독 (TeNT)이 신경 전달을 억제하는 능력이 광범위하게 다양한 치료적 및 미용적 응용에 활용되고 있다, 예를 들어, 문헌[William J. Lipham, Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin (Slack, Inc., 2004)] 참조. 약학적 조성물로서 구매가능한 클로스트리듐 독소에는, BoNT/A 제제, 예를 들어, 보톡스 (BOTOX® (미국 캘리포니아 이르빈 소재의 알러간, 인크.(Allergan, Inc.)), 디스포르트(DYSPORT ®)/릴록신(RELOXIN®, (영국 슬라우 소재의 입센 리미티드(Ipsen Ltd.), 푸르톡스(PURTOX®)(미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재의 멘토 코포레이션(Mentor Corp.)), 제오민 (XEOMIN®)(독일 프랑크푸르트 소재의 메르츠 파마슈티칼스, 게엠베하(Merz Pharmaceuticals, GmbH.)), 뉴로녹스(NEURONOX®)(대한민국 오창면 소재의 메티-톡스, 인크.(Medy-Tox, Inc.)), BTX-A (중국 샹동 얀타이 소재의 바이오겐-테크 리미티드(Biogen-tech Ltd.)); 및 BoNT/B 제제, 예를 들어, 미오블록(MYOBLOC®)/뉴로블록(NEUROBLOC®)(미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 솔스티스 뉴로사이언시즈, 인크.(Solstice Neurosciences, Inc.))가 포함된다. 예로서, 보톡스(BOTOX®)는 미국에서 경부 디스토니아와 관련된 비정상적인 머리 위치 및 목 통증의 위중도를 감소시기 위한 성인의 경부 디스토니아(cervical dystonia)의 치료, 국소 제제로는 불충분하게 관리되는 심각한 겨드랑이 다한증(severe primary axillary hyperhidrosis)의 치료, 및 12세 이상 환자에서의 제VII 신경 장애 또는 양성 본태성 안검경련(benign essential blepharospasm) 를 포함한, 디스토니아와 관련된 사시(strabismus) 및 안검경련(blepharospasm)의 치료에 대해 승인되었다.
현재는 마우스 LD50 생물검정(bioassay), 치사율 시험이, 제제의 효력을 표현하기 위해 모든 약제 제조사에 의해 사용되는 "황금 표준(gold standard)"으로 남아있다. 문헌[S. S. Arnon et al., JAMA 285: 1059-1070 (2001)] 참조. 사실, 약제학적 제제의 레이블 상의 단위는 마우스 LD50 단위이며 통계적으로 유용한 LD50 데이터를 제공하는 데 필요한 동물의 수는 크다. 마우스 LD50 생물검정의 이점은, 기질의 경쇄 절단), 이러한 중독(intoxication) 과정의 단지 일부에 대한 활성을 결정하는 대신에(예를 들어, 경쇄 효소 활성만을 측정하는 세포외(in vitro) 검정), 보툴리눔 독소 흡수(uptake)에 필요한 모든 단계를 측정한다는 것이다 (예를 들어, 세포 표면 수용체에 대한 독소 결합, 독소-수용체 복합체의 내재화(internalization), 세포질 내로의 경쇄 전위(light chain translocation)). 불행히도, 마우스 LD50 생물검정은 필요한 많은 수의 실험 동물로 인한 높은 작업 비용, 모든 BoNT 세로타입이 동일한 측정가능한 종점(end-point)을 야기하는 것으로 인한 특이성의 결여, 및 대량의 동물군을 사용하지 않는 경우 부정확할 가능성을 포함한 많은 결점들이 문제가 된다. 또한, 동물 권익 단체들은 동물 실험을 감소시키고 더 중요하게는 제품 발매를 위한 마우스 LD50 생물 검정을 대체할 것을 미국(FDA/NICEATM/ICCVAM) 및 유럽(MHRA 및 EDQM)의 규제 기관, 및 보툴리눔 신경독 제품을 제조하는 제약 회사에 압력을 행사해 왔다. 규제 기관은 제약 회사에 보툴리눔 신경독의 효력 시험에 대해 3 "R" 원칙을 적용하도록 하고 있다: 감소(Reduce), 개선(Refine), 대체(Replace). 문헌[D. Straughan, Progress in Applying the Three Rs to the Potency Testing of 보툴리눔 독소 Type A, Altern. Lab. Anim. 34(3): 305-313 (2006)] 참조. 최근 수년에는, 프로토콜을 표준화하고 검정당 더 적은 수의 동물을 사용하여 더욱 일관성 있는 데이터를 제공하기 위하여, 마우스 LD50 생물 검정을 감소 및 개선하기 위한 몇가지 단계가 이미 취해졌다.
따라서, 보툴리눔 독소 흡수에 필요한 모든 단계를 온전히 평가할 수 있는, 단순하고, 신뢰성있으며(reliable), 승인된(validated), 정부 기관이 허용가능한 보툴리눔 독소 활성검정은, 이러한 비-동물 기반 검정이 동물 실험의 필요성, 및 이러한 유형의 동물-기반 검정과 관련된 모든 불리한 점, 비용 및 윤리적 문제를 경감시킬 것이기 때문에, 상당히 가치를 가질 것이다. 본 발명은 예를 들어, 제약 및 식품 산업과 같은 다양한 산업을 위한 보툴리눔 독소 A의 활성을 검정하기 위한, 신규한 조성물, 세포 및 방법을 제공하며, 관련된 이점을 또한 제공한다. 이러한 조성물, 세포 및 방법은 살아있는 동물 또는 살아있는 동물로부터 취한 조직을 사용하지 않지만, 신경독 작용에 필요한 모든 단계를 평가할 수 있다.
도 1은 중추 및 말초 뉴런에서의 신경전달물질 방출 및 클로스트리듐 독소 중독(intoxication)의 현재의 패러다임의 개략도를 나타낸다. 도 1A는 중추 및 말초 뉴런의 신경전달물질 방출 메커니즘에 대한 개략도를 나타낸다. 방출 프로세스는 다음 2단계를 포함하는 것으로 설명될 수 있다: 1) 소포 도킹(vesicle docking), 여기서는, 신경전달물질 분자를 함유하는 소포의 소포-결합 SNARE 단백질이 원혈질 막에 위치하는 막-결합 SNARE 단백질과 연합한다; 및 2) 신경전달물질 방출, 여기서는, 소포가 원형질 막과 융합하고 신경전달물질 분자가 엑소시토시스된다. 도 1B은 중추 및 말초 뉴런에서의 파상풍 및 보툴리늄 독소 활성에 대한 중독 메커니즘의 개략도를 나타낸다. 중독 프로세스는 다음 4 단계를 포함하는 것으로서 설명될 수 있다: 1) 수용체 결합, 여기서는, 클로스트리듐 독소가 클로스트리듐 수용체 복합체에 결합하고 중독 프로세스를 개시한다; 2) 복합체 내재화(complex internalization), 여기서는, 독소 결합 후에, 독소/수용체 시스템 콤플렉스를 함유하는 소포가 세포 내에 엔도시토시스된다(endocytosed); 3) 경쇄 전위(light chain translocation), 여기서는, 소포의 내부 pH의 변화, 클로스트리듐 독소 중쇄의 HN 도메인을 포함하는 채널 포어(channel pore)의 형성, 중쇄로부터 클로스트리듐 독소 경쇄의, 및 경쇄의 방출을 포함하는 다수의 사건이 일어나는 것으로 여겨진다; 그리고 4) 효소 표적 변형(enzymatic target modification), 여기서는, 클로스트리듐 독소의 경쇄가 그의 표적SNARE 기질, 예를 들어, SNAP-25, VAMP 또는 신택신 단백질가수분해적으로 절단하여, 소포 도킹 및 신경전달물질 방출을 방지한다.
도 2는 4가지 세포주(세포 line)에서의 웨스턴 블럿(Western blot) 분석에 의한 BoNT/A 흡수의 비교를 나타낸다. 도 2A는 세포주를 처리하는 데 사용된 BoNT/A의 양에 기초한 검출된 SNAP-25 절단 생성물의 그래프를 나타낸다. 데이터는 4개의 파라미터 논리 모델을 사용하는 시그마플롯(SigmaPlot)에서 분석하였고, 각각의 세포주에 대해 EC50 값을 얻었다. 검출된SNAP-25 절단 생성물 신호의 랭킹은: SiMa>> Neuro-2a>LA1-55n> PC12였다. 도 2B는 검정을 위해 계산된, 300 pM 대 0 pM 및 1.2 pM 대 0 pM 에서의 원신호(raw signal)의 신호-대-잡음 비를 나타낸다. SiMa 세포가 가장 큰 신호-대-잡음 비 및 가장 낮은 EC50 값을 발생하였다.
도 3은 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법에 유용한 계통확립(established) 세포주를 위한 세포 분화 배지의 최적화를 나타낸다.
도 4는 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법에 유용한 계통확립 세포주를 구성하는 세포를 위한 세포 분화 시간의 최적화를 나타낸다.
도 5는 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법에 유용한 계통확립 세포주를 구성하는 세포의 BoNT/A 처리의 최적화를 나타낸다. 결과는 시험된 임의의 BoNT/A 처리를 사용하여 2 pM 미만의 EC50이 달성되었음을 나타낸다.
도 6은 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법의 민감도(sensitivity)를 나타낸다. 결과는 백그라운드와 비교하여 상당량의 SNAP-25 절단 생성물을 생성하기 전에 세포에 의한 BoNT/A의 흡수가 1분 미만이 걸림을 나타낸다.
도 7은 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법의 특이성(specificity)을 나타낸다. 결과는 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법이 BoNT/A 중독과 관련된 모든 단계를 측정할 수 있음을 나타낸다.
도 8은 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 사용하여 BoNT/A 복합체로 처리된 분화된 SiMa 세포의 투여량 반응 곡선을 나타낸다.
도 9는 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 사용한, 제형화된 BoNT/A약학적 제품에 대한 면역-기반 BoNT/A 활성 검정의 결과를 나타낸다.
도 10은 본 명세서에 개시된BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 사용하여, 사람 혈청에서 α-BoNT/A 항체의 중화를 검출하는 것을 나타낸다.
본 발명은 샘플에서 활성 BoNT/A의 존재 또는 부재를 결정하기 위한, 그리고 BoNT/A 제제의 활성/효력을 결정하기 위한 신규한 검정을 제공한다. 본 명세서에 개시된 신규한 세포-기반 검정은 검정이 샘플 내의 BoNT/A의 피코몰 수준의 양을 검출할 수 있게 하는 세포, 시약 및 검출 방법에 의존적이다. 세포-기반 검정은 동물 독성 연구의 필요성을 감소시키지만, BoNT/A의 다수의 기능, 즉, 독소의 결합 및 세포 흡수, 세포 시토졸 내로의 전위, 및 프로테아제 활성을 분석하는 역할을 한다. 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 신규한 방법 및 조성물은 조(crude) 샘플 및 벌크 샘플뿐만 아니라 고도로 정제된 이중-사슬(di-chain) 독소 및 제형화된 독소 제품을 분석하는 데 사용될 수 있으며 또한 자동화된 고처리량 검정 포맷에도 적용가능하다.
따라서, 본 명세서에 개시된 일 태양은 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한(scissile) 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프(epitope)를 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 SNAP-25 항원, SNAP-25 항원에 연결된 캐리어, 또는 SNAP-25 항원에 연결된 유연성 스페이서(flexible spacer)에 연결된 캐리어(유연성 스페이서는 SNAP-25 항원과 캐리어 사이에 끼워짐)를 포함하는 조성물 및 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 면역 반응을 유발하는(trigger) 임의의 그리고 모든 SNAP-25 항원이 SNAP-25 항원으로서 유용할 수 있는 것으로 생각되며, 여기에는, 천연SNAP-25로부터 유래된 SNAP-25 항원, 비-천연SNAP-25로부터 유래된 SNAP-25 항원, 및 SNAP-25, 천연SNAP-25 또는 비-천연SNAP-25로부터의 SNAP-25 의 면역반응성 단편을 포함하는 SNAP-25 항원이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 데 유용한 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 38을 포함하지만 이로 한정되지 않는, 캐리어 펩티드에 연결된 카르복실화된 C-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 펩티드를 포함하는 SNAP-25 항원을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 데 유용한 다른 조성물은 SNAP-25 항원에 연결된 유연성 링커(linker)에 연결된 캐리어, 카르복실화된 C-말단 글루타민 를 포함하는 조성물(유연성 링커는 SNAP-25 항원과 캐리어 사이에 끼워짐)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 임의의 그리고 모든 보조제가 이러한 조성물에 유용할 수 있으며, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 완전 또는 불완전 프로인트 보조제(complete and incomplete Freund's adjuvant)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 개시된 다른 태양은 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 방법의 태양은 (a) 본 명세서에 개시된 조성물을 동물에 투여하는 단계; (b) 동물로부터 α-SNAP-25 항체 또는 α-SNAP-25 항체-생성 세포를 샘플을 수집하는 단계; 및 (c) 샘플로부터 α-SNAP-25 항체를 단리하는 단계를 포함한다. 개시된 방법은 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 단클론성 항체, 아니면 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 제조하는 데 유용할수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 태양은 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 제공한다. 이러한 α-SNAP-25 항체는 천연 및 비-천연 항체 둘 모두, 뿐만 아니라, 단클론성 α-SNAP-25 항체 또는 다클론성 α-SNAP-25 항체를 포함한다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체로서 유용한 단클론성 α-SNAP-25 항체는 하이브리도마(hybridoma) 세포주1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 및 3C3E2로부터 생성된 단클론성 α-SNAP-25 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 개시된 또 다른 태양은 BoNT/A 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 태양은 (a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계(계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성이 있음(susceptible)); (b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 성분을 단리하는 단계; (c) SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체와 SNAP-25 성분을 접촉시키는 단계; 및 (d) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계(항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함한다. 단계 (c)의 α-SNAP-25 항체는 선택적으로 고체상 지지체(solid phase support)에 연결될 수 있다.
본 명세서에 개시된 또 다른 태양은 BoNT/A 활성을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 태양은 (a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계(계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); (b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 포함하는 SNAP-25 성분을 단리하는 단계; (c) SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체와 SNAP-25 성분을 접촉시키는 단계; 및 (d) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계(항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함한다. 단계 (c)의 α-SNAP-25 항체는 선택적으로 고체상 지지체에 연결될 수 있다.
본 명세서에 개시된 추가적인 태양은 포유류에서BoNT/A 면역저항(immunoresistance)을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 태양은 (a) α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험할 포유류로부터 얻어진 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; (b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계(계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성이 있음); (c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 성분을 단리하는 단계; (d) SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체와 SNAP-25 성분을 접촉시키는 단계; (e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; (f) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계; 및 (g) 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계 (단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비해 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄). 단계 (d)의 α-SNAP-25 항체는 선택적으로 고체상 지지체에 연결될 수 있다. 단계 (f)의 대조구 샘플은 네거티브 대조구 샘플에 더하여 포지티브 대조구 샘플을 또한 포함할 수 있다.
클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 바라티(Clostridium baratii) 및 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum)에 의해 제조된 클로스트리듐 독소가 사람 및 다른 포유류의 치료 및 미용 처리에 있어서 가장 널리 사용된다. 클로스트리듐 보툴리눔 균주는 7가지 항원적으로 식별되는 세로타입의 보툴리늄 독소 (BoNT)를 생성하며, 이는 사람 (BoNT/A, BoNT/B, BoNT/E 및 BoNT/F), 동물 (BoNT/C1 및 BoNT/D)에서의 보툴리즘 발생을 조사하여 확인되거나, 토양으로부터 분리되었다(BoNT/G). 7개의 보툴리눔 독소 세로타입은 유사한 구조 및 생물학적 특성을 갖지만, 각각은 또한 이질적인 특성, 예를 들어, 상이한 약리학적 특성을 나타낸다. 대조적으로, 파상풍 독소(tetanus toxin; TeNT)는 동일한 그룹의 클로스트리듐 테타니에 의해 생성된다. 2가지 다른 종의 클로스트리듐, 클로스트리듐 바라티 및 클로스트리듐 부티리쿰은 또한 각각 BoNT/F 및 BoNT/E와 유사한 독소를 생성한다. 클로스트리듐 독소는 각각 대략 150 kDa의 단일-사슬 폴리펩티드로서 번역되며(translated), 이후에 천연 프로테아제, 예를 들어, 내인성 클로스트리듐 독소 프로테아제 또는 환경에서 생성되는 천연 프로테아제에 의해 다이설파이드 루프 내의 단백질가수분해 분리(proteolytic scission)에 의해서 절단된다. 이러한 번역후 (posttranslational) 프로세싱은 단일 다이설파이드 결합 및 비-공유적 상호작용에 의해서 함께 결합되어 있는 대략 50 kDa의 경쇄(LC) 및 대략 100 kDa의 중쇄 (HC)를 포함하는 이중-사슬 분자를 제공한다. 각각의 성숙(mature) 이중-사슬 분자는 3가지의 기능적으로 구별되는 도메인을 포함한다: 1) 신경전달물질 방출 기구의 코어 구성요소를 특이적으로 표적화하는 아연-의존성 엔도펩티다아제 활성을 포함하는 메탈로프로테아제(metalloprotease) 영역을 포함하는 LC에 위치하는 효소 도메인; 2) 세포내 소포(vesicle)로부터 표적 세포의 세포질 내로의 LC의 방출을 용이하게 하는 HC (HN)의 아미노 말단 반쪽에 포함된느 전위 도메인; 및 3) 표적 세포의 표면에 위치한 수용체 복합체에 대한 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 HC (HC)의 카르복실-말단 반쪽 내에서 발견되는 결합 도메인.
이러한 3가지 기능성 도메인의, 결합, 전위 및 효소 활성이 모두 독성에 필요하다. 그 프로세스의 모든 상세 사항이 아직 정확히 알려져 있지는 않지만, 클로스트리듐 독소가 뉴런으로 들어가서 신경전달물질 방출을 억제하는 전반적인 세포 중독 메커니즘은 세로타입 및 서브타입에 관계 없이 유사하다. 출원인은 하기 설명으로 제한하는 것을 원하지 않지만, 중독 메커니즘은 적어도 4 단계를 포함하는 것으로 설명될 수 있다: 1) 수용체 결합, 2) 복합체 내재화, 3) 경쇄 전위, 및 4) 효소적 표적 변형 (도 1 참조). 프로세스는 클로스트리듐 독소의 HC 도메인이 표적 세포의 원형질 막 표면에 위치하는 독소-특이적인 수용체 시스템에 결합할 때 개시된다. 수용체 복합체의 결합 특이성은, 각각 클로스트리듐 독소 수용체 복합체를 구별되게 포함하는 것으로 여겨지는 강글리오사이드와 단백질 수용체의 특이적인 조합에 의해 일부분 달성되는 것으로 생각된다. 일단 결합되면, 독소 /수용체 복합체는 엔도시토시스에 의해 내재화되고 내재화된 소포는 특이적인 세포내 경로에 의해서 분류된다(sorted). 전위 단계는 소포 격막(vesicle compartment)의 산성화에 의해 유발되는 것으로 보인다. 이러한 프로세스는 소수성을 증가시키는 2가지 중요한 pH-의존성 구조 재배열을 개시하고, 포어(pore) 형성을 촉진하고, 독소의 중쇄 및 경쇄의 분리를 용이하게 하는 것으로 생각된다. 일단 분리되면, 독소의 경쇄 엔도펩티다아제가 세포내 소포로부터 세포질로 방출되고, 여기서 신경전달물질 방출 기구의 코어 구성요소를 특이적으로 표적화하는 것으로 보인다. 이러한 코어 단백질, 소포-관련 막 단백질 (VAMP)/시냅토브레빈, 25 kDa의 시냅토솜-관련 단백질 (SNAP-25) 및 신택신(Syntaxin)은 시냅스 소포 도킹 및 신경 말단에서의 융합에 필수적이이며, 용해성 N-에틸말레이미드-감응성 인자-부착 단백질-수용체 (soluble N -ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor; SNARE) 패밀리의 구성원을 이룬다. BoNT/A 및 BoNT/E는 SNAP-25를 카르복실-말단 영역에서 절단하여, 각각 9개 또는 26개의 아미노산 단편을 방출하고, BoNT/C1은 또한 SNAP-25를 카르복실-말단 근처에서 절단하여 8개의 아미노산 단편을 방출한다. 보툴리늄 세로타입 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 파상풍 독소는, VAMP의 보존된 중앙 부분에서 작용하며, VAMP의 아미노-말단 부분을 세포질로 방출한다. BoNT/C1는 신택신을 세포질 막 표면 근처의 단일 부위에서 절단한다. 시냅스 SNARE의 선택적인 단백질가수분해는 생체 내(in vivo)에서 클로스트리듐 독소에 의해 야기되는 신경전달물질 방출의 차단을 설명한다. 클로스트리듐 독소의 SNARE 단백질 표적은 다양한 비-뉴런 유형에서의 엑소시토시스에 일반적이며; 이러한 세포에서는, 뉴런에서와 같이, 경쇄 펩티다아제 활성이 엑소시토시스를 억제한다, 예를 들어, 문헌[Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins : Structure , Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003)]을 참고한다.
본 발명의 태양은, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하기 위한 조성물을, 일부분, 포함한다. 본 발명의 다른 태양은 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하기 위한 면역 반응 유도 조성물을, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역 반응 유도 조성물(면역 반응 inducing composition)"이라는 용어는 동물에 투여시 SNAP-25 항원에 대한 면역 반응을 자극하여, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는, SNAP-25 항원을 포함하는 조성물을 말한다. "면역 반응"이라는 용어는 면역 반응 유도 조성물에 대한 동물의 면역계에 의한 임의의 반응을 말한다. 예시적인 면역 반응은, 세포뿐만 아니라 국부 및 전신 체액성 면역성, 예를 들어, CD8+ CTL의 항원-특이적 유도를 포함하는 CTL 반응, T-세포 증식성 반응 및 시토킨 방출을 포함하는 헬퍼 T-세포 반응, 및 예를 들어, 항체 생성 반응을 포함하는 B-세포 반응을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. "면역 반응을 유도"라는 용어는 면역 반응 유도 조성물 또는 면역 반응 유도 조성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여를 말한다(면역 반응이 영향을 받음, 즉, 자극되거나, 개시되거나 유도됨).
조성물은 SNAP-25 항원을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항원"이라는 용어는 면역 반응을 이끌어내는 분자를 말하며, 펩티드, 다당류, 및 지질 컨쥬게이트, 예를 들어, 지질단백질 및 당지질을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "SNAP-25 항원"이라는 용어는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 임의의 항원을 말한다. 면역 반응 유도 조성물에 사용될 수 있는 SNAP-25 항원은 서열이 실질적으로 유일(unique)하도록 충분히 커야만 하므로, SNAP-25 이외의 항원에 대한 교차 반응성인 항체를 생성할 가능성을 감소시킨다. 또한, 면역 반응 유도 조성물에 사용되는 SNAP-25 항원은 실질적으로, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 대한 면역 반응만을 유발하도록 충분히 작아야 하므로, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복시 말단 잔기가 결여된 SNAP-25와 구별할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성할 수 있는 가능성을 증가시킨다. 게다가, 단일 아미노산 서열의 α-SNAP-25 항체를 생성하는 것은 고도로 민감한 검정의 디자인을 가능하게 하기 위한 허용가능한 활성도(avidity)와 결합된, 재현가능하게 선택적인 우수한 수율에 있어서 또한 매우 바람직하다
SNAP-25에 존재하는 BoNT/A 절단 부위 주변의 서열은 P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'로 표시되며, P1-P1'는 분리가능한 결합을 나타낸다. BoNT/A로 절단시, 생성되는 절단 생성물은 P5-P4-P3-P2-P1 서열을 포함하는 단편 및 P1'-P2'-P3'-P4'-P5'을 포함하는 단편을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, " BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25"라는 용어는 카르복실-말단 아미노산으로서 P1잔기를 갖는 임의의 SNAP-25를 말한다. 예를 들어, 사람 SNAP-25의 Q197-R198 (SEQ ID NO: 5)는 BoNT/A 절단 부위를 위한 P1-P1' 분리가능한 결합을 나타낸다. 마찬가지로, "BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25"라는 용어는 카르복실-말단 아미노산에서 글루타민을 갖는 임의의 SNAP-25 절단 생성물일 것이다(글루타민은 분리가능한 결합의 Q197를 나타냄). 다른 예로서, 토르페도 마르모라타(Torpedo marmorata) SNAP-25의 K204-H205 (SEQ ID NO: 16)는 BoNT/A 절단 부위를 위한 P1-P1' 분리가능한 결합을 나타낸다. 마찬가지로, "BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 리신을 갖는 SNAP-25"는 카르복실-말단 아미노산에서 리신을 갖는 임의의 SNAP-25 절단 생성물일 것이다(리신은 분리가능한 결합의 K204를 나타냄)
BoNT/A 절단 부위로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SNAP-25 항원, 합텐(hapten), 또는 변형되지 않을 때 면역원성, 비-면역원성, 또는 약한 면역원성인 임의의 다른 항원성 화합물의 면역원성(immunogenicity)을 향상시키도록 변형될 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, SNAP-25 항원의 분리가능한 결합으로부터의 카르복실 말단 P1 잔기는 카르복실화될 수 있다. 카르복실화는 SNAP-25 항원의 원하는 면역원성 특성을 2가지 관점에서 증가시킨다. 첫째로, 하전된 아미노산은 면역원성을 증가시키기 때문에, COO- 기를 카르복실 말단 잔기에 추가하는 것은 SNAP-25 항원의 전체 면역원성을 증가시킬 것이다. 둘째로, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기는 절단시 하전된 상태이기 때문에, COO- 기를 카르복실 말단 잔기에 추가하는 것은 본 명세서에 개시된 α-SNAP-25 항체가 결합하도록 디자인된 실제 항원과 더욱 유사하게 될 것이다.
본 실시 형태의 태양에서, SNAP-25 항원으로부터의 아미노 말단 잔기는, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 오발부민(ovalbumin; OVA), 티로글로불린(THY), 소 혈청 알부민(BSA), 대두 트립신 억제제(STI), 또는 다중 부착 펩티드(MAP)와 같은, 캐리어 단백질에 SNAP-25 항원을 부착시키는 데 알맞은 아미노산의 추가에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 캐리어 단백질 KLH을 컨쥬게이트하기 위하여 시스테인 잔기가 아미노 말단에 위치될 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 길이가 예를 들어, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 또는 적어도 30개의 아미노산이다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원 예를 들어, 길이가 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 최대 14, 최대 15, 최대 16, 최대 17, 최대 18, 최대 19, 최대 20, 최대 25, 또는 최대 30개의 아미노산일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 예를 들어, 7 내지 12개의 아미노산, 10 내지 15개의 아미노산, 또는 13 내지 18개의 아미노산일 수 있다.
다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 32를 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148를 포함한다. 추가적인 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 38을 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 39를 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 또는 SEQ ID NO: 44를 포함한다. 추가적인 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 45를 포함한다.
SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 면역 반응을 유발하는 임의의 그리고 모든 SNAP-25 항원이 SNAP-25 항원으로서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148를 포함하는 아미노산 서열 변이체(variant)가 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 면역 반응을 유발하는 SNAP-25 항원으로서 유용할 수 있다. 따라서, 실시 형태에서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148을 포함하는 SNAP-25 항원에 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개의 아미노산 치환(substitution), 제거(deletion) 또는 추가(addition)가 가능하다. 또 다른 실시 형태에서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148을 포함하는 SNAP-25 항원에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율(identity)을 가질 수 있다.
하나 이상의 캐리어가, 캐리어와 관련되지 않을 때는 면역원성, 비-면역원성, 또는 약한 면역원성인 SNAP-25 항원에 연결될 수 있는 것으로 생각된다. 비제한적인 예는, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 오발부민(OVA), 티로글로불린(THY), 소 혈청 알부민(BSA), 대두 트립신 억제제(STI), 또는 다중 부착 펩티드(MAP)를 포함한다. 본 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 항원을 캐리어와 커플링하여 비-항원성 또는 약하게 항원성인 항원을 항원성으로 만들 수 있다. 다양한 다른 캐리어 및 항원을 캐리어와 커플링하는 방법이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, supra, 1998a; Harlow and Lane, supra, 1998b; and David W. Waggoner, Jr. et al., Immunogenicity -enhancing carriers and compositions thereof and methods of using the same, U.S. Patent Publication No. 20040057958 (Mar. 25, 2004)] 참조. 에피토프는 또한 융합 단백질로서 에피토프를 발현시켜 생성될 수 있다. 폴리펩티드 융합을 발현시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)]에 기재되어 있다. SNAP-25 항원의 카르복실 말단 말단은 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기이어야만 하기 때문에, 캐리어는 SNAP-25 항원의 아미노 말단에 연결되어야 한다.
유연성 링커와 관련되지 않을 때는 면역원성, 비-면역원성, 또는 약한 면역원성인 SNAP-25 항원의 면역원성을 향상시키기 위하여 하나 이상의 유연성 스페이서가 SNAP-25 항원에 연결될 수 있는 것으로 생각된다. 유연성 스페이서는 SNAP-25 항원의 전체 펩티드 길이를 증가시키고 유연성을 제공하여 면역 세포에 대한 SNAP-25 항원의 적절한 프리젠테이션(presentation)을 용이하게 한다. 비제한적인 예로서, 조성물은 하나 이상의 유연성 스페이서에 탠덤(tandem)으로 연결된 SNAP-25 항원을 포함하여 면역 세포에 SNAP-25 항원을 더 잘 프리젠팅할 수 있으며, 그에 의해서 면역 반응이 촉진된다.
펩티드를 포함하는 유연성 스페이서는 길이가 적어도 1개의 아미노산이며, 측쇄 R 기를 갖는 비-하전된 아미노산, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 세린을 포함한다. 따라서, 실시 형태에서 유연성 스페이서는, 길이가 예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10개의 아미노산일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 유연성 스페이서는 길이가, 예를 들어, 적어도 1, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 또는 최대 10개의 아미노산일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 유연성 스페이서는, 예를 들어, 1 내지 3개의 아미노산, 2 내지 4개의 아미노산, 3 내지 5개의 아미노산, 4 내지 6개의 아미노산, 또는 5 내지 7개의 아미노산일 수 있다. 유연성 스페이서의 비제한적인 예는, 예를 들어, G-스페이서, 예를 들어, GGG, GGGG (SEQ ID NO: 55), 및 GGGGS (SEQ ID NO: 56) 또는 A-스페이서, 예를 들어, AAA, AAAA (SEQ ID NO: 57) 및 AAAAV (SEQ ID NO: 58)를 포함한다. 유연성 스페이서는 융합 단백질로서 SNAP-25 항원에 인-프레임 (in-frame) 연결된다.
상기에 논의된 바와 같이, 유연성 스페이서는 SNAP-25 항원의 전체 펩티드 길이를 증가시키기 위하여, 일부분, 사용된다. 예를 들어, 5-10개 아미노산의 SNAP-25 항원은 SNAP-25 항원의 아미노 말단에 3-5개 아미노산의 유연성 스페이서를 연결하여 전체 길이를 증가시킬 수 있다. 다른 예로서, 5-10개 아미노산의 SNAP-25 항원은 SNAP-25 항원의 아미노 말단에 4-6 개 아미노산의 유연성 스페이서를 연결하여 전체 길이를 증가시킬 수 있다. 다른 예로서, 5-10개 아미노산의 SNAP-25 항원은 SNAP-25 항원의 아미노 말단에 7-10개 아미노산의 유연성 스페이서를 연결하여 전체 길이를 증가시킬 수 있다. 다른 예로서, 7-12 개 아미노산의 SNAP-25 항원은 SNAP-25 항원의 아미노 말단에 1-3개 아미노산의 유연성 스페이서를 연결하여 전체 길이를 증가시킬 수 있다. 다른 예로서, 7-12 개 아미노산의 SNAP-25 항원은 SNAP-25 항원의 아미노 말단에 4-6 개 아미노산의 유연성 스페이서를 연결하여 전체 길이를 증가시킬 수 있다. 유연성 스페이서에 의해 제공되는 길이 증가는 작은 크기의 SNAP-25 항원의 선택을 가능하게 하며, 그에 의해서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원이 실질적으로 SNAP-25에 대한 면역 반응만을 유발할 가능성을 증가시키므로, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복시 말단이 결여된 SNAP-25와 구별할 수 있는 α-SNAP-25 항체를 생성할 수 있는 가능성을 증가시킨다.
본 명세서에 개시된 조성물은 선택적으로 본 명세서에 개시된 SNAP-25 항원 및 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있는 것으로 생각된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "보조제"라는 용어는, SNAP-25 조성물에 관하여 사용될 때, SNAP-25 항원에 대한 면역 반응을 증가 또는 다양화시키는 임의의 물질 또는 물질들의 혼합물을 말한다. 보조제는, 예를 들어, 면역법의 수 및 보호적 면역법(immunization)에 필요한 항원의 양을 감소시키는 역할을 한다. 면역 반응 유도 조성물에서의 보조제의 사용이 잘 알려져 있다. 이러한 보조제의 주된 목적은 면역 반응의 증갈르 가능하게 하는 것이다. 비제한적인 보조제에는, 예를 들어, 리포솜(liposome), 오일상(oily phase), 예를 들어, 프로인트 유형의 보조제, 예를 들어, 프로인트 완전 보조제 (FCA); 프로인트 불완전 보조제 (FIA); 사포제닌 글리코사이드(sapogenin glycoside), 예를 들어, 사포닌; 카프보폴; N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민 (보통 무라밀 다이펩티드 또는 "MDP"로 알려져 있음); 및 지질다당류 (LPS)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이러한 보조제는 일반적으로 수성 상과 함께 에멀젼의 형태로 사용되거나, 또는 더욱 일반적으로는, 수-불용성 무기 염으로 이루어 질 수 있다. 이러한 무기 염은, 예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 아연 설페이트, 콜로이드성 철 하이드록사이드, 카라슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드로 이루어질 수 있다. 알루미늄 하이드록사이드 (Al(OH)3)가 보통 사용되는 보조제이다. 현재, 사람에 사용하기 위해 FDA-승인된 보조제는 오직 알루미늄 염(Alum)이며, 이는 항원의 침전에 의해서 항원을 "침착(depot)"하는 데 사용될 수 있다. 상기에 제공된 보조제는 단순히 예시이다. 실제로, 보조제가 면역 반응을 유도하는 필수적인 특성을 충족시키기만 한다면 임의의 보조제가 본 명세서에 개시된 SNAP-25조성물에 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 캐리어가 또한 보조제로서 작용할 수 있다. 특정 보조제 및 제조 및 사용 방법이, 예를 들어, 문헌 [Gupta et al. Vaccine, 11: 993-306, 1993; Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines 1:83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987; and David W. Waggoner, Jr. et al., Immunogenicity - Enhancing 캐리어 s and Compositions Thereof and Methods of Using the Same, U.S. Patent Publication No. 20040057958 (Mar. 25, 2004)]에 기재되어 있다. 추가적인 보조제는 문헌 [Chapter 7 (pp 141-227) of "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" (eds. Powell, M. F. and Newman, M. J.) Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Plenum Press (New York)]에 기재된 임의의 화합물을 포함한다. 이러한 문헌의로부터의 예는 무라밀 다이펩티드 (MDP) 및 몬타나이드(Montanide) 720을 포함한다. 폴리 이노신(Poly Inosine):시토신(Cytosine) (폴리 I:C)과 같은 분자, 또는 CpG 모티브를 포함하는 플라스미드 DNA가 또한 보조제로서 미립자(microparticle) 중에 캡슐화된 항원과 조합되어 투여될 수 있다. 다른 예에서, 보조제는 항원성 화합물이 세포의 세포질로 들어가는 것을 용이하게 하는 제제, 예를 들어, 리스테리오리신(listeriolysin), 스트렙토리신(streptolysin) 또는 이들의 혼합물이다.
따라서, 실시 형태에서, SNAP-25 조성물은 캐리어 펩티드에 연결된 카르복실화된 카르복실 말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 항원을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 카르복실화된 카르복실 말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148를 포함한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 38을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 캐리어 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 오발부민(OVA), 티로글로불린(THY), 소 혈청 알부민(BSA), 대두 트립신 억제제(STI), 또는 다중 부착 펩티드(MAP)를 포함한다
다른 실시 형태에서, SNAP-25 조성물은 SNAP-25 항원 having a 카르복실화된 카르복실 말단 리신 linked to a 캐리어 펩티드. 본 실시 형태의 태양에서, 카르복실화된 카르복실 말단 리신을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 또는 SEQ ID NO: 44를 포함한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 45를 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 캐리어 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 오발부민 (OVA), 티로글로불린 (THY), 소 혈청 알부민 (BSA), 대두 트립신 억제제(STI) 또는 다중 부착 펩티드 (MAP)이다.
또 다른 실시 형태에서, SNAP-25 조성물은 하나 이상의 유연성 링커에 연결된 카르복실화된 C-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 항원 및 캐리어 펩티드를 포함한다(유연성 링커는 SNAP-25 항원과 캐리어 펩티드 사이에 끼워짐). 본 실시 형태의 태양에서, 카르복실화된 카르복실 말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148을 포함한다. 다른 실시 형태에서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 46을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 캐리어 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 오발부민 (OVA), 티로글로불린 (THY), 소 혈청 알부민 (BSA), 대두 트립신 억제제(STI) 또는 다중 부착 펩티드 (MAP)이다. 본 실시 형태의 태양에서, 유연성 링커는 G-스페이서 또는 A-스페이서이다.
또 다른 실시 형태에서, SNAP-25 조성물은 유연성 링커에 연결된 카르복실화된 C-말단 리신을 갖는 SNAP-25 항원 및 캐리어 펩티드를 포함한다(유연성 링커는 SNAP-25 항원과 캐리어 펩티드 사이에 끼워짐). 본 실시 형태의 태양에서, 카르복실화된 카르복실 말단 리신을 갖는 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 또는 SEQ ID NO: 44를 포함한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 47을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 캐리어 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 오발부민 (OVA), 티로글로불린 (THY), 소 혈청 알부민 (BSA), 대두 트립신 억제제(STI) 또는 다중 부착 펩티드 (MAP)이다. 본 실시 형태의 태양에서, 유연성 링커는 G-스페이서 또는 A-스페이서이다.
본 발명의 다른 태양은, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 방법을, 일부분, 포함한다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체는 본 기술 분야에 알려진 매우 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 항체를 제조 및 사용할 뿐만 아니라, 항체 결합 특이성(binding specificity), 결합 친화도(binding affinity) 및 결합 활성도(binding avidity)를 검출하고 측정하는 특정 프로토콜은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Antibodies:: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998a); and Using 항체: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998b); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2001; and Current Protocols in Molecular Biology, 2004; David Anderson et al., Therapeutic Polypeptides , Nucleic Acids Encoding Same , and Methods of Use, U.S. Patent 7,034,132 (Apr. 25, 2005); and Beatriz M. Carreno et al., Antibodies Against CTLA4, U.S. Patent 7,034,121 (Apr. 25, 2006)] 참조.
비제한적인 예로서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체는, 동물, 예를 들어, 래빗, 염소, 마우스 또는 다른 포유류에, 본 명세서에 개시된 조성물을 1회 이상 주사하여 생성될 수 있다. 다른 비-제한적인 예로서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체는 알(egg), 예를 들어, 달걀에 본 명세서에 개시된 조성물을 1회 이상 주사하여 생성될 수 있다. 면역화된 동물에서의 항체 역가(titer)를 시간에 걸쳐 표준 기술에 의해, 예를 들어, 고정화된 항원을 사용하는 효소결합면역흡착검정 (ELISA) 또는 세포-기반 활성 검정을 사용하여 모니터링할 수 있다. 원한다면, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 위한 다클론성 항체를 포유류 로부터 (예를 들어, 혈액으로부터) 단리하고 추가로 잘 알려진 기술, 예를 들어, IgG 분획을 얻기 위한 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 또는 항체를 생성하는 데 사용된 펩티드에 대한 친화도 정제에 의해 정제할 수 있다.
다른 비제한적인 예로서, 하이브리도마 방법을 사용하여, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 6 Monoclonal Antibodies, pp. 196-244, Harlow & Lane, supra, 1998a; and Chapter 7 Growing Hybridomas, pp. 245-282, Harlow & Lane, supra, 1998a; and Goding, pp. 59-103, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986)] 참조. 이러한 방법에서, 숙주 동물, 예를 들어, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 본 명세서에 개시된 SNAP-25 항원의 1회 이상의 주사에 노출되어 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 특이적으로 결합할 α-SNAP-25 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 면역화된 동물에서의 항체 역가를 시간에 걸쳐 표준 기술에 의해, 예를 들어, 고정화된 항원을 사용하는 효소결합면역흡착검정 (ELISA) 또는 세포-기반 활성 검정을 사용하여 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 적합한 세포 배양 라인을 사용하여 림프구를 생체 내에서 면역화할 수 있다. 면역화후 적합한 시간에, 예를 들어, 항체 역가가 가장 높을 때, 항체-생성 세포를 동물로부터 단리한다. 일반적으로, 사람 유래 세포가 요구되는 경우, 말초 혈액 림프구가 사용되거나, 아니면 비-사람 포유류 공급원이 요구되는 경우, 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 단리된 항체-생성 세포는 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸세포주(immortal 세포 line)와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 고정화된 세포주는 보통 변형된(transformed) 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 사람 유래의 골수종(myeloma) 세포이다. 전형적으로, 쥐과의 골수종 세포주가 적절히 면역화된 마우스로부터 수확된 비장세포(splenocyte)와 융합되어 하이브리도마를 생성한다. 바람직한 불멸세포주는 하이포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양 배지(HAT)에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 임의의 수의 골수종 세포주가 표준 기술에 따른 융합 파트너로서 사용될 수 있다, 예를 들어, P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주. 융합으로부터 얻은 하이브리도마 세포를 그 다음 HAT 배지를 사용하여 선별하고, 융합되지 않은, 그리고 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸한다(융합되지 않은 비장세포는 변형되지 않기 때문에 배양 수일 후에 죽는다). 그 다음, 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 예를 들어, 면역침전 검정(immunoprecipitation assay), 생체외 결합 검정, 예를 들어, 방사면역검정(radioimmunoassay) (RIA) 또는 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 또는 세포-기반 활성 검정으로, α-SNAP-25 포지티브 배지를 사용하여 하이브리도마 상청액을 스크리닝할 수 있다. 이러한 기술 및 검정법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Chapter 11 Immunoprecipitation, pp. 421-470, Harlow & Lane, supra, 1998a; Chapter 12 Immunoblotting, pp. 471-510, Harlow & Lane, supra, 1998a; Chapter 14 Immunoassays, pp. 553-612, Harlow & Lane, supra, 1998a] 참조. 항체가 또한 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복시 말단이 결여된 SNAP-25에 대해 비반응성인지를 결정하기 위하여 추가적인 연구가 행해질 수 있다. 예를 들어, 스캐차드 분석(Scatchard analysis)을 사용하여, α-SNAP-25 단클론성 항체의 결합 친화도가 또한 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Peter J. Munson and David Rodbard, Ligand : A Versatile Computerized Approach For Characterization of Ligand - Binding Systems, 107(1) Anal. Biochem. 220-239 (1980)] 참조. 원하는 하이브리도마 세포가 확인된(identified) 후에, 제한된 희석 절차를 사용하여 원하는 단클론성 항체를 발현하는 클론성 세포주가 얻어질 때까지 단일 세포로부터 유래한 클론을 단리한다. 이러한 항체는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 대해 충분히 선택적이며, 추가적인 특성화 및 연구를 위해 선택되는 충분히 높은 활성도로 결합한다.
SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 제조하는 다른 대안은 SNAP-25 펩티드를 갖는, 재조합 조합적 면역글로불린 라이브러리(recombinant combinatorial immunoglobulin library), 예를 들어, 항체 파지(phage) 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하고, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 단리하는 것이다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하기 위한 키트가, 예를 들어, 재조합 파지 항체 시스템 (미국 뉴욕주 피스카타웨이 소재의 애머샴 지이 헬스케어(Amersham GE Healthcare); 및 SurfZAPTM 파지 디스플레이 키트 (미국 캐리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타젠(Stratagene))로 구매가능하다. 추가로, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하는 데 유용한 방법 및 시약의 예는, 예를 들어, 특허 문헌 [Ladner et al. U.S. Patent 5,223,409; Borrebaeck et al. U.S. Patent 5,712,089; Griffiths et al. U.S. Patent 5,885,793; Griffiths et al. U.S. Patent 5,962,255; McCafferty et al. U.S. Patent 5,969,108; Griffiths et al. U.S. Patent 6,010,884; Jespers et al. U.S. Patent 6,017,732; Borrebaeck et al. U.S. Patent 6,027,930; Johnson et al. U.S. Patent 6,140,471; McCafferty et al. U.S. Patent 6,172,197]에서 찾을 수 있으며, 이들 각각음 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 태양은, α-SNAP-25 항체 또는 α-SNAP-25 항체-생성 세포를 포함하는 샘플을 수집하는 것을, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, " α-SNAP-25 항체 또는 α-SNAP-25 항체-생성 세포를 포함하는 샘플"이라는 용어는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 α-SNAP-25 항체를 포함하거나 잠재적으로 포함하는 임의의 생물학적 물질을 말한다.
SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 포함할 수 있는 임의의 그리고 모든 샘플이 본 방법에 사용될 수 있는 것으로 생각되며, 혈액, 혈장, 혈청 및 림프액이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 생성할 수 있는 임의의 세포가 본 방법에 사용될 수 있는 것으로 또한 생각되며, CD8 세포, CTL 세포, 헬퍼 T-세포 및 B-세포가 포함된다. 잘 알려진 다양한 방법이 개체로부터 α-SNAP-25 항체 또는 α-SNAP-25 항체-생성 세포를 포함하는 샘플을 수집하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow & Lane, supra , 1998a; and Harlow & Lane, supra , 1998b] 참조. 유사하게, 잘 알려진 다양한 방법이 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 단리하기 위한 샘플 처리에 사용될 수 있다. 샘플을 수집하는 방법은 단리할 항체의 유형에 기초하여 선택될 수 있다. 비제한적인 예로서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 단리하는 경우, 적절한 샘플은 그러한 α-SNAP-25 항체를 포함하는 혈액 샘플일 수 있는 반면, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 단리하는 경우, 적절한 샘플은 α-SNAP-25 항체-생성 세포, 예를 들어, 비장세포 또는 하이브리도마일 수 있다.
본 발명의 태양은 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 샘플로부터 단리하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 α-SNAP-25 항체, 예를 들어, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체 또는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 단리하는 방법은, 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, supra, 1998a; and Harlow and Lane, supra, 1998b] 참조. 예를 들어, 그러한 α-SNAP-25 다클론성 항체는 잘 알려진 기술, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화도 크로마토그래피(면역 혈청의 IgG 분획을 주로 제공함)에 의해 샘플로부터 단리될 수 있다. 후속하여, 또는 대안적으로, 특이적인 SNAP-25 항원을 컬럼 또는 자석 비드에 고정화하여 면역친화도 크로마토그래피에 의해서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 정제할 수 있다. SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체는 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로즈, 하이드록시라파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수(ascites fluid)로부터 단리될 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 제조하는 방법은 (a) 캐리어 펩티드에 연결된 카르복실화된 C-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 항원을 포함하는 조성물을 동물에 투여하는 단계; (b) 동물로부터 α-SNAP-25 항체 또는 α-SNAP-25 항체-생성 세포를 포함하는 샘플을 수집하는 단계; 및 (c) 샘플로부터 α-SNAP-25 항체 구성요소를 단리하는 단계를 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체는 다클론성 항체이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체는 단클론성 항체이다. 본 발명의 추가적인 태양에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체는 IgG 서브타입으로 생성된다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 조성물은 보조제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), 또는 폴리비닐 알코올 (PVA)을 추가로 포함한다.
다른 실시 형태에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체를 생성하는 방법은 (a) 유연성 링커에 연결된 카르복실화된 C-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 펩티드 및 캐리어 펩티드를 포함하는 조성물(유연성 링커는 SNAP-25 펩티드와 캐리어 펩티드 사이에 끼워짐)을 동물에 투여하는 단계; (b) α-SNAP-25 항체 또는 α-SNAP-25 항체-생성 세포를 포함하는 샘플을 동물로부터 수집하는 단계; 및 (c) α-SNAP-25 항체를 샘플로부터 단리하는 단계를 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체는 다클론성 항체이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체는 단클론성 항체이다. 본 실시 형태의 추가적인 태양에서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체는 IgG 서브타입으로 생성된다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25 조성물은 보조제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), or 폴리비닐 알코올 (PVA)를 추가로 포함한다.
본 발며의 태양은, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는, 단리된 α-SNAP-25 항체를, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단리된(isolated)"이라는 사람의 개입을 통해 자연적 환경으로부터 용어는 분자를 분리하는 것을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체"라는 용어는 특정 항원에 반응하여 만들어진 면역계에 의해서 생성되는, 그 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 말하며, 천연항체 및 비-천연항체 둘 모두를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "α-SNAP-25"라는 용어는 "항(anti)-SNAP-25"라는 용어와 같은 의미이며 SNAP-25 항원에 결합하는 항체를 말한다. 예를 들어, 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 이합체(dimer), 다합체(multimer), 다중특이적(multispecific) 항체, 인간화(humanized) 항체, 키메라(chimeric) 항체, 2작용성(bi-functional) 항체, Ig 수용체와 같은 세포-결합(cell-associated) 항체, 선형(linear) 항체, 다이어바디(diabody), 또는 미니바디(minibody)일 수 있으며, 단편이 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면, 이들의 단일 사슬 유도체일 수 있다. 항체는 VH 및 VL 도메인뿐만 아니라, 경쇄 불변(constant) 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 포함하는 전체길이 면역글로불린 분자, 또는 전체길이 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, Fd 단편, Fv 단편일 수 있다. 항체는 임의의 척추 동물(예를 들어, 사람, 염소, 말, 당나귀, 쥐과, 래트, 래빗, 또는 닭)로부터 유래될 수 있으며, 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM) 또는 서브클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 일 수 있다. 천연 항체, 비-천연 항체, 및 이들의 항원성 화합물-결합 단편의 구조에 대한 일반적인 개시에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995)]을 참조하며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
천연 항체는 보통 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종4합체성 당단백질(heterotetrameric glycoprotein)이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 다이설파이드 결합에 의해서 중쇄에 연결되는 한편, 다이설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입(isotype)의 중쇄에 따라 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 다이설파이드 가교를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 가지며, 다수의 불변 도메인이 이어진다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을, 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 일렬로 되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬로 된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변 도메인들 사이에 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
완전 항원-인식 (complete antigen-recognition) 및 항원-결합 부위가 항체의 가변 도메인 내에 포함된다, 즉, Fv 단편. 이러한 단편은 단단한, 비-공유 결합인, 하나의 중쇄 가변 도메인 (VH)과 하나의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 이합체를 포함한다. 각각의 도메인은 4개의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 포함하며, 이는 주로 베타-시트 배열을 채택하고, 3개의 초가변 영역(hypervariable region)(루프 결합을 형성하고, 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성함)에 의해서 연결된다. 각각의 초가변 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 총체적으로, VH-VL 이합체의 표면 상의 항원 결합 부위를 한정하는 6개의 CDR 영역의 3차원적 배열이 항원-결합 특이성을 부여한다. 예를 들어, 문헌 [Cyrus Chothia, et al., Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions, Nature 342(6252): 877-883 (1989); Elvin A. Kabat, et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]을 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 항체의 불면 도메인은 항체를 항원에 결합하는 데 직접 관여하지 않으나, 다양한 효과기(effector) 기능, 예를 들어, 항체 의존성 세포의 세포독성에 항체가 참여하는 것으로 나타난다.
표적 항원은 일반적으로 하나 이상의 결합 부위, 소위 에피토프를 가지며, 이는 CDR-형성된 항원-결합 부위에 의해서 인식된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 "항원성 결정자(antigenic determinant)"와 같은 의미이며, 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나, 이와 달리 분자와 상호작용할 수 있는, 예를 들어, 펩티드, 다당류 또는 지질-함유 분자와 같은 표적 항원 상의 부위를 말한다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상기한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원이 하나의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
다클론성 항체는 특정 항원에 결합할 수 있는 적어도 2종의 항체를 포함하는 항체 분자의 이종 집단(heterogeneous population)을 말한다. 정의에 의하면, 다클론성 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 상이한 항체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체들"이라는 용어는 특정 항원에 결합할 수 있는 오직 1종의 항체를 포함하는 항체 분자의 실질적으로 동종 집단(homogeneous population)을 말한다, 즉, 집단을 구성하는 개별적인 항체가, 소량에서 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는, 동일하다. 정의에 의하면, 단클론성 항체는 단일 에피토프에 결합한다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 지향된다. 게다가, 다클론성 항체와 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지향된다. 특이성 외에, 단클론성 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. "단클론성"이라는 수식어는 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 얻어질 수 있는 것과 같은 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성이 필요한 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 개시에 따라 사용되는 단클론성 항체는 문헌 [Kohler et al (1975) Nature 256:495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를들어: U.S. Pat. No. 4,816,567; U.S. Pat. No. 5,807,715 참조). 단클론성 항체는 또한 예를 들어, 문헌 [Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 방법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, α-SNAP-25 항체는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 중쇄 가변 도메인 (VH)은 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, 또는 SEQ ID NO: 82이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 경쇄 가변 도메인 (VL)은 SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, 또는 SEQ ID NO: 92이다.
다른 실시 형태에서, α-SNAP-25 항체는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 도메인 (VH) CDR1 영역, CDR2 영역, CDR3 영역, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) CDR1 영역은 SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, 또는 SEQ ID NO: 120이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) CDR2 영역은SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, 또는 SEQ ID NO: 123이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 중쇄 가변 도메인 (VH) CDR3 영역은 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, 또는 SEQ ID NO: 124이다.
다른 실시 형태에서, α-SNAP-25 항체는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 경쇄 가변 도메인 (VL) CDR1 영역, CDR2 영역, CDR3 영역, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 경쇄 가변 도메인 (VL) CDR1 영역은 SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, 또는 SEQ ID NO: 129이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 경쇄 가변 도메인 (VL) CDR2 영역은 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 경쇄 가변 도메인 (VL) CDR3 영역은SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, 또는 SEQ ID NO: 117이다.
또 다른 실시 형태에서, α-SNAP-25 항체는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 본 실시 형태의 태양에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148를 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 에피토프는 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, 또는 SEQ ID NO: 44를 포함한다.
상기에 논의된 바와 같이, SNAP-25에 존재하는 BoNT/A 절단 부위 주변의 서열은 P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'로 표시되며, P1-P1'는 분리가능한 결합을 나타낸다. BoNT/A에 의해 절단시, 생성되는 절단 생성물은 P5-P4-P3-P2-P1 서열을 포함하는 단편 및 P1'-P2'-P3'-P4'-P5'를 포함하는 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, " SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 항체"라는 용어는, P5-P4-P3-P2-P1 서열을 포함하는 임의의 SNAP-25 절단 생성물 단편에 특이적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체를 말하며, P1'-P2'-P3'-P4'-P5' 서열을 포함하는 임의의 SNAP-25 절단 생성물 단편 또는 BoNT/A 절단 부위의 그대로의(intact) P1-P1' 분리가능한 결합을 갖는 임의의 SNAP-25는 제외된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "α-SNAP-25197 항체"라는 용어는, SEQ ID NO: 5의 글루타민 197에 상응하는 카르복실-말단 P1 잔기를 갖는 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "α-SNAP-25204 항체"라는 용어는 SEQ ID NO: 16의 리신에 상응하는 카르복실-말단 P1 잔기를 갖는 SNAP-25에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "선택적(selectively)"이라는 용어는 유일한 효과 또는 영향을 갖거나 또는 오직 한 가지 방식으로 또는 오직 하나의 것과 반응하는 것을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합"이라는 용어는, 항체와 관련된 경우, 항체가 비-표적 에피토프와 실질적으로 교차 반응하지 않도록 하는, 표시된 표적 에피토프에 대한 항체의 차별적인 결합을 말한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 펩티드 에피토프의 최소 크기는, 약 5개의 아미노산이며, 펩티드 에피토프는 전형적으로 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 또는 적어도 20개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 에피토프는 불연속적일 수 있으며, 즉, 펩티드의 1차 구조에서는 인접하지 않으나 펩티드의 2차, 3차 또는 4차 구조에 의해서는 에피토프 내로 함께 합쳐지는 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 게다가, 에피토프는 아미노산 서열 이외의 분자 부분, 예를 들어, 탄수화물 부분, 지질단백질 또는 당지질과 같은 지질 부분, 또는 포스포릴화된 아미노산과 같은 화학적으로-변형된 아미노산 부분을 포함할 수 있는 것에 또한 주목한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 또는 적어도 20개의 아미노산을 포함하는, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합될 수 있다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 15, 또는 최대 20개의 아미노산을 포함하는, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합할 수있다.
선택적인 결합은 결합 특성, 예를 들어, 결합 친화도, 결합 특이성, 및 결합 활성도를 포함한다. 문헌[David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, pp. 240 (1998)]참조. 결합 친화도는 항체가 그의 에피토프 결합 부위에서 머무르는 시간의 길이를 말하며, 항체가 그의 에피토프에 결합하는 강도로서 관찰될 수 있다. 결합 친화도는 평형에서의 Kd/Ka 비로서 정의되는, 항체의 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant; KD)로 설명될 수 있으며, 여기서, Ka는 항체의 결합 속도 상수(association rate constant)이고, kd는 항체의 해리 속도 상수(dissociation rate constant)이다. 결합 친화도는 결합과 해리 둘 모두에 의해서 결정되며, 높은 결합 만으로 또는 낮은 해리 만으로는 높은 친화도를 보장할 수 없다. 결합 속도 상수 (Ka), 또는 온-레이트 상수(on-rate constant; Kon)는, 단위 시간 당 결합 사건의 수, 또는 항체와 항원이 그의 항체-항원 복합체로 역으로 결합하는 경향을 측정한다. 결합 속도 상수는 M-1 s-1 단위로 표시되며 하기와 같이 표현된다: [Ab] x [Ag] x Kon. 결합 속도 상수가 클수록, 항체가 그 항원에 더 빨리 결합하거나, 또는 항체와 항원 사이의 결합 치환도가 더 커진다. 해리 속도 상수 (Kd), 또는 오프-레이트 상수(off-rate constant) (Koff)는 단위 시간당 해리 사건의 수, 또는 항체-항원 복합체가 그 구성 분자들, 즉, 항체 및 항원으로 역으로 분리(해리)되는 경향을 측정한다. 해리 속도 상수는 s-1 단위로 표시되며 하기와 같이 표현된다: [Ab + Ag] x Koff. 해리 속도 상수가 작을수록, 항체가 그 항원에 더 단단하게 결합하거나, 또는 항원과 항체 사이의 결합 치화도가 더 크다. 평형 해리 상수 (KD)는 평형에서, 새로운 항체-항원 복합체가 형성되는 속도가 항체-항원 복합체가 해리되는 속도와 동일할 때의 속도를 측정한다. 평형 해리 상수는 M으로 표시되며, Koff/Kon=[Ab] x [Ag]/[Ab + Ag]로 정의되고, 여기서, [Ab]는 항체의 몰 농도이고, [Ag]는 항원의 몰 농도이고, [Ab + Ag] 는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, 모든 농도는 계가 평형일 때의 그러한 구성성분들의 농도이다. 평형 해리 상수가 더 작을수록 항체가 그 항원에 더 단단히 결합하거나, 또는 항체와 항원 사이의 결합 친화도가 더 크다.
따라서, 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 결합 속도 상수가, 예를 들어, 1 x 105 M-1 s-1 미만, 1 x 106 M-1 s-1 미만, 1 x 107 M-1 s-1 미만, 또는 1 x 108 M-1 s-1 미만일 수 있다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 결합 속도 상수가, 예를 들어, 1 x 105 M-1 s-1 초과, 1 x 106 M-1 s-1 초과, 1 x 107 M-1 s-1 초과, 또는 1 x 108 M-1 s-1 초과일 수 있다. 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 결합 속도 상수가 1 x 105 M-1 s-1 내지 1 x 108 M-1 s-1, 1 x 106 M-1 s-1 내지 1 x 108 M-1 s-1, 1 x 105 M-1 s-1 내지 1 x 107 M-1 s-1, 또는 1 x 106 M-1 s-1 내지 1 x 107 M-1 s-1일 수 있다.
다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 해리 속도 상수가 1 x 10-3 s-1 미만, 1 x 10-4 s-1 미만, 또는 1 x 10-5 s-1 미만일 수 있다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 해리 속도 상수가, 예를 들어, 1.0 x 10-4 s-1 미만, 2.0 x 10-4 s-1 미만, 3.0 x 10-4 s-1 미만, 4.0 x 10-4 s-1 미만, 5.0 x 10-4 s-1 미만, 6.0 x 10-4 s-1 미만, 7.0 x 10-4 s-1 미만, 8.0 x 10-4 s-1 미만, 또는 9.0 x 10-4 s-1 미만일 수 있다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 해리 속도 상수가, 예를 들어, 1 x 10-3 s-1 초과, 초과1 x 10-4 s-1 초과, 또는 1 x 10-5 s-1 초과일 수 있다.본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 해리 속도 상수가, 예를 들어, 1.0 x 10-4 s-1 초과, 2.0 x 10-4 s-1 초과, 3.0 x 10-4 s-1 초과, 4.0 x 10-4 s-1 초과, 5.0 x 10-4 s-1 초과, 6.0 x 10-4 s-1 초과, 7.0 x 10-4 s-1 초과, 8.0 x 10-4 s-1 초과, 또는9.0 x 10-4 s-1 초과일 수 있다.
다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 평형 해리 상수가 0.500 nM 미만일 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 평형 해리 상수가, 예를 들어, 0.500 nM 미만, 0.450 nM 미만, 0.400 nM 미만, 0.350 nM 미만, 0.300 nM 미만, 0.250 nM 미만, 0.200 nM 미만, 0.150 nM 미만, 0.100 nM 미만, 또는 0.050 nM 미만일 수 있다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 평형 해리 상수가 0.500 nM 초과이다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는 평형 해리 상수가, 예를 들어, 0.500 nM 초과, 0.450 nM 초과, 0.400 nM 초과, 0.350 nM 초과, 0.300 nM 초과, 0.250 nM 초과, 0.200 nM 초과, 0.150 nM 초과, 0.100 nM 초과, 또는 0.050 nM 초과일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는, 그대로의(intact) SNAP-25에 대한 결합 속도 상수가, 예를 들어, 1 x 100 M-1 s-1 미만, 1 x 101 M-1 s-1 미만, 1 x 102 M-1 s-1 미만, 1 x 103 M-1 s-1 미만, 또는 1 x 104 M-1 s-1 미만일 수 있다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 친화도는, 그대로의(intact) SNAP-25에 대한 결합 속도 상수가, 예를 들어, 최대 1 x 100 M-1 s-1, 최대 1 x 101 M-1 s-1, 최대 1 x 102 M-1 s-1, 최대 1 x 103 M-1 s-1, 또는 최대 1 x 104 M-1 s-1일 수 있다.
결합 특이성은 항체가 그의 에피토프를 포함하는 분자와 그 에피토프를 포함하지 않는 분자를 구별하는 능력이다. 결합 특이성을 측정하는 한 가지 방법은 그의 에피토프를 포함하는 분자에 대한 항체의 Kon 결합 속도를 그 에피토프를 포함하지 않는 분자에 대한 항체의 Kon 결합 속도와 비교하는 것이다. 예를 들어, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 대한 α-SNAP-25 항체의 결합 속도 상수 (Ka)를, 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25, 예를 들어, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단이 결여된 SNAP-25 에피토프 또는 BoNT/A 절단 부위의 그대로의 P1-P1' 분리가능한 결합을 갖는 SNAP-25 에피토프 와 비교한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는, 그의 에피토프(들)을 포함하지 않는 SNAP-25에 대한 결합 속도 상수 (Ka)가, 예를 들어, 1 x 100 M-1 s-1 미만, 1 x 101 M-1 s-1 미만, 1 x 102 M-1 s-1 미만, 1 x 103 M-1 s-1 미만 또는 1 x 104 M-1 s-1 미만이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는, 그의 에피토프(들)을 포함하지 않는 SNAP-25에 대한 결합 속도 상수 (Ka)가, 예를 들어, 최대 1 x 100 M-1 s-1, 최대 1 x 101 M-1 s-1, 최대 1 x 102 M-1 s-1, 최대 1 x 103 M-1 s-1 또는 최대 1 x 104 M-1 s-1이다.
본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는, 그의 에피토프에 대한 결합 속도 상수 (Ka)가 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25과 비교하여, 예를 들어, 적어도 2배 초과, 적어도 3배 초과, 적어도 4배 초과, 적어도 5배 초과, 적어도 6배 초과, 적어도 7배 초과, 적어도 8배 초과, 또는 적어도 9배 초과이다. 본 실시 형태의 추가적인 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는, 그의 에피토프에 대한 결합 속도 상수 (Ka)가 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25과 비교하여, 예를 들어, 적어도 10배 초과, 적어도 100배 초과, 적어도 1,000배 초과 또는 적어도 10,000배 초과이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는, 그의 에피토프에 대한 결합 속도 상수 (Ka)가 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25과 비교하여, 예를 들어, 최대 1배 초과, 최대 2배 초과, 최대 3배 초과, 최대 4배 초과, 최대 5배 초과, 최대 6배 초과, 최대 7배 초과, 최대 8배 초과, 또는 최대 9배 초과이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는, 그의 에피토프에 대한 결합 속도 상수 (Ka)가 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25과 비교하여, 예를 들어, 최대 10배 초과, 최대 100배 초과, 최대 1,000배 초과 또는 최대 10,000배 초과이다.
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체의 결합 특이성은 또한 그러한 α-SNAP-25 항체가 SNAP-25 에피토프를 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25, 예를 들어, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단이 결여된 SNAP-25 에피토프 또는 BoNT/A 절단 부위의 그대로의 P1-P1' 분리가능한 결합을 갖는 SNAP-25 에피토프와 구별할 수 있는 비로서 특징지워질 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는 그의 SNAP-25 에피토프 대 그 에피토프를 포함하지 않는 SNAP-25에 대한 결합 특이성 비가, 예를 들어, 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 64:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1, 또는 적어도 40:1이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는 그의 SNAP-25 에피토프 대 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단이 결여된 SNAP-25에 대한 결합 특이성 비가, 예를 들어, 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1, 또는 적어도 40:1이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는 그의 SNAP-25 에피토프 대 BoNT/A 절단 부위의 그대로의 P1-P1' 분리가능한 결합을 갖는 SNAP-25에 대한 결합 특이성 비가, 예를 들어, 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 64:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1, 또는 적어도 40:1이다.
기능성 친화도(functional affinity)라고도 알려진, 결합 활성도는 다가 항체와 그 항원 사이의 기능성 결합 강도의 총 합을 말한다. 항체 분자는 하나를 초과하는 결합 부위를 가질 수 있으며 (예를 들어, IgG 2개, IgM 10개), 많은 항원이 하나를 초과하는 항원성 부위를 포함한다. 항체의 결합 활성도는 개별 항체 결합 부위의 결합 친화도에 의존적이지만, 항체가 완전히 해리되기 위해서는 모든 항체-항원 상호작용이 동시에 끊어져야만 하기 때문에 결합 활성도는 결함 친화도보다 더 크다. BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체는 그 항체에 대한 임의의 그리고 모든 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, α-SNAP-25 항체는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체이다. 본 실시 형태의 태양에서, α-SNAP-25 항체는 카르복실-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체 또는 카르복실-말단 리신을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, α-SNAP-25 항체는 SEQ ID NO: 5의 글루타민에 상응하는 카르복실-말단 P1 잔기를 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체 또는 SEQ ID NO: 16의 리신 204에 상응하는 카르복실-말단 P1 잔기를 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, α-SNAP-25 항체는 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148의 카르복실 말단 아미노산 서열을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체이다.
본 발명의 태양은, BoNT/A 활성을 검풀하는 면역-기반 방법을 부분적으로, 포함한다. 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 예를 들어, 정확도(accuracy), 정밀도(precision), 검출한계 (LOD), 정량한계 (LOQ), 범위(range), 특이성(specificity), 선택성(selectivity), 선형도(linearity), 견뢰성(ruggedness), 및 시스템 안정성(system suitability)을 포함하는 몇가지 파라미터에 의해 평가될 수 있다. 방법의 정확도는 분석 방법의 엄밀함(exactness)의 측정치, 또는 측정된 값과 통상적인 참값(true value)으로 허용되는 값 또는 허용되는 기준 값 사이의 일치(agreement)의 접근(closeness)이다. 방법의 정밀도는 동종 샘플의 다중 샘플링을 위해 방법이 반복적으로 적용될 때 개별 시험 결과들 사이의 일치 정도이다. 마찬가지로, 정밀도는 1) 검정중 가변성(within assay variability); 2) 일중 가변성 (within-day variability) (반복가능성); 및 3) 일간 가변성(between-day variability) (중간 정밀도(intermediate 정밀도)); 및 4) 실험실간 가변성(between-lab variability) (재현가능성)를 평가한다. 변이계수(Coefficient of variation; CV%)는 관찰된 또는 이론적인 평균 값에 대해 나타낸 정밀도의 정량적 측정치이다.
본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은, 백그라운드에 대해, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 포함하는 α-SNAP-25 항체-항원 복합체의 존재를 검출할 수 있어야만 한다. 방법의 검출 한계 (LOD)는 네거티브 대조구 또는 블랭크와는 상당히 상이한 신호를 발생시키는 분석물의 농도를 말하며, 백그라운드로부터 구별될 있는 분석물의 최저 농도를 나타낸다.
따라서, 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 네거티브 대조구 또는 블랭크와는 상당히 상이한 양에서 BoNT/A의 LOD를 검출할 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 10 ng 이하, 9 ng 이하, 8 ng 이하, 7 ng 이하, 6 ng 이하, 5 ng 이하, 4 ng 이하, 3 ng 이하, 2 ng 이하, 1 ng 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 900 pg 이하, 800 pg 이하, 700 pg 이하, 600 pg 이하, 500 pg 이하, 400 pg 이하, 300 pg 이하, 200 pg 이하, 100 pg 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 추가적인 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 90 pg 이하, 80 pg 이하, 70 pg 이하, 60 pg 이하, 50 pg 이하, 40 pg 이하, 30 pg 이하, 20 pg 이하, 10 pg 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 9 pg 이하, 8 pg 이하, 7 pg 이하, 6 pg 이하, 5 pg 이하, 4 pg 이하, 3 pg 이하, 2 pg 이하, 1 pg 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD 가, 예를 들어, 0.9 pg 이하, 0.8 pg 이하, 0.7 pg 이하, 0.6 pg 이하, 0.5 pg 이하, 0.4 pg 이하, 0.3 pg 이하, 0.2 pg 이하, 0.1 pg 이하의 BoNT/A이다.
본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법 은 LOD가, 예를 들어, 10 nM 이하, 9 nM 이하, 8 nM 이하, 7 nM 이하, 6 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의BoNT/A이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 20 pM 이하, 또는 10 pM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 10 pM 이하의 BoNT/A, 9 pM 이하, 8 pM 이하, 7 pM 이하, 6 pM 이하, 5 pM 이하, 4 pM 이하, 3 pM 이하, 2 pM 이하, 또는 1 pM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 1000 fM 이하, 900 fM 이하, 800 fM 이하, 700 fM 이하, 600 fM 이하, 500 fM 이하, 400 fM 이하, 300 fM 이하, 200 fM 이하, 또는 100 fM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 100 fM 이하, 90 fM 이하, 80 fM 이하, 70 fM 이하, 60 fM 이하, 50 fM 이하, 40 fM 이하, 30 fM 이하, 20 fM 이하, 또는 10 fM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOD 가, 예를 들어, 10 fM 이하, 9 fM 이하, 8 fM 이하, 7 fM 이하, 6 fM 이하, 5 fM 이하, 4 fM 이하, 3 fM 이하, 2 fM 이하, 또는 1 fM 이하의 보툴리늄 신경독 A이다.
정량 한계 (LOQ)는 허용가능한 수준의 정확도 및 정밀도로 측정될 수 있는 샘플 또는 시편 중의 분석물의 가장 낮은 농도 및 가장 높은 농도이다. 정량 하한은 검출 방법이 백그라운드로부터 일관되게 측정할 수 있는 가장 낮은 양을 말한다. 정량 상한은 신호 포화(saturation of the signal)가 일어나기 전에 검출 방법이 일관되게 측정할 수 있는 가장 높은 양을 말한다. 방법의 선형 범위(linear range)는 정량 하한과 정량 상한 사이의 영역이다. 선형 영역은 정량 상한으로부터 정량 하한을 감하여 계산된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비(signal to noise ratio for the lower asymptote)"라는 용어는 방법에서 검출 하한에서 검출되는 신호를 백그라운드 신호로 나눈 것을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비(signal to noise ratio for the upper asymptote)" 라는 용어는 방법에서 검출 상한에서 검출되는 신호를 백그라운드 신호로 나눈 것을 말한다.
따라서, 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 네거티브 대조구 또는 블랭크와는 상당히 상이한 양에서 BoNT/A의 LOQ를 검출할 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법 은 LOQ가, 예를 들어, 10 ng 이하, 9 ng 이하, 8 ng 이하, 7 ng 이하, 6 ng 이하, 5 ng 이하, 4 ng 이하, 3 ng 이하, 2 ng 이하, 1 ng 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법 LOQ가, 예를 들어, 900 pg 이하, 800 pg 이하, 700 pg 이하, 600 pg 이하, 500 pg 이하, 400 pg 이하, 300 pg 이하, 200 pg 이하, 100 pg 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 추가적인 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 90 pg 이하, 80 pg 이하, 70 pg 이하, 60 pg 이하, 50 pg 이하, 40 pg 이하, 30 pg 이하, 20 pg 이하, 10 pg 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 9 pg 이하, 8 pg 이하, 7 pg 이하, 6 pg 이하, 5 pg 이하, 4 pg 이하, 3 pg 이하, 2 pg 이하, 1 pg 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 0.9 pg 이하, 0.8 pg 이하, 0.7 pg 이하, 0.6 pg 이하, 0.5 pg 이하, 0.4 pg 이하, 0.3 pg 이하, 0.2 pg 이하, 0.1 pg 이하의 BoNT/A이다.
본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법 은 LOQ 가, 예를 들어, 10 nM 이하, 9 nM 이하, 8 nM 이하, 7 nM 이하, 6 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 900 pM 이하, 800 pM 이하, 700 pM 이하, 600 pM 이하, 500 pM 이하, 400 pM 이하, 300 pM 이하, 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 100 pM 이하, 90 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 30 pM 이하, 20 pM 이하, 또는 10 pM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 10 pM 이하의 BoNT/A, 9 pM 이하, 8 pM 이하, 7 pM 이하, 6 pM 이하, 5 pM 이하, 4 pM 이하, 3 pM 이하, 2 pM 이하, 또는 1 pM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 1000 fM 이하, 900 fM 이하, 800 fM 이하, 700 fM 이하, 600 fM 이하, 500 fM 이하, 400 fM 이하, 300 fM 이하, 200 fM 이하, 또는 100 fM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 100 fM 이하, 90 fM 이하, 80 fM 이하, 70 fM 이하, 60 fM 이하, 50 fM 이하, 40 fM 이하, 30 fM 이하, 20 fM 이하, 또는 10 fM 이하의 BoNT/A이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 10 fM 이하, 9 fM 이하, 8 fM 이하, 7 fM 이하, 6 fM 이하, 5 fM 이하, 4 fM 이하, 3 fM 이하, 2 fM 이하, 또는 1 fM 이하의 BoNT/A이다.
개시된 발명의 태양을 실시하는 데 유용한 면역-기반 검정은 정밀도가 50% 이하여야 한다.　 본 실시 형태의 태양에서, 면역-기반 검정은 정밀도가 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 또는 20%이하이다. 　본 실시 형태의 다른 태양에서, 면역-기반 검정은 정밀도가 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하이다.　 본 실시 형태의 다른 태양에서, 면역-기반 검정 은 정밀도가 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하이다.
개시된 방법의 태양을 실시하는 데 유용한 면역-기반 검정은 정확도가 적어도 50%이어야 한다.　 본 실시 형태의 태양에서, 면역-기반 검정은 정확도가 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%이다. 　본 실시 형태의 다른 태양에서, 면역-기반 검정은 정확도가 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%이다.　 본 실시 형태의 다른 태양에서, 면역-기반 검정은 정확도가 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이다.
본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비가 통계적으로 유의하여야 하며, 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비가 통계적으로 유의하여야 한다. 본 실시 형태의 태양에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비가, 예를 들어, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 적어도 8:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1 또는 적어도 20:1이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 면역-기반 방법은 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비가, 예를 들어, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1, 적어도 40:1, 적어도 45:1, 적어도 50:1, 적어도 60:1, 적어도 70:1, 적어도 80:1, 적어도 90:1, 또는 적어도 100:1, 적어도 150:1, 적어도 200:1, 적어도 250:1, 적어도 300:1, 적어도 350:1, 적어도 400:1, 적어도 450:1, 적어도 500:1, 적어도 550:1, 또는 적어도 600:1이다.
방법의 특이성은 방법이 다른 관련 구성요소, 예를 들어, 부분-활성 또는 비활성(inactive) 분석불을 배제하고 관심 분석물을 검출하는 능력을 정의한다. 방법의 특이성은 분석 방법이 샘플 중의 다양한 물질을 구별하는 능력을 설명한다. 방법의 선형성은 방법이 직접적으로, 또는 잘 정의된 수학적 변환에 의해, 샘플 중의 분석물의 농도에 비례하는 결과를 도출하는 능력을 말한다. 따라서, 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 면역-기반 방법은 예를 들어, 완전히 활성인 BoNT/A의 활성의 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 10% 이하를 갖는 부분적으로 활성인 BoNT/A로부터 완전히 활성인 BoNT/A를 구별할 수 있다.
방법의 견뢰성은 보통의 (그러나 가변의) 시험 조건 하에서 동일한 샘플에 대해 얻어지는 시험 결과의 재현가능성이다. 방법의 견고성(Robustness)은 방법 파라미터의 적으나 고의적인 변동에 의해 영향을 받지 않는 채로 남아있는 능력의 측정치이며 정상적인 사용 시의 신뢰성의 표시를 제공한다. 따라서, 견뢰성은 피할 수 없는 변화를 평가하는 반면, 견고성은 고의적인 변화를 평가한다. 견뢰성 및 견고성에 의해 평가되는 전형적인 파라미터는 동결/해동, 인큐베이션 시간, 인큐베이션 온도, 시약의 수명(longevity), 샘플 제조, 샘플 보관, 세포 통과 수(cell passage nunber), 독소의 로트(lot), 정제들 사이의 가변성, 및 니킹 반응(reaction) 사이의 가변성의 영향을 포함한다. 세포-기반 검정에 대한 견고성 파라미터는 세포 은행(동결 초기, 중기 및 말기), 세포 통과 수준, 세포 시딩 (seeding) 밀도, 세포 스톡(stock) 밀도(배양 일수), 플라스크 내에서의 세포 나이 (시딩 대기 시간), 인큐베이션 시간, 상이한 플레이트, 과량의 혈청, 및 시약의 공급원을 포함한다. 방법의 시스템 안정성은 기준 표준물의 분석에 의해 시간이 지남에 따른 시약 및 장비의 성능을 포함한, 검정 성능을 결정하는 것이다. 시스템 안정성은 장비, 전자기기, 검정 성능, 및 분석할 샘플이 통합 시스템을 구성한다는 사실을 참고하여 FDA 가이던스에서 강조된다. 시스템 안정성은 반응에 대한 로그 투여량을 플롯할 때, 기준물의 계열 희석 및 샘플의 계열 희석이 평행한 곡선을 생성하여야 하는 평행성(parallelism)에 대한 시험에 의해서 평가될 수 있다.
본 발명의 태양은, 계통확립 세포주로부터의 세포를, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "세포"라는 용어는 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성인 임의의 진핵 세포 또는 BoNT/를 흡수할 수 있는 임의의 진핵 세포를 말한다. 세포라는 용어는 다양한 유기체로부터의 세포, 예를 들어, 쥐과, 래트, 돼지, 소, 말, 영장류 및 사람 세포; 다양향 세포 유형으로부터의 세포, 예를 들어, 뉴런 및 비-뉴런 세포를 아루르며; 이종 세포 집단, 조직, 또는 유기체의 일부로부터 단리될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "계통확립 세포주"라는 용어는 "불멸 세포주" 또는 "변형(transformed) 세포주"와 동일한 의미이며, 유기체, 조직 또는 기관 공급원으로부터 유래된 세포 집단의 무한 증식을 위해 선택된 세포의 세포 배양물을 말한다. 정의에 의하면, 계통확립 세포주는 일차 세포의 세포 배양물을 배제한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "p일차 세포(rimary cell)" 라는 용어는 신선한 조직 또는 기관으로부터 직접 수확된 세포이며 무한히 증식할 능력이 없다. 계통확립 세포주는 세포의 이종 집단 또는 세포의 균일한 집단(uniform population)을 포함할 수 있다. 단일 세포로부터 유래된 계통확립 세포주는 클론성 세포주를 말한다. 계통확립 세포주는 그의 세포가, BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/의 결합, 신경독/수용체 복합체의 내재화, 세포내 소포로부터 세포질로의 BoNT/A 경쇄의 전위 및 SNAP-25의 단백질가수분해적 절단을 포함하는, BoNT/A가 SNAP-25기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 전체 세포 메커니즘을 진행하기 위해 세포에 필요한 모든 구성요소를 내인성으로(endogenously) 발현하는 것일 수 있다. 대안적으로, 계통확립 세포주는 그의 세포가, BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/의 결합, 신경독/수용체 복합체의 내재화, 세포내 소포로부터 세포질로의 BoNT/A 경쇄의 전위 및 SNAP-25의 단백질가수분해적 절단을 포함하는, BoNT/A가 SNAP-25기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 전체 세포 메커니즘을 진행하기 위해 세포에 필요한 외인성 공급원의 적어도 하나의 구성요소로부터 유도된 것일 수 있다. 또한, 유전자 조작(genetically-engineered) 세포주라 하는, 그러한 계통확립 세포주로부터의 세포가, 예를 들어, 외인성 FGFR2, 외인성 FGFR3, 외인성 SV2, 외인성 SNAP-25, 또는 이들의 임의의 조합을 발현할 수 있다.
본 발명의 태양은 BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터 의 세포를, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A 중독에 감수성인 세포(들)", " BoNT/A 에 의한 BoNT/A 중독에 감수성인 세포(들) ", 또는 " BoNT/A 에 의한 BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포(들) "이라는 용어는, BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/의 결합, 신경독/수용체 복합체의 내재화, 세포내 소포로부터 세포질로의 BoNT/A 경쇄의 전위 및 SNAP-25의 단백질가수분해적 절단을 포함하는, BoNT/A가 SNAP-25기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 전체 세포 메커니즘을 진행할 수 있는 세포(들)를 말한다. 정의에 의하면, BoNT/A 중독에 감수성인 세포(들)은 적어도 하나의 BoNT/A 수용체 및 적어도 하나의 SNAP-25 기질을 발현하거나 발현하도록 조작(engineered)되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, " BoNT/A 를 흡수할 수 있는 세포(들) " 또는 " BoNT/A 를 흡수할 수 있는 계통확립 세포주를 구성하는 세포(들)"이라는 용어는, BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/의 결합, 신경독/수용체 복합체의 내재화, 세포내 소포로부터 세포질로의 BoNT/A 경쇄의 전위 및 SNAP-25의 단백질가수분해적 절단을 포함하는, BoNT/A가 SNAP-25기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 전체 세포 메커니즘을 진행할 수 있는 세포(들)를 말한다. 정의에 의하면, BoNT/A 를 흡수할 수 있는 세포(들)은 적어도 하나의 BoNT/A 수용체 및 적어도 하나의 SNAP-25 기질을 발현하거나 발현하도록 조작되어야 한다.
따라서, 실시 형태에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성이다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 예를 들어, 약 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 또는 약 100 pM 이하의 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는, 예를 들어, 약 90 pM 이하, 약 80 pM 이하, 약 70 pM 이하, 약 60 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 40 pM 이하, 약 30 pM 이하, 약 20 pM이하, 또는 약 10 pM 이하의BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성이다. 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는, 예를 들어, 약 9 pM 이하, 약 8 pM 이하, 약 7 pM 이하, 약 6 pM 이하, 약 5 pM 이하, 약 4 pM 이하, 약 3 pM 이하, 약 2 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성이다. 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는, 예를 들어, 약 0.9 pM 이하, 약 0.8 pM 이하, 약 0.7 pM 이하, 약 0.6 pM 이하, 약 0.5 pM 이하, 약 0.4 pM 이하, 약 0.3 pM 이하, 약 0.2 pM, 또는 약 0.1 pM 이하의 a BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약"이라는 용어는 언급된 아이템, 수, 백분율 또는 기간의 값을 평할 때, 언급된 아이템, 백분율, 파라미터 또는 기간의 값의 플러스 또는 마이너스 10%의 범위를 말한다.
다른 실시 형태에서, 계통확립 세포주를 구성하는 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주를 구성하는 세포는, 예를 들어, 약500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 또는 약 100 pM 이하의 BoNT/A를 흡수할 수 있다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주를 구성하는 세포는 약 90 pM 이하, 약 80 pM 이하, 약 70 pM 이하, 약 60 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 40 pM 이하, 약 30 pM 이하, 약 20 pM 이하, 또는 약 10 pM 이하의 BoNT/A를 흡수하는 능력을 가질 수 있다. 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주를 구성하는 세포는 약 9 pM 이하, 약 8 pM 이하, 약 7 pM 이하, 약 6 pM 이하, 약 5 pM 이하, 약 4 pM 이하, 약 3 pM 이하, 약 2 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 BoNT/A를 흡수하는 능력을 가질 수 있다. 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주를 구성하는 세포는 약 0.9 pM 이하, 약 0.8 pM 이하, 약 0.7 pM 이하, 약 0.6 pM 이하, 약 0.5 pM 이하, 약 0.4 pM 이하, 약 0.3 pM 이하, 약 0.2 pM 이하, 또는 약 0.1 pM 이하의 BoNT/A 를 흡수하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 태양은, BoNT/A를, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A"라는 용어는 "보툴리눔 신경독 세로타입 A" 또는 "보툴리눔 신경독 타입 A"와 동일한 의미이며, 천연 BoNT/A 또는 비-천연BoNT/A 둘 모두를 말하고, 약 150 kDa BoNT/A 신경독 및 관련된 비-독소 관련 단백질 (NAP)을 포함하는 BoNT/A 복합체, 뿐만 아니라 약 150 kDa BoNT/A 신경독 단독을 포함한다. BoNT/A 복합체의 비-제한적인 예는, 예를 들어, 900-kDa BoNT/A 복합체, 500-kDa BoNT/A 복합체, 300-kDa BoNT/A 복합체를 포함한다. 약 150 kDa BoNT/A 신경독의 비-제한적인 예는, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "천연BoNT/A"이라는 용어는 천연 프로세스에 의해서 제조된 임의의 BoNT/A를 말하며, 번역후 변형, 대안적으로-스플라이싱된 전사(alternatively-spliced transcript), 또는 자발적 돌연변이로부터 생성된 BoNT/A 아이소폼, 및 BoNT/A 서브타입, 예를 들어, BoNT/A1 서브타입, BoNT/A2 서브타입, BoNT/A3 서브타입, BoNT/A4 서브타입, 및 BoNT/A5 서브타입을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연BoNT/A은, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4로부터, 예를 들어, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개의 아미노산이 치환, 제거 또는 추가된 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연 BoNT/A의 구매가능한 약학적 조성물은 보톡스 (BOTOX® (미국 캘리포니아 이르빈 소재의 알러간, 인크.(Allergan, Inc.)), 디스포르트(DYSPORT ®)/릴록신(RELOXIN®, (영국 슬라우 소재의 입센 리미티드(Ipsen Ltd.), 푸르톡스(PURTOX®)(미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재의 멘토 코포레이션(Mentor Corp.)), 제오민 (XEOMIN®)(독일 프랑크푸르트 소재의 메르츠 파마슈티칼스, 게엠베하(Merz Pharmaceuticals, GmbH.)), 뉴로녹스(NEURONOX®)(대한민국 오창면 소재의 메티-톡스, 인크.(Medy-Tox, Inc.)), BTX-A를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-천연BoNT/A"이라는 용어는 인간의 조작의 도움으로 구조가 변형된 임의의 BoNT/A를 말하며, 무작위 돌연변이유발(random mutagenesis) 또는 합리적 디자인(rational design)을 사용한 유전자 조작에 의해서 변경된 아미노산 서열을 갖는 BoNT/A및 세포외 화학적 합성에 의해 생성된 BoNT/A를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 비-천연BoNT/A의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌 [Steward, L.E. et al., Post - translational Modifications and Clostridial Neurotoxins, U.S. Patent 7,223,577; Dolly, J.O. et al., Activatable Clostridial Toxins, U.S. Patent No. 7,419,676; Steward, L.E. et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, US 2004/0220386; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, U.S. Patent Publication No. 2008/0096248; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, U.S. Patent Publication No. 2008/0161543; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins With Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Clostridial Toxin Target Cells, U.S. Patent Publication No. 2008/0241881]에서 설명되며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
따라서, 실시 형태에서, 검출되는 BoNT/A 활성은 천연BoNT/A으로부터의 것이다. 본 실시 형태의 태양에서, 검출되는BoNT/A 활성은 BoNT/A 아이소폼 또는 BoNT/A 서브타입 으로부터의 것이다. 본 실시 형태의 태양에서, 검출되는BoNT/A 활성은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4의 BoNT/A로부터의 것이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 검출되는BoNT/A 활성은, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 BoNT/A로부터의 것이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 검출되는 BoNT/A 활성은 BOTOX®, DYSPORT®/RELOXIN®, PURTOX®,, XEOMIN®, NEURONOX®, 또는 BTX-A로부터의 것이다.
다른 실시 형태에서, 검출되는 BoNT/A 활성은 비-천연BoNT/A로부터의 것이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 검출되는 BoNT/A 활성은, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 비-천연BoNT/A 변이체로부터의 것이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 검출되는 BoNT/A 활성은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 비-인접(non-contiguous) 아미노산 치환, 제거, 또는 삭제를 갖는 비-천연BoNT/A 변이체로부터의 것이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 검출되는 BoNT/A 활성은, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 인접(contiguous) 아미노산 치환, 제거, 또는 삭제를 갖는 비-천연BoNT/A 변이체로부터의 것이다.
본 발명의 태양은 SNAP-25를, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "SNAP-25" 라는 용어는 BoNT/A에 의해 우선적으로 절단되는 천연 SNAP-25 또는 비-천연SNAP-25를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "우선적으로 절단(preferentially cleaved)"이라는 용어는 BoNT/A에 의한 BoNT/A 기질의 절단 속도가 BoNT/A에 의한 임의의 다른 기질의 절단 속도보다 적어도 1차수(order of magnitude) 더 큼을 말한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A에 의한 BoNT/A 기질의 절단 속도는 BoNT/A에 의한 임의의 다른 기질의 절단 속도보다 적어도 2차수 더 크거나, 적어도 3차수 더 크거나, 적어도 4차수 더 크거나, 또는 적어도 5차수 더 크다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "천연SNAP-25"라는 용어는 천연 프로세스에 의해서 제조된 임의의 SNAP-25를 말하며, 번역후 변형, 대안적으로-스플라이싱된 전사, 또는 자발적 돌연변이로부터 생성된 SNAP-25 아이소폼, 및 SNAP-25 서브타입을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연SNAP-25는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24로부터, 예를 들어, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산이 치환, 제거 또는 추가된 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-천연SNAP-25"라는 용어는 인간의 조작의 도움으로 구조가 변형된 임의의 SNAP-25 를 말하며, 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생성된 SNAP-25 및 세포외 화학적 합성에 의해 생성된 SNAP-25를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 비-천연SNAP-25의 비제한적인 예는 예를 들어, 문헌 [Steward, L.E. et al., FRET Protease Assays for Clostridial Toxins, U.S. Patent 7,332,567; Fernandez-Salas et al., Lipohilic Dye - based FRET Assays for Clostridial Toxin Activity, U.S. Patent Publication 2008/0160561]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 비-천연SNAP-25은, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24로부터, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산이 치환, 제거 또는 추가될 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, SNAP-25는 천연SNAP-25이다. 본 실시 형태의 태양에서, SNAP-25는 SNAP-25 아이소폼 또는 SNAP-25 서브타입이다. 본 실시 형태의 태양에서, 천연SNAP-25는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24의 천연SNAP-25이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25는, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24와 적어도 70%의 아미노산 일치율, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 아미노산 일치율을 갖는 천연SNAP-25이다.
다른 실시 형태에서, SNAP-25은 비-천연SNAP-25이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25은, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 비-천연SNAP-25이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, SNAP-25는, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 비-인접 아미노산 치환, 제거 또는 추가를 갖는 비-천연SNAP-25이다.
본 실시 형태의 또 다른 태양에서, SNAP-25는, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 인접 아미노산 치환, 제거 또는 추가를 갖는 비-천연SNAP-25이다.
SNAP-25는 내인성 SNAP-25 또는 외인성 SNAP-25일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내인성 SNAP-25"라는 용어는 SNAP-25 의 외부 공급원 또는 SNAP-25 를 인코딩하는 유전자 물질의 외부 공급원의 필요 없이 세포의 게놈 내에서 자연적으로 인코딩되어 세포가 SNAP-25 를 본래 발현하기 때문에 세포 내에 자연적으로 존재하는 SNAP-25를 말한다. 내인성 SNAP-25의 발현은 예를 들어, 세포 분화와 같은 환경적 자극에 의해서 또는 자극없이 이루어질 수 있다. 정의에 의하면, 내인성 SNAP-25는 오직 천연 SNAP-25 또는 그의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 하기 계통확립 세포주가 내인성 SNAP-25를 발현한다: BE(2)-M17, Kelly, LA1-55n, N1E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa, and SK-N-BE(2)-C.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "외인성 SNAP-25"라는 용어는 인간의 조작에 의한 SNAP-25 의 외부 공급원 또는 SNAP-25 를 인코딩하는 유전자 물질의 외부 공급원의 도입을 통해 세포에서 발현되는 SNAP-25를 말한다. 외인성 SNAP-25의 발현은 예를 들어, 세포 분화와 같은 환경적 자극에 의해서 또는 자극없이 이루어질 수 있다. 비제한적인 예로서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 SNAP-25의 일시적 또는 안정한 트랜스펙션(transient or stably transfection)에 의해 외인성 SNAP-25를 발현할 수 있다. 다른 비제한적인 예로서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 SNAP-25의 단백질 트랜스펙션에 의해 외인성SNAP-25를 발현할 수 있다. 외인성 SNAP-25는 천연 SNAP-25 또는 그 변이체, 또는 비-천연SNAP-25 또는 그 변이체일 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 내인성 SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 SNAP-25는 천연 SNAP-25이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 SNAP-25는 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 SNAP-25는 천연SNAP-25, 예를 들어, SNAP-25 아이소폼 또는 SNAP-25 서브타입이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 SNAP-25는, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24와 적어도 70% 아미노산 일치율, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 천연SNAP-25이다.
다른 실시 형태에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 (transiently or stably engineered) 외인성 SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 천연 SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24의 천연 SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 천연SNAP-25, 예를 들어, SNAP-25 아이소폼 또는SNAP-25 서브타입을 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24와 적어도 70% 아미노산 일치율, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 천연SNAP-25를 발현한다.
실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 비-천연SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 비-천연SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24에 대한, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 100 이상의 비-인접 아미노산 치환, 제거, 또는 추가를 갖는 비-천연SNAP-25를 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 또는 SEQ ID NO: 24에 대한 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 100 이상의 인접 아미노산 치환, 제거, 또는 추가를 갖는 비-천연SNAP-25를 발현한다.
BoNT/A에 노출후 BoNT/A 기질의 절단을 검출하는 검정은 세포가 내인성 또는 외인성 SNAP-25를 발현하는 지를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 검정에서, SNAP-25 절단 생성물의 생성은 BoNT/A 처리후 SNAP-25를 발현하는 세포에서 검출될 것이다. 특이적 웨스턴 블럿 분석, 뿐만 아니라 잘-특성화된 시약, 조건 및 프로토콜의 비제한적인 예는 상업적 판매처로부터 쉽게 입수가능하며, 애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences, 미국 뉴욕주 피스카타웨이); 바이오-라드 래브러토리즈(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘리스); 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 락포트); 프로메가 코포레이션(Promega Corporation, 미국 위스콘신주 매디슨), 및 스트라타진, 인크.(Stratagene, Inc., 미국 캘리포니아 라 졸라)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. SNAP-25 절단에 대한 이러한 및 유사한 검정이 내인성 또는 외인성 SNAP-25를 발현하는 세포를 확인하는 데 유용할 수 있는 것으로 이해된다.
비제한적인 예로서, BoNT/A SNAP-25 절단 생성물 또는 절단된 및 절단되지 않은 형태의 SNAP-25 둘 모두를 인식하는 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석이 BoNT/A의 흡수에 대한 검정에 사용될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 α-SNAP-25 항체의 예는, α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체 SMI-81 (Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD), 마우스 α-SNAP-25 단클론성 항체 CI 71.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체 CI 71.2 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체 SP12 (Abcam, Cambridge, MA), α-SNAP-25 래빗 다클론성 항혈청 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), α-SNAP-25 래빗다클론성 antiserum (Abcam, Cambridge, MA), 및 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항혈청 S9684 (Sigma, St Louis, MO)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 태양은 BoNT/A 수용체를 일부분 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A 수용체"라는 용어는 BoNT/A 중독 반응을 이끌어내는 방식으로 BoNT/A와 우선적으로 상호작용하는 천연 BoNT/A 수용체 또는 비-천연BoNT/A 수용체 중 어느 하나를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "우선적으로 상호작용 "이라는 용어는 BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/A의 평형 해리 상수(KD)가 세표 표면에서의 다른 수용체에 대한 BoNT/A의 것보다 1차수 더 작음을 말한다. BoNT/A-BoNT/A 수용체 복합체가 그의 구성요소 분자, 즉, BoNT/A 및 BoNT/A 수용체로 역으로 분리(해리)하는 경향을 측정하는 특정 유형의 평형 상수인, 평형 해리 상수는 평형에서 KD=Ka/Kd로 정의된다. 결합 상수 (Ka)는 Ka=[C]/[L][R]로 정의되고, 해리 상수 (Kd)는 Kd=[L][R]/[C]로 정의되며, 여기서, [L]은 BoNT/A의 몰 농도이고, [R]은 BoNT/A 수용체의 몰 농도이고, [C] 는 BoNT/A-BoNT/A 수용체 복합체의 몰 농도이고, 모든 농도는 계가 평형일 때의 그러한 구성성분들의 농도이다. 해리 상수가 더 작을수록 BoNT/A 가 그 수용체에 더 단단히 결합하거나, 또는 BoNT/A와 BoNT/A 수용체 사이의 결합 친화도가 더 크다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/A의 해리 상수는 임의의 다른 수용체에 대한 BoNT/A의 해리 상수보다 적어도 2차수 더 적거나, 적어도 3 차수 더 적거나, 적어도 4 차수 더 적거나, 또는 적어도 차수 더 적다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 수용체 와 우선적으로 상호작용하는 BoNT/A 의 결합 친화도는 평형 해리 상수(KD)가, 예를 들어, of 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하 또는100 nM 이하일 수 있다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 수용체 와 우선적으로 상호작용하는 BoNT/A 의 결합 친화도는 평형 해리 상수(KD)가, 예를 들어, 90 nM 이하, 80 nM 이하, 70 nM 이하, 60 nM, 50 nM 이하, 40 nM 이하, 30 nM 이하, 20 nM 이하, 또는10 nM 이하일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A 중독 반응을 이끌어내는"이라는 용어는 BoNT/A 수용체가 BoNT/A와 상호작용하여 신경독/수용체 복합체를 형성하고, 세포 세포질로 그 복합체를 후속하여 내재화하는 능력을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "천연BoNT/A 수용체"라는 용어는 천연 프로세스에 의해 생성된 임의의 BoNT/A 수용체를 말하며, 번역후 변형, 대안적으로-스플라이싱된 전사, 또는 자발적 돌연변이로부터 생성된 BoNT/A 수용체 아이소폼, 및 BoNT/A 수용체 서브타입을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연BoNT/A 수용체는, 섬유아세포 성장 인자 수용체 2 (FGFR2), 섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR3), 시냅스 소포 당단백질 2 (SV2), 및 복합체 강글리오사이드 유사 GT1b, 예를 들어, 각각 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된, 문헌 [Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, U.S. Patent Publication 2008/0003240; Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, U.S. Patent Publication 2008/0182799; Min Dong et al., SV2 is the Protein Receptor for Botulinum Neurotoxin A, Science (2006); S. Mahrhold et al, The Synaptic Vesicle Protein 2C Mediates the Uptake of Botulinum Neurotoxin A into Phrenic Nerves, 580(8) FEBS Lett. 2011-2014 (2006)]에 기재된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연FGFR2은, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 및 SEQ ID NO: 70를 포함하거나, 또는 예를 들어, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 및 SEQ ID NO: 70으로부터 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산을 치환, 삭제 또는 추가한 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연FGFR3은 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, 및 SEQ ID NO: 27 를 포함하거나, 또는, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, 및SEQ ID NO: 27로부터 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산을 치환, 삭제 또는 추가한 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 천연SV2는SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, 및 SEQ ID NO: 31을 포함하거나, 또는, 예를 들어, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, 및 SEQ ID NO: 31로부터 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는100개 이상의 아미노산을 치환, 삭제 또는 추가한 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-천연BoNT/A 수용체 변이체" 라는 용어는 인간의 조작 또는 디자인의 도움으로 생성된 임의의 BoNT/A 수용체를 말하며, 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생성된 BoNT/A 수용체 및 화학적 합성에 의해 생성된 BoNT/A 수용체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 비-천연BoNT/A 변이체의 비제한적인 예는, 예를 들어, 보존성(conservative) BoNT/A 수용체 변이체, 비-보존성 BoNT/A 수용체 변이체, BoNT/A 수용체 키메라 변이체 및 활성 BoNT/A 수용체 단편을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-천연BoNT/A 수용체"라는 용어는 인간의 조작의 도움으로 구조가 변형되는 임의의 BoNT/A 수용체를 말하며, 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생성된 BoNT/A 수용체 및 생체외 화학적 합성에 의해 생성된 BoNT/A 수용체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 비-천연BoNT/A 수용체의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌 [Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, U.S. Patent Publication 2008/0003240; Ester Fernandez-Salas, et al., Botulinum Toxin Screening Assays, U.S. Patent Publication 2008/0182799]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 비-천연BoNT/A 수용체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70으로부터, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산을 치환, 제거 또는 추가할 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, BoNT/A 수용체는 천연BoNT/A 수용체, 예를 들어, FGFR2, FGFR3 또는 SV2이다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 수용체는 BoNT/A 수용체 아이소폼 또는BoNT/A 수용체 서브타입이다. 본 실시 형태의 태양에서, 천연BoNT/A 수용체는 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70의 천연BoNT/A 수용체이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 수용체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70와 적어도 70% 아미노산 일치율, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 천연BoNT/A 수용체이다.
다른 실시 형태에서, BoNT/A 수용체는 비-천연BoNT/A 수용체, 예를 들어, 유전자 조작 FGFR2, a 유전자 조작 FGFR3, or a 유전자 조작 SV2이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 수용체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 비-천연BoNT/A 수용체이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 수용체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 비-인접 아미노산 치환, 제거 또는 추가를 갖는 비-천연BoNT/A 수용체이다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 수용체는 having, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 인접 아미노산 치환, 삭제, 또는 추가를 갖는 비-천연BoNT/A 수용체이다.
BoNT/A 수용체는 내인성 BoNT/A 수용체 또는 외인성 BoNT/A 수용체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내인성 BoNT/A 수용체"라는 용어는 BoNT/A 수용체 의 외부 공급원 또는 BoNT/A 수용체를 인코딩하는 유전자 물질의 외부 공급원의 필요 없이 세포의 게놈 내에서 자연적으로 인코딩되어 세포가 BoNT/A 수용체를 본래 발현하기 때문에 세포 내에 자연적으로 존재하는 BoNT/A 수용체를 말한다. BoNT/A 수용체의 발현은 예를 들어, 세포 분화 또는 프로모터 활성화(promoter activation)와 같은 환경적 자극에 의해서 또는 자극없이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하기 계통확립 세포주는 적어도 하나의 내인성 BoNT/A 수용체를 발현한다: BE(2)-M17, Kelly, LA1-55n, N1E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa, 및 SK-N-BE(2)-C. 내인성 BoNT/A 수용체는 오직 천연 BoNT/A 수용체 또는 그의 천연 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "외인성 BoNT/A 수용체"라는 용어는 인간의 조작에 의한 BoNT/A 수용체의 외부 공급원 또는 BoNT/A 수용체를 인코딩하는 유전자 물질의 외부 공급원의 도입을 통해 세포에서 발현되는 BoNT/A 수용체를 말한다. 외인성 BoNT/A 수용체의 발현은 예를 들어, 세포 분화 또는 프로모터 활성화와 같은 환경적 자극에 의해서 또는 자극없이 이루어질 수 있다. 비제한적인 예로서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 수용체, 예를 들어, FGFR2, FGFR3, 또는 SV2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 일시적 또는 안정한 트랜스펙션에 의해 하나이상의 외인성 BoNT/A 수용체를 발현할 수 있다. 다른 비제한적인 예로서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 수용체, 예를 들어, FGFR2, FGFR3, 또는 SV2의 단백질 트랜스펙션에 의해서 하나 이상의 외인성 BoNT/A 수용체를 발현할 수 있다. 외인성 BoNT/A 수용체는 천연 BoNT/A 수용체 또는 그의 천연 변이체, 또는 비-천연BoNT/A 수용체 또는 그의 비-천연 변이체일 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 내인성 BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 BoNT/A 수용체는 천연 BoNT/A 수용체이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 BoNT/A 수용체는 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포 에 의해 발현된 내인성 BoNT/A 수용체는 천연BoNT/A 수용체, 예를 들어, BoNT/A 수용체 아이소폼 또는 BoNT/A 수용체 서브타입이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포에 의해 발현된 내인성 BoNT/A 수용체는 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70와 적어도 70% 아미노산 일치율, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 천연BoNT/A 수용체이다.
다른 실시 형태에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 외인성 BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 천연 BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70의 천연 BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 천연BoNT/A 수용체, 예를 들어, BoNT/A 수용체 아이소폼 또는 BoNT/A 수용체 서브타입을 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70과 적어도 70%의 아미노산 일치율, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 천연BoNT/A 수용체를 발현한다.
실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 비-천연BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 아미노산 일치율을 갖는 비-천연BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는 100개 이상의 비-인접 아미노산 치환, 제거, 또는 추가 를 갖는 갖는 비-천연BoNT/A 수용체를 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어, 예를 들어, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, 또는 SEQ ID NO: 70에 대한 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 또는100개 이상의 인접 아미노산 치환, 제거, 또는 추가를 갖는 비-천연BoNT/A 수용체를 발현한다.
다른 실시 형태에서, 계통확립 세포주로부터의 세포 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 외인성 FGFR2, 외인성 FGFR3, 외인성 SV2, 또는 이들의 임의의 조합을 발현한다. 본 실시 형태의 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 천연 FGFR2, 천연 FGFR3, 천연 SV2, 또는 이들의 임의의 조합을 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 비-천연 FGFR2, 비-천연 FGFR3, 비-천연 SV2, 또는 이들의 임의의 조합을 발현한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 일시적으로 또는 안정하게 조작되어 천연 FGFR2 또는 비-천연 FGFR2 중 하나, 천연 FGFR3 또는 비-천연 FGFR3 중 하나, 천연 SV2 또는 비-천연 SV2 중 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 발현한다.
하나 이상의 내인성 또는 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 세포가, 독소 흡수에 대한 직접 및 간접 검정을 포함하는 일상적인 방법에 의해 확인될 수 있다. BoNT/A 결합 또는 흡수 특성을 결정하는 검정이 세포가 BoNT/A 수용체를 발현하는 지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 검정은, 표지된 BoNT/A, 예를 들어, [125I] BoNT/A, [125I]를 사용한 가교결합 검정(cross-linking assay)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Noriko Yokosawa et al., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); Noriko Yokosawa et al., Binding of botulinum type Cl , D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29(2) Toxicon 261-264 (1991); and Tei-ichi Nishiki et al., Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes, 269(14) J. Biol. Chem. 10498-10503 (1994)] 참조. 다른 비제한적인 검정은 표지된 또는 비표지된 항체를 사용한 BoNT/A 결합을 검출하는 면역세포화학(immunocytochemical) 검정 - 예를 들어, 문헌 [Atsushi Nishikawa et al., The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT -29 cells, 319(2) Biochem. Biophys. Res. Commun. 327-333 (2004) 참조 - 및 표지된 또는 비표지된 항체를 사용하여 결합된 독소를 검출하는 면역침전(immunoprecipitation) 검정 - 예를 들어, 문헌[Yukako Fujinaga et al., Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes, 150(Pt 5) Microbiology 1529-1538 (2004)]참조 - 을 포함한다. 이러한 검정에 유용한 항체는 BoNT/A에 대하여 선택된 항체, BoNT/A 수용체, 예를 들어, FGFR2, FGFR3, 또는 SV2에 대하여 선택된 항체, 및/또는 강글리오사이드, 예를 들어, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b, 또는 GT1b 에 대하여 선택된 항체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 항체가 표지되는 경우, 분자의 결합은 당업자에게 잘알려진 기술을 사용하여, 웨스턴 블럿 분석, 항체의 세포 배치(cellular location)의 직접적인 현미경 관찰, 세척 단계후 세포 또는 기질-결합된 항체의 측정, 유동세포계수법(flow cytometry), 전기영동 또는 모세관 전기영동을 포함하는 다양한 방법으로 검출될 수 있다. 항체가 비표지되는 경우, 결합된 분자의 간접적 검출을 위해 표지된 2차 항체를 사용할 수 있으며, 검출은 표지된 항체에 대해서와 같이 처리될 수 있다. BoNT/A 흡수 특성 및 특징을 결정하는 이러한 및 유사한 검정이 내인성 또는 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 세포를 확인하는 데 유용할 수 있는 것으로 이해된다.
BoNT/A에 노출후 분자의 방출을 모니터링하는 검출이 또한 세포가 하나 이상의 내인성 또는 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 지를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 검정에서, 분자의 방출의 억제가 BoNT/A 처리후 BoNT/A 수용체를 발현하는 세포에서 일어날 것이다. 잘 알려진 검정은 뉴런으로부터의 방사표지된 카테콜아민 방출, 예를 들어, [3H] 노르아드레날린 또는 [3H] 도파민 방출의 억제를 측정하는 방법 - 예를 들어, 문헌 [A Fassio et al., Evidence for calcium - dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F, 90(3) Neuroscience 893-902 (1999); and Sara Stigliani et al., The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin C1 and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool, 85(2) J. Neurochem. 409-421 (2003)] 참조 -, 또는 형광측정법(fluorometric procedure)을 사용해 카테콜아민 방출을 측정하는 방법 - 예를 들어, 문헌 [Anton de Paiva et al., A role for the interchain disulfide or its participating thiols in the internalization of botulinum neurotoxin A revealed by a toxin derivative that binds to ecto - acceptors and inhibits transmitter release intracellularly, 268(28) J. Biol. Chem. 20838-20844 (1993); Gary W. Lawrence et al., Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25- kDa synaptosomal -associated protein ( SNAP -25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, 236(3) Eur. J. Biochem. 877-886 (1996); and Patrick Foran et al., Botulinum neurotoxin C1 cleaves both syntaxin and SNAP -25 in intact and permeabilized chromaffin cells : correlation with its blockade of catecholamine release, 35(8) Biochemistry 2630-2636 (1996)] 참조 - 을 포함한다.
다른 비제한적인 예는 내분비 세포, 예를 들어, 뇌하수체전엽 세포 또는 난소 세포로부터의 호르몬 방출의 억제를 측정하는 검정을 포함한다. 분자 방출에 대한 이러한 및 유사한 검정이 내인성 또는 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 세포를 확인하는 데 유용할 수 있는 것으로 이해된다.
BoNT/A에 노출후 BoNT/A 기질의 절단을 검출하는 검정이 또한 세포가 하나 이상의 내인성 또는 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 검정에서는, BoNT/A 기질 절단 생성물의 생성, 또는 그대로의 BoNT/A 기질의 소멸이, BoNT/A 처리후 BoNT/A 수용체를 발현하는 세포에서 검출될 것이다.
특이적 웨스턴 블럿 분석, 뿐만 아니라 잘-특성화된 시약, 조건 및 프로토콜의 비제한적인 예는 상업적 판매처로부터 쉽게 입수가능하며, 애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences, 미국 뉴욕주 피스카타웨이); 바이오-라드 래브러토리즈(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘리스); 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc., 미국 일리노이주 락포트); 프로메가 코포레이션(Promega Corporation, 미국 위스콘신주 매디슨), 및 스트라타진, 인크.(Stratagene, Inc., 미국 캘리포니아 라 졸라)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. BoNT/A 기질 절단에 대한 이러한 및 유사한 검정이 내인성 또는 외인성 SNAP-25를 발현하는 세포를 확인하는 데 유용할 수 있는 것으로 이해된다.
비제한적인 예로는, BoNT/A SNAP-25 절단 생성물 또는 절단된 및 절단되지 않은 형태의 SNAP-25 둘 모두를 인식하는 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 분석이 BoNT/A의 흡수에 대한 검정에 사용될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 α-SNAP-25 항체의 예는, SMI-81 α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체 (Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD), CI 71.1 마우스 α-SNAP-25 단클론성 항체 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), CI 71.2 α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), SP12 α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체 (Abcam, Cambridge, MA), α-SNAP-25 래빗 다클론성 항혈청 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), α-SNAP-25 래빗 다클론성 항혈청 S9684 (Sigma, St. Louis, MO), 및 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항혈청 (Abcam, Cambridge, MA)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 태양은 유전자 조작 또는 재조합 가공되어 외인성 SNAP-25 및/또는 하나 이상의 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 세포를 제공한다. 유전자 조작 또는 재조합 가공을 통해 외인성 SNAP-25 및/또는 하나 이상의 외인성 BoNT/A 수용체를 발현하는 데 유용한 세포는 내인성 SNAP-25 및/또는 하나 이상의 내인성 BoNT/A 수용체를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있는 뉴런 세포 및 비 뉴런-세포를 포함한다. 이러한 유전자 조작 또는 재조합 가공된 세포는 구성적(constitutive), 조직-특이성, 세포-특이성 또는 유도가능한(inducible) 프로모터 요소, 인핸서(enhancer) 요소 또는 둘 모두의 제어 하에 외인성 SNAP-25 및 하나 이상의 외인성 BoNT/A 수용체를 발현할 수 있는 것으로 또한 이해된다. 세포가 유전자적으로 조작되거나 재조합적으로 가공되어 외인성 SNAP-25 및/또는 하나 이상의 외인성 BoNT/A 수용체를 발현할 수 있고 BoNT/A 중독을 진행할 수 있기만 하다면 임의의 세포가 유용한 것으로 이해된다.
세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하는 데 필요한 구성요소를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포 내로 도입하여, BoNT/A가 SNAP-25 기질, 예를 들어, SNAP-25, FGFR2, FGFR3, 또는 SV2을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 유용한 방법은, 화학-매개 전달 방법(chemical-mediated delivery method), 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개, 다이에틸-아미노에틸 (DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개, 폴리리신-매개 및 폴리브렌(polybrene)-매개 방법; 물리-매개 전달 방법, 예를 들어, 바이오리스틱 입자 전달(biolistic particle delivery), 미세주사(microinjection), 원형질체 융합(protoplast fusion) 및 전기천공(electroporation); 및 바이러스-매개 전달 방법(viral-mediated delivery method), 예를 들어, 레트로바이러스-매개 트랜스펙션을 포함하지만 이로 한정되지 않는다, 예를 들어, 문헌[Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001); Alessia Colosimo et al., Transfer and Expression of Foreign Genes in Mammalian Cells, 29(2) Biotechniques 314-318, 320-322, 324 (2000); Philip Washbourne & A. Kimberley McAllister, Techniques for Gene Transfer into Neurons, 12(5) Curr. Opin. Neurobiol. 566-573 (2002); and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, pp 9.16.4-9.16.11 (2000)]을 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다. 당업자는 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포 내로 도입하기 위한 특정 방법의 선택이, 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 SNAP-25 기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 구성요소를 세포가 일시적으로 또는 안정하게 포함하는 지의 여부에, 일부분, 의존적일 것임을 이해한다. 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 SNAP-25 기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, 또는 SEQ ID NO: 138; FGFR3 폴리뉴클레오타이드 분자 of SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, 또는 SEQ ID NO: 141의 FGFR2 폴리뉴클레오타이드 분자; SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 SV2 폴리뉴클레오타이드 분자; 및 SEQ ID NO: 145, 또는 SEQ ID NO: 146의 SNAP-25 폴리뉴클레오타이드 분자.
화학-매개 전달 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium Phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004); Chun Zhang et al., Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to Brain - Derived Cells, 33(2) Methods 144-150 (2004)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 이러한 화학-매개 전달 방법은 표준 절차에 의해 제공될 수 있으며, 상업적으로 이용가능하다, 예를 들어, 셀펙트 트랜스펙션 키트(CellPhect Transfection Kit) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); 포유류 트랜스펙션 키트(Mammalian Transfection Kit), 칼슘 포스페이트 및 DEAE 덱스트란, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); 리포펙타민(Lipofectamine™) 트랜스펙션 시약 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 트랜스펙션 키트 (Fermentas, Inc., Hanover, MD), 및 슈퍼펙트(SuperFect) 및 이펙텐(Effectene) 트랜스펙션 키트 (Qiagen, Inc., Valencia, CA)참조.
물리-매개 전달 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Jeike E. Biewenga et al., Plasmid - Mediated Gene Transfer in Neurons using the Biolistics Technique, 71(1) J. Neurosci. Methods. 67-75 (1997); John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and Diolistic Transfection : Using the Gene Gun to Deliver DNA and Lipophilic Dyes into Mammalian Cells, 33(2) Methods 121-125 (2004); M. Golzio et al., In Vitro and In Vivo Electric Field -Mediated Permeabilization , Gene Transfer , and Expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); and Oliver Greschet al., New non - Viral Method for Gene Transfer into Primary Cells, 33(2) Methods 151-163 (2004)]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
바이러스-매개 전달 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Chooi M. Lai et al., Adenovirus and Adeno - Associated Virus Vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Ilya Frolov et al., Alphavirus - Based Expression Vectors : Strategies and Applications, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 11371-11377 (1996); Roland Wolkowicz et al., Lentiviral Vectors for the Delivery of DNA into Mammalian Cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004); A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus Vectors : Novel Mammalian Cell Gene - Delivery Vehicles and Their Applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003); Tiziana Tonini et al., Transient Production of Retroviral- and Lentiviral - Based Vectors for the Transduction of Mammalian Cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight Control of Gene Expression in Eukaryotic Cells by Tetracycline - Responsive Promoters, U.S. Patent No. 5,464,758; Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for Regulating Gene Expression, U.S. Patent No. 5,814,618; David S. Hogness, Polynucleotides Encoding Insect Steroid Hormone Receptor Polypeptides and Cells Transformed With Same, U.S. Patent No. 5,514,578; David S. Hogness, Polynucleotide Encoding Insect Ecdysone Receptor, U.S. Patent 6,245,531; Elisabetta Vegeto et al., Progesterone Receptor Having C. Terminal Hormone Binding Domain Truncations, U.S. Patent No. 5,364,791; Elisabetta Vegeto et al., Mutated Steroid Hormone Receptors , Methods for Their Use and Molecular Switch for Gene Therapy, U.S. Patent No. 5,874,534]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 이러한 바이러스 매개 전달 방법은 표준 절차에 의해 제공될 수 있으며, 상업적으로 이용가능하다, 예를 들어, 바이라파워(ViraPower™) 아데노바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 바이라파워(ViraPower™) 아데노바이러스 발현 시스템 사용 매뉴얼 25-0543 버전 A, (Invitrogen, Inc., Jul. 15, 2002); 및 애드이지(AdEasy™) 아데노바이러스 벡터 시스템 (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) 및 애드이지(AdEasy™) 아데노바이러스 벡터 시스템 사용 매뉴얼 064004f, (Stratagene, Inc) 참조. 또한, 이러한 바이러스 전달 시스템은 표준 방법에 의해 제공될 수 있고, 상업적으로 이용가능하다, 예를 들어, BD™ Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) 및 BD™ Tet-Off 및 Tet-On 유전자 발현 시스템 사용자 매뉴얼, PT3001-1 (BD Biosciences Clonetech, Mar. 14, 2003), 진스위치(GeneSwitch™) 시스템 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 포유류 세포를 위한 진스위치(GeneSwitch™) 시스템 A 미페프리스톤-조절된(Mifepristone-Regulated) 발현 시스템, 버전 D, 25-0313 (Invitrogen, Inc., Nov. 4, 2002); 바이라파워(ViraPower™) 렌티바이러스(Lentiviral) 발현 시스템 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 바이라파워 (ViraPower™) 렌티바이러스 발현 시스템 사용 매뉴얼 25-0501 버전 E (Invitrogen, Inc., Dec. 8, 2003); 및 완전 제어(Complete Control)® 레트로바이러스 유도가능한 포유류 발현 시스템 (Stratagene, La Jolla, CA) 및 완전 제어 ® 레트로바이러스 유도가능한 포유류 발현 시스템 매뉴얼, 064005e 참조.
따라서, 실시 형태에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 SNAP-25 기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 SNAP-25 기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 복수의 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 FGFR2, FGFR3, SV2 또는 SNAP-25를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, 또는 SEQ ID NO: 138의 FGFR2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, 또는 SEQ ID NO: 141의 FGFR3을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144 의 SV2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 145, 또는 SEQ ID NO: 146의 SNAP-25를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 일시적으로 포함한다.
다른 실시 형태에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 SNAP-25 기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 SNAP-25 기질을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 복수의 구성요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 FGFR2, FGFR3, SV2 또는 SNAP-25를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, 또는 SEQ ID NO: 138의 FGFR2를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, 또는 SEQ ID NO: 141의 FGFR3 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 SV2 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다. 본 실시 형태의 또 다른 태양에서, BoNT/A 중독에 감수성인 계통확립 세포주로부터의 세포는 SEQ ID NO: 145, 또는 SEQ ID NO: 146의 SNAP-25 를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 안정적으로 포함한다.
상기에 언급된 바와 같이, 세포가 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 본 명세서에 개시된 SNAP-25 기질, 예를 들어, SNAP-25, FGFR2, FGFR3, 또는 SV2을 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 외인성 구성요소가 세포 내로 도입될 수 있다. 전달제(delivery agent)를 사용하여 그러한 외인성 구성요소를 세포 집단 내로 도입하는 데 유용한 임의의 그리고 모든 방법이 유용할 수 있으며, 단, 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 외인성 구성요소를 주어진 세포 집단 내의 세포의 적어도 50%에 일시적으로 도입한다는 조건이다. 따라서, 본 실시 형태의 태양은, 예를 들어, 주어진 세포 집단의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 세포가, 전체 세포 메커니즘을 진행하여 BoNT/A가 본 명세서에 개시된 SNAP-25 기질, 예를 들어, SNAP-25, FGFR2, FGFR3, 또는 SV2를 단백질가수분해적으로 절단하는 데 필요한 외인성 구성요소를 일시적으로 포함하는, 세포 집단을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전달제 "라는 용어는 공유 결합, 비-공유 결합 또는 폴리펩티드와 관련된 임의의 다른 방식의 세포 내로의 내재화를 가능하게 하거나 강화시키는 임의의 분자를 말한다. 따라서, "전달제 "라는 용어는 공유 또는 비공유 결합 분자를 세포막, 세포 세포질 또는 핵으로 이동시키는, 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 소분자, 폴리뉴클레오타이드 분자, 리포좀(liposome), 지질, 바이러스, 레트로바이러스 및 세포를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. "전달제"라는 용어는 임의의 메커니즘에 의해서 내재화되는 분자를 포함하는 것으로 또한 이해되며, 수용체 매개 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 기능하는 전달제 및 수용체 매개 엔도시토시스에 의존적인 것들을 포함한다.
전달제는 또한 예를 들어, 화학 컨쥬게이션에 의해 또는 유전자적으로 생성된 융합 단백질에 의해서, 공유 결합된 구성요소, 예를 들어, FGFR2, FGFR3, SV2, 또는 SNAP-25의 세포 흡수를 가능하게하거나 강화하는 제제일 수 있다. 전달제를 공유 결합하는 방법 및 그러한 제제를 사용하는 방법이, 예를 들어, 문헌[Steven F. Dowdy, Protein Transduction System and Methods of Use Thereof, International Publication No WO 00/34308; Gerard Chassaing & Alain Prochiantz, Peptides which can be Used as Vectors for the Intracellular Addressing of Active Molecules, U.S. Patent No. 6,080,724; Alan Frankel et al., Fusion Protein Comprising TAT - derived Transport Moiert, U.S. Patent No. 5,674,980; Alan Frankel et al., TAT - derived Transport Polypeptide Conjugates, U.S. Patent No. 5,747,641; Alan Frankel et al., TAT - derived Transport Polypeptides and Fusion Proteins, U.S. Patent No. 5,804,604; Peter F. J. O'Hare et al., Use of Transport Proteins, U.S. Patent No. 6,734,167; Yao-Zhong Lin & Jack J. Hawiger, Method for Importing Biologically Active Molecules into Cells, U.S. Patent No. 5,807,746; Yao-Zhong Lin & Jack J. Hawiger, Method for Importing Biologically Active Molecules into Cells, U.S. Patent No. 6,043,339; Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, U.S. Patent No. 6,248,558; Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, U.S. Patent No. 6,432,680; Jack J. Hawiger et al., Method for Importing Biologically Active Molecules into Cells, U.S. Patent No. 6,495,518; Yao-Zhong Lin et al., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, U.S. Patent No. 6,780,843; Jonathan B. Rothbard & Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, U.S. Patent No. 6,306,993; Jonathan B. Rothbard & Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, U.S. Patent No. 6,495,663; and Pamela B. Davis et al., Fusion Proteins for Protein Delivery, U.S. Patent No. 6,287,817]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
전달제는 또한 비-공유 결합된 구성요소, 예를 들어, FGFR2, FGFR3, SV2c, 또는 SNAP-25의 세포 흡수를 가능하게 하거나 강화하는 제제일 수 있다. 공유 결합의 부재시 기능하는 방법 및 그러한 제제를 사용하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Gilles Divita et al, Peptide - Mediated Transfection Agents and Methods of Use, U.S. Patent No. 6,841,535; Philip L Felgner and Olivier Zelphati, Intracellular Protein Delivery Compositions and Methods of Use, U.S. Patent Publication No. 2003/0008813; and Michael Karas, Intracellular Delivery of Small Molecules , Proteins and Nucleic Acids, U.S. Patent Publication 2004/0209797]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 그러한 펩티드 전달제는 표준 방법에 의해 제조 및 사용될 수 있고, 구매가능하다, 예를 들어, 샤리오트(CHARIOT™) 시약 (Active Motif, Carlsbad, CA); 바이오-포터(BIO-PORTER®) 시약 (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA), 바이오 트렉(BIO TREK™) 단백질 전달 시약 (Stratagene, La Jolla, CA), 및 프로-젝트(PRO-JECT™) 단백질 트랜스펙션 시약 (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL) 참조.
본 발명의 태양은BoNT/A를 포함하는 샘플을, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, " BoNT/A를 포함하는 샘플"이라는 용어는 활성 BoNT/A를 포함하거나 잠재적으로 포함하는 임의의 생물학적 물질을 말한다. 다양한 샘플이 본 명세서에 개시된 방법에 따라 검정될 수 있으며, 정제된, 부분적으로 정제된, 또는 비정제된 BoNT/A; 천연 또는 비-천연 서열을 갖는 재조합 단일 사슬 또는 이중-사슬 독소; 변형 프로테아제 특이성을 갖는 재조합 BoNT/A; 변경 세포 특이성을 갖는 재조합 BoNT/A; 발ㅋ, BoNT/A; 예를 들어, BOTOX®, DYSPORT®/RELOXIN®, XEOMIN®, PURTOX®, NEURONOX®, BTX-A를 포함하는 제형화된 BoNT/A 제품; 및 예를 들어, 세균, 효모, 곤충, 또는 포유류 공급원으로부터의 세포 또는 조(crude), 분획화 또는 부분 정제된 세포 용해물; 혈액, 혈장 또는 혈청; 생으로의(raw), 부분 조리된, 조리된, 또는 또는 처리된 식품; 음료; 동물 사료; 토양 샘플(soil sample); 물 샘플; 연못 침전물(pond sediment); 로션; 화장품; 및 임상적 제형(clinical formulation)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 샘플이라는 용어는 포유류 조직 샘플, 가축(livestock) 조직 샘플, 예를 들어, 양, 소 및 돼지 조직 샘플; 영장류 조직 샘플; 및 인간 조직 샘플을 포함하지만 이로 한정되지 않는 조직 샘플을 아우르는 것으로 이해된다. 이러한 샘플은 유아 장내 샘플 (infant intestinal sample)과 같은 장내 샘플, 및 상처로부터 얻은 조직 샘플을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 비제한적인 예로서, BoNT/A 활성의 피코몰 양을 검출하는 방법은 식품 또는 음료 샘플 내의 BoNT/A의 존재 또는 활성을 결정하는 데; 예를 들어, BoNT/A에 노출된 또는 하나 이상의 보툴리즘 증상을 갖는 사람 또는 동물로부터의 샘플을 검정하는 데; 벌크 BoNT/A의 생성 및 정제 동안 활성을 추적하는 데; 약학적 또는 화장품 응용에 사용되는 제형화된 BoNT/A 제품을 검정하는 데; 또는 중화(neutralizing) α-BoNT/A 항체의 존재 또는 부재에 대한 대상의 혈액 혈청을 검정하는 데 유용할 수 있다.
따라서, 실시 형태에서, BoNT/A를 포함하는 샘플은 임의의 양의 BoNT/A를 포함하는 샘플이다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A를 포함하는 샘플은 약 100 ng 이하, 약 10 ng 이하, 약 1 ng 이하, 약 100 pg 이하, 약 10 pg 이하, 또는 약 1 pg 이하의 BoNT/A를 포함한다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A를 포함하는 샘플은 약 1 uM 이하, 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 1 pM 이하, 약 100 fM 이하, 약 10 fM 이하, 또는 약 1 fM 이하의 BoNT/A를 포함한다.
본 발명의 태양은 처리된 세포로부터 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 것을, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25를 포함하는 SNAP-25 구성요소"라는 용어는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 세포 구성요소를 말한다. SNAP-25 구성요소를 풍부하게 하거나 단리하는 데 적합한 임의의 방법이 유용할 수 있는 것으로 생각되며, 세포 용해 프로토콜(lysing protocol), 스핀-컬럼(spin-column) 정제 프로토콜, 면역침전, 친화도 정제, 및 단백질 크로마토그래피 가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 태양은, 고체상 지지체에 연결된 α-SNAP-25 항체를, 일부분, 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "고체상 지지체"라는 용어는 "고체상"과 동일한 의미이고 본 명세서에 개시된 α-SNAP-25 항체를 고정화하는 데 사용될 수 있는 임의의 매트릭스를 말한다. 고체상 지지체의 비제한적인 예는, 예를 들어, 튜브; 플레이트; 컬럼; 핀 또는 "딥스틱(dipstick)"; 자석 입자, 비드 또는 다른 구형 또는 섬유질 크로마토그래피 매질, 예를 들어, 아가로즈(agarose), 세파로즈(sepharose), 실리카 및 플라스틱; 및 시트 또는 멤브레인, 예를 들어, 니트로셀룰로오스 및 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)를 포함한다. 고체상 지지체는 매우 다양한 물질, 예를 들어, 유리, 탄소, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 다이아조셀룰로오스, 또는 전분을 사용하여 구성될 수 있다. 선택된 고체상 지지체는 이를 가용성 또는 비결합된 물질로부터 쉽게 분리가능하게 만들며 일반적으로 비결합된 물질, 예를 들어, 과량의 시약, 반응 부생성물, 또는 용매가 (예를 들어, 세척, 여과, 원심분리 등에 의해) 고체상 지지체-결합된 검정 구성요소로부터 분리 또는 달리 제거될 수 있게 하는 물리적 특성을 가질 수 있다. 고체상 지지체를 제조 및 사용하는 방법의 비제한적 예가, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, supra, (2001); and Current Protocols in Molecular Biology, supra, (2004)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
본 발명의 태양은 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체 및 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 것을, 일부분, 포함한다. 임의의 검출 시스템을 사용하여 본 개시된 면역-기반 방법의 태양을 실시 할 수 있는 것으로 생각되며, 단, 신호-대-잡음 비가 항체-항원 복합체로부터의 통계적으로 유의한 정도의 신호를 백그라운드 신호로부터 구별할 수 있다는 조건이다. 면역-기반 검출 시스템의 비제한적인 예는 면역블롯(immunoblot) 분석, 예를 들어, 웨스턴 블롯 및 도트-블로팅(dot-blotting), 면역침전 분석, 효소결합 면역흡착 분석(ELISA), 및 샌드위치 ELISA를 포함한다. 신호의 검출은 이미징 또는 포스포이미징 (AU), 케미루미네선스(chemiluminescense) (CL), 일렉트로케미루미네선스(electrochemiluminescence) (ECL), 바이오루미네선스(bioluminescence) (BL), 플루오레선스(fluorescence), 공명 에너지 전이(resonance energy transfer), 평면 편광(plane polarization), 비색(colormetric), 또는 유동세포계수(flow cytometry) (FC)과 함께 자가방사법(autoradiography)을 사용하여 달성될 수 있다. 면역-기반 검출 시스템의 설명은, 예를 들어, 문헌 [Michael M.Rauhut, Chemiluminescence, In Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology (Ed. Grayson, 3rd ed, John Wiley and Sons, 1985); A. W. Knight, A Review of Recent Trends in Analytical Applications of Electrogenerated Chemiluminescence, Trends Anal. Chem. 18(1): 47-62 (1999); K. A. Fahnrich, et al., Recent Applications of Electrogenerated Chemiluminescence in Chemical Analysis, Talanta 54(4): 531-559 (2001); Commonly Used Techniques in Molecular Cloning, pp. A8.1-A8-55 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001); Detection Systems, pp. A9.1-A9-49 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001); Electrogenerated Chemiluminescence, (Ed. Allen J. Bard, Marcel Dekker, Inc., 2004)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
샌드위치 ELISA (또는 샌드위치 면역검정)은 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 2가지 항체에 기초한 방법이다. 관심 항원에 대해 높은 결합 특이성을 갖는 포획(capture) 항체를 고체 표면에 결합시킨다. 그 다음, 이 항원을 첨가한 후, 검출 항체라고 부르는 제2 항체를 첨가한다. 검출 항체는 포획 항체와 상이한 에피토프에 항원을 결합시킨다. 그러므로, 항원은 두 항체 사이에 '샌드위치'된다. 항원에 대한 항체 결합 친화도는 보통 면역검정 민감도의 주된 결정치이다. 항원 농도가 증가함에 따라 검출 항체의 양이 증가하여 더 높은 측정 반응을 야기한다. 결합하는 정도를 정량화하기 위하여, 상이한 리포터시스템, 예를 들어, 효소 반응이 검출 신호로서 리드아웃(readout)을 형성하는, 제2 항체 및 리포터 기질에 부착된 효소가 사용될 수 있다. 생성된 신호는 샘플에 존재하는 표적 항원의 양에 비례한다. 결합 사건을 측정하는 데 사용되는 리포터 기질은 검출 방식을 결정한다. 분광광도 플레이트 리더(spectrophotometric plate reader)가 비색 검출을 위해 사용된다. 신호를 더욱 증폭하고 형광 리더 상에서 판독될 수 있는 케미루미네선스 및 일렉트로케미루미네선스 기질이 개발되어 있다. 리포터는 또한 형광 리드아웃일 수 있으며, 여기서, 검정의 효소 단계는 플루오로포어(fluorophore)로 대체되며 리드아웃은 그 후에 형광 리더를 사용하여 측정된다. ECL 샌드위치 ELISA를 수행하는 데 필요한 시약 및 프로토콜은 상업적으로 이용가능하며, 예외 없이, MSD 샌드위치 ELISA-ECL 검출 플랫폼 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)이 포함된다.
따라서, 실시 형태에서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 항체 및 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 것은, 면역-블롯 분석, 면역 침전 분석, ELISA, 또는 샌드위치 ELISA를 사용하여 수행될 수 있다. 본 실시 형태의 태양에서, 검출은 AU, CL, ECL, 또는 BL 면역-블롯 분석, AU, CL, ECL, BL, 또는 FC 면역침전 분석, AU, CL, ECL, BL, 또는 FC ELISA, 또는 AU, CL, ECL, BL, 또는 FC 샌드위치 ELISA를 사용하여 실시된다.
본 발명의 태양은 싱글플렉스(singleplex) 또는 멀티플렉스(multiplex) 방식으로 실시될 수 있다. 싱글플렉스 방식으로 실시되는 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법은 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재만을 오직 검출하는 것이다. 멀티플렉스 방식으로 실시되는 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법은 둘 이상의 항체-항원 복합체의 존재를 동시에 검출하는 것이다; BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체인 것; 및 제2, 제3, 제4 등의 상이한 단백질에 대한 항체-항원 복합체인 다른 것(들). 제2 단백질은, 예를 들어, 제2 단백질에 대해 검출되는 항체-항원 복합체의 양에 대해 검출되는 α-SNAP-25/SNAP-25 항체-항원 복합체의 양을 정규화하여, 샘플 대 샘플의 가변성을 최소화하기 위한 내부 대조구로서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 제2 단백질은 보통 세포, 예를 들어, 하우스-키핑 단백질(house-keeping protein)에 의해 일관되게 발현되는 것이다. 유용한 제2 단백질의 비제한적인 예는, 예를 들어, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH), 신택신, 시토킨 을 포함한다. 멀티플렉스 방식으로 면역-기반 검정을 실시하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [U. B. Nielsen and B. H. Geierstanger, Multiplexed Sandwich Assays in Microarray Format, J. Immunol. Methods. 290(1-2): 107-120 2004); R. Barry and M, Soloviev, Quantitative Protein Profiling using Antibody Arrays, Proteomics, 4(12): 3717-3726 (2004); M. M. Ling et al., Multiplexing Molecular Diagnostics and Immunoassays using Emerging Microarray Technologies, Expert Rev Mol Diagn. 7(1): 87-98 (2007); S. X. Leng et al., ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research, J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63(8): 879-884 (2008)]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
따라서, 일 실시 형태에서, BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법은BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재만을 오직 검출함으로써 싱글플렉스 방식으로 실시된다. 다른 실시 형태에서, BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법은 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체, 및 SNAP-25이외의 단백질, 예를 들어, GAPDH 또는 신택신에 대한 적어도 다른 하나의 항체-항원 복합체의 존재를 동시에 검출하는 멀티플렉스 방식으로 실시된다.
본 발명의 태양은, BoNT/A면역저항성(immunoresistance)을 결정하는 방법을, 일부분, 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A 면역저항성"이라는 용어는 포유류의 면역 반응이, 직접 또는 간접적으로, 요법(therapy)의 효능을 감소시키기 때문에 BoNT/A 요법에 완전히 반응하지 않거나, 또는 BoNT/A 요법의 감소된 유익한 효과를 나타내는 포유류를 말한다. 감소된 효능의 비제한적인 예는 독소의 특이성 또는 활성을 감소 또는 방지하는 방식으로 BoNT/A 독소에 결합하는 적어도 하나의 중화 α-BoNT/A 항체의 포유류에서의 존재 이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "BoNT/A 요법"이라는 용어는 처리(treatment), 치료(remedy), 의료(cure), 치유(healing), 회복(rehabilitation), 또는 BoNT/A 독소를 사용한 신경조절(neuromodulation)을 필요로 하는 포유류에서 바람직하지 않은 것을 방해(counteract)하거나, 의학적, 치료학적, 의료적, 미용적, 치료적, 또는 임의의 다른 이로운 효과를 갖는 하나 이상의 제어된 투여량의 의약품, 제제 또는 BoNT/A 독소 혼합물을 포유류에 투여하는 임의의 다른 수단을 의미한다. BoNT/A 요법은 임의의 캐리어 또는 활성 성분과 조합되고 임의의 투여 경로로 투여되는 임의의 제형으로서의 임의의 천연 또는 변형 단편의 사용을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 예시적인, 잘 알려진 BoNT/A 요법은 보톡스(BOTOX®) 요법이다.
본 발명의 태양은 α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험되는 포유류로부터 얻어지는 시험 샘플을, 일부분, 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "시험 샘플"이라는 용어는 적어도 하나의 α-BoNT/A 항체를 포함하거나 잠재적으로 포함하는 임의의 생물학적 물질을 말한다. α-BoNT/A 항체는 중화 항-BoNT/A 항체 또는 비-중화 항-BoNT/A 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "중화 항-BoNT/A 항체"라는 용어는, 생리학적 조건 하에서, BoNT/A 요법에서 독소가 효과를 발휘하는 것을 감소시키거나 방지하는 것과 같은 방식으로 BoNT/A 독소의 영역에 결합할 임의의 α-BoNT/A 항체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "비-중화 α-BoNT/A 항체"라는 용어는 생리학적 조건 하에서, BoNT/A 요법에서 독소가 효과를 발휘하는 것을 막지 않고, BoNT/A 독소의 영역에 결합할 임의의 α-BoNT/A 항체를 의미한다. α-BoNT/A 항체를 포함할 수 있는 임의의 그리고 모든 샘플이 본 방법에 사용될 수 있는 것으로 생각되며, 혈액, 혈장, 혈청 및 림프액이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 또한, BoNT/A 독소에 대한 α-BoNT/A 항체를 올릴 수 있는 임의의 그리고 모든 유기체가 샘플의 공급원 역할을 할 수 있으며, 조류 및 마우스, 래트, 염소, 양, 말, 당나귀, 소, 영장류 및 사람을 포함하는 포유류가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 혈액 수집 및 혈청 제조에 특이적인 프로토콜의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[Marjorie Schaub Di Lorenzo & Susan King Strasinger, Blood Collection in Healthcare (F.A. Davis Company, 2001); and Diana Garza & Kathleen Becan-McBride, Phlebotomy Handbook: Blood Collection Essentials (Prentice Hall, 6th ed., 2002)]에 기재되어 있다. 이러한 프로토콜은 당업자의 범주 내의 그리고 본 명세서의 교시로부터의 일상적인 절차이다. 시험 샘플은 BoNT/A 독소에 노출되기 전, 단일 BoNT/A 처리 후, 다중 BoNT/A 독소 처리 후, BoNT/A 요법에 대한 저항성 발생 전, 또는 BoNT/A 요법에 대한 저항성 발생 후 유기체로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 태양은, 대조구 샘플을, 일부분, 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대조구 샘플"이라는 용어는 시험 샘플의 존재 또는 부재가 알려져 있는 임의의 샘플을 의미하며 네거티브 및 포지티브 대조구 샘플 둘 모두를 포함한다. 중화 α-BoNT/A 항체에 대한, 네거티브 대조구 샘플은 BoNT/A에 노출되지 않은 개체로부터 얻어질 수 있으며, 시험 샘플을 공급하는 동일한 개체로부터의, 그러나, BoNT/A 요법을 진행하기 전에 취한 샘플; BoNT/A에 노출되지 않은상이한 개체로부터 취한 샘플; BoNT/A에 노출되지 않은 복수의 상이한 개체로부터 취한 풀링된(pooled) 샘플을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 중화 α-BoNT/A 항체에 대해서, 포지티브 대조구 샘플은 BoNT/A 면역저항성을 나타내는(manifesting) 개체로부터 얻어질 수 있으며, 환자-기반 시험 검정에서 포지티브인 개체; 생체 내 생물검정에서 포지티브인 개체; 및 과다면역성(hyperimmunity)을 나타내는 개체, 예를 들어, BoNT/A 백신된(vaccinated) 개체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
α-BoNT/A 항체는 샘플로부터 정제될 수 있는 것으로 또한 예상된다. 단백질 A/G 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 절차를 사용하여 항-BoNT/A 항체가 샘플로부터 정제될 수 있다. 항체를 정제하는 데 특이적인 프로토콜의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998); Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I (Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998); and Molecular Cloning, A Laboratory Manual, supra, (2001)]에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 또한, 항체 정제 방법뿐만 아니라 잘-특성화된 시약, 조건 및 프로토콜의 비제한적인 예는 상업적인 판매처로부터 쉽게 이용가능하며, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL); 및 지메드 래브러토리즈, 인크.(Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA.)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이러한 프로토콜은 당업자의 범주 내의 일상적인 절차이다.
따라서, 실시 형태에서, 샘플은 혈액을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 샘플은 마우스 혈액, 래트 혈액, 염소 혈액, 양 혈액, 말 혈액, 당나귀 혈액, 소 혈액, 영장류 혈액 또는 사람 혈액을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 샘플을 혈장을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 시험 샘플은 마우스 혈장, 래트 혈장, 염소 혈장, 양 혈장, 말 혈장, 당나귀 혈장, 소 혈장, 영장류 혈장 또는 사람 혈장을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 샘플은 혈청을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 샘플은 마우스 혈청, 래트 혈청, 염소 혈청, 양 혈청, 말 혈청, 당나귀 혈청, 소 혈청, 영장류 혈청 및 사람 혈청을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 샘플은 림프액을 포함한다. 본 실시 형태의 태양에서, 샘플은 마우스 림프액, 래트 림프액, 염소 림프액, 양 림프액, 말 림프액, 당나귀 림프액, 소 림프액, 영장류 림프액 또는 사람 림프액을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 샘플은 시험 샘플이다. 또 다른 실시 형태에서, 샘플은 대조구 샘플이다. 본 실시 형태의 태양에서, 대조구 샘플은 네거티브 대조구 샘플 또는 포지티브 대조구 샘플이다.
본 발명의 태양은 단계 (d)에서 검출되는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25의 양을 단계 (e)에서 검출되는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25와 비교하는 것을, 일부분, 제공한다. 실시 형태에서, 시험 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 양은 대조구 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 양과 비교하여 더 크다. 본 실시 형태의 태양에서, 포지티브 대조구 샘플과 비교하여 시험 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 더 큰 양은 포유류에서 BoNT/A 면역저항성의 감소 또는 결여를 나타낸다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 네거티브 대조구 샘플과 비교하여 시험 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 동일한 양은 포유류에서 BoNT/A 면역저항성의 감소 또는 결여를 나타낸다. 다른 실시 형태에서, 시험 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 양은 대조구 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 양과 비교하여 더 작다. 본 실시 형태의 태양에서, 포지티브 대조구 샘플과 비교하여 시험 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 더 작거나 동일한 양은 포유류에서 BoNT/A 면역저항성의 존재의 증가를 나타낸다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 네거티브 대조구 샘플과 비교하여 시험 샘플 중의 SNAP-25 절단 생성물의 더 적은 양은 포유류에서 BoNT/A 면역저항성의 존재의 증가를 나타낸다.
샘플 중의 중화 α-BoNT/A 항체의 존재를 검출하는 데 적합한 임의의 그리고 모든 검정 조건, 예를 들어, 선형 검정 조건 및 비-선형 검정 조건이 본 명세서에 개시된 방법에 유용한 것으로 생각된다. 본 실시 형태의 태양에서, BoNT/A의 검정 양은 과량이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, BoNT/A의 검정 양은 속도-제한적(rate-limiting)이다. 본 실시 형태의 다른 태양에서, 시험 샘플의 검정 양은 속도-제한적이다.
본 발명의 태양은 하기와 같이 설명될 수 있다:
1. BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 연결된 유연성 링커에 연결된 캐리어를 포함하는 조성물.
2. 제1항의 조성물로서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기는 글루타민 또는 리신인 조성물.
3. 제1항의 조성물로서, SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 147을 포함하는 조성물.
4. 제1항의 조성물로서, 유연성 링커 및 SNAP-25 항원 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 38 또는 SEQ ID NO: 46인 조성물.
5. 단리된 α-SNAP-25 항체로서, SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
6. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 포함하지 않는 에피토프에 대한 결합 속도 상수가 1 x 101 M-1 s- 1미만이고; α-SNAP-25 항체는 에피토프에 대한 평형 해리 상수가 0.450 nM 미만인 단리된 α-SNAP-25 항체.
7. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, 및 SEQ ID NO: 82로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, 및 SEQ ID NO: 92 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 α-SNAP-25 항체.
8. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, 적어도 SEQ ID NO: 93의 VH CDR1, SEQ ID NO: 94의 VH CDR1, SEQ ID NO: 95의 VH CDR1, SEQ ID NO: 118의 VH CDR1, SEQ ID NO: 119의 VH CDR1, 또는 SEQ ID NO: 120의 VH CDR1를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
9. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, 적어도 SEQ ID NO: 96의 VH CDR2, SEQ ID NO: 97의 VH CDR2, SEQ ID NO: 98의 VH CDR2, SEQ ID NO: 99의 VH CDR2, SEQ ID NO: 121의 VH CDR2, SEQ ID NO: 122의 VH CDR2, 또는 SEQ ID NO: 123의 VH CDR2를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
10. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, 적어도 SEQ ID NO: 100의 VH CDR3, SEQ ID NO: 101의 VH CDR3, SEQ ID NO: 102의 VH CDR3, 또는 SEQ ID NO: 124의 VH CDR3를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
11. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, 적어도 SEQ ID NO: 103의 VL CDR1, SEQ ID NO: 104의 VL CDR1, SEQ ID NO: 105의 VL CDR1, SEQ ID NO: 106의 VL CDR1, SEQ ID NO: 107의 VL CDR1, SEQ ID NO: 125의 VL CDR1, SEQ ID NO: 126의 VL CDR1, SEQ ID NO: 127의 VL CDR1, SEQ ID NO: 128의 VL CDR1, 또는 SEQ ID NO: 129의 VL CDR1를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
12. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, 적어도 SEQ ID NO: 108의 VL CDR2, SEQ ID NO: 109의 VL CDR2, SEQ ID NO: 110의 VL CDR2, SEQ ID NO: 111의 VL CDR2, 또는 SEQ ID NO: 112의 VL CDR2를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
13. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, 적어도 SEQ ID NO: 113의 VL CDR3, SEQ ID NO: 114의 VL CDR3, SEQ ID NO: 115의 VL CDR3, SEQ ID NO: 116의 VL CDR3, 또는 SEQ ID NO: 117의 VL CDR3를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
14. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 121 및 SEQ ID NO: 100을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
15. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148의 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
16. 제5항의 단리된 α-SNAP-25 항체로서, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, 또는 SEQ ID NO: 44의 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
17. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서, a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성임); b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; c) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); 및 d) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 BoNT/A 활성을 검출하는 방법.
18. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서, a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성임); b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; c) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 연결된 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); 및 d) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 BoNT/A 활성을 검출하는 방법.
19. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서, a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성임); b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; c) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 고정하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); 및 e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 BoNT/A 활성을 검출하는 방법.
20. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서, a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; c) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); 및 d) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 BoNT/A 활성을 검출하는 방법.
21. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서, a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; c) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 연결된 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); 및 d) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 BoNT/A 활성을 검출하는 방법.
22. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서, a) 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); b) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; c) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 고정하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); 및 e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 BoNT/A 활성을 검출하는 방법
23. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서, a) α-BoNT/A 중화 항체 의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성임); c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; f) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및 g) 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법.
24. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서, a) α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성임); c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 고정상 지지체에 연결된 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; f) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및 g) 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법.
25. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서, a) α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성임); c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 고정하는 단계; e) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); f) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; g) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (f)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및 h) 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (g)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (g)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법.
26. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서, a) α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; f) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및 g) 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법
27. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서, a) α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 연결된 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); e) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; f) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및 g) 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법.
28. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서, a) α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계; b) 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A를 흡수할 수 있음); c) 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계; d) SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 고정하는 단계; e) SNAP-25 구성요소를 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합함); f) α-SNAP-25 항체 및 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계; g) 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (f)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및 h) 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (g)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (g)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법.
29. 제17항 내지 제22항 및 제23항 내지 제25항의 방법으로서, 세포가 약 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 약 100 pM 이하의 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성인 방법.
30. 제20항 내지 제22항 및 제26항 내지 제28항의 방법으로서, 세포가 약 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 약 100 pM 이하의 BoNT/A를 흡수할 수 있는 방법.
31. 제17항 내지 제22항의 방법으로서, 샘플은 약 100 ng 이하, 약 10 ng 이하, 약 1 ng 이하, 100 fg 이하, 10fg 이하, 또는1 fg 이하의 BoNT/A를 포함하는 방법.
32. 제17항 내지 제22항의 방법으로서, 샘플은 약 100 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 1 pM 이하, 약 100 fM 이하, 약 10 fM 이하, 또는 약 1 fM 이하의 BoNT/A를 포함하는 방법.
33. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, α-SNAP-25 항체는 제5항 내지 제16항의 단리된 α-SNAP-25 항체인 방법.
34. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 항체-항원 복합체의 존재는 면역-블롯 분석, 면역 침전 분석, ELISA, 또는 샌드위치 ELISA에 의해 검출되는 방법.
35. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비가 적어도 3:1, 적어도 5:1, 적어도 10:1, 적어도 20:1, 적어도 50:1, 또는 적어도 100:1인 방법.
36. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비가 적어도 10:1, 적어도 20:1, 적어도 50:1, 적어도 100:1, 적어도 200:1, 적어도 300:1, 적어도 400:1, 적어도 500:1, 또는 적어도 600:1인 방법.
37. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은, 예를 들어, 적어도 100 ng, 적어도 50 ng, 적어도 10 ng, 적어도 5 ng, 적어도 100 pg, 적어도 50 pg, 적어도 10 pg, 적어도 5 pg, 적어도 100 fg, 적어도 50 fg, 적어도 10 fg, 또는 적어도 5 fg의 EC50 활성을 검출할 수 있는 방법.
38. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, wherein the 면역-기반 방법 can detect the EC50 활성 of, 예를 들어, 적어도 10 nM, 적어도 5 nM, 적어도 100 pM, 적어도 50 pM, 적어도 10 pM, 적어도 5 pM, 적어도 100 fM, 적어도 50 fM, 적어도 10 fM, 적어도 5 fM, 또는 적어도 1 fM.
39. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 10 pg 이하, 9 pg 이하, 8 pg 이하, 7 pg 이하, 6 pg 이하, 5 pg 이하, 4 pg 이하, 3 pg 이하, 2 pg 이하, 1 pg 이하의 BoNT/A인 방법.
40. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 LOD가, 예를 들어, 100 fM 이하, 90 fM 이하, 80 fM 이하, 70 fM 이하, 60 fM 이하, 50 fM 이하, 40 fM 이하, 30 fM 이하, 20 fM 이하, 또는 10 fM 이하의 BoNT/A인 방법.
41. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 10 pg 이하, 9 pg 이하, 8 pg 이하, 7 pg 이하, 6 pg 이하, 5 pg 이하, 4 pg 이하, 3 pg 이하, 2 pg 이하, 1 pg 이하의 BoNT/A인 방법.
42. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 LOQ가, 예를 들어, 100 fM 이하, 90 fM 이하, 80 fM 이하, 70 fM 이하, 60 fM 이하, 50 fM 이하, 40 fM 이하, 30 fM 이하, 20 fM 이하, 또는 10 fM 이하의 BoNT/A인 방법.
43. 제17항 내지 제28항의 방법으로서, 면역-기반 방법은 완전히 활성인 BoNT/A의 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 10% 이하의 활성을 갖는 부분적으로 활성인 BoNT/A로부터 완전히 활성인 BoNT/A를 구별할 수 있는 방법.
실시예
실시예 I
부호자 세포주의 스크리닝( Screening of Candidate Cell Lines )
하기 실시예는 본 명세서에 개시된 BoNT/A 활성을 검출하는 방법에 필요한, BoNT/A 중독에 감수성이거나 BoNT/A 흡수 능력을 갖는 계통확립 세포주를 확인하는 방법을 예시한다.
1. 후보 세포주의 스톡 배양물의 성장
세포주를 성장시키기 위하여, 시험할 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를, 30 mL의 적합한 성장 배지(표 1 참조)를 포함한 162 cm2 조직 배양 플라스크에 플레이팅하고, 세포가 원하는 밀도에 도달할 때까지 5% 또는 10% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 성장시켰다.
표 1. 세포주 스크리닝에 사용된 배지
세포주 혈청 성장 배지 조성
Kelly
SiMa		 RPMI 1640, 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민
NB69 RPMI 1640, 15% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신
CHP-126 RPMI 1640, 20% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신
N4TG3 RPMI 1640, 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 100 uM 6-티오구아닌
MHH-NB-11 RPMI 1640, 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산
PC12 RPMI 1640, 5% 열-비활성화된 소태아 혈청, 10% 말 혈청, 2 mM GlutaMAX™ 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신
N18TG2 DMEM (11885-084, Gibco), 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 100 uM 6-티오구아닌
N1E-115
N18
ND8/34
NG108-15
NG115-401L
NS20Y
SK-N-SH		 90 % DMEM, 10% 열-비활성화된 소태아 혈청, 2 mM 글루타민, 2 mM 글루코스
SK-N-DZ
SK-N-F1		 90% DMEM, 10% 열-비활성화된 소태아 혈청, 4 mM 글루타민, 4 mM 글루코스, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1.5 g/L NaHCO3
BE(2)-C
BE(2)-M17
CHP-212
LA-1-55n
LA-N-1
MC-1XC
SK-N-BE(2)
SH-SY5Y		 EMEM(11090-081, Gibco), Ham's F12 (11765-054, Gibco), 10% 열-비활성화된 소태아 혈청, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산,
NB4 1A3 Ham's F10 (12471-017, Gibco), 2.5% 열-비활성화된 소태아 혈청, 15% 열-비활성화된 말 혈청, 2 mM 글루타민
Neuro-2a EMEM, 10% 열-비활성화된 소태아 혈청, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1.5 g/L NaHCO3, 1 mM 소듐 피루베이트
2. 1 nM BoNT /A를 사용한 후보 세포주의 단일-투여량 스크리닝.
세포-기반 검정의 민감도를 향상시키기 위해 시험된 한 가지 파라미터는 클로스트리듐 신경독을 흡수하며 기질 표면에 부착하는 우수한 능력을 나타내는 적합한 세포주를 확인하는 것이었다. 처음에, 1 nM BoNT/A를 흡수하는 능력 및 표면에 부착하는 능력에 대해 세포주를 시험하였다. 세포주가 1 nM BoNT/A를 흡수할 수 있는 지 여부를 결정하기 위하여, 시험될 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 농도의 세포를 1 mL의 적합한 혈청 성장 배지(표 1)가 담긴 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 세포가 원하는 밀도에 도달할 때까지 (대략 18 내지 24시간) 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 성장시켰다. 각각의 웰로부터 성장 배지를 흡입하고 1) 독소를 함유하지 않은 신선한 성장 배지 (비처리 세포주) 또는 2) 1 nM의 a BoNT/A 복합체를 함유하는 신선한 성장 배지 (처리 세포주) 중 어느 하나로 대체하였다. 하룻밤 인큐베이션 후에, 성장 배지를 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ of 1 x PBS로 헹구어서 세포를 세척하였다. 세포를 수확하기 위하여, 1 x PBS를 흡입하고, 50 ㎕의 2 x SDS 로딩 완충제를 첨가하여 세포를 용해시키고, 용해물을 깨끗한 시험관으로 옮기고 샘플을 95 ℃까지 5분간 가열하였다.
절단되지 않은 SNAP-25 기질 및 절단된 SNAP-25 생성물 둘 모두의 존재를 검출하기 위하여, 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물(aliquot)을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 이 분석에서는, 수확된 샘플의 12 ㎕ 분취물을 변성, 환원 조건 하에서, NuPAGE® Novex 12% Bis-Tris 프리캐스트(precast) 폴리아크릴아미드 젤 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 MOPS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 분리하였다. 분리된 펩티드를, Trans-Blot® SD 세미-드라이 전기영동 트랜스퍼 세포 장치(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해서, 젤로부터 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) 상으로 옮겼다. Tris- 완충 염수 (TBS) (25 mM 2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로판다이올 염산 (Tris-HCl)(pH 7.4), 137 mM 염화나트륨, 2.7 mM 염화칼륨), 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 2% 소 혈청 알부민 (BSA), 5% 무지방 분유(nonfat dry milk)를 포함하는 용액 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하여 PVDF 멤브레인을 블로킹하였다. 블로킹된 멤브레인을 1) 1차 항체로서 α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체의 1:5,000 희석액 (SMI-81; Sternberger monoclonals Inc., Lutherville, MD); 또는 2) 1차 항체로서 S9684 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항혈청의 1:5,000 희석액 (Sigma, St. Louis, MO) 중 어느 하나를 포함하는, TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 2% BSA, 및 5% 무지방 분유 중에서, 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. α-SNAP-25 마우스 단클론성 및 래빗 다클론성 항체 둘 모두는 절단되지 않은 SNAP-25 기질 및 절단된 SNAP-25 생성물 둘 모두를 검출할 수 있으며, 각각의 세포주에서의 전체 SNAP-25 발현 및 BoNT/A 흡수량을 평가하기 위한 파라미터로서 BoNT/A 처리후 절단된 SNAP-25의 퍼센트의 평가가 가능하다. 1차 항체 프로빙된 블롯(Primary antibody probed blot)을 TBS, TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중에서 매회 15분간 3회 세척하였다. 세척된 멤브레인을, 1) 2차 항체로서, 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 컨쥬게이트된 염소 다클론성 항-마우스 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄 (IgG, H+L) 항체의 1:10,000 희석액 (Zymed, South San Francisco, CA); 또는 2) 2차 항체로서, 서양고추냉이 퍼옥시다제 와 컨쥬게이트된 염소 다클론성 항-래빗 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄의 (IgG, H+L) 항체의 1:10,000 희석물 (Zymed, South San Francisco, CA) 중 어느 하나를 포함하는, TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 2% BSA, 및 5% 무지방 분유 중에서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅 하였다. 2차 항체 프로빙된 블롯을 TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중에서 매회 15분간 3회 세척하였다. 표지된 SNAP-25 생성물의 신호 검출을 ECL Plus™ 웨스턴 블롯 검출 시스템 (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 가시화하였고 멤브레인을 영상화하였고, Typhoon 9410 가변 모드 이미저(Variable Mode Imager) 및 이미저 분석 소프트웨어 (GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 사용하여 절단된 퍼센트를 정량하였다. 픽셀 크기의 선택 (100 내지 200 픽셀) 및 PMT 전압 세팅 (350 내지 600, 보통 400)은 개별 블롯에 따라 좌우되었다. 표 2는 1 nM BoNT/A로 처리하였을 때 SNAP-25 절단 생성물이 검출된 세포주를 나타낸다. 하기 세포주는 1 nM BoNT/A의 흡수 및 기질 표면에 대한 적절한 부착 둘 모두를 나타내었다: BE(2)-M17, IMR-32, Kelly, LA1-55n, N1E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa 및 SK-N-BE(2)-C.
세포주가 표면에 부착할 수 있는 지의 여부를 결정하기 위하여, 시험할 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를 1 mL의 적합한 성장 배지(표 1)를 포함한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 세포가 원하는 밀도에 도달할 때까지 (대략 18 내지 24시간) 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 성장시켰다. 시딩된 세포의 전체 수에 대한 조직 플레이트의 바닥 웰 표면에 부착된 세포의 백분율에 의해서 세포 부착을 평가하였다. 세포주 CHP-126, IMR-32, LA-N-1, MC-IXC, NG115-401L, SK-N-BE(2)-C, SK-N-F1 및 SK-N-MC는 각 세포주가 50% 미만의 부착을 나타냈기 때문에 부적합한 것으로 간주되었다(표 2). 시험된 모든 다른 세포주는 적합한 세포 부착 특성을 나타내었다(표 2).
표 2. 1 nM BoNT /A를 사용한 후보 세포주의 단일-투여량 스크리닝
세포주 설명 공급처 1 nM BoNT /A
흡수 		부착
BE(2)-C 인간 신경아세포종(Human neuroblastoma) ATCC CRL-2268 No >60%
BE(2)-M17 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2267 Yes >60%
CHP-126 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 304 No <50%
CHP-212 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2273 No >60%
HCN-1a 뇌 피질 뉴런(Brain cortical neuron) ATCC CRL-10442 No >60%
HCN-2 뇌 피질 뉴런 ATCC CRL-10742 No >60%
IMR-32 인간 신경아세포종 ATCC CRL-127 Yes <50%
Kelly 인간 신경아세포종 ECACC 92110411 Yes >60%
Kelly 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 355 Yes >60%
LA1-55n 인간 신경아세포종 ECACC 06041203 Yes >60%
LA-N-1 인간 신경아세포종 ECACC 06041201 - <25%
MC-IXC 인간 신경상피종(Human neuroepithelioma) ATCC CRL-2270 - <25%
MHH-NB-11 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 157 No >60%
N1E-115 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-2263 Yes >60%
N4TG3 마우스 신경아세포종 DSMZ ACC 101 No >60%
N18TG2 마우스 신경아세포종 DSMZ ACC 103 No >60%
NB4 1A3 마우스 신경아세포종 ECACC 89121405 No >60%
ND3 마우스 신경아세포종/1차 신생아(primary neonatal) 래트 DRG 하이브리드 ECACC 92090901 No >60%
ND7/23 마우스 신경아세포종/1차 래트 DRG 하이브리드 ECACC 92090903 No >60%
ND8 마우스 신경아세포종/1차 신생아 래트 DRG 하이브리드 ATCC No >60%
ND8/34 마우스 신경아세포종 ECACC 92090904 No >60%
ND15 마우스 신경아세포종/1차 신생아래트 DRG 하이브리드 ECACC 92090907 No >60%
ND27 마우스 신경아세포종/1차 래트 DRG 하이브리드 ECACC 92090912 No >60%
NB69 인간 신경아세포종 ECACC 99072802 No >60%
NDC 마우스 신경아세포종/1차 신생아래트 DRG 하이브리드 ECACC 92090913 No >60%
Neuro-2a 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-131 Yes >60%
NG108-15 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드(rat glioma hybrid) ECACC 88112302 Yes >60%
NG115-401L 마우스 신경아세포종/ 래트 신경교종 하이브리드 ECACC 87032003 No <50%
NS20Y 마우스 신경아세포종 DSMZ ACC 94 No >60%
PC12 래트 크롬친화성세포종(Rat pheochromocytoma) ATCC CRL-1721 Yes >60%
SH-SY5Y 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2266 Yes >60%
SiMa 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 164 Yes >60%
SK-N-BE(2)-C 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2271 Yes <50%
SK-N-AS 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2137 No >60%
SK-N-DZ 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2149 No >60%
SK-N-F1 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2142 No <50%
SK-N-MC 인간 신경아세포종 ATCC HTB-10 - <25%
SK-N-SH 인간 신경아세포종 ECACC 86012802 No >60%
TE 189.T 척수 ATCC CRL-7947 No >60%
실시예 II
후보 세포주에서의 신경독 흡수에 대한 성장 조건의 평가
하기 실시예는 BoNT/A 중독에 대한 감수성을 최대화하거나 BoNT/A 흡수 능력을 갖는 계통확립 세포주에 대한 성장 조건을 결정하는 방법을 예시한다.
1. 후보 세포주의 신경독 흡수에 대한 세포 분화의 효과
세포 분화가 신경독 흡수를 개선하는 지를 결정하기 위하여, 1 nM BoNT/A의 흡수를 나타내는 세포주를 무혈청 배지로 옮겨 분화를 유도하였다. 시험할 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 얼스 염(Earle's salt)을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I를 갖는 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium), 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 100 유닛/mL 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 1 mL의 무혈청 배지를 포함한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 성장 정지 및 신경돌기(neurite) 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준(standard and routine morphological criteria)으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 2내지 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이들 세포를 인큐베이팅하였다. 대조구로서, 시험할 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 1 mL의 적합한 성장 배지(표1)를 포함한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 이러한 분화된 대조구 세포를, 세포가 원하는 밀도에 도달할 때까지(대략 18 내지 24시간), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 성장시켰다. 분화된 및 미분화된 대조구 배양물 둘 모두로부터의 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 0(비처리 배지), 0.1 nM, 0.3 nM, 또는 1 nM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 함유하는 신선한 배지로 대체하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포를 세척하고 수확하였다.
절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 수확된 샘플을 12 % 26-웰 기준 젤(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 래빗 다클론성 α-SNAP-25197 항체 혈청을 1차 항체(실시예 IV 참조)로 사용한 점을 제외하고는, 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 실시예 I에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 표 3은 0.1 nM BoNT/A로 처리시 SNAP-25 절단 생성물을 나타내는 세포주를 나타낸다. 시험된 세포주 중에, 미분화된 상태에서는 오직 SiMa 및 Neuro-2a 세포주가 0.1 nM BoNT/A의 흡수를 나타내었다. 그러나, SiMa 및 Neuro-2a 외에도, 분화된 상태에서는 세포주 N18, LA1-55n, PC12, 및 SH-SY5Y가 모두 0.1 nM BoNT/A의 흡수를 나타내었다.
표 3. 후보 세포주의 신경독 흡수에 대한 세포 분화의 효과.
세포주 설명 공급처 0.1 nM BoNT /A 흡수
미분화 분화
BE (2)- M17 인간 신경아세포종 ATCC CRL -2267 No No
Kelly 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 355 No No
LA1-55n 인간 신경아세포종 ECACC 06041203 No Yes
N1E-115 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-2263 No 시험되지 않음
N4TG3 마우스 신경아세포종 DSMZ ACC 101 No 시험되지 않음
N18 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드 ECACC 88112301 No Yes
Neuro-2a 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-131 Yes Yes
NG108-15 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드 ECACC 88112302 No 시험되지 않음
PC12 래트 크롬친화성세포종 ATCC CRL-1721 No Yes
SH-SY5Y 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2266 No Yes
SiMa 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 164 Yes Yes
SK-N-BE(2)-C 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2271 No 시험되지 않음
2. 미분화 후보 세포주의 신경독 흡수에 대한 강글리오사이드 처리의 효과 .
신경독의 저-친화도 결합을 개선하는 처리가 신경독 흡수를 개선할 수 있는지를 결정하기 위하여, 1 nM BoNT/A의 흡수를 나타내는 분화된 세포주를 강글리오사이드 GT1b로 처리하였다. 시험할 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 25 ㎍/mL GT1b (Alexis Biochemicals, San Diego, CA)가 있거나 없는, 상기에 기재된 바와 같은 무혈청 배지를 포함한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 상기한 바와 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지, 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, either 0 (비처리 샘플), 1.9 pM, 3.7 pM, 7.4 pM, 14.8 pM, 29.7 pM, 59.4 pM, 118.8 pM, 237.5 pM, 574 pM, 950 pM, 및 1900 pM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 함유하는 신선한 무혈청 배지로 대체하였다. 세포주를 2가지 상이한 시간, 24시간 및 48 시간으로 인큐베이팅하였다. 독소 인큐베이션 후에, 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포를 세척하고 수거하였다.
절단된SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 수확된 샘플을 12 % 26-웰 기준 젤(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 래빗 다클론성 α-SNAP-25197 항체 혈청을 1차 항체(실시예 IV 참조)로 사용한 점을 제외하고는, 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 실시예 I에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 표 4는 분화된 세포주가 BoNT/A를 흡수하는 능력에 대한 강글리오사이드 처리의 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 웨스턴 블럿에서 SNAP-25 절단 생성물의 검출가능한 밴드를 생성할 가장 낮은 농도의 BoNT/A를 나타낸다.
표 4. 후보 세포주의 신경독 흡수에 대한 강글리오사이드 처리의 효과.
세포주 설명 공급처 BoNT /A 흡수
24 시간 인큐베이션 48 시간 인큐베이션
BE (2)- M17 인간 신경아세포종 ATCC CRL -2267 237.5 pM 118.8 pM
Kelly 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 355 시험되지 않음 시험되지 않음
LA1-55n 인간 신경아세포종 ECACC 06041203 15 pM 7.4 pM
N1E-115 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-2263 시험되지 않음 시험되지 않음
N4TG3 마우스 신경아세포종 DSMZ ACC 101 시험되지 않음 시험되지 않음
N18 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드 ECACC 88112301 14.8 pM 7.4 pM
Neuro-2a 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-131 7.4 pM 7.4 pM
NG108-15 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드 ECACC 88112302 시험되지 않음 시험되지 않음
PC12 래트 크롬친화성세포종 ATCC CRL-1721 7.4 pM 7.4 pM
SH-SY5Y 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2266 시험되지 않음 시험되지 않음
SiMa 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 164 1.9 pM 1.9 pM
SK-N-BE(2)-C 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2271 시험되지 않음 시험되지 않음
3. 후보 세포주의 신경독 흡수를 향상시키는 세포 분화 특성을 갖는 무혈청 배지의 발현 .
세포 분화를 유도하는 처리 개선이 신경독 흡수를 개선할 수 있는지를 결정하기 위하여, SiMa, Neuro-2a 및 PC12 세포주를 다양한 무혈청 배지에서 성장시켜 분화를 유도하였다. 시험할 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 1 mL의 다양한 시험 무혈청 배지를 포함한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 시험된 파라미터는 1) BoNT/A 흡수에 대한 다양한 기본 배지의 효과 (MEM 및 RPMI 1649); 2) BoNT/A 흡수에 대한 신경영양 인자(neurotrophic factor)의 존재 또는 부재의 효과 (N2 보충물 및 B27 보충물); 3) BoNT/A 흡수에 대한 분화 인자의 존재 또는 부재의 효과 (레틴산 및 신경 성장 인자); 및 4) BoNT/A 흡수에 대한 혈청의 존재 또는 부재의 효과 (무혈청 배지 및 감소 혈청 배지)였다. 대조구로서, 시험할 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 1 mL의 대조구 무혈청 배지 (최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 100 유닛/mL 페니실린, 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)를 포함한 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 2일 내지 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 0 (비처리 샘플), 0.005 pM, 0.015 pM, 0.05 pM, 0.14 pM, 0.42 pM, 1.2 pM, 3.7 pM, 11 pM, 33 pM, 100 pM 및 300 pM의 BoNT/A 복합체 중 하나를 포함하는 신선한 무혈청 배지로 대체하였다. 또한, 분화된 세포를 24시간 동안 BoNT/A로 처리하였고, 그 후에 배지를 바꾸고 독소가 없는 신선한 배지에서 48시간 인큐베이팅하여 SNAP-25 절단 생성물의 축적을 가능하게 하였다. 그 다음, 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포를 세척하고 수확하였다.
표 5. 세포주 분화에 사용된 무혈청 배지.
세포주 시험 무혈청 배지 조성
LA1-55n 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™I를 갖는 최소 필수 배지, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES, 1x N2 보충물, 및 1 x B27 보충물
Neuro-2a 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES
PC12 RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX™I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 50 ng/mL 신경 성장 인자
SiMa 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES
SNAP-25 절단 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 수확된 샘플을 12 % 26-웰 기준 젤(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, α-SNAP-25 래빗 다클론성 항체 혈청을 사용한 점(실시예 IV 참조)을 제외하고는, 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 실시예 I에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 각각의 세포주에 대해 결정된 가장 최적화된 배지를 표 5에 나타낸다. 표 6은 세포주가 최적 무혈청 배지에서 성장될 때 검출되는 SNAP-25 절단 생성물의 최저량을 나타낸다. 최적화된 무혈청 배지의 사용은 LA1-55n, Neuro-2a, PC-12, 및 SiMa 세포주에서 허용가능한 신호-대-잡음 비의 BoNT/A 활성 신호의 검출을 가져온다(도 2). 예를 들어, 최적화된 분화 조건은 Neuro-2a 및 PC12 세포에 대해 대조구 무혈청 배지와 비교하여 SNAP-25 절단 생성물 검출에 있어서 5배 증가를 가져오며, SiMa에 대해서는 거의 50배이다. 또한, 하위 점근선에 대한 3:1 및 상위 점근선에 대한 10:1의 최소 신호-대-잡음 비가 유효성(validation)을 위해 적용가능한 견고한 검정(robust assay)을 개발하는 데 필요하다. 1.2 pM 투여량으로부터 검출된 신호를 0 pM BoNT/A의 백그라운드 신호와 비교했을 때, LA-1-55n를 제외하고는, 모든 최적화된 세포주가 적어도 3:1의 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비를 제공하였다(도 2). 또한, 300 pM 투여량으로부터 검출된 신호를 0 pM BoNT/A의 백그라운드 신호와 비교했을 때, 모든 최적화된 세포주가 적어도 100:1의 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비를 제공하였다(도 2). 검정이 pM 양의 BoNT/A의 존재를 검출하였기 때문에, 이러한 결과는 임의의 이러한 세포주가 본 명세서에 개시된 바와 같은 BoNT/A 활성을 검출하기 위한 면역-기반 방법을 개발하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
표 6. 후보 세포주의 신경독 흡수에 대한 최적화된 무혈청 배지의 효과.
세포주 설명 공급처 BoNT /A 흡수
대조구 무혈청 배지 최적화된 무혈청 배지
BE(2)-M17 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2267 시험되지 않음 시험되지 않음
Kelly 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 355 시험되지 않음 시험되지 않음
LA1-55n 인간 신경아세포종 ECACC 06041203 7.4 pM 3.7 pM
N1E-115 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-2263 시험되지 않음 시험되지 않음
N4TG3 마우스 신경아세포종 DSMZ ACC 101 시험되지 않음 시험되지 않음
N18 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드 ECACC 88112301 시험되지 않음 시험되지 않음
Neuro-2a 마우스 신경아세포종 ATCC CCL-131 3.7 pM 0.8 pM
NG108-15 마우스 신경아세포종/래트 신경교종 하이브리드 ECACC 88112302 시험되지 않음 시험되지 않음
PC12 래트 크롬친화성세포종 ATCC CRL-1721 2.0 pM 0.42 pM
SH-SY5Y 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2266 시험되지 않음 시험되지 않음
SiMa 인간 신경아세포종 DSMZ ACC 164 0.23 pM 0.005 pM
SK-N-BE(2)-C 인간 신경아세포종 ATCC CRL-2271 시험되지 않음 시험되지 않음
실시예 III
BoNT /A 절단 부위 분리가능한 결합의 P 1 잔기에서 유리 카르복실 -말단을 갖는 SNAP -25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α- SNAP -25 단클론성 항체의 발현
하기 실시예는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 제조하는 방법을 예시한다.
1. α- SNAP -25 단클론성 항체의 생성.
SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 단클론성 α-SNAP-25 항체를 발현하기 위하여, 13-잔기 펩티드 CDSNKTRIDEANQCOOH (SEQ ID NO: 38)를 SNAP-25 절단 생성물 항원으로서 디자인하였다. 이러한 펩티드는 유연성 링커 영역 및 KLH에 대한 컨쥬게이션을 위한 N-말단 시스테인 잔기 및 카르복실화된 C-말단 글루타민 (SEQ ID NO: 38)을 갖는 인간 SNAP-25의 아미노산 186-197 (SEQ ID NO: 5)을 포함하였다. 잘-선택된, 유일한(unique) 펩티드 서열에 대한 단클론성 항체의 생성은 에피토프 특이성에 대한 제어를 제공하여, 근접하게 관련된 아이소폼의 풀(pool) 중의 특정 서브집단의 단백질의 확인을 가능하게 한다. 블라스트 서치(Blast search)는 이러한 펩티드가 오직 SNAP-25에 대해 고도의 상동성(homology)을 가지며, 뉴런 세포의 다른 단백질과의 가능한 교차-재활성이 거의 없음을 밝혀내었다. 서열은 또한 소수성 지표(hydropathy index), 단백질 표면 확률(protein surface probability), 유연성의 영역(regions of flexibility), 및 선호하는 2차 구조, 그 후, 선택된 펩티드 서열의 적당한 배향 및 프리젠테이션을 결정하기 위한 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 주의깊게 검토하였다. 펩티드를 합성하고 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 컨쥬게이션하여 면역원성을 증가시켰다. 6마리의 Balb/c 마우스를 이 펩티드로 면역화하였고, 약 8주의 3회 면역화 후에, 마우스를 시험을 위해 채혈하였다. 혈액을 4 ℃에서 60분 동안 인큐베이팅하여 응고되게 하였다. 응고된 혈액을 4 ℃에서 10분 동안 10,000x g에서 원심분리하여 세포 부스러기를 펠렛화하였다. 생성된 혈청 샘플을 50 ㎕ 분취물로 분배하였고 필요시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
본 명세서에 개시된 다른 SNAP-25 항원에 기초한 유사한 계획을 사용하여 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 발현하였다. 예를 들어, SEQ ID NO: 45의 SNAP-25 항원을 SEQ ID NO: 38의 SNAP-25 항원을 대신하여 KLH에 컨쥬게이트 할 수 있다. 다른 예로서, SEQ ID NO: 38의 SNAP-25 항원으로부터의 인간 SNAP-25의 아미노산 186-197을 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, 또는 SEQ ID NO: 44로 대체할 수 있다.
2. α- SNAP -25 단클론성 항체의 존재에 대한 스크리닝.
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 단클론성 항체의 존재를 결정하기 위하여, 추출된 마우스 혈청을 사용하여 비교 ELISA 및 세포-기반 절단 검정을 실시하였다. 비교 ELISA를 위하여, 2가지 융합 단백질을 구성하였다: SEQ ID NO: 48의 BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 및 SEQ ID NO: 49의 BirA-HisTag®-SNAP-25134-206. BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 134-197을 포함하는 SNAP-25 펩티드에 아미노 말단으로 연결된 SEQ ID NO: 50의 자연적으로-비오티닐화된 16 아미노산 BirA 펩티드를 포함하였다. BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 134-206을 포함하는 SNAP-25 펩티드에 아미노말단으로 연결된 SEQ ID NO: 50의 자연적으로-비오티닐화된 16 아미노산 BirA 펩티드를 포함하였다. 이러한 2가지 기질을 1 x PBS 중에 10 ㎍/mL BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 및 BirA-HisTag®-SNAP-25134-206의 농도로 현탁하였다. 대략100 ㎕의 적합한 기질 용액을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간동안 인큐베이팅하여, BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 및 BirA-HisTag®-SNAP-25134- 206 를 별도의 플레이트에 코팅하였다. 6마리의 면역화된 마우스(마우스 1, 마우스 2, 마우스 3, 마우스 4, 마우스 5, 및 마우스 6) 중 하나로부터 유래한 항체-함유 혈청의 1:10 내지 1:100 희석액을 포함하는 1 x TBS 중의 0.5% BSA 중에서, 세척된 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 1차 항체 프로빙된 플레이트를 200 ㎕ TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중에서 매회 5분간 4회 세척하였다. 제2 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이팅된 염소 다클론성 항-마우스 IgG 항체의 1:10,000 희석액을 포함하는 1 x TBS (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) 중에서, 세척된 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 표지된 SNAP-25 생성물의 발색 검출(Chromogenic detection)은 ImmunoPure TMB 기질 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 사용한 발색 검출에 의해 가시화되었다. BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 코팅된 플레이트에서는 황색의 발현이 α-SNAP-25 항체가 SNAP-25197 절단 생성물을 우선적으로 인식하였음을 나타내었으나, BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 코팅된 플레이트는 그러하지 않았다. 면역화에 사용된 6마리의 마우스에서 나타난 결과 중, 3마리 마우스 (마우스 2, 마우스 3, 및 마우스 4)가 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 대해 더 높은 역가 및 더 큰 특이성을 가졌다.
이러한 결과를 ELISA 경쇄 활성 검정을 사용하여 확인하였다. 대략 100 ㎕의 하기 기질 용액을 첨가하여 96-웰 Reacti-Bind 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 준비하였다: 열A 내지 C는 12개의 상이한 농도의 100 ㎕의 BirA-HisTag®-SNAP-25134-197로 코팅하였다; 열 D 내지 H는 100 ㎕의 BirA-HisTag®-SNAP-25134-206로 10 ㎍/mL로 코팅하였다. 기질 용액을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서 플레이트를 세척하였다. BoNT/A의 희석액을 BoNT/A 인큐베이션 완충제 (50 mM HEPES, pH 7.4, 1% 소태아 혈청, 10 uM ZnCl2, 10 mM 다이티오트리에톨) 중에서 37 ℃에서 20분 동안 예비-환원하였고, 100 ㎕의 예비-환원된 BoNT/A를 기질-코팅된 플레이트에 첨가하였고 37 ℃에서 90분 동안 인큐베이팅하였다. BoNT/A 인큐베이션 완충제를 흡입하고 각각의 플레이트를 200 ㎕ TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서 BoNT/A 처리된 플레이트를 세척하였다. 시험할 항체-함유 혈청의 1:10 내지 1:100 희석액을 포함하는 1 x TBS 중의 0.5% BSA 중에서, 세척된 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 1차 항체 브로빙된 플레이트를 200 ㎕ TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)에서 매회 5분간 4회 세척하였다. 제2 항체로서, 서양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이팅된 염소 다클론성 항-마우스 IgG 항체의 1:10,000 희석액을 포함하는 1 x TBS(Pierce Biotechnology, Rockford, IL) 중에서, 세척된 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 2차 항체-프로빙된 플레이트를 200 ㎕ TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)에서 4회 세척하였다. 표지된 SNAP-25 생성물의 발색 검출을 ImmunoPure TMB 기질 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 사용한 발색 검출에 의해서 가시화하였다. SNAP-25197 절단 생성물의 존재와 상호관련된, 황색의 발현이, 모든 6마리 면역화 마우스(마우스 1, 마우스 2, 마우스 3, 마우스 4, 마우스 5, 및 마우스 6)로부터 유래된 항체-함유 혈청을 사용한, BoNT/A 처리된 샘플에서는 검출되었고, 비처리 대조구에서는 검출되지 않았다. 따라서, 비교 ELISA 분석은 면역화에 사용된 마우스 중, 3마리의 마우스 (마우스 2, 마우스 3, 및 마우스 4)가 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 대해 더 높은 역가 및 더 큰 특이성을 가졌음을 나타내었다.
세포-기준 절단 검정을 위하여, 적합한 밀도의 PC12 세포를 3 mL의 적합한 혈청 배지(표 1)를 포함한 60 mm2 조직 배양 플레이트 내에 플레이팅하였다. 세포가 적합한 밀도에 도달할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 성장시켰다. 실온에서 5분간 인큐베이팅된 15 ㎕의 LipofectAmine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)을 포함하는 250 ㎕의 OPTI-MEM 감소 혈청 배지를, 10 ㎍의 pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체(expression construct) (SEQ ID NO: 51)를 포함하는 250 ㎕의 OPTI-MEM 감소 혈청 배지에 첨가하여 500 ㎕ 트랜스펙션 용액을 제조하였다. pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체는, 프로모터 요소가 SEQ ID NO: 52의 GFP-BoNT/A 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결된 pQBI-25 발현 벡터 (Qbiogene Inc., Carlsbad, CA)를 포함한다. 이러한 트랜스펙션 혼합물을 실온에서 대략 20분 동안 인큐베이팅하였다. 배지를 신선한 보충되지 않은 배지로 대체하였고, 500 ㎕ 트랜스펙션 용액을 세포에 첨가하였다. 그 후, 세포를 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 대략 6 내지 18시간 동안 인큐베이팅하였다. 실시예 II에 기재된 바와 같이 세포를 세척하고 수확하였다. 절단된 SNAP-25197 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 사용된 1차 항체는 항체-함유 혈청의 1:1,000 희석액이었고, 사용된 2차 항체는 마우스 α-IgG 서양고추냉이 퍼옥시다제의 1:20,000(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)이었던 점을 제외하고는, 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 실시예 II에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. SNAP-25197 절단 생성물에 상응하는 단일 밴드가 3마리의 마우스(마우스 2, 마우스 3, 및 마우스 4)로부터 유래된 항체-함유 혈청을 사용한 BoNT/A 처리된 샘플에서 검출되었고, 처리되지 않은 대조구에서는 그렇지 않았다. 따라서, 세포-기반 절단 검정은 면역화를 위해 사용된 마우스 중 3마리 마우스 (마우스 2, 마우스 3, 및 마우스 4)가 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 대해 더 높은 역가 및 더 큰 특이성을 나타내었다.
3. 하이브리도마의 생성
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 생성하는 하이브리도마를 제조하기 위하여, 최종 "부스터(booster)" 면역화 3일 후에 마우스 2로부터 비장을 수확하였고 표준 하이브리도마 프로토콜을 사용하여 비장 세포를 골수종 세포 P3-X63 Ag8.653와 융합하였다. 이러한 세포를 5개의 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 HAT 배지를 사용하여 하이브리드를 선별하였다. 융합 후 8 내지 14일 내에, 2개의 개별 플레이트에 코팅된 BirA-HisTag®-SNAP-25134-197 및 BirA-HisTag®-SNAP-25134-206 펩티드를 갖는 비교 ELISA를 사용하여, 대략 480개의 모 클론(parent clone)의 제1 클로닝을 행하였다. 비교 ELISA는 절단된 SNAP-25197에 대해 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인하기 위한 신속 스크린 방법을 제공한다. 상기에 기재된 세포-기반 절단 검정 및 LC/A 트랜스펙팅된 세포의 면역염색(immunostaining)을 사용하여 상위 18 클론을 추가로 스크리닝하였다.(표 7).
표 7. α- SNAP -25 단클론성 항체를 포함하는 상청액의 분석
클론 비교 ELISA 세포-기반 검정
OD SNAP -25 197 OD SNAP -25 206 Ratio 197 /206 Ratio 206 /197 SNAP -25 197 SNAP -25 206
1 D3 1.805 0.225 8.02 0.13 +++ -
1F12 0.365 0.093 3.92 0.25 - -
1G10 0.590 0.137 4.31 0.23 ++ -
1H1 0.335 0.121 2.77 0.36 - -
1H8 0.310 0.302 1.03 0.97 + -
2C9 0.139 0.274 0.51 1.97 - -
2E2 0.892 0.036 24.78 0.04 ++ -
2E4 0.228 0.069 3.30 0.30 + -
2F11 1.095 1.781 0.61 1.63 - -
3C1 1.268 0.053 23.92 0.04 ++ -
3C3 0.809 0.052 15.56 0.06 ++ -
3E1 0.086 0.155 0.55 1.80 0 -
3E8 2.048 0.053 38.64 0.03 +++ -
3G2 0.053 0.158 0.34 2.98 - -
4D1 0.106 0.218 0.49 2.06 - -
4G6 0.061 0.159 0.38 2.61 - -
5A5 0.251 0.106 2.37 0.42 + -
5F11 0.243 0.061 3.98 0.25 - -
제한 희석(limiting dilution)에 의해서 클론 1D3, 1G10, 2E2, 3C1, 3C3, 및 3E8을 추가로 클로닝하였고, 이는 이러한 클론에 의해 생성된 컨디셔닝된 배지가, SNAP-25197 절단 생성물 대 SNAP-25206 절단된 기질에 대한 비197 /206가 적어도 4:1인 우선적 결합 특이성을 갖는 α-SNAP-25 항체를 포함하였기 때문이고, 세포-기반 절단 검정 및 GFP-LC/A로 트랜스펙팅된 PC12 세포의 면역염색을 사용하여 SNAP-25197-절단 생성물을 검출하였다. 유사하게, 클론 2C9, 2F11, 3G2, 4D1 및 4G6을 제한 희석에 의해 추가로 클로닝하였고, 이는 이러한 클론에 의해 생성된 컨디셔닝된 배지가 SNAP-25206 uncleaved 기질 대 SNAP-25197 절단 생성물에 대한 비 206/197가 적어도 1.5:1인 우선적 결합 특이성을 갖는 α-SNAP-25 항체를 포함하였기 때문이고 세포-기반 절단 검정을 사용하여 SNAP-25206-비절단 기질을 검출하였다. 이러한 단일-세포 유래 클론을 비교 ELISA, 세포-기반 절단, 및 면역염색을 사용하여 다시 스크리닝하여 친화도 및 특이성을 확인하였고, 표준 절차를 사용하여 항체를 아이소타이핑하였다. 클론 1D3B8 (IgM.k), 1G10A12 (IgG3.k), 2C9B10 (IgG3.k), 2E2A6 (IgG3.k), 2F11B6 (IgM.k), 3C1A5 (IgG2a.k), 및 3C3E2 (IgG2a.k)으로부터 복수(Ascites)를 생성하였다. 클론 3E8은 클로닝 프로세스 동안의 항체 생성을 중단시켰고 더 이상 평가할 수 없었다.
4. α- SNAP -25 단클론성 항체의 결합 특이성의 평가.
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 단클론성 항체의 결합 특이성을 평가하기 위하여, 세포-기반 활성 검정, 면역세포화학 및 면역침전을 사용하여 SNAP-25 절단 생성물을 검출하는 데, 클론 1D3B8, 1G10A12, 2C9B10, 2E2A6, 2F11B6, 3C1A5, 및 3C3E2로부터의 복수를 사용하였다. 세포-기반 활성 검정을 위하여, α-SNAP-25 항체-함유 복수가 절단되지 않은 SNAP-25206 기질 및 절단된 SNAP-25197 생성물을 검출하는 능력을 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하여 결합 특이성을 결정하였다. 적합한 밀도의 PC12 세포를 3 mL의 적합한 혈청 배지를 포함한 60 mm2 조직 배양 플레이트 내에 플레이팅하였고, 적합한 세포 밀도에 도달할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 성장시켰고, 상기한 바와 같이 pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체가 결여된 트랜스펙션 용액 (트랜스펙팅되지 않은 세포) 또는 pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체를 포함하는 트랜스펙션 용액 (트랜스펙팅된 세포)중 어느 하나로 트랜스펙팅하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포를 세척하고 수확하였다. 절단되지 않은 SNAP-25206 기질 및 절단된 SNAP-25197 생성물 둘 모두의 존재에 대해 검출하기 위하여, 사용된 1차 항체가 α-SNAP-25 단클론성 항체-함유 복수의 1:100 희석물이었고 2차 항체가 서양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이팅된 α-마우스 IgG의 1:20,000(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)이었던 점을 제외하고는, 각각의 수확된 샘플의 분취물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 또한, 3가지 구매가능한 마우스 α-SNAP-25 단클론성 항체를 시험하였다. 절단되지 않은SNAP-25206 기질 및 절단된 SNAP-25197 생성물 둘 모두를 검출한다고 제조사가 표시한 α-SNAP-25 항체인, SMI-81 (Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD)를 제조사의 추천에 따라 15,000 희석물로 사용하였다. 절단되지 않은 SNAP-25206 기질 및 절단된 SNAP-25197 생성물 둘 모두를 검출한다고 제조사가 표시한 α-SNAP-25 항체인, MC-6050 (Research & Diagnostic Antibodies, Las Vegas, NV)를 제조사의 추천에 따라 1:100 희석물로 사용하였다. 오직 절단된 SNAP-25197 생성물만을 검출한다고 제조사가 표시한 α-SNAP-25 항체인, MC-6053 (Research & Diagnostic Antibodies, Las Vegas, NV)을 제조사의 추천에 따라 1:100 희석물로 사용하였다.
표 8은 오직 SNAP-25197 절단 생성물만을 검출하는 α-SNAP-25 항체-함유 복수를 나타낸다. 세포-기반 절단 검정은 클론 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5, 및 3C3E2로부터 생성된 복수가, SNAP-25206 비절단 기질에 대한 이러한 절단 생성물의 선택적인 인식을 가능하게 하는 SNAP-25197 절단 생성물에 대한 높은 결합 특이성을 갖는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 합성함을 나타낸다. 시판 항체 SMI-81는SNAP-25206 비절단 기질은 검출하였으나, 단지 불량하게 SNAP-25197 절단 생성물을 인식하였다 (표 8). 놀랍게도, 시판 항체 MC-6050는 오직 SNAP-25206 비절단 기질을 검출하였고, SNAP-25197 절단 생성물은 인식하는 데 실패하였다 (표 8). 훨씬 더욱 놀랍게도, 시판 항체 MC-6050는 오직 SNAP-25206 비절단 기질을 검출하였고, 제조사는 이 항체가 SNAP-25197 절단 생성물을 선택적으로 검출한다고 광고하지만, SNAP-25197 절단 생성물을 인식하는 데는 실패하였다 (표 8). 따라서, 이러한 분석은 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5, 및 3C3E는 SNAP-25197 절단 생성물에 대한 적합한 선택성을 나타내지만, 1G10A12 및2F11B6는 그렇지 않음을 나타낸다. 또한, SNAP-25197 절단 생성물을 선택적으로 검출하는 데 모두 실패하였기 때문에, 시판 항체 SMI-81, MC-6050 및 MC-6053는 모두 본 발명에 개시된 면역-기반 방법에 부적합하다.
면역세포화학 분석의 경우, 면역염색에 의해 α-SNAP-25 항체-함유 복수가 비절단 SNAP-25206 기질 및 절단 SNAP-25197 생성물을검출하는 능력을 분석하여 결합 특이성을 결정하였다. 예를 들어, 문헌 [Ester Fernandez-Salas et al., Plasma Membrane Localization Signals in the Light Chain of Botulinum Neurotoxin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 101(9): 3208-3213 (2004)] 참조. 적합한 밀도의 PC12 세포를 플레이팅하고, 성장시키고, 상기한 바와 같이 pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체가 결여된 트랜스펙션 용액(트랜스펙팅되지 않은 세포) 또는 pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체를 포함하는 트랜스펙션 용액(트랜스펙팅된 세포) 중 어느 하나로 트랜스펙팅하였다. 세포를 1 x PBS 중에서 세척하고, 5 mL의 PAF 중에서 실온에서 30분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 포스페이트 완충된 염수 중에서 세척하고, 1 x PBS 중의 5 mL의 0.5% Triton® X-100 (폴리에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르) 중에서 인큐베이팅하고, 1 x PBS 중에서 세척하고, -20 ℃에서 6분 동안 5 mL의 메탄올 중에서 투과성으로 만들었다(permeabilized). 투과성으로 된 세포를 5 mL의 100 mM 글리신 중에서 실온에서 30분 동안 블로킹하고, 1 x PBS 중에서 세척하고, 5 mL의 0.5% BSA in 1 x PBS 중에서 실온에서 30분 동안 블로킹하였다. 블로킹된 세포를 1 x PBS 중에 세척하고, 시험되는 클론성 하이브리도마 세포주로부터의 복수의 1:10 희석액을 포함하는 1 x PBS 중의 0.5% BSA 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 1차 항체 프로빙된 세포를 1 x PBS 중에서 매회 5분간 3회 세척하였다. 세척된 세포를 제2 항체로서 ALEXA® FLUOR 568 Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)에 컨쥬게이팅된 염소 다클론성 항-마우스 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄 (IgG, H+L) 항체의 1:200 희석액을 포함하는 1 x PBS 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 제2 항체 프로빙된 세포를 1 x PBS 중에서 매회 5분간 3회 세척하였다. 세척된 세포를 VECTASHIELD® 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 마운팅하여 현미경 검사를 위해 준비하고 커버슬립을 덮었다. 적절한 레이저 세팅을 사용하여 Leica 공초점 현미경으로 신호 검출의 이미지를 얻었다. 표 8은 SNAP-25197-절단 생성물을 특이적으로 검출하는 α-SNAP-25 항체-함유 복수를 나타낸다. 면역세포화학 분석은 클론 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5, 및 3C3E2으로부터 생성된 복수가 SNAP-25197 절단 생성물에 대해 고도의 결합 특이성(이는 SNAP-25206 비절단 기질과 비교하여 이러한 절단 생성물의 우선적인 인식을 가능하게 함)을 갖는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 합성함을 나타낸다.
면역침전 분석의 경우, 단백질 A (HiTrap™ 단백질 A HP 컬럼, GE Healthcare, Amersham, Piscataway, NJ), 정제된 α-SNAP-25 단클론성 항체가 비절단 SNAP-25206 기질 및 절단 SNAP-25197 생성물을 침전시키는 능력을 분석하여 결합 특이성을 결정하였다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 8 Storing and Purifying Antibodies, pp. 309-311, Harlow & Lane, supra, 1998a] 참조. 적합한 밀도의 PC12 세포를 플레이팅하고, 성장 시키고, 상기한 바와 같이 pQBI-25/GFP 발현 구조체를 포함하는 트랜스펙션 용액(대조구 세포; SEQ ID NO: 53) 또는 pQBI-25/GFP-BoNT/A-LC 발현 구조체를 포함하는 트랜스펙션 용액(실험 세포) 중 어느 하나로 트랜스펙팅하였다. pQBI-25/GFP 발현 구조체는 프로모터 요소가 SEQ ID NO: 54의 GFP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 기능적으로 연결되어 있는 발현 벡터를 포함한다. 하룻밤 인큐베이션 후에, 성장 배지를 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS로 헹구어서 세포를 세척하였다. 세포를 수확하기 위하여, PBS를 흡입하였고, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGDT, 10%글리세롤, 1% Triton® X-100 (폴리에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르) 및 1 x COMPLETE™ 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche Applied Biosciences, Indianapolis, IN)을 포함하는 면역침전 용해 완충제를 첨가하여 세포를 용해시키고 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 용해된 세포를 3,000 x g로 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고 상청액을 깨끗한 튜브로 옮기고 대략 1 mg/mL의 단백질 농도로 희석하였다. 대략 5 ㎍의 정제된 단클론성 항체를 0.5 mL의 희석된 상청액에 첨가하고 4 ℃에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 1차 항체 인큐베이션 후, 대략 50 ㎕의 고정된 단백질 G (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 희석된 상청액에 첨가하고 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 0.5 mL의 면역침전 용해 완충제를 첨가하여, 인큐베이팅된 상청액을 매회 30분간 3회 세척하고, 300 x g 로 4 ℃에서 1분 동안 원심분리하여 고정된 단백질 G를 펠렛화하고, 상청액을 따라내었다. 세척 후에, 펠렛을 30 ㎕의 1 x SDS 로딩 완충액에 재현탁하고 샘플을 95 ℃까지 5분간 가열하였다. 비절단SNAP-25206 기질 및 절단 SNAP-25197 생성물 둘 모두의 존재를 검출하기 위하여, 사용된 1차 항체가 α-SNAP-25 다클론성 항체 혈청의 1:1,000 희석액이었고(실시예 IV 참고), 사용된 2차 항체가 래빗 α-IgG 서양고추냉이 퍼옥시다제(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)의 1:20,000 희석물이었던 점을 제외하고는, 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 실시예1에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 표 8은 면역침전 분석에 의해 SNAP-25197-절단 생성물을 특이적으로 침전시키는 α-SNAP-25 항체-함유 복수를 나타낸다. 면역침전 분석은 클론 2E2A6 및 3C1A5으로부터 생성된 복수가 SNAP-25197 절단 생성물에 대한 고도의 결합 특이성(이는 SNAP-25206 비절단 기질과 비교하여 이러한 절단 생성물의 우선적 인식을 가능하게 함)을 갖는 α-SNAP-25 단클론성 항체를 합성함을 나타낸다.
표8. α- SNAP -25 단클론성 항체를 함유하는 클론 복수의 분석
클론 세포-기반 검정 면역세포화학 면역침전
SNAP -25 197 SNAP -25 206 SNAP -25 197 SNAP -25 206 SNAP -25 197 SNAP -25 206
1 D3B8 ++ - ++ - 시험되지 않음 시험되지 않음
1G10A12 ++ ++ 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음
2C9B10 ++ - ++ - 시험되지 않음 시험되지 않음
2E2A6 ++ - ++ - ++ -
2F11B6 + + + + 시험되지 않음 시험되지 않음
3C1A5 ++ - ++ - ++ -
3C3E2 + - 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음
MC-6050 - + 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음
MC-6053 - + 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음
SMI-81 -/+ ++ 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음 시험되지 않음
5. α- SNAP -25 단클론성 항체의 결합 친화도의 평가.
[01]
SNAP-25197 절단 생성물 또는 SNAP-25206 비절단 기질 중 어느 하나에 대한 고도의 결합 특이성을 나타내는 α-SNAP-25 단클론성 항체의 결합 친화도를 결정하기 위하여, 카르복시메틸 덱스트란(CM5) 센서 칩을 사용하는 BIAcore 3000 기기(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)에서 검정을 실시하였다. 25 ℃에서 10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.005% (v/v) 계면활성제 P20를 포함하는 HBS-EP 완충제를 사용하여 10 ㎕/분의 유속으로 작동시켰다. SEQ ID NO: 5의 아미노산 134-197을 포함하는 SNAP-25 펩티드 (SNAP-25134-197) 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 134-206을 포함하는 SNAP-25 펩티드 (SNAP-25134-206)를, 표준 아민 커플링을 사용하여 CM5 센서 칩의 표면에 공유적으로 부착시켰다. 간단히, 0.2 M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보다이이미드 및 0.05 M N-하이드록시석시미드의 혼합물의 7분 주사에 의해서 CM5 칩을 활성화시켰고; 이어서, SNAP-25 펩티드를 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.0) 중에 20분 동안 10 ㎕/분의 유속으로 주사하였고; 미반응 석시미드 에스테르를 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드, pH 8.5의 7분 주사에 의해서 블로킹하였다. 칩 상에 고정된 SNAP-25134-197 또는 SNAP-25134-206의 양은 반응 유닛(약0.10-0.15 ng/mm2)의 100-150 증가에 반영되었다. 클론 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5, 및 3C3E2으로부터 생성된 복수 또는 정제된 단클론성 항체, 뿐만 아니라, 구매가능한 α-SNAP-25 항체를 포함하는 항체 샘플을 10분의 결합 시간 및 20분의 해리 시간이 가능하게 CM5 칩의 표면 위에 통과시켰다. 각각 진행할 때마다 15 ㎕/분의 유속에서 10 mM 글리신 -HCl (pH 2.5)의 1분 주사에 의해서 표면을 재생하였다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 사용하여 센서그램(Sensorgram) 곡선을 1:1 역학 결합 모델에 피팅하였다.
결과는 2E2A6 및 3C1A5 둘 모두가 SNAP-25 비절단 기질보다 절단 SNAP-25197 생성물에 대해 고도로 특이적임을 나타낸다(표 9). MC-6050 및 MC-6053의 결합 친화도와 비교할 때, 이러한 시판 항체에 비하여 1D3B6는 SNAP-25 절단 생성물에 대해 대략 10배 더 큰 평형 해리 상수를 갖는다(표 9). 흥미롭게도, 이러한 시판 항체에 비하여 2E2A6는 SNAP-25 절단 생성물에 대해 단지 약간 더 낮은 평형 해리 상수를 갖는다 (0.405 nM 대 0.497 및 0.508)(표 9). 이러한 시판 α-SNAP-25 항체는 어느 것도 SNAP-25 절단 생성물을 인식하지 못하였기 때문에(표 8), 약 0.5 nM보다 낮은 평형 해리 상수는 그러한 선택성을 달성하는 데, 일부분, 중요한 것으로 보인다. 유사하게, MC-6050 및 MC-6053결합 친화도와 비교할 때, 2E2A6는 적어도 약 1배 더 느린 오프 레이트/해리 상수(6.74 x 10-5 대 8.82 x 10-4 s-1 및 1.18 x 10-3 s-1)를 가졌다(표 9). 이는 약 8.82 x 10-4보다 낮은 오프 레이트/해리 상수가 SNAP-25 절단 생성물에 대한 선택적인 결합을 달성하는 데, 일부분, 중요한 것을 보여짐을 또한 시사한다. 이러한 결과는 오프 레이트/해리 상수가 5.78 x 10-5 s-1인 1D3B8와 일관된다(표 9).
표 9. α- SNAP -25 단클론성 항체의 결합 친화도의 분석
SPR 파라미터 1 D3B8 2 E2A6 *
SNAP -25 197 SNAP -25 206 a SNAP -25 197 SNAP -25 206 b
Ka (M -1 s -1 ) 1.06 x 10 6 1.70 x 10 6
(1.66 x 10 5 )
(-)
Kd ( s-1) 5.78 x 10-5 1.53 x 10-4
(6.74 x 10-5)
(-)
KD (nM) 0.050 0.090
(0.405)
(-)
SPR 파라미터 3 C1A5 2 C9B10
SNAP -25 197 SNAP -25 206 c SNAP -25 197 SNAP -25 206 d
Ka (M -1 s -1 ) 2.17 x 10 5 1.15 x 10 4
Kd ( s-1) 2.88 x 10-4 3.11 x 10-4
KD (nM) 1.33 27.1
SPR 파라미터 MC -6050 MC -6053
SNAP -25 197 SNAP -25 206 SNAP -25 197 SNAP -25 206
Ka (M -1 s -1 ) 1.78 x 10 6 3.06 x 10 2 2.32 x 10 6 1.06 x 10 2
Kd ( s-1) 8.82 x 10-4 6.07 x 10-3 1.18 x 10-3 2.56 x 10-5
KD (nM) 0.497 19,800 0.508 240
* 2개의 상이한 칩을 사용하여 이 항체에 대해 2회의 독립적인 진행을 행하였다.
a 10분 결합 시간 후에 최대 125 nM의 α-SNAP-25 단클론성 항체 1D3B8가 CM5 센서 칩의 표면 위로 통과할 때 결합이 관찰되지 않았다.
b 10분 결합 시간 후에 최대 10uM의 α-SNAP-25 단클론성 항체 2E2A6가 CM5 센서 칩의 표면 위로 통과할 때 결합이 관찰되지 않았다.
c 10분 결합 시간 후에 최대 100 nM의 α-SNAP-25 단클론성 항체 3C1A5가 CM5 센서 칩의 표면 위로 통과할 때 결합이 관찰되지 않았다.
d 10분 결합 시간 후에 최대 100 nM의 α-SNAP-25 단클론성 항체 2C9B10가 CM5 센서 칩의 표면 위로 통과할 때 결합이 관찰되지 않았다.
6. 단리된 α- SNAP -25 단클론성 항체로부터의 에피토프의 서열화( Sequencing ).
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단리된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 에피토프를 결정하기 위하여, 하이브리도마 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5 및 3C3E2에 의해 생성된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 서열화하였다. mRNA를 추출하고 표준 프로토콜을 사용하여 각각의 하이브리도마로부터 정제하고 올리고dT 안티-센스(anti-sense) 프라이머 또는 유전자-특이적 (쥐과 IgG1 CH 및 kappa CL) 안티-센스 프라이머 중 어느 하나를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. cDNA 생성 후에 특이적인 쥐과 및 인간 불변 도메인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 cDNA를 증폭시켜 항체의 아이소타입을 결정하였다. 축퇴성(Degenerate) VH 및 VL 프라이머를 사용하여 cDNA로부터의 가변 도메인을 증폭시켰다. 5'RACE에 대해, 단일중합체성 dCTP 꼬리를 cDNA의 3' 말단에 추가하였다. 그 다음, 올리고dG 센스 프라이머 및 유전자 특이적 (CH/KC) 안티-센스 프라이머를 사용하여 중쇄 및 경쇄를 증폭하였다. PCR 생성물은 안티-센스 프라이머까지 신호 펩티드, 가변 도메인 및 불변 도메인의 서열을 포함하였다. PCR 생성물을 젤 여과하여 작은 단편을 제거하고, 서열화를 위해 블런트(blunt) 또는 TA 벡터 내로 클로닝하였다. 각각의 사슬에 대해 5개의 독립적인 클론을 서열화하였고 VH 및 VL사슬의 배열 및 콘센서스(consensus) 서열을 결정하였다(표 10). VH 및 VL 아미노산 서열을 결정하는 데 사용되는 방법이, 예를 들어, 문헌 [Roger A. Sabbadini, et al., Novel Bioactive Lipid Derivatives and Methods of Making and Using Same, U.S. Patent Publication 2007/0281320; and Peter Amersdorfer, et al., Molecular Characterization of Murine Humoral Immune Response to Botulinum Neurotoxin Type A Binding Domain as Assessed by Using Phage Antibody Libraries, 65(9) Infect. Immun. 3743-3752]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 또한, 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 (VL) 경쇄를 서열화하고 CDR 영역을 확인하는 상업적 서비스 (예를 들어, Fusion Antibodies Ltd., Northern Ireland)가 이용가능하다.
본 명세서에 개시된 하이브리도마에 의해 생성된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 VH 및 VL 사슬을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다: 1D3B8 VH (SEQ ID NO: 71), 2C9B10 VH (SEQ ID NO: 73), 2E2A6 VH (SEQ ID NO: 75), 3C1A5 VH variant 1 (SEQ ID NO: 77), 3C1A5 VH variant 2 (SEQ ID NO: 79), 3C3E2 VH (SEQ ID NO: 81); 1D3B8 VL (SEQ ID NO: 83), 2C9B10 VL (SEQ ID NO: 85), 2E2A6 VL (SEQ ID NO: 87), 3C1A5 VL (SEQ ID NO: 89), 및 3C3E2 VL (SEQ ID NO: 91). 본 명세서에 개시된 하이브리도마에 의해 생성된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 VH 및 VL 사슬을 포함하는 아미노산 서열은 다음과 같다: 1D3B8 VH (SEQ ID NO: 72), 2C9B10 VH (SEQ ID NO: 74), 2E2A6 VH (SEQ ID NO: 76), 3C1A5 VH variant 1 (SEQ ID NO: 78), 3C1A5 VH variant 2 (SEQ ID NO: 80), 3C3E2 VH (SEQ ID NO: 82); 1D3B8 VL (SEQ ID NO: 84), 2C9B10 VL (SEQ ID NO: 86), 2E2A6 VL (SEQ ID NO: 88), 3C1A5 VL (SEQ ID NO: 90), 및 3C3E2 VL (SEQ ID NO: 92). 하이브리도마 1D3B8, 2C9B10, 2E2A6, 3C1A5, 및 3C3E2에 의해 생성된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 VH 및 VL CDR 도메인을 포함하는 아미노산 서열이 표 10에 제공된다.
표10. α- SNAP -25 단클론성 항체로부터의 V H 및 V L 도메인의 CDR 서열
CDR 서열 다음으로 확인됨 SEQ ID NO :
VH CDR 1 TFTDHSIH 2E2A6
2C9B10
3C1A5 variant 2		 93
VH CDR 1 TFTNYVIH 3C1A5 variant 1
3C3E2		 94
VH CDR 1 IFTDHALH 1D3B8 95
VH CDR 2 YIFPGNGNIEYNDKFKG 2E2A6 96
VH CDR 2 YLFPGNGNFEYNEKFKG 2C9B10
3C1A5 variant 2		 97
VH CDR 2 YINPYNDGSKYNEKFKG 3C1A5 variant 1
3C3E2		 98
VH CDR 2 YIFPGNGNIEYNEKFKG 1D3B8 99
VH CDR 3 KRMGY 2E2A6
3C1A5 variant 2		 100
VH CDR 3 KKMDY 2C9B10
1D3B8		 101
VH CDR 3 ARHLANTYYYFDY 3C1A5 variant 1
3C3E2		 102
VL CDR 1 RSSQSIVHSNGNTYLE 1D3B8 103
VL CDR 1 RTTENIYSYFV 2C9B10 104
VL CDR 1 RASKSVSTSGYSYMH 2E2A6 105
VL CDR 1 KASQDIKSYLS 3C1A5 106
VL CDR 1 RASQNIGNYLH 3C3E2 107
VL CDR 2 KVSNRFS 1D3B8 108
VL CDR 2 NAKSLAE 2C9B10 109
VL CDR 2 LVSNLES 2E2A6 110
VL CDR 2 YATSLAD 3C1A5 111
VL CDR 2 YASQSIS 3C3E2 112
VL CDR 3 FQGSHVPPT 1D3B8 113
VL CDR 3 QHHYGTPYT 2C9B10 114
VL CDR 3 QHIRELTRS 2E2A6 115
VL CDR 3 LQHGESPFT 3C1A5 116
VL CDR 3 QQSDTWPLT 3C3E2 117
본 명세서에 개시된 하이브리도마에 의해 생성된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 VH CDR 도메인 변이체를 포함하는 아미노산 서열의 비-제한적인 예는 1D3B8에 대한 VH CDR1 변이체 SEQ ID NO: 118; 2C9B10, 2E2A6 및 3C1A5 VH 변이체 2에 대한 VH CDR1 변이체 SEQ ID NO: 119; 3C1A5 VH 변이체 1 및 3C3E2에 대한 VH CDR1 변이체 SEQ ID NO: 120; 1D3B8 및 2E2A6에 대한 VH CDR2 변이체 SEQ ID NO: 121; 2C9B10 및 3C1A5 VH 변이체 2에 대한 VH CDR2 변이체 SEQ ID NO: 122; 3C1A5 VH 변이체 1, 및 3C3E2에 대한 VH CDR2 변이체 SEQ ID NO: 123; 1D3B8 및 2C9B10에 대한 VH CDR3 변이체 MDY; 2E2A6 및 3C1A5 VH 변이체 2에 대한 VH CDR3 변이체 MGY; 및 3C1A5 VH 변이체 1 및 3C3E2에 대한 VH CDR3 변이체 SEQ ID NO: 124를 포함한다. 본 명세서에 개시된 하이브리도마에 의해 생성된 α-SNAP-25 단클론성 항체의 VL CDR 도메인 변이체를 포함하는 아미노산 서열의 비제한 적인 예는 1D3B8에 대한 VL CDR1 변이체 SEQ ID NO: 125; 2C9B10에 대한 VL CDR1 변이체 SEQ ID NO: 126; 2E2A6에 대한 VL CDR1 변이체 SEQ ID NO: 127; 3C1A5에 대한 VL CDR1 변이체 SEQ ID NO: 128; 3C3E2에 대한 VL CDR1 변이체 SEQ ID NO: 129; 1D3B8에 대한 VL CDR2 변이체 KVS; 2C9B10에 대한 VL CDR2 변이체 NAK; 2E2A6에 대한 VL CDR2 변이체 LVS; 3C1A5에 대한 VL CDR2 변이체 YAT; 및 3C3E2에 대한 VL CDR2 변이체 YAS를 포함한다.
실시예 IV
BoNT /A 절단 부위 분리가능한 결합의 P 1 잔기에서 유리 카르복실 -말단을 갖는 SNAP -25 에피토프에 선택적으로 결합하는 α- SNAP -25 다클론성 항체의 발현
하기 실시예는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 제조하는 방법을 예시한다.
SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 발현시키기 위하여, 10-잔기 펩티드 CGGGRIDEANQ (SEQ ID NO: 46)를 SNAP-25 절단 생성물 항원으로서 디자인하였다. 이러한 펩티드는 KLH에 대한 컨쥬게이션을 위한 N-말단 시스테인 잔기, 인간 SNAP-25의 아미노산 191-197 (SEQ ID NO: 5)에 연결된 G-스페이서 유연성 스페이서 (GGG)를 포함하고 카르복실화된 C-말단 글루타민을 갖는다. 블라스트 서치는 이러한 펩티드가 오직 SNAP-25에 대해 고도의 상동성(homology)을 가지며, 뉴런 세포의 다른 단백질과의 가능한 교차-재활성이 거의 없음을 밝혀내었다. 서열은 또한 소수성 지표(hydropathy index), 단백질 표면 확률(protein surface probability), 유연성의 영역(regions of flexibility), 및 선호하는 2차 구조, 그 후, 선택된 펩티드 서열의 적당한 배향 및 프리젠테이션을 결정하기 위한 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 주의깊게 검토하였다. 펩티드를 합성하고 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 컨쥬게이션하여 면역원성을 증가시켰다. 동물을 면역화하기 전에, 세포 용해물에 존재하는 단백질에대해 면역반응성이 없는 동물을 확인하기 위하여 비처치(naive) 래빗을 먼저 웨스턴 블롯에서 후보 세포주로부터의 세포 용해물에 대해 스크리닝하였다. 2마리의 예비스크리닝된 래빗을 이러한 펩티드로 면역화하였고, 약 8주의 3회 면역화 후에, 래빗을 시험을 위해 채혈하였다. 혈액을 4 ℃에서 60분 동안 인큐베이팅하여 응고되게 하였다. 응고된 혈액을 4 ℃에서 10분 동안 10,000x g에서 원심분리하여 세포 부스러기를 펠렛화하였다. 생성된 혈청 샘플을 50 ㎕ 분취물로 분배하였고 필요시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
본 명세서에 개시된 다른 SNAP-25 항원에 기초한 유사한 계획을 사용하여 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합로부터의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 포함하는 에피토프에 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 발현하였다. 예를 들어, SEQ ID NO: 47의 SNAP-25 항원이 SEQ ID NO: 46의 SNAP-25 항원 대신에 KLH에 컨쥬게이션될 수 있다. 다른 예로서, SEQ ID NO: 38의 SNAP-25 항원으로부터의 인간 SNAP-25의 아미노산 191-197이 SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 147, 또는 SEQ ID NO: 148로 대체될 수 있다.
2. α- SNAP -25 다클론성 항체의 존재의 스크리닝.
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합하는 α-SNAP-25 다클론성 항체의 존재를 결정하기 위하여, 실시예 III에 기재된 바와 같이 추출된 래빗 혈청을 사용하여 비교 ELISA 및 세포-기반 절단 검정을 실시하였다. 두 래빗 모두로부터의 항체가BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 포함하였다. α-SNAP-25 래빗 다클론성 항체를 NTP 22 및 NTP 23로 지정하였다..
3. α- SNAP -25 다클론성 항체의 정제.
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 다클론성 항체를 정제하기 위하여, 래빗 혈청으로부터의 NTP 22 및 NTP 23 항체를 SEQ ID NO: 46의 SNAP-25 항원을 포함하는 친화도 컬럼을 사용하여 정제하였다.
4. α- SNAP -25 다클론성 항체의 결합 특이성의 평가.
BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 α-SNAP-25 다클론성 항체의 결합 특이성을 평가하기 위하여, 실시예 III에 기재된 바와 같이 세포-기반 활성 검정, 면역세포화학 및 면역침전을 사용하여 절단 생성물을 검출하는 데에 정제된 NTP 22 및 NTP 23 α-SNAP-25 다클론성 항체를 사용하였다. 세포-기반 절단 검정, 면역세포화학 분석 및 면역 침전 분석 모두에서, NTP 22 및 NTP 23 α-SNAP-25 다클론성 항체가 비절단 SNAP-25와 교차반응하지 않은 것으로 나타났다. 따라서, NTP 22 및 NTP 23 둘 모두가 SNAP-25197 절단 생성물에 대한 고도의 결합 특이성(이는 SNAP-25206 비절단 기질에 비하여 본 절단 생성물의 우선적인 인식을 가능하게 함)을 갖는다. 항원에 대한 친화도는 실시예 III에 기재된 바와 같이 BiAcore에서의 SPR을 사용하여 결정할 수 있다.
실시예 V
샌드위치 ELISA 를 위한 구성요소 및 조건 준비
하기 실시예는 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 대해 특이적인 α-SNAP-25 단클론성 항체를 사용하여 SNAP-25 절단 생성물을 검출함으로써 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 수행하는 데 유용한 샌드위치 ELISA를 실시하는 데 필요한 구성요소 및 조건을 확인하고 준비하는 방법을 예시한다.
1. BoNT /A로 처리된 세포로부터의 세포 용해물의 제조 .
분석을 위한 BoNT/A 처리된 세포 용해물을 얻기 위하여, Neuro-2a의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES를 포함하는 50 mL의 무혈청 배지를 포함한 T175 플라스크에 시딩하였다. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 2일 내지 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 대조구로서, Neuro-2a의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 50 mL의 적합한 성장 배지(표 1)를 포함한 T175 플라스크에 시딩하였다. 이러한 분화된 대조구 세포를 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 50% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 성장시켰다(대략 18 시간). 분화된 배양물 및 미분화된 대조구 배양물 둘 모두로부터의 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고 0 (비처리 샘플) 또는 10 nM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, 일정하게 교반하면서 4℃에서 30분간, 새로 제조된 Triton X-100 용해 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100)에서 용해시켜 세포를 수확하였다. 벤치-탑 원심분리기(bench-top centrifuge)를 사용하여 용해된 세포를 4000 rpm에서 20분간 4℃에서 원심분리하여 부스러기를 제거하였다. 세포 용해물의 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 검정으로 측정하였다.
2. 샌드위치 ELISA 구성요소의 제조 및 확인.
적합한 포획 항체-검출 항체 쌍을 확인하기 위하여, 11개의 상이한 α-SNAP-25 포획 항체 및 7개의 상이한 α-SNAP-25 검출 항체를 비교하여, 포획 및 검출 항체 쌍의 26개의 상이한 조합에 대하여 ECL 샌드위치 ELISA 분석을 행하였다(표12). 사용된 α-SNAP-25 항체는 본 명세서에 개시된 2E2A6 및 3C1A5 α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체, 본 명세서에 개시된 SMI-81, MC-6050, 및 MC-6053 α-SNAP-25 마우스 단클론성 항체, 본 명세서에 개시된 NTP 23 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항체, S9684 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항체 (Sigma, St. Louis, MO), H-50 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), C-18 α-SNAP-25 염소 다클론성 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), N-19 α-SNAP-25 염소 다클론성 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), 및 SP12 α-SNAP-25 마우스 다클론성 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)였다.
포획 항체 용액을 제조하기 위하여, 하이브리도마 세포주 2E2A6 및 3C1A5로부터의 복수에 포함된 하이브리도마 세포주 2E2A6 및 3C1A5 뿐만 아니라 α-SNAP-25 MC-6050 및 MC-6053 단클론성 항체를 표준 단백질 A 정제 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 모든 다른 α-SNAP-25 항체는 정제된 항체로서 구입하였다.
검출 항체 용액을 제조하기 위하여, 제조사 사용설명서(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD))에 따라 루테늄(II)-트리스-바이피리딘 -(4-메틸설포네이트) NHS 에스테르 표지 시약 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 적합한 α-SNAP-25 항체를 컨쥬게이팅하였다. 컨쥬게이션 반응은 30 ㎕의 증류수 재구성된 MSD SULFO-TAG™ 스톡 용액을200 ㎕의 2 mg/mL α-SNAP-25 다클론성 항체200 ㎕의 2 mg/mL α-SNAP-25 다클론성 항체에 첨가하고 반응물을 실온에서 2시간 동안 암실에서 인큐베이팅하여 수행하였다. 표지된 항체를 표준 스핀 컬럼 프로토콜(standard spin column protocol), 및 표준 비색 단백질 검정을 사용하여 결정된 단백질 농도를 사용하여 정제하였다. 분광광도계를 사용해 α-SNAP-25 항체/MSD SULFO-TAG™ 컨쥬게이트의 흡광도를 455 nm에서 관찰하여 몰/리터 단위로 농도를 결정하였다. 검출 항체 용액을 필요 시까지 4 ℃에서 보관하였다.
SNAP-25 절단 생성물에 대해 특이적인 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 제조하기 위하여, 약 5 ㎕의 적합한 α-SNAP-25 단클론성 항체 용액 (1 x PBS 중의 20 ㎍/mL)을, 96-웰 MSD 고결합(High Bind) 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 용액을 액체 증발시키기 위하여 생물학적 안정 캐비닛에서 2-3시간 동안 용액을 공기 건조되게 하였다. 그 다음, 2% 애머샴 블로킹 시약 (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) 및 10% 염소 혈청 (VWR, West Chester, PA)을 포함하는 150 ㎕ 의 블로킹 완충제를 실온에서 2시간 동안 첨가하여 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하였다. 블로킹된 플레이트를 밀봉하고 필요 시까지 4 ℃에서 보관하였다.
ECL 샌드위치 ELISA 분석으로, 절단된 SNAP-25 절단 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 보관된 플레이트로부터의 블로킹 완충제를 웰로부터 흡입하고, 상기한 바와 같이, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 25 ㎕의 용해물을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 하룻밤 4 ℃에서 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2%의 애머샴 블로킹 시약을 포함하는 25 ㎕의 5 ㎍/mL 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 검출 항체 인큐베이션 후, 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 웰을 3회 세척하였다. 세척 후, 150 ㎕의 1 x 판독 완충제(Read Buffer) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 각각의 웰에 첨가하고, SECTOR™ 이미저 6000 이미지 리더(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 각각의 항체-쌍에 대해 10 nM 투여량에서 얻어진 신호를 각각의 항체 쌍에 대해 0 nM에서 얻어진 신호로 나누어서 비를 계산하였다. 이러한 결과는 시험된 26개의 상이한 항체 쌍 조합 중에서, 오직 3개의 항체 쌍만이 시험된 더 높은 투여량에 대해 10:1을 초과하는 신호-대-잡음 비를 가짐을 나타낸다: 쌍 No. 1 (2E2A6 마우스 mAb와 S9684 래빗 pAb), 쌍 No. 4 (3C1A5 마우스 mAb와 S9684 래빗 pAb), 및 쌍 No. 18 (S9684 래빗 pAb와 2E2A6 마우스 mAb). 추가적인 검정을 진행하기 위하여 항체 쌍 1을 선택하였다.
표 12. α- SNAP -25 항체 조합의 스크리닝
항체 쌍 No . 포획 항체 검출 항체 검출 SNAP -25 절단 생성물 검출 SNAP -25 비절단 기질 신호/잡음 비
(10 nM /0 nM )
1 2 E2A6 마우스 mAb S9684 래빗 pAb Yes No 26.6:1
2 2E2A6 마우스 mAb N-19 염소 pAb Yes No 7.3:1
3 2E2A6 마우스 mAb H-50 래빗 pAb Yes No 0.9:1
4 3C1A5 마우스 mAb S9684 래빗 pAb Yes No 12.1:1
5 3C1A5 마우스 mAb N-19 염소 pAb Yes No 1.9:1
6 3C1A5 마우스 mAb H-50 래빗 pAb Yes No 0.9:1
7 C-18 염소 pAb S9684 래빗 pAb No No 0.8:1
8 C-18 염소 pAb N-19 염소 pAb No No 0.9:1
9 C-18 염소 pAb H-50 래빗 pAb No No 0.9:1
10 H-50 래빗 pAb 2E2A6 마우스 mAb Yes No 0.9:1
11 H-50 래빗 pAb C-18 염소 pAb No No 1.0:1
12 N-19 염소 pAb 2E2A6 마우스 mAb Yes No 0.9:1
13 N-19 염소 pAb C-18 염소 pAb No No 1.1:1
14 NTP 23 래빗 pAb N-19 염소 pAb Yes No 1.2:1
15 NTP 23 래빗 pAb C-18 염소 pAb No No 1.1:1
16 NTP 23 래빗 pAb SP12 마우스 pAb Yes No 1.3:1
17 NTP 23 래빗 pAb H-50 래빗 pAb Yes No 1.1:1
18 S9684 래빗 pAb 2E2A6 마우스 mAb Yes No 21.3:1
19 S9684 래빗 pAb C-18 염소 pAb No No 0.7:1
20 S9684 래빗 pAb SMI-81마우스 mAb Yes Yes 1.2:1
21 SMI-81 마우스 mAb S9684 래빗 pAb Yes Yes 1.1:1
22 SMI-81 마우스 mAb N-19 염소 pAb Yes Yes 1.0:1
23 SMI-81 마우스 mAb C-18 염소 pAb No No 0.8:1
24 SP12 마우스 pAb C-18 염소 pAb No No 1.0:1
25 MC-6050 마우스 mAb S9684 래빗 pAb Yes Yes 5.0:1
26 MC-6053 마우스 mAb S9684 래빗 pAb Yes Yes 7.1:1
3. 세포 분화 조건의 최적화 .
샌드위치 ELISA 검출 시스템을 사용할 때 BoNT/A 중독에 감수성인 세포를 포함하는 세포주에 대한 최적 분화 조건을 결정하기 위하여, 다양한 세포 포획 배지 및 분화 시간을 시험하였다.
최적 분화 배지를 결정하기 위하여, SiMa 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를 1 mL의 하기 배지 중 하나 및 분화 보충물을 포함한 콜라겐 IV 코팅된 24-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다: 1) RPMI 1640, 10% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 및 25 ㎍/mL GT1b); 2) RPMI-1640, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 및 25 ㎍/mL GT1b; 3) 최소 필수 배지, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 및 25 ㎍/mL GT1b; 및 4) RPMI-1640, 10% BSA, 1 x N2 보충물, 1 x NGF 보충물, 및 25 ㎍/mL GT1b. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고 0 (비처리 샘플), 0.2 pM, 2 pM, 또는 20 pM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 하룻밤 처리한 후에, 세포를 세척하고, 독소 없이 추가로 2일간 인큐베이팅하여 SNAP-25 기질이 절단되게 하고, 섹션 1에서 상기에 기재된 바와 같이 수확하였다. 세포 용해물의 단백질 농도를 브래드포드 검정으로 측정하였다. 상기한 바와 같은, 항체 쌍 1을 사용하여 ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의해, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재의 검출을 실시하였다. 실시예 1에 논의된 바와 같이, 분화된 세포만큼 효과적으로 미분화 세포는 독소를 흡수하지 않았다. BoNT/A 흡수 및 결과적으로 SNAP-25 절단을 증가시키는 가장 효과적인 분화 배지는 배지 3 (MEM+N2+B27), 그 다음이 배지 2 (RPMI-1640+N2+B27), 및 배지 4 (RPMI-1640 +N2+NGF+BSA)였다(도 3). 배지 2에서 배양된 세포는 다른 배지와 비교하여 SNAP-25의 더 많은 절단을 야기하였다.
최적 분화 시간을 결정하기 위하여, SiMa 세포주로부터의 적합한 농도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 25 ㎍/mL GT1b를 포함하는 100 ㎕의 무혈청 배지를 포함한 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 세포를 4일의 서로 다른 날에 플레이팅하여, 6시간, 24시간, 48시간 및 72시간을 시험하는 분화 시간 코스를 얻었고, 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 0 (비처리 샘플), 0.1 pM, 0.2 pM, 0.4 pM, 0.8 pM, 1.6 pM, 3.1 pM, 6.25 pM, 12.5 pM, or 25 pM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 하룻밤 처리한 후에, 세포를 세척하고, 독소 없이 추가로 2일간 인큐베이팅하여 SNAP-25 기질이 절단되게 하고, 섹션 1에서 상기에 기재된 바와 같이 수확하였다. 수확 후에, 상기와 같이 세포 용해물의 단백질 농도를 측정하고 ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의해 절단된 SNAP-25 생성물의 존재의 검출을 실시하였다. 그 다음, ECL 이미저로부터 얻은 원 데이터를 SigmaPlot v. 9.0으로 옮기고 4-파라미터 로지스틱스(4-parameter logistics)를 사용하여 투여량-반응 곡선을 정의하였다. 데이터를 플롯팅할 때 4-파라미터 로지스틱 함수에 대해 사용되는 제약(constraint)을 없었다. 하기 분석을 사용하여 그래프 리포트를 생성하였다: R2 (상관 계수), a (데이터 세트에 대한 최대치), b (힐슬로프(hillslope)), 및 X0 ± SE (EC50 값 ± 표준 오차). 결과는 48-72 시간 동안 분화된 세포를 사용하여 2 pM 미만의 EC50 값이 달성될 수 있음을 나타낸다(도 4). 셀의 성능에 대한 유의미한 변화 없이, 48시간 내지 72시간의 분화로 분화된 세포가 사용될 수 있다는 것은 검정의 견고성을 강조한다. 48 시간 미만의 분화 시간은 제형화된 제품의 피코몰 시험에는 적합하지 않았지만, 이러한 더 적은 분화 시간은 벌크 약물 시험에 대해서는 충분히 민감하다.
4. BoNT /A 처리 시간의 최적화.
세포주로부터의 세포가 BoNT/A로 처리되는 데 필요한 최적 시간 길이를 결정하기 위하여, 다양한 길이의 BoNT/A 처리 시간을 시험하였다. SiMa 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 25 ㎍/mL GT1b를 포함하는 100 ㎕의 무혈청 배지를 포함한 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 세포를 플레이팅하였고, 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, RPMI 1640 성장 배지 중 0 (비처리 샘플), 0.1 pM, 0.2 pM, 0.4 pM, 0.8 pM, 1.6 pM, 3.1 pM, 6.3 pM, 12.5 pM, 또는 25 pM 의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하여 3중복으로 (in triplicate) 전체 투여량-반응(full dose-response)을 발생시켰다. 5개의 상이한 BoNT/A 처리 시간 계획을 실시하였다: 1) 6 시간 BoNT/A 처리, 제거 및 세포 세척, BoNT/A없이 18시간 세포 인큐베이션, 및 섹션 1기재된 바와 같은 세포 수확; 2) 24 시간 BoNT/A 처리, 제거 및 세포 세척, 및 섹션 1기재된 바와 같은 세포 수확; 3) 24 시간 BoNT/A 처리, 제거 및 세포 세척, BoNT/A없이 24시간 세포 인큐베이션, 및 섹션 1기재된 바와 같은 세포 수확; 4) 24시간 BoNT/A 인큐베이션, 제거 및 세포 세척, BoNT/A없이 48시간 세포 인큐베이션, 및 섹션 1기재된 바와 같은 세포 수확; 및5) 24시간 BoNT/A 인큐베이션, 제거 및 세포 세척, BoNT/A없이 72시간 세포 인큐베이션, 및 섹션 1기재된 바와 같은 세포 수확. 수확 후에, 세포 용해 물의 단백질 농도를 측정하고 ECL 샌드위치 ELISA에 의한 SNAP-25 절단 생성물의 검출을 수행하고, 상기와 같이 EC50을 계산하였다. 결과는 시험된 임의의 BoNT/A 처리에 의해서 2 pM 미만의 EC50 값이 달성될 수 있음을 나타낸다(도 5). 흥미롭게도, 24시간 + 24시간, 24시간 + 48시간, 및 24시간 + 73시간 BoNT/A 처리 계획이 각각 1.0 pM, 1.1, pM 및 0.9 pM으로 본질적으로 동일한 EC50 값을 발생시켰다. 6시간 + 18시간 및 24시간 + 0시간 BoNT/A 처리 계획에 대해 발생된 EC50 값은 각각 1.7 pM 및 1.6 pM이었다. 얻어진 신호의 양은 더 낮았지만, 이러한 결과는 6시간 내지 24시간의 BoNT/A 처리 시간 + 1일 내지 3일의 처리후 인큐베이션이, BoNT/A 활성을 검출하는 데 적합한 EC50을 발생시키는 데 사용될 수 있으며 검정의 전반적인 시간 코스에 있어서 융통성을 제공함을 나타낸다.
5. BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법의 민감도.
본 명세서에 개시된 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법의 민감도(sensitivity)를 평가하기 위하여, BoNT/A 중독에 감수성인 세포에 의한 BoNT/A 흡수의 타이밍을 결정하였다. SiMa 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 20 ㎍/mL GT1b를 포함하는 100 ㎕의 무혈청 배지를 포함한 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 1 nM의 BoNT/A 복합체를 포함하는 신선한 배지로 대체하고, BoNT/A 처리된 세폴를 0 min (신경독 첨가 후 즉시 제거), 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 및 60 min의 6가지 상이한 시점에 인큐베이팅하였다. BoNT/A를 갖지 않는(0 nM) 배지의 네거티브 대조구를 사용하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 세척하고 섹션 1에 기재된 바와 같이 수확하였다. 수확 후에, 세포 용해 물의 단백질 농도를 측정하고 ECL 샌드위치 ELISA에 의한 SNAP-25 절단 생성물의 검출을 수행하고, 상기와 같이 EC50을 계산하였다. 결과는, 백그라운드에 비해 유의미한 양의 SNAP-25 절단 생성물을 생성하기 전에, 세포에 의한 BoNT/A의 흡수가
1 분 미만이 걸렸음을 나타낸다 (도 6).
6. BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법의 특이성.
본 명세서에 개시된 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법의 특이성을 평가하기 위하여, BoNT/A 중독에 대해 감수성인 세포가 부분적으로 불활성화된 BoNT/A를 배제하고 BoNT/A를 정확히 구별하는 능력을 결정하였다.
SiMa 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 20 ㎍/mL GT1b를 포함하는 100 ㎕의 무혈청 배지를 포함한 폴리-D-리신 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 1) 0 (비처리 샘플), 0.03 pM, 0.1 pM, 0.31 pM, 0.93 pM, 2.78 pM, 8.33 pM, 및 25 pM의 BoNT/A 복합체; 2) 0, 0.14 nM, 0.41 nM, 1.23 nM, 3.7 nM, 11.11 nM, 33.33 nM, 및 100 nM의 불활성 BoNT/A (iBoNT/A); 또는 3) 0, 0.14 nM, 0.41 nM, 1.23 nM, 3.7 nM, 11.11 nM, 33.33 nM, 및 100 nM의 LHN/A 단편 중 어느 하나를 포함하는 신선하 배지로 대체하였다. iBoNT/A는 신경독의 금속프로테아제 활성을 완전히 불활성화하는, 경쇄의 아연 결합 도메인 중의 돌연변이를 포함한다, 예를 들어, 문헌 [Liqing Zhou, et al., Expression and Purification of the Light Chain of Botulinum Neurotoxin A: A Single Mutation Abolishes its Cleavage of SNAP -25 and Neurotoxicity after Reconstitution with the Heavy Chain, Biochemistry 34: 15175-15181 (1995)]을 참조하며 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. LHN/A 단편은 결합 도메인이 없으나, 본래 전위 도메인 및 경쇄를 포함한다, 예를 들어, 문헌[Clifford C. Shone, et al., Recombinant Toxin Fragments, U.S. Patent 6,461,617]을 참조하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 24시간 처리 후, 세포를 세척하고, 독소 없이 추가로 2일 간 인큐베이팅하여 SNAP-25 기질이 절단되게 하고, 섹션 1에서 상기 기재된 바와 같이 수확하였다. 수확 후에, 세포 용해 물의 단백질 농도를 측정하고 ECL 샌드위치 ELISA에 의한 SNAP-25 절단 생성물의 검출을 수행하고, 상기와 같이 EC50을 계산하였다. 결과는 iBoNT/A 및 LHN/A (EC50 > 100 nM)에 대한 세포의 결합 친화도가 BoNT/A(EC50= 1.6 pM) 에 대한 결합 친화도보다 적어도 60,000 더 낮음을 나타낸다 (도 7). iBoNT/A로 처리된 세포에서는 시험된 모든 농도에서 SNAP-25 절단 생성물이 검출되지 않았다. 가장 높은 투여량의 LHN/A 단편으로 처리된 세포에서 적은 양의 SNAP-25 절단 생성물이 검출되었지만, 이러한 활성은 전위 도메인의 활성으로 인한 이 단편의 비-특이적 흡수에 의한 것이다. 따라서, 결과는 본 명세서에 개시된 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법이, BoNT/A 수용체에 대한 BoNT/A의 결합, 신경독/수용체 복합체의 내제화, 세포내 소포로부터 세포질로의 BoNT/A 경쇄의 전위 및 SNAP-25의 단백질가수분해적 절단을 포함하는, BoNT/A가 단백질가수분해적으로 SNAP-25 기질을 절단하는 중독 과정에 관여된 모든 단계를 측정할 수 있음을 나타낸다.
실시예 VI
ECL 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 ECL 샌드위치 ELISA를 사용하여, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25 절단 생성물에 특이적인 α-SNAP-25 단클론성 항체를 사용하여 SNAP-25 절단 생성물을 검출함으로써 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 예시한다.
BoNT/A로 처리된 세포로부터 용해물을 제조하기 위여, 계통확립 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 20 ㎍/mL GT1b를 포함하는 100 ㎕의 무혈청 배지를 포함한 96-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다(실시예 I 및 II 참조). 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 세포를 인큐베이팅하였다. 분화된 세포로부터의 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 0 (비처리 샘플), 0.03 pM, 0.1 pM, 0.3 pM, 0.9 pM, 2.8 pM, 8.3 pM, 및 25 pM의BoNT/A 복합체를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 24시간 처리 후, 세포를 세척하고, 독소 없이 추가로 2일 간 인큐베이팅하였다. 세포를 실시예 V에 기재된 바와 같이 수확하였다.
α-SNAP-25 포획 항체 용액을 제조하기 위하여, 하이브리도마 세포주 2E2A6로부터의 복수에 포함된 α-SNAP-25 단클론성 항체를 표준 단백질 A 정제 프로토콜을 사용하여 정제하였다. α-SNAP-25 검출 항체 용액을 제조하기 위하여, 제조사의 사용설명서(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 따라 α-SNAP-25 래빗 다클론성 항체 S9684 (Sigma, St. Louis, MO)를 루테늄(II)-트리스-바이피리딘-(4-메틸설포네이트) NHS 에스테르 표지 시약 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 컨쥬게이팅하였다. 컨쥬게이션 반응, 표지된 α-SNAP-25 항체의 정제, 농도 결정 및 보관은 실시예 V에 기재된 바와 같았다.
SNAP-25 절단 생성물에 특이적인 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 제고하기 위하여, 약 5 ㎕의 α-SNAP-25 단클론성 항체 2E2A6 용액 (1 x PBS 중 20 ㎍/mL)을 96-웰 MSD 고결합 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 용액을 액체 증발시키기 위하여 생물학적 안정 캐비닛에서 2-3시간 동안 용액을 공기 건조되게 하였다. 그 다음, 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하고 BoNT/A 활성을 검출하는 데 직접 사용하였다.
ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의해, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위해서, 보관된 플레이트로부터의 블로킹 완충제를 각각의 웰로부터 흡입하고, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 25 ㎕의 용해물을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2% 애머샴 블로킹 시약을 포함하는, 25 ㎕의 5 ㎍/mL 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 검출 항체 인큐베이션 후, 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 웰을 3회 세척하였다. 세척 후, 150 ㎕의 1 x 판독 완충제 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 각각의 웰에 첨가하고, SECTOR 이미저 6000 이미지 리더(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 수집된 데이터를 분석하였고 실시예 V에 기재된 바와 같이 EC50를 계산하였다. 대표적인 결과를 도 8에 나타낸다. 이러한 결과는 EC50에서 평균 1.0 pM의 BoNT/A (약 0.3 pM 내지 약 2.0 pM의 범위)가, 약 15:1 내지 약 20:1의 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비 및 약20:1 내지 약 500:1의 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비로 검출되었음을 나타낸다.
실시예 VII
CL 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 CL 샌드위치 ELISA에 의해서, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단을 갖는 SNAP-25에 특이적인 α-SNAP-25 단클론성 항체를 사용하여 SNAP-25 절단 생성물을 검출함으로써 BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 예시한다.
BoNT/A로 처리된 세포로부터의 용해물 및 α-SNAP-25 포획 항체 용액을 실시예 VI에서와 같이 제조하였다.
α-SNAP-25 검출 항체 용액을 제조하기 위하여, 제조사의 사용설명서(Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)에 따라 α-SNAP-25 다클론성 항체 S9684 (Sigma, St. Louis, MO)를 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 컨쥬게이팅하였다. 500 ㎕의 1 mg/mL α-SNAP-25 다클론성 항체를 동결건조된 활성화된 퍼옥시다아제를 포함하는 바이알에 첨가하고 성분들을 혼합한 다음, 10 ㎕의 소듐 시아노보로하이드라이드를 첨가하여, 컨쥬게이션 반응을 실시하였다. 흄 후드(fume hood) 안에서 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 반응을 켄칭(quenching)한 후에, 표지된 항체를 표준 스핀 컬럼 프로토콜을 사용하여 정제하고 표준 비색 단백질 검정을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 분광광도계를 사용하여 α-SNAP-25 다클론성 항체/HRP 컨쥬게이트의 흡광도를 455 nm에서 측정하여 몰/리터 단위의 농도를 결정하였다. α-SNAP-25 검출 항체 용액은 필요 시까지 4 ℃에서 보관하였다.
SNAP-25절단 생성물에 특이적인 α-SNAP-25 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 제조하기 위하여, 약 100 ㎕의 α-SNAP-25 단클론성 항체 2E2A6 용액 (1 x PBS 중 1 mg/mL)을 96-웰 그레이너(Greiner) 화이트 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이팅한 후, 임의의 과잉의 항체 용액을 폐기하였다. 그 다음, 실온에서 1시간 동안 2% 애머샴 블로킹 시약 (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) 및 10% 염소 혈청 (VWR, West Chester, PA)을 포함하는 150 ㎕의 블로킹 완충제를 첨가하여 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하였다. 블로킹 완충제를 폐기하고 플레이트를 엎어놓고 페이퍼 타월로 두드려 건조시켰다. 그 다음, 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하고 BoNT/A 활성을 검출하는 데 직접 사용하였다.
CL 샌드위치 ELISA 분석에 의해, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 50 ㎕의 용해물을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 4 ℃에서 2-4시간 내지 하룻밤 동안 500 rpm으로 회전시키면서 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.05 % TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2% 애머샴 블로킹 시약을 포함하는, 100 ㎕의 1 mg/mL α-SNAP-25 다클론성 항체/HRP 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 650 rpm으로 회전시키면서 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 검출 항체 인큐베이션 후, 200 ㎕ 1 x PBS, 0.05% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 웰을 3회 세척하였다. 세척 후, 100 ㎕의 SuperSignal ELISA Pico 1:1 혼합물 (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)을 각각의 웰에 첨가하고 395 nm에서 루미노미터(luminometer) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 수집된 데이터를 분석하였고 실시예 V에 기재된 바와 같이 EC50를 계산하였다. 이러한 결과는 EC50에서 평균 1.0 pM의 BoNT/A (약 0.3 pM 내지 약 2.0 pM의 범위)가, 약 15:1 내지 약 20:1의 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비 및 약20:1 내지 약 500:1의 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비로 검출되었음을 나타낸다.
실시예 VIII
멀티플렉스 ECL 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 SNAP-25 절단 생성물에 특이적인 α-SNAP-25 단클론성 항체및 상이한 단백질에 대한 제2 항체 쌍을 사용하여 SNAP-25 절단 생성물을 검출함으로써 BoNT/A 활성을 검출하는 멀티플렉스 면역-기반 방법을 예시한다.
1. 제2 단백질에 대한 포획 항체-검출 항체 쌍의 제조 및 확인
분석을 위한 비처리 세포 용해물을 얻기 위하여, SiMa 세포의 스톡 배양물로부터의 적당한 밀도의 세포를, 1X RPMI 1640, 10% FBS, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 및 100 U/100 ㎍의 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 40 mL의 성장 배지를 포함하는 T175 플라스크에 시딩하였다. 이러한 세포를 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 70-90% 컨플루언스에 도달할 때까지 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, 일정하게 교반하면서 4℃에서 약 30분간, 새로 제조된 Triton X-100 용해 완충제 (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 0.001M EDTA, 1 mM EGTA, 및 1% Triton-X-100)에 용해하여 수확하였다. 벤치-탑 원심분리기를 사용하여, 용해된 세포를 약 3300-3330 x g에서 40분간 8℃에서 원심분리하여 부스러기를 제거하였다.
제2 단백질에 대한 적합한 포획 항체-검출 항체 쌍을 확인하기 위하여, 5가지 상이한 단백질로 구성된 포획 및 검출 항체 쌍의 21개의 상이한 조합에서 ECL 샌드위치 ELISA 분석을 행하였다 (표 13). 사용된 항체는 α-신택신 1A-HPC 마우스 단클론성 항체 S0664 (Sigma, St. Louis, MO), α-GAPDH 마우스 단클론성 항체 MAB374 (Chemicon, Temecula, CA), α-신택신 1 래빗 다클론성 항체 S1172-1 (Sigma, St. Louis, MO), α-GAPDH 래빗 다클론성 항체 2275-PC-1 (R & D Systems, Minneapolis, MN), α-신택신 2 래빗 다클론성 항체 S5687 (Sigma, St. Louis, MO), α-인간 신택신 2 마우스 단클론성 항체 MAB2936 (R & D Systems, Minneapolis, MN), α-마우스 신택신 2 염소 다클론성 항체 AF2568 (Sigma, St. Louis, MO), α-신택신 2 래빗 다클론성 항체 AB5596 (Sigma, St. Louis, MO), α-신택신 1 래빗 다클론성 항체 S1172-2 (Sigma, St. Louis, MO), α-h, m, r 액틴(actin) 양 다클론성 항체 AF4000 (R & D Systems, Minneapolis, MN), α-beta 액틴 마우스 단클론성 항체 A1978 (Sigma, St. Louis, MO), α-beta 마우스 다클론성 항체 액틴 A2228 (Sigma, St. Louis, MO), 마우스 α-GAPDH 마우스 단클론성 항체 G8795 (Sigma, St. Louis, MO), α-GAPDH 래빗 다클론성 항체 G9595 (Sigma, St. Louis, MO)였다.
제2 단백질 포획 항체 용액을 제조하기 위하여, 단클론성 항체를 정제된 항체로서 구매하였다. 제2 단백질 검출 항체 용액을 제조하기 위하여, 제조사의 사용설명서 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 따라 적합한 항체를 루테늄(II)-트리스-바이피리딘-(4-메틸설포네이트) NHS 에스테르 표지 시약 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 컨쥬게이팅하였다. 30 ㎕의 증류수 재구성된 MSD SULFO-TAG™ 스톡 용액을 200 ㎕의 2 mg/mL 다클론성 항체에 첨가하여 컨쥬게이션 반응을 실시하고 반응물을 실온에서 2시간 동안 암실에서 인큐베이팅하였다. 표지된 항체를 표준 스핀 컬럼 프로토콜을 사용하여 정제하고 표준 비색 단백질 검정을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 항체/MSD SULFO-TAG™ 컨쥬게이트의 흡광도를 분광광도계를 사용하여 455 nm에서 측정하여 몰/리터 단위의 농도를 결정하였다. 검출 항체 용액은 사용 시까지 4 ℃에서 보관하였다.
SNAP-25절단 생성물에 특이적인 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 제조하기 위하여, 약 5 ㎕의 α-SNAP-25 단클론성 항체 2E2A6 용액 (1 x PBS 중 20 ㎍/mL)을 96-웰 MSD 고결합 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 용액을 액체 증발시키기 위하여 생물학적 안정 캐비닛에서 2-3시간 동안 용액을 공기 건조되게 한 다음, 플레이트를 밀봉하고 사용 시까지 4 ℃에서 보관하였다. 그 다음, 실온에서 1-2 시간 동안 0.05% Tween-20 PBS 중의, 3% BSA (Pierce, Rockford, IL) 10% 염소 혈청 (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA), 및 Difco 1% 탈지유 (BD BioSciences Franklin Lakes, NJ)로 구성된 150 ㎕의 블로킹 완충제를 첨가하여, 건조된 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하였다.
ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의해 단백질의 존재를 검출하기 위하여, 보관된 플레이트로부터의 블로킹 완충제를 각각의 웰로부터 흡입하고, 상기한 바와 같이, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 25 ㎕의 용해물을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 상기한 바와 같은 블로킹 완충제 중에 재현탁된, 25 ㎕의 5 ㎍/mL 적합한 제2 단백질 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 검출 항체 인큐베이션 후, 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 웰을 3회 세척하였다. 세척 후, 150 ㎕의 1 x 판독 완충제 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 각각의 웰에 첨가하고, SECTOR™ 이미저 6000 이미지 리더(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 각각의 항체-쌍에 대해 비처리 세포 용해물로부터 얻어진 신호를 각각의 항체 쌍에 대해 용해물 완충 대조구 (0 nM 투여량)으로부터 얻어진 신호로 나누어서 비를 계산하였다(표 13). 이러한 결과는 시험된 21개의 상이한 항체 쌍 조합 중에서, 오직 2개의 항체 쌍만이 시험된 더 높은 투여량에 대해 10:1을 초과하는 신호-대-잡음 비를 가짐을 나타낸다: 쌍 No. 16 α-GAPDH 마우스 단클론성 항체 MAB374와 α-GAPDH 래빗 다클론성 항체 RDS2275-PC-1; 및 쌍 21: α-GAPDH 마우스 단클론성 항체 MAB374와 α-GAPDH 래빗 다클론성 항체 G9545. α-GAPDH 마우스 단클론성 항체 MAB374와 α-GAPDH 래빗 다클론성 항체 G9545 쌍을 멀티플렉스 ECL 샌드위치 ELISA를 위한 제2 단백질 포획 항체-검출 항체으로서 선택하였다.
표 13. 제2 단백질 항체 조합의 스크리닝
항체 쌍 No . 포획 항체 검출 항체 단백질의 검출 신호/잡음 비 ( 용해물 / 완충제 )
1 α- 신택신 2 S5687 pAb α- 신택신 2 MAB2936 mAb No 0.92
2 α-신택신 2 AF2568 pAb α-신택신 2 AB5596 pAb No 1.1
3 α-신택신 2 AF2568 α-신택신 2 S5687 pAb No 1.11
4 α-신택신 2 AF2936 pAb α-신택신 2 AB5596 pAb Yes 1.63
5 α-신택신 2 AF2936 pAb α-신택신 2 S5687 pAb Yes 1.6
6 α-신택신 2 AB5596 pAb α-신택신 2 S5687 pAb No 0.82
7 α-신택신 2 AB5596 pAb α-신택신 2 MAB2936 mAb No 0.87
8 α-신택신 2 MAB2936 mAb α-신택신 2 AB5596 pAb Yes 1.2
9 α-신택신 2 MAB2936 mAb α-신택신 2 S5687 pAb No 1.07
10 α-신택신 S0664 mAb α-신택신 1 S1172-1 pAb Yes 4.23
11 α-신택신 S0664 mAb α-신택신 1 S1172-2 pAb No 1.21
12 α-신택신 1 S1172-1 pAb α-신택신 S0664 mAb Yes 5.5
13 α-신택신 1 S1172-2 pAb α-신택신 S0664 mAb Yes 2.5
14 α-h,m,r 액틴 AF4000 pAb α-베타 액틴 A1978 mAb No 1.04
15 α-h,m,r 액틴 AF4000 pAb α-베타 액틴 A2228 mAb No 1.08
16 α-GAPDH MAB374 mAb α-GAPDH 2275-PC-1 pAb Yes 20.04
17 α-GAPDH MAB374 mAb α-GAPDH G8795 mAb No 0.89
18 α-GAPDH 2275-PC-1 pAb α-GAPDH MAB374 mAb No 1.08
19 α-GAPDH 2275-PC-1 pAb α-GAPDH G8795 mAb Yes 1.27
20 α-GAPDH G8795 mAb α-GAPDH 2275-PC-1 pAb Yes 2.74
21 α-GAPDH MAB374 mAb α-GAPDH G9545 pAb Yes ≥100
2. 멀티플렉스 ECL 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법.
분석을 위한 BoNT/A 처리된 세포 용해물을 얻기 위하여, SiMa 세포주의 스톡 배양물로부터의 적합한 밀도의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스염을 갖는 2 mM GlutaMAX I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES를 포함하는 무혈청 배지를 포함한 폴리-D-리신 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고 0 (비처리 샘플), 0.67 U/mL, 2.35 U/mL, 8.23 U/mL, 28.82 U/mL, 101 U/mL, 353 U/mL의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 24시간 처리 후에, 세포를 세척하고, 독소 없이 추가로 2일 간 인큐베이팅하였다. 세포를 세척하고, 수확하고, 섹션 1에서 상기 기재된 바와 같이 처리하였다.
α-SNAP-25 포획 항체 용액 및 α-SNAP-25 검출 항체 용액을 실시예 VII에 기재된 바와 같이 제조하였다. α-GAPDH 포획 항체 용액을 제조하기 위하여, α-GAPDH 단클론성 항체 마우스 MAB374 (Chemicon, Temecula, CA)를 상기 섹션 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. α-GAPDH 검출 항체 용액을 제조하기 위하여, 제조사의 사용설명서 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 따라 α-GAPDH 래빗 다클론성 항체 G9545 (Sigma, St. Louis, MO)를 루테늄(II)-트리스-바이피리딘-(4-메틸설포네이트) NHS 에스테르 표지 시약 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)에 컨쥬게이팅하였다. 컨쥬게이션 반응, 표지된 α-SNAP-25 항체의 정제, 농도 결정 및 보관은 상기 섹션 1에 기재된 바와 같았다.
α-SNAP-25포획 항체 및 α-GAPDH 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 제조하기 위하여, 대략 2.5 nL의 α-SNAP-25 포획 항체 용액 (45 ㎍/mL in 1 x PBS) 및 2.5 nL의 α-GAPDH 포획 항체 용액 (120 ㎍/mL in 1 x PBS)을 로봇 시스템(robotic system)을 사용하여 멀티플렉스 방식으로 96-웰 MSD 고결합 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 용액을 액체 증발시키기 위하여 생물학적 안정 캐비닛에서 적어도2-3시간 동안 용액을 공기 건조되게 하였다. 그 다음, 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하고 BoNT/A 활성 및 GAPDH 단백질을 거물하는 데 직접 사용하였다.
멀티플렉스 ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의해서 SNAP-25 절단 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 보관된 플레이트로부터의 블로킹 완충제를 각각의 웰로부터 흡입하고, 상기한 바와 같이, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 25 ㎕의 용해물을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 상기한 바와 같은, 25 ㎕의 5 ㎍/mL α-SNAP-25 검출 항체 용액 및 25 ㎕의 5 ㎍/mL α-GAPDH 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 검출 항체 인큐베이션 후에, 웰을250 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 세척하였다. 세척 후에, 150 ㎕의 1 x 판독 완충제 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 각각의 웰에 첨가하고, SECTOR™ 이미저 6000 이미지 리더(Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
수집된 데이터를 분석하였고 PLA 2.0 소프트웨어(Stegmann Systems, GmbH, Germany)를 사용한 점을 제외하고는 실시예 V에 기재된 바와 같이, 정규화된 데이터로부터의 상대적인 효력을 계산하였다.
비교를 위하여, 실시예 VI에 기재된 바와 같이 싱글플렉스 ECL 샌드위치 ELISA를 사용하여 SNAP-25 절단 생성물의 검출을 또한 실시하였다.
결과는 싱글플렉스 ECL 샌드위치 ELISA로부터 얻은 SNAP-25 데이터, 멀티플렉스 ECL 샌드위치 ELISA로부터 얻은 비-정규화된 SNAP-25 데이터가, 투여량-반응 곡선에 피팅되지 않는 하나의 이상치(outlier) 샘플 투여량을 보임을 나타낸다. 그러나, GAPDH에 대한 SNAP-25 데이터의 정규화는 더 우수한 곡선 핏(fit)을 제공하였으며 효력은 예상치에 더 가까웠다.
실시예 IX
멀티플렉스 EC 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 SNAP-25 절단 생성물에 특이적인 α-SNAP-25 단클론성 항체 및 상이한 단백질에 대한 제2 항체 쌍을 사용하여 SNAP-25 절단 생성물을 검출함으로써 BoNT/A 활성을 검출하는 멀티플렉스 면역-기반 방법을 예시한다.
BoNT/A로 처리된 세포로부터의 용해물을 실시예 VI에 기재된 바와 같이 제조하였다. α-SNAP-25 포획 항체 용액, α-SNAP-25 검출 항체 용액, 및 α-SNAP-25 고체상 지지체를 실시예 VII에 기재된 바와 같이 제조하였다.
α-GAPDH 포획 항체 용액을 제조하기 위하여, α-GAPDH 단클론성 항체 MAB374 (Millipore, Billerica, MA)를 정제된 항체로서 구입하였다. α-GAPDH 검출 항체 용액을 제조하기 위하여, 제조사의 사용설명서 (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)에 따라 α-GAPDH 다클론성 항체 G9545 (Sigma, St. Louis, MO)를 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 컨쥬게이팅하였다. 컨쥬게이션 반응, 농도 결정 및 보관은 실시예 VII에 기재된 바와 같았다.
제2 단백질에 특이적인 제2 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 제조하기 위하여, 1 ㎍/mL α-GAPDH 단클론성 항체 MAB374를 포함하는 대략 100 ㎕의 단클론성 항체 용액을 96-웰 그레이너(Greiner) 화이트 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 인큐베이팅한 후, 임의의 과잉의 항체 용액을 폐기하였다. 그 다음, 실온에서 1시간 동안 2% 애머샴 블로킹 시약 (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) 및 10% 염소 혈청 (VWR, West Chester, PA)을 포함하는 150 ㎕의 블로킹 완충제를 첨가하여 α-GAPDH 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하였다. 블로킹 완충제를 폐기하고 플레이트를 엎어놓고 페이퍼 타월로 두드려 건조시켰다. 그 다음, 포획 항체-결합된 웰을 블로킹하고 BoNT/A 활성을 검출하는 데 직접 사용하였다.
멀티플렉스 CL 샌드위치 ELISA 분석에 의해서, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 50 ㎕의 용해물을, α-SNAP-25 포획 항체 고체상 지지체 및 α-GAPDH 포획 항체 고체상 지지체의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 4 ℃에서 2-4시간 내지 하룻밤 동안 500 rpm으로 회전시키면서 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.05 % TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2% 애머샴 블로킹 시약 및 1 mg/mL α-SNAP-25 다클론성 항체/HRP를 포함하는, 100 ㎕의 검출 항체 용액을 α-SNAP-25 포획 항체 고정상 지지체의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 650 rpm으로 회전시키면서 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 유사하게, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2% 애머샴 블로킹 시약 및 0.25 mg/mL α-GAPDH G9545 다클론성 항체/HRP (Sigma Co., St Louis, MO)를 포함하는 100 ㎕의 검출 항체 용액을 α-GAPDH 포획 항체 고정상 지지체의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 650 rpm으로 회전시키면서 진탕기에 두었다. 검출 항체 인큐베이션 후, 200 ㎕ 1 x PBS, 0.05% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 웰을 3회 세척하였다. 세척 후, 100 ㎕의 SuperSignal ELISA Pico 1:1 혼합물 (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)을 각각의 웰에 첨가하고 395 nm에서 루미노미터(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 수집된 데이터를 분석하였고 실시예 V에 기재된 바와 같이 EC50를 계산하였다. 결과는 검출된 α-SNAP-25항체-항원 복합체의 양에 대해 수집된 데이터 포인트가 검출된 α-GAPDH 항체-항원 복합체의 양에 대해 정규화된 후에 더 잘 피팅되었으며, 그에 의해서 더욱 정확한 판독을 제공하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 EC50에서 평균 1.0 pM의 BoNT/A (약 0.3 pM 내지 약 2.0 pM의 범위)가, 약 15:1 내지 약 20:1의 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비 및 약20:1 내지 약 500:1의 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비로 검출되었음을 나타낸다.
유사한 디자인을 동일한 α-GAPDH 항체쌍을 갖는 ECL 샌드위치 ELISA를 사용하여, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 P1 잔기에서 카르복실-말단울 갖는 SNAP-25 절단 생성물에 특이적인 α-SNAP-25 단클론성 항체를 사용해 SNAP-25 절단 생성물을 검출하여 BoNT/A 활성을 검출하는 멀티플렉스 면역-기반 방법에 사용할 수 있다.
실시예 X
BoNT /A의 피코몰 양을 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 피코몰 양의 BoNT/A 약학 제품, 예를 들어, BOTOX® DYSPORT®/RELOXIN®, PURTOX®,, XEOMIN®, NEURONOX®, 또는 BTX-A를 검출할 수 있는, BoNT/A 활성을 검출하는 면역-기반 방법을 실시하는 방법을 예시한다.
1. ECL 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /를 검출하는 면역-기반 방법.
BoNT/A로 처리된 세포로부터의 용해물을 제조하기 위하여, 약 50,000 내지 150,000의 계통확립 세포주로부터의 세포를, 최소 필수 배지, 얼스 염을 갖는 2 mM GlutaMAX™ I, 1 x B27 보충물, 1 x N2 보충물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 10 mM HEPES 및 25 ㎍/mL GT1b를 포함하는 100 ㎕의 무혈청 배지를 포함하는 폴리-D-리신 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다 (실시예 I 및 II 참조). 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 2일 내지 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 분화된 세포로부터의 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 무 염화나트륨 용액에 재구성된, 0 (비처리 샘플), 0.03 pM, 0.1 pM, 0.3 pM, 0.9 pM, 2.8 pM, 8.3 pM, 또는 25 pM의 BoNT/A 약학 제품; 또는 무 염화나트륨 배지에 재구성된, 0 (비처리 샘플), 0.7 U/mL, 2.1 U/mL, 6.2 U/mL, 18.5 U/mL, 55.6 U/mL, 166.7 U/mL 또는 500 U/mL의 BoNT/A 약학 제품 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. BoNT/A 약학 제품은 염화나트륨을 포함하기 때문에, 배양 배지에 대한 첨가는 세포 활성(viability)에 해로운 고장성(hypertonic) 배지를 야기하였다. 고장성 문제를 해결하기 위하여, 염화나트륨 없이 제조된 200 ㎕의 MEM 배지를 사용해 BoNT/A 약학 제품을 재구성하여 25 pM BoNT/A (500 U/mL)의 최종 농도를 얻었다. 사용된 최고 농도(25 pM 또는 500 U/mL)에 존재하는 부형제의 양에 맞추어 희석물을 제조하는 데 사용된 배지에 염화나트륨을 첨가하여 투여량-반응 곡선을 따라 모든 농도에 대해 매트릭스를 일정하게 유지하였다. 24시간 처리 후에, 세포를 세척하고, 독소없이 추가로 2일간 인큐베이팅하였다. 세포를 수확하기 위하여, 배지를 흡입하고, 1 x PBS로 세척하고, 각각의 웰에 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100을 포함한느 30 ㎕의 용해 완충제를 첨가하여 용해하고, 플레이트를 500 rpm로 회전시키면서 진탕기에서 30분간 4 ℃에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 4000 rpm에서 20분간 4 ℃에서 원심분리하여 세포 부스러기를 펠렛화하고 상청액을 포획 항체 코팅된 96-웰 플레이트로 옮겨서 검출 단계를 수행하였다.
α-SNAP-25 포획 항체 용액, α-SNAP-25 검출 항체 용액, 및 SNAP-25 절단 생성물에 대해 특이적인 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 실시예 VI에 기재된 바와 같이 제조하였다.
ECL 샌드위치 ELISA 분석에 의해, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 보과된 플레이트로부터의 블로킹 완충제를 흡입하고, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 25 ㎕의 용해물을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 4 ℃에서 2시간 아니면 24시간동안 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1 % TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척후, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2% 애머샴 블로킹 시약을 포함하는 25 ㎕의 5 ㎍/mL α-SNAP-25 검출 항체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. α-SNAP-25 검출 항체 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 세척하였다. 세척 후에, 플레이트를 처리하고, 수집된 데이터를 분석하고 EC50를 실시예 V에 기재된 바와 같이 계산하였다. 이러한 결과는 EC50에서 평균 1.0 pM의 BoNT/A (약 0.3 pM 내지 약 2.0 pM의 범위)가, 약 15:1 내지 약 20:1의 하위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비 및 약20:1 내지 약 500:1의 상위 점근선에 대한 신호-대-잡음 비로 검출되었음을 나타낸다 (도 9). 이러한 방법은 실시예 VIII에 기재된 바와 같이 멀티플렉스 방식으로 또한 실시할 수 있다.
2. CL 샌드위치 ELISA 를 사용하여 BoNT /A를 검출하는 면역-기반 방법
BoNT/A로 처리된 세포로부터의 용해물 및 α-SNAP-25 포획 항체 용액을 실시예 VI에 기재된 바와 같이 제조하였다. α-SNAP-25 검출 항체 용액, 및 SNAP-25 절단 생성물에 특이적인 포획 항체를 포함하는 고체상 지지체를 실시예 VII에 기재된 바와 같이 제조하였다.
CL 샌드위치 ELISA 분석에 의해서, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, BoNT/A로 처리된 세포로부터의 25 ㎕의 용해물을 각각에 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 4 ℃ 에서 2시간 아니면 24시간 동안 500 rpm으로 회전시키면서 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 세포 용해물을 흡입하고 각각의 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.05 % TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 헹구어서, 플레이트 웰을 3회 세척하였다. 세척 후에, 1 x PBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트) 중 2% 애머샴 블로킹 시약을 포함하는 1 mg/mL α-SNAP-25 다클론성 항체/HRP 검출 항체 용액 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 650 rpm으로 회전시키면서 진탕기에서 인큐베이팅하였다. 검출 항체 인큐베이션 후에, 웰을 200 ㎕ 1 x PBS, 0.05% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로 3회 세척하였다. 세척 후, 100 ㎕의 SuperSignal ELISA Pico 1:1 혼합물 (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)을 각각의 웰에 첨가하고 395 nm에서 루미노미터(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 수집된 데이터를 분석하였고 실시예 V에 기재된 바와 같이 EC50를 계산하였다. 이러한 방법은 실시예 VIII에 기재된 바와 같이 멀티플렉스 방식으로 또한 실시할 수 있다.
실시예 XI
중화 α- BoNT /A 항체를 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 중화 α-BoNT/A 항체의 존재를 검출할 수 있는 면역-기반 방법을 실시하는 방법을 예시한다.
BoNT/A는 현재 근육 과활동성(muscle hyperactivity), 안과, 위장관, 비뇨기과 및 미용 등의 광범위한 의학 처방에 사용된다. BoNT/A의 반복되는 장기간의 치료로 인해, 환자는 독소에 대한 중화 α-BoNT/A 항체를 발현하여 면역저항성을 가질 수 있다. 중화 α-BoNT/A 항체는 BoNT/A의 결합 도메인(HC) 및/또는 전위 도메인(HN) 에 결합하여 뉴런 세포로의 독소의 흡수를 중단시킴으로써 BoNT/A 활성을 억제한다. 일부 연구는 BoNT/A의 제형으로 디스토니아에 대해 반복적으로 치료된 최대 5-10%의 환자가 중화 α-BoNT/A 항체의 발현으로 인한 면역저항성을 갖는다고 제시하였다. 환자의 혈액에서 중화 α-BoNT/A 항체 의 존재를 결정하는 확립된 검정은 마우스 보호 검정(mouse protection assay; MPA)이다. 최근에는, 마우스에 주사하기 전에 BoNT/A를 환자의 혈청과 인큐베이팅한다. 항체의 존재는 동물에서 신경독에 대한 반응의 감소에 의해 명백해진다. MPA는 생체 내 기반 검정이기 때문에, 비용이 더 많이 들며 세포 기반 검정으로 대체된다면 시간 효율적일 것이다.
중화 α-BoNT/A 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위하여, 본 명세서에 개시된 BoNT/A 활성을 결정하는 면역-기반 방법을 사용할 수 있다. 한 가지 방법은 웨스턴 블롯 검출 방법을 사용하여, 다양한 농도의 BoNT/A 처리 후의 SNAP-25 절단 생성물의 양을 결정하는 것이고, 다른 방법은 ECL 샌드위치 ELISA 검출 방법을 사용하는 것이다.
중화 α-BoNT/A 항체를 포함하는 샘플 및 α-BoNT/A 중화 항체가 없는 것으로 알고 있는 네거티브 대조구 샘플을 제조하기 위하여, 상이한 개체들의 혈액으로부터 혈청을 단리하였다. 면역화를 거절하는 개체를 나이브(naive) 개체라고 하였다. 면역화를 받아들이는 개체를 면역화 개체라고 하였다. 혈액을 응고 활성화제(clot activator) (BD Biosciences, Bedford, MA)와 함께 혈청 튜브에 넣었다. 1000xg에서 10분간 4 ℃ 에서 원심분리하여 혈청을 얻었다. 2명의 공여자의 혈청을 얻었다: 한 개체는 BoNT/A에 면역화되었고 다른 개체는 그렇지 않았다.
BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리된 세포로부터의 용해물을 제조하기 위하여, SiMa 세포를 폴리-D-리신 96-웰 플레이트에 시딩하고 실시예 VI에 기재된 바와 같이 분화시켰다. 무혈청 배지를 사용하여 2.5배 증분에 의해 인간 혈청을 1:100 -1:152,000로 계열 희석하였다. BoNT/A를 0.5 mL SiMa 배양 배지에 10 pM의 농도로 현탁하였다. α-BoNT/A 항체 및 BoNT/A를 포함하는 배지를 혼합하고 15분간 또는 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 세포를 인간 혈청을 갖는 BoNT/A로 2시간 동안 처리한 다음 신선한 성장 배지에서 15시간 동안 인큐베이팅하였다. 추가적인 인큐베이션 시간 없이 세포를 또한 15시간 동안 처리하였다.
웨스턴 블롯 분석에 의해서, 절단된 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 세포를 50 ㎕의 SDS-PAGE로딩 완충액에 현탁한 후 95 ℃에서 5분간 가열하였다. 수확된 샘플을 12 % 26-웰 기준 젤 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하는 SDS-PAGE으로 분리하고, 래빗 다클론성 α-SNAP-25197 항체 혈청을 1차 항체(실시예 IV 참조)로 사용한 점을 제외하고는 실시예 I에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 분석하였다. 결과는 시험 샘플이 네거티브 대조구 샘플과 비교하여 SNAP25의 감소된 절단을 야기하였음을 나타내며, 이는 면역화된 개체로부터의 혈청이 중화 α-BoNT/A 항체를 포함하였음을 입증한다.
ECL 샌드위치 ELISA에 의해서, 절단 SNAP-25 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 각각의 웰로부터 배지를 제거하고 실시예 V에 기재된 바와 같이 세포를 용해하였다. α-SNAP-25 포획 항체 용액, α-SNAP-25 검출 항체 용액, 및 α-SNAP-25 고체상 지지체를 실시예 VII에 기재된 바와 같이 제조하였다. 상청액을 α-SNAP-25 고체상 지지체로 옮기고 실시예 V에 기재된 바와 같이 ECL 샌드위치 ELISA 검정을 실시하였다. 수집된 데이터를 분석하였고, EC50 가 BoNT/A의 활성을 그 최대치의 1/2로 억제하는 데 필요한 혈청 희석이며, 신호 (SignalMax) 대 최소 신호(SignalMin)의 비는 혈청의 최고 희석물을 사용하여 얻은 SNAP-25 절단 생성물 신호를 최소 혈청 희석물을 사용하여 얻은 신호로 나누어 얻는 것을 제외하고는 실시예 V에 기재된 바와 같이 EC50를 계산하였다.
결과는 인간 혈청 중의 중화 α-BoNT/A의 존재를 검출할 수 있음을 나타낸다. 면역화된 개체로부터의 혈청 중에서 인큐베이팅된 BoNT/A 복합체의 활성은 혈청 희석이 감소함에 따라 감소한 반면, 나이브 혈청의 존재는 시험된 모든 희석에서 검정에 영향을 주지 않았다. 이러한 검정은 제형화된 BoNT/A 약학 제품, 벌크 BoNT/A 복합체 또는 정제된 신경독을 사용하여 실시될 수 있다.
실시예 XII
조작된 세포( Engineered Cell )를 사용하여 BoNT /A 활성을 검출하는 면역-기반 방법
하기 실시예는 BoNT/A 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 계통확립 세포주로부터의 세포 내로 도입하여 BoNT/A 중독에 대한 감수성을 더욱 개선하거나 BoNT/A 흡수 능력을 개선하는 방법을 예시한다.
계통확립 세포주를 포함하는 세포 내로 외인성 BoNT/A 수용체를 도입하기 위하여, SEQ ID NO: 59의 FGFR2를 인코딩하는 SEQ ID NO: 130의 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 SEQ ID NO: 25의 FGFR3을 인코딩하는 SEQ ID NO: 139의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 구조체를, 양이온 지질법(cationic lipid method)을 사용하여 계통확립 세포주로부터의 세포 내로 트랜스펙팅하였다. 계통확립 세포주로부터의 적합한 밀도 (약 5 x106 세포)의 세포를 5 mL의 완전 배양 배지를 포함하는 100 mm 조직 배양 접시에 플레이팅하고, 세포가 트랜스펙션에 적합한 밀도에 도달할 때까지 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 성장시켰다. 실온에서 5분간 인큐베이팅된 60 ㎕의 LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 1.5 mL의 OPTI-MEM 감소 혈청 배지를, FGFR2 또는 FGFR3을 인코딩하는 24 ㎍의 발현 구조체, 또는 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 대조구 발현 구조체를 포함하는 1.5 mL의 OPTI-MEM 감소 혈청 배지에 첨가하여, 3 mL 트랜스펙션 용액을 제조하였다. 이러한 트랜스펙션 혼합물을 실온에서 약 30분 동안 인큐베이팅하였다. 완전 배지를 3 mL 트랜스펙션 용액으로 대체하고 세포를 8 시간 동안 5% 이산화탄소 하에서 37 ℃ 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다. 트랜스펙션 배지를 3 mL의 신선한 완전 배양 배지로 대체하고 세포를 약 24시간 동안 5% 이산화탄소 하에서 37 ℃ 인큐베이터에서 인큐베이팅하였다, 배지를, 약 1mM G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 3 mL의 신선한 완전 배양 배지로 대체하였다. 세포를 약 1주 동안 5% 이산화탄소 하에서 37 ℃ 인큐베이터에서 인큐베이팅하고, 오래된 배지를 0.5 mM G418을 포함하는 신선한 완전 배양 배지로 대체하였다. 일단 항생제 저항성(antibiotic-resistant) 콜로니가 확립되면, 이러한 세포가 6 내지 20x105 세포/mL의 밀도에 도달할 때까지, 약 0.5 mM G418로 보충된 신선한 완전 배양 배지를 포함한 새로운 100 mm 배양 플레이트에 저항성 콜로니를 다시 플레이팅하였다.
BoNT/A 수용체의 과발현(overexpression)이 BoNT/A 중독에 대한 세포 감수성을 개선하였는 지, 또는 BoNT/A 흡수 능력을 개선하였는 지를 결정하기 위하여, 상이한 투여량의 BoNT/A 복합체로 처리된 세포를 사용하여 투여량-반응 곡선을 생성하였다. BoNT/A로 처리된 세포로부터의 용해물을 제조하기 위하여, 계통확립된 트랜스펙팅된 세포주로부터의 적합한 밀도의 세포를, 100 ㎕의 적합한 무혈청 배지(표 5)를 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 성장 정지 및 신경돌기 연장과 같은 표준의 일상적인 형태학적 기준으로 평가할 때, 세포가 분화될 때까지(대략 3일), 5% 이산화탄소 하에 37 ℃ 인큐베이터에서 이러한 세포를 인큐베이팅하였다. 분화된 세포로부터의 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, SiMa 또는 PC12 트랜스펙팅된 세포주를 포함하는 세포에 대해서는, 0 (비처리 샘플), 0.01 nM, 0.04 nM, 0.12 nM, 0.37 nM, 1.1 nM, 3.3 nM, 및 10 nM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나, Neuro-2a 트랜스펙팅된 세포주를 포함하는 세포에 대해서는, 0 (비처리 샘플), 0.14 nM, 0.40 nM, 1.2 nM, 3.7 nM, 11 nM, 33 nM, 및 100 nM의 BoNT/A 복합체 중 어느 하나를 포함하는 신선한 배지로 대체하였다. 세포를 BoNT/A 함유 배지로 6시간 처리한 다음 신선한 배지로 15시간 인큐베이팅하고, 40 ㎕의 2 x SDS-PAGE 로딩 완충제를 첨가하고 95 ℃에서 5분간 플레이트를 가열하여 수확하였다.
SNAP-25 절단 생성물의 존재를 검출하기 위하여, 수확된 샘플을12 % 26-웰 기준 젤 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하는 SDS-PAGE으로 분리하고, 1차 항체는 래빗 다클론성 α-SNAP-25 항체 혈청(실시예IV) (AGN, 다클론성 항체)의 1:1,000 희석액, α-FGFR2 래빗 다클론성 C-17 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:500 희석액, 또는 α-FGFR3 래빗 다클론성 C-15 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 1:500 희석액을 사용한 점을 제외하고는 실시예 I에 기재된 바와 같이 각각의 수확된 샘플로부터의 분취물을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 각각의 샘플로부터의 관심 단백질의 강도(intensity)는 Image Quant (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 계산하였고, 각각의 세포주에 대한 EC50은 SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 추산하였다.
결과는 FGFR2 또는 FGFR3로 트랜스펙팅된 세포가 GFP로 트랜스펙팅된 세포보다 BoNT/A에 더욱 민감하였으며, 또한 더 높은 수준의 SNAP-25 절단을 보였음을 나타낸다(표 14). FGFR2 또는 FGFR3를 과발현하는 세포에 대한 EC50 값은 GFP를 과발현하는 세포에 의해 나타나는 EC50 값보다 낮았고, 이는 FGFR2 또는 FGFR3의 도입이 BoNT/A 중독에 대한 세포 감수성을 개선하거나 또는 BoNT/A 흡수 능력을 개선하였음을 나타낸다.
표 14. BoNT /A 중독 또는 BoNT /A 흡수에 대한 세포 감수성에 대한 외인성 BoNT /A 수용체 도입의 효과
세포 트렌스펙팅된 유전자 EC 50 ( nM ) 최대 신호
SiMa GFP 0.0812 ± 0.010 22,733,787
SiMa FGFR2 0.0459 ± 0.003 26,136,578
SiMa FGFR3 0.0377 ± 0.006 24,326,271
PC-12 GFP 3.3362 ± 1.881 26,956,063
PC-12 FGFR2 0.3429 ± 0.059 25,376,114
PC-12 FGFR3 0.2634 ± 0.026 24,102,459
Neuro-2a GFP 61.80 ± 9.710 4,605,974
Neuro-2a FGFR2 31.59 ± 8.800 23,279,765
Neuro-2a FGFR3 11.55 ± 5.240 28,347,413
SNAP-25 절단 생성물의 존재의 검출은 실시예 VI-X에 기재된 바와 같은 샌드위치 ELISA를 사용하여 실시될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Fernandez-Salas, Ester Wang, Joanne Garay, Patton E. Wong, Lina S. Hodges, D. Dianne Aoki, Kei Roger <120> Immuno-Based Botulinum Toxin Serotype A Activity Assays <130> 18383 (BOT) <150> US 61/036,723 <151> 2008-03-14 <160> 148 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1296 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 1 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe 450 455 460 Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu 465 470 475 480 Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu 485 490 495 Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro 500 505 510 Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu 515 520 525 Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu 530 535 540 Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu 545 550 555 560 His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu 565 570 575 Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys 580 585 590 Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu 595 600 605 Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr 610 615 620 Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala 625 630 635 640 Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu 645 650 655 Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala 660 665 670 Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys 675 680 685 Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu 690 695 700 Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys 705 710 715 720 Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu 725 730 735 Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn 740 745 750 Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp 755 760 765 Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile 770 775 780 Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met 785 790 795 800 Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly 820 825 830 Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp 835 840 845 Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser 850 855 860 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn 865 870 875 880 Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser 885 890 895 Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn 900 905 910 Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu 915 920 925 Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser 930 935 940 Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn 945 950 955 960 Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val 965 970 975 Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu 980 985 990 Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005 Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu 1010 1015 1020 Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro 1025 1030 1035 1040 Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys 1045 1050 1055 Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe 1060 1065 1070 Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr 1075 1080 1085 Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr 1090 1095 1100 Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn 1105 1110 1115 1120 Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu 1125 1130 1135 Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser 1140 1145 1150 Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly 1155 1160 1165 Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val 1170 1175 1180 Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn 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gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcc tcgaggcctg gccattgcat acgttgtatc 240 catatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaac attaccgcca tgttgacatt 300 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 360 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 420 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 480 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 540 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 600 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 660 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 720 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 780 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 840 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 900 cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 960 tccgcgggcc accatggagg gcccggttac cggtaccgga tccagatatc tgggcggccg 1020 ctcagcaagc ttcgcgaatt cgggaggcgg aggtggagct agcaaaggag aagaactctt 1080 cactggagtt gtcccaattc ttgttgaatt agatggtgat gttaacggcc acaagttctc 1140 tgtcagtgga gagggtgaag gtgatgcaac atacggaaaa cttaccctga agttcatctg 1200 cactactggc aaactgcctg ttccatggcc aacactagtc actactctgt gctatggtgt 1260 tcaatgcttt tcaagatacc cggatcatat gaaacggcat gactttttca agagtgccat 1320 gcccgaaggt tatgtacagg aaaggaccat cttcttcaaa gatgacggca actacaagac 1380 acgtgctgaa gtcaagtttg aaggtgatac ccttgttaat agaatcgagt taaaaggtat 1440 tgacttcaag gaagatggca acattctggg acacaaattg gaatacaact ataactcaca 1500 caatgtatac atcatggcag acaaacaaaa gaatggaatc aaagtgaact tcaagacccg 1560 ccacaacatt gaagatggaa gcgttcaact agcagaccat tatcaacaaa atactccaat 1620 tggcgatggc cctgtccttt taccagacaa ccattacctg tccacacaat ctgccctttc 1680 gaaagatccc aacgaaaaga gagaccacat ggtccttctt gagtttgtaa cagctgctgg 1740 gattacacat ggcatggatg aactgtacaa catcgatgga ggcggaggtg gaccttttgt 1800 taataaacaa tttaattata aagatcctgt aaatggtgtt gatattgctt atataaaaat 1860 tccaaatgca ggacaaatgc aaccagtaaa agcttttaaa attcataata aaatatgggt 1920 tattccagaa agagatacat ttacaaatcc tgaagaagga gatttaaatc caccaccaga 1980 agcaaaacaa gttccagttt catattatga ttcaacatat ttaagtacag ataatgaaaa 2040 agataattat ttaaagggag ttacaaaatt atttgagaga atttattcaa ctgatcttgg 2100 aagaatgttg ttaacatcaa tagtaagggg aataccattt tggggtggaa gtacaataga 2160 tacagaatta aaagttattg atactaattg tattaatgtg atacaaccag atggtagtta 2220 tagatcagaa gaacttaatc tagtaataat aggaccctca gctgatatta tacagtttga 2280 atgtaaaagc tttggacatg aagttttgaa tcttacgcga aatggttatg gctctactca 2340 atacattaga tttagcccag attttacatt tggttttgag gagtcacttg aagttgatac 2400 aaatcctctt ttaggtgcag gcaaatttgc tacagatcca gcagtaacat tagcacatga 2460 acttatacat gctggacata gattatatgg aatagcaatt aatccaaata gggtttttaa 2520 agtaaatact aatgcctatt atgaaatgag tgggttagaa gtaagctttg aggaacttag 2580 aacatttggg ggacatgatg caaagtttat agatagttta caggaaaacg aatttcgtct 2640 atattattat aataagttta aagatatagc aagtacactt aataaagcta aatcaatagt 2700 aggtactact gcttcattac agtatatgaa aaatgttttt aaagagaaat atctcctatc 2760 tgaagataca tctggaaaat tttcggtaga taaattaaaa tttgataagt tatacaaaat 2820 gttaacagag atttacacag aggataattt tgttaagttt tttaaagtac ttaacagaaa 2880 aacatatttg aattttgata aagccgtatt taagataaat atagtaccta aggtaaatta 2940 cacaatatat gatggattta atttaagaaa tacaaattta gcagcaaact ttaatggtca 3000 aaatacagaa attaataata tgaattttac taaactaaaa aattttactg gattgtttga 3060 attttataag ttgctatgtg taagagggat aatcacttcg aaatgaacgc gttggcccta 3120 ttctatagtg tcacctaaat gctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 3180 gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 3240 ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 3300 ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 3360 ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct 3420 ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 3480 cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 3540 cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg ggcatccctt 3600 tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 3660 gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 3720 cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 3780 attcttttga tttataaggg attttgggga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 3840 tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa 3900 gtccccaggc tccccaggca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa 3960 ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 4020 attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca 4080 gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg 4140 ccgcctctgc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 4200 tttgcaaaaa gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg atctgatcaa gagacaggat 4260 gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 4320 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<400> 74 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ser 20 25 30 Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Leu Phe Pro Gly Asn Gly Asn Phe Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Lys 85 90 95 Lys Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 75 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 75 caggttcagc tgcagcagtc cgacgctgag ttggtgaaac ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaggg cttctggcta caccttcact gaccattcta ttcactgggt gaagcagcag 120 cctggccagg gcctggaatg gatcggatat atttttcccg gaaatggaaa tattgaatac 180 aatgacaaat tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccgg cactgcctac 240 atgcagctca acagcctgac atctgaggat tctgcagtgt atttctgtaa aaggatgggg 300 tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca 336 <210> 76 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ser 20 25 30 Ile His Trp Val Lys Gln Gln Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Phe Pro Gly Asn Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Asp Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Lys 85 90 95 Arg Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 77 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 77 caggtcaagc tgcaggagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact aactatgtta tacactgggt gaagcaaaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg ctctaagtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggcctcactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagacatctc 300 gctaatacct actactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 78 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Val 20 25 30 Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg His Leu Ala Asn Thr Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 79 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 79 caggtcaagc tgcaggagtc tggcgctgag ttggtgaaac ctggggcttc agtgaagatc 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gaccattcta ttcactgggt gaagcagaag 120 cctggacagg gcctagaatg gattggatat ctttttcccg gaaatggtaa ttttgagtac 180 aatgaaaaat tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cactgtctac 240 atgtacctca acagcctgac atctgaggat tctgcagtgt atttctgtaa aaggatgggg 300 tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca 336 <210> 80 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ser 20 25 30 Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Leu Phe Pro Gly Asn Gly Asn Phe Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Lys 85 90 95 Arg Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 81 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 81 gtgaagctgc aggagtctgg acctgaactg gtaaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 60 tgcaaggctt ctggatacac attcactaac tatgttatac actgggtgaa gcaaaagcct 120 gggcagggcc ttgagtggat tggatatatt aatccttaca atgatggctc taagtacaat 180 gagaagttca aaggcaaggc ctcactgact tcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240 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ggaaaatctc ctcagctccg ggtctataat gcaaaatcct tagcagaagg tgtgccatca 180 agtttcaatg tcagtgtatc aggcacacag ttttctctga agatcaatag cctgcagcct 240 gaagattttg ggacttatca ctgtcaacac cattatggta ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaggc tggaaataag acgg 324 <210> 86 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Thr Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Phe Val Trp Ser Gln Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Arg Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Ser Phe Asn Val 50 55 60 Ser Val Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr His Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Arg Arg 100 105 <210> 87 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 87 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcgtaca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120 caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300 tcggaggggg gcaccaagct ggaaatcaaa cggaga 336 <210> 88 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 88 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg 100 105 110 <210> 89 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 89 gacatcaaga tgacccagtc tccatcctcc atgtatgcat cgctgggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120 tggaaatctc ctaagaccct gatctattat gcaacaagct tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240 gacgatacag caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgggct 327 <210> 90 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 91 <211> 327 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 91 gatgttgtgc taactcagtc tcctgccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtcagt 60 ctttcctgca gggccagcca aaatattggc aactacctac actggtatca acagaaatca 120 catgagtctc caaggcttct catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggatc agtcacagat ttcactctca atatcaacag tgtggagact 240 gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtgacacct ggcctctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa acgggct 327 <210> 92 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 92 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Thr Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93 Thr Phe Thr Asp His Ser Ile His 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 94 Thr Phe Thr Asn Tyr Val Ile 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agtggtaaaa tgcaaatgca atccatattt gttaggatgg tcaggtctca tgagaaatct 3660 atgctatgtg tccagagctt ttgaaacaga gtccattgga gtgggagtta gggagtgtag 3720 tggatgccaa atatgttttt cttcagtgct taagagaact gtttcctgaa gtccagcttt 3780 gaacataaac aggggtgtgg gttgggggag gagcttagga caaacctctc tgatgaaggt 3840 cagcaataga ctgaagtctt gactgcatgg aagaggaaaa acatcagaac tgtctgacaa 3900 tggaggggac agtgagctac gcacaactgc cagcggaggt gaacttgcac ctgcccaggc 3960 cggatgaaca tcagcctgca agaactagtt gtttgagttg atttgcagtg ctctcaatgg 4020 gcaagtgcca cattttccct ggcagagatc tccaaaaatt taaaacagaa taataatggc 4080 tatatcgagt gttttctcag tattggagaa atgcttaggt cctatgatag cttcgggaca 4140 tctttctgta attttcctca attaacgggt tggtaggggt aaatcttatg acacctttcc 4200 accgtcgatt tgagatcagt tttaatggtt aaaatgttta ctctccttct gtcaaccctc 4260 acctttttat ttacacccct cccttttttt ctgtacaggg agagaagaca tattgactct 4320 gactggacac cctgattcct ccaaatatat ataccactgt gtattaatct ttctctcagt 4380 gttttatagg agtactaaca tttattgctc tgtcaataat gaaaggctcg atgtaatata 4440 gctgtaattt actttccata tgaatacagt ggctaggttc ataaaagaga attgtgtgag 4500 tctgggatta ccacatctaa aacattattc tttaatggga taatacaatt cattgagcag 4560 ctaccactta aaaaacttgc aggacagtta gagcctgcat ttctagttaa gatggatctt 4620 gtaaatttaa aattggatta acattggagt gctggggtgg ctgcaataat ttgggggcta 4680 actccatttg gtttccaaga tctcacttct gcattatctt tatggctctt taaaccagcc 4740 acctagccaa tcaagggcaa ttcccatctc atccatcact caggtctttg taaagggtgc 4800 agccaagctc tgcagacttt tgcaggattg tctagcctga gtaccgggct acttcttaaa 4860 tgccgtcact cctgctgaga taaatgcgtc tttaaaaata gtctctgtgg caggtcactg 4920 ggggacaatg tacagcattc tggccatcca cttctttttc acttcatgtt ctaccccaag 4980 agactcccga tgtcggctgt ggagggttaa agggatgagg ctttcctttg tttagcaaat 5040 ctgttcacag ttcttgatga tgtattttat gatgcccagc ttggaaatag ttgctttcca 5100 tagtctcaac tgtattgtgt catctcctga tgctgatttt tgatcttttg ttttattaaa 5160 aataattagt gaaagaggtg tgcctatctg tgaagtttgt agtacatcat cctgaggtca 5220 tgtaacaagt aaaccccaac ccagcgttcc ctcctacgtt gtgttagttc attaaaacta 5280 aataataaaa ataactgtaa gaaaacctta a 5311 <210> 144 <211> 2362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 cactcagggc aagggtgtcc gacggctgga gcgttctgtt ttgaacccaa agtggatgat 60 gctgtcagag ctgaactact gaaaggaggc tgtgaaaatt tcccatcttc tcattggcca 120 tcagttgaga taagatggaa gactcttaca aggataggac ttcactgatg aagggtgcca 180 aggacattgc cagagaggtg aagaaacaaa cagtaaagaa ggtgaatcaa gctgtggacc 240 gagcccagga tgaatacacc cagaggtcct acagtcggtt ccaagatgaa gaagatgatg 300 atgactacta cccggctgga gaaacctata atggtgaggc caacgatgac gaaggctcaa 360 gtgaagccac tgaggggcat gatgaagatg atgagatcta tgagggggag tatcagggca 420 tccccagtat gaaccaagcg aaggacagca tcgtgtcagt ggggcagccc aagggcgatg 480 agtacaagga ccgacgggag ctggaatcag aaaggagagc tgacgaggaa gagttagccc 540 agcagtatga gctgataatc caagaatgcg gtcatggtcg ttttcagtgg gcccttttct 600 tcgtcctggg catggctctt atggcagacg gtgtagaggt gtttgtcgtt ggcttcgtgt 660 tacccagtgc tgagacagac ctctgcatcc caaattcagg atctggatgg ctaggcagca 720 tagtgtacct cgggatgatg gtgggggcgt tcttctgggg aggactggca gacaaagtgg 780 gaaggaaaca gtctcttctg atttgcatgt ctgtcaacgg attctttgcc ttcctttctt 840 catttgtcca aggttatggc ttctttctct tctgtcgctt actttctgga ttcgggattg 900 gaggagccat acccactgtg ttctcgtact ttgctgaagt cctggcccgg gaaaagcggg 960 gcgaacactt gagctggctc tgcatgttct ggatgatcgg tggcatctac gcctctgcca 1020 tggcctgggc catcatcccg cactacgggt ggagcttcag catgggatcg gcctaccagt 1080 ttcacagttg gcgtgtgttt gtcatcgtct gtgcactccc ctgtgtctcc tccgtggtgg 1140 ccctcacatt catgcctgaa agcccacgat tcttgttgga ggttggaaaa catgatgaag 1200 cttggatgat tctgaagtta attcatgaca ccaacatgag agcccggggt cagcctgaga 1260 aggtcttcac ggtaaacaaa ataaaaactc ctaaacaaat agatgagctg attgaaattg 1320 agagtgacac aggaacatgg tataggaggt gttttgttcg gatccgcacc gagctgtacg 1380 gaatttggtt gacttttatg agatgtttca actacccagt cagggataat acaataaagc 1440 ttacaattgt ttggttcacc ctgtcctttg ggtactatgg attatccgtt tggttccctg 1500 atgtcattaa acctctgcag tccgatgaat atgcattgct aaccagaaat gtggagagag 1560 ataaatatgc aaatttcact attaacttta caatggaaaa tcagattcat actggaatgg 1620 aatacgacaa tggcagattc ataggggtca agttcaaatc tgtaactttc aaagactctg 1680 tttttaagtc ctgcaccttt gaggatgtaa cttcagtgaa cacctacttc aagaactgca 1740 catttattga cactgttttt gacaacacag attttgagcc atataaattc attgacagtg 1800 aatttaaaaa ctgctcgttt tttcacaaca agacgggatg tcagattacc tttgatgatg 1860 actatagtgc ctactggatt tattttgtca actttctggg gacattggca gtattgccag 1920 ggaacattgt gtctgctctg ctgatggaca gaattgggcg cttaacaatg ctaggtggct 1980 ctatggtgct ttcggggatc agctgtttct tcctttggtt cggcaccagt gaatccatga 2040 tgataggcat gctgtgtctg tacaatggat tgaccatctc agcctggaac tctcttgacg 2100 tggtcactgt ggaactgtac cccacagacc ggagggcaac aggctttggc ttcttaaatg 2160 cgctatgcaa ggcagcagcc gtcctgggaa acttaatatt tggctctctg gtcagcatca 2220 ccaaatcaat ccccatcctg ctggcttcta ctgtgctcgt gtgtggagga ctcgttgggc 2280 tgtgcctgcc tgacacacga acccaggttc tgatgtaatg ggaaaaaaag ccatccttcc 2340 tgcgtttctt cctcctgccc tg 2362 <210> 145 <211> 2053 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 catctttgat gagggcagag ctcacgttgc attgaagacg aaacctcggg gaggtcaggc 60 gctgtctttc cttccctccc tgctcggcgg ctccaccaca gttgcaacct gcagaggccc 120 ggagaacaca accctcccga gaagcccagg tccagagcca aacccgtcac tgacccccca 180 gcccaggcgc ccagccactc cccaccgcta ccatggccga agacgcagac atgcgcaatg 240 agctggagga gatgcagcga agggctgacc agttggctga tgagtcgctg gaaagcaccc 300 gtcgtatgct gcaactggtt gaagagagta aagatgctgg tatcaggact ttggttatgt 360 tggatgaaca aggagaacaa ctcgatcgtg tcgaagaagg catgaaccat atcaaccaag 420 acatgaagga ggctgagaaa aatttaaaag atttagggaa atgctgtggc cttttcatat 480 gtccttgtaa caagcttaaa tcaagtgatg cttacaaaaa agcctggggc aataatcagg 540 acggagtggt ggccagccag cctgctcgtg tagtggacga acgggagcag atggccatca 600 gtggcggctt catccgcagg gtaacaaatg atgcccgaga aaatgaaatg gatgaaaacc 660 tagagcaggt gagcggcatc atcgggaacc tccgtcacat ggccctggat atgggcaatg 720 agatcgatac acagaatcgc cagatcgaca ggatcatgga gaaggctgat tccaacaaaa 780 ccagaattga tgaggccaac caacgtgcaa caaagatgct gggaagtggt taagtgtgcc 840 cacccgtgtt ctcctccaaa tgctgtcggg caagatagct ccttcatgct tttctcatgg 900 tattatctag taggtctgca cacataacac acatcagtcc acccccattg tgaatgttgt 960 cctgtgtcat ctgtcagctt cccaacaata ctttgtgtct tttgttctct cttggtctct 1020 ttctttccaa aggttgtaca tagtggtcat ttggtggctc taactccttg atgtcttgag 1080 tttcattttt cattttctct cctcggtggc atttgctgaa taacaacaat ttaggaatgc 1140 tcaatgtgct gttgattctt tcaatccaca gtattgttct tgtaaaactg tgacattcca 1200 cagagttact gccacggtcc tttgagtgtc aggctctgaa tctctcaaaa tgtgccgtct 1260 ttggttcctc atggctgtta tctgtcttta tgatttcatg attagacaat gtggaattac 1320 ataacaggca ttgcactaaa agtgatgtga tttatgcatt tatgcatgag aactaaatag 1380 atttttagat tcctacttaa acaaaaactt tccatgacag tagcatactg atgagacaac 1440 acacacacac acaaaacaac agcaacaaca acagaacaac aacaaagcat gctcagtatt 1500 gagacactgt caagattaag ttataccagc aaaagtgcag tagtgtcact tttttcctgt 1560 caatatatag agacttctaa atcataatca tcctttttta aaaaaaagaa ttttaaaaaa 1620 gatggatttg acacactcac catttaatca tttccagcaa aatatatgtt tggctgaaat 1680 tatgtcaaat ggatgtaata tagggtttgt ttgctgcttt tgatggctac gttttggaga 1740 gagcaatctt gctgtgaaac agtgtggatg taaattttat aaggctgact cttactaacc 1800 accatttccc ctgtggtttg ttatcagtac aattctttgt tgcttaatct agagctatgc 1860 acaccaaatt gctgagatgt ttagtagctg ataaagaaac cttttaaaaa aataatataa 1920 atgaatgaaa tataaactgt gagataaata tcattatagc atgtaatatt aaattcctcc 1980 tgtctcctct gtcagtttgt gaagtgattg acattttgta gctagtttaa aattattaaa 2040 aattatagac tcc 2053 <210> 146 <211> 2053 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 catctttgat gagggcagag ctcacgttgc attgaagacg aaacctcggg gaggtcaggc 60 gctgtctttc cttccctccc tgctcggcgg ctccaccaca gttgcaacct gcagaggccc 120 ggagaacaca accctcccga gaagcccagg tccagagcca aacccgtcac tgacccccca 180 gcccaggcgc ccagccactc cccaccgcta ccatggccga agacgcagac atgcgcaatg 240 agctggagga gatgcagcga agggctgacc agttggctga tgagtcgctg gaaagcaccc 300 gtcgtatgct gcaactggtt gaagagagta aagatgctgg tatcaggact ttggttatgt 360 tggatgaaca aggagaacaa ctggaacgca ttgaggaagg gatggaccaa atcaataagg 420 acatgaaaga agcagaaaag aatttgacgg acctaggaaa attctgcggg ctttgtgtgt 480 gtccctgtaa caagcttaaa tcaagtgatg cttacaaaaa agcctggggc aataatcagg 540 acggagtggt ggccagccag cctgctcgtg tagtggacga acgggagcag atggccatca 600 gtggcggctt catccgcagg gtaacaaatg atgcccgaga aaatgaaatg gatgaaaacc 660 tagagcaggt gagcggcatc atcgggaacc tccgtcacat ggccctggat atgggcaatg 720 agatcgatac acagaatcgc cagatcgaca ggatcatgga gaaggctgat tccaacaaaa 780 ccagaattga tgaggccaac caacgtgcaa caaagatgct gggaagtggt taagtgtgcc 840 cacccgtgtt ctcctccaaa tgctgtcggg caagatagct ccttcatgct tttctcatgg 900 tattatctag taggtctgca cacataacac acatcagtcc acccccattg tgaatgttgt 960 cctgtgtcat ctgtcagctt cccaacaata ctttgtgtct tttgttctct cttggtctct 1020 ttctttccaa aggttgtaca tagtggtcat ttggtggctc taactccttg atgtcttgag 1080 tttcattttt cattttctct cctcggtggc atttgctgaa taacaacaat ttaggaatgc 1140 tcaatgtgct gttgattctt tcaatccaca gtattgttct tgtaaaactg tgacattcca 1200 cagagttact gccacggtcc tttgagtgtc aggctctgaa tctctcaaaa tgtgccgtct 1260 ttggttcctc atggctgtta tctgtcttta tgatttcatg attagacaat gtggaattac 1320 ataacaggca ttgcactaaa agtgatgtga tttatgcatt tatgcatgag aactaaatag 1380 atttttagat tcctacttaa acaaaaactt tccatgacag tagcatactg atgagacaac 1440 acacacacac acaaaacaac agcaacaaca acagaacaac aacaaagcat gctcagtatt 1500 gagacactgt caagattaag ttataccagc aaaagtgcag tagtgtcact tttttcctgt 1560 caatatatag agacttctaa atcataatca tcctttttta aaaaaaagaa ttttaaaaaa 1620 gatggatttg acacactcac catttaatca tttccagcaa aatatatgtt tggctgaaat 1680 tatgtcaaat ggatgtaata tagggtttgt ttgctgcttt tgatggctac gttttggaga 1740 gagcaatctt gctgtgaaac agtgtggatg taaattttat aaggctgact cttactaacc 1800 accatttccc ctgtggtttg ttatcagtac aattctttgt tgcttaatct agagctatgc 1860 acaccaaatt gctgagatgt ttagtagctg ataaagaaac cttttaaaaa aataatataa 1920 atgaatgaaa tataaactgt gagataaata tcattatagc atgtaatatt aaattcctcc 1980 tgtctcctct gtcagtttgt gaagtgattg acattttgta gctagtttaa aattattaaa 2040 aattatagac tcc 2053 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 antigen having a free carboxyl-terminus at the P1 residue of the scissile bond of the BoNT/A cleavage site <400> 147 Asp Glu Ala Asn Gln 1 5 <210> 148 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 antigen having a free carboxyl-terminus at the P1 residue of the scissile bond of the BoNT/A cleavage site <400> 148 Ile Asp Glu Ala Asn Gln 1 5

Claims (15)

  1. 캐리어, 유연성 링커(flexible linker) 및 SNAP-25 항원을 포함하는 조성물로서, 유연성 링커는 적어도 3개의 아미노산을 포함하며 SNAP-25 항원은 SEQ ID NO: 148을 포함하는 조성물.
  2. 제2항에 있어서, 유연성 링커 및 SNAP-25 항원 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 38인 조성물.
  3. 단리된 α-SNAP-25 항체로서,
    단리된 α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 포함하는 에피토프(eptiope)에 결합하고,
    α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 포함하지 않는 에피토프에 대한 결합 속도 상수가 1 x 101 M-1 s- 1미만이고;
    α-SNAP-25 항체는 상기 에피토프에 대한 평형 해리 상수가 0.450 nM 미만인, 단리된 α-SNAP-25 항체.
  4. 제3항에 있어서, 에피토프는 SEQ ID NO: 32인 단리된 α-SNAP-25 항체.
  5. a. SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, 또는 SEQ ID NO: 82를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b. SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, 또는 SEQ ID NO: 92를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
  6. a. SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 121, 또는 SEQ ID NO: 100을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b. SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, 또는 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
  7. 적어도 SEQ ID NO: 100의 VH CDR3, SEQ ID NO: 101의 VH CDR3, 또는 SEQ ID NO: 102의 VH CDR3를 포함하는 단리된 α-SNAP-25 항체.
  8. BoNT/A 활성을 검출하는 방법으로서,
    a. 계통확립 세포주로부터의 세포를 BoNT/A를 포함하는 샘플로 처리하는 단계 (여기서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 약 500 pM 이하의 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성임);
    b. 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계;
    c. SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 연결된 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 포함하는 에피토프에 결합하고, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 포함하지 않는 SNAP-25로부터의 에피토프에 대한 결합 속도 상수가 1 x 101 M-1 s-1 미만이고 α-SNAP-25 항체는 상기 에피토프에 대한 평형 해리 상수가 0.450 nM 미만임); 및
    d. BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 절단 생성물 및 α-SNAP-25 항체를 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계 (여기서, 항체-항원 복합체에 의한 검출은 BoNT/A 활성을 나타냄)를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, SNAP-25 절단 생성물은 SNAP-25197인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 항체-항원 복합체의 존재는 샌드위치 ELISA를 사용하여 검출하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 하위 점근선에서의 신호-대-잡음 비가 적어도 3:1이고, 상위 점근선에서의 신호-대-잡음 비가 적어도 10:1방법.
  12. 제8항에 있어서, 샘플은 최대 100 pM의 BoNT/A를 포함하는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 계통확립 세포주로부터의 세포는 약 100 pM 이하의 BoNT/A에 의한 BoNT/A 중독에 감수성인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 싱글플렉스 또는 멀티플렉스 방식으로 실시되는 방법.
  15. 포유류에서의 BoNT/A 면역저항성을 결정하는 방법으로서,
    a. α-BoNT/A 중화 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험될 포유류로부터 얻은 시험 샘플에 BoNT/A를 첨가하는 단계;
    b. 계통확립 세포주로부터의 세포를 시험 샘플로 처리하는 단계 (계통확립 세포주로부터의 세포는 BoNT/A 중독에 감수성임);
    c. 처리된 세포로부터, BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 절단 생성물을 포함하는 SNAP-25 구성요소를 단리하는 단계;
    d. SNAP-25 구성요소를 고체상 지지체에 고정된 α-SNAP-25 항체와 접촉시키는 단계 (여기서, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 포함하는 에피토프에 결합하고, α-SNAP-25 항체는 SNAP-25 절단 생성물로부터의 BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합의 카르복실-말단 글루타민을 포함하지 않는 SNAP-25로부터의 에피토프에 대한 결합 속도 상수가 1 x 101 M-1 s-1 미만이고 α-SNAP-25 항체는 상기 에피토프에 대한 평형 해리 상수가 0.450 nM 미만임);
    e. BoNT/A 절단 부위 분리가능한 결합으로부터의 카르복실-말단 글루타민을 갖는 SNAP-25 절단 생성물 및 α-SNAP-25 항체를 포함하는 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계;
    f. 시험 샘플 대신에 네거티브 대조구 샘플을 사용하여 단계 (b) 내지 (e)를 반복하는 단계(네거티브 대조구 샘플은 α-BoNT/A 중화 항체를 포함하지 않는 것으로 알고 있는 혈청 및 BoNT/A 를 포함함); 및
    g. 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양을 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양과 비교하는 단계(여기서, 단계 (e)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양이 단계 (f)에서 검출된 항체-항원 복합체의 양에 비하여 더 적은 것이 α-BoNT/A 중화 항체의 존재를 나타냄)를 포함하는 방법.
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