KR20060022646A - Ｓｔｏｐ-1 관련 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질환을 치료 및 예방하고 의료적 진단 및 연구하는데 유용한 STOP-1에 관련된 신규한 폴리펩티드, 항체, 길항제, 아고니스트, 증강제, 핵산 분자, 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 유용한 STOP-1에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 컨센서스 서열 및 특이 서열을 제공한다.

Description

ＳＴＯＰ-1 관련 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO STOP-1}
본원은 그 전체가 본원에 참고로 인용되고 2003년 4월 16일자로 출원된 미국 가출원 제60/463,656호로부터의 우선권을 주장한다.
본 발명은 STOP-1 폴리펩티드, 항체, 핵산 분자, 길항제, 작용제, 증강제 및 STOP-1 관련 조성물, 및 포유동물에게서 종양의 진단 및 치료를 위한 방법을 포함하는, 이를 이용하고 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 혈관형성(angiogenesis) 및 맥관신생(vaculogenesis)을 수반하는 장애들(예; 심혈관 및 종양 장애)의 진단 및 치료에 관한 것이다.
조절 불가능한 세포 증식은 다양한 세포 형태들에서 다수의 질병의 원인이다. 예를 들어, 암은 종양 덩어리를 형성하도록 증식되는 정상적 조직으로부터 유도된 비정상적인 또는 신생 세포의 수의 증가가 있을 경우 발생한다. 종양 세포는 종종 인접 조직에 침입하고 혈액 또는 림프계를 통하여 부위 림프절로 그리고 전이라 불리는 과정을 통하여 원위(distant) 부위로 퍼질 수 있다. 암성 증식에서, 세포는 정상 세포가 자라지 않는 조건하에서 증식한다. 암은 침윤성 및 공격성의 상이한 정도에 의해 특징져지는 다양한 형태로 자신을 나타낸다. 악성 종양(암)은 미국에서 심장병 다음으로 제2위의 사망의 원인이다(문헌 [Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)]).
암과 같은 세포 증식성 장애에 대한 새로운 치료법을 발견하기 위한 많은 연구들이 있었다. 최근의 진전에도 불구하고, 세포 증식을 조절하기 위한 새로운 세포 표적의 역할을 동정하고 이해하는 것과 치료의 대안 또는 더 효과적인 방법 및 치료 및 진단제를 개발하는 것에 대한 요구가 크다. 또한, 특정 세포형을 치료하고 암과 같은 비정상적 세포 증식에 의하거나 이와 관련된 질병들을 치료하기 위한 대안적 치료제 및 방법들을 개발하는 것에 대한 요구가 존재한다. 예를 들어, 결합조직형성은 섬유아세포의 증식 및 섬유성 결합 조직의 형성, 특히 암종의 기질에서의 형성이다. 결합조직형성은 종양 침윤 및 악성의 증명이다. 유건종 및 복부 근종은 아이를 출산한 여성의 복부 근육에서 가장 흔히 발생하는, 섬유아세포의 활성 증식으로부터 초래되는 비정상적으로 단단한 흉터같은 결합조직의 혹 또는 상대적으로 큰 덩어리이고; 섬유아세포는 근육 및 근막을 둘러싸면서 침윤한다.
생후에는, 맥관신생(기본 관상 그물구조를 형성하는 내피세포) 및 혈관형성(존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장 또는 발생)이 종양성 장애의 병리생리학에서 핵심적 역할을 한다([Semenza, G.L., (2003) Ann. Rev. med. 54:17-28]). 맥관신생 및 혈관형성 사이의 구분은 절대적이지 않으며 이들은 중복된다([Ribatti, D et al., (2001) Mech. Dev. 100:157-163]). 둘 다 내피세포 증식, 이동, 새롭게 형성된 응집체의 삼차원적 재구성을 요구하며 유사한 세포외기질 접착 기전을 이용한다(상기 Ribatti 문헌). 아바스틴이라 불리는 혈관내피 성장에 대한 항체와 같은 항-혈관형성 치료의 이용이 암을 치료하는데 있어서 유용한 것으로 나타나고 있다.
본 명세서에서 STOP-1 또는 UNQ762로서 칭해지는 또 다른 세포성 단백질이 특정 종양에서 과발현된 것으로 나타나고 있다(예를 들어, WO 01/163318, WO 01/68848, WO 02/00690, WO 02/08284, WO 02/16602, WO 02/42487). STOP-1에 대한 다클론 항체들이 보고되고 있다(예를 들어, WO 02/42487). 혈관형성과 관련된 암 및 질환 치료를 위하여 STOP-1을 표적화하는 것에 대하여 일부 논의가 있었지만(예; WO 01/163318, WO 01/68848, WO 02/00690, WO 02/08284, WO 02/16602, WO 02/42487, WO 00/71581, WO 02/00690), 과도하거나 불충분한 혈관형성에 의해 발생되거나, 이와 관련되거나, 이에 의해 악화되는 조절불가능한 세포 증식 및 질환들의 진단 및 치료를 위한 대안적이고 더 효과적인 치료제 및 방법을 동정하기 위하여 STOP-1의 생물학을 더 연구하는 것이 요구되고 있다.
본 발명은 새로운 STOP-1 폴리펩티드, 항체, 핵산 분자, 상기 STOP-1 단백질에 대한 추가 지식을 도입한 조성물 및 방법을 제공함에 의해 이러한 요구 및 기타 요구들을 해결한다. 다른 것들 가운데, 본 발명에서는 STOP-1가 몇몇 종양 형태의 기질에서 과발현되는 것을 개시한다. 본 발명에서는 STOP-1의 과발현이 단독으로 발암성일 수 있다는 것을 개시한다. 나아가, 본 발명의 개시는 STOP-1이 분비될 수 있고 분비가 발암을 위해 필요하다는 것을 증명한다. 더 나아가, 본 발명의 개시는 STOP-1의 글리코실화가 분비 여부에 영향을 주고 N-글리코실화 자리의 제거, 예를 들어 186 위치(Asn)에서 아미노산을 알라닌으로 치환시킴에 의한 제거가 분비의 상실을 초래한다는 것을 보여준다. 본 발명의 개시는 STOP-1 단백질들 사이의 이황화결합이 STOP-1의 삼중 나선 도메인에서 배양물의 시스테인 55에서 발생할 수 있다는 것을 보여준다. 추가로, 본 발명의 개시는 STOP-1 단백질이 이량체, 삼량체 및 육량체로서 자신과 복합체를 형성할 수 있고, 콜라겐의 삼중 나선 도메인에 관한 한 영역이 요구되지 않는 반면에 이 단백질의 c-말단이 올리고머화를 위해 충분하다는 것을 보여준다. 본 발명의 개시는 또한 핵산 및 이들을 코딩하는 단백질 서열뿐만 아니라 단백질의 C-말단 영역 및 N-말단 영역을 포함하는, STOP-1에 특이적으로 결합하는 다수의 물질을 보여준다. 나아가, 본 발명의 개시는 STOP-1 발현이 마우스에서 유방암을 유발하는 것으로 알려진 WNT 신호화 경로에서의 단백질의 과발현, 예를 들어 WNT의 과발현에 의해 조절될 수 있다는 것을 보여준다. 추가로, 본 발명의 개시는 STOP-1과 같은 종양에서 과발현되는 프로테아제, 예를 들어 MMP-9에 의해 STOP-1이 분리될 수 있다는 것을 보여준다. 나아가, 본 발명의 개시는 프로테오글리칸 합성 결합 세포주에서 폴리펩티드를 발현시켜 STOP-1 폴리펩티드를 생성시키는 방법을 보여준다. 본 발명은 STOP-1이 암세포 및 내피세포와 같은 세포들의 표면에 결합되는 것을 보여준다. 본 발명은 세포 표면과 STOP-1의 상호작용을 억제할 수 있는 길항적 분자를 제공한다. 본 발명은 세포 표면과의 STOP-1의 결합을 강화시킬 수 있는 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 혈관형성 및 맥관신생에서의 STOP-1의 역할, 및 혈관형성 및 맥관신생을 조절하여 치료가 개선될 장애들을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에서 제공된 이러한 데이터 및 기타 데이터는 본 명세서에서의 다른 개시내용과 함께 STOP-1 단백질을 이용하는 신규하고 더 우수하고(하거나) 대안적인 방법 또는 이에 관한 조성물을 교시한다.
발명의 요약
본 발명은 STOP-1의 활성, 발현 및 조절을 표적화하여 암 및 기타 질환들을 포함하여 조절불가능한 세포증식을 치료 또는 예방하기 위한 새로운 치료제, 진단제 및 방법을 제공한다. 본 발명은 STOP-1의 활성, 발현 및 조절을 표적화하여 차선이거나, 과도하거나 부적절한 혈관형성 또는 맥관신생 발생을 갖는 임의의 의학적 상태를 치료하기 위한 새로운 치료제, 진단제 및 방법을 제공한다.
한 실시태양에 따르면, 본 발명은 인간 STOP-1의 올리고머형태에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다. 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 인간 STOP-1의 아미노산 33-53 또는 33-52에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다. 또 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 인간 STOP-1의 아미노산 94-243에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함한다. 추가의 실시태양에 따르면, 인간 STOP-1의 잔기 94-243에 특이적으로 결합하거나 인간 STOP-1의 잔기 33-53 또는 33-52에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 또한 삼량체 형태와 같은 인간 STOP-1의 올리고머형태를 인식한다. 본 발명에 따라 항체가 단리될 수 있다. 인간 STOP-1의 잔기 33-52 또는 33-53 내의 한 잔기에 특이적으로 결합하는 상기 항체는 또한 STOP-1 또는 그의 비인간 균등물 내의 다른 잔기에 결합할 수 있는 것으로 이해된다.
또 다른 실시태양에서는, 본 발명은 미국 20110-2209 버지니아주, 매나사스, 유니버시티 블루바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 2003년 3월 25일에 기탁된 V0350-4-S7로 명명된 핵산 분자에 의해 코딩된 S7, 2003년 3월 25일에 기탁된 V0350-2b-S4로 명명된 핵산 분자에 의해 코딩된 S4, 2003년 3월 25일에 기탁된 V0350-2b-S9로 명명된 핵산 분자에 의해 코딩된 S9, 2003년 3월 25일에 기탁된 V0350-4-S16로 명명된 핵산 분자에 의해 코딩된 S16, 2003년 3월 25일에 기탁된 V0350-5로 명명된 핵산 분자에 의해 코딩된 F5, 및 2003년 3월 28일에 기탁된 6B12.1.7로 명명된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 6B12, 상기 기탁된 항체들, 항체들의 일부를 포함하는 항체들 및 이들의 변형물을 포함하여 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 생물학적 특징들을 갖는 단클론 항체를 제공한다. 또 다른 실시태양에서는, 본 발명은 STOP-1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는데, 여기서 STOP-1에 대한 항체의 결합은 상기 기탁된 항체들 중 하나로부터 선택된 제2의 단클론 항체에 의해 억제될 수 있다(예를 들어, 경쟁적 ELISA 분석에서 관찰되는 바와 같이).
본 발명은 또한 하기 서열을 갖는 항체들에 관한 것이다:
하기 아미노산 서열을 포함하는 단클론 항체:
(a) 다음을 포함하는 제1 아미노산 서열:
T-I-X1-X2-X3-X4
여기서, X1은 S, N 또는 T이고;
X2는 G, N, S 또는 A이고;
X3은 Y, S 또는 T이고;
X4는 D 또는 W이다.
(b) 다음을 포함하는 제2 아미노산 서열:
X1-X2-I-X3-P-X4-X5-G-X6-T-X7 (서열 115)
여기서 X1은 G 또는 A이고;
(1) X2는 S, T, A로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, X3은 R, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이거나; 또는
(2) X3은 S, T, A로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, X2는 R, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;
X4는 Y 또는 F이고;
X5는 G, S, T 또는 A이고;
X6은 N, Y 또는 A이고;
X7은 N, Y 또는 D이고;
(c) 다음을 포함하는 제3 아미노산 서열:
C-X1-X2-X3-G-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (서열 116)
여기서, X1은 A, S 또는 T이고;
X2는 염기성 아미노산이고;
X3은 임의의 아미노산이고;
X4는 소수성 아미노산이고;
X5-X8 중 임의의 하나는 임의의 아미노산일 수 있거나 결실될 수 있고, X5-X8 중 하나 이상은 방향족 아미노산이거나 소수성 아미노산이고;
X9는 방향족 또는 소수성 아미노산이고;
X10은 D 또는 A이고;
X11은 Y 또는 V이다.
한 실시태양에 따르면, 단클론 항체는 도 34의 경쇄 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에 따르면, 단클론 항체는 전장 IgG이다.
본 발명의 한 실시태양에 따르면, 제1 아미노산 서열의 X1은 S이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 제1 아미노산 서열의 X2는 G이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 제1 아미노산 서열의 X3은 S이다. 한 실시태양에 따르면, 제1 아미노산 서열은 TISGSD, TITNSD 및 TISGSW로 이루어진 군으로부터 선택된 서열이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 115의 X3은 S 또는 A이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 115의 X4는 Y이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 115의 X5는 G 또는 A이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 115의 X6은 N 또는 A이다. 한 실시태양에 따르면, 서열 115는 GRISPYGNTN, ATIYPYGGYTY 및 AWIAPYSGATD로 이루어진 군으로부터 선택된 서열이다.
본 발명의 한 실시태양에 따르면, 서열 116의 X1은 A이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 116의 X2는 R이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 116의 X4는 L 또는 M이다. 본 발명의 한 바람직한 실시태양에 따르면, X5-X8에 존재하는 방향족 아미노산은 트립토판 잔기이다. 또 다른 실시태양에 따르면, X5-X8 중 한 아미노산은 결실된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 서열 116의 X9는 F이다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 서열 116의 X10은 D이다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 서열 116의 X11은 Y이다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 서열 116은 CARVGGLKLLFDY, CARGGGMDGYVMDY 및 CAREGGLYWVFDY로 이루어진 군으로부터 선택된 서열이다.
본 발명에 따른 한 항체는 (a) 서열 TISGSD를 포함하는 제1 아미노산 서열; (b) 서열 GRISPYGNTN을 포함하는 제2 아미노산 서열; 및 (c) 서열 CARVGGLKLLFDY를 포함하는 제3 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 항체의 변형물을 포함할 수 있다. 별법으로는, 본 발명에 따른 항체는 (a) 서열 TITNSD를 포함하는 제1 아미노산 서열; (b) 서열 ATIYPYGGYTY를 포함하는 제2 아미노산 서열; 및 (c) 서열 CARGGGMDGYVMDY를 포함하는 제3 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 항체의 변형물을 포함할 수 있다. 별법으로는, 본 발명에 따른 항체는 (a) 서열 TISGSW를 포함하는 제1 아미노산 서열; (b) 서열 AWIAPYSGATD를 포함하는 제2 아미노산 서열; 및 (c) 서열 CAREGGLYWVFD를 포함하는 제3 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 항체의 변형물을 포함할 수 있다. 별법으로는, 본 발명에 따른 항체는 (a) 서열 TISNYG를 포함하는 제1 아미노산 서열; (b) 서열 GRISPSNGSTY를 포함하는 제2 아미노산 서열; 및 (c) 서열 CAKCSVRFAY를 포함하는 제3 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 항체의 변형물을 포함할 수 있다. 별법으로는, 본 발명에 따른 항체는 (a) 서열 TINNYD를 포함하는 제1 아미노산 서열; (b) 서열 GYISPPSGATY를 포함하는 제2 아미노산 서열; 및 (c) 서열 CARMVGMRRGVMDY를 포함하는 제3 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 항체의 변형물을 포함할 수 있다.
추가의 실시태양에서는, 상기 제1, 제2 및 제3 아미노산 서열들이 인간 중쇄에 위치할 수 있는데, 여기서, 제1 아미노산 서열은 카바트(Kabat) 번호 체계에 따른 중쇄의 잔기 28-33에 있고, 제2 아미노산 서열은 카바트 번호 체계에 따른 중쇄의 잔기 49-58에 있고, 제3 아미노산 서열은 카바트 번호 체계에 따른 중쇄의 잔기 92-102에 있다.
또 다른 실시태양에서는, 본 발명은 (a) 도 27의 중쇄 서열; (b) 도 28의 중쇄 서열; (c) 도 29의 중쇄 서열; (d) 도 30의 중쇄 서열; (e) 도 31의 중쇄 서열; 또는 (f) 도 34의 중쇄 서열의 아미노산 서열; 또는 이들의 변형물을 포함하는 단클론 항체를 제공한다. 추가의 실시태양에서는, 본 발명의 항체는 (a) 도 27의 경쇄 사슬, (b) 도 34의 경쇄 사슬; 또는 이들의 변형물을 추가로 포함한다.
추가의 실시태양에서는, 본 발명의 항체는 키메라 또는 인간화 항체이다. 또 다른 실시태양에서는, 본 발명의 항체는 항체 단편이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서는, 항체가 기질 표적화제, 성장 억제제, 세포독성제, 검출제, 생체허용성 개선제 및 항체 반감기 개선제로 이루어진 군으로부터 선택된 제제에 접합된다. 또 다른 실시태양에서는, 본 발명의 항체는 STOP-1 폴리펩티드에 대한 결합 특이성 및 임의의 기타 항원에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 갖는 다중-특이적 항체이다. 한 실시태양에 따르면, 기타 항원은 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 상기 세포 표면 단백질은 자연킬러(NK) 세포 수용체이다. 추가의 바람직한 실시태양에서는, NK 수용체에 대한 항체의 결합은 자연킬러 세포를 활성화시킨다.
본 발명은 STOP-1 폴리펩티듸 변이체의 변이체 및 변형을 제공한다. 한 실시태양에서, STOP-1 폴리펩티드 변이체는 세포로부터 분비될 수 없는 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 변이체는 글리코실화되지 않은 인간 STOP-1 폴리펩티드이다. 추가 실시태양에서, 변이체는 186번 잔기에서 돌연변이된 인간 STOP-1 폴리펩티드이다. 또한, 본 발명은 다른 STOP-1과 이황화될 수 없는 STOP-1을 포함하는 인간 STOP-1 변이체 폴리펩티드를 제공한다. 한 실시태양에 따르면, 변이체는 55번 잔기에서 돌연변이된 인간 STOP-1 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명은 항체 및 폴리펩티드 및 이들의 변이체를 코딩하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 항체, 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 한 실시태양에 따르면, 조성물은 추가적으로 제약학상 허용되는 담체를 포함한다. 추가 실시태양에서, 조성물은 기질 표적화제를 포함한다. 추가 실시태양에서, 기질 표적화 물질은 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드에 공유 결합되어 있다. 다른 추가 실시태양에서, 기질 표적화 물질은 종양의 기질 세포를 인식한다.
본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 세포를 배양하여 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드 또는 항-STOP-1 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에 따르면, STOP-1 폴리펩티드를 제조하는 방법은 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 프로테오글리칸 합성이 결여된 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, 프로테오글리칸 합성이 결여된 세포주는 갈락토실트랜스퍼라제 I 활성이 결여되어 있다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 세포주는 CHO-psbg 세포주이다.
본 발명은 STOP-1 폴리펩티드를 함유하고 있는 것으로 의심되는 샘플을 항-STOP-1 항체에 노출시키는 단계, 및 상기 항체가 상기 샘플의 성분에 결합하는 것을 측정하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 STOP-1 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에 따르면, 항체는 본 발명의 모노클로날 항체이다.
본 발명은 정상 조직 중의 STOP-1 발현을 환자 유래의 시험되는 STOP-1의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 환자의 세포 증식성 장애, 예를 들어, 종양을 진단 또는 모니터링하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, STOP-1 단백질은 본 발명의 항체와 같은 물질에 의해 탐지될 수 있다. 다른 실시태양에서, STOP-1 mRNA는 UNQ6762 mRNA에 특이적으로 혼성화하는 핵산 분자와 같은 물질에 의해 탐지될 수 있다. 추가 실시태양에서, 시험되는 종양은 큰 기질 구획을 갖는다. 추가 실시태양에서, STOP-1 탐지 물질은 시험되는 조직의 기질 구획 또는 그 근처에 투여된다. 또 다른 실시태양에서, 방법은 정상 조직 및 시험되는 조직의 기질 구획 물질에서 STOP-1 단백질 또는 mRNA를 관찰하거나 또는 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 항체는 본 발명의 모노클로날 항체이다.
본 발명은 환자에게 본 발명의 조성물을 환자의 세포 증식을 억제하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 증식성 장애를 예방하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 증식성 장애는 결합조직증식증이다. 또한, 본 발명은 환자에게 STOP-1 길항제를 환자의 종양 성장을 억제하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 STOP-1을 과발현하는 종양의 성장을 예방하거나 또는 억제하는 방법을 제공한다. 추가 실시태양에서, 치료되는 종양은 기질 구획을 갖는다. 다른 추가 실시태양에서, 치료되는 종양은 기질 구획을 갖는다. 다른 추가 실시태양에서, 기질 구획을 갖는 종양은 데스모이드 종양, 이자암, 육종(예를 들어, 혈관육종, 횡문근아세포종) 및 선암종(유선 섬암종, 결장 선암종, 위장관 선암종 및 난소 선암종), 간세포암종, 유방암, 결장암, 폐암, 난소암, 신경아교종, 자궁내막암 및 혈관암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시태양에서, 길항제는 종양의 기질 또는 그 근처에 투여된다. 다른 실시태양에서, 종양은 흑색종 또는 원형세포성 종양(예를 들어, 악성섬유조직구증)이다.
본 발명에 따른 길항제는 천연 STOP-1 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해 또는 중화하고, 천연 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 분자로, 여기서, 길항제 분자의 결합은 (1) 올리고머 형태의 천연 STOP-1 폴리펩티드에 대한 것이고, (2) 천연 인간 STOP-1의 94-243번 잔기에 대한 것이고(또는) (3) 본 발명의 모노클로날 항체(예를 들어, 본 발명의 기탁된 항체 등)에 의해 저해될 수 있는 것이다(예를 들어, STOP-1 및 6B12를 사용한 경쟁적 ELISA 분석에서 관측된 것과 같이). 한 실시태양에 따르면, 기탁된 항체는 6B12 항체이다. 한 실시태양에 따르면, 길항제는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에 따르면, 길항제는 본 발명의 항체이다. 다른 실시태양에서, 길항제가 저해하는 STOP-1 폴리펩티드는 삼량체 복합체의 일부이다.
다른 실시태양에 따르면, 길항제에 의해 저해되는 생물학적 활성은 STOP-1에 특이적으로 결합하는 세포와 STOP-1의 상호작용이다. 한 실시태양에 따르면, 세포는 유방암 세포이다. 다른 실시태양에 따르면, 세포는 내피세포이다. 다른 실시태양에 따르면, 길항제는 (1) 6B12 항체가 결합하는 인간 STOP-1 내의 에피토프에 결합할 수 있는 성질; (2) 인간 STOP-1의 최소한 33-52번 잔기 내의 잔기에 결합할 수 있는 성질; 및 (3) 6B12 항체에 의한 STOP-1으로 결합으로부터부터 경쟁될 수 있는 성질(예를 들어, STOP-1, 길항제 및 6B12 항체를 사용한 경쟁적 ELISA 분석에서 관측된 것과 같이)로 이루어진 군으로부터 선택된 추가적인 성질을 갖는다.
본 발명은 세포로부터 STOP-1의 분비를 저해하는 단계를 포함하는, STOP-1을 과발현하는 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 분비는 STOP-1의 글리코실화를 저해함으로써 저해된다. 다른 실시태양에서, 분비는 세포로부터 분비될 수 없는 STOP-1 단백질을 과발현함으로써 저해된다. 추가 실시태양에서, 분비는 186번 잔기에서 돌연변이된 STOP-1 단백질에 의해 저해된다.
본 발명은 (1) STOP-1을 코딩하는 DNA 분자를 시스테인 55번 잔기에서 돌연변이시킴; (2) 천연 STOP-1 단백질의 존재 하에서 시스테인 55번 잔기에서 돌연변이된 STOP-1 단백질을 발현시킴; 및 (3) 시스테인 55번 잔기에서 돌연변이된 STOP-1 단백질을 천연형 STOP-1 단백질과 함께 인큐베이션시키는 것으로 이루어진 군에서 선택된 단계를 포함하는, STOP-1 분자 사이의 이황화 결합을 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 매트릭스 메탈로프로테아제-7(MMP-7) 및 매트릭스 메탈로프로테아제-9(MMP-9)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제와 함께 STOP-1을 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, STOP-1을 절단하는 방법을 제공한다. 추가 실시태양에서, 방법은 생성된 STOP-1 절단 생성물을 모니터링하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양은 STOP-1 폴리펩티드를 과발현하는 세포의 성장을 저해하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 STOP-1의 길항제를 투여하는 단계를 포함하고, 길항제는 STOP-1에 특이적으로 결합하고, 임의로는 기질 표적화 물질, 성장 저해 물질 또는 독소(예를 들어, 메이탠시노이드 또는 칼리케아미신, 항생제, 방사능 동위원소 및 핵분해 효소)와 같은 세포독성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 물질 또는 물질(들)의 조합에 컨쥬게이션된다. 본 발명의 추가 실시태양은 STOP-1 폴리펩티드를 과발현하는 세포 성장을 저해하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 종양의 기질 세포에 작용제를 투여하는 단계를 포함하고, 물질은 STOP-1의 길항제이거나 또는 STOP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. 물질은 환자 또는 의사에 의해 기질 세포에 직접적으로 투여되거나, 또는 작용제가 기질 세포로 향할 수 있게 하는 기질 표적화제를 사용하여 간접적으로 투여된다. 본 발명은 (a) 변형된 STOP-1 폴리펩티드, STOP-1 폴리펩티드 변이체, STOP-1 길항제, STOP-1 아고니스트, STOP-1 증강제 또는 비히클에 컨쥬게이트된 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 안티센스 치료법 또는 RNAi 치료법)를 포함하는 물질 조성물; (b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및 (c) 증식성 장애 또는 비정상적 혈관형성 또는 혈관형성에 관련된 질환의 치료에서의 상기 폴리펩티드 변이체, 변형된 폴리펩티드 또는 길항제의 용도를 언급하는 상기 용기에 부착된 라벨, 또는 상기 용기 내에 포함된 패키지 삽입물을 포함하는 프로모터를 제공한다. 한 실시태양에 따라, STOP-1 길항제 또는 증강제는 본 발명의 항체이다.
본 발명은 STOP-1 및 STOP-1의 아고니스트 또는 길항제의 활성을 시험하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, STOP-1 폴리펩티드를 내피세포의 이동을 유도하기에 효과적인 양으로 내피세포에 투여하는 단계를 포함하는, 시험관내에서 세포 이동을 유도하는 방법이 제공된다. 다른 실시태양에 따르면, 본 발명은 제1 내피세포를 STOP-1으로 처리하는 단계, 제2 내피세포를 STOP-1 및 후보 길항제 또는 아고니스트로 처리하는 단계, 및 제1 및 제2 내피세포의 이동을 비교하는 단계를 포함하는, STOP-1의 후보 길항제 또는 아고니스트의 활성을 시험하는 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시태양에서, 이같은 이동 분석에 사용되는 세포는 HUVEC 세포이다.
또한, 본 발명은 포유동물 개체에서 과도하고, 부적절하거나 또는 조절되지 않은 혈관형성과 관련된 질환 또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 방법은 STOP-1 길항제를 질환을 치료하기에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 STOP-1 길항제는 (1) 6B12 항체가 결합하는 인간 STOP-1 내의 잔기에 결합하는 성질; (2) 인간 STOP-1의 최소한 33-52번 잔기 내의 잔기에 결합하는 성질; 및 (3) STOP-1으로의 결합이 6B12 항체에 의해 저해될 수 있는 성질로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 성질을 갖는다.
또한, 본 발명은 세포로의 STOP-1의 결합 및(또는) 세포 표면 상의 STOP-1의 응집을 향상시키는 분자인 STOP-1 증강제의 치료적으로 효과적인 양을 투여하여 증가된 혈관형성 또는 혈관형성으로부터 이익을 얻는 환자를 치료하는 것을 고려한다. 이같은 분자는 혈관형성 또는 혈관형성을 증가시키기 위해 효과적인 양으로 투여될 것이다. 한 바람직한 실시태양에서, 아고니스트는 STOP-1을 세포 표면 상에 응집시키는 항-STOP-1 항체이다.
또한, 본 발명은 3개를 초과하는 STOP-1 폴리펩티드를 포함하는 STOP-1 폴리펩티드의 올리고머 형태를 포함하는 아고니스트를 제공한다. 한 실시태양에 따르면, 아고니스트는 6개의 STOP-1 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시태양에 따르면, STOP-1 폴리펩티드는 상기 아고니스트를 형성하기 위해 사용되는 면역부착소(immunoadhesin)의 일부이다.
본 발명은 길항제, 아고니스트 또는 증강제의 존재 또는 부재 하에서 STOP-1의 세포로의 결합을 관찰 또는 측정하는 단계를 포함하는, 후보작용제를 동정하고, 평가하고, STOP-1 길항제, 아고니스트 및 증강제를 확인하는 신규한 방법을 제공한다. 한 실시태양에 따르면, 세포는 암 세포이다. 추가 실시태양에서, 세포는 유방암 세포이다. 다른 실시태양에서, 세포는 내피 세포이다.
도 1은 다양한 종 유래의 STOP-1을 코딩하는 아미노산 서열의 배열을 나타낸다-인간(서열 1), 마우스(서열 3), 라이스피쉬(ricefish)(서열 4), 지브라피쉬(zebrafish)(서열 5) 및 닭(서열 6). 컨센서스(consensus) 서열도 제공된다. 화살표는 신호 서열 절단 부위를 나타낸다. 붉은 색은 모든 종에서 보존된 잔기를 나타낸다. 컨센서스 서열 중의 대문자는 모든 종에 걸쳐서 보존되어온 잔기를 나타낸다. 컨센서스 서열 중의 소문자는 대부분의 종에서 보존된 잔기를 나타낸다. 이들 종에서 보존되지 않은 잔기는 "생략점(.)"으로 나타난다. "!"는 I 또는 V를 나타낸다. "$"는 L 또는 M을 나타낸다. "%"는 F 또는 Y를 나타낸다. "#"는 B, D, E, N, Q 또는 Z를 나타낸다.
도 2는 인간 STOP-1을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 신호 서열은 박스 안의 아미노산 서열로 표시된다. 삼중 나선 도메인은 밑줄로 표시된다. 글리코실화 부위는 아미노산 186번이다.
도 3은 (A) 특정 조직 유형 중의 인간 STOP-1 mRNA의 존재 및 (B) 마우스 발생의 상이한 단계 유래의 마우스 STOP-1 mRNA를 나타낸다. 전장 인간 또는 마우스 STOP-1 DNAs는 방사능 표지되었고, 성인 인간 또는 발생 중인 마우스 태아 유래의 조직의 노던 블롯을 프로브하는데 사용되었다.
도 4는 (A) CHO-DP12 또는 (B) CHO-psgb(ATCC) 세포에 의해 생성되고, 니켈-NTA 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된, 코마시 염색된 인간 STOP-1 단백질을 나타낸다. 벡터, pRK5를 대조구로 사용하였다.
도 5는 일시적으로 형질감염된 CHO-psgb 세포의 (A) 상징액 및 (B) 세포 용해물 중에 존재하는 히스티딘-태그된 인간 STOP-1 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 항-His 항체로 프로브된다.
도 6은 SF9 곤충 세포 중에서 바큘로바이러스 감염 시스템을 사용하여 발현된 인간 STOP-1 단백질의 올리고머화를 나타낸다. STOP-1 단백질 및 다양한 결실 변이체가 SF9 세포로부터 발현되고, 크기 배제 칼럼 상에서 분리되고, 광 분산 분석 처리된다(예를 들어, (A) S31-K243, (B) E89-K243 및 (C) L94-K243). 단량체의 예측된 분자량은 각 그래프의 좌측 코너에 나타난다. 다음번부터 수개의 피크로 나타나는 숫자는 피크 중의 복합체의 평균 분자량을 나타낸다.
도 7은 포유동물 세포로부터 발현된 인간 STOP-1 단백질의 올리고머화를 나타낸다. 인간 STOP-1 단백질 및 다양한 결실 변이체가 CHO 세포로부터 발현되고, 크기 배제 칼럼 상에서 분리되고, 광 분산 분석 처리된다(예를 들어, (A) M1-K243 및 (B) 델타-THD(잔기 1-54, 94-243, 플러스 히스티딘 태그)). 단량체의 예측된 분자량은 각 그래프의 좌측 코너에 나타난다. 다음번부터 수개의 피크로 나타나는 숫자는 이들 피크 중의 복합체의 평균 분자량을 나타낸다. 비환원 조건 하에서, CHO-psgb 세포로부터 재조합적으로 발현된 분비된 전장, his-태그된 인간 STOP-1 단백질의 웨스턴 블롯은 대부분 동종이량체화된 복합체를 나타낸다(C). 웨스턴 블롯은 항-his 항체로 프로브되었다.
도 8은 인간 his-태그된 STOP-1 WT, 델타-THD 및 델타-델타-THD STOP-1(잔기 1-51, 94-243, 플러스 히스티딘 태그)를 발현하는 CHO-psgb 세포로부터 유래하고, 환원 또는 비환원 조건 처리된, (A) 세포 배양 배지 및 (B) 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 항-his 항체로 프로브되었다.
도 9는 his-태그된 WT, G53A 및 N186A STOP-1 구조체를 발현하는 CHO-psgb 세포로부터 유래하고, 환원 또는 비환원 조건 처리된, (A) 세포 배양 배지 및 (B) 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 항-his 항체로 프로브되었다.
도 10은 his-태그된 WT, C55A, C93A 및 C109A STOP-1 구조체를 발현하는 CHO-psgb 세포로부터 유래하고, 환원 또는 비환원 조건 처리된 (A) 세포 배양 배지 및 (B) 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 항-his 항체로 프로브되었다.
도 11은 뮤린(murine) STOP-1 mRNA(mSTOP1 mRNA)가 MMTV-WNT1 트랜스제닉 마우스로부터 유래하는 유방 종양 중에서는 발현되지만, 정상 유선 상피 세포에서는 발현되지 않는다는 것을 보여준다. RNA 샘플을 유방 종양 세포("T1"-"T7"으로 표시함) 또는 C57Mg 마우스 정상 유선 상피 세포("n"으로 표시함)으로부터 채취하고, mSTOP-1 프라이머 및 mRLP19 프라이머를 사용하여 RT-PCR하였다. PCT 생성물을 아가로즈 젤 상에서 분리하였다.
도 12는 인간 STOP-1 또는 쥐 STOP-1로 형질감염한 후 3T3 세포의 증식을 나타낸다. 도 12A는 3H-티미딘을 첨가하고 12시간, 28시간, 96시간 지난 후 3T3 세포에서 3H-티미딘이 혼입된 양(분당계수(cpm))을 나타낸다. 도 12B는 3H-티미딘을 첨가하고 12시간, 28시간, 96시간 지난 후 3T3 세포에서 3H-티미딘이 혼입된 양(분당계수(cpm))을 나타낸다. 대조군: 벡터만으로 형질감염(puro2 및 ph1).
도 13은 인간 STOP-1을 코딩하는 레트로바이러스로 감염시킨 후 3T3 또는 293 세포의 증식을 나타낸다. 도 13A 및 B는 각각 대조 백터(Babe) 또는 인간 STOP-1을 코딩하는 레트로바이러스로 감염시킨 3T3 세포 또는 293으로부터 발현된 인간 STOP-1 단백질의 웨스턴 블롯이다. STOP-1은 S7-IgG 항체를 사용하여 전세포 용해물로부터 면역침강시켰다. 웨스턴 블롯은 다클론 항인간 STOP-1 항체로 탐침하였다. 도 13C는 비색 세포 적정법(colorimetric Cell Titer Assay)으로 탐지한 감염 세포 개체수에 대해 관찰한 세포 증식 수준을 나타낸다.
도 14는 쥐 STOP-1이 이종이식 쥐 모델에서 3T3 섬유아세포에 의한 종양형성을 촉진하는 것을 나타낸다. 도 14A는 벡터(p2 벡터) 만으로 또는 STOP-1 또는 RAS 단백질을 코딩하는 DNA로 형질감염한 3T3 섬유아세포로 이식한 쥐에서 종양의 평균 부피를 나타낸다. 이 형질감염한 세포는 누드 마우스에 이식하거나 또는 단백질 발현을 시험하였다. 도 14B 및 C는 각각 형질감염한 세포의 상청액 분획 및 용해물 분획의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 이 웨스턴 블롯은 항-STOP-1 다클론 항체로 탐침하였다. "TI"는 종양 발생률를 의미한다.
도 15는 인간 STOP-1이 이종이식 쥐 모델에서 3T3 섬유아세포에 의한 종양형성을 촉진하는 것을 나타낸다. 도 15는 벡터(p2 벡터) 만으로 또는 STOP-1, RAS 단백질 또는 LP1을 코딩하는 DNA로 형질감염한 3T3 섬유아세포로 이식한 쥐에서 종양의 평균 부피를 나타낸다.
도 16은 재조합 STOP-1 단백질이 SK-Mel-31 세포의 상처 치유력 및 자동력을 증가시키는 것을 나타낸다. SK-Mel-31 세포는 (A) NT-외인성 리간드로 처리하지 않음, (B) b762-바큘로바이러스에서 생성된 인간 STOP-1 단백질, (C) hrEGF-(50ng/ml), (D) hrEGF 및 b762, 또는 (E) CHO 포유동물에서 생성된 인간 STOP-1 단백질로 처리하였다.
도 17은 항인간 STOP-1 항체, 6B12가 신호 서열과 3중 나선 도메인 사이에서 인간 STOP-1의 N-말단 서열에 결합하는 것을 나타낸다. 도 17A는 도 18B와 C의 에피토프 위치 연구에서 사용된 his 태그된 인간 및 전장 지브라피쉬 STOP-1 단백질의 개요이다. 도 17B 및 C는 각각 재조합적으로 도 17A의 단백질을 발현한 세포로부터 추출한 항-his 항체 및 6B12 항체로 탐침한 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 18은 인간 STOP-1에 친화성을 갖는 파지에서 유래한 몇몇 항체의 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다. "H1", "H2", 및 "H3"은 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3을 의미한다. 숫자 서두는 일반적으로 카바트 넘버링 시스템(Kabat numbering system)에 따른 아미노산 위치 28-33, 49-58 및 92-102에 대응한다.
도 19는 상기 항체가 STOP-1에 대해 나타내는 친화성을 측정하기 위한 경쟁 ELISA에 사용하기 위한 S4 및 S7 Fab 또는 IgG의 적정 농도를 결정하기 위한 ELISA 분석 그래프를 나타낸다. "S 코팅"은 마이크로타이터 플레이트 상에서 코팅된 STOP-1의 단형(#94-243)을 의미한다. "F 코팅"은 마이크로타이터 플레이트 상에서 코팅된 인간 STOP-1의 전장형을 의미한다. 최대 결합의 약 90%가 경쟁 ELISA 분석에 사용하기 위해 적절한 것으로 판단되었다. 결합된 Fab 및 IgG를 탐지하기 위해 호스-래디쉬 퍼옥시다제로 컨쥬게이션된 단백질 G를 사용하였다.
도 20은 S4 및 S7 Fab 또는 IgG의 결합 친화력을 측정하기 위한 경쟁 ELISA 결과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 플레이트를 단형 또는 전장형 인간 STOP-1으로 코팅하고, 각각 단형 또는 전장형 STOP-1과 경쟁시켰다(도 20A 및 B). 계산된 결합 친화력은 괄호 안에 나타내었다.
도 21은 파지에서 유래된 몇가지 항체의 STOP-1에 대한 결합 친화력의 요약을 나타낸다. "S/S"는 마이크로타이터 플레이트가 단형 STOP-1으로 코팅되고 단형 STOP-1과 경쟁하는 ELISA를 의미한다. "F/S"는 마이크로타이터 플레이트가 전장형 인간 STOP-1으로 코팅되고 단형 인간 STOP-1과 경쟁하는 ELISA를 의미한다. "F/F"는 마이크로타이터 플레이트가 전장형 STOP-1으로 코팅되고 전장형 STOP-1과 경쟁하는 ELISA를 의미한다. 이 연구에서 사용된 파지는 S4-Fab 파지 및 S7-F(ab)'2 파지이었다.
도 22는 플레이트가 인간 STOP-1으로 코팅되고, S4IgG와 결합되고, S4(Fab) 파지, S7(F(ab)'2) 파지, (Fab) 파지, S16(F(ab)'2) 파지 및 F5(F(ab)'2)파지이었다. Y축은 S4IgG를 블로킹한 웰의 OD450nm 값을 S4IgG를 블로킹하지 않은 웰의 OD450nm 값으로 나누어 계산한 비블로킹 백분율을 의미한다.
도 23은 다양한 프로테아제로 생체외에서 분절한, 바큘로바이러스에서 발현된 인간 STOP-1 단백질의 코마시 착색 겔을 나타낸다. "MMP"는 기질 메탈로프로테아제를 의미한다.
도 24A-D는 F(ab)'2 파지 디스플레이 단백질의 Fab를 코딩하는 파지미드 또는 Fab 또는 IgG 단백질을 코딩하는 벡터의 개요이다. 도 24A는 Fab-파지미드 구조체의 개요이다. 이 구조체는 알칼린 포스파타제 프로모터, STII 신호 서열, VL 및 VC 경쇄 서열, gD 태그, 다른 STII 신호 서열, 중쇄 VH 및 CH1 영역 및 M13 박테리오파지 pIII 코팅 단백질(cP3)를 포함한다. 도 24B는 F(ab)'2-파지미드 구조체의 개요이다. 이 구조체는 일반적으로 Fab-파지미드와 같은 서열을 갖는데, 루신 지퍼 서열(Zip)을 더 갖는다는 점만 다르다. 도 24C는 Fab 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 개요이다. 도 24D는 IgG 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 개요이다. IgG 단백질은 CH2 및 CH3 서열을 포함한다.
도 25A-H는 파지 디스플레이 항-Her-2 Fab의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 25는 항-Her-2 Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 86), 항-Her-2 Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 87) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 파지미드의 핵산 서열(서열 88)을 나타낸다.
도 26A-H는 파지 디스플레이 항-Her-2 F(ab)'2의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 26은 항-Her-2 F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 89), 항-Her-2 F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 90) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 파지미드의 핵산 서열(서열 91)을 나타낸다.
도 27A-C는 파지 디스플레이 S4-Fab의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 27은 S4-Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 92), S4-Fab 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 93) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 핵산 서열(서열 94)을 나타낸다.
도 28A-C는 파지 디스플레이 S9 Fab의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 28은 S9-Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 95), S9-Fab 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 96) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 핵산 서열(서열 97)을 나타낸다.
도 29A-C는 파지 디스플레이 S7-F(ab)'2의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 29는 S7-F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 98), S7-F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 99) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 핵산 서열(서열 100)을 나타낸다.
도 30A-C는 파지 디스플레이 S16-F(ab)'2의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 30은 S16-F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 101), S16-F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 102) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 핵산 서열(서열 103)을 나타낸다.
도 31A-C는 파지 디스플레이 F5-F(ab)'2의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 31은 F5-F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 104), F5-F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 105) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 핵산 서열(서열 106)을 나타낸다.
도 32A-G는 S4-Fab의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 32는 S4-Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 107), S4-Fab 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열 108) 및 이 아미노산 서열들을 코딩하는 백터의 핵산 서열(서열 109)을 나타낸다.
도 33A-F는 IgG 단백질의 S4 경쇄 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 33은 S4 경쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 110), 이 아미노산 서열을 코딩하는 백터의 핵산 서열(서열 111)을 나타낸다.
도 34A-G는 IgG 단백질의 S4 중쇄 서열을 나타낸다. 구체적으로, 도 34는 S4 중쇄를 포함하는 아미노산 서열(서열 112), 이 아미노산 서열을 코딩하는 백터의 핵산 서열(서열 113)을 나타낸다.
도 35는 카바트 데이터베이스로부터 얻은 인간 항체 경쇄 서열에서의 아미노산 빈도를 타나낸다.
도 36은 코돈 세트 설계의 적절한 예를 나타낸다.
도 37은 CDR L1, L2 & L3의 다변형을 위한 제한된 다양성을 갖는 변형 코돈(또한, "nonrandom"이라고도 칭함)의 대표적인 예를 나타낸다.
도 38은 CDR L1, L2 & L3의 다변형을 위한 제한된 다양성을 갖는 변형 코돈(또한, "nonrandom"이라고도 칭함)의 대표적인 예를 나타낸다.
도 39는 CDR L3의 다변형을 위한 제한된 다양성을 갖는 변형 코돈(또한, "nonrandom"이라고도 칭함)의 대표적인 예를 나타낸다.
도 40은 CDR L1, L2 & L3의 다변형을 위한 제한된 다양성을 갖는 변형 코돈(또한, "nonrandom"이라고도 칭함)의 대표적인 예를 나타낸다.
도 41은 (1) 항-HIS 항체, (2) 항-HIS 항체 및 STOP-1 단백질, 또는 (3) 항-플래그 항체 및 STOP-1 단백질로 처리하고, 이어서 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC) 컨쥬게이션된 염소 항-쥐 항체로 처리한 293, HeLa, HT1080 또는 HUVEC 세포군의 유세포 분석을 나타낸다. 유의하지 않은 작은 수의 세포가 항-플래그 항체에 결합하였다(즉, 293, HeLa, HT1080 그래프의 x축 왼쪽 끝부분의 피크). x축은 세포 수를 나타낸다(플루오레신 신호 강도의 로그값). y축은 표지화된 세포가 방출하는 형광 수준을 나타낸다(사건).
도 42는 (1) 항-HIS 항체, (2) 항-HIS 항체 및 STOP-1 단백질, 또는 (3) 항-플래그 항체 및 STOP-1 단백질, (3) STOP-1 단백질, (4) STOP-1 단백질 및 S7 항체, 또는 (5) STOP-1 및 6b12 항체로 처리하고, 이어서 FITC 컨쥬게이션된 염소 항-쥐 항체로 처리한 HT1080 세포군의 FACS 분석을 나타낸다.
도 43은 bFGF 또는 STOP-1("762") 또는 음성 대조군으로 처리한 후의 변성 보이덴 주호성 챔버에서의 HT1080 세포의 이동(세포수)를 도시한다.
도 44는 항-STOP-1 항체(6B12) 또는 항체 대조 물질(4B7)의 존재 및 부재 하에서 MDA435에 대한 STOP-1의 결합 FACF 분석을 나타낸다.
도 45는 재조합 인간 TNFalpha 존재 및 부재 하에 (A) 8시간 및 34시간동안 감압 조건 하에서, 또는 (B) 3시간, 8시간 및 34시간동안 상압 조건 하에서 처리한 후 STOP-1 mRNA 발현에서의 폴딩 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따라 STOP-1 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들면 서열 1 및 도 1의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.
서열 1
본 명세서에 사용되는 "STOP-1", "STOP-1 단백질", "STOP-1 폴리펩티드"(또한 UNQ762 또는 762라고도 칭함)라는 용어는 달리 말하지 않으면 천연 서열 폴리펩티드, 폴리펩티드 변이체, 및 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체의 단편을 포함한다. STOP-1 단백질은 다양한 종(예를 들면, 인간)으로부터 본 발명에 따른 항체를 이용하여 또는 기탁된 핵산 분자를 이용하는 것을 포함하는 재조합법 또는 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. STOP-1의 올리고머형은 잔기 94-243만을 갖는 인간 STOP-1 또는 그 일부를 포함한다. 본 발명에 따른 올리고머형은 STOP-1의 다이머, 트리머, 및 헥사머를 포함할 수 있다. STOP-1의 바람직한 올리고머형은 트리머이다.
"천연 서열" 폴리펩티드 또는 "천연" 폴리펩티드는 자연에서 유래된 폴리펩티드(예를 들면, 항체)와 같은 아미노산 서열을 갖는 것이다. "천연 서열" 폴리펩티드는 자연에서 유래된 폴리펩티드(예를 들면, 항체)와 같은 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연에서 분리하거나 재조합법 또는 합성법으로 만들 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연에서 존재하는 인간 폴리펩티드, 쥐과 폴리펩티드, 또는 다른 포유동물 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. "천연 서열" STOP-1 폴리펩티드 또는 "천연" STOP-1 폴리펩티드는 자연에서 유래된 STOP-1 폴리펩티드에 대응하는 아미노산과 같은 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 한 바람직한 실시 형태에서, 인간 STOP-1의 천연 서열을 코딩하는 핵산은 서열 2 및 도 2에서 발견할 수 있다.
서열 2
이러한 STOP-1 폴리펩티드는 자연에서 분리하거나 재조합법 또는 합성법으로 만들 수 있다. "천연 서열" 또는 "천연" STOP-1 폴리펩티드 또는 단백질이라는 용어는 특히 자연적으로 발생하는 STOP-1 단백질의 절단형 또는 분비형, 자연적으로 발생하는 변이형(예를 들면, 교대로 접합된 형태) 및 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드는 첨부한 도면에서 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다.
본원에 개시된 다양한 STOP-1 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략의 위치는 본 명세서 및(또는) 첨부된 도면에서 볼 수 있다. 어떤 경우, 분비된 폴리펩티드로부터 신호 서열의 절단은 전체적으로 균일하지 않아서 하나 이상의 분비된 종이 생성되는 것으로도 인식된다. 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단 경계의 양 측에서 약 5 개 이하의 아미노산 이내에서 신호 펩티드가 절단된 경우, 이 성숙 폴리펩티드 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 고찰된다.
"STOP-1 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드 또는 삼중 나선 도메인이 없는 STOP-1 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 개시된 전장 STOP-1 폴리펩티드 서열의 다른 단편(에를 들면, 전장 STOP-1 폴리펩티드에 대한 완전한 코딩 서열의 일부만을 나타내는 핵산에 의해 코딩된 것들)과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 STOP-1 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 STOP-1 폴리펩티드 변이체는, 예를 들면, 전장 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나 결실된 STOP-1 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, STOP-1 폴리펩티드 변이체는 본원에 개시된 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드가 있거나 없는, STOP-1 폴리펩티드의 삼중 나선 도메인이 없는 STOP-1 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 개시된 전장 STOP-1 폴리펩티드 서열의 특정적으로 한정된 기타 단편에 대하여 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 통상적으로, STOP-1 변이체 폴리펩티드는 길이가 약 10 개 이상의 아미노산, 또는 길이가 약
개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다. 통상적으로, STOP-1 변이체 폴리펩티드는 천연 STOP-1 폴리펩티드 서열과 비교하여 하나 이하의 보존적 아미노산 치환, 또는 천연 STOP-1 폴리펩티드 서열과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
본원에서 확인된 STOP-1 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위하여 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 특정 STOP-1 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성 결정의 목적을 위한 정렬은 당업자의 지식 범위 이내의 다양한 방법에 의해, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 알고리듬을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적에서, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성되고, ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드는 하기 표 1에 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었고, 하기 표 1에 나타낸 소스 코드는 미국 저작권청(Washington D.C., 20559)에 사용자 문서와 함께 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.(Genentech,Inc., South San Francisco, California)를 통해서 공개적으로 입수가능하고, 또는 하기 표 1에 제공된 소스 코드로부터 컴파일 될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상의 사용을 위해 컴파일 되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 고정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 비한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(또는 주어진 아미노산 서열 B에 비한, 서열 B와의 또는 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 X/Y 비
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 A 및 B의 정렬에서 이 프로그램에 의해 동일한 쌍으로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것으로 이해될 것이다. 이 방법을 사용하는 % 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2 및 3은 "STOP-1"으로 지정된 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지정된 아미노산 서열의 % 아미노산 서열 동일성을 계산하는 방법을 보여주고, 여기서 "STOP-1"은 관심있는 가상의 STOP-1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심 있는 "STOP-1" 폴리펩티드가 비교되고 있는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 전 단락에 기재된 대로 얻어진다.
"STOP-1 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "STOP-1 변이체 핵산 서열"은 본원에 기재된 STOP-1 폴리펩티드, 바람직하게는 활성 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하고 본원에 기재된 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드가 있거나 없는, STOP-1 폴리펩티드의 삼중 나선 도메인이 없는 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 개시된 전장 STOP-1 폴리펩티드 서열의 기타 단편(예를 들면, 인간 STOP-1의 94-243 잔기)을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 보통, STOP-1 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된, 신호 펩티드가 있거나 없는, STOP-1 폴리펩티드의 삼중 나선 도메인이 없는 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 개시된 전장 STOP-1 폴리펩티드 서열의 기타 단편을 코딩하는 핵산 서열과 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성, 또는 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, STOP-1 변이체 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 5 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 길이가 약
개 이상의 뉴클레오티드이고, 이 경우 "약"이라는 용어는 언급된 뉴클레오티드 서열 길이 플러스 또는 마이너스 언급된 길이의 10%를 의미한다.
본원에서 확인된 STOP-1 코딩 핵산 서열에 대하여 "퍼센트(%) 핵산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위하여 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 관심 있는 STOP-1 핵산 서열 중의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 중의 뉴클레오티드의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 핵산 서열 동일성 결정의 목적을 위한 정렬은 당업자의 지식 범위 이내의 다양한 방법에 의해, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 그러나, 본원의 목적에서, % 핵산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성되고, ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드는 하기 표 1에 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었고, 하기 표 1에 나타낸 소스 코드는 미국 저작권청(Washington D.C., 20559)에 사용자 문서와 함께 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.(Genentech,Inc., South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하고, 또는 하기 표 1에 제공된 소스 코드로부터 컴파일 될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상의 사용을 위해 컴파일 되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 고정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 핵산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에 비한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 % 핵산 서열 동일성(또는 주어진 핵산 서열 D에 비한, 서열 D와의 또는 서열 D에 대한 특정 % 핵산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 W/Z 비
여기서, W는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 C 및 D의 정렬에서 이 프로그램에 의해 동일한 쌍으로서 기록된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않을 경우, D에 대한 C의 % 핵산 서열 동일성은 C에 대한 D의 % 핵산 서열 동일성과 같지 않을 것으로 이해될 것이다. % 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 4 및 5는 "STOP-1-DNA"로 지정된 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지정된 핵산 서열의 % 핵산 서열 동일성을 계산하는 방법을 보여주고, 여기서 "STOP-1-DNA"는 관심있는 가상의 STOP-1 코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 관심 있는 "STOP-1-DNA" 핵산 분자가 비교되고 있는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가상의 뉴클레오티드를 나타낸다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 핵산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 전 단락에 기재된 대로 얻어진다.
다른 실시태양에서, STOP-1 변이체 폴리뉴클레오티드는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하고 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에서 본원에 개시된 전장 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 혼성화할 수 있는 핵산 분자이다. STOP-1 변이체 폴리펩티드는 STOP-1 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
"전장 코딩 영역"이라는 용어는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관하여 사용될 때 본 발명의 전장 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다(첨부하는 도면에서 개시 코돈과 정지 코돈을 포함하여 그 사이에 나타나는 경우가 많다). "전장 코딩 영역"이라는 용어는 ATCC에 기탁된 핵산과 관련하여 사용될 때 ATCC에 기탁된 벡터내로 삽입된 cDNA의 STOP-1 폴리펩티드 코딩 부분을 지칭한다(첨부하는 도면에서 개시 코돈과 정지 코돈을 포함하여 그 사이에 나타나는 경우가 많다).
"단리된"은 본원에 개시된 다양한 STOP-1 폴리펩티드를 기술하기 위하여 사용될 때 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고(되거나) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 전형적으로 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는, 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비-환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 동질성에 이르기까지 정제될 것이다. 한 성분 이상의 STOP-1 폴리펩티드 천연 환경이 존재하지 않을 것이므로, 단리된 폴리펩티드는 제조합 세포 내의 계내(in situ) 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"단리된" STOP-1 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 다른 폴리펩티드 코딩 핵산은 폴리펩티드 코딩 핵산의 천연 공급원에서 보통 결합되어 있는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견된 형태 또는 세팅 이외의 것이다. 그러므로 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재할 때 특정 폴리펩티드 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 통상적으로 폴리펩티드를 발현하는 세포에 함유된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자를 포함하며, 여기서 예를 들면, 핵산 분자는 천연 세포와는 다른 염색체 위치에 존재한다.
"조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서(enhancer)를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 프리서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있는 것으로서, 일반적으로 탐침 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산되는 것이다. 일반적으로, 탐침이 길수록 적당한 어닐링을 위해서 더 높은 온도가 요구되고, 탐침이 짧을수록 더 낮은 온도가 요구된다. 일반적으로 혼성화는 상보적 가닥이 융해점 아래의 조건에 존재할 때 변성된 DNA가 재연합(reanneal)하는 능력에 좌우된다. 탐침과 혼성가능한 서열간의 상동성이 높게 요구되는 경우에는 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 상대적 온도가 더 높아지면 반응 조건은 더 엄격해지는 것이고, 온도가 낮으면 덜 엄격해지는 것이다. 혼성화 반응의 엄격성에 관한 더 자세한 정보는 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]를 참조할 수 있다.
본원에서 정의된 "엄격한 조건" 또는 "매우 엄격한 조건"이란 (1) 이온 강도가 낮고 세척 온도가 높은 조건, 예를 들면 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 나트륨 도데실 술페이트를 50℃에서 사용하는 것; (2) 42℃에서 0.1% 소혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)이 함유된 50% (v/v) 포름아미드 등의 포름아미드와 같은 변성제를 혼성화시에 사용하는 것; 또는 (3) 50% 포름아미드, 5 x SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산 나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하는 용액에서 42℃에서 밤새 혼성화하고, 0.2 x SSC(염화나트륨/시트르산 나트륨)로 42℃에서 10 분 세척하고 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC로 이루어진 고엄격 세척을 10 분 수행하는 것에 의해 확인될 수 있다.
"적당한 엄격 조건(Moderately stringent conditions)"은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 같이 정의될 수 있으며, 세정 용액의 사용 및 상기 기술된 것보다 덜 엄격한 혼성화 조건(예를 들면, 온도, 이온 강도 및 %SDS)를 포함한다. 적당한 엄격 조건의 예는 이하를 포함하는 용액 [20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 디네이쳐드 시어드 연어 스펌 DNA(denatured sheared salmon sperm DNA)] 중 37℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, 이어서 약 37-50 ℃ 에서 1 x SSC 중 필터를 세정하는 것이다. 숙련된 기술자는 프로브 길이 등 같은 인자를 조절하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 알 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "에피토프 태그 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 항-STOP-1 항체 또는 STOP-1 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 가지지만, 그것이 융합되는 폴리펩티드의 활성에 간섭하지 않을 정도로 충분히 짧다. 테그 폴리펩티드는 바람직하게 또한 꽤 독특하여 항체가 실질적으로 다른 에피토프와는 교차 반응을 하지 않는다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 보통 약 8 내지 50 개의 아미노산 잔기를 갖는다(바람직하게는 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는다). 에피토프 태그 부착된 본 발명의 항체 및 폴리펩티드가 고려된다.
STOP-1과 관련하여 "생물학적으로 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특성"은, 달리 기재된 경우를 제외하고, (1) 생체내 또는 생체외의 포유동물 세포(예를 들어 3T3)의 하나 이상 유형의 세포 증식을 증가시키는 능력을 갖는 것; STOP-1을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것; 및(또는) (3) STOP-1 활성 또는 STOP-1 신호전달을 달리 조절하는 능력을 갖는 것을 의미한다.
변형된 STOP-1 폴리펩티드 또는 STOP-1 폴피펩티드와 관련하여 "생물학적으로 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특성"은, 달리 기재된 경우를 제외하고, (1) 천연 STOP-1의 생물학적 활성을 (반대로 하거나 또는 차단하는 방법으로) 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 능력을 갖는 것; (2) STOP-1을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것; 및/또는 (3) STOP-1 활성 또는 STOP-1 신호전달을 달리 조절하는 능력을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 항-STOP-1 항체와 관련하여 "생물학적으로 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특성"은, 달리 기재된 경우를 제외하고, (1) 천연 STOP-1의 생물학적 활성을 (반대로 하거나 또는 차단하는 방법으로) 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 능력을 갖는 것; (2) STOP-1을 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것; 및/또는 (3) STOP-1 활성 또는 STOP-1 신호전달을 달리 조절하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 한 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 1 uM 또는 그 미만, 100 nm 또는 그 미만, 50 nm 또는 그 미만, 10 nm 또는 그 미만, 5 nM 또는 그 미만, 1 nm 또는 그 미만의 친화도로 STOP-1에 결합한다. 본원에서 사용되는 것처럼, "항체 가변 도메인"은 프레임워크 영역(FR) 및 상보성 결정 영역 (CDR, 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄의 부분을 말한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 말한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 말한다. 본 발명에서 사용되는 방법에 따르면, CDR 및 FR에 배정되는 아미노산 위치는 카밧(Kabat) (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. , 1987 and 1991))에 따라 정의된다. 항체 및 항원 결합 단편의 아미노산 번호 역시 카밧에 따른다.
본원에서 사용되는 것처럼, "코돈 세트"는 원하는 변이 아미노산을 인코딩하기 위해 사용되는 여러가지 뉴클레오티드 트리플렛 서열의 세트를 말한다. 올리고뉴클레오티드의 세트는 예를 들어 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오티드 트리플렛의 모든 가능한 조합을 나타내고, 아미노산의 원하는 기를 인코딩할 서열을 포함하는 고상(solid phase) 합성에 의해 합성될 수 있다. 코돈 지정의 표준 형식은 당분야에 알려져 있고, 본원에 기술된 IUB 코드의 표준 형식이다. 본원에서 사용되는 것처럼, "비-무작위 코돈 세트"는 본원에서 기술된 것처럼 아미노산 선택의 범주를 부분적으로, 바람직하게는 완전히 채우는 선택 아미노산을 인코딩하는 코돈 세트를 말한다. 특정 위치에서의 선택된 뉴클레오티드 "동의성(degeneracy)"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당분야에 알려져 있다 (예를 들어 TRIM 접근[Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296: 57-86); Garrard & Henner, Gene (1993), 128: 103]). 특정 코돈 세트를 갖는 뉴클레오디트의 그런 세트는 상업적인 핵산 합성기(예를 들면, 미국 캘리포니아 포스터시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)로부터 입수가능)를 이용하여 합성하거나 또는 상업적으로(예를 들면, 미국 매릴랜드 록빌 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터) 입수할 수 있다. 따라서, 특별한 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 다른 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 다수를 포함하며, 전체 서열 중 코돈 세트에 의해 그 차이점이 만들어진다. 본 발명에 따라 사용되는 것처럼, 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산에 대해 혼성화를 할 수 있는 서열을 갖고, 또한 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수 있으나, 필수적인 것은 아니다.
"이종 DNA"는 호스트 세포(host cell)에 도입된 임의의 DNA이다. DNA는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 이의 융합체 또는 조합체를 포함하는 다양한 원천으로부터 유도될 수 있다. DNA는 호스트 또는 레시피언트(recipient) 세포 같은 동일한 세포 또는 세포 유형으로부터의 DNA, 또는 상이한 세포 유형, 예를 들면 포유동물 도는 식물로부터의 DNA를 포함할 수 있다. DNA는 임의적으로 마커 또는 선택 유전자, 예를 들면 항생물 내성 유전자, 온도 내성 유전자 등 포함할 수 있다. 본 발명의 UNQ 폴리펩티드 및 항체를 포함하는 호스트 세포 인코딩 이종 DNA가 그들의 용도와 함께 고려된다.
본원에서 사용된 것처럼, "매우 다양한 위치"는 알려진(지거나) 자연적으로 발생하는 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 비교할 때, 그 위치에서 표현되는 수많은 다른 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 위치한 아미노산의 위치를 말한다. 매우 다양한 위치는 전형적으로 CDR 영역에 있다. 한 면으로는, 알려진(지거나) 자연적으로 발생하는 항체 내의 매우 다양한 위치를 결정하는 능력은 카밧에 의해 제공되는 데이타[Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. , 1987 and 1991)]를 이용하면 용이 해진다. http://Immuno.bme.nwu.edu에 위치한 인터넷 기반의 데이타 베이스는 이러한 서열 중 매우 다양한 위치의 결정을 용이하게 하고, 인간 경쇄 및 중쇄 서열의 정렬 및 광범위한 수집을 제공한다. 본 발명에 따르면, 만약 그 위치에서 약 2개 내지 약 11개, 바람직하게는 약 4개 내지 9개, 및 바람직하게는 약 5개 내지 약 7개의 다른 가능한 아미노산 잔기 변이를 갖는다면, 아미노산 위치는 매우 다양하다. 일부 실시태양에서, 만약 그것이 바람직하게 약 2개 이상, 바람직하게 약 4개 이상, 바람직하게 약 6개 이상, 및 바람직하게 약 8개 이상의 다른 가능한 아미노산 잔기 변이를 그 위치에서 갖는다면, 아미노산 위치는 매우 다양하다.
본원에서 사용된 것처럼 "라이브러리"는 다수의 항원 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이러한 서열을 인코딩하는 핵산을 말하며, 서열은 본 발명의 방법에 따라 이 서열에 도입되는 변이 아미노산의 조합에서 다르다.
"파지 디스플레이"는 파지, 예를 들면 실모양의 파지(filamentous phage), 입자의 표면의 코트 단백질에 융합 단백질로서 변이 폴리펩티드가 디스플레이되는 기법이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위된 단백질 변이체의 큰 라이브러리가 빨리 그리고 효과적으로, 높은 친화성으로 타켓 분자에 결합하는, 그 서열들에 대해 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지의 펩티드 및 단백질 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 성질을 갖는 것에 대한 수백만개의 폴리펩티드의 스크리닝에 이용되어 왔다. 다가의 파지 디스플레이법은 실모양의 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII에의 융합을 통해 작은 단백질 및 작은 랜덤 펩티드를 디스플레이하는데 이용되어 왔다. 문헌[Wells and Lowman,Curr. Opin. Struct. Biol.,3:355-362(1992)] 및 상기 문헌에 인용된 문헌. 일가의 파지 디스플레이에서, 단백질 또는 펩티드 라이브러리는유전자 III 또는 그의 부분에 융합되고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재하의 낮은 수준에서 발현되어, 파지 입자는 융합 단백질의 한 카피를 디스플레이하거나 아무것도 디스플레이하지 않는다. 어비디티 효과(Avidity efftec)는 다가 파지에 비해 감소되어 분류는 고유의 리간드 친화성이 기초하고, 파지미드 벡터가 사용되며, DNA 조작을 간단하게 한다. 문헌[Lowman and Wells, Methods : A companion to Methods in Enzymology, 3: 205-0216 (1991)].
"파지미드(phagemid)"는 박테리아 복제 원점, 예를 들며,Co1E1 및 박테리오파지의 유전자간(intergenic) 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 실모양의 박테리오파지 및 삼각형의 박테리오파지를 포함하는 임의의 알려진 박테리오파지에서 이용될 수 있다. 플라스미드는 또한 일반적으로 항생 내성에 대한 선택가능한 마커를 포함할 것이다. 이 벡터들로 클론된 DNA의 절편은 플라스미드로서 성장될 수 있다. 이 벡터를 번식시킨 세포가 파지 입자의 생성에 대해 필요한 모든 유전자를 가지고 제공될 때, 플라스미드의 복제 모드는 순환 복제로 변화하여 한 가닥의 플라스미드 DNA의 카피 및 패키지 파지 입자를 생성한다. 파지미드는 전염성 또는 비-전염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어는 파지 코트 단백질 유전자 및 유전자 융합으로서 이종 폴리펩티드 유전자에 연결된 그의 단편을 함유하는 파지미드를 포함하며, 이종 폴리펩티드는 파지 입자의 표면에 디스플레이된다.
용어 "파지 벡터"는 이종 유전자를 함유하고, 복제가능한 박테리오파지의 양가닥 복재 형태를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제 및 파지 복제 형성을 허용하는 파지 복제 원점을 갖는다. 파지는 바람직하게 실모양의 박테리오 파지, 예를 들어 M13, f1, fd, Pf3 파지 또는 그의 유도체 또는 삼각형의 파지, 예를 들면 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, 등 또는 그의 유도체이다.
본원에서 사용되는 것처럼, "표적 아미노산"은 기지 및(또는) 천연 항체 또는 항원 결합 단편의 특별한 위치에서 발견되는 가장 공통적으로 나타나는 아미노산을 총괄한 아미노산 군에 속하는 아미노산을 말한다. 일부 실시태양에서, 가장 공통적으로 나타나는 아미노산은 기지 및(또는) 천연 항체 또는 항원 결합 단편의 바람직하게 약 50% 이상, 바람직하게 약 70% 이상, 바람직하게 약 80% 이상, 바람직하게 약 90% 이상, 바람직하게 모든 서열의 특별한 위치에서 발견되는 아미노산이다. 일부 실시태양에서, 가장 공통적으로 나타나는 아미노산은 기지 및(또는) 천연 항체 또는 항원 결합 단편의 바람직하게 약 50% 내지 약 100%, 바람직하게 약 60% 내지 약 90%, 바람직하게 약 70% 내지 약 85%, 바람직하게 약 80% 내지 약 85%의 서열의 특별한 위치에서 발견되는 아미노산이다. 알려진 항체 또는 항원 결합 단편은 그의 서열이 당분야에서 입수가능한 것, 예를 들어, 공공 접근이 가능한 데이타 베이스, 예를 들면 카밧 데이타베이스["Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., hand 1991] 및/또는 http//immuno.bme.nwu.edu에 위치한 데이타베이스에서 입수가능한 것이다. 아미노산 위치는 바람직하게 CDR 영역의 위치이다. 아미노산 표적 군은 특별한 위치에 대한 표적 아미노산 군을 말한다. 바람직하게, 표적 아미노산은 시스테인 잔기가 아니다. 경쇄 CDR1, CDR2, CDR3 및 중쇄 CDR1 및 CDR2에서의 위치의 경우, 전형적으로, 아미노산의 표적군은 공급원(source) 서열의 특별히 매우 다양하고, 용매-접근 가능한 위치에서 바람직하게 약 2 내지 약 7, 바람직하게 약 4 내지 약 9, 바람직하게 약 5 내지 약 7, 바람직하게 약 6개의 아미노산을 포함한다.
용어 "프로테오글리칸(proteoglycan)"은 적어도 하나의 글리코사미노글리칸 측쇄가 분자의 단백질 코어에 공유적으로 부착된 분자를 말한다. 본 발명에 따른 프로테오글리칸 합성 부족 세포주는 갈락토실트랜스페라제 I이 부족한 세포주를 포함한다. 한 바람직한 실시태양에 따르면, 세포주는 CHO-psbg 세포주이다.
용어 "길항제"는 천연 STOP-1 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하고, 천연 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분자로, 길항제의 결합은 (1) 올리고머 형태의 천연 STOP-1 폴리펩티드에 대한 것, (2) 천연 인간 STOP-1의 잔기 94-243에 대한 것 및(또는) (3) 본 발명의 모노클로날 항체(예를 들면, 본 발명의 디파짓(deposit)된 항체, 등)에 의해 억제될 수 있는 것이다(예를 들면, STOP-1 및 6B12를 이용한 경쟁적 ELISA 분석에서 관찰됨). 한 실시태양에 따르면, 길항제는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에 따르면 6B12는 STOP-1에 대한 길항제의 결합을 억제할 수 있다. 다른 실시태양에 따르면, 길항제는 인간 STOP-1의 잔기 33-52 또는 33-53 내의 잔기 또는 그의 비-인간 STOP-1 등가물내에 결합한다.
용어 "소분자 길항제"는 분자량이 1500 달톤 이하이고, 본 발명에 따른 길항제인 임의의 분자를 말한다. 한 실시태양에 따르면, 소분자 길항제는 약 500 달톤 미만이다.
한 바람직한 실시태양에 따르면, 길항제는 천연 STOP-1을 발현하는 세포에서 세포 증식을 차단, 억제 또는 중화한다. 한 실시태양에서, 길항제 또는 소분자 길항제는 STOP-1이 결합하는 세포의 이동(migration)을 막는다. 한 바람직한 실시태양에서, 길항제 또는 소분자 길항제는 STOP-1의 삼량체 형태에 특이적으로 결합한다. 적절한 길항제는 본 발명의, 항체, 천연 STOP-1 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 펩티드 등을 포함한다. STOP-1 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법은 STOP-1 폴리펩티드를 후보 길항제 분자와 접촉시키고, STOP-1 폴리펩티드와 연관된 하나 이상의 생물학적 활성에서 감지가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "증강제(potentiator)"는 천연 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 천연 STOP-1 폴리펩티드의 생물학적 활성을 증가시키는 임의의 분자를 말하며, 증강제는 천연 STOP-1 폴리펩티드의 올리고머 형태에 결합할 수 있고, 이하로 구성되는 군으로부터 선택된 추가적 활성을 하나 이상 갖는다: (1) 천연 인간 STOP-1의 잔기 94-243 중 잔기에 결합할 수 있음; (2) 세포에 STOP-1을 결집시킬 수 있음; 및 (3) 본 발명의 모노클로날 항체 S& 또는 S4 항체에 의해 경쟁될 수 있음(예를 들면, STOP-1, S7 또는 S4 및 증강제를 이용한 경쟁적 ELISA 분석에서 관찰되는 것 같음). 한 실시태양에 따르면, 증강제는 세포에 대한 STOP-1의 결합을 증가시킨다(예를 들면, HUVEC 세포, HeLa 세포 및 HT1080 세포). 한 바람직한 실시태양에서, 아고니스트가 STOP-1의 삼량체 형태에 결합한다. STOP-1 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법은 STOP-1과 결합하는 세포를 STOP-1 폴리펩티드와 접촉시키고, STOP-1 폴리펩티드와 연관된 하나 이상의 생물학적 활성에서 감지가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다(예를 들면, STOP-1 폴리펩티드의 증가된 결합, 세포 증식 또는 세포 이동).
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "경감"은 목적이 표적된 병리적 상태 또는 장애를 예방 또는 늦추는(완화시키는) 것인, 처치 치료 및 예방 또는 방지 방법 모두 말한다. 치료가 필요한 경우는 장애를 갖기 쉽거나 장애를 예방하려는 경우 뿐만 아니라 이미 장애가 있는 경우를 포함한다. 이 용어는 만약 그들이 증세, 합병증 또는 기타 질병과 연관된 문제를 완화, 경감 또는 감소시키거나, 증세, 합병증 또는 기타 질병과 연관된 문제의 빈도 또는 발병의 기회를 완화, 경감 또는 감소시킨다면, 본원에서의 치료 및 예방적 사용이 성공적인 것을 나타낸다.
만약 본 발명의 방법에 따른 길항제의 치료적 양을 투여받은 후, 환자가 이하의 것 중 하나 또는 그 이상이 없거나 관찰가능하고/거나 측정가능한 감소를 보인다면, 대상체 또는 포유동물은 STOP-1 폴리펩티드-발현 암에 대해 성공적으로 "치료"된다: 암 세포 수 또는 존재의 감소; 암종 크기의 감소; 연 조직 및 뼈로의 암 확산을 포함하는, 말단 기관으로의 암세포 침투의 억제 (즉, 일정 정도로 늦추거나, 바람직하게는 중단시키는 것); 암종 전이의 억제 (즉, 일정 정도로 늦추거나, 바람직하게는 중단시키는 것); 암종 성장의, 일정 정도의, 억제; 및/또는 구체적 암과 연관된 하나 이상의 증상을 일정 정도로 경감; 감소된 이병률 및 사망률, 및 삶 질의 문제의 향상. 항-STOP-1 항체 또는 STOP-1 결합 올리고펩티드가 존재하는 암 세포의 성장을 억제하고/거나 죽인다는 점에서, 이것은 세포증식억제(cytotoxic) 및/또는 세포독성(cytotoxic)일 수 있다. 이러한 신호 또는 증세의 감소는 환자에 의해서도 역시 감지될 수 있다.
만약 본 발명의 방법에 따른 길항제 또는 아고니스트의 치료적 양을 투여받은 후, 환자가 이하의 것 중 관찰가능하고/거나 측정가능한 [채워질 것임] 및/또는 비정상 혈관형성(angiogenesis)과 연관된 증세 하나 이상의 어느 정도 완화; 및 삶 질의 향상 문제의 향상을 감소를 보인다면, 대상체 또는 포유동물은 비정상 혈관형성에 대해 성공적으로 "치료"된다.
질병에서의 성공적 치료 및 향상을 평가하기 위한 상기 파라미터들은 의사에게 친숙한 과정에 의해 쉽게 측정가능하다. 암 치료법에 대하여, 효능은 예를 들면 TTP(Time to disease progression)을 평가하고/거나 RR(Response rate)을 측정하여 측정될 수 있다. 전이는 스태깅 테스트(staging test), 뼈 스캔, 칼슘 수준 테스트 및 뼈에 확산을 측정하는 다른 효소에 의해 측정될 수 있다. CT 스캔은 또한 그 영역에서 골반 및 림프절에 퍼져 있는 것을 보기 위해 실시할 수 있다. 흉부 X-선 및 공지 방법에 의한 간 효소 수준 측정은 각각 폐 및 간에의 전이를 보기 위해 실시할 수 있다. 질병을 관찰하는 다른 공지 방법에는 TRUS(transrectal ultrasonography) 및 TRNB(transrectal needle biopsy)이 포함된다.
보다 국부화된 암인 방광 암에 대해서는, 질환의 진행을 결정하는 방법은 방광경 검사에 의한 비뇨기 세포학적 평가, 뇨중의 혈액의 존재의 모니터링, 초음파촬영술에 의한 요로상피관의 가시화 또는 정맥 신우조영술, 전산화단층촬영술 (CT) 및 자기공명영상(MRI)를 포함한다. 원위 전이의 존재는 복부의 CT, 흉부 x-레이, 또는 골격의 방사선핵종 영상화에 의해 검정될 수 있다.
"만성" 투여는 급성 방식과 반대로 약제를 계속적인 방식으로 투여하여 연장된 기간동안 초기의 치료 효과(활성)를 유지하도록 하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 투여하는 것이 아니라, 성질상 주기적인 치료이다.
암의 치료, 증상의 완화 또는 진단 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯하여 포유동물(즉, 환자)로 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직하게는 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 다른 치료제와 "병용하여" 투여한다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것이 포함된다.
본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제가 포함된다. 생리학상 허용되는 담체는 종종 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 산화방지제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN, 상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS, 상표명)가 포함된다.
"고상(solid phase)" 또는 "고체 담체(solid support)"는 본 발명의 항체, 길항제 또는 폴리펩티드가 접착되거나 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함된 고상의 예에는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어, 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘(silicone)이 포함된다. 특정 실시태양에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시태양에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
본원에 사용된 "면역부착소"이란 면역글로불린 불변 도메인의 작용기 기능과 이종 단백질(부착소)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로는 면역부착소은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌(즉, '이종'임), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역부착소 분자의 부착소 부분은 전형적으로 천연 STOP-1 단백질의 부분과 같은 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 적어도 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 아형, IgA(IgA-1및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM 등 어떠한 면역글로불린으로부터든지 얻을 수 있다.
"리포좀"은 약물(예를 들어, STOP-1 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체, 또는 STOP-1 결합 올리고펩티드)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 소낭(小囊)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형태로 배열되어 있다.
본원에서 정의된 "소"분자 또는 유기 "소"분자란 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것을 말한다.
본원에 개시된 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "유효량"은 특정하게 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 경험적으로 및 언급된 목적과 관련된 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다.
용어 "치료 유효량"이란 포유동물(즉, 환자)에서 질환 또는 장애를 "치료"하기에 효과적인 본 발명의 항체, 폴리펩티드, 길항제 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포 수의 감소; 종양 크기의 감소; 주변 기관으로의 암 세포 침윤의 억제(즉, 어느 정도까지의 지연 및 바람직하게는 정지); 전이의 억제(즉, 어느 정도까지의 지연 및 바람직하게는 정지); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및(또는) 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감을 일으킬 수 있다. 본원의 "치료(treating)"의 정의를 참고할 것. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방해하고(하거나) 죽일 수 있는 정도까지, 이는 세포성장억제성(cytostatic) 및(또는) 세포독성(cytotoxic)일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "성장 억제량"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들면, 암 세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포성장을 억제하는 목적을 위한 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "성장 억제량"은 경험적으로, 및 공지된 방법 또는 본원에 제공된 예에 따라 결정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "세포독성량(cytotoxic amount)"은 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 종양, 예를 들면, 암 세포의 파괴를 일으킬 수 있는 양이다. 신생물 세포성장을 억제하는 목적을 위한 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "세포독성량"은 경험적으로, 및 공지된 방법 또는 본원에 제공된 예에 따라 결정할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 예를 들면, 단일의 항-STOP-1 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-STOP-1 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일 쇄 항-STOP-1 항체, 및 이들이 천연 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고(하거나) 본 발명의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 나타내는 한, 항-STOP-1 항체의 단편을 포함한다(하기 참조). 한 실시태양에 따르면, 항체는 STOP-1의 올리고머형, 예를 들면, 삼량체형에 결합한다. 다른 실시태양에서, 항체는 잔기 94 내지 243 사이에서 인간 STOP-1에 특이적으로 결합한다. 다른 실시태양에 따르면, 항체는 STOP-1에 특이적으로 결합하는데, 이 결합은 본 발명의 모노클로날 항체(예를 들면, 본 발명의 기탁된 항체, 등)에 의해 저해될 수 있다. 항체의 "기능적 단편 또는 유사체"는 이것이 지칭되는 항체와 공통되는 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물이다. 항-STOP-1 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 STOP-1 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 세포 증식을 유도하는 STOP-1 분자의 활성을 방해하거나 실질적으로 감소시킨다. 용어 "면역글로불린(Ig)"은 본원에서 "항체"와 상호교환가능하게 사용된다. 한 실시태양에 따르면, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 GWNSVSRIDEELPK을 갖는 펩티드에 결합하지 않는다.
"단리된" 항체는 자신의 자연 환경으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 있을 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99중량％ 초과의 항체로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 동질성을 갖도록 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 자연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원래 위치에 존재하는(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다
기본 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(L)로 구성된 헤테로사량체 당단백질이다(IgM 항체는 J 쇄라고 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 기본 헤테로사량체 단위의 5개로 이루어지고, 따라서, 10개의 항원 결합 부위를 가지는 한편, 분비된 IgA 항체는 J 쇄와 함께 기본 4-쇄 단위의 2 내지 5를 포함하는 다가 조립체를 형성하도록 중합될 수 있다). IgG의 경우, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 두 중쇄는 중쇄 이소형(isoform)에 따라 1 이상의 디술피드 공유결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH) 및 이 도메인에 후속하는, α 및 γ쇄 각각에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 나란히 배열되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 나란히 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄 와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH 및 VL의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 항체의 상이한 부류의 구조 및 성질은 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조할 것.
임의의 척추동물 종으로부터 유래한 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 유형 중의 하나로 분류될 수 있다. 면역글로불린은 중쇄의 불변 도메인(CH)의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불리우는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있다. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서의 비교적 경미한 차이에 근거하여 서브클래스로 더욱 분류되는데, 예를 들면, 인간은 다음의 서브클래스를 나타낸다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
"가변"이란 용어는 항체들 간에 가변 도메인의 특정 영역의 서열이 크게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원에 대한 결합을 중개하고, 그 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110-아미노산 스팬 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지는 않는다. 대신, V 영역은 각각이 9-12 아미노산 길이인 "고도 가변 영역(hypervariable regions)"이라고 불리우는 극단적 가변성을 갖는 보다 짧은 영역에 의해 분리되는 15-30 아미노산의 프레임워크 영역(FR)이라고 불리우는 비교적 불변의 신장부로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 대개 β-시이트 구조를 취하며, 루프 연결을 형성하는 3개의 고도 가변 영역에 의해 연결되는 4개의 FR을 포함하고, 어떤 경우에서는 β-시이트 구조의 일부를 형성한다. 각각의 쇄에서의 고도가변영역은 FR에 의해 인접하게 가까이 모여있으며, 다른 쇄로부터의 가변영역과 함께 항체의 항원-결합부위를 형성하는데 기여한다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조. 불변 도메인은 항원에 항체가 결합하는데 직접적으로 관여하지는 않으나, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기(effector) 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "고도가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 고도 가변 영역은 "상보성 결정 영역", 즉 "CDR"(경쇄 가변 도메인(VL)의 잔기 약 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3), 및 중쇄 가변 도메인(VH)의 잔기 약 31 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3) (한 실시태양에서는 H1은 약 31-35 부근이다)); 문헌(Kabar et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, 5th Ed. Public Health Services, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1990])으로부터의 아미노산 잔기 및(또는) "고도 가변 루프"(경쇄 가변 도메인(VL)의 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3), 및 중쇄 가변 도메인(VH)의 잔기 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3); 문헌(Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917[1987])으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이성이 높고, 단일의 항원 부위를 갖는다. 또한, 상이한 결정자(에피토프)에 대해 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리 각 모노클로날 항체는 항원에 대해 단일의 결정자를 갖는다. 이들의 특이성 외에도, 모노클로날 항체는 다른 항체로 오염되지 않은 상태에서 합성된다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"이란 어떤 특정 방법에 의해 항체를 생산하는 것이 필요하다는 점을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[콜러 등, Nature, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마 배양법 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서의 재조합 DNA법에 의해 제조될 수 있다(미국특허 제4,817,567호 참조). 또한 "모노클로날 항체"는 클락슨 등, Nature, 352: 624-628면(1991) 및 마르크스 등, J. Mol. Biol. 222: 581-597면(1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다.
본원의 모노클로날 항체는 구체적으로는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 항체 그룹 또는 서브그룹에 속하거나 특정 종으로부터 유도된 항체의 해당 서열과 동일하거나 유사하고, 쇄의 나머지 부분은 다른 항체 그룹 또는 서브그룹에 속하거나 다른 종으로부터 유래된 항체(바람직한 생물학적 활성을 갖는다면 이러한 항체의 단편도 포함)의 해당 서열과 동일하거나 유사한 "키메릭(chimetic)" 항체를 포함한다[미국특허 제4,816,567호 및 모리슨 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국판 81: 6851-6855면(1984) 참조]. 본원에서 관심의 대상이 되는 키메릭 항체는 비인간 영장류(예: 구세계 원숭이, 유인원 등) 및 인간 가변 영역 서열로부터 유도된 가변 도메인 항원-결합 서열을 포함하는 "영장류화된(primatized)" 항체를 포함한다.
"완전(intact)" 항체는 항원-결합 부위 뿐 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예: 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이형일 수 있다. 바람직하게는, 완전 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 완전 항체의 일부, 바람직하게는 완전 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabodies); 선형 항체 (미국특허 제5,641,870호, 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)] 참조); 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 제조된 다중특이성 항체를 포함한다. "선형 항체"는 일반적으로 문헌[Zapata etal., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)]에 기술된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 탠덤(tandem) Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 2종 특이성 또는 단일 특이성일 수 있다.
항체의 파파인(Papain) 소화는 "Fab" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 용이하게 결정화되는 능력을 지칭하는 나머지 "Fc"단편을 생산한다. Fab 단편은 H 쇄(VH)의 가변 영역 도메인을 갖는 전체 L 쇄 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)으로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대하여 1가성이다. 즉, 이는 단일 항원- 결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 2가성 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대체로 상응하고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 수득한다. Fab'단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 추가의 몇개 잔기를 갖는다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 원래는 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab'단편의 쌍으로서 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 유지되는 양 H 쇄의 카르복시-말단 부를 포함한다. 항체의 효과기 기능은, 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용기 (FcR)에 의해 인식되는 부분인 Fc 영역에서의 서열에 의해 결정된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 이들 두 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H쇄 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 CDR을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일 쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결되어 있는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. sFv의 개관을 위해서는 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)] 및 [Borrebaeck 1995, 하기 문헌]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개의 잔기)가 있는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 제작하여 V 도메인들의 쇄내 페어링이 아닌 쇄간 페어링을 형성시킴으로써 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위가 있는 단편을 생성시켜 제조한 작은 항체 단편을 의미한다. 이중특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 증진시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 초가변 루프의 전체 또는 실질적으로 전체는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"종-의존성 항체", 예를 들어 포유동물 항-인간 IgE 항체는 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화성이 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성 보다 더 강한 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합" (즉, 결합 친화성 (Kd) 값이 단지 약 1 x 10-7 M, 바람직하게는 단지 약 1 x 10-8 M, 가장 바람직하게는 단지 약 1 x 10-9 M임)하지만, 제2의 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성은 인간 항원에 대한 결합 친화성 보다 약 50배 이상 또는 약 500배 이상 또는 약 1,000배 이상 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기에서 정의된 바와 같은 다양한 유형의 항체 중 임의의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
"STOP-1 결합 올리고펩티드"는 본원에 기재한 바와 같은 STOP-1 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. STOP-1 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성법을 사용하여 화학적으로 합성할 수도 있거나, 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수도 있다. 통상적으로, STOP-1 결합 올리고펩티드의 길이는 아미노산 약 5개 이상, 다르게는 약
개 이상이며, 이러한 올리고펩티드는 본원에 기재한 바와 같은 STOP-1 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 하나의 실시태양에 따르면, STOP-1 결합 올리고펩티드는 6B12 항체가 결합하는 영역과 동일하거나 그와 중첩되는 영역에 결합한다. STOP-1 결합 올리고펩티드는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대한 올리고펩티드 라이브러리의 스크리닝 기술이 당업계에 공지되어 있음을 주지한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 동 제5,750,373호, 동 제4,708,871호, 동 제4,833,092호, 동 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호, 동 제5,663,143호, PCT 공개공보 WO 84/03506 및 W0 84/03564, [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)], [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)], [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)], [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)], [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378], [Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832], [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624], [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581], [Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
대상 항원, 예를 들어 STOP-1과 같은 종양-관련 폴리펩티드 항원 표적에 "결합"하는 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물은 상기 항원에 충분한 친화도로 결합하여, 상기 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물은 상기 항원을 발현하는 세포의 표적화에 진단제 및(또는) 치료제로서 유용하고 다른 단백질과 유의한 교차반응하지 않는다. 이러한 실시태양에서, 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물과 "비-표적" 단백질과의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 분석 또는 방사성 면역침전법 (RIA)으로 측정했을 때, 상기 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물과 그의 특정 표적 단백질과의 결합의 약 10％ 미만일 것이다. 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 표적 분자와의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합," "그에 특이적으로 결합하는" 또는 "그에 특이적인"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 조절 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과 유사한 조절 분자와의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 특이적 결합이 나타난다. 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합," "그에 특이적으로 결합하는" 또는 "그에 특이적인"이라는 본원에 사용된 용어는 예를 들어, 표적에 대한 Kd가 약 10-4 M 이상, 다르게는 약 10-5 M 이상, 다르게는 약 10-6 M 이상, 다르게는 10-7 M 이상, 다르게는 약 10-8 M 이상, 다르게는 약 10-9 M 이상, 다르게는 약 10-10 M 이상, 다르게는 약 10-11 M 이상, 다르게는 약 10-12 M 이상, 또는 그 이상인 분자에 의해 나타낼 수 있다. 한 실시태양에 있어서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 비-STOP-1 단백질)에 대해 실질적으로 결합하지 않으면서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다. 인간 천연 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 비인간 천연 STOP-1 폴리펩티드에도 결합할 수 있는 것으로 이해된다.
STOP-1 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포의 "성장을 억제하는" 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물 또는 "성장 억제" 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물은 적절한 STOP-1 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하는 암세포의 성장을 측정가능하게 억제하는 것이다. 바람직한 성장억제성 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물은 적절한 대조군에 비해 STOP-1-발현 종양 세포의 성장을 20％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 내지 약 50％, 훨씬 더 바람직하게는 50％ 초과 (예를 들어, 약 50％ 내지 약 100％) 억제하며, 여기서 대조군은 전형적으로 시험될 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물로 처리하지 않은 종양 세포이다. 한 실시태양에서, 성장억제는 세포 배양물 중에서 약 0.1 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이때 성장억제는 종양 세포를 항체에 노출시킨지 1-10일 후 측정한다. 생체내 종양 세포의 성장억제는 하기 실시예 단락에 기재된 바와 같은 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg의 항-STOP-1 항체를 투여했을 때 항체의 1차 투여로부터 약 5일 내지 3개월, 바람직하게는 약 5일 내지 30일 이내에 종양 크기 또는 종양 세포의 증식이 감소되는 경우, 상기 항체는 생체내에서 성장억제성이다.
항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 말하고, 항체 이소타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 대식작용 (phagocytosis); 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 상에 결합된 분비 Ig가 항원을 보유하는 표적 세포에 이들 세포독성 이펙터 세포를 특이적으로 결합하도록 하고, 이어서 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포의 "무기"이고 이러한 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464쪽, 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 대상 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 바와 같은 동물 모델 등에서 생체내 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 의미한다. 바람직한 FcR은 인간 천연 서열 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것으로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체가 포함되는데, 이들 수용체의 대립유전자 변이체와 다르게 스플라이싱된 (alternatively spliced) 형태도 포함된다. FcγRII 수용체에는 주로 세포질 도메인이 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (개관을 위해서는 문헌 [M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]을 참조). FcR에 대한 개관을 위해서는 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 추후로 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달시키는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적인 보체 활성화 경로는 그의 인식 항원과 결합한 (적절한 서브클래스의) 항체에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합됨으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 의미한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예로는 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포암종을 비롯한 폐암, 복막암, 간암, 위장암을 비롯한 위암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요도암, 간종, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 다발성 흑색종 및 B-세포 림프종, 뇌암 뿐만 아니라 두부경부암 및 관련 전이가 있다.
용어 "세포 증식성 질환" 및 "증식성 질환"은 특정한 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 질환을 의미한다. 한 실시태양에 있어서, 세포 증식성 질환은 암이다. 한 실시태양에 있어서, 세포 증식성 질환은 결합조직 증식이다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양"은 악성이든 양성이든 관계없이 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다.
본 발명에 따른 용어 비정상적인 혈관형성은 질병 상태에서 새로운 혈관이 지나치게, 불충분하게 또는 부적절하게 (예를 들어, 혈관형성의 장소, 시기 또는 발생이 의학적 관점에서 바람직하지 않음) 성장하거나, 또는 이러한 현상이 질병 상태를 유발할 경우 사용한다. "지나친, 불충분한 또는 비조절성 혈관형성"은 질병 상태, 예를 들어 암, 특히 혈관성 고형 종양 및 전이성 종양 (결장암, 폐암 (특히, 소세포 폐암), 또는 전립선암을 포함), 눈의 신혈관생성에 의한 질병, 특히 당뇨병성 실명, 망막병증, 주로 당뇨병성 망막병증 또는 연령-유도성 황반 변성 및 혈관형성 (rubeosis); 건선, 혈관 모세포종, 예를 들어 혈관종; 염증성 신질환, 예를 들어 사구체 신염, 특히 사구체기질증식성 (mesangioproliferative) 사구체 신염, 용혈성 요독 증후군, 당뇨병성 신장병증 또는 고혈압성 신 경화증; 다양한 염증성 질병, 예를 들어 관절염, 특히 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 건선, 사르코이드증, 동맥성 동맥경화증 및 이식후 발생하는 질병, 자궁 내막증 또는 만성 천식, 및 70가지 이상의 기타 증상 악화의 원인이 되는 새로운 혈관의 성장이 있는 질병 상태에서 발생한다. 새로운 혈관은 유병 조직에 영양분을 공급할 수 있고, 정상 조직을 파괴할 수 있으며, 암의 경우, 새로운 혈관은 종양 세포가 순환계를 빠져나와 다른 장기에 정착시킬 수 있다 (종양 전이). 불충분한 혈관형성은 유병 상태, 예를 들어 관상동맥 질병, 뇌졸중, 및 상처 치유 지체와 같은 질병에서 질병을 악화시키는 부적절한 혈관 성장이 있는 경우 나타난다. 또한, 궤양, 뇌졸중 및 심장 마비는 자연 치유에 정상적으로 필요한 혈관형성이 없어서 야기될 수 있다. 본 발명은 상기 언급한 질환이 발생할 위험이 있는 환자의 치료도 의도한다.
본 발명의 STOP-1 길항제를 받기 위한 후보자인 다른 환자들은 섬유혈관 조직의 비정상 증식, 장미 여드름, 후천성 면역 결핍증, 동맥 폐색, 아토피 각막염, 박테리아성 궤양, 베케트 병, 혈액계 종양, 목동맥 폐쇄 질환, 맥락막 신생혈관 형성, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트 렌즈 과착용, 각막 이식 거부, 각막 신생혈관 형성, 각막 이식 신생혈관, 크론병, 일스 병, 유행성 각막결막염, 진균 궤양, 단순 헤르페스 감염, 대상포진 감염, 과다점성 증후군, 카포시 육종, 백혈병, 지질 변성, 라임병, 가장자리 각질용해증, 무렌 각막 궤양, 나병 이외의 미코박테리아 감염, 근시, 눈 혈관형성 질병, 안구 결점(optic pits), 오슬러-웨버 증후군 (오슬러-웨버-렌두, 골관절염, 파젯 병, 평면부염, 유사천포창, 파이렉테뉼로시스(phylectenulosis), 다발동맥염, 레이저 후 합병증, 원충 감염, 탄력섬유거짓황색증, 익상편 건성 각막증, 방사상 각막절개, 망막 신생혈관, 미숙아의 망막병증, 수정체뒤 섬유증식, 사르코이드, 공막염, 겸상적혈구 빈혈, 소그렌 증후군, 고형 종양, 스타가르트 병, 스티븐 존슨 병, 상윤부 각막염, 매독, 전신성 루푸스, 테리엔 변연변성, 톡소포자충증, 외상, 유잉 육종 종양, 신경모세포종 종양, 골육종 종양, 망막모세포종, 횡문근육종, 궤양성 직장염, 정맥 폐쇄, 비타민 A 결핍 및 베게너 사르코이드증, 당뇨병 관련 바람직하지 않는 혈관형성, 기생충 병, 비정상 상처 치유, 수술 후 비대, 상처 또는 외상, 모발 성장 억제, 배란 억제 및 황체 형성, 이식 억제 및 자궁 내 배란 발전의 억제를 갖거나, 이들이 진행되는 위험에 있다.
항혈관형성 요법은 이식 거부, 폐렴, 신증후군, 자간전증, 심장막염과 관련있는 것과 같은 심장막삼출, 및 가슴막 삼출, 바람직하지않는 혈관 투과로 특징되는 질병 및 질환, 예를 들어, 뇌종양과 관련있는 부종, 암과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐렴, 신증후군, 심장막삼출 및 가슴막 삼출 등의 일반 치료에 유용하다.
본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 다른 혈관형성-의존성 질병은 혈관 섬유종 (출혈하기 일쑤인 비정상 혈관), 혈관형성 녹내장 (눈에서 혈관의 비정상 서성장), 동정맥 기형 (정맥과 동맥간의 비정상 교류), 비유착 골절 (잘 낫지 않는 골절), 죽상경화판 (동맥의 경화), 육아종 화농 (혈관에 생긴 보통의 상처 병변), 피부경피증 (결합조직 질병의 한 형태), 혈관종 (혈관에 생긴 종양), 트라코마 (제3세계에서 실명의 최고 원인), 혈우병성 관절증, 혈관 부착 및 비대 상처 (비정상 상처 형성)을 포함한다.
혈관은 뼈 파괴 및 성장의 제어 조절에 중요한 역할을 맡기 때문에, 또는 염증 과정에 매개되는 조직 파괴 과정(콜라게나제 활성, 파골세포의 활성 등) 또는 염증을 막음으로써, 본 발명에 따른 증강제 즉 작용제은 질병 또는 상처로부터의 뼈 및(또는) 연골의 회복을 자극 또는 향상할 수 있다. 본 발명의 STOP-1 증강제 또는 작용제로 치료될 뼈 상처 또는 질병은 치주질환, 다른 치아 수선 과정, 골다공증 및 골절을 포함한다.
본 발명에 따른 "기질 표적화제(stromal targeting agent)"는 다른 조직과 비교하여 실질적으로 기질 조직을 인식하고 여기에 결합하는 시약이다. 기질 조직이란 장기, 선 또는 기타 구조의 연결 조직 골격으로서, 장기 또는 부분의 특수 작용을 수행하는 조직과 구별된다. 기질 표적화제의 예로 FAP, 파스킨(fascin), HSP47, 메소텔린(mesothelin) 및 전립선 줄기 항원에 특이 결합하는 항체를 포함한다.
"세포 사멸"을 유발하는 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 작용제 또는 조성물은 생육가능한 세포를 생육불가능하게 야기하는 것이다. 이 세포는 STOP-1 폴리펩티드를 발현하는 세포, 바람직하게 동일 조직 형태와 비교하여 STOP-1 폴리펩티드를 과발현하는 세포이다. 바람직하게, 이 세포는 암 세포, 예를 들어, 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 장, 갑상선, 이자 또는 방광 암 세포일 수 있다. 시험관내 세포 사멸을 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 유도되는 세포 사멸과 구별하기 위하여 보체 및 면역 작동체 세포 없이 결정할 수 있다. 이와 같이, 열 불활성화된 혈청을 사용(즉, 보체 없이)하고, 면역 작동체 세포 없이, 세포 사멸에 대한 검정을 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 작용제 또는 조성물이 세포 사멸을 야기할 수 있는가를 결정하기 위하여, 프로피디움 요오다이드(propidium iodide (PI)), 트립판 블루(trypan blue)를 흡수시켜 막의 보전성의 상실을 평가하거나 (문헌 [Moore et al.Cytotechnology 17: 1-11 (1995)] 참조) 또는 7AAD를 비처리 세포와 비교하여 검정할 수 있다. 바람직한 세포 사멸 유발 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물은 BT474 세포에서 PI 흡수 검정에서 PI 흡수를 유발하는 것들이다.
"STOP-1 발현 세포"는 내생 또는 감염된 STOP-1 폴리펩티드를 세포 표면에 또는 분비된 형태로 발현하는 세포이다. "STOP-1 발현 암"은 세포 표면에 존재하는 STOP-1 폴리펩티드를 갖거나, STOP-1 폴리펩티드를 분비하는 세포를 포함하는 암이다. 다른 태양으로, "STOP-1 발현 암"은 임의로 STOP-1 폴리펩티드의 충분한 양을 생성하고 분비하여, 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 작용제 또는 조성물이 거기에 결합하고, 암에 대하여 치료효과를 갖는다. STOP-1 폴리펩티드를 "과발현"하는 암은 동일 조직 형태의 암이 아닌 세포에 비해, 이 세포 표면에서 현저히 많은 STOP-1 폴리펩티드를 갖거나, 생성 및 분비하는 암이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭 또는 전사의 증가 또는 번역의 증가에 의해 야기될 수 있다. 세포 표면에 존재하거나 세포에 의해 분비된 STOP-1 단백질의 양의 증가를 평가함으로써, STOP-1 폴리펩티드 과발현을 진단 또는 예후 검정으로 결정할 수 있다. (예를 들어, STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산으로부터 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있는 단리된 STOP-1 폴리펩티드에 대하여 제조된 항 STOP-1 항체를 사용한 면역조직화학 검정을 통하여; FACS 분석을 통하여 등). 별법으로, 또는 추가로, 세포 중의 STOP-1 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 양을, 예를 들어 STOP-1 코딩 핵산 또는 이의 보체와 상응하는 핵산 기초 프로브를 사용한 제자리 형광 혼성화, (FISH; 1998년 10월에 간행된 W098/45479 참조), 써든 블롯팅(Southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blotting), 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술, 예컨대 실시간 양적 PCR (RT-PCR)를 통하여, 측정할 수 있다. 또한, STOP-1 폴리펩티드 과발현을 혈장과 같은 생물학적 유액에서 발산된 항원을 측정함으로써, 예를 들어 항체 기초 검정을 사용하여 STOP-1 폴리펩티드 과발현을 연구할 수 있다 (또한, 예를 들어 1990년 6월 12일에 허여된 미국 특허 번호 4,933, 294; 1991년 4월 18일에 공개된 W091/05264; 1995년 3월 28일에 허여된 미국 특허 5,401,638; 및 문헌[Sias et al. , J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)] 참조). 상기 검정을 차치하고, 당업자는 여러 체내 검정을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 포유동물 체내에서 세포를 검지가능 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 노출할 수 있고, 항체의 세포에의 결합을 방사선에 대한 외부 스캔 또는 항체에 이미 검출된 포유동물로부터 취한 생체검사를 분석함으로써 평가할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표지"는 폴리펩티드, 항체, 작용제 또는 조성물과 직접 또는 간접으로 결합되어 "표지된" 폴리펩티드, 항체, 작용제 또는 조성물을 생성하는 검지가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
표지는 자체로 검지가능하거나 (예를 들어 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소 표지의 경우, 검지가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학 교체를 촉매화할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 막고(막거나) 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성동위원소 (예를 들어, At2ll, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성동위원소), 화학치료제 예를 들어 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아미신(adriamicin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) (빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신(mitomycin) C, 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 기타 층간삽입제 (intercalating agent), 효소 및 이의 단편 예컨대 핵산분해(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 독소 예컨대 소분자 독소 또는 효소적으로 활성 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 독소 및 이들의 단편 및(또는) 변형물 및 아래 기술하는 다양한 항암제 또는 항종양제를 포함하고자 한다. 다른 세포독성 약제를 아래에서 기술한다. 종양제거제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.
"화학치료제"는 암의 치료에 사용되는 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이톡산(CYTOXAN)(등록상표) 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan); 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 에틸렌이민 및 메틸아멜아민 예컨대 알트레아민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에티일렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌(acetogenin) (특히 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone)); 캄프토테신(camptothecin) (합성 유사체 토포테칸(topotecan)을 포함함); 브리오스타틴(bryostatin); 칼리스타틴(callystatin); CC-1065 (이의 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체를 포함함); 크립토파이신(cryptophycin) (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 두오카르마이신(duocarmycin) (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘레우테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 아사르코딕타이인(asarcodictyin); 스폰지스타틴(spongistatin); 니트로겐 무사르드(nitrogen musards) 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민(mechlorethamine) 옥시드 히드로클로라이드, 멜파란(melphalan), 노벰비친(novembichin), 펜에스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 무스타드(uracil mustard); 니트로우레아, 예컨대 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 루무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 및 라님누스틴(ranimnustine); 항생제 예컨대 에네디인(enediyne) 항생제 (예를 들어, 칼리테아미신(calicheamicin), 특히 칼리테아미신 감마 1I 및 칼리케아미신 오메가 Il (예를 들어 문헌[Agnew, Chem Intl. Ed.Engl., 33: 183-186(1994)] 참조); 디네미신(dynemicin), 예를 들어 디네미신 A; 비포스포네이트 예컨대 클로드로네이트(clodronate); 에스페라미신(esperamicin); 뿐만아니라 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin) 발색단(chromophore) 및 관련 크로모프로틴 에네디인 항생제 발색단), 아크라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 오트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레이마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycinis), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표) 독소루비신(doxorubicin) (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥소루비신 포함), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin) 예컨대 아시미토바이신(asmitomycin) C, 마이코페놀산, 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투버시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항대사제 예컨대 메트록세이트 및 5-플루오로우라실(fluorouracil) (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노테린(denopterin), 메트록세이트, 프테로프테린(pteropterin), 트리메트록세이트(trimetrexate); 푸린 유사체 예컨대 플루다라비딘(fludarabine), 6-머캅토푸린(mercaptopurine), 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌(thioguanine); 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시디딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 칼모퍼(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘, 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine); 안드로겐 예컨대 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀론(dromostanolone) 프로피오네이트, 에피토스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항-아드레날 예컨대 아미노글루티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트릴로스탄(trilostane); 엽산 보충제 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 에닐우라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지쿠온(diaziquone); 엘포르니틴(elfornithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에포티올론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다닌(lonidainine); 마이탄시노이드(maytansinoid) 예컨대 마이탄신(maytansine) 및 암사미토신(ansamitocin); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidanmol) ; 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴(pentostatin); 펜아메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로속산트론(losoxantrone); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카바진(procarbazine); PSKO 폴리사카라이드 복합물 (JHS Natural Products, Eugene, 오레건주); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테뉴아존산(tenuazonic acid); 트리아지쿠온(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(trichothecenes) (특히 T-2 톡신, 베라쿠린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및 안귀딘(anguidine)); 우레탄; 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol) ; 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파(thiotepa); 탁소이드(taxoid), 예를 들어, 택솔(TAXOL)(등록상표) 파클리택솔(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스톤), 압락산(ABRAXANE)(상표명) 크레모포 부재, 파클리택셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 일리노이주), 및 탁소테어(TAXOTERE)(등록상표) 독세탁셀(doxetaxel) (Rhone)- Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실(chloranbucil); 겜자(GEMZAR)(등록상표) 겜시부타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌(thioguanine); 머캅토푸린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(etoposide) (VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine) ; 나벨빈(NAVELBINE)(등록상표); 비노렐빈(vinorelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 셀로다(xeloda); 아반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틀히로르니틴(difluorometlhylornithine, DMFO); 레티노이드 예컨대 레틴산; 카페시타빈; 및 이들의 제약학상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
이 정의에서 또한 포함되는 것은 종양의 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 예를 들어 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자(SERM)을 비롯한 항호르몬제로서, 예를 들어 타목시펜(tamoxifen) (놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표) 타목시펜), 랄록시펜(raloxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 4-히드록시타목시펜(hydroxytamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 파레스톤; 토레미펜(toremifene) ; 효소 아로마타제를 억제하여 부신 선의 에스트로겐 생성을 조절하는 아로마테제 억제제, 예를 들면 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE)(등록상표); 메게스트롤(megestrol) 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)(등록상표); 엑세메스탄(exemestane), 포르메스타니(formestanie), 파드로졸(fadrozole), 리비소르(RIVISOR)(등록상표) 보로졸(vorozole), 페마라(FEMARA)(등록상표) 레트로졸, 및 아르미덱스(ARMIDEX)(등록상표) 아나스트로졸; 및 항안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루트아미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시코신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레이티드, 특히 비정상 세포 증식에 연루된 경로를 신호전달하는 데 있어서 유전자의 발현을 억제하는 것들, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; 리보자임 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)(등록상표) 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예컨대 유전자 치료 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(등록상표) 백신, 및 백시드(VAXID)(등록상표) 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)(등록상표) rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표) rmRH; 및 이들의 제약학상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 세포, 특히 STOP-1 발현 암 세포의 성장을 체내 또는 시험관 내에서 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 이처럼, 장 억제제는 S 파지에서 STOP-1 발현 세포의 비율을 현저히 감소하는 것들일 수 있다. 성장 억제제의 예로서 세포 주기 진행을 억제하는 제제, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 것들을 포함한다. 전형적인 M기 차단제로 빈카스(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. 또한 G1을 정지시키는 시약은 S기 정지도 정지시키는데, 예를 들어 DNA 알킬화제 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 아라-C를 포함한다. 나아가, 이들 정보는 문헌[The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, 표제 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" 저자 Murakami 등]에서 (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p. 13에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 주목으로부터 얻을 수 있는 항암제이다. 유럽 주목으로부터 얻을 수 있는 도세탁셀 (탁소테어(등록상표), Rhone-Poulenc Rorer), 파클리탁셀(택솔(등록상표), Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜블린 이량체로부터의 마이크로튜블의 조립을 촉진하고, 탈중합을 억제하여 마이크로튜블을 안정화시켜, 세포의 유사분열을 일으킨다.
"독소루비신"은 안트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 총명은 (8S-시스)-10-[ (3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
용어 "팩키지 삽입물"이란 치료 프로모터의 용도와 관련하여 처방, 용도, 투여량, 투여방법, 부작용 및(또는) 주의사항에 관한 정보를 담아놓은 치료 프로모터의 시판 팩키지 안에 통상적으로 포함되어 있는 지시를 나타낸다.
STOP-1 XXXXXXXXXXXXXXX (길이= 15개 아미노산)
비교 단백질 XXXXXYYYYYYY (길이= 12개 아미노산)
% 아미노산 서열 동일성= (ALIGN-2에 의해 결정된 두개의 폴리펩티드 서열 간의 동일하게 매치되는 아미노산 잔기 수) 나누기 (STOP-1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 총수) = 5 나누기 15 = 33.3%
STOP-1 XXXXXXXXXX (길이= 10개 아미노산)
비교 단백질 XXXXXYYYYYYZZYZ (길이 = 15개 아미노산)
% 아미노산 서열 동일성= (ALIGN-2에 의해 결정된 두개의 폴리펩티드 서열 간의 동일하게 매치되는 아미노산 잔기 수) 나누기 (STOP-1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 총수) =5 나누기 10 = 50%
STOP-1-DNA NNNNNNNNNNNNNN (길이= 14개 뉴클레오티드)
비교 DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (길이 = 16개 뉴클레오티드)
% 핵산 서열 동일성= (ALIGN-2에 의해 결정된 두개의 핵산 서열 간의 동일하게 매치되는 뉴클레오티드 수) 나누기 (PRO-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드 총수) = 6 나누기 14 = 42.9%
STOP-1-DNA NNNNNNNNNNNN (길이= 12개 뉴클레오티드)
비교 DNA NNNNLLLVV (길이 = 9개 뉴클레오티드)
% 핵산 서열 동일성= (ALIGN-2에 의해 결정된 두개의 핵산 서열 간의 동일하게 매치되는 뉴클레오티드 수) 나누기 (PRO-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드 총수) = 4 나누기 12 = 33.3%
본 발명의 조성물 및 방법
STOP-1 폴리펩티드 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 이외에, STOP-1 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. STOP-1 폴리펩티드 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 STOP-1 DNA에 도입하고(하거나) 원하는 STOP-1 폴리펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 세포막 부착 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 STOP-1 폴리펩티드 번역후 프로세싱을 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명된 전장 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드 또는 STOP-1 폴리펩티드의 다양한 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드와 비교해 STOP-1 폴리펩티드의 아미노산 서열 변화를 초래하는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 STOP-1 폴리펩티드 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 STOP-1 폴리펩티드 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환 (예를 들어, 루이신의 세린으로의 치환), 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 결정할 수 있다.
구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 6에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 6에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
STOP-1 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지하는 그의 효과를 상당히 변화시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환하는 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 유발법 (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), 제한 선택 돌연변이 유발법 (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) 또는 다른 공지 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 STOP-1 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 통상, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변화시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). 또한, 알라닌은 통상 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
STOP-1 폴리펩티드의 변형
STOP-1 폴리펩티드의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 STOP-1 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 STOP-1 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는, 예를 들어 항-STOP-1 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 STOP-1 폴리펩티드를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제에는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 작용제가 포함된다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 (잠재성 있는 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 상기 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
상기 STOP-1 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는, 예를 들어 상기 천연 서열 STOP-1 폴리펩티드에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-결합 글리코실화 부위의 경우). 상기 STOP-1 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 상기 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
본 발명의 STOP-1 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 결합시키는 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 국제 공개 제87/05330호 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
본 발명의 STOP-1 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 문헌 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 (문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)] 참조).
STOP-1 폴리펩티드의 공유결합 변형에 대한 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는, 예를 들면 인간 면역결핍 바이러스 TAT 단백질의 단백질 신호전달 도메인을 이용해 다양한 조직 및 더 구체적으로는 뇌혈관장벽 (blood-brain barrier)으로 STOP-1 폴리펩티드를 전달하는 단백질 신호전달 도메인을 갖는 STOP-1 폴리펩티드의 융합체를 포함한다 (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72).
본 발명의 또다른 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태인 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)), 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 (Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)), KT3 에피토프 펩티드 (Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)), α-튜불린 에피토프 펩티드 (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))가 포함된다.
다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 본 발명의 STOP-1 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태 ("면역부착소"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 가변 영역의 적어도 일부 대신에 인간 STOP-1의 잔기 94-243, 잔기 33-53 또는 잔기 33-52만을 또는 대략 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
STOP-1 폴리펩티드의 제조
이하의 기재는 주로 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포의 배양에 의한 STOP-1 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 물론, 당업계에 알려진 다른 방법을 사용하여 STOP-1 폴리펩티드를 제조하는 것을 고려할 수 있다. 예를 들어, 고체상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성에 의해 STOP-1 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co.: San Francisco, CA, 1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)] 참조. 생체내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하거나 또는 자동화에 의해 수행ㄷㄹ 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스 펩티드 신써사이저(Applied Biosystems Peptide Synthesizer; 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 이용하여 생산자의 사용 설명서를 사용하여 달성될 수 있다. STOP-1 폴리펩티드의 다양한 부분을 개별적으로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 합쳐서 전체 길이의 STOP-1 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 STOP-1 폴리펩티드 제조에 대해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염되거나 또는 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 필요한 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적합하도록 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 최대화시키기 위한 세포 성분, 프로토콜 및 실시 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press,1991)] 및 삼브룩 등(Sambrook et al)의 앞의 문헌에서 찾을 수 있다.
형질감염 방법은 일반적인 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 CaPO4 처리 및 전기천공법이 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 삼브룩 등의 앞의 문헌에 기술된 바와 같은 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리 또는 전기천공법이 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 원핵생물 또는 기타 세포에 일반적으로 사용된다. 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983)] 및 WO 89/05859 (1989년 6월 29일 공개)에 기재된 바와 같은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포에서는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 양상은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 중에서의 형질전환은 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76: 3829 (1979)]의 방법에 따라 전형적으로 수행된다. 그러나, 핵 미세주입, 전기천공, 완전한 세포와의 박테리아 프로토플라스트 융합, 또는 다중양이온, 예를 들어 폴리브렌 또는 폴리오르니틴에 의한 것과 같은, 세포로의 DNA 도입을 위한 다른 방법이 사용될 수도 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 다양한 기술에 대해서는, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 또는 발현시키는데 적절한 숙주 세포로는, 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 적절한 원핵생물로는, 이에 한정되지는 않지만, 그람음성 또는 그람양성 생물과 같은 유박테리아, 예를 들어 이. 콜라이와 같은 엔테로박테리아세아이(Enterobacteriaceae)를 포함한다. 다양한 이. 콜라이 균주는 공중에서 입수가능하며, 예컨대 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325); 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 있다. 다른 적절한 원핵생물 균주 세포로는, 엔테로박테리아세아이, 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라, 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella) 뿐 아니라 바실리(Bacilli), 예컨대 비. 수브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 수도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 스트렙토르니세스(Streptornyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적인 것이라기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110은 한가지 특히 바람직한 숙주 또는 모숙주인데, 이는 이것이 재조합 DNA 산물 발효에 통상적인 숙주 균주이기 때문이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110는, 예를 들어 전체 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 전체 유전자형 tonA ptr3를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 전체 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 전체 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일 발행 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 돌연변이 원형질막 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주와 같은 균주 내부의 단백질을 인코딩하는 유전자 내에서의 유전자 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있다. 다르게는, 생체내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적절하다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 사상진균 또는 효모가 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터에 대해 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비시아이(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 저급 진핵 숙주 미세생물이다. 다른 것으로는, 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharonzyces pombe) (문헌 [Beach and Nurse, Nature, 290: 140[1981]]; 1985년 5월 2일 공개된 유럽 특허 제139,383호); 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)]), 예컨대 케이. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]]), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)]), 케이. 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스( K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (유럽 특허 제402,226호); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (유럽 특허 제183,070호; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (유럽 특허 제244,234호); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]]); 쉬와니오미세스(Schwanniomyces), 예컨대 쉬와니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 유럽 특허 제394,538호); 및 사상진균, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) (문헌 [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]]; [Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]]) 및 에이. 니게르(A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]])를 포함한다. 메틸로트로픽 효모가 본원에서 적절하며, 이로는, 이에 한정되지 않지만, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피키아(Pichia), 사카로미세스, 토룰로프시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속(屬)으로부터 선택되는 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함한다. 이러한 효모군의 예시가 되는 구체적인 종의 리스트는 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾을 수 있다.
글리코실화된 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는, 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 S2(Drosophila S2) 및 스포돕테라 Sf9(Spodoptera Sf9), 및 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포계의 예로는, 중국비단털난쥐 난소(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 더욱 구체적인 예로는, SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1계; 인간 태생신계(human embryonic kidney line) (293 또는 현탁배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)]); 중국비단털난쥐 난소세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포(mouse sertoli cells) (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)]); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적합한 숙주 세포의 선택은 당업계의 기술 내에 있다고 본다.
복제가능한 벡터의 선택 및 사용
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 핵산은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공중에서 입수가능하다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열이 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로, 이에 한정되지 않지만, 하나 이상의 시그널 서열(서열이 분비될 수 있는 경우), 복제의 기원, 하나 이상의 표지 유전자, 증강요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 하나 이상의 이들 성분을 함유하는 적절한 벡터의 구성은 당업자에게 알려진 표준 결찰 기술을 사용한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 직접적으로 뿐만 아니라, 시그널 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-종말에서의 특정 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로 재조합되어 제조될 수 있다. 일반적으로, 시그널 서열은 벡터의 한 성분이거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 시그널 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 내열성 장독소 II 선도자의 군으로부터 선택되는 원핵 시그널 서열일 수 있다. 효모 분비물에서, 시그널 서열은, 예를 들어 효모 역전효소 선도자, 알파 인자 선도자 (사카로미세스 및 클루이베로미세스 α-인자 선도자를 포함함, 후자는 미국 특허 제5,010,182호에 기재됨), 또는 산성 포스타파제 선도자, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 선도자 (1990년 4월 4일 공개된 유럽 특허 제362,179호), 또는 1990년 11월 15일에 공개된 WO 90/13646에 기재된 시그널일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그널 서열은 단백질의 직접적인 분비, 예컨대 동일하거나 또는 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 시그널 서열, 및 바이러스 분비 선도자에 사용될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두 하나 이상의 선택된 숙주 세포에 벡터를 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 대부분의 그람음성 박테리아에 대해 적절하고, 2u 플라스미드 기원은 효모에 대해 적절하고, 다양한 바이러스 기원 (SV40, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택 유전자를 함유하며, 선택가능한 마거로도 명칭된다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 내성을 부여하거나, (b) 영양결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 얻을 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩하며, 예를 들어 바실리에 대한 D-알라닌 라세마제를 인코딩하는 유전자이다.
포유동물 세포에 대한 적절한 선택가능한 마커의 예로는, DHFR 또는 티미딘 키나제와 같은 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 핵산을 취할 수 있는 세포의 식별이 가능한 것들이다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 부족한 CHO 세포계이며, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고, 증식된다. 효모에 사용하기 위한 적절한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다. 문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주에 대해 선택 마커, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1을 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 통상 mRNA 합성을 지시하는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 알려져 있다. 원핵 숙주와 사용하기에 적절한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980)]; 유럽 특허 제36,776호), 및 혼성 프로모터, 예컨대 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)])를 포함한다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno; S.D.) 서열 또한 함유할 수 있다.
효모 숙주와 사용하기에 적절한 촉진 서열의 예로는, 3-포스포글리세레이트 키나제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)]) 또는 다른 해당효소(glycolytic enzyme) (문헌 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)]), 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코세-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코세 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가적인 장점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는, 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스에 반응성인 효소에 대한 프로모터 부위가 있다. 효모 발현에 사용하는데 적절한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제73,657호에 더 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 핵산 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종바이러스, 조류 육아종바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 헤파티티스-B 바이러스 및 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40; SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어지는 프로모터에 의해; 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터에 의해; 및 열충격 프로모터에 의해 조절되며, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포계와의 적합성이 있는 것이다.
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 벡터 내로 증강자 서열을 삽입하여 증가시킬 수 있다. 증강자는 통상 이의 전사를 증가시키는 프로모터 상에서 작용하는, 통상 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 다수의 증강자 서열은 포유동물 유전자로부터 알려져 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질(α-fetoprotein) 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 증강자를 사용할 수 있다. 예로는, 복제 기원 (bp 100-270)의 후측 상에서의 SV40 증강자, 시토메갈로바이러스 조기 프로모터 증강자, 복제 기원의 후측 상에서의 폴리오마 증강자, 및 아데노바이러스 증강자를 포함한다. 증강자는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체에서의 서열 코딩에서 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 분할될 수 있으며, 바람직하게는 프로모터로부터의 부위 5'에 위치한다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터의 유핵세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사의 종결 및 mRNA를 안정화에 필요한 서열 또한 함유할 수 있다. 이러한 서열은 통상 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비해독 부위인 5' 및 때때로 3'으로부터 이용가능하다. 이들 부위는 폴리펩티드 또는 항체를 인코딩하는 mRNA의 비해독 부위 내의 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 구획을 함유한다.
재조합 척추 세포 배양에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체의 합성에 적용하기에 적절한 또다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281: 40-46 (1979)]; 유럽 특허 제117,060호; 및 유럽 특허 제117,058호에 기재되어 있다.
유전자 증폭/발현 탐지
유전자 증폭 및/또는 발현은, 예를 들어 mRNA의 전사를 측량할 수 있는 통상적인 서던 블로팅, 노던 블로팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)]), 다트 블로팅 (DNA 분석) 또는 본원에 제공된 서열에 기초하여 적합하게 표지된 프로브를 사용하는 원위치에서의 혼성화에 의해 직접적으로 샘플에서 측정될 수 있다. 다르게는, DNA 2중가닥, RNA 2중가닥, 및 DNA-RNA 혼성 2중가닥 또는 DNA-단백질 2중가닥을 포함하는 특정 2중가닥을 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 항체는 차례로 표지될 수 있고, 분석은 2중가닥이 표면에 결합하는 곳에서 수행되어, 표면 상에서의 2중가닥의 형성시 2중가닥에 결합된 항체의 존재가 탐지될 수 있다.
다르게는, 유전자 발현은 세포 또는 조직 구획의 면역조직화학염색과 같은 면역적 방법 및 세포 배양 또는 체액의 분석에 의해 측정되어 유전자 산물의 발현을 직접적으로 측정할 수 있다. 면역조직화학염색 및/또는 샘플액의 분석에 유용한 항체는 모노클론 또는 폴리클론일 수 있으며, 임의의 포유동물에서 제조되거나 또는 합성될 수 있다 (예를 들어, 본 발명의 모노클론 항체). 편리하게는, 항체는 네가티브-서열 STOP-1 폴리펩티드에 대해 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드에 대해, 또는 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하고 특정 항체 에피토프를 인코딩하는 DNA에 융합된 외인성 서열에 대해 제조될 수 있다.
STOP-1 폴리펩티드의 정제
STOP-1 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포로로부터 회복될 수 있다. 막 협착인 경우, 적당한 세제 용액 (예컨대, TRITON-XTM 100) 또는 효소 절단에 의해 막으로부터 떨어질 수 있다. STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 발현에 이용되는 세포는 여러 가지 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 얼림-녹임 순환, 초음파 처리, 기계적 교란, 또는 세포 용해 제 등에 의해 교란될 수 있다. 일 실시태양에 따르면, STOP-1 폴리펩티드가 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제되는 것이 바람직하다. 하기하는 절차는 적절한 정제 과정의 예시이다: 이온 교환 컬럼상에서의 분할, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 암모늄 술페이트 침전, 예를 들어, Sephadex G-75를 이용한 겔 여과, IgG와 같은 오염을 제거하기 위한 단백질 A 세팔로스 컬럼, 및 STOP-1 폴리펩티드의 에피토프-태그 형태에 결합하는 금속 킬레이트 컬럼. 단백질 정제의 여러 가지 방법이 이용될 수 있고 그러한 방법은 공지되어 있거나 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods inEnzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York, 1982)]에 기술되어 있다. 선택되는 정제 단계는 예를 들어, 사용되는 제조 방법의 및 생산되는 특정 STOP-1 폴리펩티드의 성질에 의존한다. 일 실시태양에 따르면, STOP-1 폴리펩티드는 본 발명의 항체를 이용하는 친화 크로마토그래피에 의해 정제된다.
세포 정제의 분석 억제
본 발명의 길항제의 억제 활성을 하기 실시예 13-14 및 기타 공지된 검정법을 이용하여 측정할 수 있다.
종양 및 암 (예컨대, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델은 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 모두를 포함한다. 비-재조합 동물 모델은 예를 들어 예컨대, 뮤린 (murine) 모델을 포함한다. 그러한 모델은 종양 세포를 동계의 마우스 내에 표준 기법, 예컨대 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 지라 이식, 복강내 주사, 신장 캡슐하 이식, 또는 오르토핀 이식, 예컨대 결장 조직 내에 이식된 결장암 세포에 도입하여 발생시킬 수 있다. 예컨대, PCT 출원 제 WO 97/33551 (1997. 9. 17 공개)를 참조하라. 돌연변이 연구에서 아마도 가장 자주 사용되는 동물종은 면역결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 흉선 하이포/형성부전 누드 마우스가 인간 종양 이종 이식에 대해 숙주로 성공적으로 작용할 수 있다는 관찰이 이러한 목적을 위해 광범위하게 사용되도록 하였다. 상염색체 열성 nu 유전자가, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL를 비롯한 누드 마우스의 매우 많은 별개의 동조주에 도입되었다. 또한, 누드 마우스 이외에 선척적인 면역적 결함이 있는 매우 다양한 다른 동물들이 사육되어 종양 이종 이식의 수용자로서 이용되었다. 더 자세히는, 예컨대 문헌 [The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991)]을 참조하라.
그러한 동물에 도입되는 세포는 기지의 종양/암 세포주, 예컨대 상기 나열된 종양 세포주 중 임의의 것 및 예를 들어, B104-1-1 세포주 (neu 원발암유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 (ATCC HTB-37); 또는 적당하게 잘 분화된 그레이드 II 인간 결장 아데노칼시노마 세포주, HT-29 (ATCC HTB-38); 또는 종양 및 암에서 유도될 수 있다. 종양 또는 암 세포는 냉동하고 액체 질소에 보관하는 것을 포함하는 표준 조건을 이용하여, 수술을 받는 환자로부터 얻을 수 있다 (문헌[Karmali etal., Br. J. Cnacer, 48: 689-696 (1983)]).
종양세포는 다양한 방법에 의해 누드 마우스와 같은 동물 내에 도입될 수 있다. 마우스의 피하(s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적당하다. 종양은 고체 블록으로, 투관침을 이용한 바늘 생검으로, 또는 세포 현탁액으로 피하에 이식될 수 있다. 고체-블록 또는 투관침 이식에 있어서, 적당한 크기의 종양 세포 절편이 피하 공간에 도입된다. 세포 현탁액은 원발성 종양 또는 안정한 종양세포주로부터 신선하게 준비되고, 피하로 주입된다. 종양 세포는 또한 진피 밑 이식으로 주입될 수도 있다. 이 위치에는, 접종물이 진피 연결 조직 및 피하 조직의 낮은 부위 사이에 위치한다.
래트 신경 모세포종 세포 (여기서 neu 종양유전자가 처음 단리되었음), 또는 누드 마우스 내의 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포에 의해 유방암이 걸린 동물 모델을 발생시킬 수 있다 (문헌 [Drebin et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83: 9129-9133 (1986)]).
유사하게는, 누드 마우스와 같은 동물 내에 결장암 세포를 통과시킴으로써 이들 동물 내에 종양의 밸생을 유도하여 결장암이 걸린 동물 모델을 시킬 수 있다. 누드 마우스 내의 인간 결장암의 동소 이식 모델은 예를 들어 문헌 [Wang et al., Cancer Research, 54: 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995)]에 기술되어 있다. 이들 모델은 AntiCancer, Inc (캘리포나아 샌디에고 소재)에 의해 판매되는 소위 "METAMOUSETM"에 기초한다.
동물에서 발생하는 종양은 제거되어 시험관 내에서 배양될 수 있다. 시험관 내 배양으로부터의 세포는 이어서 동물에 통과될 수 있다. 그러한 종양은 추가적인 테스트 또는 약물 스크리닝에 대한 표적으로 작용할 수 있다. 별법으로, 통과로부터 얻게되는 종양은 단리될 수 있고, 하나 이상의 통과 후에 단리된 세포 또는 통과전 세포는 관심 유전자의 감별 발현에 대해 분석될 수 있다. 그러한 통과 기법은 임의의 공지된 종양 또는 암 세포주로 수행될 수 있다.
예를 들어, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, 및 WEHI-164 은 화학적으로 도입된 BALB/c 암컷 마우스의 섬유육종인데 (문헌 [DeLeo et al., J. Exp. Med. , 146: 720 (1977)]), 이는 여러 가지 제제의 항종양 활성을 연구하기 위한 매우 제어가능한 모델 시스템을 제공한다 (문헌 [Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987)]). 요약하면, 종양 세포는 세포 배양에서 시험관 내에서 번식된다. 동물 내로 주입하기 전에, 세포주를 세척하고 완충용액에 현탁하였다 (세포밀도 약 10 x 106 내지 1O x 107 세포/ml). 동물은 이어서 피하로 10 내지 100 ul의 세포 현탁액을 주입받고 종양이 나타날 때까지 일 내지 삼주 둔다.
또한, 가장 심도있게 연구된 실험 종양의 하나인 루이스 폐 (3LL) 암종이 조사를 위한 종양 모델로 이용될 수 있다. 이 종양 모델에서의 효능이 폐의 소-세포 암종 (SCCL)으로 진단된 인간 환자의 치료에서 유익한 효과와 연관되어 있다. 이 종양은 질환 마우스로부터의 종양 절편 또는 배양에서 유지되는 세포를 주입하면 정상 마우스에 도입될 수 있다 (문헌[Zupi et al., Br. J. Cancer, 41: suppl. 4,30 (1980)]). 종양이 단독 세포의 주입만으로도 시작될 수 있다는 것, 매우 높은 비율의 감염 종양 세포가 생존한다는 것이 입증되었다. 이 종양 모델에 관한 더 자세한 정보는 문헌 [Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986)]을 참조하라.
종양이 이식된 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한가지 방법은 치료 전 후의 종양 크기를 측정하는 것이다. 일반적으로, 이식된 종양의 크기는 2차원 또는 3차원 슬라이드 캘리퍼로 측정하였다. 2차원으로 제한된 측정은 종양의 크기를 정확히 반영하지 못하였다. 따라서, 대개는 수식을 사용하여 해당하는 부피로 전환된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확하다. 약물 후보의 치료 효과는 치료로 유발된 성장 지연 및 특정 성장 지연으로 더욱 잘 기술될 수 있다. 종양 성장의 기술에 있어 또 다른 중요한 변수는 종양 부피 배가 시간이다. 순환 및 종양 성장의 기술에 대한 컴퓨터 프로그램 ([Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds (Basel, 1989), p. 301.]등에서 보고된 프로그램 등)또한 이용가능하다. 그러나 치료 후의 괴사 및 염증 반응은 적어도 초기에는 실제로 종양 크기의 증가를 가져올 수 있다. 따라서, 이들 변화가 형태 계측 및 유동 세포 계산 분석의 조합으로 주의깊게 모니터될 필요가 있다.
또한, 재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생산하는 표준 기법을 이용하여, 관심 동물 게놈 내에 본원에서 확인된 STOP-1 유전자의 코딩 부분을 도입함으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작에 대한 표적 역할을 할 수 있는 동물은 제한됨 없이, 마우스, 래트, 토기, 기니 피그, 양, 염소, 돼지 및 비인간 영장류, 예컨대 비비, 침팬치 및 원숭이 등을 포함한다. 그러한 동물에 트랜스유전자를 도입하는 당업계에 공지된 기법은 전핵 마이크로주입 (미국 특허 4,873, 191); 배선 내로의 레트로바이러스-매개 유전자 전이 (예컨대, 문헌 [Van der Puttenet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985)]); 배아 줄기 세포 내의 유전자 표적화 (문헌 [Thompsonet al., Cell, 56: 313-321 (1989)]); 배아의 전기 천공법 (문헌 [Lo, Mol. Cell.Biol., 3:1803-1814 (1983)]); 및 정자-매개 유전자 전이 (문헌 [Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989)]) 등을 포함한다. 검토를 위해 예컨대 미국 특허 4,736, 866를 참조하라.
본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 그 세포의 단지 일부에 트랜스유전자를 가지는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 트랜스유전자는 단독 트랜스유전자로서, 또는 콘카테머 내에서, 예컨대 머리 대 머리 (head-to-head) 또는 머리 대 꼬리 (head-to-tail) 탄뎀에 통합될 수 있다. 트랜스유전자를 특정 세포 타입에 선택적으로 도입하는 것은 또한 문헌 [Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992)]의 기법 등에 의해 가능하다. 트랜스제닉 동물에서의 트랜스유전자의 발현은 표준 기법으로 모니터될 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭이 트랜스유전자의 통합을 입증하기 위해 이용될 수 있다. mRNA 수준의 표현은 현장 (in situ) 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR, 또는 면역세포화학과 같은 기법을 이용하여 분석될 수 있다. 동물들은 추가로 종양 또는 암 발현의 표지에 대해 검사될 수 있다.
별법으로, STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포 내에 도입된 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 변형된 게놈 DNA 사이의 동종 재조합의 결과로서, 본원에서 밝혀진 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 "녹-아웃(knock-out)" 동물이 구성될 수 있다. 예를 들어, 특정 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 cDNA가 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 인코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 이용될 수 있다. 특정 STOP-1 폴리펩티드를 인코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나 다른 유전자, 예컨대 통합 (integration)을 모니터하는데 이용될 수 있는 선택가능 마커 (selectable maker)를 인코딩하는 유전자로 치환될 수 있다. 전형적으로, 수 킬로베이스의 비변형 인접 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터 내에 포함된다. 동종 재조합 벡터의 설명에 대해서는 예컨대, 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503(1987)]을 참조하라. 벡터는 배아 줄기 세포주 내로 도입되고 (예컨대, 전기 천공법에 의해), 도입된 DNA가 내인성 DNA와 동종으로 재조합된 세포가 선택된다. 예컨대 문헌 [Li et al., Cell, 69: 915 (1992)]을 참조하라. 선택된 세포는 이어서 동물 (예컨대, 마우스 또는 래트)의 포배로 주입되어 응집 키메라를 형성한다. 예컨대 문헌 [Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL : Oxford, 1987), pp.113-152]을 참조하라. 다음으로, 키메라 배아는 적당한 가성 임신 암컷 보모 동물 내로 이식될 수 있고 그 배아는 "녹-아웃" 동물을 만드는 시기에 이른다. 생식 세포 내에 동종으로 재조합된 DNA를 갖는 자손은 표준 기법에 의해 식별될 수 있고, 동물의 모든 세포가 동종으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 번식시키기 위해 이용된다. 녹 아웃 동물은 예컨대 특정 병리 증상에 대한 방어 능력에 의해, 그리고 STOP-1 폴리펩티드의 부재로 인한 병리 증상의 발생이 특징이다.
본원에 나타난 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 기타 약물 후보의 효능은 자발적인 동물 종양의 치료에서 또한 시험될 수 있다. 그러한 연구의 적절한 표적은 고양이 경구 평편 세포 암종 (SCC)이다. 고양이 경구 SCC는 고양이 종에서 보고된 경구 종양의 60% 이상을 차지하는, 가장 흔한 매우 공격적인 악성 종양이다. 이 종양을 가진 고양이가 짧은 생존 기간을 가진 단순 반영이긴 하지만, 이것은 다른 부위로 거의 전이되지 않는다. 이 종양은 주로 고양이 구강의 해부 구조 때문에 일반적으로 수술로 치료할 수 없다. 현재는 이 종양에 대한 효과적인 치료법이 없다. 연구에 들어가기 앞서, 각각의 고양이는 철처한 임상 검사 및 생검을 받고, 컴퓨터 단층 촬영술 (CT)로 스캐닝한다. 설하 경구 평편 세포 종양으로 진단된 고양이는 연구로부터 제외된다. 혀는 그러한 종양의 결과 마비될 수 있고, 그 치료가 종양을 없애더라도 동물을 먹이를 먹지 못할 수 있다. 각 고양이는 긴 시간에 걸쳐 반복하여 치료받는다. 종양의 사진을 치료 기간 동안 매일, 그리고 다음의 체크시 매번 찍는다. 치료 후, 각 고양이는 또 다른 CT 스캔을 받는다. CT 스캔 및 흉부 방사선 사진이 그 후 매 8 주 동안 평가된다. 그 데이타는 대조군에 비해 생존, 반응 및 독성의 차이로 평가된다. 긍정적 반응은 종양 퇴행의 증거, 바람직하게는 삶의 질의 개선 및/또는 수명의 증가가 요구될 수 있다.
또한, 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 샘암종, 림프종, 연골종, 또는 평활근육종과 같은 자발적인 동물 종양 역시 시험될 수 있다. 물론, 개 및 고양이의 유선 샘암종은 그 양태 및 거동이 인간의 것과 매우 유사하기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이 모델의 사용은 동물에서의 이러한 유형의 종양이 드물게 나타나기 때문에 제한된다.
혈관형성 또는 맥관신생 활성의 평가를 위한 검정
본 발명의 작용제, 전구체, 길항제의 예비 혈관형성, 항 혈관형성, 예비 맥관신생 또는 항 맥관신생 활성을 측정하는데 유용한 검정법은 실시예 14 및 26의 검정법 또는 아래 포함된 것과 같은 기타 적당한 공지의 검정법을 포함한다. 상처 치유 활성에 대한 검정법은 예컨대, 문헌 [Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384(1978)]에 의해 수정된 문헌 [Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds. (Year Book Medical Publishers, Inc. , Chicago), pp. 71-112]에 기술된 것을 포함한다.
내피 세포 증식에 대한 검정은 예컨대, WO 02/00690 또는 미국 특허 공개 20010036955A1에 기술된 것을 포함한다.
혈관형성의 억제를 평가하는 검정법은 예컨대 미국 특허 공개 20010036955A1에 기술된 검정법을 포함한다.
내피 튜브 형성의 억제를 측정하는 검정법은 예컨대 미국 특허 공개 20010036955A1에 기술된 검정법을 포함한다.
항체 결합 연구
항체 결합 연구는 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정 및 면역침전 검정과 같이 공지의 검정법을 이용하여 수행할 수 있다 (문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc.,1987), pp.147-158] 참조).
경쟁적 결합 검정법은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 테스트 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준의 능력에 의존한다. 테스트 샘플 내의 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준의 양에 반비례한다. 결합되게 되는 표준의 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 항체는 바람직하게는 경쟁 전 또는 후에 불용화되어, 항체에 결합된 표준 및 분석물이 결합되지 않고 남아있는 표준 및 분석물로부터 용이하게 분리될 수 있다.
샌드위치 검정법은 두가지의 항체를 이용하는 것과 관련 있는데, 각각은 검출할 단백질의 상이한 면역원성 부위, 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 샌드위치 검정에서, 테스트 샘플 분석물은 고체 지지체상에 고정화된 제1 항체에 의해 결합되고, 그 후 제2 항체가 분석물에 결합하여, 불용성 3-부분 복합체를 형성한다. 예컨대 미국 특허 4,376,110를 참조하라. 제2 항체는 그 자체가 검출가능 잔기로 표지화되거나 (직접 샌드위치 검정) 또는 검출가능 잔기로 표지화된 항-면역글로불린 항체를 이용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 검정). 예를 들어, 샌드위치 검정의 한가지 유형은 ELISA 검정으로, 이 경우 검출가능 잔기는 효소이다.
경쟁적 ELISA 검정은 STOP-1에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 항체 또는 길항제를 스크리닝하기 위해 수행될 수 있고, 이 결합은 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 억제될 수 있다.
일 실시태양에서, 경쟁적 ELISA 검정이 실시예 (예컨대 실시예 22)에서 기술된 방법 후에 수행될 수 있다. 천연 STOP-1 단백질의 최대 길이 또는 짧은 형태 (PBS 중 2ug/ml)가 하룻밤 동안 4 ℃에서 또는 2 시간 동안 실온에서 마이크로티터 플레이트 상에서 코팅될 수 있다. 30분 동안 65ul 1 % BSA를 첨가한 후, 또다시 30분 동안 40ul 1% 트윈 (Tween) 20을 첨가하여 웰을 블로킹할 수 있다. 그 다음, 웰을 PBS-0.05% 트윈20으로 5회 세척할 수 있다. 다양한 농도의 S7, S16, S4, F15 또는 S9 항체 (ELISA 완충용액 중)가 실온에서 30 분 동안 웰에서 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 테스트할 폴리펩티드 또는 항체를, S7, S16, S4, F15 또는 S9 항체가 없는 가운데 보통 90% 결합능을 보이는 농도에서 10분 동안 상이한 웰에 첨가할 수 있다. 다음으로, PBS-0.05% 트윈 20으로 5회 웰을 세척할 수 있다. 결합은 당업계에 공지된 방법으로 정량화한다.
면역조직화학을 위해, 조직 샘플을 새롭게 하거나 냉동할 수 있거나, 또는 파라핀 내에 고정하여 예컨대 포르말린과 같은 보존제로 고정할 수 있다.
세포-기재 종양 분석
종양과 같은 증식 장애에 대한 세포-기재 분석 및 동물 모델은 본 발명의 길항제의 억제 활성을 확인하는데 사용될 수 있다. 유용한 세포-기재 분석, 동물 모델 및 방법은 예를 들어 본 실시예에서 설명하는 것을 포함한다.
예를 들어, 증식 장애와 관련된 세포 유형의 세포는 본원에서의 STOP-1 cDNA로 형질감염되며, 과도한 성장을 유도하거나 성장을 억제하는 이러한 cDNA의 능력은 길항제의 존재 또는 부재 중에서 분석한다. 증식 장애가 암인 경우, 적절한 종양생성 세포는 예를 들어 안정한 종양 세포주, 예를 들어 B104-1-1 세포주 (neu 원암유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 ras-형질감염된 NIH-3T3 세포를 포함하며, 이는 STOP-1 서열로 형질감염되고 종양 성장을 모니터링할 수 있다. 그후 이러한 형질감염된 세포주는 형질전환된 세포의 성장에 있어서 세포성장 억제 또는 세포독성 활성을 나타내거나 항체-의존적 세포독성(ADCC)를 매개하여 종양생성 세포 성장을 억제하는 폴리-또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는데 사용될 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물의 종양에서 유도된 초대 배양(앞서 기재한 바와 같음)은 안정한 세포주가 바람직하기는 하지만 세포-기재 분석에서 사용될 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터의 연속 세포주를 유도하는 기술이 당업계에 공지되어 있다. 문헌[Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985)] 참조.
유전자 치료
질환 증상을 개선할 수 있는 방법 및 조성물을 하기에 기재하였다. 본원에 기재한 STOP-1 폴리펩티드 (STOP-1 폴리펩티드 변형물 포함), 본 발명의 길항제 및 항체는 각 세포내 발현에 의한 본 발명에 따라서 사용될 수 있으며, 이를 종종 유전자 치료라고 지칭한다. 예를 들어, STOP-1 폴리펩티드 변형물은 이러한 방법을 이용하여 세포 내에서 발현될 수 있다. 한 실시태양에 따라서, STOP-1 폴리펩티드 (변형물 포함)를 발현하는데 사용되는 벡터 또는 방법은 원하는 기질 영역(stromal region)으로 UNQ 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 함유하는 비히클을 향하게 하는 기질 표적화제의 사용을 포함한다.
핵산 (임의로 벡터 내에 함유되어 있음)을 포유동물의 세포내로 넣는 것에는 2가지 접근법이 있다: 생체내 및 생체외. 세포내 전달에 있어서, 핵산은 포유동물로 보통 STOP-1 폴리펩티드이 필요한 위치 (즉, STOP-1 폴리펩티드의 합성의 부위, 및 알려져 있다면 STOP-1 폴리펩티드의 생물학적 활성이 필요한 부위(예를 들어, 상처))에 직접적으로 주사될 수 있다. 세포외 처리에 있어서, 포유동물의 세포를 제거하고, 핵산을 이렇게 분리된 세포로 도입하고, 변형된 새포를 포유동물로 직접적으로 또는 예를 들어 포유동물로 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화하여 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제4,892,538호 및 5,283,187호 참조). 핵산을 생장 세포(viable cell)로 도입하는데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 본 기술은 핵산이 배양된 세포로 세포내로 전달되는지, 아니면 목적하는 호스트의 세포로 세포내로 전달되는지에 따라서 다르다. 포유동물 세포 시험관내로 핵산을 전달하는 적절한 기술은 리포솜, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 이용하는 것을 포함한다. 형질도입은 복제-결여, 재조합 바이러스 (바람직하게는, 레트로바이러스) 입자와 세포 수용체를 연관시키고, 이어서 입자에 함유된 핵산을 세포로 도입하는 것을 포함한다. 유전자의 세포외 전달에서 보통 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 세포내 핵산 전달 방법은 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV)) 및 지질-기재 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE, 및 DC-Chol이다; 문헌[Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996)] 참조)로 형질감염하는 것을 포함한다. 그러한 벡터는 전달 제제, 예를 들어 길항제 및 본 발명의 핵산 분자를 위한 비히클로서 사용될 수 있는 바이러스를 합성하는데 사용된다. 유전자 치료에 사용되는 가장 바람직한 벡터는 바이러스, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 하나 이상의 전사 프로모터/인핸서 또는 좌위-한정 인자(들) (locus-defining element), 또는 교차 스플라이싱, 핵 RNA 배출, 또는 전달자의 번역후 변형과 같은 다른 방법에 의하여 유전자 발현을 조절하는 다른 요소를 포함한다. 또한, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재하에 전사될 때 그에 기능적으로 연결되고 번역 개시 서열로서 작동한다. 그러한 벡터는 또한 패키지 시그날, 장 말단 반복 (long terminal repeat) (LTRs) 또는 그의 부분, 및 (이들이 바이러스 벡터에 이미 존재하지 않는 경우에는) 사용되는 바이러스에 적당한 양성 및 음성 스트랜드 프라이머 결합 부위를 포함한다. 또한, 그러한 벡터는 통상적으로 위치해 있는 숙주 세포로부터 STOP-1 폴리펩티드가 분비되는 신호 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 목적을 위한 신호 서열은 포유동물 신호 서열이며, 가장 바람직하게는 STOP-1 폴리펩티드를 위한 천연 신호 서열이다. 임의적으로, 벡터 구조물은 폴리아데닐화를 지시하는 신호, 및 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 그러한 벡터는 RNA 결합 부위에서 5'LTR, 제2 스트랜드 DNA 합성의 시작 부분에서 패키지 시그날, 및 3'LTR 또는 그의 부분을 포함할 것이다. 비-바이러스성, 예를 들어 양이온성 지질, 폴리리신, 및 덴드리머인 다른 벡터를 사용할 수 있다. 한 실시태양에 따라서, 비히클은 기질 표적화제를 가진다.
일부 경우에, 표적 세포를 표적하는 제제, 예를 들어 세포-표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜을 사용하는 경우에, 세포내분열과 연관된 세포-표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 절편, 주기중에 내재화를 거치는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치를 표적하고 세포내 반감기를 증가시키는 단백질이 표적화 및(또는) 흡수 촉진에 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내 분열 기술이 예를 들어 문헌[Wuetal., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 : 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 알려진 유전자 마킹(marking) 및 유전자 치료 프로토콜의 검토는 문헌[Anderson etal., Science, 256: 808-813 (1992)]을 참고한다. 또한, WO 93/25673 및 본원에 인용된 참고문헌을 참고한다.
적절한 유전자 치료 및 레트로바이러스 입자 및 구조 단백질을 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,681,746호에서 발견할 수 있다.
STOP-1 돌연변이의 검출
본 발명은 또한 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 진단제로서의 용도에 관한 것이다. STOP-1 폴리펩티드의 돌연변이 형태의 검출은 증식 장애가 진행하는 경향에 대한 지표일 수 있다. 포유동물의 조직에서 STOP-1 폴리펩티드의 정상 포유동물의 동일한 조직보다 높은 STOP-1 폴리펩티드의 농도의 검출은 증식 장애 진행의 경향의 지표이다 (하기 참조).
인간 STOP-1 폴리펩티드을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 갖는 개체는 각종 기술로 DNA 농도에서 검출될 수 있다. 진단을 위한 핵산은 포유동물 세포, 예를 들어 혈액, 소변, 타액, 조직 생검 및 해부 물질에서 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 검출을 위하여 직접적으로 사용될 수 있거나 분석 전에 PCR을 이용하여 효소적으로 증폭할 수 있다 (Saikiet al., Nature, 324: 163-166 (1986)). RNA 또는 cDNA가 또한 동일한 목적을 위하여 사용될 수 있다. 일례로서, STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 STOP-1 폴리펩티드 돌연변이를 확인하고 분석하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 정상 유전자형에 비교하여 증폭된 생성물의 크기의 변형에 의하여 결실 및 삽입을 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 방사성표지된 RNA, 또는 다르게는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 방사성표지된 안티센스 DNA 서열에 증폭된 DNA를 혼성화하여 확인할 수 있다. 바람직하게 매칭된 서열은 RNase A 분해 또는 융점의 차이에 의하여 잘못 매치된 2중구조에 의하여 구별할 수 있다.
DNA 서열 차이에 기초한 유전자 시험은 변성제의 존재 또는 부재시에 DNA 절편의 전기영동 이동성의 변화의 검출에 의하여 달성될 수 있다. 작은 서열 결실 및 삽입은 고해상도 겔 전기영동에 의하여 가시화될 수 있다. 다른 서열의 DNA 절편은 변성 포름아미딘 구배 겔 상에서 구별할 수 있고, 여기서 다른 DNA 절편의 이동성은 그의 특정한 융점 또는 부분적인 융점에 따라서 다른 위치에서 겔에서 지체된다. 예를 들어, 문헌[Myerset al., Science, 230: 1242 (1985)] 참조.
특정 위치에서 서열 변화는 또한 예를 들어 문헌[Cottonet aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985)]에서와 같이 RNase 및 S1 보호 또는 화학적 분해 방법과 같은 뉴클레아제 보호 분석에 의하여 밝힐 수 있다.
그러므로, 특정 DNA 서열의 검출은 혼성화, RNase 보호, 화학적 분해, 직접 DNA 시퀀싱, 또는 제한 효소의 사용, 예를 들어 제한 절편 길이 다형성(RFLP), 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법에 의하여 달성할 수 있다.
보다 통상적인 겔-전기영동 및 DNA 시퀀싱 이외에, 또한 계내(in situ) 분석에 의하여 STOP-1 폴리펩티드의 돌연변이를 검출할 수 있다.
STOP-1 폴리펩티드 또는 핵산 농도의 검출
STOP-1 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 농도를 예를 들어 계내(in situ) 혼성화, RT-PCR, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 또는 본원에서 제공된 실시예 및 시약을 사용하여 당업계에 공지된 방법과 조합하여 본원에 개시된 시약을 이용하여 검출될 수 있다.
STOP-1 폴리펩티드가 고체 지지체에 부착되어 있고, 표지된 STOP-1 폴리펩티드 및 호스트에서 유래된 샘플을 고체 지지체를 통과시키고, 고체 지지체에 부착된 검출된 표지의 양을 샘플 중의 STOP-1 폴리펩티드의 양에 관련시킬 수 있는 경쟁 분석을 사용할 수 있다.
한 바람직한 실시태양에서, 본원에 개시된 STOP-1에 특이적으로 결합하는 항체는 STOP-1 단백질 농도를 모니터링하는데 사용된다.
약물 후보의 스크리닝 분석
본 발명은 STOP-1 폴리펩티드 활성과 유사한 반응을 내는 것 (작용제) 또는 STOP-1 폴리펩티드의 효과를 억제하는 것 (길항제)을 확인하는 화합물의 스크리닝 방법을 포함한다. 일반적으로, STOP-1 폴리펩티드를 인큐베이션 또는 각종 조건 하에서 접촉에 의하여 약물 후보에 노출시킨다. 길항제 약물 후보의 스크리닝 분석은 천연 STOP-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 화합물을 확인하도록 고안하였다. 그러한 스크리닝 분석은 소분자 약물 후보를 확인하는데 특히 적절한 화합물 라이브러리의 고-효율 스크리닝에 적절한 분석을 포함한다.
분석은 STOP-1 폴리펩티드, 및 그의 절편, 또는 STOP-1 폴리펩티드 또는 절편을 발현하는 세포와 함께 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포-기재 분석을 포함하여 다양한 포맷으로 수행할 수 있다.
길항제에 대한 모든 분석은 2종의 성분이 상호작용하도록 하는 조건과 충분한 시간 동안 본원에서 확인된 핵산에 의하여 코딩되는 STOP-1 폴리펩티드와 약물 후보를 접촉하도록 한다는 점에서 공통적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이며, 형성된 복합체는 단리되거나 반응 혼합물에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 후보 길항제의 존재 또는 부재중에 암세포 또는 내피 세포로의 STOP-1 폴리펩티드의 결합은, 길항제가 세포로의 STOP-1의 결합을 차단하는지 여부를 평가하기 하기 실시예에서 기재된 분석에서 수행할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자 또는 약물 후보에 의하여 코딩되는 STOP-1 폴리펩티드는 공유 또는 비공유 부착에 의하여 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 고정시킨다. 일반적으로, STOP-1 폴리펩티드의 용액으로 고체 표면을 코팅시키고, 건조하여 건조부착한다. 다르게는, 고정시켜야 하는 STOP-1 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들어 모노클로날 항체를 고체 표면에 고정하여 사용할 수 있다. 분석은 검출가능한 표지에 의하여 표지될 수 있는 비-고정화 성분을 고정화 성분, 예를 들어 고정된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가하여 수행한다. 반응이 완결될 때, 반응하지 않은 성분을 예를 들어 세척에 의하여 제거하고, 고체 표면에 고정된 복합체를 검출한다. 본래 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 포함할 때, 고체 상에 고정된 표지의 검출은 복합체화가 일어났다는 것을 나타낸다. 본래 고정되지 않은 성분이 표지를 포함하지 않는 경우, 복합체화는 예를 들어 표지된 항체가 특이적으로 고정된 복합체에 결합을 사용하여 검출할 수 있다.
후보 화합물이 특정 STOP-1 폴리펩티드과 상호작용하지만 결합하지 않는 경우에, 폴리펩티드와의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위하여 공지된 방법에 의하여 분석할 수 있다. 그러한 분석은 통상적인 접근법, 예를 들어, 가교-결합, 공-면역침전 및 구배를 통한 공-정제 또는 크로마토그래피 칼럼을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 필드 (Fields)와 동료에 의하여 기재된 이스트-기재 유전 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다(Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chienet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578- 9582(1991)) (체브레이(Chevray) 및 나탄스(Nathans)에 의하여 기재됨), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789- 5793 (1991). 많은 전사 활성화제, 예를 들어 이스트 GAL4는 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로 기능하는 2개의 물리적으로 분리된 모듈식 도메인으로 이루어져 있다. 전술한 문헌에 기재되어 있는 이스트 발현 시스템 (일반적으로 "2-혼성화 시스템"으로 지칭)은 이러한 특성의 장점을 가지며, 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합되고, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인과 융합되는 2 혼성화 단백질을 사용한다. GAL4-활성화 프로모터 하에서의 GAL1-ZacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 의존한다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 색원성(chromogenic) 기질 forp-갈락토시다제로 검출한다. 2-혼성화 기술을 이용한 2종의 특이적인 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완결 키트(MATCHMAKER)는 클론테크(Clontech)에서 시판된다. 이러한 시스템은 또한 특정 단백질 상호작용과 관련된 단백질 도메인을 배치하기 위하여, 또한 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기의 위치를 정확히 확인하기 위하여 연장될 수 있다.
STOP-1 폴리펩티드와 다른 단백질 사이 (다른 STOP-1 폴리펩티드 포함)의 결합을 방해하는 화합물을 하기와 같이 시험할 수 있다: 2종의 단백질의 결합 및 상호작용을 가능하게 하는 시간과 조건 하에서 STOP-1 폴리펩티드와 다른 단백질을 함유하는 반응 혼합물을 보통 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위하여, 반응을 시험 화합물의 존재 및 부재시에 수행한다. 또한, 양성 대조군으로서 작용하기 위하여 플라시보를 제3 반응 화합물에 첨가할 수 있다. 시험 화합물과 혼합물 중에 존재하는 다른 폴리펩티드 사이의 결합 (복합체 형성)은 상기 기재와 같이 모니터링한다. 대조 반응(들)에서는 이루어지지만 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 이루어지지 않는 복합체의 형성은 시험 화합물이 STOP-1 폴리펩티드과 다른 폴리펩티드의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다.
증식 분석에서, STOP-1 폴리펩티드는 공-미토겐 ConA의 존재시에 내피 세포의 증식을 자극하는 능력을 가진다. 특히, 인간 태아 정맥 내피 세포를 얻고, 96-웰 평판 배양 플레이트(메사추세스주 캠브리지에 소재한 코스타 (Costar) 제품)에서 배양하고, 세포의 증식을 촉진하기에 적절한 반응 혼합물 (Con-A (캘리포니아주 라졸라에 소재한 칼바이오켐 (Calbiochem) 제품)를 함유)을 공급할 수 있다. Con-A 및 스크리닝할 시험 억제 화합물을 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션한 후에 배양물을 3-H-티미딘으로 펄스로 보내고, 유리 섬유 필터(phD; 메사추세스주 워터타운에 소재한 캠브리지 테크놀로지(Cambridge Technology) 제품)로 수집한다. 3회 배양의 평균 3-H-티미딘 도입 (cpm)은 액체 섬광 계수기를 사용하여 결정한다 (캘리포니아주 어바인에 소재한 벡크만 인스트루먼츠(Beckman Instruments) 제품). 3-(H)-티미딘의 현저한 도입은 내피 세포 증식의 자극을 나타낸다.
한 실시태양에 따르면, 상기 분석 또는 이하의 실시예에서 기재한 분석은 본 발명의 길항제를 시험하기 위하여 수행한다. 다르게는, 길항제는 경쟁적 억제 분석에 적절한 조건 하에서 차가운 STOP-1 폴리펩티드와 잠재적 길항제와 STOP-1 폴리펩티드를 조합하여 검출할 수 있다. STOP-1 폴리펩티드를 방사성활성 또는 색측 방법으로 표지하여 결합된 STOP-1 폴리펩티드 분자의 수를 잠재적 길항제의 효과를 측정하는데 사용할 수 있다. STOP-1 폴리펩티드를 위치-특이적 단백질 키나아제에 대한 인식 부위의 포함 또는 요오드화를 포함하는 각종 방법에 의하여 표지할 수 있다. 고정화 및 인큐베이션 후에, 슬라이드를 자기방사성 분석한다.
약물 후보는 폴리 및 모노클로날 항체 및 항체 절편, 단일 쇄 항제, 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체 및 그러한 항체 또는 절편의 키메릭 또는 인간화 형을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 다르게는, 약물 후보를 인접하게 관련된 단백질, 예를 들어 STOP-1 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 STOP-1 폴리펩티드의 돌연변이형일 수 있다.
투여 프로토콜, 일정, 투약량 및 제제
본원의 분자 및 그에 대한 길항제는 앞서 기재한 다양한 장애 및 질환에 대한 예방용 및 치료용 제제로서 제약학적으로 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 길항제의 치료용 조성물은 적절한 순도를 갖는 원하는 분자를 선택적인 제약학적으로 용인가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정화제 (문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]참조)와 혼합시킴으로써 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조된다. 용인가능한 캐리어, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 버퍼; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르지닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염형성 카운터이온; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
그러한 캐리어의 부가적인 예로는, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레티신, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 버퍼 물질, 글리신, 소르빈산, 소르빈산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염, 또는 프로타민 술페이트와 같은 전해질, 디나트륨 하이드로겐 포스페이트, 칼륨 하이드로겐 포스페이트, 나트륨 클로라이드, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-계 물질, 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 작용제 또는 길항제의 국소 또는 겔기재 형태의 캐리어의 예로는, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 또는 메틸셀룰로오스과 같은 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 우드 왁스 알코올이 포함된다. 모든 투여에 대해, 통상적인 보관 형태가 적절하게 사용된다. 그러한 형태로는, 예컨대, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 리포좀, 고약, 흡입 형태, 코 스프레이, 설하 정제, 및 서방성 제제가 포함된다. STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 길항제는 통상적으로 약 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL의 농도로 그러한 비히클 중에 조제될 것이다.
또다른 제제로는, STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제를 성형 제품 내에 포함시키는 것을 포함한다. 그러한 제품은 내피세포 성장 및 혈관형성을 조절하는데 사용될 수 있다. 또한, 종양 침입 및 전이가 이들 제품으로 조절될 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용될 STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제는 살균성이어야 한다. 이는, 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 살균성 여과 멤브래인을 통해 여과함으로써 용이하게 수행된다. STOP-1 폴리펩티드는, 전신 투여되는 경우, 대개는 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 동결건조 형태인 경우, STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제는 통상적으로, 재구성을 위한 다른 성분과 조합하여 사용에 적절한 희석제와 함께 통상적으로 조제된다. STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제의 액체 제제의 예로는, 피하주사용 단일 투약용 바이알에 충진된 살균성, 투명, 무색의 비보존형 용액이다. 반복 사용에 적절한 보존용 제약학적 조성물은, 예컨대, 주로 폴리펩티드의 타입 및 조치에 따라, a. STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제; b. 용액 중 폴리펩티드 또는 다른 분자의 안정성을 최대로 하는 pH 범위 (바람직하게는 약 4-8)를 유지할 수 있는 버퍼; c. 교반-유도된 응집에 대해 폴리펩티드 또는 분자를 주로 안정화시키기 위한 세정제/계면활성제; d. 등장화제; e. 페놀, 벤질알코올 및 벤제토늄 할라이드(예컨대 클로라이드)의 군으로부터 선택된 보존제; 및 f. 물을 함유할 수 있다.
사용된 세정제가 비이온성인 경우, 이는, 예컨대 폴리소르빈산 (예컨대, POLYSORBATE™ (TWEEN™) 20, 80, 등) 또는 폴록사머 (예컨대, POLOXAMER™ 188)일 수 있다. 비이온성계면활성제의 사용은 상기 제제가 폴리펩티드의 변성을 야기하지 않고 전단 표면 응력에 노출되게 한다. 또한, 그러한 계면활성제 함유제제는 폐 투약에서 사용되는 것들과 같은 에어로졸 장치 및 바늘없는 제트 주사건에 사용될 수 있다 (예컨대, EP 257,956 참조).
등장화제는 STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제의 액체 조성물을 등장성있도록 하기 위해 제공될 수 있으며, 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 또는 그 이상의 당 알코올 (예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨)을 포함한다. 이들 당 알코올은 단독으로 사용될 수도 있고, 조합하여 사용될 수도 있다. 다르게는, 나트륨 클로라이드 또는 기타 적절한 무기 염이 용액을 등장성으로 만들기 위해 사용될 수 있다.
버퍼는, 예컨대, 원하는 pH에 따라 아세테이트, 시트레이트, 숙신에이트, 또는 포스페이트 버퍼일 수 있다. 본 발명의 한가지 타입의 액체 제제의 pH는 약 4 내지 8, 바람직하게는 생리적 pH 정도로 버퍼된다.
보존제 페놀, 벤질알코올 및 벤제토늄 할라이드, 예컨대, 클로라이드는 사용될 수 있는 공지된 항균제이다.
치료용 STOP-1 폴리펩티드 또는 항체 조성물은 일반적으로, 살균성 출입 포트를 갖는 용기, 예컨대 정맥주사용 용액 백 또는 피하주사 바늘에 의해 삽입될 수 있는 마개를 갖는 바이알에 넣어진다. 상기 제제는 바람직하게는 반복적인 정맥 주사 (i.v.), 또는 피하주사 (s.c.)또는 근육내 주사 (i.m.), 또는 비강내 전달 또는 폐내 전달 (폐내 전달에 대해서는 EP 257,956 참조)에 적절한 에어로졸 제제로서 투여된다.
STOP-1 폴리펩티드 또는 항체는 또한 서방성 제제의 형태일 수도 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는, 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 상기 매트릭스는 성형 제품, 에컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는, 폴리에스테르, 히드로겔 (예컨대 , 문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)] 및 문헌[Langer, Chem. Tech., 12: 98-105(1982)]에 기재된 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리 (비닐알코올)), 폴리락티드 (U.S. 3,773,919, EP 58,481), L-글루타민산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌[Sidman et al., BioPolymers, 22: 547-556 (1983)]참조), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (앞의 Langer et al.의 문헌), 분해성 락틱산-글리콜산 공중합체 (예컨대, Lupron Depot™(락틱산-글리콜산 공중합체와 류프롤라이드 아세테이트를 포함하는 주사가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)가 포함된다.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락틱산-글리콜산과 같은 중합체가 100 일 이상동안 분자를 방출할 수 있는 한편, 어떤 히드로겔은 단백질을 좀더 짧은 시간동안 방출한다. 캡슐화된 단백질이 신체내에 장기간 남아 있을 때, 이들은 37 ℃에서 습기에 대한 노출의 결과로 변성 또는 응집하여, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 변화등을 야기할 수 있다. 합리적인 전략이 관련된 메카니즘에 따라 단백질 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예컨대, 응집 메카니즘이 티오-디술파이드 교환반응을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시킴으로써, 산성용액으로부터 동결건조시킴으로써, 습기 함량을 조절함으로써, 적절한 첨가제를 사용함으로써, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
서방성 STOP-1 폴리펩티드 및 항체 조성물은 또한, 리포좀-포착된 STOP-1 폴리펩티드를 포함할 수도 있다. STOP-1 폴리펩티드를 함유하는 리포좀은 그 자체가 공지된 방법에 의해 제조된다: DE 3,218,121; 문헌들[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985)]; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980)]; EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046; EP 143,949 ; EP 142,641 ; 일본 특허출원 83-118008; U.S. 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324 참조. 통상적으로 리포좀은 작은 단일 라멜라형 (약 200-800 Å)으로, 여기서 지질 함량은 약 30 몰% 콜레스테롤 초과이고, 최적 요법을 위해 비율이 선택 조절된다.
STOP-1 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 치료용 유효 투약량은 물론, 치료()예방)될 증식성 장애, 투여 방법, 치료용으로 사용되는 화합물 타입, 관련된 임의의 보조요법, 환자의 나이, 무게, 전체적 의학적 상태, 의학적 병력 등과 같은 요인에 따라 변화할 것이며, 개원의 정도의 숙련된 의사는 결정을 내릴 수 있다. 따라서, 임상의사가 최대 치료 효과를 얻기 위해 요구될 때 투여경로를 변형시키고 투약량을 적정화시킬 필요가 있을 것이다. 임상의학자는, 문제의 상태의 치료에 대해 원하는 효과를 달성하는 투약량에 도달할 때까지 STOP-1 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 투여할 것이다. 예컨대, 목적이 암의 치료인 경우, 양은 암의 성장을 억제하는 것일 것이다.
상기 지침으로, 유효 투약량은 일반적으로 약 0.001 내지 약 1.0 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.01-1.0 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01-0.1 mg/kg이다.
증식 장애를 치료하는 비경구 사용을 위해, 주사 형태로 STOP-1 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 체중 kg 당 약 0.01 내지 50 mg, 바람직하게는 약 0.05 내지 20 mg, 가장 바람직하게는 1 내지 20 mg으로, 정맥 주사로 매일 1 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다. 경구 투여에 대해서는, 체중 kg 당 STOP-1 폴리펩티드계 분자는 바람직하게는 약 5 mg 내지 1 g, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 100 mg으로 매일 1 내지 3회 투여된다. 내독소 오염이 안전 수준, 예컨대 0.5 ng/mg 단백질 미만으로 최소한으로 유지되어야 한다는 것을 알고 있어야 한다. 또한, 인간 투여에 대해서는, 상기 제제는 바람직하게는 FDA 및 생물학적 기준에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반적 안정성 및 순도 요건을 만족한다.
조직 재생에 사용될 STOP-1 폴리펩티드를 함유하는 제약학적 조성물의 투약 요법은 상기 폴리펩티드의 작용을 변화시킬 다양한 요인, 예컨대 형성되기를 원하는 조직 중량, 손상 부위, 손상 조직의 상태, 상처의 크기, 손상 조직의 타입 (예컨대, 뼈), 환자의 나이, 성별 및 음식물, 감염 정도, 투여 시간, 및 기타 임상적 요인을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 투약량은 제약학적 조성물에서 기타 단백질의 함유물에 따라 재구성에 사용된 매트릭스의 타입에 따라 변화할 수 있다. 예컨대, 기타의 공지된 성장 인자, 예컨대 IGF-I를 최종 조성물에 첨가하는 것도 또한 투약량에 영향을 준다. 조직/뼈 성장 및(또는) 회복을 주기적으로, 예컨대 X-선, 조직형태계측법, 테트라사이클린 표지법에 의해 평가하여 경과를 측정할 수 있다.
STOP-1 폴리펩티드 또는 길항제 또는 작용제의 투여 경로는 공지된 방법, 예컨대 정맥내, 근육내, 뇌내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 안내, 관절내, 활막내, 경막내, 구강, 국소, 또는 흡입 경로, 또는 이하에 기재된 서방성 시스템에 의해 주사법 또는 주입관에 따른다. STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제는 또한 종양내, 종양주위, 병변내 또는 병변주위 경로에 의해 적절히 투여되어 전신 치료용 효과뿐만 아니라 국소 치료에도 적용된다. 복막내 경로는, 예컨대 난소 종양의 치료에서 특히 유용한 것으로 예측된다.
펩티드 또는 소분자가 길항제 또는 작용제로서 사용되는 경우, 이는 바람직하게는 액체 또는 고체의 형태로 포유동물에 경구식 또는 비경구식으로 투여된다.
염을 형성하고 이하에 유용한 분자의 약리학적으로 용인가능한 염의 예로는, 알칼리 금속 염 (예컨대, 나트륨 염, 칼륨 염), 알칼리토 금속 염 (예컨대, 칼슘 염, 마그네슘 염), 암모늄 염, 유기 염기 염 (예컨대, 피리딘 염, 트리에틸아민 염), 무기산 염 (예컨대, 염화수소, 술페이트, 니트레이트), 및 유기산 염 (예컨대 , 아세테이트, 옥살레이트, p-톨루엔술포네이트)가 포함된다.
뼈, 연골, 힘줄, 또는 인대 재생에 유용한 본원의 조성물에 대해서는, 치료 방법으로는, 조성물을 국소적으로, 전신적으로 또는 이식 또는 장치로서 부분적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 사용하기 위한 치료용 조성물은 발열원이 없고, 생리적으로 용인가능한 형태에 있다. 또한, 조성물은 바람직하게는 뼈, 연골 또는 조직 손상 부위에 전달되기 위해 점성 형태로 주사되거나 캡슐화될 수 있다. 국소 투여는 상처 치료 및 조직 회복에 적절할 수 있다. 바람직하게는, 뼈 및(또는) 연골 형성을 위해서는, 조성물은 뼈 및(또는) 연골 손상 부위에 뼈 및 연골을 발달시키고 바람직하게는 신체내로 재흡수될 수 있는 구조체를 제공하는 단백질-함유 조성물을 전달할 수 있는 매트릭스를 포함할 것이다. 그러한 매트릭스는, 기타 이식 의료 용도를 위해 현재 사용되는 재료로 형성될 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 성질, 미학적 외관 및 계면 성질에 기초한다. 조성물의 특정 응용은 적절한 제제를 정의할 것이다. 조성물의 가능한 매트릭스는 생분해성일 수도 있고, 화학적으로 정의된 칼슘 술페이트, 트리 칼슘 포스페이트, 히드록시아파티트, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 및 폴리안하이드라이드일 수 있다. 기타 가능한 재료는 생분해성이고 생물학적으로 잘 분화된 것들, 예컨대 뼈 또는 피부콜라겐과 같은 것이다. 추가의 매트릭스는, 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분을 포함한다. 기타 가능한 매트릭스는 비생분해성이고, 화학적으로 분화된 것들, 예컨대 소결된 히드록시아파티트, 바이오유리, 알루미네이트, 또는 기타 세라믹과 같은 것이다. 매트릭스는 상기한 재료의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 그 예로는 폴리락틱산과 히드록시아파티트, 또는 콜라겐과 트리칼슘 포스페이트와 같은 것이 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트에서와 같은 조성물, 및 프로세싱에서 기공 크기, 입자크기, 입자 형태 및 생체적합성을 변경시키기 위해 변경될 수 있다.
특정 실시태양은 150 내지 800 미크론의 입경을 갖는 다공성 입자의 형태인 락틴산과 글리콜산의 50:50 (몰 중량) 공중합체이다. 몇가지 용도에서, 폴리펩티드 조성물이 매트릭스로부터 분리되는 것을 방지하기 위해, 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 자가혈액 덩어리와 같은 격절형성제를 사용하는 것이 유용할 것이다.
격절형성제의 한가지 적절한 분류는, 알킬셀룰로오스 (히드록시알킬셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 카르복시메틸셀룰로오스 포함)와 같은 셀룰로오스 물질이며, 바람직한 것 중 하나는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC)의 양이온 염이다. 다른 바람직한 격절형성제의 예로는, 히아루론산, 나트륨 알지네이트, 폴리 (에틸렌 글리콜), 폴리옥시에틸렌 옥사이드, 카르복시비닐 중합체, 및 폴리(비닐 알코올)이 포함된다. 본원에서 유용한 결절형성제의 양은 총 제제 중량에 대해 0.5-20 중량%, 바람직하게는 1-10중량%이며, 이는 폴리펩티드 (또는 그의 길항제)가 중합체 매트릭스로부터 탈착되는 것을 방지하고 조성물의 적절한 취급성을 제공하지만 전구세포가 매트릭스를 침투하는 것을 방지할 정도로 많지는 않아 폴리펩티드 (또는 그의 길항제)가 전구세포의 뼈발생 활성을 보조할 기회를 제공하기 위해 필요한 양을 나타낸다.
조합 요법
STOP-1 폴리펩티드 또는 작용제 또는 이의 길항제의 문제의 장애를 예방 또는 치료에서의 유효성은 활성 제제를, 이 목적에 효과적인 다른 제제와 순차적으로 또는 동일한 조성물 또는 별도의 조성물에 조합하여 투여함으로써 개선될 수 있다.
예컨대, 세포 증식 장애의 치료에 대해서, STOP-1 폴리펩티드 길항제 요법은 세포독성 제제와 같은 세포 증식의 다른 억제제의 투여와 조합될 수 있다.
또한, 암을 치료하기 위해 사용된 STOP-1 폴리펩티드 길항제는 상기한 세포독성, 화학치료 또는 성장 억제제와 조합될 수 있다. 또한, 암 치료를 위해, STOP-1 폴리펩티드 길항제는, 방사선 조사 또는 방사선 물질의 투여와 관련된, 방사선 치료와 순차적으로 또는 조합하여 적절히 투여될 수 있다.
치료가 암을 위한 것이라면, 다른 종양-관련 항원에 대한 항체, 예컨대 ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 또는 VEGF 수용체 중 1종 이상에 결합하는 항체를 투여하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 이에 더하여, 상기 항원 또는 본원에 개시된 2종 이상의 다른 항원에 결합하는 2종 이상의 항체가 환자에게 동시 투여될 수도 있다. 종종, 1종 이상의 사이토킨을 환자에게 투여하는 것이 이로울 수도 있다. 바람직한 일실시태양에 있어서, 본원의 길항제 항체는 성장-억제 작용제와 함께 투여될 수도 있다. 예를 들면, 성장-억제 작용제가 먼저 투여되고, 그 뒤 본 발명의 길항제 항체가 투여될 수 있다. 그러나, 동시에 투여하거나, 본 발명의 길항제 항체가 먼저 투여되는 것 또한 계획되어진다. 성장-억제제의 적절한 투여량은 현재 사용되는 정도이며, 성장-억제제 및 본원의 항체의 조합 활성(상승작용)에 기인하여 줄어들 수도 있다.
일실시태양에 있어서, 조합 요법에 의해 종양의 혈관형성이 공격받게 된다. 본 발명의 길항제 항체 및 또 다른 항체(예를 들면, 항-VEGF)은, 예를 들면, 종양의 괴사 또는 (만일 존재한다면) 그의 전이초점을 관찰함으로써, 정해진 치료적 효과량으로 종양을 지닌 환자에게 투여된다. 이 요법은 더 이상의 이로운 효과가 전혀 관찰되지 않거나, 임상 시험이 아무런 종양 또는 임의의 전이초점의 흔적을 나타내지 않을 때까지 계속된다. 그 뒤, TNF가 투여되는데, 단독 또는 보조제, 예컨대 알파-, 베타-, 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린, 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 집락형성인자(GM-CSF); 또는 종양에서의 미세 혈관 응고를 촉진하는 작용제, 예컨대 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체, 또는 C4b 결합 단백질(1991년 2월 21일 공개된 WO 91/01753을 참조); 또는 가열 또는 방사선과 조합하여 투여된다.
STOP-1 폴리펩티드 또는 그의 길항제와 조합하여 투여되는 치료제의 효과량은 내과의사 또는 수의사의 판단에 달려 있다. 약의 투여 및 조정은 치료되는 상태의 최대한의 관리를 달성하기 위해 이루어진다. 투여량은 사용되는 치료제의 유형 및 치료되는 특정 환자 등의 요인에 또한 좌우될 것이다. 대체로, 사용되는 양은 주어진 치료제가 STOP-1 폴리펩티드 없이 투여되는 경우 사용되는 투여량과 동일할 것이다.
프로모터
상기 기술된 장애의 진단 또는 치료에 유용한, STOP-1 폴리펩티드 또는 그들의 아고니스트 또는 길항제를 함유하는 키트 등의 제조물은 적어도 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 성형될 수 있다. 용기는 상태를 진단 또는 치료하는 데 효과적인 조성물을 보관하며, 멸균 접근 포트(port)를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사바늘로 관통 가능한 마개를 가진 바이알일 수 있다). 상기 조성물의 활성제는 STOP-1 폴리펩티드 또는 그에 대한 아고니스트 또는 길항제이다. 용기 위의, 또는 용기와 관련된 표지는 상기 조성물이 특정 상태를 진단 또는 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 제조물은 제약학적으로 허용 가능한 완충액, 예컨대 인산염-완충 염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2 용기를 더 포함할 수 있다. 제조물은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 포함한 포장기록을 포함하는 상업적 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물품들을 더 포함할 수 있다. 제조물은 또한 상기 언급한 또 다른 활성제를 수반하는 제 2 또는 제 3의 용기를 포함할 수 있다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들면 면역제 및, 원한다면 아쥬반트의 1회 이상의 주사에 의해, 포유동물에서 길러질 수 있다. 대체로, 면역제 및(또는) 아쥬반트는 다수의 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물 내로 주사될 것이다. 면역제는 STOP-1 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역제를 면역될 포유동물 내에서 면역성을 띠는 것으로 알려진 단백질에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 그러한 면역성 단백질의 예로는, 키홀 림펫 헤테로시아닌(KLH), 혈청 알부민, 소 갑상선글로불린, 및 대두 트립신 억제제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 사용 가능한 아쥬반트의 예로는 프로인드 완전 아쥬반트 및 MPL-TDM 아쥬반트(모노포스포릴 리피드 A 또는 합성 트리할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역 프로토콜은 과도한 시험 없이도 당업자에 의해 선택될 수 있다.
모노클로날 항체
항-STOP-1 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들면, 히브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)]에 기술된 방법에 의해 제조되거나, 재조합 DNA 방법(미국 특허번호 4,816,567)에 의해 만들어질 수도 있고, 또는 본원의 실시예 부분에 기술된 방법에 의해 제조될 수도 있다. 히브리도마 방법에 있어서, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물이, 전형적으로는 면역제로 면역되어, 면역제에 특정적으로 결합할 항체를 만들거나 만들 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역될 수도 있다.
면역제는 대체로 STOP-1 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원 세포가 바람직한 경우라면 말초 혈액 림프구(PBL)가 사용되거나, 인간이 아닌 포유동물 공급원이 바람직한 경우라면 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 림프구는 그 뒤, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 면역 세포주와 융합되어, 히브리도마 세포를 형성한다. 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]을 참조한다. 면역 세포주는 보통 변환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소, 및 인간 기원의 골수 세포이다. 보통, 래트 또는 마우스의 골수 세포주가 사용된다. 히브리도마 세포는 바람직하게는 비융합, 면역 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는, 적합한 배지 내에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 만일 모세포에 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 부족하다면, 히브리도마를 위한 배지는 대체로 히포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)를 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT-부족 세포의 성장을 방해한다.
바람직한 면역 세포주는 효과적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 안정적인 고수준 항체 발현을 지탱하는 것들이며, HAT 배지 등의 배지에 민감하다. 더욱 바람직한 면역 세포주는 쥐의 골수 세포인데, 이들은 예를 들어 캘리포니아주 샌디에고에 위치한 샐크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center), 및 버지니아주 마나사에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 구할 수 있다. 인간 골수세포주 및 마우스-인간 이종골수세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 제조에 관해 공지되어 왔다. 문헌 ([Kozbor, J.Immunol., 133: 3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63]을 참조한다.
히브리도마 세포가 배양된 배지는 그 뒤 STOP-1 폴리펩티드에 대적하여 유도되는 모노클로날 항체의 존재에 관해 시험될 수 있다. 바람직하게는, 히브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특정성은 면역 침강 또는 시험관내 결합 시험, 예컨대 방사선면역시험(RIA) 또는 효소-연계 면역흡수 시험(ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기법 및 시험법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들면 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캣차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 히브리도마 세포가 식별된 후, 클론은 희석 절차를 제한하여 서브클론되고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 상기 Goding의 논문을 참조한다. 이러한 목적의 적합한 배지는 예를 들면, 둘베코의 개질 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 히브리도마 세포는 시험관내에서 포유동물 내의 복수(ascites)로서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 배지 또는 복수액으로부터 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화 크로마토그래피에 의해 단리 또는 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국특허번호 4,816,567에 기재된 방법에 의해 제조될 수도 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 DNA 인코딩은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특정적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 쉽게 단리되고 서열화될 수 있다. 본 발명의 히브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 한번 단리되면, DNA는 발현 벡터에 놓여지고, 그 뒤 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소세포(CHO), 또는 재조합 숙주 세포 내의 모노클로날 항체의 합성을 얻기 위해 다른 방법으로는 면역 글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수세포 등의 숙주 세포로 감염된다. DNA 또한, 예를 들면, 인간의 중쇄 및 경쇄의 일정 도메인의 코딩 서열을 상동 쥐 서열 대신 치환하거나(미국특허번호 4,816,567 및 모리슨 등의 상기 논문) 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드용 전부 또는 일부의 코딩 서열을 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 일정 도메인 대신 치환되거나, 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 위치의 다양한 도메인 대신 치환되여, 키메라 2가 항체를 제조할 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 한 방법은 면역글로불린의 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 중쇄 가교를 방지하기 위해서, 일반적으로 Fc 영역 내의 임의의 지점에서 절단된다. 별법으로, 가교를 방지하기 위해서, 적절한 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되거나, 또는 절단된다.
시험관내 방법 또한 1가 항체의 제조에 적절하다. 항체 분절, 특히 Fab 분절의 생성을 위한 항체의 소화는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 성취될 수 있다.
인간 항체 및 인간화 항체
항-STOP-1 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 더 포함할 수 있다. 비-인간(예를 들면, 쥐) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 그들의 분절(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 다른 항체의 항원-결합 서열)이다. 인간화 항체는 수여자의 CDR로부터의 잔기가 비-인간종(공여자 항체), 예컨대 원하는 특정성, 친화성, 및 용량을 가지는 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)을 포함한다. 몇몇의 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 구조 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체 또한 수용자 항체에서도, 및 수입 CDR 또는 구조 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 및 대체로 두 개의 가변 도메인 전부를 실질적으로 포함하며, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하며, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 교감 서열의 것이다. 인간화 항체는 바람직하게는 대체로 인간 면역글로불린의, 적어도 일부분의 면역글로불린 일정 영역(Fc)을 또한 포함할 것이다. 문헌 ([Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)])을 참조한다.
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입되는 1종 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되며, 대체로 "수입" 가변 도메인으로부터 포획된다. 인간화는 윈터 및 그의 동료의 하기 방법(문헌 ([Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)] 및 [Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)])을 참조한다)에 의해, 상응하는 인간 항원 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 수행될 수 있다. 이에 따라, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체(미국특허 4,816,567)이며, 여기서 실질적으로 손상되지 않은 것 이하인 인간 가변 도메인이 비-인간종으로부터의 상응하는 서열로 치환된다. 실제로는, 인간화 항체는 대체로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 위치로부터의 잔기로 대체되는 인간 항체이다.
인간화의 별법으로써, 인간 항체가 생성될 수도 있다. 예를 들면, 면역 하에서, 내성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 완전 레퍼토리를 생산할 수 있는 이식 유전자 동물(예를 들면 마우스)을 제조하는 것이 이제는 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식 계열 돌연변이 마우스의 항체 중쇄 결합 영역(JH)의 동형 삭제가 내성 항체 생성의 완전 억제를 유발한다는 것이 공지되어 있다. 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 배열을 이러한 생식 계열 돌연변이 마우스로 이동시키면, 항원 도전 하에서 인간 항체의 생성이 이루어질 것이다. 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)], [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)], 미국특허번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm 소유), 5,545,807] 및 WO 97/17852)을 참조한다. 별법으로, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 이식 유전자 동물, 예컨대 내성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스 내로 도입하여 제조될 수 있다. 도전에 직면한 경우, 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 점에서 인간에게 나타나는 유사한 형태의 인간 항체 생성이 관찰된다. 이러한 시도는 예를 들면, 미국특허번호 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 및 5,661,016, 그리고 하기 과학문헌 ([Marks et al., Bio/Technolog, 10: 779-783 (1992)], [Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)], [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)], [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)], [Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)] 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev.ImmunoL, 13: 65-93 (1995)])에 기재되어 있다.
별법으로, 파지 디스플레이 기술(문헌 [McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)]이 비면역 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 분절을 시험관 내에서 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 기법에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13, 또는 fd의 주 또는 부 코트 단백질 유전자 내로 골격내 클론되며, 파지 입자의 표면 위에 기능적 항체 분절로서 표시된다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 복사체를 함유하므로, 항체의 기능성 성질에 기반한 선택 또한 이러한 성질을 나타내는 항체를 인코딩하는 유전자의 선택을 유발한다. 그러므로, 상기 파지는 B-세포의 일부 성질을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 유형으로 수행될 수 있는데, 이는 예를 들면 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]에서 재고된다. V-유전자 분획의 여러 가지 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 소형 난수 조합 라이브러리로부터의 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 비면역 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 수립될 수 있고, 항원(자가-항원을 포함하는)의 다양한 배열에 대한 항체는 본질적으로 문헌 ([Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)])에 기재된 기법을 따라 단리될 수 있다. 또한 미국특허번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.
상기에서 논의되었듯이, 인간 항체는 또한 시험관내에서 활성화된 B 세포로부터도 생성될 수 있다 (미국특허번호 5,567,610 및 5,229,275를 참조한다).
인간 항체는 또한, 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 문헌 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)])을 참조한다. 콜(Cole) 등, 및 뵈르너(Boerner) 등의 기법 역시 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용 가능하다. 문헌 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147(1) : 86-95 (1991)])을 참조한다.
이중특이적 항-STOP-1 항체
이중특이적 항체는 2 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 본 경우에 있어서, 결합 특이성 중 하나는 STOP-1 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 및 바람직하게는 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다. 예를 들면, 세포-표면 단백질은 천연 킬러(NK) 세포 수용체일 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에 의하면, 본 발명의 이중특이적 항체는 STOP-1을 결합할 수 있고 NK 세포를 결합할 수 있고, 임의로 NK 세포를 활성화할 수 있다. 또다른 실시태양에 의하면, 본 발명의 이중특이적 항체는 STOP-1을 결합할 수 있고 다른 조직과 비교해서 기질 조직에 결합한다(예를 들면, 기질 표적화제).
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 제조는 두 개의 이뮤노글로불린 중쇄/경쇄 쌍(여기서, 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 가짐)의 공동 발현에 기초한다. 문헌[Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539(1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의의 분류 때문에, 이들 하이브리도마(콰드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생성한다(이중 하나만이 정확한(correct) 이중특이적 구조를 가짐). 정확한(correct) 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 자리)은 이뮤노글로불린 불변-도메인 서열에 융합될 수 있다. 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합을 위해 필요한 자리를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합 및, 필요한 경우, 이뮤노글로불린 경쇄를 코드화하는 DNA는 별도의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 기관 내로 공동-형질감염된다. 이중특이적 항체의 발생의 추가의 상세한 설명을 위해, 예를 들면, 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210(1986)]을 참조한다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양으로부터 제조하고 단리하는 다양한 기술들이 또한 기술된다. 예를 들면, 이중특이적 항체가 루신 지퍼(leucine zipper)를 사용하여 제조되어왔다. 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553(1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 두 개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결된다. 항체 호모다이머는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고 그 후 재산화되어 항체 헤테로다이머를 형성한다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머의 제조에 사용될 수 있다. 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448(1993)]에 기술된 "다이아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조에 대한 대체 메카니즘을 제공하였다. 단편은 동일 쇄 상의 두 도메인 사이의 쌍형성을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적 VL 및 VH와 강제로 쌍을 형성하고, 그로 인해 두 개의 항원-결합 자리를 형성한다. 단일 쇄 Fv(sFv) 다이머의 사용에 의해 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 방법이 또한 보고되어왔다. 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368(1994)]을 참조한다.
2 이상의 수가(valency)를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60(1991)].
이형접합체 항체
이형접합체 항체는 두 개의 공유 결합된 항체를 포함한다. 상기 항체는, 예를 들면, 면역-시스템 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하기 위해(미국 특허 제 4,676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. 가교제를 포함하는 것들을 포함하여, 항체가 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다는 점이 고려된다. 예를 들면, 항체 독소가 이황화물-교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성하는 것에 의해 구성될 수 있다. 이러한 목적을 위해 적합한 시약의 예들은 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및, 예를 들면, 미국 특허 제 4,676,980호에 개시된 것들을 포함한다.
이펙터(effector) 기능 유전자 조작
예를 들면, 암 치료에 있어서 항체의 유효성을 증강하기 위해 본 발명의 항체를 이펙터 기능에 대하여 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기(들)은 Fc 영역 내로 도입될 수 있고, 그로 인해 이 영역 내에 사슬간 이황화물 결합 형성을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 발생한 호모다이머 항체는 개선된 내부이행 능력 및(또는) 증가한 상보체-매개된 세포 킬링 및 항체-의존성 세포 독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌[Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195(1992)] 및 문헌[Shopes, J. Immunol.. 148: 2918-2922(1992)]을 참조한다. 증강된 항-종양 활성을 갖는 호모다이머 항체가 또한, 문헌[Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565(1993)]에 기술된 바와 같이, 헤테로이관능성 가교제를 사용하여 제조될 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 유전자 조작될 수 있고 그로 인해 증강된 상보체 용균 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 문헌[Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230(1989)]을 참조한다.
면역접합체
본 발명은 또한 화학요법제와 같은 세포 독성 작용제에 접합된 항체, 독소(예를 들면, 박테리아, 균, 식물성 또는 동물성 성분, 또는 그 단편들의 효소적으로 활성인 독소), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
상기 면역접합체의 발생에 유용한 화학요법제는 위에서 설명하였다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 독소, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 리스트릭토신(restrictocin), 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테신을 포함한다. 다양한 방사성 핵종이 방사성접합된 항체의 제조에 이용될 수 있다. 예들은 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다.
항체 및 세포 독성 작용제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올레인(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들면, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들면, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 같은 다양한 이관능성 단백질-커플링제를 사용하여 제조된다. 예를 들면, 리신 항체 독소는 문헌[Vitetta et al., Science, 238 : 1098(1987)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에릴렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)는 방사성 핵종과 항체의 접합을 위한 킬레이트제의 예이다. WO 94/11026을 참조한다.
또다른 실시태양에서, 항체는 종양 사전 표적화에 사용하기 위해 "수용체"(예를 들면, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고(여기서, 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여됨), 이어서 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 접합체가 제거되고 그 후 세포 독성 작용제(예를 들면, 방사성 핵종)에 접합된 "리간드"(예를 들면, 아비딘)가 투여된다.
면역 리포좀
본원에 개시된 항체는 또한 면역 리포좀으로 조제될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985)]; 문헌[Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980)]; 및 미국 특허 제 4,485,045호 및 4,544,545호에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 증강된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 제 5,013,556호에 개시되어 있다.
특별히 유용한 리포좀이 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 액체 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 한정된 구멍 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 가진 리포좀이 수득된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 문헌[Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288(1982)]에 기술된 것과 같이 이황화물-교환 반응에 의해 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제(예를 들면, 독소루비신(Doxorubicin))가 임의로 리포좀에 함유된다. 문헌[Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484(1989)]을 참조한다.
항체의 제약 조성물
본원에서 확인되는 STOP-1 폴리펩티드를 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자들은 상기 및 하기 언급된 다양한 장애의 치료를 위해 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
리포펙틴 또는 리포좀이 폴리펩티드, 핵산 분자, 항체, 길항제 또는 본 발명의 조성물을 세포 내로 운반하는데 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들면, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 펩티드 분자는 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하도록 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있고(있거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893(1993)]을 참조한다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 증세에 필수적인 활성 화합물을 하나 이상 함유할 수 있고, 서로에게 불리한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 활성 화합물들이 바람직하다. 별법으로, 또는 부가적으로, 조성물은 그 기능을 증강하는 작용제를 포함할 수 있으며, 그 예는 세포 독성 작용제, 화학요법제, 또는 성장-억제제이다. 이러한 분자들은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적절하게 존재한다.
활성 성분 또한, 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합반응에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각 콜로이드성 약물 운반 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자, 및 나노-캡슐) 또는 매크로에멀젼 내에 존재하는 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐 내에 갇힐 수 있다. 상기 기술은, 앞서, 레밍턴(Remington)의 문헌[Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다.
생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 반드시 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 손쉽게 수행된다.
서방형(sustained-release) 제제가 또한 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예들은 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고,여기서 매트릭스는 조형품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방형 매트릭스의 예들은 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제 3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루탐산염의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(상표명)와 같은 분해성 락트산-글리콜 산 공중합체(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 이상 동안 분자들의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔이 더 짧은 시간 동안 단백질들을 방출한다. 캡슐화된 항체들이 신체에 장기간 남아있는 경우, 그들은 37℃에서 습기에 노출되어서 변성 또는 응집될 수 있고, 이는 생물학적 활성의 손실 및 면역성의 가능한 변화를 초래한다. 포함된 메카니즘에 의존하여 합리적인 방법이 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들면, 응집 메카니즘이 티오-이황화물 교환을 통한 분자간 S-S 결합으로 밝혀진다면, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형하여, 산성 용액으로부터 동결 건조하여, 습기 함량을 조절하여, 적절한 첨가제를 사용하여, 그리고 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 달성될 수 있다.
항-STOP-1 항체를 사용한 치료 방법
STOP-1 폴리펩티드에 대한 항체가 상기한 혈관형성과 관련된 또는 그것에 합병된 다양한 증식성 장애 및 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 점이 고려된다.
항체는 공지된 방법, 예를 들면, 볼루스(bolus)로서의 정맥 투여에 의해 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국부성, 또는 흡입 경로에 의한 장시간 동안의 연속 주입에 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 항체의 정맥 투여가 바람직하다.
다른 치료적 투여 계획이 상기한 본 발명의 항체의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들면, 항체가 암을 치료한다면, 상기 항체를 사용하여 치료될 환자는 또한 방사선 치료를 받을 수 있다. 별법으로, 또는 부가적으로, 화학요법제가 환자에게 투여될 수 있다. 상기 화학요법제에 대한 제제 및 투여 스케쥴은 제조자의 지시에 의해 또는 숙련된 개업의에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다. 상기 화합요법에 대한 제제 및 투여 스케쥴은 또한 문헌[Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry(Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992)]에 기술되어 있다. 화학요법제는 항체의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있거나, 또는 항체와 동시에 투여될 수 있다. 항체는 타목시펜 또는 EVISTA(상표명) 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤(EP 616812 참조) 같은 항-프로게스테론과 상기 분자들에 대해 알려진 투여량으로 조합될 수 있다.
항체가 암의 치료에 사용되는 경우, 그것은, 임의로, 다른 종양-관련 항원에 대한 항체, 예컨대, 하나 이상의 ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 또는 VEGF 수용체(들)에 결합하는 항체와 함께 투여될 수 있다. 이들은 또한 상기 설명한 작용제를 포함한다. 또한, 항체는, 방사성 물질의 조사 또는 투여를 포함하든지 않든지 간에, 방사선 치료와 연속하여 또는 그것과 함께 적절하게 투여된다. 별법으로, 또는 부가적으로, 동일한 것을 결합하는 2 이상의 항체 또는 본원에 개시된 2 이상의 상이한 항원은 환자에게 공동-투여될 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서, 본원의 항체는 성장-억제제와 함께 공동-투여된다. 예를 들면, 성장-억제제가 먼저 투여되고, 이어서 본 발명의 항체가 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 본 발명의 항체의 우선 투여 또한 고려된다. 성장-억제제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 것이고 성장-억제제 및 본원의 항체의 조합 작용(상승 작용)에 의해 낮아질 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서, 종양의 재혈관화가 조합 요법에 의해 공격받는다. 항-STOP-1 폴리펩티드 항체 및 다른 항체(예를 들면, 항-VEGF)가, 예를 들면, 종양 또는 설사 있다 해도 그것의 전이성 부위의 괴사의 관찰에 의해 결정된 치료학적 유효량으로 종양을 갖는 환자에게 투여된다. 이 요법은 더 이상의 추가의 이로운 효과가 관찰되지 않거나 또는 임상 조사가 종양 또는 임의의 전이성 부위의 추적을 보이지 않을 때까지 계속 된다. 그 후 TNF가 단독으로 또는 알파-, 베타, 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린, 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과랍구-대식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating foactor, GM-CSF), 또는 종양 내의 미세혈관 응고를 촉진하는 작용제(예를 들면, 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체, 또는 C4b 결합 단백질; 1991년 2월 21일에 공개된 WO 91/01753 참조)와 같은 보조제, 또는 열 또는 방사선과 함께 투여된다.
보조제들의 유효성은 변할 것이기 때문에, 통상적인 방식의 매트릭스 스크리닝에 의해 보조제들의 종양에 대한 영향을 비교하는 것이 바람직하다. 항-STOP-1 폴리펩티드 항체 및 TNF의 투여는 원하는 임상 효과가 달성될 때까지 반복된다. 별법으로, 항-STOP-1 폴리펩티드 항체가 TNF 및, 임의로, 보조제(들)과 함께 투여된다. 고체 종양이 일반적인 순환으로부터의 단리에 감수성인 사지 또는 다른 부위에서 발견되는 경우, 본원에 기술된 요법제가 단리된 종양 또는 기관에 투여될 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체 같은 FGF 또는 PDGF 길항제가 항-STOP-1 폴리펩티드 항체와 결합하여 환자에게 투여된다. 항-STOP-1 폴리펩티드 항체를 사용한 치료는 바람직하게는 상처 치료 또는 바람직한 신혈관형성의 기간 동안 중지될 수 있다.
증식성 장애의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 항체의 적절한 투여량은, 항체가 예방 목적이든 또는 치료 목적이든 간에, 상기 정의한 바와 같이, 치료되는 장애의 유형, 질환의 중증도 및 경로, 이전 요법, 환자의 임상 경력 및 항체에 대한 반응, 주치의의 결정에 의존할 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다.
예를 들면, 장애의 유형 및 중증도에 의존하여, 약 1㎍/kg 내지 50㎎/㎏(예를 들면, 0.1 내지 20㎎/㎏)의 항체가, 예를 들면, 한번 이상의 별개의 투여에 의하든지, 연속 주입에 의하든지, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 일일 또는 주간 투여량은, 상기 언급한 인자들에 의존하여 약 1㎍/kg 내지 100㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상의 날에 걸친 반복 투여를 위해, 증상에 의존하여, 치료는 장애 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 반복되거나 또는 지속한다. 그러나, 다른 투여 계획이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은, 예를 들면, 방사선 종양 영상화를 포함하는 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
항체를 사용하는 제조품
항체를 갖는 컨테이너 및 표지를 함유한 제조품을 또한 제공한다. 활성제가 항-STOP-1 항체인 이러한 물품은 상기 기재되어 있다.
항체를 사용하는 종양의 진단 및 예후
항체를 사용하는 지시가 암인 경우에, 특정 종양에 과발현되는 세포-표면 단백질, 예컨대 성장 수용체는 약물 후보 또는 종양 (예컨대, 암) 치료에 대한 탁월한 표적인 반면에, STOP-1 폴리펩티드와 함께 동일한 단백질은 종양의 진단 및 예후에서 추가 용도를 찾는다. 예를 들어, STOP-1 폴리펩티드에 결합되는 항체는 종양 진단 또는 예후로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체는 STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자의 발현을 탐지하기 위해 질적으로 또는 양적으로 사용될 수 있다. 항체는 바람직하게는 탐지가능한 것, 예컨대 형광 표지를 가질 수 있고, 결합은 광 현미경, 유세포측정기, 형광측정기, 또는 당업계에 공지된 기타 기술에 의해 모니터링할 수 있다. 이러한 결합 분석은 실질적으로 상기 기재한 바와 같이 수행한다.
마커 유전자 생성물에 결합하는 항체의 동일 계내 탐지는 예를 들어 면역형광 또는 면역전자 현미경에 의해 수행할 수 있다. 이 목적을 위해, 조직학 표본을 환자로부터 얻고, 표지된 항체는 바람직하게는 항체를 생물학적 샘플 상에 오버레이함으로써 그에 가한다. 이 과정은 또한 조사한 조직에서 마커 유전자 생성물의 분포를 결정할 수 있다. 광범위한 조직학 방법이 동일 계내 탐지에 용이하게 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 인용된 모든 공개물 (특허 및 특허 출원을 포함함)은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원의 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙 (부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30 년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크, 인크.와 ATCC 사이의 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 (이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙 (37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건 하에 배양할 때 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 그 통지시 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)이다. 별도의 언급이 없는 경우, 본 발명은 상기 기재한 문헌 및 하기 교과서 [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)]; [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988)]; [Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984)]; [Freshney, Animal Cell Culture, 1987]; [Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991] 등에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 사용한다.
본 명세서 및 청구의 범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다 (comprise)" 또는 그의 변형, 예컨대 "포함하다 (comprises)" 또는 "포함하는"은 언급한 완전한 단어 또는 그의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 완전한 단어 또는 그의 그룹을 제외하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
앞서 기술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 고려된다. 하기 실시예는 단지 설명을 위해 제공되는 것이지, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 한정하려는 의도가 아니다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게는 명백하고, 이는 첨부된 청구의 범위 내에 있을 것이다.
실시예 1 --STOP-1은 진화에서 보존되어 있다
인간, 마우스 및 지브라 피쉬 (zebra fish) STOP-1을 함유한 핵산 분자는 PCR을 사용하여 수득하였다. 인간, 마우스 및 지브라 피쉬 STOP-1에 대해 상동성을 갖는 서열은 젠뱅크 (Genebank) 데이타베이스 마우스 EST: AK003674; 닭 EST: A1585129, AL585130; 라이스 피쉬 (rice fish) EST: BJ490431, BJ498080, BJ510203, BJ504730; 및 지브라 피쉬 EST: AL727874, AW595388; 및 HGT AL844521에서 발견할 수 있었다. 인간, 마우스, 라이스 피쉬, 지브라 피쉬 및 닭 STOP-1 핵산 분자의 핵산 서열을 각각 서열 1, 3, 5, 7 및 9에 기재한다. 그의 아미노산 서열을 서열 2, 4, 6, 8 및 10 및 도 1로서 재인용한다. 인간 STOP-1의 cDNA를 부다페스트 조약의 협약하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 불러바드 대학 (University Blvd.) 10801)에 하기에 기재하는 바와 같이 기탁하였다:
종 물질 기탁 번호 기탁일
인간 76393-1664 203323 1998년 10월 6일
인간 h762HIP PTA-5019 2003년 2월 21일
몇몇 고등 척추동물 종 (인간, 마우스, 닭, 지브라 및 라이스 피쉬) 중의 STOP-1의 아미노산 정렬은 고도의 보존, 특히 삼중 나선 도메인을 포함하는 C-말단 도메인의 부분을 나타낸다 (도 1). 컨센서스 서열에서, 별표는 모든 종에서 보존된 잔여부분을 나타낸다. 흑색 원은 대부분 종에서 보존된 잔여부분을 나타낸다.
도 2는 인간 STOP-1 단백질을 나타낸다. 박스 내의 서열은 신호 절단 부위를 나타낸다. 삼중 나선 도메인에 밑줄을 하였다.
실시예 2 --STOP-1은 종양에서 과발현된다.
마이크로어레이로부터의 유전자 발현 정보를 함유한 사유 데이타베이스 (GeneExpress (등록상표), 미국 메릴랜드주 가이테르스버그 소재의 젠로직 인크. (GeneLogic Inc.) 제품)를 각종 종양에서 STOP-1 mRNA의 발현에 대해 분석하였다 (BLIST 분석, GeneExpress (등록상표) 데이타베이스를 사용하기 위해 제넨테크, 인크.에서 개발된 사유 소프트웨어). 분석된 조직의 일부 유형에 지방, 부신, 혈관, 뼈, 유방, 자궁, CNS, 직장결장 자궁내막, 식도, 담낭, 두부 및 목, 심장, 조혈계, 신장, 간, 폐, 림프계, 근육, 자궁근층, 신경내분비계, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 소장, 연조직, 위, 고환, 흉선, 갑상선 및 비뇨계 및 정상 조직 (유방, 결장, 폐, 난소 및 신장)이 포함된다. STOP-1 mRNA 수준은 골, 유방, 자궁, 직장결장, 자궁내막, 식도, 신경교종, 두부 및 목, 신장, 폐, 신경내분비계, 난소, 췌장, 피부, 연조직, 위, 갑상선 및 비뇨계 종양에서 특히 상승되는 것으로 관찰되었다.
RNA 발현 수준은 또한 각종 종양 및 정상 조직 (유방, 결장, 폐, 난소 및 신장)으로부터의 전체 RNA에서 특정 표적인 STOP-1 (서열 1)의 역전사 (RT) 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 결정하였다. 조직을 제넨테크 병리학부에 의해 수득하고, RNA를 염화세슘 원심분리에 의해 제조하였다.
1 단계 RT-PCR 증폭 반응물은 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 하는 물 중에 10 x 완충액 A (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 제품), 10 유닛 RNase 억제제, 200 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mm MgCl2, 1.25 유닛 Taq Gold 중합효소, 25 유닛 MULV 역전사효소 (PE 바이오시스템즈 (PE Biosystems) 제품), 전체 RNA 50 ng, 200 nM 유전자-특이적 혼성화 프로브 (FAM-CATCCAGTAGAAGCATCTCCTTTTGGGTAA-TAMRA) (서열 23), 300 nM 유전자-특이적 정방향 프라이머 (GGGTTGGCACTTGTTCAGA) (서열 24) 및 300 nM 유전자-특이적 역방향 프라이머 (CAATAATGATGCGAGAAACTGAAT) (서열 25)로 이루어졌다. 열 주기 조건은 하기와 같았다: ABI 7700 시퀸스 디텍션 시스템 (Sequence Detection System)을 사용하는 1) 48℃, 30분; 2) 95℃, 10분; 및 3) 95℃, 15초 및 60℃, 1분의 40 주기. 전사 수준을 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 GAPDH 또는 RPL19으로 규격화하였다.
Taqman 분석은 이들 종양, 특히 췌장, 신장, 유방, 폐, 난소, 직장결장 종양, 연조직, 위 갑상선 및 비뇨계 종양에서 STOP-1 mRNA의 과발현을 확인하였다. 18개의 유방 및 결장 종양 샘플 중 14개가 정상 샘플에 비해 5 내지 27배의 과발현을 나타냈다. 다른 종양 유형도 또한 상승을 나타냈지만 더 작은 정도이었다. 이들 종양 유형에는 부신, 뼈, 경부, 자궁내막, 식도, 두부 및 목, 신장, 간 및 신경내분비계가 포함된다.
실시예 3 --동일 계내 혼성화 연구
(a) 프로브 합성
12.O ㎕ (125 mCi)의 [알파-33P] UTP (NEN/퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer) 제품 NEG307H)를 실리콘화된 1.5 ㎕ 미세원침관 (에펜도르프 (Eppendorf) 제품)에서 고속 진공기 (speed vac)로 건조시켰다. 건조된 33P-UTP를 갖는 각 튜브에 하기 시약을 가하고, 1시간 동안 37℃ 수조에서 인큐베이션하였다:
2.0 ㎕ 전사 최적화 5 X 완충액 (프로메가 (Promega) 제품, P1181),
2.0 ㎕ SQ H20
1.0 ㎕ DTT, 100 mM (프로메가 제품, P1171)
2.0 ㎕ rNTP 믹스, 2.5 mM [10 mM rATP (프로메가 제품, P113B), rCTP (프로메가, P114B) 및 GTP (프로메가 제품, P115B) 각각 10 ㎕ + 뉴클레아제-무함유 H20 (프로메가 제품, P1193) 10 ㎕]
1.0 ㎕ RNasin 리보뉴클레아제 억제제 (프로메가 제품, N2511)
1.0 ㎕ DNA 주형 (센스 대조 프로브 전사에 대한 상류 가닥 상에 박테리오파지 T7 및 안티센스 프로브 전사에 대한 하류 가닥 상에 박테리오파지 T3의 RNA 중합효소 프로모터 서열의 측면에 인간 STOP-1 코딩 서열의 부분을 코딩하는 선형 PCR-증폭 DNA 주형 1 ㎍)
센스 및 안티센스 프로브를 사용하는 전사 반응의 서열은 하기와 같다:
안티센스 프로브에 대해 RNA 중합효소 T3 (프로메가 제품, P2083) 1.0 ㎕ 또는
센스 프로브에 대해 RNA 중합효소 T7 (프로메가 제품, P2075) 1.0 ㎕.
다음에, 1 ㎕의 RQ1 RNase-무함유 DNase (프로메가 제품, M6101)는 방사성-표지 RNA 프로브를 함유한 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 반응물을 15분 동안 37℃에서 추가로 인큐베이션하였다. 이 단계는 반응물 중의 DNA 주형을 퇴화시켰다. 분해 반응을 중지시키기 위해, TE (lOmM 트리스 pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0) 90 ㎕를 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 도입되지 않은 뉴클레오티드는 RNeasy 미니 키트 (RNeasy Mini Kit) (미국 메릴랜드주 게르만타운 74104 소재의 퀴아젠 (Qiagen) 제품)를 사용하여 제거하였다.
프로브 수율은 분리 원형의 DE81 이온 교환지 (왓트만 (Whatman) 제품, 3658 325) 상으로 예비여과한 프로브 1 ㎕ 및 추후 여과 프로브 1 ㎕를 파이펫으로 옮김으로써 측정하였다. 샘플을 섬광 바이알 (위톤 사이언티픽 (Wheaton Scientific) 제품, 986701) 내의 바이오플루오르 (Biofluor) (팩카드 (Packard) 제품, 6NEF-961) 6 ml에 함침하고, 벡맨 (Beckman) LS 6500 상에서 계수하였다.
다음에, 프로브를 6% 폴리아크릴아미드 TBE/우레아 겔 (노벡스 (Novex) EC6865, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠 (Invitrogen) 제품) 상에서 분석하여 전사가 적절한 길이임을 확인하였다. 1 x 106 cpm의 프로브 또는 노바젠 퍼펙트 (Novagen Perfect) RNA 마커 0.1 내지 1 kb (노바젠 69924-1) 2 ㎕를 TBE/우레아 샘플 완충액 (노벡스, LC6876) 3 ㎕에 첨가하였다. RNA를 95℃ 히트 블록 상에서 3분 동안 변성시키고, 이어서 즉시 빙 상에서 냉각시켰다. 샘플을 180 내지 250 볼트에서 45분 동안 운행시켰다. 겔은 1시간 동안 -70℃ 동결기 내에서 강화 스크린을 갖는 바이오멕스 (Biomax) MS 필름 (코닥 (Kodax) 제품, 829 4985)에 노출시켰다.
(b) 동일 계내 혼성화
동일 계내 혼성화 분석을 정상 및 종양 조직의 구획 상에서 초기에 수행하였다. 슬라이드는 하기 기재하는 기술을 이용하여 인간 STOP-1 센스 및 안티센스 RNA 프로브에 혼성화시켰다. 추가 분석은 다수의 정상 및 종양 조직 표본을 함유한 조직 마이크로어레이 (TMA)의 구획 상에서 수행하였다. TMA 구획을 안티센스 RNA 프로브로로 독점적으로 혼성화하였다.
슬라이드를 오븐에서 베이킹하여 조직을 유리에 37℃에서 밤새, 이어서 65℃에서 30분 동안 부착시켰다. 구획은 레이카 오토스테이너 (Leica Autostainer) XL (미국 일리노이주 데르필드 소재의 레이카 제품)에서 각각 5분 동안 3 회 크실렌즈 (Xylenes) (미국 미시건주 칼라마주 소재의 리차드 알렌 (Richard Allen) 제품)에서 인큐베이션하고, 이어서 증류수로 등급화된 에탄올 시리즈를 통해 수화시킴으로써 탈파라핀화하였다. 슬라이드를 이어서 2 X SSC (0.3 M NaCl, 0.030 M Na시트레이트, pH 7.0)에서 각각 5분 동안 2 회 세척하였다. 슬라이드를 15분 동안 37℃에서 10 mM 트리스 pH 8.0/0. 5 M NaCl 용액 중의 단백질분해효소 K (미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로세 디아그노스틱스 (Roche Diagnostics) 제품) 20 ㎍/ml에서 처리하고, 10분 동안 0.5 X SSC (0.075 M NaCl, 0.007 M Na시트레이트, pH 7.0)에서 세척하였다. 슬라이드를 에탄올 구배 (70%-95%-100%)로 탈수화시키고, 공기 건조시켰다. 슬라이드를 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 10% 덱스트란 술페이트, 및 2 X SSC) 100 ㎕로 덮고, 1 내지 4시간 동안 42℃에서 예비혼성화시켰다. 상기에서 참조한, 농도 2 x 106 cpm의 [33P]-표지 단일-가닥 STOP-1 프로브 (안티센스 방향)를 tRNA 1 mg/ml를 함유한 혼성화 완충액 100 ㎕에 용해하고, 하나의 슬리드 상의 예비혼성화 완충액에 첨가하고, 잘 혼합하고, 커버슬립으로 덮고, 밤새 55℃의 밀봉된 항습 컨테이너 내에서 혼성화시켰다.
상기 혼성화 과정은 센스 방향의 동일한 [33P]-표지 단일-가닥 STOP-1 프로브를 사용하여 동일한 조직 블록으로부터의 또다른 슬라이드 상에서 수행하였다.
혼성화 후에, 슬라이드를 실온에서 10분 동안 1 mM EDTA를 함유한 2 X SSC 중에 2 회 세척하고, 이어서 30분 동안 37℃에서 10 mM 트리스 pH 8, 0.5 M NaCl 중의 RNase A 20 ㎍/mL에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 실온에서 1 mM EDTA를 함유한 2 X SSC로 10분 동안 세척하고, 이어서 55℃에서 1 mM EDTA를 함유한 0.1 X SSC로 각각 30분 동안 4 회 세척하고, 이어서 실온에서 0.5 X SSC로 10분 동안 세척하였다. 슬라이드는 0.3 M 암모늄 아세테이트를 함유한 50%, 70%, 및 90% 에탄올로 각각 2분 동안 탈수시키고, 공기 중에서 건조시켰다.
슬라이드를 X선 필름 (바이오멕스 MR 필름, 코닥, 870 1302)에 16시간 동안 덧붙여 실험 성공의 예비 평가를 얻었다. 슬라이드를 이어서 NTB2 에멀션 (Emulsion) (코닥 제품, 165 4433) [H2O를 사용하는 1:1 희석]에 침지하고, 완전 암흑에서 밤새 건조시키고, 건조제를 갖는 빛이 통하지 않는 박스로 옮기고, 4 주 동안 노출시켰다. 4 주 후에, 슬라이드는 D-19 현상액 [H2O를 사용하는 1:1 희석]을 사용하여 3분 동안 15℃에서 현상시키고, 세정하고, 6분 동안 15℃에서 GBX 정착액 중에서 고정시켰다. 슬라이드는 병리학자에 의해 조사하기 전에 헤마톡실린 및 에오신으로 대조염색하였다.
하기 표 7은 동일 계내 혼성화 실험의 결과를 나타낸다:
조직 유형 정상 조직 (양성의 개수/전체) 종양 조직 양성의 개수/전체)
폐 2/16 성인 41/49 선암종27/30 편평세포 암종1/1 대세포 암종2/5 폐 신경내분비계 종양 세포주-모든 시험된 음성Calu-6 (폐 암종 퇴행성)SK-MES 세포 (편평세포 폐)H322A549 (폐 암종)H522
유방 0/6 성인 2/14 성인
결장 0/5 성인 4/8 성인
소장 1/5 성인 -
췌장 0/2 성인 3/5 성인
심장 0/2 태아 0/4 성인 - -
태반 0/5 성인 -
대동맥 0/1 성인 -
혈관 0/1 성인 -
흉선 0/1 성인 -
기도 0/1 성인 -
간 0/3 성인 2/4 성인 간세포 암종
갑상선 1/3 성인 -
피부 소포 및 진피 중에서 1/1 성인 4/4 성인 흑색종
위 0/3 성인 -
뇌 0/4 성인 -
비장 0/4 성인 -
림프절 0/3 성인 0/4 림프종 성인
전립선 0/3 성인 0/1 림프종 성인
난소 1/1 성인 2/2 성인
방광 0/1 성인 3/3 이행 세포 암종
담낭 0/1 성인 -
신장 0/2 성인 0/4 성인
부신 0/1 성인 -
자궁내막 - 2/3 성인
연골 - 0/1 연골육종
지방 - 0/1 지방육종
태아 조직 0/1 대동맥, 혈관, 흉선, 기도, 간, 폐 -
동일 계내 혼성화 실험은 대부분의 정상 샘플이 STOP-1 mRNA에 대해 음성으로 검사되었음을 나타냈다. 한편, 놀랍게도 다수의 폐 종양, 결장 종양, 췌장 종양, 간세포 암종, 흑색종, 난소암, 자궁내막암 및 방광 이행 세포 암종이 유의한 STOP-1 mRNA 발현을 나타냈다. 또한, STOP-1 mRNA는 기질 (예컨대, 폐 편평세포 암종, 선암종, 유방 암종)에서 주로 발현되고, 종양 세포에서 STOP-1 mRNA를 발현하는 흑색종을 제외하고는 대부분의 종양의 상피 구획에서는 발현되지 않았다. STOP-1 mRNA에 대해 양성으로 검사된 몇몇의 정상 조직은 갑상선 조직을 제외하고는 상피 세포에서 STOP-1 mRNA를 발현하는 기질 조직에서의 발현을 나타냈다. "-"는 조직을 조사하지 않았음을 나타낸다.
실시예 4 --정상 조직에서의 STOP-1 mRNA의 노던 분석
인간 및 마우스 STOP-1 cDNA 프로브 (전장 코딩 서열)를 랜덤-프라임 키트(random-prime kit) (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer))로 방사성 표지하고 제조업자의 지침에 따라 인간 멀티플 조직 및 마우스 배아 블롯 (클론테크(Clontech))의 분석을 위해 적용하였다. 그 결과를 도 3a 및 도 3b에서 알 수 있다.
정상 성인 인간 조직에서, 최고 STOP-1 mRNA 발현은 태반, 심장 및 골격근에서 검출되었다 (도 3a). 도 3b는 마우스 배아에서 발달 7일, 11일, 15일 및 17일째에 STOP-1 mRNA가 현저하게 발현되었다는 것을 나타내는 노던 블롯을 도시하고 있다.
실시예 5 - STOP-1 DNA 구조물
(a) 포유동물 세포 발현
모든 야생형 및 돌연변이체 인간, 마우스 및 지브라피시 STOP-1 cDNA 서열을 PCR로 제조하였고 포유동물 세포에서의 발현을 위해 합성 8 X HIS 태그 코딩 서열 (HIP)을 갖는 pIRESpuro2 벡터 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosiences)) 또는 pIRESpuro2에서 발현시켰다. 인간 FAP cDNA를 N-말단 pFLAG-CMV 벡터 (시그마(Sigma))에서 발현시켰다.
(b) 바큘로바이러스 발현
바큘로바이러스에서의 발현을 위해, 하기 인간 STOP-1 구조물을 제작하였다: 인간 STOP-1의 S31-K243을 코딩하는 S31인간STOP-1-pAcGP67B, L94-K243을 코딩하는 L94인간STOP-1-pAcGP67B, 및 E89-K243을 코딩하는 E89인간STOP-1-pAcGP67B. S31인간STOP-1-pAcGP67B를 2 단계의 PCR 접근법으로 제조하였다. 5' 파편을 프라이머 #161344 (GGATCGTCGGTTTTGTACAATATGT) (서열 71) 및 #161347 (GGGGATCTCAGACGCAAAGGCAGAATGCGC) (서열 72)을 사용하여 pAcGP67B로부터 제조하였다. 3' 파편을 프라이머 #161348 (TCTGCCTTTGCGTCTGAGATCCCCAAGGGG) (서열 73) 및 #161732 (CCGTTCTGCAGTTAATGATGATGATGATGATGATGATGG) (서열 74)를 사용하여 DNA #84694로부터 제조하였다. 전장 삽입물 (이어서 pAcGP67B로 서브클로닝됨)을 프라이머 #161344 및 #161732를 사용하여 동일한 부분 5' 및 3' 파편의 PCR 반응으로 제조하였다.
L94인간STOP-1-pAcGP67B를 2 단계의 PCR 접근법으로 제조하였다. 5' 파편을 프라이머 #161344 및 #161349 (GCTTTCCCTCAGCGCAAAGGCAGAATGCGC) (서열 75)를 사용하여 pAcGP67B로부터 제조하였다. 3' 파편을 프라이머 #161350 (TCTGCCTTTGCGCTGAGGGAAAGCTTTGAGG) (서열 76) 및 #161346 (CCGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAT) (서열 77)을 사용하여 DNA #84694로부터 제조하였다. 전장 삽입물 (이어서 pAcGP67B로 서브클로닝됨)을 프라이머 #161344 및 #161346을 사용하여 동일한 부분 5' 및 3' 파편의 PCR 반응으로 제조하였다.
DNA #84694를 PCR에 의해 증폭시켜 C-말단 His 태그를 갖는 S31-K243 및 L94-K243을 함유하는 두 개의 단편을 제조하였다. PCR 단편을 바큘로바이러스 전이 벡터 pAcGP67B (파민겐(PharMingen))로 서브클로닝하고, 이어서 BaculoGold DNA (파민겐)와 함께 Sf9 세포로 동시-형질감염시켰다. 재조합 바이러스를 단리하고 Sf9 세포에서 증폭시켰다.
E89인간STOP-1-pAcGP67B를 2 단계의 PCR 접근법으로 제조하였다. 5' 파편을 프라이머 #161344 (GGATCGTCGGTTTTGTACAATATGT) (서열 71) 및 #161351 (ATTCCCCCTTTTCCGCAAAGGCAGAATGCGC) (서열 78)을 사용하여 pAcGP67B로부터 제조하였다. 3' 파편을 프라이머 #161352 (TCTGCCTTTGCGGAAAAGGGGGAATGTCTGAG) (서열 79) 및 #161346 (CCGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAT) (서열 77)을 사용하여 DNA #84694로부터 제조하였다. 전장 삽입물 (이어서 pAcGP67B로 서브클로닝됨)을 프라이머 #161344 및 #161346을 사용하여 동일한 부분 5' 및 3' 파편의 PCR 반응으로 제조하였다.
실시예 6 - STOP-1 DNA 구조물로부터의 발현 및 단백질의 정제
STOP-1 DNA 구조물을 코딩하는 DNA를 제조업자 (로쉐(Roche))의 지침에 따라 인산칼슘 또는 퓨진(fugene) 6 형질감염 시약을 사용하여 CHO-DP12 세포, CHO-psgb 세포 (햄스터 갈락토실트랜스퍼라제 I 결핍 상피 pgsB-618 CHO 세포) (ATCC# CRL-2241) 또는 293 세포 (로쉐)로 형질감염시켰다. 성장 배지에 1 mM의 NiCl, 5 mM의 CaCl2 및 50 mM의 트리스 pH 7.6-8.0를 보충하였다. 형질감염 후 16시간에 혈청 함유 배지를 혈청 무함유 배지로 교체하고 단백질을 4-6일 동안 축적시켰다. 분비된 단백질을 Ni-NTA 아가로스 비드를 사용하여 정제하였다.
세포 용해물로부터 단백질을 형질감염 후 4일에 50 mM의 HEPES (pH 7.5), 150 mM의 NaCl, 1％의 트리톤 X-100, 5 mM의 EDTA, 1 X 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 완충액 (로쉐, [용해 완충액])에서 세포를 용해시킴으로써 제조하였다. 면역침강을, 세포 용해물을 25 ㎕의 고정된 단백질 A/G - 아가로스 비드 (피어스(Pierce))로 예비소제 (4℃에서 2시간)하고 이어서 용해물의 분취물 (0.5 ml) (분취물당 4 × 105 개의 세포)을 항-His 에피토프 항체 (퀴아겐(Qiagen)) 및 단백질 A/G - 아가로스 비드와 함께 배양 (4℃에서 4시간)함으로써 수행하였다. 면역침강물을 용해 완충액으로 3회, 인산 완충 식염수로 1회 세척하고, 10％의 SDS-PAGE로 분별하고, 니트로셀룰로스 막 (인비트로겐(Invitrogen))에 옮겼다. 웨스턴 블롯 분석을 마우스 항-His 및 ECL 키트 (아머샴(Amersham))를 사용하여 수행하였다.
도 4a로부터 재조합 단백질의 발현을 위해 통상 사용되는, CHO-DP12 세포는 분비된 STOP-1을 거의 제조하지 않았다는 것을 알 수 있다. 이와 반대로, 프로테오글리칸 합성이 결여된 CHO 돌연변이 세포인 CHO-Psgb는 보다 많은 분비 STOP-1을 제조하였고 용해된 형태의 분비된 단백질의 우수한 회수율을 산출하였다 (도 4b). pRK5를 음성 대조군으로서 형질감염시켰다. 도 5a 및 도 5b로부터 His-태깅 단백질을 CHO-psgB 형질감염된 세포의 세포 상등액 및 세포 용해물 각각에서 항-His 항체로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
바큘로바이러스로부터의 단백질 제조를 위해, Hi5 세포를 증폭된 바큘로바이러스로 감염시켰다. 27℃에서 배양한 3일 후에, 배지를 원심분리에 의해 수거하였다. 상등액에 50 mM의 트리스 8.0, 1 mM의 NiCl2, 5 mM의 CaCl2를 보충하고, pH를 7.6으로 조정하였다. 배지를 여과하고 Ni-NTA 아가로스 컬럼 (퀴아겐)에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM의 트리스 8.0, 300 mM의 NaCl, 2 mM의 벤즈아미딘, 0.5 mM의 PMSF, 및 5 mM의 이미다졸로 세척하였다. 300 mM의 이미다졸을 함유하는 동일한 완충액에서 용리하였다. STOP-1을 함유하는 분획을 풀링하고 농축시켰다. 단백질을 수퍼덱스(Superdex)-75 컬럼 상에서 50 mM의 트리스 8.0, 100 mM의 NaCl, 0.5 mM의 PMSF, 및 2 mM의 벤즈아미딘으로 정제하였다. STOP-1을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축시키고, 결정학적 시험 및 기타 연구를 위해 사용하였다.
실시예 7 - STOP-1 올리고머화
전장 STOP-1-HIS 단백질 또는 그의 다양한 말단절단물(truncation)을 전술한 바와 같이 SF9 바큘로바이러스 감염된 세포 또는 CHO 세포에서 발현시켰다. 단백질을 전술한 바와 같이 Ni-NTA 아가로스 비드를 사용하여 배지로부터 정제하였다. 바큘로바이러스성 발현된 단백질 S31-K243-His, E89-K243-His, 또는 L94-K243-His를 8 mm × 300 mm의 쇼덱스(Shodex) KW802.5 크기 배제 컬럼에 로딩하고 100 mM의 NH4HCO3, 200 mM의 NH4Cl (pH 7.8)을 사용하여 1 ml/ml의 유속으로 용리하였다. CHO-psgb 발현된 전장 단백질을 8 mm × 300 mm의 쇼덱스 KW804 크기 배제 컬럼에 로딩하고 25 mM의 인산나트륨, 500 mM의 NaCl을 사용하여 1 ml/ml의 유속으로 용리하였다. CHO-psgb 발현된 단백질인, L94-K243-His에 융합된 M1-M54를 8 mm × 300 mm의 쇼덱스 KW802.5 크기 배제 컬럼에 로딩하고 25 mM의 인산나트륨, 500 mM의 NaCl을 사용하여 1 ml/ml의 유속으로 용리하였다.
용리된 단백질을 와이어트 미니DAWN(Wyatt MiniDAWN) 레이저 광산란 (LS) 장치 및 와이어트 옵티랩(Wyatt Optilab) 시차 굴절계 (RI)에 연결된 아길런트(Agilent) 다파장 검출기 (UV)가 장착된 아길런트 모델 1100 HPLC 시스템으로 분석하였다. 각 피크에서 단백질 또는 그의 집합체의 평균 분자량을 피크를 선택하고 아스트라 소프트웨어 팩키지(Astra software package, 미국 소재의 와이어트)와 함께 짐 핏팅 방법(Zimm fitting method, 문헌[Phillip J. Wyatt, (1993) Analytica Chimica Acta 272:1-40])을 사용하여 측정하였다. 집합율은 214 nm에서 UV 시그널의 피크 면적을 합하여 계산하였다. 그 결과에 대해서는 도 6 및 도 7을 참조하기 바란다.
광산란 분석은 바큘로바이러스 S31-K243-His 단백질이 주로 삼량체 분자 (겉보기 분자량 74 kD, 합한 전체 피크 면적의 95％)를 형성하였다는 것을 나타낸다 (도 6A). 바큘로바이러스 E89-K243-His 단백질은 대략 36％가 삼량체이고 64％가 육량체 (즉, 겉보기 분자량 126 kD가 피크 면적의 36％에 해당하고, 겉보기 분자량 61 kD가 피크 면적의 64％에 해당함)인 복합체를 형성하였다 (도 6B). 그러나, E89-K243-His에 의해 형성된 육량체 복합체는 홀수의 시스테인으로 인해 이형(異形)인 것으로 생각된다. 삼중 나선 도메인이 결여된, 바큘로바이러스 L94-243 단백질은 삼량체 복합체 (겉보기 분자량 59 kD가 피크 면적의 98％에 해당함)를 형성하였다 (도 6C). 이것은 단백질의 N-말단 도메인 및 삼중 나선 도메인이 삼량체화를 위해서 필요하지 않다는 것을 나타낸다. L94-K243 영역은 충분하였다. THD는 삼량체를 안정화시키는 작용을 할 수 있었다.
CHO-psgb에서 발현된 단백질 또한 복합체를 형성하였다 (도 7A-도 7C). 광산란 분석이 전장 발현된 단백질 (M1-K243-His)이 대략 58％가 육량체이고 42％가 삼량체인 복합체를 형성하였다는 것을 나타낸다 (도 7A). 델타-THD 발현에 의해 형성된 복합체 (M1-M54 및 L94-L243-His)는 부분적으로는 삼량체 (겉보기 분자량 66 kD가 피크 면적의 61％에 해당함)이고 아마도 CHO 세포에서의 단백질의 다양한 당화 상태로 인해 부분적으로는 질량이 다양하였다 (평균 분자량 627 kD) (도 7B).
SDS 겔 상에서, CHO-psgb 세포에서 발현된, 정제된 전장 STOP-1은 환원성 조건하에서는 단량체로서 이동하고 비환원성 조건 (DTT 무함유)에서는 이량체로서 이동하였다. 도 7C를 참조하기 바란다. 그 결과는 두 개의 단량체 사이에 디술파이드 결합이 일어날 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8 - STOP-1의 결실 및 점 돌연변이 분석
전장 STOP-1 (WT)-His, 델타-THD-His, 델타-델타-THD-His, 델타-N-말단 및 다수의 점 돌연변이가 일어난 돌연변이체를 전술한 바와 같이 CHO-psgb 세포에서 발현시켰다. 전체 세포 추출물을 제조하였다. 전체 세포 추출물로부터의 분취물 또는 세포를 배양한 배지를 환원성 및 비환원성 조건하에서 SDS 겔 상에 러닝하고 항-His 항체 (ECL 검출 키트, 아머샴)를 사용하여 웨스턴 블롯팅하였다.
도 8A 및 도 8B는 디술파이드 결합이 상등액 및 용해물 각각으로부터의 추출물에서 THD 영역에서 두 개의 단량체 사이에 형성될 수 있다는 것을 나타낸다. 시스테인 55를 포함하는, THD가 결여된 각 결실 돌연변이체는 비환원성 조건하에서 이량체를 형성하지 않았다. 동종이량체가 비환원성 조건하에서 전장 단백질을 발현하는 세포의 상등액 및 용해물에는 존재하지만, 환원성 조건하에서는 존재하지 않았다. 표 9에 하기와 같이 그 결과를 요약하였다.
"+"는 분비 또는 이량체화 수준이 야생형 STOP-1과 동일하다는 것을 나타낸다.
"-"는 이량체화가 이 분석에서 검출되지 않았다는 것을 나타낸다.
인간 STOP-1의 점 돌연변이체를 분비능 및 이량체화능에 대해 시험하였다. 도 9A 및 도 9B로부터 야생형 STOP-1 단백질 및 G53A 돌연변이체가 분비되었고 동종이량체가 상등액 및 용해물에서 관찰되었다는 것을 알 수 있다. 그러나, 잠재적인 당화 부위인 186에서의 돌연변이체 ("N"이 "A"로 돌연변이됨)는 배양 배지에 존재하지 않았고 동종이량체화되지 않았다. 다수의 다른 돌연변이체 또한 시험하였다. 표 10에 하기와 같이 그 결과를 요약하였다.
"+"는 분비 또는 이량체화 수준이 야생형 STOP-1과 동일하거나 그보다 우수("++")하다는 것을 나타낸다. "-"는 분비 또는 이량체화가 이 분석에서 검출되지 않았다는 것을 나타낸다. N186A를 제외한 모든 이들 돌연변이체가 분비되었고 SDS 겔 상에서 WT와 유사하게 러닝하였다.
도 10A 및 도 10B로부터 시스테인 잔기 55, 93 및 109에서 점 돌연변이가 일어난 인간 STOP-1 단백질의 상태를 알 수 있다. 점 돌연변이를 또한 단백질 전체에서 다른 시스테인에서도 일으켰다. 표 11에 하기와 같이 그 결과를 요약하였다.
"+"는 분비 또는 이량체화 수준이 야생형 STOP-1과 동일하다는 것을 나타낸다. "-"는 이량체화가 이 분석에서 가시적으로 검출되지 않았다는 것을 나타낸다. "-/+"는 분비 또는 이량체화가 이 분석에서 약하게 검출되었다는 것을 나타낸다.
모든 돌연변이체가 발현되었지만, 단지 두개 (C55A 및 C93A)만이 분비되었다. C93A는, C55가 서브유닛 내 디술파이드 결합을 위해 필요하다는 것을 나타내는, 분비되지만 이량체를 형성하지 않는 C55A와 달리, 분비되어 이량체를 형성하였다.
실시예 9 - STOP-1 mRNA를 상향조절하는 Wnt 경로
STOP-1 유전자는 인간 염색체 8번 상에서 8q22와 8q23 사이에 위치한다. 상기 유전자는 FZD6 유전자 (프리즐링(frizzled) 상동체 8 (초파리)), WISP-1 유전자 (WNT1 유발성 분비된 단백질 1)와 같은 Wnt 시그널링 경로에서 중요한 단백질을 코딩하는 유전자에 근접하여 위치한다. Wnt 경로에는 인간의 일차암 및 다른 종의 실험 종양에서 돌연변이된 3개 이상의 조절 유전자가 있다.
MMTV-Wnt-1 트랜스제닉 마우스를 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)로부터 입수하였다. 이들 마우스는 MMTV 프로모터의 조절하에서 Wnt-1 단백질이 과발현되었다. C57Mg 세포는 Wnt-1이 과발현되지 않았다. 이들 마우스에서 유방 종양을 제거하였다. 유방 종양 또는 C57Mg 유방 상피 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 역전사효소 반응을 올리고(dT) 프라이머, 조류 골수아세포종 바이러스 역전사효소(프로메가(Promega)) 및 추출된 mRNA를 사용하여 제조업자(프로메가)의 지침에 따라 수행하였다. 역전사된 생성물 상에서의 PCR을 mRLP19 프라이머 및 마우스 STOP-1 프라이머를 사용하여 Ex-taq 폴리머라제 (다까라(Takara))로 수행하였다.
mRLP19는 뮤린(murine) 미토콘드리아 리보솜 단백질 L19 (MRPL19), 하우스킵핑(housekeeping) 단백질이다. mRNA의 추출 및 PCR에 대한 대조군으로서 mRLP19에 대한 프라이머를 사용하는 PCR을 사용하였다.
결과로부터 mSTOP-1 mRNA가 MMTV-Wnt-1 트랜스제닉 마우스에서는 발현되나 (도 11, 레인 T1-T7), C57Mg 정상 마우스 유방 상피 세포에서는 발현되지 않았다 ("N")는 것을 알 수 있다. 따라서, Wnt 시그널링 경로 및 STOP-1 발현 사이의 상관관계가 설명된다.
실시예 10 - 다른 유전자와의 STOP-1의 공동발현
유전자 발현 정보를 함유한 사설 데이타베이스 (미국 메릴랜드주 게이덜스버그에 소재한 진로직 인크.의 진익스프레스®)를 STOP-1과 동일한 조직에서 발현되는 유전자에 대해 조사하였다 (BLIST 분석, 진익스프레스® 데이타베이스와 함께 사용하기 위한 제넨테크 인크.에서 개발된 사설 소프트웨어). 이 방법으로, 유방 및 결장 종양에서의 발현의 유의한 관계를 갖는 여러 유전자를 확인하였다. 유방 및 결장 종양에서 공동발현되는 유전자는 Wisp-1 (WNT 표적 유전자), SFRP2 (가용성 WNT 수용체), 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 세포 표면 세린 프로테아제 (이는이온 암과 관련됨), 콜라겐 제I 유형 알파 2 쇄, 콜라겐 제V 유형 알파 2 쇄, 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 2 (THBS2) (ECM), ADAM12 (MMP 효소), OB-카드헤린(Cadherin) 및 OSF-2 (TCI 단백질)를 포함하였다. 보다 후자의 유전자들이 세포외 매트릭스의 형성 및(또는) 조정에 있어서의 STOP-1의 관여를 제안한다.
실시예 11 - STOP-1는 실험관내에서 MMP-7 및 MMP-9에 의해 절단됨
재료: 인간 his-태그 부착 STOP-1 단백질을 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성하였다. 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)-1, -2, -3, -7 및 -9를 엔자임 시스템즈 프로덕츠 (Enzyme Systems Products)로부터 구입하였다. 트립신을 시그마로부터 수득하였다.
STOP-1의 단백질분해성 소화: STOP-1과의 반응 전에, MMP를 37 ℃에서 1 시간 동안 1 mM p-아미노수은 아세테이트로 활성화시켰다. STOP-1 (31 ㎍)을 최종 부피가 20 ㎕인 프로테아제 (50 또는 250 nM)로 37 ℃에서 4 시간 동안 소화시켰다. 완충액 A (50 mM 트리스, pH 87.5, 10 mM CaCl2, 10 μM ZnCl2 및 100 mM NaCl)는 MMP 절단 반응을 위해 사용되는 완충액이었다. ZnCl2가 결핍된 완충액 A는 트립신 절단 반응을 위해 사용되는 완충액이었다. MMP 반응을 EDTA (15 mM)를 첨가하여 종결하였다. 트립신 반응을 PMSF (1 mM)를 첨가하여 종결하였다. 그 다음, 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색법으로 분석하였다.
도 23은 실험관내에서 다양한 프로테아제에 의한 바큘로바이러스 발현된 인간 STOP-1 단백질의 절단을 보여준다. 또한, MMP-7은 실험관내에서 인간 STOP-1을 절단하는 반면, MMP-1, -2 및 -3은 최소한의 절단 생성물을 생성하거나 또는 생성하지 않았다 (데이타는 나타내지 않았음). MMP-7은 약 23 및 21 kDa의 STOP-1 절단 생성물을 생성하였다. 반면에, MMP-9는 약 22 및 18 kDa의 STOP-1 절단 생성물을 생성하였다. 트립신은 20 및 22 kDa의 단편을 생성하였다 (데이타는 나타내지 않았음). 이들 데이타는 STOP-1 활성이 단백질분해에 의해 조절될 수 있다는 것을 제안한다. 이것은 종양 기질-관련 프로테아제, 예컨대 MMP-7 및 MMP-9와 특히 관련될 수 있다.
실시예 12 - STOP-1 발현은 3T3 증식을 촉진함
(a) 3T3 STOP-1 안정 세포주의 세포 배양 및 세대
3T3 세포를 10% FCS로 보충된 DMEM 중에 유지하였다. 마우스 및 인간 STOP-1-발현 세포주를 3T3 세포에 제조자의 지침서에 따라 FuGENE 6 형질감염 시약 (로슈)을 사용하여 m762pIRESpuro2 및 h762pIRESpuro2 벡터로 혈질감염시켜 설립하였다. STOP-1 클론을 푸로마이신 (4 g/ml)을 사용하여 형질감염된 세포를 선택하여 설립하였다.
(b) 실험관내 증식 검정
3T3 세포를 상기 기재한 바와 같이 마우스 STOP-1, 인간 STOP-1 또는 벡터 단독으로 형질감염시키고, 10% FCS를 함유한 DMEM 중에 1.5 x 103 세포에서 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 12 시간 후, 배지를 1.5% FCS 및 1O uCi/ml [3H]-티미딘을 함유한 DMEM으로 바꾸었다. 12 시간, 48 시간 및 96 시간 후, 세포를 패커드 사의 96-웰 필터메이트(Filtermate) 196을 사용하여 GF/C 여과기 상에서 수확하고, 세척하고, 최상의 계수기인, 마이크로플레이트 섬광 계수기 (패커드) 상에서 계수하였다. 결과는 STOP-1을 발현하는 클론이 벡터 단독으로 형질감염된 클론 (puro2 및 ph1)에 비해 증식이 증가하였음을 입증한다는 것을 보여준다. 도 12A 및 B 참고.
(c) 3T3 세포주에서의 레트로바이러스성 발현
인간 전장 STOP-1 cDNA를 H762pirespuro2로부터 pMSCV1(puro) 벡터 (클론테크)로 클로닝하고, 맥커 (Maecker) 등의 문헌 [Maeker H. L., et al., Cancer Cell 2, 139-148, 2002]에 기재된 방법을 사용하여 레트로바이러스 감염으로 3T3 섬유모세포 및 293 세포 중으로 도입하였다. 간단하게는, 웰 당 5000개의 세포를 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 다음날 저 혈청 배지 (0.25% 소 태아 혈청)로 바꾸었다. 레트로바이러스로 감염된 세포를 푸로마이신 (3 ㎍/ml) 중에서 선택하였다. 24 시간 후, 세포 증식을 세포 역가 키트 (Cell Titer Kit) (프로메가)를 사용하여 측정하였다. 도 13C는 STOP-1 레트로바이러스로의 감염이 대조군으로 감염된 3T3 또는 293 세포와 비교하여 3T3 및 293 세포 둘 다의 증식을 촉진한다는 것을 보여준다.
STOP-1 단백질을 검출하기 위해, 세포 펠렛 (약 2 x 106개 세포)의 전체 세포 용해물을 준비하고, 하기 기재하는 항체 S7-IgG (1 ㎍)와 함께 인큐베이션하고, 후속적으로 단백질 A/G로 면역침전시켰다. 이어서, 면역침전물을 변성시키고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이어서, STOP-1을 토끼 폴리클로날 항-STOP-1 항체를 사용하여 검출하였다. 도 13A 및 B는 벡터 대조군인 베이브 (Babe)와 비교된 STOP-1 레트로바이러스로 감염시킨 이후 전체 세포 용해물 중의 3T3 및 293 세포에서의 STOP-1의 발현을 보여준다.
실시예 13 - STOP-1 발현은 마우스에서 종양발생을 일으킴
암컷 무흉선 nu/nu 마우스 (챨스 리버 레보라토리즈(Charles River Laboratory), [1 그룹 당 5마리의 동물])를 마우스 또는 인간 STOP-1, RAS cDNA (문헌 [Hudziak RM, Lewis GD, Shalaby MR, Eessalu TE, Aggarwal BB, Ullrich A, Shepard HM. (1988) Proc Natl Acad Sci. 85(14), pp.: 5102-6] 참고) 또는 빈 puro2 벡터 (p2)로 안정하게 형질감염된 1 x 106개의 3T3 세포를 피하 접종하였다. 종양 성장을 1 주일에 1회 측정하였다. 안정 3T3 세포주를 또한 펠렛화된 세포의 전체 세포 용해물을 준비하고, 용해물 또는 세포 배양물 배지의 분취액에 대한 SDS-PAGE를 수행하고, 겔을 웨스턴 블로팅하고, 토끼 항-STOP-1 항체를 사용하여 이들을 탐침하여 STOP-1 발현에 대해 평가하였다. RAS cDNA로 형질감염된 세포는 양성 대조군으로 제공하였다. 도 14A 내지 C 참고.
결과는 뮤린 STOP-1이 모든 NIH 3T3 클론의 용해물 중에 존재하는데 반해, 3개의 NIH 3T3 클론 중 2개의 세포 배양물 배지에만 존재하였다는 것을 보여준다 (각각 도 14B 및 C 참고). 즉, 세포 내에서 단백질을 발현하는 클론 18은 뮤린 STOP-1 단백질을 분비하는데는 결손되어 있다. 도 14B 참고. 또한, STOP-1을 분비하는 2개의 클론은 누드 마우스 중에서 종양을 생성하는 반면, 분비에 결손이 있는 클론은 종양을 생성하지 않았다 (도 14A 참고). 이들 결과는 분비된 뮤린 STOP-1은 단독으로 종양발생성일 수 있는 반면, 세포내 발현된 STOP-1은 그렇지 않다는 것을 제안한다.
상기 결과는 또한 인간 STOP-1이 마우스에서 종양발생을 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 도 15 참고. 종양은 인간 STOP-1 단백질을 발현하는 여러 마우스 및 RAS 대조군에서 성장하였으나, 벡터 단독으로 형질감염된 세포로 처리한 마우스에서는 성장하지 않았다. 마우스 STOP-1과는 달리, 이들 결과는 분비된 인간 STOP-1은 단독으로 종양발생성일 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 14 - STOP-1은 상처 치유를 촉진함
악성 흑색종 SK-MEL-31 세포를 10% FCS로 보충된 DMEM 중에 유지시켰다. SK-Mel-31 세포를 6 웰 디쉬 (코르닝 (Corning)) 중에 이들이 아합류될 때까지 배양한 다음, 가열로 불활성화시킨 2% FCS를 함유한 DMEM 중에 8 시간 동안 영양 결핍시켰다. 이어서, 세포를 2 시간 동안 미토마이신 C (시그마) 10 g/ml를 함유한 FCS 비함유 DMEM 중에 처리하고, 이어서 실험관내 상처 패쇄 검정을 수행하였다.
세포가 없는 영역을 황색 피펫 팁을 사용하여 SK-MEL-31 세포 단층을 스크랩핑함으로써 도입하였다. 스크랩핑 후 48 시간 동안의 세포가 없는 영역으로의 세포 이동을 세포를 EGF (로슈) 30 ng/ml, 인간 STOP-1 단백질을 발현하는 전장 바큘로바이러스, 둘 다의 부재하에 또는 둘 다의 존재하에 가열로 불활성화시킨 2% FCS로 보충된 DMEM 중에 유지하면서 평가하였다. 도 16A 내지 E는 스크랩핑 한 지 48 시간 후의 스크랩핑된 영역의 상-반전된 사진이다.
결과는 세포가 CHO-psgB 세포로부터 발현된 EGF 또는 STOP-1, 특히 STOP-1로 처리하였을 때 스크랩핑된 영역으로 이동하였다는 것을 보여준다. 결과는 STOP-1이 세포 이동을 촉진한다는 것을 나타낸다. 세포 이동은 종양 세포에서 이들이 주변 조직을 침입할 때 발생한다. 상기 데이타는 STOP-1의 종양 촉진 특성을 추가로 지지한다.
실시예 15 - 모노클로날 항체 발생
10마리의 BALB/c 마우스 (미국 델라웨어주 윌밍톤 소재한 챨스 리버 라보라토리즈)를 리비 (Ribi) 아쥬반트 (리비 이뮤노켐 리서치, 인크. (Ribi Immunochem Research, Inc.) 미국 미주리주 하밀톤 소재) 중에서 PSGB 중국 햄스터 난자 세포 (제넨테크, 인크. 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)에 일시적으로 발현된 재조합 폴리히스티딘-태그 부착된 (HIS8) 인간 STOP-1 (a.k.a. DNA 145960)로 고면역화시켰다. 항-STOP-1 항체 역가를 입증하는 5마리의 마우스로부터의 B-세포를 문헌 [Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Nature 256: 495-497; Hongo, J. S., et al., (1995) Hybridoma 14: 253-260]에 이미 기재된 프로토콜과 유사한 변형된 프로토콜을 사용하여 마우스 골수종 세포 (X63.Ag8.653; 미국 메릴랜드주 로크빌에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)와 함께 융합시켰다.
10 내지 14일 후, 상청액을 수확하고, 직접 효소 연관 면역흡착법 (ELISA)에 의해 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. 한정 희석에 의한 서브클로닝의 두번째 라운드 후에 가장 높은 면역결합을 나타낸 1개의 양성 클론 (6B12.1.7)을 Mab의 생체내 생성을 위해 프리스탄(Pristane)-프라임된 마우스 (Freund YR and Blair PB (1982) J Immunol 129: 2826-2830)에 주사하였다. 복수를 풀링하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (파마시아(Pharmacia) 고속 단백질 액체 크로마토그래피 [FPLC]; 파마시아, 스웨덴 웁살라(Uppsala) 소재)로 상기 기재한 바와 같이 정제하였다 (문헌 [Hongo et al., 1995, 상기문헌] 참고). 정제된 항체 제제를 멸균 여과시키고 (0.2-㎛ 포어 크기; 미국 뉴욕주 로체스터에 소재한 날진(Nalgene)), 인산 완충 식염수 (PBS) 중에 4 ℃로 보관하였다. 6B12 항체를 생성하는 하이브리도마 클론은 부타페스트 조약 하에 2003년 3월 28일에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 빌딩 10801에 소재)에 "6B12.1.7"로서 기탁하였다.
6B12 항체에 대한 결합 부위를 인간 STOP-1의 N-말단 영역에 맵핑하였다. 인간 전장 단백질인, 델타-THD 단백질, 델타-델타-THD 단백질, 델타-N-말단 단백질 및 지브라피쉬 전장 단백질을 코딩하는 His-태그 부착된 작제는 CHO-psgB 세포에서 발현시켰다. 형질감염된 세포 추출물의 분취액을 SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅 및 항-His 항체 또는 6B12 항체를 사용한 탐침을 수행하였다.
6B12 모노클로날 항체가 웨스턴 상에서 보다 우수하게 작업하였다. 도 17C 참고. 이는 델타-N-말단 단백질을 제외하고, 상기 기재된 바와 같이 발현된 모든 인간 단백질에 결합하였다. 따라서, 6B12 항체의 결합 에피토프는 인간 STOP-1의 N-말단 아미노산 제33번 내지 제52번에 맵핑된다. 6B12 항체는 웨스턴 블로팅 상에서 지브라피쉬 STOP-1 단백질을 인식하지 않았다.
실시예 16 - STOP-1에 대한 파지-유도된 항체
개관: STOP-1에 대한 파지-유도된 항체를 부분적으로 2002년 6월 3일에 출원한 미국 가출원 제60/385,338호 (이하, "338 출원") 중에 기재된 재료 및 방법을 사용하여 제조하였다. 이 연구에서는, 파지미드를 추가로 변형하고, 생성된 항체를 올리고머화 STOP-1에 대한 결합을 기초로 하여 스크리닝하였다.
항-Her2 Fab 및 F(ab)' 2 파지미드의 작제: 파지미드 벡터인, pS0643 (또한 phGHam-g3로 공지됨, 예를 들어, 미국 특허 제5,688,666호의 실시예 8 참고)은 pBR322 및 f1 복제 개시점, 암피실린 내성 유전자, 이. 콜라이 알칼리 포스파타제 (phoA) 프로모터 (문헌 [Bass et al., (1990) Proteins 8: 309-314] 참고), 인간 성장 호르몬 (hGH)의 잔기 제1번 내지 제191번과 융합된 stII 분비 신호 서열을 코딩하는 서열 및 M13 파지의 단백질 III의 C-말단 잔기 제267번 내지 제421번을 코딩하는 서열 (이후, cP3)을 함유한다. pS0643 파지미드는 또한 hGH의 잔기 제191번 이후의 XbaI 부위 및 앰버 정지 코돈을 함유한다. stII 분비 신호 서열은 박테리아 세포의 페리플라즘으로 단백질 (예를 들어, 항체의 경쇄 영역 (LC))을 배출시킬 수 있다. 본 연구에서는, 인간 성장 호르몬을 코딩하는 서열을 pS0643 벡터로부터 제거하고, stII 분비 신호 (humAb4D5-8, 서열에 대해서는 문헌 [Carter et al., (1992) PNAS 89: 4285-4289, 표 1 및 도 1] 또는 미국 특허 제 5,821,337호 참고)와 함께 프레임 중에 라이게이션된 인간화 항-Her2 Fab 단편 ("h4D5" 서열)을 코딩하는 NsiI/XbaI 핵산 단편으로 대체하였다.
h4D5 항체는 Her-2 (erbB2)로 공지된 암-관련된 항원을 특이적으로 인지하는 인간화 항체이다. 본 연구에서, h4d5는 PCR 생성물 중에 5'NsiI 부위 및 3'XbaI 부위를 발생시키도록 조작된 humAb4D5 버젼 8 ("humAb4D5-8") 서열 및 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응으로 수득하였다 (문헌 [Carter et al., (1992) PNAS 89: 4285-4289] 참고). PCR 생성물을 NsiI 및 XbaI로 절단하고, pS0643 파지미드 벡터 중으로 라이게이션하였다. h4D5 핵산 서열은 대개 인간 컨센서스 서열 Fab 프레임워크 중에 Her-2에 대해 특이적인 마우스 모노클로날 항체로부터 변형된 CDR 영역을 코딩한다. 구체적으로, 상기 서열은 VH 및 CH1 도메인 (HC 영역)의 카파 경쇄 (LC 영역) 상류를 함유한다. 항-Her-2 항체를 제조하는 방법 및 가변 도메인 서열의 확인은 미국 특허 제5,821,337호 및 동 제6,054,297호에 제공되어 있다.
인간화 4D5 (버젼 8)를 함유한 pS0643 플라스미드는 또한 추가로 변형되었다. 예를 들어, 제1형 단순 포진 바이러스 당단백질 D 에피토프 태그 (gD 태그)를 부위-특이적 돌연변이유발을 사용하여 LC의 C-말단에 프레임 중에 추가하였다. LC의 정지 코돈 하류 이후에, 리보좀 결합 부위 및 stII 신호 서열을 코딩하는 핵산 분자를 HC 서열의 N-말단에 라이게이션하였다. 결론적으로, HC 서열은 M13 파지의 소수 코트 단백질인 p3의 C-말단 도메인 (cP3)과 함께 프레임 중에 존재한다. 따라서, 파지 상에 표시된 Fab는 하나의 작제로부터 생성될 수 있다. 이 Fab 파지미드 벡터는 pV0350-2b (도 25A 내지 H 참고)로 지칭되고, 도 24A로서 도시적으로 도식될 수 있다.
파지 상에 표시되는 F(ab)'2를 생성하기 위해, PV0350-4 벡터를 카세트 돌연변이유발에 의해 HC와 cP3 서열 사이에 이량체화될 수 있는 류신 지퍼 GCN4 서열 (GRMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERG) (서열 84)을 삽입하여 추가로 변형시켰다. GCN4 류신 지퍼는 이. 콜라이 페리플라즘에서 2 세트의 LC/HC-cP3 융합 폴리펩티드를 함께 유발하고, 파지의 표면상에 이량체를 나타낸다. 이 F(ab)'2 파지미드 벡터를 pV0350-4로서 지칭하고 (도 27A 내지 H 참고), 도 24B로서 도시적으로 도식할 수 있다.
STOP-1 선택에 사용하기 위한 H1/H2/H3 다양성을 갖는 F(ab) 라이브러리 생성: 항-STOP-1 항체를 찾기 위한 다양화된 라이브러리를 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발을 사용하여 pV0350-2b 및 pV0350-4 벡터 중에 HC 가변 영역을 코딩하는 서열을 돌연변이시키고, ELISA 검정에 의한 인간 STOP-1에의 결합하는 것을 기초로 하여 이들을 함유하는 파지를 스크리닝하여 생성하였다. 스크리닝 방법은 이후에 보다 상세하게 기재하였다. STOP-1에 더 높은 특이성 또는 친화성을 갖는 다른 항체를 예를 들어, 이들의 LC CDR 영역에서 Fab 및 F(ab)'2 서열을 추가로 돌연변이유발시키고 (예를 들어, 쿤켈 돌연변이유발 (문헌 [Kunkel et al., (1987) MethodsEnzymol. 154: 367-382] 참고), STOP-1에 대한 결합으로 이들을 스크리닝하여 수득할 수 있다.
파지의 발현: 이. 콜라이 균주 SS320을 상기 기재된 돌연변이유발된 DNA로 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 라이브러리의 크기는 대략 109이다. 형질전환된 박테리아 세포를 헬퍼 파지 K07의 존재하에 밤새 성장시켜 여전히 다른 박테리아 세포를 감염시킬 수 있는 디스플레이 파지를 생성하였다. 그 다음, 이. 콜라이 균주 XL-1 블루 (스트레이트진(Strategene), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 F(ab) 또는 F(ab)'2 파지로 감염시킨 다음, K07 헬퍼 파지 (스트레이트진, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 20 시간 동안 37 ℃에서 2YT 배지 중에 성장시키고, 파지를 상기 기재한 바와 같이 수확하였다 (문헌 [Sidhu et al., Methods Enzymol. (2000), 328: 333-363]). 간단하게, 파지를 우선적으로 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 밤새 배양된 배지로부터 침전시켜 정제하고, PBS 중에 현탁시켰다. 파지를 268 nm에서 판독하는 분광광도계로 정량하였다 (1 OD = 1.13 x 1013/ml).
파지 분류: 파지 라이브러리를 4 라운드의 분류로 수행하였다. 96-웰 눈크 맥시솔프 (Nunc Maxisorp) 플레이트를 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 PBS 중에 표적 항원 (CHO-psgb-발현된 인간 his-태그 부착된 STOP-1 전장 또는 바큘로바이러스성으로 발현된 인간 his-태그 부착된 제94번 내지 제243번 아미노산 ("단형")) (5 ㎍/ml) 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트를 30 분 동안 1% 차단 단백질 65 ㎕, 및 추가 30 분 동안 1% 트윈20 40㎕로 차단하였다 (차단 단백질: 1st 라운드-소 혈청 알부민 (BSA), 2nd 라운드-오브알부민, 3rd 라운드-카세인, 4th 라운드-오브알부민). 그 다음, 라이브러리 파지를 0.1% 트윈20을 함유한 1% BSA를 사용하여 3 내지 5 O.D/ml로 희석하였다 (1 O.D = 1.13 x 1013 파지/ml). 일반적으로, 파지 투입은 1st 라운드 3 내지 5 O.D/ml, 2nd 라운드 3 O.D/ml, 3rd 라운드 0.5 내지 1 O.D/ml 및 4th 라운드 0.1 내지 0.5 O.D/ml이었다. 희석된 파지를 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 및 0.05% 트윈20으로 5회 이상 연속적으로 세척하였다. 차단된 라이브러리 파지를 실온에서 1 시간 동안 8개의 표적 항원-코팅된 웰 및 2개의 코팅되지 않은 웰에 웰 당 100 ㎕로 첨가하였다. 플레이트를 PBS 및 0.05% 트윈20으로 10회 이상 연속적으로 세척하였다. 파지를 실온에서 20 분 동안 웰 당 100 mM HCl 100㎕를 사용하여 용출하였다. 용출된 파지 (코팅된 웰로부터) 및 배경 파지 (코팅되지 않은 웰로부터)를 별도의 튜브에 수집하였다. 용출된 수집물을 1/10 부피 1M 트리스 pH 11.0을 두 튜브에 첨가하여 중성화하였다. BSA를 용출된 파지의 튜브 중으로 최종 0.1%가 되도록 첨가하였다. 용출된 파지를 20 분 동안 62 ℃에서 가열하였다. 파지를 적정하기 위해, 로그 기간의 XL-1 90 ㎕ (OD 600nm 약 0.1 내지 0.3)를 30분 동안 37 ℃에서 용출된 파지 또는 배경 파지 10 ㎕로 감염시켰다. 그 다음, 감염된 세포를 2YT 90 ㎕를 사용하여 10 배 증가량으로 계열 희석하였다. 카르베니실린 플레이트 당 감염된 세포의 10 ㎕ 분취액을 플레이팅하였다.
파지를 번식시키기 위해, 용출된 파지의 대략 400 ㎕를 사용하여 로그 상의 XL-1 수프 약 4 ml (OD 600nm 약 0.1 내지 0.3)를 37 ℃에서 30 내지 45 분 동안 감염시켰다. 헬퍼 파지인 K07 및 카르베니실린을 첨가하여 37 ℃에서 추가 1 시간 동안 1 x 1O10 pfu/ml K07 및 50 ㎍/ml 카르베니실린의 최종 농도로 감염시켰다. 배양물을 50 ㎍/ml 카르베니실린 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 50:50 2YT/CRAP 배지 중에 최종 부피가 20 내지 25 ml가 되도록 37 ℃에서 밤새 (또는 17 시간 이상) 성장시켰다. 다음날, 배양물을 30 ℃에서 추가 2 시간 동안 성장시켜 파지 수율을 증가시켰다.
파지를 세포를 800 rpm에서 10 분 동안 회전시켜 정제하였다. 상청액을 수집하였다. 20% PEG/2.5M NaCl을 상청액 부피의 1/5로 첨가하고, 혼합하고, 5분 동안 빙상에서 정치하였다. 파지를 12000 rpm으로 15 분 동안 펠렛으로 회전시켰다. 상청액을 수집하고, 5 동안 5000 rpm으로 다시 회전시켰다. 펠렛을 PBS 1 ml 중에 재현탁시키고, 15 분 동안 12000 rpm으로 회전시켜 데브리스를 제거하였다. PEG/NaCl 첨가로 개시된 단계를 재현탁된 펠렛에 대해 반복하였다. 재현탁된 파지 펠렛의 OD를 270 nm에서 판독하였다.
파지 분류의 2nd, 3rd 및 4th 라운드를 상기 기재한 바와 같은 파지 분류를 반복하여 완료하였다. 단형에 결합하는 것을 기초로 하여 선택된 파지 항체를 "S숫자"로 나타내었다 (예를 들어, S4, S9, S7 및 S16). 전장 형태에 결합하는 것을 기초로 하여 선택된 파지 항체를 "F숫자"로 나타내었다 (예를 들어, F5, F6, F13 및 F47).
ELISA 스크리닝 검정: 분류 2 내지 4로부터의 클론을 ELISA 검정에 의해 특이성 및 친화성에 대해 스크리닝하였다. 양성 클론 (결합체)은 표적 항원에 결합한 상기 배경을 갖지만 관련되지 않은 다른 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 및 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1)에는 결합하지 않는 클론이었다.
우선, 384-웰 미세적정 플레이트의 웰을 웰 당 전장 또는 단형 (제93aa 내지 제243aa) his-태그 부착된 인간 STOP-1, IGF-1, Her-2 또는 항-gD를 20 ㎕로 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 코팅하였다.
HER2 STOP-1
항-gD IGF-1
다른 96 웰 플레이트에서, 2 내지 4 가지 종류의 콜로니를 50 ㎍/ml의 카르베니실린 및 헬퍼 파지 KO7이 포함된 2YT/CRAP(50:50) 배지 150 ㎕ 중에서 밤새 37 ℃에서 성장시켰다. 플레이트를 2500 rpm에서 20분 동안 회전 침강시켰다. 상청액 50 ㎕를 ELISA 완충액(PBS-0.5％ BSA 및 0.05％ Tween20) 120 ㎕와 혼합하였다. 384개-웰 코팅 플레이트의 각 사분면에 혼합물 30 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.5％ BSA 및 0.05％ Tween20이 첨가된 PBS 중 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-M13 항체를 웰 당 75 ㎕씩 실온에서 30분 동안 첨가함으로써 결합을 정량화하였다(시두 등의 상기 문헌). 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B(H2O2)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈)를 웰 당 100 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 1M 인산(H3PO4)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰의 황색 용액의 OD 값을 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 코팅된 플레이트에 최대 약 90％가 결합하는 F(ab) 또는 F(ab)'2 파지의 농도를 이용하여 용액 결합 경쟁 ELISA 분석을 수행하였다. 결합도가 BSA, IGF-1, Her2 및 항-gD 보다 3 내지 4배 더 높은 F(ab) 및 F(ab)'2 파지가 보다 양호한 특이성을 갖는 것으로 간주한다. 상기 결합 인자의 서열을 분석하였다.
도 18은 친화성 및 특이성이 보다 높은 몇몇 결합 인자(예를 들어, S7, S16, F5, S9, F13, F47 및 S9)의 부분적인 아미노산 서열을 도시하고 있다. 3개의 클론, 즉 F13, F47 및 S4는 동일한 CDR 서열을 공유한다. 또한, S7 및 S16은 약간의 서열 상동성을 공유한다. F13, F47, S4, S7, S9 및 S16의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 영역 사이의 서열 상동성에 기초하여, 공통적으로 인식되는 에피토프에 사용되는 공통 서열을 유도하였다. 파지 디스플레이 S4-Fab, 파지 디스플레이 S9-Fab, 파지 디스플레이 S7-F(ab)'2, 파지 디스플레이 S16-F(ab)'2, 파지 디스플레이 F5-F(ab)'2를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열은 각각 도 27A 내지 C, 도 28A 내지 C, 도 29A 내지 C, 도 30A 내지 C 및 도 31A 내지 C에서 찾아볼 수 있다.
하기 벡터는 미국 20110-2209 버지니아주 메나서스 유니버시티 불레바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection(ATCC))에 부다페스트 조약에 의거하여 하기 기재된 바와 같이 기탁하였다
물질 기탁 번호 기탁일
V0350-4-S7 PTA-5090 2003년 3월 25일
V0350-4-S16 PTA-5089 2003년 3월 25일
V0350-2b-S4 PTA-5086 2003년 3월 25일
V0350-2b-S9 PTA-5087 2003년 3월 25일
V0350-4-F5 PTA-5088 2003년 3월 25일
실시예 17 - 용액 결합 경쟁 ELISA
선별된 F(ab) 및 F(ab)'2 파지에 대한 결합 친화도를 측정하기 위해, 경쟁 ELISA 분석을 수행하였다.
첫째, 파지를 증식시켜 정제하였다. 상기 클론 중 하나로 37 ℃에서 30분 동안 감염시킨 XL-1 박테리아 10 ㎕를 카르베니실린 플레이트에 플레이팅하였다. 콜로니를 피킹하여 50 ㎍/ml의 카르베니실린이 포함된 2YT 2 ml에서 3 내지 4시간 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 헬퍼 파지 KO7을 37 ℃에서 다른 1시간 동안 최종 농도 1010 pfu/ml로 배양액에 첨가하였다. 배지(50 ㎍/ml 카르베니실린이 포함된 2YT/CRAP(50:50)) 20 ml를 배양액에 첨가하여 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. 파지를 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
둘째, 하기 경쟁 ELISA 분석에 사용하기 가장 적합한 정제된 파지의 농도(즉, 코팅된 플레이트 상에서의 최대 결합 능력의 대략 90％)를 결정하였다. 96개-웰 넌크 맥시소프(Nunc Maxisorp) 플레이트를 전장 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1(PBS 중 2 ㎍/ml)로 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 1％ BSA 65 ㎕를 30분 동안 첨가한 후에 1％ Tween20 40 ㎕를 다른 30분 동안 첨가함으로써 웰을 블록킹하였다. 이어서, 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 세척하였다. ELISA 완충액(PBS-0.1％ BSA 및 0.05％ Tween20)에서 0.1 O.D./ml까지 낮춘 F(ab) 또는 F(ab)'2의 여러 희석액을 실온에서 15분 동안 웰에 첨가하였다. 이어서, 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 3회 이상 세척하였다. 웰 당 HRP-접합된 항-M13 항체(아머샴, ELISA 완충액을 사용하여 1/5000으로 희석함) 75㎕를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 다시 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B(H2O2)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈)을 웰 당 100 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 1M 인산(H3PO4)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰의 컬러 광학 밀도를 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 파지 희석액을 O.D. 판독값에 대하여 그래프로 분석하였다.
셋째, 경쟁 ELISA 분석을 수행하였다. 96개-웰 넌크 맥시소프 플레이트를 전장 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1(PBS 중 2 ㎍/ml)로 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 1％ BSA 65 ㎕를 30분 동안 첨가한 후에 1％ Tween20 40 ㎕를 다른 30분 동안 첨가함으로써 웰을 블록킹하였다. 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 세척하였다. 상기 결합 분석에 기초하여, 코팅된 플레이트에 최대 약 90％가 결합하는 파지 희석액 50 ㎕를 다양한 농도의 ELISA 완충 용액 중 전장 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1(0.1 내지 500 nM) 50 ㎕와 함께 웰에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합하지 않은 파지는, 웰 혼합물 75 ㎕를 전장 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1로 미리 코팅된 제2 96개-웰 플레이트로 옮기고 실온에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 분석하였다. 제2 플레이트의 웰을 PBS-0.5％ Tween20으로 3회 이상 세척하였다. 웰 당 HRP-접합된 항-M13 항체(ELISA 완충액을 사용하여 1/5000으로 희석함) 75 ㎕를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 다시 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B(H2O2)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈)을 웰 당 100 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 1M 인산(H3PO4)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 각 웰의 컬러 광학 밀도를 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 경쟁자 STOP-1의 농도를 O.D. 판독값에 대하여 그래프로 분석하였다. IC50값(F(ab)-파지 또는 F(ab)'2-파지를 50％ 억제하는 STOP-1의 농도)은 친화도를 나타낸다(표 12 참조).
표 12는 F5가 전장 STOP-1의 N-말단에는 결합하지만 짧은 형태의 STOP-1에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. S7, S16, S9 및 S4(즉, F13 및 F47)는 짧은 형태(#94 내지 243)의 인간 STOP-1에 결합한다. 표 2에서, 용어 "762 S/S"는 마이크로타이터 플레이트의 웰이 짧은 형태의 인간 STOP-1로 코팅되었으며 F(ab)-파지 또는 F(ab)'2-파지가 짧은 형태의 인간 STOP-1과 경쟁한다는 것을 나타낸다. 용어 "762 S/F"는 마이크로타이터 플레이트의 웰이 짧은 형태의 인간 STOP-1로 코팅되었으며 F(ab)-파지 또는 F(ab)'2-파지가 전장 형태의 인간 STOP-1과 경쟁한다는 것을 나타낸다. 용어 "762 F/F"는 마이크로타이터 플레이트의 웰이 전장 형태의 인간 STOP-1로 코팅되었으며 F(ab)-파지 또는 F(ab)'2-파지가 전장 형태의 인간 STOP-1과 경쟁한다는 것을 나타낸다. "ND"는 결과를 검출할 수 없다는 것을 나타낸다. "N/A"는 결과를 이용할 수 없다는 것을 나타낸다.
이러한 항체들은 또한 면역침전법에서 인간 STOP-1을 인식한다.
실시예 18 - 6B12 블록킹 분석
또한, 특정 F(ab)'2-파지의 결합 위치를 조사하였다. 모노클로날 항-인간 STOP-1 항체인 6B12는 인간 STOP-1 단백질의 N-말단 영역에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 6B12가 STOP-1에 대한 특정 F(ab)'2-파지의 결합을 블록킹할 수 있는지 시험하였다.
6B12 블록킹 분석을 다음과 같이 수행하였다: 96개-웰 넌크 맥시소프 플레이트를 전장 인간 STOP-1(PBS 중 2 ㎍/ml)로 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 코팅하였다. 1％ BSA 65 ㎕를 실온에서 30분 동안 첨가한 후에 1％ Tween20 40 ㎕를 다른 30분 동안 첨가함으로써 웰을 블록킹하였다. 이어서, 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 세척하였다. 다양한 농도의(ELISA 완충액 중) 6B12 항체를 웰에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, S7-F(ab)'2-파지, S16-F(ab)'2-파지 또는 F5-FF(ab)'2-파지를, 6B12 항체의 부재하에 보통 90％의 결합 능력을 생성하는 농도로, 각각의 웰에 10분 동안 첨가하였다. 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 세척하였다.
0.5％ BSA 및 0.05％ Tween20이 첨가된 PBS 중 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-M13 항체를 웰 당 75 ㎕씩 실온에서 30분 동안 첨가함으로써 결합을 정량화하였다(시두 등의 상기 문헌). 웰을 PBS-0.05％ Tween20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B(H2O2)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈)을 웰 당 100 ㎕씩 각각의 웰에 첨가하였다. 1M 인산(H3PO4)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 키르케가드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 황색 용액의 OD 값을 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
표 13은 6B12 항체가 F(ab)'2-F5 파지는 블록킹할 수 있지만 F(ab)'2-S7 파지 또는 F(ab)'2-S16 파지는 블록킹 할 수 없다는 것을 나타낸다. 이에 따라 F5는 6B12와 동일한 N-말단 영역에서 인간 STOP-1에 결합하지만, S7 및 S16은 결합하지 않는다.
실시예 19 - F(ab) 및 IgG 단백질 구조물 및 단백질 발현
박테리아 세포에서 발현되는 F(ab) 구조물: 바이러스 cP3 서열을 제거하고, 이를 5'-GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATG-3'(서열 85)을 함유하는 터미네이터 서열로 교체하고, 류신 지퍼 및 gD 태그를 코딩하는 서열을 제거함으로써 V0350-2b-S4 및 V0350-2b-S7 파지미드를 변형시켰다(이하, 각각 pv0120-S4 및 pv0120-S7이라 지칭함). 도 24C는 상기 벡터의 개략도이다. pv0120 벡터를 이. 콜라이 34B8 세포에 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 피킹하여 25 ㎍/ml의 카르베니실린이 포함된 완전 CRAP 배지에서 적어도 22시간 동안 30 ℃에서 성장시켰다. 발현된 단백질을 단백질 G 고트랩 컬럼(아머샴 파마시아)을 통해 정제하였다.
S4-Fab를 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열을 도 32A 내지 G에 도시하였다
포유동물 세포에서 발현되는 IgG 구조물:
일반적으로, LPG3 벡터에 코딩된 경쇄를 S4 또는 S7의 경쇄로 교체하고, LPG4 벡터에 코딩된 VH 및 CH1 영역을 S4 또는 S7의 VH 및 CH1 영역으로 교체하여 IgGl 구조물을 제작하였다. 도 24D는 각각 IgG 단백질의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 LPG3 및 LPG4 벡터의 개략도이다. LPG3 벡터는 인간화된 MaE11 E27 경쇄를 코딩한다. LPG4 벡터는 인간화된 MaE11 E27 중쇄를 코딩한다. 이들은 함께 인간화된 MaE11 E27(항-IgE 항체)의 전장 인간 IgGl 형태를 코딩한다(인간화된 MaE11 E27에 대한 보다 상세한 정보는 미국 특허 제6,172,213호(로우만(Lowman)) 참조). LPG3 및 LPG4 벡터는 각각 인간화된 MaE11 E27의 전장 경쇄 및 중쇄를 다른 것들 사이에 삽입함으로써 변형시킨 pRK 벡터이다(문헌 [Gorman, CM et al., (1990) DNA Protein Eng. Tech. 2:3]). LPG3 및 LPG4 벡터를 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재의 제넨테크의 인크사의 얀 유(Yan Wu)로부터 입수하였다.
LPG4 벡터를 BsiwI 및 ApaI으로 분해하여 인간화된 MaE11 E27 항체의 중쇄 가변 영역을 제거하였다. 제거된 서열을 pv0120-S4 또는 pv0120-S7 벡터로부터의 Bsiwl-ApaI 단편으로 교체하였다. LPG3 벡터를 EcorRV 및 KpnI으로 분해하여 인간화된 MaE11 E27 항체의 경쇄 가변 영역을 제거하였다. 제거된 서열을 S4 및 S7의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 pv0120-S4 또는 pv0120-S7 벡터로부터의 EcorRV-KpnI 단편으로 교체하였다. 생성된 벡터 LPG3-인간 카파G6 및 LPG4-인간 HC-S4를 도 35 및 36(각각, 서열 110 및 서열 112)에 기재하였다. LPG4-인간 HC-S7의 서열은 Bsiwl-ApaI 부위 사이의 서열이 pv0120-S7 벡터의 Bsiwl-ApaI 부위 사이의 서열과 동일하다는 것만을 제외하고는 LPG4-인간 HC-S4의 서열과 동일하였다.
LPG3-인간 카파G6, LPG4-인간 HC-S4 및 LPG4-인간 HC-S7 dsDNA를 형질감염용으로 제조하였다. DP12 DHFR＋CHO 세포(ATCC)를 1× Tris EDTA(TE), 2 mg/L의 인슐린, 1 ％ dFBS, 0.15 g/L의 젠타마이신 술페이트를 함유하는 조직 배양 배지에 1.5×106개 세포/ml의 농도로 시딩하였다. 세포를 37 ℃에서 1 내지 2시간 동안 인큐베이션한 후에 형질감염시켰다. 이어서, 온난한 조직 배양 배지 3.5 L를 DNA 20 mg, DMRIE-C 시약(1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록실 에틸 암모늄 브로마이드, 제넨테크, 인크.) 20 ml와 함께 배양액에 첨가하고, 37 ℃에서 적어도 20분 동안 더 인큐베이션하였다. 배양액을 생체반응기에 첨가하고, 온난한 조직 배양 배지 250 ml/L를 첨가하였다. 세포 배양 온도를 33 ℃로 변경하였다. 7 내지 12일 후에, 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 상청액 중 단백질을 단백질 G 고트랩 컬럼(아머샴 파마시아)을 통해 정제하였다.
S4 IgG 단백질을 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열을 도 33A 내지 F 및 도 24A 내지 G에 도시하였다.
실시예 20- S4와 S7 Fab 및 IgG의 친화도 측정
인간 STOP-1에 대한 S4와 S7 Fab 및 IgG의 친화도를 측정하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 먼저, 경쟁적 ELISA 분석에 사용하기에 최적화로 정제 (즉, 코팅된 플레이트 상의 최대 결합 능력의 대략 90%) 된 Fab 및 IgG의 농도를 측정하였다. 96-웰 넌크 막시소르프 (Nunc Maxisorp) 플레이트를 총 길이 형태 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1 (PBS 중 2 ㎍/㎖)로 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 코팅하였다. 상기 웰에 1% BSA 65 ㎕를 30 분 동안 첨가하고 이어서 1% Tween20 40 ㎕를 추가 30 분 동안 첨가하여 블로킹하였다. 그 후, 웰을 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 세척하였다. ELISA 완충액 (PBS-0.5% BSA 및 0.05% Tween20) 중 희석한 0.1 nM 내지 100 nM 농도의 F(ab) 또는 IgG를 실온에서 15 분 동안 웰에 첨가하였다. 이어서 웰을 PBS-0.05% Tween20으로 3 회 이상 세척하였다. 웰 당 HRP-접합 단백질 G 항체 75 ㎕ (아머샴, ELISA 완충액으로 1/5000로 희석)를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 웰을 다시 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 이상 세척하였다. 그 후, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H202)(메릴랜드 주 소재, 가이테르스버그의 키르케가르드-페리 레보러토리즈 (Kirkegaard-Perry Laboratories)) 100 ㎕/웰을 상기 웰에 첨가하였다. 1 M 인산 (H3P04)(메릴랜드 주 소재, 가이테르스버그의 키르케가르드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에서 색의 흡광도는 450 nm에서 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. Fab 또는 IgG의 희석을 O.D. 판독에 대해 플롯팅하였다.
도 19는 경쟁적 분석에서 Fab 또는 IgG의 최적 농도를 측정하는데 사용된 ELISA 분석의 예를 나타낸다. "S 코팅된"은 마이크로티터 플레이트 상에 코팅된 STOP-1의 짧은 형태 (short form) (#94 - 243)를 나타낸다. "F 코팅된"은 마이크로티터 플레이트 상에 코팅된 인간 STOP-1의 총 길이 형태 (full length form)를 나타낸다. 최대 결합의 대략 90%는 경쟁적 ELISA 분석에서 사용하기에 적합한 것으로 고려된다.
그 후, 앞서 측정한 최적 농도의 Fab 및 IgG를 사용하여 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰 넌크 막시소르프 플레이트를 총 길이 형태 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1 (PBS 중 2 ㎍/㎖)을 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 코팅하였다. 상기 웰에 1% BSA 65 ㎕를 30 분 동안 첨가하고 이어서 1% Tween20 40 ㎕를 추가 30 분 동안 첨가하여 블로킹하였다. 웰을 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 세척하였다. 앞의 결합 분석을 기준으로, 코팅된 플레이트에 약 90%로 최적 결합하여 생성된 Fab 또는 IgG 희석액 50㎕를 웰 내의 ELISA 완충 용액 중 다양한 농도 (0.1 내지 500 nM)의 총 길이 형태 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1 50㎕와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 Fab 또는 IgG은 웰 혼합물의 75㎕를 총 길이 형태 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1으로 예비-코팅된 제 2 96-웰 플레이트로 전달하고 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하여 분석하였다. 제 2 플레이트의 웰을 PBS-0.5% Tween20으로 3 회 이상 세척하였다. 웰 당 HRP-접합 단백질 G 75㎕ (ELISA 완충액으로 1/5000로 희석)를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 웰을 다시 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 이상 세척하였다. 그 후, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H202)(메릴랜드 주 소재, 가이테르스버그의 키르케가르드-페리 레보러토리즈 (Kirkegaard-Perry Laboratories)) 100 ㎕/웰을 상기 웰에 첨가하였다. 1 M 인산 (H3P04)(메릴랜드 주 소재, 가이테르스버그의 키르케가르드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에서 색의 흡광도는 450 nm에서 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 첨가된 경쟁적 STOP-1의 농도를 O.D. 판독에 대해 플롯팅하였다. IC50은 Fab 또는 IgG 결합의 50%를 저해한 STOP-1의 농도이다. 도 20A 및 B를 참조하시오. 결합 친화도는 삽입구에 나타내었다.
도 21은 STOP-1에 대한 여러 파지-유도 항체의 결합 친화도를 요약한 것이다. "S/S"는 마이크로티터 플레이트가 짧은 형태의 STOP-1으로 코팅되고 짧은 형태의 STOP-1과 경쟁하는 ELISA를 나타낸다. "F/S"는 마이크로티터 플레이트가 총 길이 형태의 인간 STOP-1으로 코팅되고 짧은 형태의 인간 STOP-1과 경쟁하는 것을 나타낸다. "F/F"는 마이크로티터 플레이트가 총 길이 형태의 인간 STOP-1으로 코팅되고 총 길이 형태의 인간 STOP-1과 경쟁하는 것을 나타낸다. 이 연구에 사용된 파지는 S4-Fab 파지 및 S7-F(ab)'2 파지였다.
실시예 21 - S4 블로킹 분석
S4 IgG가 짧은 형태 또는 총 길이 형태의 인간 STOP-1에 결합하는 S4(Fab)-파지, S7(F(ab)'2)-파지, S9(Fab)-파지, S16(F(ab)'2)-파지 또는 F5(F(ab)'2)-파지를 블로킹할 수 있는지를 보여주는 경쟁적 ELISA 분석에 사용되었다.
먼저, 96-웰 넌크 막시소르프 플레이트를 총 길이 형태 또는 짧은 형태의 인간 STOP-1 (PBS 중 2 ㎍/㎖)로 4 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 코팅하였다. 상기 웰에 1% BSA 65 ㎕를 30 분 동안 첨가하고 이어서 1% Tween20 40 ㎕를 추가 30 분 동안 첨가하여 블로킹하였다. 그 후, 웰을 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 세척하였다. 다양한 농도의 S4 IgG (ELISA 완충액 중)을 상기 웰 중에 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, S4(Fab)-파지, S7(F(ab)'2)-파지, S9(Fab)-파지, S16(F(ab)'2)-파지 또는 F5(F(ab)'2)-파지를 S4 IgG 항체의 부재시 일반적으로 90% 결합 능력을 발생시키는 농도에서 10 분 동안 다른 웰에 첨가하였다. 상기 웰을 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 세척하였다.
결합은 PBS 플러스 0.5% BSA 및 0.05% Tween20 중 양고추냉이 (horse radish) 퍼옥시다제 (HRP)-접합 항-M13 항체 75 ㎕/웰을 실온에서 30 분 동안 첨가함으로써 정량화하였다 (Sidhu et al., supra). 상기 웰을 PBS-0.05% Tween20으로 5 회 이상 세척하였다. 그 후, 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H202)(메릴랜드 주 소재, 가이테르스버그의 키르케가르드-페리 레보러토리즈 (Kirkegaard-Perry Laboratories)) 100 ㎕/웰을 상기 웰에 첨가하였다. 1 M 인산 (H3P04)(메릴랜드 주 소재, 가이테르스버그의 키르케가르드-페리 레보러토리즈) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 각 웰에서 황색의 OD를 450 nm에서 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
도 22는 F5를 제외한 대부분의 파지-유도 항체가 S4 파지-유도 항체와 같이 STOP-1 상의 유사 영역에 결합한 것을 나타낸다. Y축은 S4 IgG로 블록화된 웰의 OD450 nm 값을 S4 IgG가 없는 웰의 OD450 nm 값으로 나눠서 계산한 바와 같은 블록화되지 않은 백분율을 나타낸다. 시험한 파지는 S4(Fab)-파지, S7(F(ab)'2)-파지, S9(Fab)-파지, S16(F(ab)'2)-파지 또는 F5(F(ab)'2)-파지였다. 더 낮은%는 S4 IgG에 의해 블록화된 것이 더 많음을 의미한다.
실시예 23 -경쇄 서열을 변경하여 결합을 최적화함
항체의 결합은 또한 특히 경쇄의 서열을 변경함으로써 최적화될 수 있다. 최적화는 파지 나열법으로 알려진 것을 비롯하여, 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 추가적으로, 경쇄 CDR의 서열은 자리-유도 돌연변이에 의해 변화될 수 있고 2002년 6월 3일에 출원한 미국 임시 특허 번호 제60/385,388호에서 기술한 바와 같이 다양성이 경쇄 가변 영역에서 발생된다는 점을 제외하고는 앞서 실시예 16에서 기술한 방법과 유사한 ELISA 분석으로 스크리닝할 수 있다. 또한 다음을 참조하시오.
한 실시예에 따라, 항체 경쇄 가변 도메인의 라이브러리는 항체 가변 도메인에서 구조적 교란을 최소화하는 반면 CDR 영역에서 다양성을 최대화하기에 적합하다. 항체 가변 도메인에서 구조적 교란은, 예를 들어 박테리아 세포에서 발생될 때 일반적으로 비적절하게 접힌 항체 도메인과 조합하여 낮은 수율을 초래한다. 낮은 수율은 스크리닝에서 검출된 결합제의 수를 감소시킨다. 경쇄 CDR 영역에서의 다양성은 CDR LI, L2, L3에 대해 각 CDR에서 매우 다양한 위치 및 이용가능한 용매를 확인하고, 하나 이상의 CDR 영역 내의 매우 다양한 위치에서 하나 이상의 이용가능한 용매 잔류물의 위치에 상응하는 아미노산 위치에 대해 다양한 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 맞춤 (tailored) (즉, 비-랜덤) 코돈 세트를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 디자인함으로써 발생시킬 수 있다. 맞춤 코돈 세트는 알려진 자연 항체에서 이용가능한 용매 잔류물에 상응하는 위치에서 가장 일반적으로 발생한 아미노산을 바람직하게 코딩하는 동의 (degenerate) 헥산 서열이다.
CDR에서 이용가능한 용매 잔류물은 주형 분자의 결정 구조를 분석함으로써 항체 가변 도메인 주형 분자에서 확인할 수 있다. 인간화 항체 4D5는 박테리아 세포 배양을 비롯한, 다양한 숙주 세포에서 생산될 때 효율적으로 생산되고 바람직하게 접힌다. 인간화 항체 4D5 가변 영역에 대한 결정 구조는 공지되어 있고 http://www.rcsb.org (접근 코드 IFVC)에서 공개적으로 이용가능하다.
경쇄의 CDR에서 얻기 쉬운 용매의 위치는 인사이트 Ⅱ 프로그램 (캘리포니아, 산 디에고 소재의 악셀라이스 (accelrys))을 사용하여 확인하였다.
CDR 잔류물은 또한 CDR에서의 어떤 위치가 매우 다양한지 측정하여 분석하였다. 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역에서 매우 다양한 위치는 카바트 데이타베이스 (Kabat database)에서 공지된 자연적으로 발생한 항체의 서열을 시험하여 확인하였다 (문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, Kabat, E. A., et al., (1991)]). 카바트 데이타베이스는 또한 http://www.bioinf.org.uk/abs/를 통해 이용할 수 있다. 카바트 데이타베이스에는, 약 1540 개의 인간 경쇄 서열 및 3600 개의 인간 중쇄 서열이 있다. CDR 자리가 정렬되어 있고 카바트에 의해 기재된 데로 번호가 매겨져 있다 (http://www. bioinf.org.uk/abs/du 참조). 매우 다양한 아미노산 위치는 일렬로 줄을 세우고 각 CDR 잔류물에 대해 가장 빈번하게 사용되는 것부터 덜 빈번하게 사용되는 것까지 아미노산 용도에 서열을 매김으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, L3-91 (즉, 경쇄 CDR3의 91 잔류물)은 카바트 데이타베이스에서 1582 항체 서열의 849 번째에 있는 Y (티로신)이고, 이것은 이 자리에서 가장 빈번하게 발견되는 아미노산이다. 남아있는 잔류 아미노산의 서열 35와 함께 다음 목록에서 빈번한 것은 세린 (196 개의 서열로 발견), 이어서 아르기닌 (169 개의 서열), 알라닌 (118 개의 서열), 글리신 (61 개의 서열), 히스티딘 (41 개의 서열)이다. 카바트 데이타베이스로부터 인간 항체 경쇄 서열에서의 아미노산 빈도 (아미노산의 상응 다양성 목록과 함께 예시적인 다양한 자리를 포함함)를 도 35에 나타내었다.
알려진 자연 항체 서열 사이에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산을 총괄하여 구성하는, 특정 자리에서 발견되는 아미노산 잔류물은 라이브러리 디자인에 대한 기준으로서 선택될 수 있다. 가장 빈번하게 발생하는 아미노산은 다양한 아미노산 목록의 상위 90%에서 가장 일반적으로 발견되는 것으로 생각된다 (이러한 아미노산 군은 본원에 "아미노산의 표적군"으로 나타냄). 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 아미노산의 표적군에 대한 차단 백분율은 상기 기재된 바와 같이, 달성하려는 다양한 라이브러리의 환경과 목적에 따라 다양할 수 있다.
인간화 항체 4D5에 대해, 이용가능하고 매우 다양한 용매로서 확인된 위치는 다음과 같다:
자연 다양성 (즉, 알려진 자연 항체 서열 중) (도 3에 "표적군" 또는 "자연 다양성"으로 나타냄)에서 높은 빈도로 발생한 아미노산의 예, 및 이러한 각각의 위치에 대해 DNA 코돈 ("다양성 < DNA 코돈 >")에 의해 디자인된 다양성을 도 36에 나타내었다.
아미노산의 특정 기 (다양성)를 코딩하는 코돈 세트는 알려진, 자연 서열 (도 36에 "함유율 (% covering)"으로 명시됨)에서 아미노산의 특정 백분율 이상을 포함하는 것으로 명시하였다. 코돈 세트에 의해 코딩된 아미노산의 약 40% 이상이 이용가능한 특정 용매 및 매우 다양한 위치에 대해 확인된 아미노산을 표적화할 수 있다 (도 36에 "적합률 (% good)"으로 명시함; 표적 아미노산인 코돈 세트로 코딩된 아미노산은 도 36의 컬럼 3에 굵은 선으로 나타냄). 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 적합성 값은 환경과 목적에 따라 다양해질 수 있다. 상기 코돈 세트를 선택하여 특정 위치에서 가장 많이 나타나는 아미노산을 코딩한다. 특정 위치에 대해 코돈 세트로 코딩된 비-표적 아미노산의 수는 최소화한다. 코돈 세트 선택/명시의 효과는 "적합성" 값을 기준으로 부분적으로 평가하였다. 높은 백분율은 매우 낮은 비-표적 아미노산을 의미하고; 높은 "적합성" 값은 특정 코돈 세트로 코딩된 아미노산 중에 더 많은 표적 아미노산을 갖는 것보다 더 중요한 것으로 생각된다. 과잉 (redundancy)은 "적합성" 값을 계산하는데에 포함된다. 목적을 평가하기 위해, 또한 "함유율" 값을 계산하였다. 이값은 "우수한" 아미노산 (특정 코돈 세트에 의해 코딩된 아미노산)에 포함되는 자연 다양성의 백분율을 나타낸다. 예를 들어, 코돈 세트 KMT를 사용할 경우, L3-91에 대해, "우수한" 아미노산은 YSA이고, 이는 상기 코돈에 의해 코딩된 YSAD 아미노산의 75%이다. YSA는 이 아미노산 위치에서 공지된, 자연 항체 서열 1580 중 1190을 포함하는 아미노산이다. 1190/1580은 75%이고, 이것이 "함유율" 값이다. 따라서, L3-91에서 KMT를 사용하는 한 디자인에서, 75%의 라이브러리는 91번 위치에서 CDRL3 중에 75%의 자연 다양성을 포함한다.
코돈 세트는 또한 가능할 경우, 시스테인 및 정지 코돈을 제외하는 것으로 명시되었다. 시스테인 잔류물의 존재는 접힘 문제를 야기하는 경향이 있고 정지 코돈은 효과적인 라이브러리 크기를 감소시킬 수 있다. 코돈 세트의 디자인에서, 또한 비표적 아미노산의 수를 최소화시키는 것이 바람직할 것으로 생각된다.
인간화 항체 4D5의 이용가능한 각 용매 및 매우 다양한 잔류물을 위해 디자인 된 코돈 세트를 도 36에 나타낸다. 임의의 특정 잔류물에서, 하나 이상의 코돈 세트는 확인된 표적 아미노산에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 L1 올리고뉴클레오티드는 L3-96에서 하나는 YKG 함유 코돈 및 다른 하나는 TWT를 함유하거나, H2-50에서 하나는 DGG 함유 코돈 및 다른 하나는 DHT를 함유한다.
다양한 코돈 세트는 CDR L1, CDR L2, CDR L3를 비롯한 하나 이상의 CDR 지역에서 다양성을 갖는 다양한 라이브러리를 야기하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 37-40은 다양성을 야기하는데 사용될 수 있는 코돈 세트 디자인의 다양한 예시를 나타낸다. 도 36은 이러한 디자인의 아미노산 적용 범위의 요약을 제공한다. 일반적으로, 상기 디자인은 더 많은 자연 다양성을 포함하는 다양성을 줄이고 "비-표적" 아미노산을 가능한 많이 제외시키는 것이 바람직하나, 필수적인 것은 아니다. 일부 실시태양에서, 이러한 기준을 기준으로 가장 높은 점수를 얻지 못한 디자인은 STOP-1에 대해 우수한 결합제를 수득하는데 사용될 수 있다.
실시예 24 - STOP-1은 세포의 표면에 결합함
HT1080 세포를 FACS 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgC12, 2% FBS) 중 S7 또는 6bl2 모노클로날 항체 100 ㎍/㎖의 존재시 정제된 재조합 총 길이 형태 인간 His-표지된 STOP-1 (lO ㎍/㎖, A; 시료당 50만 세포)와 함께 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 결합은 FACS를 갖는 상기 세포를 항-His 모노클로날 항체 (Smg/㎖) 또는 항-Flag (5 mg/㎖, 음성 통제로서) 및 이어서 FITC-접합 염소 항-마우스 항체로 처리하여 검출하였다.
도 41은 STOP-1이 특히 인간 태아 신장 293 세포가 아니라, 인간 HeLa 세포, 인간 HT1080 섬유아세포 및 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC) 세포의 표면에 결합하는 것을 보여준다. STOP-1에 대한 수용체는 HeLa, HT1080 및 HUVEC 세포 상에 존재하는 것으로 생각된다.
실시예 25 -S7 모노클로날 항체는 STOP-1이 세포에 결합하는 것을 증진시킴
HT1080 세포를 FACS 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgC12, 2% FBS) 중 S7 또는 6bl2 모노클로날 항체 100 ㎍/㎖의 존재시 정제된 재조합 총 길이 형태 인간 His-표지된 STOP-1 (lO ㎍/㎖, A; 시료당 50만 세포)와 함께 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 결합은 FACS를 갖는 상기 세포를 항-His 모노클로날 항체 (Smg/㎖) 또는 항-Flag (5 mg/㎖, 통제로서) 및 이어서 FITC-접합 염소 항-마우스 항체로 처리하여 검출하였다.
도 42는 S7 항체가 HT1080 세포의 표면에 결합한 STOP-1의 효과를 증진시킨 반면, 6B12는 그렇지 않음을 나타낸다. S4 항체는 또한 동일한 분석에 사용되었고 HT1080 세포에 결합하는 STOP-1의 효과를 증진시키는 것이 발견되었다. S7 항체 및 S4 항체는 세포에 결합한 STOP-1에 결합할 수 있기 때문에, S7 항체 또는 S4 항체가 STOP-1에 결합하는 것은 STOP-1 수용체가 STOP-1에 결합하는 것을 간섭하지 않는다. 따라서, S7 항체가 STOP-1 상에 결합하게 하는 에피토프는 STOP-1에 결합하는 그의 수용체를 필요로하지 않는다.
실시예 26 - STOP-1은 내피 세포 이주를 증진시킴
방향성 세포 이주는 개질된 보이덴 화학주성 (chemotaxis) 용기 (트랜스웰 (상표명), 코닝, 인크.)를 사용하여 측정한다. 8 마이크론 기공을 갖는 폴리카르보네이트 여과기를 콜라보레이티브 사이언스에서 입수한 콜라겐 I의 0.1% 용액과 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이러한 공정은 여과기의 밑면을 세포 부착에 필요한 콜라겐, 세포 외부 매트릭스 단백질로 코팅한다. 다음날, 여과기를 PBS에서 헹구고 1% 소 혈청 알부민 (BSA)과 함께 염기성 내피 세포 매질 (클로네틱스)로 이루어진 블로킹 매질 (각 저급 용기 내에 200 마이크로리터)로 실온에서 1 시간 동안 블록화하였다.
세포 용해 용액 (0.25％ EDTA)을 사용하여 HUVEC 세포 (클로네틱스(Clonetics)사 제품, 완전 배지에서 배양함)를 수획하고, 이동 배지 (0.1％ BSA를 함유하되 성장 인자는 함유하지 않는 내피 세포 기초 배지) 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 변형된 보이덴(Boyden) 챔버의 상부 챔버 (10,000 세포/ml, 150 ㎕/웰)내에 두었다. bFGF (1 ng/ml 또는 1O ng/ml, 최종 농도) 또는 STOP-1 (1 ㎍/ml 또는 1O ㎍/ml, 최종 농도)을 함유하는 이동 배지를 변형된 보이덴 챔버의 하부 챔버 (300 ㎕/웰)에 가하였다. 대조군으로서 이동 배지 단독 (bFGF 또는 STOP-1이 없음)을 하부 챔버에 가하였다. 각 조건을 3회 반복 수행하였다. 변형된 보이덴 주화성 챔버들을 37 ℃ (5％ C02)에서 3시간 동안 인큐베이터내에 두었다.
이후, 이동하지 않은 세포 (상부 챔버쪽을 향하는 필터의 맨위에 위치함)는 면봉을 사용하여 서서히 제거하였다. 필터를 4％ 파라포름알데히드 용액 (10분, RT) 중에서 고정시키고, 0.2％ 크리스탈 바이올렛 용액 (5분, RT)으로 염색하여 세포를 시각화하였다. 이어서, 니콘(Nikon) 도립 현미경을 사용해서 필터의 하면에 위치한 (즉, 이동한) 세포를 계수하였다. 필터를 랜덤화하였다(연구자가 조건에 대해 "알지못하게 (blinding)"함). 조건마다 3개의 필터, 필터 당 6개의 랜덤 필드(40x)의 세포를 계수하였다. 도 44의 데이타는 (세번의 실험 중) 대표적인 한 실험으로부터의 평균 세포수를 나타낸다.
도 43은 STOP-1이 HUVEC 세포에 대해 주화성임(즉, 지향성 이동을 유도함)을 나타낸다. 이러한 효과는 크기에 있어서 (HUVEC 이동을 유도하며 전체적으로 혈관형성유발성 분자로 작용하는 것으로 이미 밝혀진 성장 인자인) bFGF의 효과와 견줄만하다. bFGF 및 STOP-1을 둘 다 사용한 처리는 누가(additive) 효과를 나타내지 않았다. bFGF 또는 STOP-1 중 어느 것을 사용하여 처리하더라도 서로의 효과는 강화되지 않는다. 이러한 예비 데이타는 STOP-1이 혈관형성유발성 또는 혈관유발성 분자로 작용함을 시사한다. 이러한 효과를 추가로 확인하기 위한 연구는 STOP-1과HUVEC 세포의 상호작용을 차단하는 항체를 사용하여 동일 또는 유사 실험을 반복하는 것을 포함할 것이다.
실시예 27 - STOP-1은 MDA435 세포와 결함한다
10 mM EDTA를 사용하여 배양 플라스크로부터 MDA-MB-435 인간 유방 암종 세포를 제거하고, 2％ 소 태아 혈청을 함유하는 냉각 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포수를 1,000,000 세포/ml로 조정하고, 10 mg/ml 플래그-태그된(flag-tagged) 전장 인간 STOP-1 및 100 mg/ml의 특정 (6B12) 또는 대조군 (4B7) 항체를 보유하는 튜브에 상기 현탁액 0.5 ml를 분배하였다. 혼합물을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 냉각 현탁 완충액으로 세척하였다. 이어서, 혼합물을 빙상에서 1시간 동안 항-플래그 M2-FITC와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 현탁 완충액 중에서 세척하고, 유동세포계측법으로 형광을 측정하였다.
도 44는 유동세포계측 분석을 그래프로 나타낸다. 검출 항체 단독 (STOP-1이 없는 항-플래그 M2-FITC 항체)으로 처리된 세포에 의해 생성된 신호 강도의 기하 평균값은 약 7.99이었다. STOP-1 단독, STOP-1과 6B12, 및 STOP-1과 4B7로 처리된 세포에 의해 생성된 신호 강도의 기하 평균 값은 각각 약 13.24, 8.3 및 11.39이었다. 이 결과는, STOP-1이 MDA-MB-435 유방 암종 세포와 결합하며 STOP-1에 특이적인 모노클로날 항체인 6B12가 그러한 세포와 결합하는 STOP-1을 차단함을 보여준다. 이소타입 대조군인 4B7 항체는 인지가능한 활성을 나타내지 않았다. 또한, 이 분석에서는 S4 및 S7 항체가 사용되었다. 이들 두 항체는 STOP-1이 MDA-MB-435 세포와 결합하는 것을 차단하지 않았으며, 분석에서 이들 항체의 존재로 인해 STOP-1과 세포의 결합이 증가하였다.
실시예 28 - STOP-1 mRNA 발현은 TNF알파 및 세포 스트레스에 의해 상향조절된다
앞선 연구에서는 적은 산소(저산소증) 또는 세포 스트레스의 조건이 종양발생 및 혈관형성을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 흔히, TNF알파는 스트레스와 관련된 세포 반응을 촉진시키는데 사용되며, 혈관형성 및 종양발생을 촉진시키는 것과 연관된다. STOP-1 발현이 종양 발생 및 혈관형성 개시자에 의해 영향을 받는지를 시험하기 위해, HUVEC 세포를 TNF알파 및 저산소 조건으로 처리하였다.
HUVEC 세포를 저산소 조건 (95％ 공기, 5％ C02) 또는 정상산소 조건 (대략, 95％ 공기, 5％ C02)하에 3, 8 또는 24 시간 동안 100 ng/ml의 인간 재조합 TNF알파 (제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.))와 함께 인큐베이션하였다. 처리된 세포로부터의 mRNA를 추출하고, 실시예 2에 기재된 프라이머 및 조건을 사용하여 태크맨(TaqMan) RT-PCR 반응으로 처리하였다. 각 기간의 종료시 STOP-1 mRNA를, 정상산소 조건 (100 ng/ml TNF알파 없음)하에 3시간 인큐베이션한 후의 STOP-1 mRNA의 발현 수준과 비교함으로써 STOP-1 mRNA 발현 변화(배수)를 계산하였다.
도 45B는 정상산소 조건하에 TNF알파로 처리했을 때 STOP-1 mRNA 발현이 유의하게 상향조절됨을 나타낸다. 3, 8 및 34 시간의 시점에서 발현 수준은 실질적으로 변하지 않은 것으로 보였다. 한편, 도 45A는 TNF알파가 저산소 조건하에 인큐베이션된 세포에서 STOP-1 mRNA 수준에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않음을 나타낸다. 흥미롭게도, TNF알파의 부재시, 저산소 조건하에 34시간 처리한 후에 STOP-1 발현은 유의하게 상향조절되었지만, 저산소 조건하에 3시간 처리한 후에는 그렇지 않았다. 이러한 결과는, HUVEC 세포에서의 STOP-1 발현이 TNF알파 및 저산소 조건을 사용한 처리에 대해 반응하지만, 이러한 반응은 누가적 또는 상승적이지 않으며, 가능하게는 유사한 작용 경로를 나타낸다는 것을 암시한다.
서열 목록 번호 일람
서열 번호 설명
1 DNA76393-1664
2 DNA76393-1664의 아미노산 서열
3 다른(alternative) STOP-1 아미노산 서열
4 마우스 STOP-1 아미노산 서열
5 라이스 피쉬(rice fish) STOP-1 아미노산 서열
6 지브라 피쉬(zebra fish) STOP-1 아미노산 서열
7 병아리 STOP-1 아미노산 서열
8 S7 - 제1 아미노산 서열
9 S7 - 제2 아미노산 서열
10 S7 - 제3 아미노산 서열
11 S16 - 제1 아미노산 서열
12 S16 - 제2 아미노산 서열
13 S16 - 제3 아미노산 서열
14 F5 - 제1 아미노산 서열
15 F5 - 제2 아미노산 서열
16 F5 - 제3 아미노산 서열
17 S4 - 제1 아미노산 서열
18 S4 - 제2 아미노산 서열
19 S4 - 제3 아미노산 서열
20 S9 - 제1 아미노산 서열
21 S9 - 제2 아미노산 서열
22 S9 - 제3 아미노산 서열
23 RT-PCR 혼성화 프로브
24 RT-PCR 정방향 프라이머
25 RT-PCR 역방향 프라이머
26 템플레이트 서열
27 프라이머 서열
28 프라이머 서열
29 프라이머 서열
30 프라이머 서열
31 프라이머 서열
32 프라이머 서열
33 프라이머 서열
34 프라이머 서열
35 프라이머 서열
36 프라이머 서열
37 프라이머 서열
38 프라이머 서열
39 프라이머 서열
40 프라이머 서열
41 프라이머 서열
42 프라이머 서열
43 프라이머 서열
44 프라이머 서열
45 프라이머 서열
46 프라이머 서열
47 프라이머 서열
48 프라이머 서열
49 프라이머 서열
서열 번호 설명
50 프라이머 서열
51 프라이머 서열
52 프라이머 서열
53 프라이머 서열
54 프라이머 서열
55 프라이머 서열
56 프라이머 서열
57 프라이머 서열
58 프라이머 서열
59 프라이머 서열
60 프라이머 서열
61 프라이머 서열
62 프라이머 서열
63 프라이머 서열
64 프라이머 서열
65 프라이머 서열
66 프라이머 서열
67 프라이머 서열
68 프라이머 서열
69 프라이머 서열
70 프라이머 서열
71 프라이머 서열
72 프라이머 서열
73 프라이머 서열
74 프라이머 서열
75 프라이머 서열
76 프라이머 서열
77 프라이머 서열
78 프라이머 서열
79 프라이머 서열
80 프라이머 서열
81 프라이머 서열
82 프라이머 서열
83 프라이머 서열
84 GCN4 류신 지퍼
85 올리고 함유 터미네이터 서열
86 항-Her-2 Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
87 항-Her-2 Fab 경쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
88 서열 86 및 서열 87을 코딩하는 파지미드(pv0350-2b)의 핵산 서열
89 항-Her-2 F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
90 항-Her-2 F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
91 서열 89 및 90의 아미노산 서열을 코딩하는 파지미드(pv0350-4)의 핵산 서열
92 S4-Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
93 S4-Fab 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
94 서열 92 및 93의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
95 S9-Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
96 S9-Fab 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
97 서열 95 및 96의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
98 S7-F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
서열 번호 설명
99 S7-F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
100 서열 98 및 99의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
101 S16-F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
102 S16-F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
103 서열 101 및 102의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
104 F5-F(ab)'2 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
105 F5-F(ab)'2 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
106 서열 104 및 105의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열
107 S4-Fab 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
108 S4-Fab 중쇄 영역을 포함하는 아미노산 서열
109 서열 107 및 108의 경우의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터(pv0120-S4)의 핵산 서열
110 S4 IgG 경쇄를 포함하는 아미노산 서열
111 서열 110의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터의 핵산 서열(LPG3.인간카파(HumanKappa)G6)
112 S4 IgG 중쇄를 포함하는 아미노산 서열
113 서열 112의 아미노산 서열을 코딩하는 벡터의 핵산 서열(LPG4.인간HC-S4)
114 도 1의 컨센서스 아미노산 서열
115 H2 컨센서스 서열
116 H3 컨센서스 서열
본원에 인용된 모든 특허, 출원 및 간행물은 본원에 참고로 포함된다.
<110> Genentech, Inc. <120> Compositions and Methods Relating to STOP-1 <130> P5104R1 PCT <140> PCT/US2004/011793 <141> 2004-04-16 <150> US 60/463,656 <151> 2003-04-16 <160> 117 <210> 1 <211> 1257 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 1 ggagagaggc gcgcgggtga aaggcgcatt gatgcagcct gcggcggcct 50 cggagcgcgg cggagccaga cgctgaccac gttcctctcc tcggtctcct 100 ccgcctccag ctccgcgctg cccggcagcc gggagccatg cgaccccagg 150 gccccgccgc ctccccgcag cggctccgcg gcctcctgct gctcctgctg 200 ctgcagctgc ccgcgccgtc gagcgcctct gagatcccca aggggaagca 250 aaaggcgcag ctccggcaga gggaggtggt ggacctgtat aatggaatgt 300 gcttacaagg gccagcagga gtgcctggtc gagacgggag ccctggggcc 350 aatgttattc cgggtacacc tgggatccca ggtcgggatg gattcaaagg 400 agaaaagggg gaatgtctga gggaaagctt tgaggagtcc tggacaccca 450 actacaagca gtgttcatgg agttcattga attatggcat agatcttggg 500 aaaattgcgg agtgtacatt tacaaagatg cgttcaaata gtgctctaag 550 agttttgttc agtggctcac ttcggctaaa atgcagaaat gcatgctgtc 600 agcgttggta tttcacattc aatggagctg aatgttcagg acctcttccc 650 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Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala 50 55 60 Gly Val Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Val Ile Pro 65 70 75 Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys 80 85 90 Gly Glu Cys Leu Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn 95 100 105 Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu 110 115 120 Gly Lys Ile Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser 125 130 135 Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg 140 145 150 Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu 155 160 165 Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile Tyr Leu Asp Gln 170 175 180 Gly Ser Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn Ile His Arg Thr Ser 185 190 195 Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Asp 200 205 210 Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro Lys Gly Asp 215 220 225 Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile Glu Glu 230 235 240 Leu Pro Lys <210> 3 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 3 Met Arg Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Pro Ala Pro Ser Ser Ala 20 25 30 Ser Glu Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg 35 40 45 Glu Val Val Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala 50 55 60 Gly Val Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro 65 70 75 Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys 80 85 90 Gly Glu Cys Leu Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn 95 100 105 Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu 110 115 120 Gly Lys Ile Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser 125 130 135 Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg 140 145 150 Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu 155 160 165 Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile Tyr Leu Asp Gln 170 175 180 Gly Ser Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn Ile His Arg Thr Ser 185 190 195 Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Asp 200 205 210 Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro Lys Gly Asp 215 220 225 Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile Glu Glu 230 235 240 Leu Pro Lys <210> 4 <211> 245 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met His Pro Gln Gly Arg Ala Ala Pro Pro Gln Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Ser Ala Pro Ser 20 25 30 Ser Ala Ser Glu Asn Pro Lys Val Lys Gln Lys Ala Leu Ile Arg 35 40 45 Gln Arg Glu Val Val Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly 50 55 60 Pro Ala Gly Val Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly 65 70 75 Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly 80 85 90 Glu Lys Gly Glu Cys Leu Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr 95 100 105 Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile 110 115 120 Asp Leu Gly Lys Ile Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser 125 130 135 Asn Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu Lys 140 145 150 Cys Arg Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr Phe Asn Gly 155 160 165 Ala Glu Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile Tyr Leu 170 175 180 Asp Gln Gly Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Ile Asn Ile His Arg 185 190 195 Thr Ser Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala Gly Leu 200 205 210 Val Asp Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro Lys 215 220 225 Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile 230 235 240 Glu Glu Leu Pro Lys 245 <210> 5 <211> 229 <212> PRT <213> Oryzias latipes <400> 5 Met Thr Pro Leu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Leu Leu Cys Leu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Leu His Gly Gln Glu Lys Gly Arg Ser Arg Gly Tyr Arg 20 25 30 Lys Asp Pro Asp Ala Asp Lys Phe Gly Ser Cys Leu Gln Gly Pro 35 40 45 Ala Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly Ile 50 55 60 Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Leu Lys Gly Glu 65 70 75 Lys Gly Glu Cys Val Ser Glu Val Phe Glu Glu Pro Trp Lys Pro 80 85 90 Asn Tyr Lys Gln Cys Ala Trp Asn Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp 95 100 105 Leu Gly Lys Ile Ala Asp Cys Thr Phe Thr Lys Leu Arg Ser Glu 110 115 120 Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Thr Gly Ser Leu 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is synthesized <400> 17 Thr Ile Ser Gly Ser Trp 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 18 Ala Trp Ile Ala Pro Tyr Ser Gly Ala Thr Asp 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 19 Cys Ala Arg Glu Gly Gly Leu Tyr Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 20 Thr Ile Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 21 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asn Gly Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 22 Cys Ala Lys Cys Ser Val Arg Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 23 catccagtag aagcatctcc ttttgggtaa 30 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 24 gggttggcac ttgttcaga 19 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 25 caataatgat gcgagaaact gaat 24 <210> 26 <211> 266 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 26 gggagccatg cgaccccagg gccccgccgc ctccccgcag cggctccgcg 50 gcctcctgct gctcctgctg ctgcagctgc ccgcgccgtc gagcgcctct 100 gagatcccca aggggaagca aaaggcgcag ctccggcaga gggaggtggt 150 ggacctgtat aatggaatgt gcttacaagg gccagcagga gtgcctggtc 200 gagacgggag ccctggggcc aatgttattc cgggtacacc tgggatccca 250 ggtcgggatg gattca 266 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 27 gatcgcggcc gcacaccacc atcaccatca ccatcactaa gtga 44 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 28 ggcctcactt agtgatggtg atggtgatgg tggtgtgcgg ccgc 44 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 29 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sequence is synthesized <400> 36 tcaaagcttt ccctcagcat tccattatac aggtccacca cct 43 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 37 ctcaaagctt tccctcagat acaggtccac cacctccctc tg 42 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 38 ggggagctca gaggcgctcg acggcgcggg ca 32 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 39 acaggtcgac cacctccctc tgccggagct 30 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 40 gaagagctca gggaaagctt tgaggagtcc tgga 34 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 41 gtggtcgacc tgtataatgc aatgtgctta caagggccag cagga 45 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 42 aattgtcgac gccatttcag ggcttccttg gtccaa 36 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 43 tggcgtcgac aattaatatt catcgcactt 30 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 44 gtggtcgacc tgtataatgg aatggcctta caagggccag caggagtgcc 50 t 51 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 45 ctcaaagctt tccctcagag cttccccctt ttctcctttg aat 43 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 46 ccatgaggcc tgcttgtagt tgggtgtc 28 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 47 agcaggcctc atggagttca ttgaattat 29 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 48 taaacgttgc ctccgcaatt ttcccaag 28 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 49 ggcaacgttt acaaagatgc gttcaaa 27 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 50 gcatgcattt ctggctttta gccgaagtga gcca 34 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 51 ctggcatgct gcatttctgc atttta 26 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 52 gcagcatgcc agcgttggta tttcacattc aa 32 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 53 aatgcatgcg ctcagcgttg gtatttcaca 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 54 cctgaggcct cagctccatt gaatgtgaaa 30 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 55 ctgaggcctc aggacctctt cccattgaa 29 <210> 56 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 56 tccggcgcca attccttcag caagtccttc cacagaagaa gtgcgatgaa 50 <210> 57 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 57 attggcgccg gattagtgga tgttgctatc t 31 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 58 tgaagcggta ccaacccaga tagcaacatc 30 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 59 ggcggtaccg cttcagatta cccaaaagga ga 32 <210> 60 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 60 gtggtcgacc tgtatgctgg aatgtgctta caagggccag ca 42 <210> 61 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 61 gtggtcgacc tgtataatgg agcgtgctta caagggccag caggagt 47 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 62 tcggccggcc actcctgctg gcccttgtaa 30 <210> 63 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 63 gtggccggcc gagacgggag cgctggggcc aatggcattc cgggta 46 <210> 64 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 64 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gcaatgatac 5350 cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 5400 gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 5450 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 5500 atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc 5550 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 5600 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 5650 ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 5700 atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 5750 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 5800 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca 5850 catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 5900 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 5950 ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 6000 gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 6050 gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 6100 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 6150 tagaaaaata aacaaatagg 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accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4450 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 4500 acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 4550 ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 4600 taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc cagcagcaat ggcaacaacg 4650 ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 4700 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 4750 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 4800 cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 4850 ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 4900 gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 4950 ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 5000 tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 5050 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 5100 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 5150 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 5200 atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 5250 cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 5300 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 5350 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 5400 agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 5450 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 5500 tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 5550 gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 5600 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 5650 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 5700 ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 5750 ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 5800 ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 5850 acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 5900 acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tccaactggc 5950 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 6000 gtgagttacc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 6050 ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 6100 acagctatga ccatgattac gaatta 6126 <210> 114 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 1-19, 30-36, 56 <223> Xaa is any amino acid and any one can be missing <220> <221> Xaa <222> 22-28, 38-44, 46, 50-52, 56, 62, 73, 88, 153, 169, 207 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> Xaa <222> 45, 225 <223> Xaa is R or K <220> <221> Xaa <222> 47 <223> Xaa is R, P, or A <220> <221> Xaa <222> 48, 127, 136, 164, 181 <223> Xaa is B, D, E, N, Q or Z <220> <221> Xaa <222> 49 <223> Xaa is V, A or F <220> <221> Y <222> 53 <223> Y can be missing <220> <221> Xaa <222> 54 <223> Xaa is Q or N or can be missing <220> <221> Xaa <222> 55, 58, 96 <223> Xaa is L or V <220> <221> Xaa <222> 61 <223> Xaa is P or V <220> <221> Xaa <222> 64 <223> Xaa is V or T <220> <221> Xaa <222> 65 <223> Xaa is P or Q <220> <221> Xaa <222> 70 <223> Xaa is N or S <220> <221> Xaa <222> 97 <223> Xaa is R or S <220> <221> Xaa <222> 99 <223> Xaa is S, R or V <220> <221> Xaa <222> 100 <223> Xaa is F or I <220> <221> Xaa <222> 103 <223> Xaa is S or P <220> <221> Xaa <222> 105 <223> Xaa is T or K <220> <221> Xaa <222> 108 <223> Xaa is F or Y <220> <221> Xaa <222> 112, 115, 221 <223> Xaa is S or A <220> <221> Xaa <222> 114 <223> Xaa is S or N <220> <221> Xaa <222> 133 <223> Xaa is M, L or Q <220> <221> Xaa <222> 144, 198 <223> Xaa is S or T <220> <221> Xaa <222> 152 <223> Xaa is K or R <220> <221> Xaa <222> 174, 178, 213, 238 <223> Xaa is I or V <220> <221> Xaa <222> 176 <223> Xaa is A or S <220> <221> Xaa <222> 187 <223> Xaa is L or M <220> <221> Xaa <222> 214 <223> Xaa is A or G <220> <221> Xaa <222> 215 <223> Xaa is I or L <400> 114 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gln Gly 50 55 60 Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Arg Asp Gly Xaa Pro Gly Xaa Asn Gly 65 70 75 Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Xaa Lys Gly 80 85 90 Glu Lys Gly Glu Cys Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Glu Xaa Trp Xaa 95 100 105 Pro Asn Xaa Lys Gln Cys Xaa Trp Xaa Xaa Leu Asn Tyr Gly Ile 110 115 120 Asp Leu Gly Lys Ile Ala Xaa Cys Thr Phe Thr Lys Xaa Arg Ser 125 130 135 Xaa Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Xaa Gly Ser Leu Arg Leu Lys 140 145 150 Cys Xaa Xaa Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr Phe Xaa Gly 155 160 165 Ala Glu Cys Xaa Gly Pro Leu Pro Xaa Glu Xaa Ile Xaa Tyr Leu 170 175 180 Xaa Gln Gly Ser Pro Glu Xaa Asn Ser Thr Ile Asn Ile His Arg 185 190 195 Thr Ser Xaa Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Xaa Ala Gly Leu 200 205 210 Val Asp Xaa Xaa Xaa Trp Val Gly Thr Cys Xaa Asp Tyr Pro Xaa 215 220 225 Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Xaa Ile Ile 230 235 240 Glu Glu Leu Pro Lys 245 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 1 <223> Xaa is G or A <220> <221> Xaa <222> 2, 4 <223> Xaa is S, T, A, R, W or Y <220> <221> Xaa <222> 6 <223> Xaa is Y or F <220> <221> Xaa <222> 7 <223> Xaa is G, S, T or A <220> <221> Xaa <222> 9 <223> Xaa is N, Y or A <220> <221> Xaa <222> 11 <223> Xaa is N, Y, or D <400> 115 Xaa Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa 1 5 10 <210> 116 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 2 <223> Xaa is A, S or T <220> <221> Xaa <222> 3 <223> Xaa is a basic amino acid <220> <221> Xaa <222> 4 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> Xaa <222> 7 <223> Xaa is a hydrophobic amino acid <220> <221> Xaa <222> 8-11 <223> Xaa can be any amino acid or can be missing <220> <221> Xaa <222> 8-11 <223> at least one of X5-X8 is an aromatic amino acid or a hydrophobic amino acid <220> <221> Xaa <222> 12 <223> Xaa is an aromatic or hydrophobic amino acid <220> <221> Xaa <222> 13 <223> Xaa is D or A <220> <221> Xaa <222> 14 <223> Xaa is Y or V <400> 116 Cys Xaa Xaa Xaa Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Yeast <400> 117 Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile Glu Glu Leu Pro Lys 1 5 10 15

Claims (82)

  1. 올리고머 형태의 인간 STOP-1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  2. 인간 STOP-1의 아미노산 33 내지 52 또는 아미노산 33 내지 53에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  3. 인간 STOP-1의 아미노산 94 내지 243에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  4. 제3항에 있어서, 올리고머 형태의 인간 STOP-1에 결합하는 모노클로날 항체.
  5. (a) T-I-X1-X2-X3-X4 (여기서, X1은 S, N 또는 T이고; X2는 G, N, S 또는 A이고; X3은 Y, S 또는 T이며; X4는 D 또는 W임)를 포함하는 제1 아미노산 서열,
    (b) X1-X2-I-X3-P-X4-X5-G-X6-T-X7 (서열 115) (여기서, X1은 G 또는 A이고; (1) X2는 S, T 및 A로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, X3은 R, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 (2) X3은 S, T 및 A로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, X2는 R, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고; X4는 Y 또는 F이고; X5는 G, S, T 또는 A이고; X6은 N, Y 또는 A이며; X7은 N, Y 또는 D임)를 포함하는 제2 아미노산 서열, 및
    (c) 서열 C-X1-X2-X3-G-G-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 (서열 116) (여기서, X1은 A, S 또는 T이고; X2는 염기성 아미노산이고; X3은 임의의 아미노산이고; X4는 소수성 아미노산이고; X5 내지 X8 중 어느 하나는 임의의 아미노산이거나 결실될 수 있고, X5 내지 X8 중 하나 이상은 방향족 아미노산 또는 소수성 아미노산이며; X9는 방향족 또는 소수성 아미노산이고; X10은 D 또는 A이며; X11은 Y 또는 V임)을 포함하는 제3 아미노산 서열
    을 포함하는 모노클로날 항체.
    <청구항 3>
    제5항에 있어서, 제1 아미노산 서열이 TISGSD, TITNSD 및 TISGSW로 이루어진 군의 어느 하나로부터 선택된 것인 항체.
    <청구항 4>
    제5항에 있어서, 제2 아미노산 서열이 GRISPYGGNTN, ATIYPYGGYTY 및 AWIAPYSGATD로 이루어진 군의 어느 하나로부터 선택된 것인 항체.
    <청구항 5>
    제5항에 있어서, 제3 아미노산 서열이 CARVGGLKLLFDY, CARGGGMDGYVMDY 및 CAREGGLYWVFDY로 이루어진 군의 어느 하나로부터 선택된 것인 항체.
  6. 제5항에 있어서, (a) 제1 아미노산 서열 TISGSD, (b) 제2 아미노산 서열 GRISPYGGNTN, 및 (c) 제3 아미노산 서열 CARVGGLKLLFDY를 포함하는 항체 또는 그의 변이체.
  7. 제5항에 있어서, (a) 제1 아미노산 서열 TITNSD, (b) 제2 아미노산 서열 ATIYPYGGYTY, 및 (c) 제3 아미노산 서열 CARGGGMDGYVMDY를 포함하는 항체 또는 그의 변이체.
  8. 제5항에 있어서, (a) 제1 아미노산 서열 TISGSW, (b) 제2 아미노산 서열 AWIAPYSGATD, 및 (c) 제3 아미노산 서열 CAREGGLYWVFDY를 포함하는 항체 또는 그의 변이체.
  9. (a) 제1 아미노산 서열 TISNYG, (b) 제2 아미노산 서열 GRISPSNGSTY, 및 (c) 제3 아미노산 서열 CAKCSVRFAY를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 변이체.
  10. (a) 제1 아미노산 서열 TINNYD, (b) 제2 아미노산 서열 GYISPPSGATY, 및 (c) 제3 아미노산 서열 CARMVGMRRGVMDY를 포함하는 모노클로날 항체 또는 그의 변이체.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 아미노산 서열이 카바트 넘버링 체계(Kabat numbering system)에 따른 중쇄의 잔기 28 내지 33 내에 있고, 제2 아미노산 서열이 카바트 넘버링 체계에 따른 중쇄의 잔기 49 내지 58 내에 있으며, 제3 아미노산 서열이 카바트 넘버링 체계에 따른 잔기 92 내지 102 내에 있는 것인 모노클로날 항체.
  12. (a) 도 27의 중쇄 서열;
    (b) 도 28의 중쇄 서열;
    (c) 도 29의 중쇄 서열;
    (d) 도 30의 중쇄 서열;
    (e) 도 31의 중쇄 서열;
    (f) 도 34의 중쇄 서열
    의 아미노산 서열 또는 이들의 변이체를 포함하는 모노클로날 항체.
  13. 제12항에 있어서,
    (a) 도 27의 경쇄 서열;
    (b) 도 34의 경쇄 서열
    의 아미노산 서열 또는 이들의 변이체를 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  14. 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection (ATCC))에, 2003년 3월 25일자로 명칭 V0350-4-S7로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S7, 2003년 3월 25일자로 명칭 V0350-2b-S4로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S4, 2003년 3월 25일자로 명칭 V0350-2b-S9로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S9, 2003년 3월 25일자로 명칭 V0350-4-S16으로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S16, 2003년 3월 25일자로 명칭 V0350-5로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 F5, 및 2003년 3월 28일자로 명칭 6B12.1.7로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 6B12로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 생물학적 특징을 갖는 모노클로날 항체.
  15. ATCC에 명칭 V0350-4-S7로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S7, ATCC에 명칭 V0350-2b-S4로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S4, ATCC에 명칭 V0350-2b-S9로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S9, ATCC에 명칭 V0350-4-S16으로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S16, ATCC에 명칭 V0350-5로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 F5 및 ATCC에 명칭 6B12.1.7로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 6B12로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 모노클로날 항체에 의해 항체의 STOP-1에의 결합이 억제될 수 있는, STOP-1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  16. ATCC에 명칭 V0350-4-S7로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S7, ATCC에 명칭 V0350-2b-S4로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S4, ATCC에 명칭 V0350-2b-S9로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S9, ATCC에 명칭 V0350-4-S16으로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 S16, ATCC에 명칭 V0350-5로서 기탁된 핵산 분자에 의해 코딩되는 F5 및 ATCC에 명칭 6B12.1.7로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 6B12로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 포함하는, STOP-1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편 또는 이중특이적(bispecific) 항체인 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 성장 억제제, 세포독성제, 검출제, 생체이용성 개선제 및 항체 반감기 개선제로 이루어진 군으로부터 선택된 제제에 콘쥬게이션(conjugation)된 항체.
  20. 제19항에 있어서, 세포독성제가 독소, 항생제 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아에서 생산된 항체.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포에서 생산된 항체.
  23. 세포로부터 분비될 수 없는 STOP-1 폴리펩티드를 포함하는 STOP-1 폴리펩티드 변이체.
  24. 제23항에 있어서, 폴리펩티드가 잔기 186에서 돌연변이된 것인 폴리펩티드 변이체.
  25. 또다른 STOP-1과 디술피드 결합할 수 없는 STOP-1 폴리펩티드를 포함하는 STOP-1 폴리펩티드 변이체.
  26. 제24항에 있어서, 폴리펩티드가 잔기 55에서 돌연변이된 것인 폴리펩티드 변이체.
  27. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  28. 제27항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  29. 제27항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  30. STOP-1에 특이적으로 결합하며 상기 결합이 모노클로날 항체 6B12에 의해 억제될 수 있는 STOP-1 길항제 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 길항제가 인간 STOP-1의 잔기 33 내지 52 내의 잔기에 특이적으로 결합하는 것인 조성물.
  32. (누락)
  33. STOP-1 폴리펩티드의 길항제 및 기질 표적화제(stromal targeting agent)를 포함하는 조성물.
  34. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 포함하는 조성물.
  35. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 기질 표적화제를 추가로 포함하는 조성물.
  37. 제34항에 있어서, 기질 표적화제가 길항제에 공유결합 것인 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 기질 표적화제가 모노클로날 항체에 공유결합된 것인 조성물.
  39. 제35항에 있어서, 기질 표적화제가 폴리펩티드에 공유결합된 것인 조성물.
  40. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 표적화제가 종양의 기질 세포를 인식하는 것인 조성물.
  41. 제27항에 따른 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  42. 제27항에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, STOP-1 폴리펩티드 또는 항-STOP-1 항체의 생산 방법.
  43. 제42항에 있어서, 세포가 박테리아 세포 또는 포유동물 세포인 방법.
  44. STOP-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하며 프로테오글리칸 합성에 결함이 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, STOP-1 폴리펩티드의 생산 방법.
  45. 제41항에 있어서, 프로테오글리칸 합성에 결함이 있는 세포주가 갈락토실트랜스퍼라제 I 활성에 결함이 있는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 세포주가 CHO-psbg 세포주인 방법.
  47. 정상 조직 내의 STOP-1 단백질의 양을 환자로부터 시험될 조직 내의 STOP-1 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 환자 종양의 진단 또는 모니터링(monitoring) 방법.
  48. 제47항에 있어서, 정상 조직 및 종양 조직 내의 STOP-1의 양을 기질 세포에서의 발현을 기준으로 평가하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 사용하여 정상 조직 내의 STOP-1 단백질의 양을 환자로부터 시험될 조직 내의 STOP-1 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 환자 종양의 진단 또는 모니터링 방법.
  50. 제49항에 있어서, 정상 조직 및 종양 조직 내의 STOP-1의 양을 기질 세포에서의 발현을 기준으로 평가하는 것인 방법.
  51. 환자의 종양 성장을 억제하는데 유효한 양의 STOP-1 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, STOP-1을 과발현시키는 종양의 성장을 방지하거나 억제하는 방법.
  52. 환자의 종양 성장을 억제하는데 유효한 양의 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, STOP-1을 과발현시키는 종양의 성장 억제 방법.
  53. 제52항에 있어서, 종양이 기질 구획을 갖는 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 종양이 데스모이드 종양, 육종, 선암종, 간세포 암종, 원형 세포 종양, 유방암, 결장암, 폐암, 난소암, 흑색종, 자궁내막암, 신경아교종, 췌장암 및 혈관암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  55. 세포로부터의 STOP-1의 분비를 억제하는 단계를 포함하는, STOP-1을 과발현시키는 세포의 성장 억제 방법.
  56. 제55항에 있어서, 세포로부터 분비될 수 없는 STOP-1 단백질을 세포 내에서 과발현시킴으로써 분비를 억제하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 분비될 수 없는 STOP-1 단백질이 잔기 186에서 돌연변이된 것인 방법.
  58. (1) STOP-1-코딩 DNA 분자를 잔기 55의 시스테인에서 돌연변이시키는 단계;
    (2) 잔기 55의 시스테인에서 돌연변이된 STOP-1 단백질을 천연-발생 STOP-1 단백질의 존재하에서 발현시키는 단계; 및
    (3) 잔기 55의 시스테인에서 돌연변이된 STOP-1 단백질을 천연-발생 STOP-1 단백질과 함께 인큐베이션(incubation)하는 단계
    로 이루어진 군으로부터 선택된 단계를 포함하는, STOP-1 분자간의 디술피드 결합의 방지 방법.
  59. STOP-1을 매트릭스 메탈로프로테아제-7 (MMP-7) 및 매트릭스 메탈로프로테아제-9 (MMP-9)로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 STOP-1의 절단 방법.
  60. 제59항에 있어서, 생산된 STOP-1 절단 생산물을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  61. STOP-1 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 항-STOP-1 항체에 노출시키는 단계, 및 상기 시료 성분에 대한 상기 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 시료중의 STOP-1 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법.
  62. (a) 변형된 STOP-1 폴리펩티드, STOP-1 폴리펩티드 변이체 또는 STOP-1 길항제를 포함하는 물질의 조성물;
    (b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
    (c) 증식성 질병의 치료에 있어서의 상기 폴리펩티드 변이체, 변형된 폴리펩티드 또는 길항제의 용법을 지시하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 용기에 포함된 패키지 삽입물
    을 포함하는 프로모터.
  63. 제51항에 있어서, STOP-1 길항제가 (1) 6B12 항체가 결합하는 인간 STOP-1 내의 잔기에 결합하는 활성; (2) 인간 STOP-1의 최소한의 잔기 33 내지 52 또는 33 내지 53 내의 잔기에 결합하는 활성; 및 (3) 6B12 항체에 의한 STOP-1에의 결합으로부터 경쟁할 수 있는 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 활성을 갖는 것인 방법.
  64. 암 세포 또는 내피 세포의 이동을 유도하는데 유효한 양의 STOP-1 폴리펩티드를 상기 세포에 투여하는 것을 포함하는, 시험관내 세포 이동의 유도 방법.
  65. 제1 내피 세포 또는 암 세포를 STOP-1에 노출시키는 단계, 제2 내피 세포 또는 암 세포를 STOP-1 및 후보 길항제 또는 아고니스트에 노출시키는 단계, 및 제1 및 제2 내피 세포 또는 암 세포의 이동을 비교하는 단계를 포함하는, STOP-1의 후보 길항제 또는 아고니스트의 활성 시험 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 세포가 HUVEC 세포(인간 제정맥 내피 세포)인 방법.
  67. (1) 6B12 항체가 결합하는 인간 STOP-1 내의 잔기에 결합하는 활성;
    (2) 인간 STOP-1의 최소한의 잔기 33 내지 52 내의 잔기에 결합하는 활성; 및
    (3) 6B12 항체에 의한 STOP-1에의 결합으로부터 경쟁할 수 있는 활성
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 활성을 갖는 STOP-1 길항제를 과다, 부적절 또는 비제어 혈관형성과 관련된 질환을 치료하는데 유효한 양으로 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 대상체에서의 과다, 부적절 또는 비제어 혈관형성과 관련된 질환 또는 증상의 치료 방법.
  68. STOP-1 폴리펩티드 및 항체의 Fc 부분을 포함하는 면역부착소(immunoadhesin) 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 3개 초과의 STOP-1 폴리펩티드를 포함하는 올리고머 형태의 STOP-1을 포함하는 조성물.
  70. STOP-1 폴리펩티드의 세포 표면에의 결합을 증강시키는 분자 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 분자가 STOP-1을 세포 표면 상에서 응집시키는 것인 조성물.
  72. 제70항에 있어서, 증강시키는 분자가 항-STOP-1 항체인 조성물.
  73. (a) 세포에의 STOP-1 결합을 증강시키는 분자를 포함하는 물질의 조성물 또는 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 조성물;
    (b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
    (c) 증가된 혈관형성으로부터 이익을 얻을 질병의 치료 또는 개선에 있어서의 상기 분자 또는 아고니스트의 용법을 지시하는, 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 용기에 포함된 패키지 삽입물
    을 포함하는 프로모터.
  74. 치료 유효량의 STOP-1 증강제 또는 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것에 의한, 증가된 혈관형성으로부터 이익을 얻을 환자에서의 혈관형성의 유도 방법.
  75. 제74항에 있어서, 아고니스트가 항-STOP-1 항체인 방법.
  76. STOP-1을 후보 STOP-1 길항제의 존재하에서 암 세포에 노출시키는 단계, STOP-1을 후보 STOP-1 길항제의 부재하에서 암 세포에 노출시키는 단계, 및 STOP-1의 암 세포에의 결합을 후보 STOP-1 길항제의 존재하 및 부재하에서 비교하는 단계를 포함하는, 후보 STOP-1 길항제의 확인 또는 평가 방법.
  77. STOP-1을 STOP-1 길항제의 존재하에서 암 세포에 노출시키는 단계, 및 STOP-1의 암 세포에의 결합을 측정 또는 관찰하는 단계를 포함하는, STOP-1 길항제의 평가 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 암 세포가 유방암 세포인 방법.
  79. STOP-1을 후보 STOP-1 길항제의 존재하에서 내피 세포에 노출시키는 단계, STOP-1을 후보 STOP-1 길항제의 부재하에서 내피 세포에 노출시키는 단계, 및 STOP-1의 내피 세포에의 결합을 후보 STOP-1 길항제의 존재하 및 부재하에서 비교하는 단계를 포함하는, 후보 STOP-1 길항제의 확인 또는 평가 방법.
  80. STOP-1을 STOP-1 길항제의 존재하에서 내피 세포에 노출시키는 단계, 및 STOP-1의 암 세포에의 결합을 측정 또는 관찰하는 단계를 포함하는, STOP-1 길항제의 평가 방법.
  81. STOP-1을 STOP-1 증강제의 존재하에서 내피 세포에 노출시키는 단계, 및 STOP-1의 암 세포에의 결합을 측정 또는 관찰하는 단계를 포함하는, STOP-1 증강제의 평가 방법.
  82. STOP-1을 STOP-1 아고니스트의 존재하에서 내피 세포에 노출시키는 단계, 및 STOP-1의 암 세포에의 결합을 측정 또는 관찰하는 단계를 포함하는, STOP-1 아고니스트의 평가 방법.
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