EA021669B1 - Нейтрализующие антитела человека против b7rp1 - Google Patents

Нейтрализующие антитела человека против b7rp1 Download PDF

Info

Publication number
EA021669B1
EA021669B1 EA200800355A EA200800355A EA021669B1 EA 021669 B1 EA021669 B1 EA 021669B1 EA 200800355 A EA200800355 A EA 200800355A EA 200800355 A EA200800355 A EA 200800355A EA 021669 B1 EA021669 B1 EA 021669B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zeo
amino acid
acid sequence
binding fragment
antibody
Prior art date
Application number
EA200800355A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800355A1 (ru
Inventor
Джералд Сиу
Веньянь Шень
Стивен Кийоши Йошинага
Хайчунь Хуань
Original Assignee
Амджен Инк.
МЕДАРЕКС Л.Л.Си.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амджен Инк., МЕДАРЕКС Л.Л.Си. filed Critical Амджен Инк.
Publication of EA200800355A1 publication Critical patent/EA200800355A1/ru
Publication of EA021669B1 publication Critical patent/EA021669B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

В данном изобретении предложены антитела, которые взаимодействуют с человеческим B7-связанным белком-1 (B7RP1) или связываются с ним, и антитела, которые связываются с B7RP1 и посредством этого нейтрализуют его функцию. В изобретении также предложены фармацевтические композиции указанных антител и способы нейтрализации функции B7RP1, в частности, для лечения иммунных расстройств (например, неадекватного иммунного ответа) путем введения фармацевтически эффективного количества антител анти-B7RP1. Также предложены способы определения количества B7RP1 в образце с использованием антител против B7RP1.

Description

(57) В данном изобретении предложены антитела, которые взаимодействуют с человеческим В7связанным белком-1 (В7КР1) или связываются с ним, и антитела, которые связываются с В7КР1 и посредством этого нейтрализуют его функцию. В изобретении также предложены фармацевтические композиции указанных антител и способы нейтрализации функции В7КР1, в частности, для лечения иммунных расстройств (например, неадекватного иммунного ответа) путем введения фармацевтически эффективного количества антител анти-В7КР1. Также предложены способы определения количества В7КР1 в образце с использованием антител против В7КР1.
021669 В1
В данной заявке заявлен приоритет по отношению к временной патентной заявке США, серийный номер 60/700265, поданной 18 июля 2005 г., описание которой полностью включено здесь путем ссылки.
Область изобретения
Изобретение относится к моноклональным антителам человека, которые связываются с В7связанным белком-1 (В7ЕР1). Также описаны композиции и способы лечения заболеваний и расстройств, относящихся к иммуносупрессии и к иммунной активации.
Предшествующий уровень техники
Т-клетки инициируют иммунный ответ, являются посредниками в функциях специфичного к антигену эффектора и регулируют активность других лейкоцитов путем секреции цитокинов. Для генерирования адекватного иммунного ответа Т-лимфоцитов (Т-клеток) антигенпрезентирующими клетками (АПК) должно быть передано два сигнала к Т-клеткам. Антиген должен быть презентирован Тклеточному рецептору (ТКР) через главный комплекс гистосовместимости (ГКГ) в событии, которое определяет специфичность. Т-клетки могут распознать только антиген, презентированный на АПК. В дополнение к рецептору антигена адекватная активация Т-клеток также требует взаимодействия других молекул клеточной поверхности как на Т-клетках, так и на АПК. Эти молекулы, называемые молекулами костимуляции, состоят из рецептора на клетке, отвечающей за дифференциацию, и лиганда, присутствующего на индукторной клетке. Этот независимый от антигена сигнал костимуляции должен быть доставлен путем связывания членов семейства В7 на АПК их рецепторами на Т-клетках. Продуктивный иммунный ответ приводит к пролиферации, дифференциации, клональной экспансии и функции эффектора. В отсутствие второго сигнала костимуляции Т-клетки испытывают состояние стойкой невосприимчивости специфичного антигена, которую называют анергией. Клинические эксперименты фазы II показали, что блокирование одного биохимического пути костимула эффективно при лечении псориаза (АЪтатк е! а1., 2000, I Ехр Мей. 192: 681-94; АЪтатк е! а1., 1999, I. С1т. 1пуе81. 103: 1243-52) и ревматоидного артрита (Кгетег е! а1., 2003, Иете Епд1апй 1оитпа1 οί Мейюше 349: 1907-15), что указывает на то, что эта общая стратегия является хорошей целью для иммуномодулирующей терапии.
Особая молекула костимуляции В7, В7-связанный белок-1 (В7ЕР1), представляет собой трансмембранный белок типа 1 с сигнальной последовательностью и внеклеточным доменом при аминоконце, где внеклеточный домен содержит две петли 1д, трансмембранным доменом и внутриклеточным доменом карбоксильного конца (публикация заявки РСТ № \νϋ 00/46240). В7КР1 преимущественно связывается с 1СО8 (что означает индуцибельный костимулятор; УокЫпда е! а1., 2000, 1п!. 1ттип. 12: 1439-1447), который экспрессируется на клеточной поверхности Т-клеток. 1СО8 играет важную роль в продуцировании обоих типов цитокинов типа 1 и типа 2 активированными Т-клетками (Соу1е е! а1., 2000, 1ттиш1у 13: 95105).
В7КР1 является единственным лигандом, экспрессируемым конститутивно на АПК (УокЫпада е! а1., 1999, Иа!иге. 402: 827-32), тогда как 1СО8 экспрессируется только на активированных Т-клетках (МсАйат е! а1., 2000, 1оитпа1 οί 1ттипо1оду 165: 5035-40). В7ЕР1-зависимая передача сигнала требуется как для активации эффектора (то есть полностью активированной Т-клетки), так и для его созревания из его предшественника, не подвергнутого воздействию (Бопд е! а1., 2003, 1оитпа1 οί Аи!о1ттцш1у. 21: 25560; Соу1е е! а1., 2000, 1ттиш1у. 13: 95-105). Следовательно, взаимодействие В7ЕР1/1СО8 требуется для адекватных вторичных иммунных ответов, зависимых от Т-клеток (Бопд е! а1., 2003, 1оита1 οί Аи!о1ттипИу. 21: 255-60).
Современные попытки вмешательства в биохимический путь костимула Т-клеток сосредоточены, прежде всего, на полипептидах костимула, которые блокируют только активацию Т-клеток, но не сосредоточены на активации и созревании. Следовательно, эти терапии обеспечивают общее ингибирование функции Т-клеток. Напротив, блокирование взаимодействия В7ЕР1/1СО8 обеспечивает более специфичное ингибирование функции Т-клеток посредством воздействия только на зрелые Т-клетки-эффекторы. Таким образом, в клинических ситуациях очень желательно блокирование взаимодействия В7ЕР1/1СО8, поскольку это обеспечило бы более ограниченный профиль побочных эффектов, чем терапии костимула, которые блокируют только активацию Т-клеток, не подвергнутых воздействию.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предложены моноклональные антитела, которые связываются с В7-связанным белком-1 (В7ЕР1). В одном воплощении эти моноклональные антитела представляют собой человеческие моноклональные антитела, которые нейтрализуют биологические активности В7ЕР1 и, в частности, полезны для частичного или полного ингибирования иммунной костимулирующей активности В7ЕР1. В изобретении также предложены клетки, в частности клетки гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела по изобретению. В конкретных аспектах антитела по изобретению специфично связываются с Н или Б доменом В7ЕР1, как описано здесь.
Далее в изобретении предложены гибридные белки, включающие последовательность области Рс антитела и одну или более чем одну последовательность, идентифицируемую как последовательность 8ЕС 1Б ИО: 1-8ЕС 1Б ИО: 40. Такие молекулы могут быть получены с использованием методов, которые описаны, например, в международной заявке на патент, номер публикации VО 00/24782, которая включена здесь путем ссылки. Такие молекулы могут быть экспрессированы, например, в клетках млекопи- 1 021669 тающих (например, в клетках яичника китайского хомячка) или в бактериальных клетках (например, в клетках Е. сой).
В определенных аспектах в изобретении предложены антитела, включающие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из константных областей тяжелых цепей 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дМ, 1дА и 1дЕ или любого их аллельного варианта (как обсуждено в публикации КаЬа! с1 а1., 1991, 8сциспсс5 о£ Рго1еш8 о£ 1ттипо1одюа1 1п1сгс51. ΕίΠΙι ΕάίΙίοη. и.8. ОераПтеШ о£ НеаНй апб Нитап §егуюе8, ΝΙΗ РиЬйсайоп Ыо. 91-3242, включенной здесь путем ссылки), и вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, как представлено в любой из последовательностей 8ЕО ГО N0: 7-8Е© ГО N0: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Антитело по изобретению содержит любую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи 1дС2, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 41, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, либо аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи 1дС1, как представлено в последовательности 8Е© ГО N0: 42, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В некоторых воплощениях антитела представляют собой моноклональные антитела, человеческие антитела или предпочтительно человеческие моноклональные антитела.
В определенных аспектах в изобретении предложены антитела, включающие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит константную область, имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 43, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в любой из последовательностей 8Е© ГО N0: 18Е0 ГО N0: 6, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В некоторых воплощениях антитела представляют собой моноклональные антитела, антитела человека или предпочтительно моноклональные антитела человека.
В некоторых аспектах антитела по изобретению включают тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 7 или 8Е© ГО N0: 8, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В других аспектах вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 1, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В других аспектах антитела по изобретению включают тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 9, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В других аспектах вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е© ГО N0: 2, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В дополнительных аспектах тяжелая цепь содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок (ΟΌΚ), имеющий аминокислотную последовательность, как представлено в любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 27-8Е© ГО N0: 40, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Еще в дополнительных аспектах легкая цепь включает по меньшей мере одну СГОк имеющую аминокислотную последовательность, как представлено в любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 15-8Е© ГО N0: 26, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В изобретении также предложены антитела, которые специфично связываются с В7КР1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 7 или 8Е© ГО N0: 8, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 1, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Кроме того, в изобретении предложены антитела, которые специфично связываются с В7КР1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е0 ГО N0: 9, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8Е© ГО N0: 2, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В определенных аспектах в изобретении также предложены антитела, включающие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи и где вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последо- 2 021669 вательности, как представлено в любой из последовательностей §ЕЦ ГО N0: 7-8ЕЦ ГО N0: 14, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и где эта вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности, как представлено в любой из последовательностей §ЕЦ ГО N0: 1-8ЕЦ ГО N0: 6, где антитело специфично связывается с В7КР1.
В изобретении также предложены антитела, которые специфично связываются с В7КР1, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8ЕЦ ГО N0: 44 или 8ЕЦ ГО N0: 46, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8ЕЦ ГО N0: 45, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В изобретении также предложены антитела, которые специфично связываются с В7КР1, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8ЕЦ ГО N0: 47, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности 8ЕЦ ГО N0: 48, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В определенных аспектах в изобретении предложены антитела, включающие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи и где эта вариабельная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну СГОК имеющую последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности, как представлено в любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 27-8ЕЦ ГО N0: 40, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и где эта вариабельная область легкой цепи содержит по меньшей мере одну СГОК имеющую аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности, как представлено в последовательностях 8ЕЦ ГО N0: 15-ЗЕЦ ГО N0: 26, где это антитело специфично связывается с В7КР1.
В изобретении также предложены одноцепочечные антитела, одноцепочечные антитела Ρν, антитела Р(аЬ), антитела Р(аЬ)' и антитела (РаЬ')2.
В конкретных аспектах в изобретении предложена легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, как представлено в последовательностях ЗЕЦ ГО N0: 15-ЗЕЦ ГО N0: 26, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Кроме того, в изобретении предложена тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 27-ЗЕЦ ГО N0: 40, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Изобретение также относится к изолированным антителам человека, которые специфично связываются с В7КР1, где антитело включает (а) каркасные области тяжелой цепи человека, область СГОК1 тяжелой цепи человека, область СГОК2 тяжелой цепи человека и область СГОК3 тяжелой цепи человека; и (б) каркасные области легкой цепи человека, область СГОК1 легкой цепи человека, область СГОК2 легкой цепи человека и область СГОК3 легкой цепи человека. В определенных аспектах область СГОК1 тяжелой цепи человека может представлять собой область СГОК1 тяжелой цепи, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 27, 30 или 35, и область СГОК1 легкой цепи человека может представлять собой область СГОК1 легкой цепи, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 15, 18 или 24. В других аспектах область СГОК2 тяжелой цепи человека может представлять собой область СГОК2 тяжелой цепи, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 28, 31, 33, 36 или 39, и область СГОК2 легкой цепи человека может представлять собой область СГОК2 легкой цепи, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 16, 19 или 21. Кроме того, в других аспектах область С.ГОК3 тяжелой цепи человека представляет собой область СГОК3 тяжелой цепи, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО N0: 29, 32, 34, 37, 38 или 40, и область С.ГОК3 легкой цепи человека представляет собой область С.ГОК3 легкой цепи, как представлено в любой из последовательностей 81ГО ГО N0: 17, 20, 22, 23, 25 или 26.
Антитела по изобретению характеризуются способностью специфично связываться с В7КР1. Кроме того, антитела по изобретению обладают способностью антагонизировать по меньшей мере одну активность ίη νίΐτο и/или ίη νίνο, связанную с полипептидами В7КР1. В изобретении предложены изолированные человеческие антитела против человеческого В7КР1 с высоким сродством связывания к полипептидам В7КР1, где эти антитела связываются с человеческим полипептидом В7КР1 и диссоциируют от человеческого полипептида В7КР1 с константой диссоциации (Кс) примерно 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М или менее, как определено с использованием технологии КьпЕхА, или которые ингибируют индуцированное В7КР1 выживание в анализе на нейтрализацию ίη νίΐτο с ЕС50 примерно 10-6
- 3 021669
М, 10 М, 108 М, 10 ' М, 10 ' М, 10 М, 10 '2 М или менее.
В изобретении также предложены изолированные антитела человека или их антигенсвязывающие или иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулина, которые специфично связываются с В7КР1, где эти антитела или фрагменты включают вариабельную область тяжелой цепи, содержащую СЭК.1, СЭК2 и СГОК3 тяжелой цепи, где
а) СЮК1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 27, СГОК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 28, и СОКЗ тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 29;
б) СГОК1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 30, СГОК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 31, и СОКЗ тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 32;
в) СГОК1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 27, СГОК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 33, и СОКЗ тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 34;
г) СГОК1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 35, СГОК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 36, и СГОК3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 37;
д) СГОК1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 27, СГОК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 33, и СГОК3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 38; или
е) СГОК1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 35, СГОК2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 39, и СГОК3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 40.
В изобретении также предложено изолированное антитело человека или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, который специфично связывается с В7КР1, где это антитело или фрагмент включает вариабельную область легкой цепи, содержащую СГОК1. СГОК2 и СГОК3 легкой цепи, где
а) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 15, СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 16, и СГОК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 17;
б) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 18, СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 19, и СГОК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 20;
в) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 15, СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 21, и СГОК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 22;
г) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 18, СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 19, и СГОК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 23;
д) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 24, СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 16, и СГОК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 25; или
е) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 24, СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 16, и СГОК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 26.
В изобретении также предложены антитела, которые конкурируют с антителами, описанными здесь, за связывание с В7КР1. В определенных аспектах конкурирующее антитело по изобретению конкурирует за связывание антитела, которое содержит любую из последовательностей §ЕЦ ГО N0: 1-40, с В7КР1 человека.
Часть изобретения также составляют полинуклеотидные последовательности, которые кодируют
- 4 021669 человеческие антитела против В7КР1 человека, векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие человеческие антитела против В7КР1 человека, клетки-хозяева, трансформированные векторами, включающими полинуклеотиды, которые кодируют человеческие антитела против В7КР1 человека, препараты, содержащие человеческие антитела против В7КР1 человека, и способы их получения и применения.
В изобретении также предложены способы обнаружения В7КР1 в биологическом образце, включающие стадию приведения в контакт образца с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитело анти-В7КР1 по изобретению можно применять при любом известном способе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и косвенные сэндвич-анализы, анализы иммунопреципитации и твердофазные иммуноферментные анализы (ЭЛАИЗА) (см. 8о1а, 1987, Мопос1опа1 ЛпбЬойюБ: А Мапиа1 о£ ТесПшсцгез, рр. 147-158, СКС Рге88, 1пс.) для обнаружения и количественного определения В7КР1. Антитела могут связывать В7КР1 со сродством, которое является пригодным для используемого способа анализа.
Кроме того, в изобретении предложены способы лечения заболевания, обусловленного повышенным продуцированием В7КР1, повышенной чувствительностью к В7КР1, и/или заболеваний, связанных с регуляцией Т-клеточных ответов, которые включают стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело по изобретению или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Воплощения изобретения станут очевидными на основании приведенного ниже подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1А изображена последовательность вариабельной области антитела 16Н (8ЕО ГО N0: 7) и последовательность вариабельной области соответствующего антитела 16Н гаметического типа (16Нд) (81 (С) ГО N0: 8).
На фиг. 1Б изображены результаты анализов костимуляции с использованием анти-СЭЛ и гибридного белка ЬВ7КР1-Рс, которые показывают, что 16Н§ сохраняет свою биологическую активность по сравнению с 16Н.
На фиг. 2 показаны результаты анализов связывания В1асоге® с антителами 16Н, 16Н§ и 5Ό.
На фиг. 3 показаны результаты анализа связывания по технологии К1пЕхА с антителом 5Ό.
На фиг. 4 показаны результаты анализа связывания по технологии К1пЕхА с антителом 2Н.
На фиг. 5 показаны результаты анализа связывания по технологии КшЕ.хА с антителом 2Н гаметического типа (2Нд).
На фиг. 6 изображены результаты анализов конкурентного связывания, показывающие, что антитело 16Н конкурирует за связывание 1С08-Рс на В7КР-1, что проанализировано проточной цитометрией.
На фиг. 7 изображены обобщенные результаты анализа полиморфизма одного нуклеотида в ДНК (8ΝΓ, 8тд1е пис1еоййе ро1ушогрЫ8ш) В7КР-1.
На фиг. 8 изображены обобщенные результаты анализа ряда моноклональных антител против человеческого В7КР-1 в конкурентных анализах ЭЛАИЗА. Показанные значения представляют собой 1С50 для ингибирования связывания гибридного белка 1С08-Рс.
На фиг. 9А показано флуоресцентное окрашивание внеклеточного домена (ЕСГО) В7КР1 мечеными антителами 16Н, 5Ό и 1С08.
На фиг. 9Б показана сходная эффективность связывания антител 16Н и 5Ό с 8ΝΓ вариантом В7КР1.
На фиг. 9В изображены результаты анализов костимуляции с антителами 16Н или 5Ό и 8ΝΓ вариантами.
На фиг. 10А показаны результаты планшетного анализа костимуляции моноклональными антителами 1В7у2 по сравнению с рядом различных моноклональных антител против мышиного В7КР-1.
На фиг. 10Б, 10В и 101Г показаны результаты экспериментов по стимуляции антигеном, проведенных для моноспецифической антисыворотки 1дМ (фиг. 10Б), 1§С2а (фиг. 10В) и 1§С1 (фиг. 10Г).
На фиг. 11 изображены результаты ЭЛАИЗА, показывающие, что уровни ИЛ-5 в сыворотке репрессированы антителами 1В7у2.
На фиг. 12А показано, что антитела 16Н могут связываться с В7КР1 яванской макаки (правая панель) и В7КР1 человека (левая панель).
На фиг. 12Б показано, что антитела 16Н, 16Нд и 5Ό могут ингибировать В7КР1/1С08-зависимую активацию Т-клеток яванской макаки.
На фиг. 13А изображены индивидуальные и групповые средние значения титра яванской макаки на сутки 53 и на сутки 57 после вторичной стимуляции столбнячным анатоксином на сутки 42 у животных, обработанных антителами 16Н.
На фиг. 13Б изображены индивидуальные и групповые средние значения титра яванской макаки на сутки 53 и на сутки 57 после вторичной стимуляции столбнячным анатоксином на сутки 42 у животных, обработанных антителами 5Ό.
- 5 021669
Подробное описание определенных воплощений
Заголовки разделов, используемые здесь, приведены только в организационных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие описанную сущность изобретения. Все ссылки, цитируемые в данной заявке, включены в этот документ путем прямой ссылки для любой цели.
Определения
Для синтеза рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидов, а также тканевых культур и трансформации (например, электропорации, липофекции) можно использовать общепринятые методики. Ферментативные реакции и методики очистки могут быть осуществлены согласно инструкциям изготовителя или как их обычно выполняют в данной области техники, либо как описано здесь. Вышеописанные методики и процедуры, как правило, можно выполнять согласно методам, хорошо известным в данной области техники, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитированы и обсуждены на протяжении всего настоящего описания (см., например, публикацию ЗашЬгоок с1 а1., 2001, МОЬЕСиЬЛК ΤΕΟΝΙΝΟ: А ЬАВОКАТОКУ ΜΑΝυΑΣ, 36 еб., Со1б δρήη§ НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со1б 8ргш§ НагЬог, Ν.Υ., которая включена здесь путем ссылки для любой цели). Если не приведены специальные определения, номенклатура, используемая в этой связи, а также лабораторные методики и методы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, являются такими, как хорошо известно и обычно используется в данной области техники. Подобным образом, общепринятые методики можно использовать для химических синтезов, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, технологии изготовления лекарственных средств и их доставки, а также лечения пациентов.
Следует понимать, что если не указано иное, используемые в соответствии с настоящим описанием следующие термины имеют приведенные ниже значения. Выражения биологическое свойство, биологическая характеристика и термин активность при ссылке на антитело по настоящему изобретению используют здесь взаимозаменяемо, и они включают, но не ограничены, сродство и специфичность к эпитопу (например, связывание человеческого антитела против В7КР1 человека с В7КР1 человека), способность антагонизировать активность целевого полипептида (например, активность В7КР1), стабильность антитела ίη νί\Ό и иммуногенные свойства антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, признанные в данной области техники, включают, например, перекрёстную реактивность (то есть с не человеческими гомологами В7КР1 или вообще с другими белками или тканями) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеупомянутые свойства или характеристики можно наблюдать или измерять с использованием методик, признанных в данной области техники, которые включают, но не ограничены, ЭЛАЙЗА, конкурентный ЭЛАЙЗА, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализы на нейтрализацию ίη убго и ίη νί\Ό (например, пример 2) и иммуногистохимию со срезами ткани из различных источников, включая человека, приматов или любой другой соответствующий источник. Конкретные активности и биологические свойства человеческих антител против В7РР1 человека подробно описаны ниже в примерах.
Термин изолированный полинуклеотид, используемый здесь, означает полинуклеотид геномной ДНК, кДНК, РНК или нуклеиновой кислоты синтетического происхождения, либо их некоторой комбинации, где по своему происхождению изолированный полинуклеотид (1) не связан с полноразмерным полинуклеотидом или его участком, с которым изолированный полинуклеотид обнаруживают в природе, (2) сцеплен с полинуклеотидом, с которым он не сцеплен в природе, или (3) не встречается в природе в виде части большей последовательности.
Термин полинуклеотид, упоминаемый здесь, означает однонитевые или двунитевые полимеры нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов. В определенных воплощениях нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, либо модифицированную форму любого типа нуклеотида. Указанные модификации включают модификации оснований, такие как бромуридин, модификации рибозы, такие как арабинозид и 2',3'дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидной связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат и фосфороамидат. Термин полинуклеотид конкретно включает однонитевые и двунитевые формы ДНК или РНК.
Термин олигонуклеотид, упоминаемый здесь, включает природные и модифицированные нуклеотиды, сшитые вместе с помощью природных и/или неприродных олигонуклеотидных связей. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов, включающую члены, которые обычно являются однонитевыми и имеют длину 200 нуклеотидов или менее. В определенных воплощениях олигонуклеотиды имеют длину 10-60 нуклеотидов. В определенных воплощениях олигонуклеотиды имеют длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми, например, для использования при конструировании генетического мутанта. Олигонуклеотиды по изобретению могут представлять собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды в отношении последовательности, кодирующей белок.
Термин природные нуклеотиды включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин модифицированные нуклеотиды включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобное. Термин олигонуклеотидные связи включает олигонуклеотидные
- 6 021669 связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат и фосфороамидат и тому подобное (см., например, ЬаИаисЬе е! а1., 1986, Νιιοί. Λείάδ Ке8., 14: 9081; §!ес е! а1., 1984, 1. Ат. СНет. §ос., 106: 6077; §!еш е! а1., 1988, №с1. Ααάδ Ке8., 16: 3209; Ζοη е! а1., 1991, Αηίί-Саисег Отид Пе51§и, 6: 539; Ζοη е! а1., 1991, ΘΕΙΟΘΝυ^ΕΘΊΊΌΕδ ΑΝΏ ΑΝАБООиЕЗ: А РКАСПСАБ АРРКОАСН, рр. 87-108 (Р.ЕскЧещ Εά.), Θχίοτά ИтуегеНу Рге88, Θχίοτά Εη§Ηιηά; §!ес е! а1., И8 Ра!. Νο. 5151510; υЬ1таии ηηά Реутащ 1990, СЬет1са1 Ре\зе\У5. 90: 543, описание которых включено здесь путем ссылки для любых целей). Олигонуклеотид может включать обнаружимую метку для обеспечения обнаружения этого олигонуклеотида или его гибридизации.
Термин изолированный белок, упоминаемый здесь, означает, что обсуждаемый белок (1) свободен, по меньшей мере, от некоторых других белков, с которыми он должен находиться в природе, (2) по существу, свободен от других белков из того же источника, например, из тех же видов, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, (4) отделен по меньшей мере примерно от 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе, (5) не связан (путем ковалентного или нековалентного взаимодействия) с участками белка, с которыми изолированный белок связан в природе, (6) оперативно связан (путем ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой изолированный белок может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК синтетического происхождения или любой их комбинацией. В одном воплощении изолированный белок, по существу, свободен от белков или полипептидов или других загрязняющих веществ, которые находятся в его естественном окружении, которые препятствовали бы его применению (терапевтическому, диагностическому, профилактическому, в исследованиях или другому).
Изолированное антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента его естественного окружения. Компоненты загрязняющего вещества его естественного окружения представляют собой вещества, которые препятствовали бы диагностическим или терапевтическим применениям антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые вещества. В определенных воплощениях антитело очищено (1) до более чем 95% мас./мас. или более чем 99% мас./мас. антитела, как определено методом Лоури, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающимся стаканом или (3) до однородности на основании электрофореза в ДСН-ПААГ (полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в восстанавливающих или не восстанавливающих условиях с использованием окрашивания Кумасси синим или серебром. Изолированное антитело включает антитело ίη δίΐιι внутри рекомбинантных клеток, поскольку отсутствует по меньшей мере один компонент естественного окружения этого антитела.
Термины полипептид или белок означают молекулы, имеющие последовательность нативных белков, то есть белков, продуцируемых природными, а конкретно не рекомбинантными клетками, либо сконструированными путем генной инженерии или рекомбинантными клетками, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты нативной последовательности. Термины полипептид и белок конкретно охватывают антитела анти-В7КР1 или последовательности, которые имеют делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты антитела антиВ7КР1.
Термин фрагмент полипептида относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую делецию, карбоксильно-концевую делецию и/или внутреннюю делецию. В определенных воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере от 5 до примерно 500 аминокислот. Понятно, что в определенных воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот. В частности, полезные фрагменты полипептида включают функциональные домены, включающие связывающие домены, в частности антигенсвязывающие домены, особенно те, где антиген представляет собой эпитоп В7КР1 человека. В случае антитела анти-В7КР1 полезные фрагменты включают, но не ограничены, область СОК, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, участок цепи антитела или только ее вариабельной области, включая две СОК и тому подобное.
Термин специфично связывающийся агент относится к природной или неприродной молекуле, которая специфично связывается с мишенью. Примеры специфично связывающихся агентов включают, но не ограничены, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды. В определенных воплощениях специфично связывающийся агент представляет собой антитело. Термин агент, специфично связывающийся с В7КР1 относится к специфично связывающемуся агенту, который специфично связывает любой участок В7КР1. В определенных воплощениях агент, специфично связывающийся с В7КР1, представляет собой антитело, которое специфично связывается с В7КР1.
Для примера, антитело связывается специфично с мишенью, если меченое антитело может быть конкурентно вытеснено от своей мишени соответствующим немеченым антителом.
Термин иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, используемый здесь, относится к фрагменту полипептида, который содержит, по меньшей мере, СОК-области тяжелых и лег- 7 021669 ких цепей иммуноглобулина. Иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению способен связываться с антигеном. В определенных воплощениях антиген представляет собой лиганд, который специфично связывается с рецептором. В этих воплощениях связывание иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина по изобретению предотвращает связывание лиганда с его рецептором, прерывая биологический ответ в результате связывания лиганда с рецептором. В одном воплощении иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению специфично связывается с В7КР1. Предпочтительно фрагмент специфично связывается с В7КР1 человека.
Термин природный или нативный, используемый здесь и применимый к объекту, относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была преднамеренно модифицирована человеком, является природной. Термин неприродный или ненативный, используемый здесь, относится к веществу, которое не обнаруживается в природе или которое было структурно модифицировано или синтезировано человеком. Например, термин неприродный может относиться к варианту, такому как вариант полинуклеотида, который может быть получен с использованием известных в данной области техники методик мутагенеза, или к варианту полипептида, продуцируемому таким вариантом полинуклеотида. Такие варианты включают, например, варианты, полученные путем замен, делеций или добавлений нуклеотидов, которые могут включать один или более чем один нуклеотид. Варианты полинуклеотида могут быть изменены в кодирующих или некодирующих областях или и в тех и в других. Изменения в кодирующих областях могут вызвать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавления. Особенно надежными из них являются молчащие замены, добавления, делеции и консервативные замены, которые не изменяют свойства и активность антитела В7КР1 по изобретению. Специалист в данной области техники может легко определить, как получить такой вариант, используя методы, известные в данной области техники.
Термин оперативно сцепленный означает, что компоненты, к которым применяют этот термин, находятся во взаимоотношениях, которые позволяют им осуществлять свойственные им функции при подходящих условиях. Например, регуляторная последовательность, оперативно сцепленная с кодирующей последовательностью белка, лигирована с ней таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности белка достигается в условиях, совместимых с транскрипционной активностью этих регуляторных последовательностей.
Термин регуляторная последовательность, используемый здесь, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые могут осуществлять экспрессию, процессинг или внутриклеточную локализацию кодирующих последовательностей, с которыми они оперативно сцеплены. Природа таких регуляторных последовательностей может зависеть от организма-хозяина. В конкретных воплощениях регуляторные последовательности для прокариотов могут включать промоторы, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции. В других конкретных воплощениях регуляторные последовательности для эукариотов могут включать промоторы, содержащие один или множество сайтов распознавания факторов транскрипции, последовательностей транскрипционных энхансеров, последовательностей терминации транскрипции и последовательностей полиаденилирования. В определенных воплощениях регуляторные последовательности могут включать лидерные последовательности и/или последовательности членов гибридной пары.
Термин вектор включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную к переносу в клетку другой нуклеиновой кислоты, с которой он сцеплен. Один тип вектора представляет собой плазмиду, которая относится к кольцевой двунитевой петле ДНК, в которой могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусном геноме. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геноме клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются параллельно с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно сцеплены. Такие векторы упомянуты здесь как рекомбинантные экспрессионные векторы (или просто экспрессионные векторы). Обычно экспрессионные векторы, полезные в практике методик рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее распространенно используемой формой вектора. Однако в изобретение следует включать такие другие формы экспрессионных векторов, как вирусные векторы (например, ретровирусы, дефектные по репликации, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Выражение рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) включает клетку, в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Специалистам в данной области техники понятно, что такие термины следует относить не только к конкретной клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут встречаться в последующих поколениях вследствие
- 8 021669 либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство фактически может не быть идентичным родительской клетке, но все же включено в объем термина клетка-хозяин, используемого здесь. Для экспрессии антител по настоящему изобретению можно использовать широкое разнообразие экспрессионных систем-хозяев, включая экспрессионные системы бактерий, дрожжей, бакуловирусов и млекопитающих (а также экспрессионные системы фагового дисплея). Примером подходящего вектора для бактериальной экспрессии является рИС19. Чтобы экспрессировать антитело рекомбинантным путем, клетку-хозяина трансфецируют одним или более чем одним рекомбинантным экспрессионным вектором, несущим фрагменты ДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина этого антитела таким образом, что эти легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине и могут секретироваться в среду, в которой культивируют эти клетки-хозяева и из которой могут быть выделены эти антитела. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК используют для получения генов тяжелой и легкой цепи антитела, включения этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения этих векторов в клетки-хозяева, например, описаны в публикациях ЗатЬгоок с1 а1. (2001, МОЬЕСиЬЛК ί.ΈΘΝΙΝΟ. А ЬАВОКАТОКУ ΜΑΝυΑΕ, Со1й δρτίη§ НагЬог ЬаЬогаФйек, Аи8иЬе1, Р.М. с1 а1. (ейк.), СиККЕЭТ РКОТОСОЬЗ ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬООУ, Огеепе РиЬЬкЫпд АккошаКк, (1989) и патенте США 4816397 авторов Вокк е! а1.).
Термин трансдукция используют по отношению к переносу генов от одной бактерии к другой, обычно посредством фага. Трансдукция также относится к приобретению и переносу эукариотических клеточных последовательностей посредством ретровирусов.
Термин трансфекция используют по отношению к захвату чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, и клетка трансфецирована, когда экзогенная ДНК введена внутрь клеточной мембраны. Ряд методик трансфекции хорошо известен в данной области техники и раскрыт здесь (см., например, публикации ОгаЬат е! а1., 1973, УЬо1о§у 52: 456; ЗатЬгоок е! а1., 2001, МОЬЕСиЬАК СЬО№^, А ЬАВОКАТОКУ МАХиАЕ, Со1й Зрппу НагЬог ЬаЬогаФйек; Озмк е! а1., 1986, ВАЗ1С МЕТНООЗ ΙΝ МОЬЕСиЬАК ВЮЬООУ, ЕНеу1ег; и СЬи е! а1., 1981, Оепе 13: 197). Такие методики можно использовать для введения одного или более чем одного экзогенного фрагмента ДНК в подходящие клетки-хозяева.
Термин трансформация, используемый здесь, относится к изменению в генетических характеристиках клетки, и клетка трансформирована, когда ее модифицируют таким образом, чтобы она содержала новую ДНК. Например, клетка трансформирована, если она генетически модифицирована из ее нативного состояния. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может рекомбинировать с ДНК клетки путем физической интеграции в хромосому клетки, либо может временно поддерживаться в виде эписомного элемента без репликации, либо может реплицироваться независимо в виде плазмиды. Клетку считают стабильно трансформированной, когда ДНК реплицируется при делении клетки.
Термин антиген относится к молекуле или участку молекулы, которые способны к связыванию избирательно связывающим агентом, таким как антитело, и дополнительно способны к использованию у животного для продуцирования антител, способных к связыванию с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или более чем один эпитоп.
В определенных воплощениях варианты антитела включают варианты гликозилирования, где число и/или тип сайта гликозилирования изменены по сравнению с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В определенных воплощениях варианты белка включают большее или меньшее число Ν-связанных сайтов гликозилирования, чем нативный белок. Ν-связанный сайт гликозилирования характеризуется последовательностью Акп-Хаа-Зег или Акп-Хаа-ТЬг, где аминокислотный остаток, обозначенный как Хаа, может представлять собой любой аминокислотный остаток, за исключением пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает потенциально новый сайт для присоединения Ν-связанной углеводной цепи. Альтернативно замены, которые элиминируют эту последовательность, удаляют существующую Ν-связанную углеводную цепь. Также обеспечивается перегруппировка Ν-связанных углеводных цепей, где удаляют один или более чем один Νсвязанный сайт гликозилирования (обычно тот, который является природным) и создают один или более чем один новый Ν-связанный сайт. Дополнительные варианты антитела включают варианты цистеина, где один или более чем один остаток цистеина делетируют или заменяют другой аминокислотой (например, серином) по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Варианты цистеина могут быть полезны, когда антитела должны быть повторно уложены в биологически активную конформацию, например, после выделения нерастворимых телец включения. Варианты цистеина обычно имеют меньше остатков цистеина, чем нативный белок, и обычно имеют четное число, чтобы минимизировать взаимодействия за счет неспаренных остатков цистеина.
В дополнительных воплощениях варианты антитела могут включать антитела, содержащие модифицированный фрагмент Рс или модифицированную константную область тяжелой цепи. Фрагмент Рс, что означает фрагмент, который кристаллизуется, или константная область тяжелой цепи могут быть модифицированы посредством мутации, чтобы придать антителу измененные характеристики связывания (см., например, публикации Вийоп апй \УооЕ 1992, Айуапсек ш 1ттипо1оду 51: 1-84; Кауе!сЬ апй Во11апй, 2001, Аппи. Кеу. 1ттипо1. 19: 275-90; ЗНе1Й8 е! а1., 2001, 1оигпа1 оЕ Вю1. СЬет. 276: 6591-6604; Те11етап апй 1ип§Ьапк, 2000, 1ттипо1оду 100: 245-251; Мейекап е! а1., 1998, Еиг. I. 1ттипо1. 28: 2092- 9 021669
2100; все из которых включены здесь путем ссылки). Такие мутации могут включать замены, добавления, делеции или любую их комбинацию, и типично их получают путем сайт-направленного мутагенеза с использованием одного или более чем одного мутагенного олигонуклеотида(ов) согласно методам, описанным здесь, а также согласно методам, известным в данной области техники (см., например, публикации 8атЬгоок е! а1., МОБЕСОТАР СРОМХС: А ЬАВОРАТОР¥ ΜΑΝυΑΣ, 3гб Еб., 2001, Со1б 8ρτίη§ НагЬог, Ν.Υ. и Вегдег апб Кттте1, МЕТНОЭ8 ΙΝ ЕЫ2УМОЕОС¥, νοί. 152, Сшбе !о Мо1еси1аг С1отпд Тескпкщех. 1987, Асабетю Рге88, 1пс., 8ап Э1едо, СА., которые включены здесь путем ссылки).
Согласно определенным воплощениям аминокислотные замены могут (1) уменьшать чувствительность к протеолизу, (2) уменьшать чувствительность к окислению, (3) изменять связывающее сродство и/или (4) придавать или изменять другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. Согласно определенным воплощениям единичные или множественные замены аминокислот (в определенных воплощениях консервативные замены аминокислот) могут быть произведены в природной последовательности (в определенных воплощениях в участке полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярные контакты). В определенных воплощениях консервативная аминокислотная замена обычно существенно не изменяет структурные характеристики исходной последовательности (например, замененная аминокислота должна разрушать или иметь тенденцию к разрушению вторичной структуры, которая характеризует исходную последовательность, такой как спираль). Примеры вторичных и третичных полипептидных структур, известных в данной области техники, описаны в публикациях РРОΤΕΙΝ8, 8ТКиСТиКЕ8 А\1) МОБЕСОТАР РРЮТ1РРЕ8 ((СгещПюп. Еб.), 1984, ^.Н. Ртеетап апб Сотрапу, \еи ¥огк; 1\ТРОШ;СТ1О\ ТО РРОТЕШ 8ТРиСТОТЕ (С. Вгапбеп апб 1. Тоо/е. ебз.), 1991, Саг1апб РиЬНкЫпд, Νον ¥огк, Ν.Υ.; и ТкогЩоп е! а1., 1991, М-Лиге 354:105, каждая из которых включена здесь путем ссылки).
Антитело или пептид(ы) антитела относятся к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. В определенных воплощениях связывающие фрагменты продуцируют с помощью методик рекомбинантных ДНК. В дополнительных воплощениях связывающие фрагменты получают путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают, но не ограничены, Р(аЬ), Р(аЬ'), Р(аЬ')2, Ρν и одноцепочечные антитела.
В изобретении предложены антитела, которые включают тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая и легкая цепи вместе образуют антигенсвязывающую структуру, способную к специфичному связыванию В7РР1. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области УН и три домена константной области, СН1, СН2 и СН3. Домен УН находится на аминоконце полипептида, а домен СН3 находится на карбоксильном конце. Термин тяжелая цепь, используемый здесь, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области Уь и домен константной области Сь. Подобно тяжелой цепи домен вариабельной области легкой цепи находится на аминоконце полипептида. Термин легкая цепь, используемый здесь, охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. Фрагмент Р(аЬ) состоит из одной легкой цепи и СН1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Р(аЬ) не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Фрагмент Р(аЬ') содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую часть константной области между доменами СН1 и СН2, так что между двумя тяжелыми цепями может быть образована межцепочечная дисульфидная связь с образованием молекулы Р(аЬ')2. Область Ρν включает вариабельные области, как от тяжелых, так и от легких цепей, но не имеет константных областей. Одноцепочечные антитела представляют собой молекулы Ρν, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединены гибким линкером с образованием единой полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область. Одноцепочечные антитела обсуждены подробно в международной заявке на патент, номер публикации \УО 88/01649, а также в патентах США № 4946778 и 5260203.
Двухвалентное (нормальное) антитело, иное чем полное или многофункциональное антитело, в определенных воплощениях понимают как содержащее сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность.
При оценке связывания и специфичности антитела согласно изобретению антитело существенно ингибирует адгезию лиганда к рецептору, когда избыток антитела уменьшает количество лиганда, связанного с рецептором, по меньшей мере примерно на 20%, 40%, 60%, 80%, 85% или более (как измерено, среди прочего, с использованием конкурентных анализов связывания щ νίΙΐΌ).
Под нейтрализующим антителом понимают молекулу антитела, которая способна блокировать или существенно снижать функцию эффектора целевого антигена, с которым она связывается. Соответственно, нейтрализующее антитело анти-В7РР1 способно блокировать или существенно снижать функцию эффектора В7РР1, такую как связывание рецептора и/или формирование клеточного ответа. Существенно снижать предназначен для обозначения по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85% или по меньшей мере примерно 90% снижения функции эффектора целевого антигена (например, В7РР1 человека).
- 10 021669
Термин эпитоп включает любой сайт на антигене, который способен к специфичному связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. В определенных воплощениях детерминанты эпитопа включают химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных воплощениях могут иметь специфичные трехмерные структурные характеристики и/или специфичные зарядные характеристики. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом. В определенных воплощениях антитело считают специфично связывающим антиген, когда оно предпочтительно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В определенных воплощениях антитело считают специфично связывающим антиген, когда константа диссоциации равновесия равна примерно 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М, 10-12 М или менее чем 10-12 М.
Антитело связывает по существу, тот же эпитоп, что и эталонное антитело, когда эти два антитела распознают идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми методами определения того, связываются ли два антитела с идентичными или пространственно перекрывающимися эпитопами, являются конкурентные анализы связывания, которые могут быть адаптированы ко всем видам различных форматов с использованием либо меченого антигена, либо меченого антитела. Обычно антиген иммобилизуют на субстрате и измеряют способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител, используя радиоактивные изотопы или ферментные метки.
Термин агент используют здесь для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, которые получены из биологических материалов.
Используемые здесь термины метка или меченый относятся к включению обнаружимого маркера, например, путем включения радиоактивно меченой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых группировок, которые могут быть обнаружены с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего обнаружимый маркер, такой как флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер или ферментативная активность, что может быть обнаружено оптическими или колориметрическими методами). В определенных воплощениях метка может также быть терапевтической. Различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов известны в данной области техники и могут быть выгодно использованы в способах, раскрытых здесь. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничены, радиоизотопы или радионуклиды, такие как 3Н, 14С, 15Ν, 35δ, 90Υ, 99тТс, 'ίη. 1251 и 131Ι, флуоресцентные метки (например, флуоресцеинизотиоцианат, или ФИТЦ, родамин или лантаноидные люминофоры), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные метки, гаптеновые метки, такие как биотиниловые группы, и предопределенные эпитопы полипептида, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания вторичных антител, домены, связывающие металлы, или эпитопные метки). В определенных воплощениях метки присоединяют с помощью спейсерных групп (например, (СН2)П, где η < примерно 20) различной длины для уменьшения потенциальных пространственных препятствий.
Термин биологический образец, используемый здесь, включает, но не ограничен, любое количество вещества от живого существа или прежде жившего существа. Такие живые существа включают, но не ограничены, людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных. Такие вещества включают, но не ограничены, кровь, сыворотку, мочу, клетки, органы, ткани, кости, костный мозг, лимфатические узлы и кожу.
Термин фармацевтический агент или лекарственное средство, используемый здесь, относится к химическому соединению или композиции, которые способны вызывать желаемый терапевтический эффект при правильном введении пациенту. Выражение фармацевтически эффективное количество при ссылке на фармацевтическую композицию, содержащую одно или множество антител по изобретению, согласно изобретению понимают как означающее количество указанной фармацевтической композиции, которое способно прекращать у пациента снижение порога чувствительности к внешним стимулам с возвратом этого порога чувствительности к уровню, сравнимому с наблюдаемым у здоровых субъектов.
Расстройство представляет собой любое состояние, при котором благоприятно лечение согласно настоящему изобретению. Расстройство и состояние используют здесь взаимозаменяемо, и они включают хронические и острые расстройства иммунной системы или заболевания иммунной системы, обусловленные неадекватным иммунным ответом, включая такие патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому расстройству. Ряд состояний и расстройств, при которых благоприятно лечение согласно настоящему изобретению, описан, например, в международной заявке на патент РСТ/υδ 00/01871 (номер публикации АО 00/46240), описание которой включено путем ссылки в полном объеме.
Термины заболевание иммунной системы и состояние иммунной системы охватывают любые медицинские состояния или расстройства, обусловленные повышенными уровнями В7РР1, повышенной чувствительностью к В7РР1, или заболевания, опосредованные Т-клетками, включающие, но не ограниченные, аутоиммунное заболевание, приживаемость трансплантата, трансплантацию костного мозга и
- 11 021669 органа, аллосенсибилизацию при переливании крови, синдром токсического шока, заболевания, зависимые от Т-клеток и опосредованные В-клетками, хронические воспалительные заболевания, обусловленные хронической дисфункцией иммунных клеток, лимфопролиферативные расстройства (такие как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема и криоглобулинемии) и рак. Не ограничивающие примеры аутоиммунных заболеваний включают системную красную волчанку, ревматоидный артрит, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), рассеянный склероз, диабет и псориаз. Не ограничивающие примеры хронических воспалительных заболеваний включают воспалительное кишечное заболевание (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), болезнь Грейвса, тиреоидит Хасимото и сахарный диабет.
Термины заболевание иммунной системы и состояние иммунной системы также охватывают любое клиническое состояние, которое можно облегчить посредством ингибирования продуцирования антитела, такое как аллергические реакции. Аллергические реакции могут быть вызваны, например, сенной лихорадкой, аллергиями, астмой, атопией и острым отеком. Не ограничивающие примеры заболеваний, которые вызывают опосредованные антителами аллергические реакции, включают системную красную волчанку, артрит (такой как ревматоидный артрит, реактивный артрит, псориатический артрит), нефропатии (такие как гломерулонефрит, мембранная, мезангиокапиллярная, фокально-сегментарная, фокально-некротическая, полулунная и пролиферативная нефропатии, например, тубулярные нефропатии), кожные расстройства (такие как пемфигус и пемфигоид, узловатая эритема), заболевания желез внутренней секреции (такие как тиреоидит, болезнь Грейвса, болезнь Хасимото, инсулинозависимый сахарный диабет), различные пневмопатии (такие как экзогенный аллергический альвеолит), различные вазопатии, целиакию, заболевания, обусловленные аберрантным продуцированием 1дА, многие анемии и тромбоцитопении, синдром Г ийена-Барре и тяжелую миастению.
Используемые здесь термины эффективное количество и терапевтически эффективное количество при использовании по отношению к наполнителю или фармацевтической композиции, содержащей одно или более чем одно человеческое антитело против В7КР1 человека, относятся к количеству или дозировке, которые достаточны для получения желаемого результата (то есть, где для терапии с носителем или человеческими антителами против В7КР1 человека по настоящему изобретению желаемым результатом является, например, желаемое модулирование Т-клеточных ответов) или для поддержания наблюдаемого снижения уровня одной или более чем одной биологической активности В7КР1. Более конкретно терапевтически эффективное количество представляет собой количество человеческого антитела(антител) против В7КР1 человека, достаточное для ингибирования в течение некоторого периода времени одного или более чем одного клинически определенного патологического процесса, обусловленного рассматриваемым состоянием, например, иммунных расстройств и заболеваний, у субъекта, которого лечат этим агентом ίη νίνο. В настоящем изобретении эффективное количество антитела антиВ7КР1 может модулировать Т-клеточные ответы у пациента. В способах по настоящему изобретению термин контроль и его грамматические варианты используют по отношению к предупреждению, частичному или полному ингибированию, уменьшению, задержке или замедлению нежелательного события, например, иммунного ответа. Эффективное количество может варьировать в зависимости от конкретного выбранного носителя или человеческого антитела (антител) против В7КР1 человека, а также зависит от разнообразия факторов и условий, связанных с субъектом, подлежащим лечению, и от тяжести расстройства. Например, если носитель или человеческое антитело(а) против В7КР1 человека нужно вводить ίη νίνο, среди прочего следует учитывать такие факторы, как возраст, массу и состояние здоровья пациента, а также кривые доза-ответ и данные по токсичности, полученные в доклинических испытаниях на животных. Если агент нужно приводить в контакт с клетками ίη νίίτο, можно также разработать разнообразные доклинические исследования ίη νίίτο, чтобы оценить такие параметры, как всасывание, период полувыведения, дозу, токсичность и т.д. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества для данного агента находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники.
Используемые здесь термины В7-связанный белок-1 и В7КР1 определены как все виды нативной последовательности В7КР1 млекопитающих, которая описана в международной заявке на патент, номер публикации ТОО 00/46240, которая включена здесь путем ссылки.
Используемые здесь термины по существу, чистый или по существу, очищенный означает соединение или тип молекулы, которые составляют преобладающий присутствующий тип (то есть на молярной основе они составляют большее количество, чем любые другие индивидуальные типы молекул в композиции). В определенных воплощениях, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, где тип молекул включает по меньшей мере примерно 50 процентов (на молярной основе) всех присутствующих типов макромолекул. В определенных воплощениях, по существу, чистая композиция содержит более чем примерно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% всех типов макромолекул, присутствующих в композиции. В определенных воплощениях тип молекул очищают до существенной однородности (загрязняющие типы молекул не могут быть обнаружены в композиции общепринятыми методами обнаружения), где эта композиция состоит, по существу, из единственного типа макромолекул.
Термин пациент включает субъектов человека и животных.
- 12 021669
Лечение или лечить относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже страдает расстройством, а также тех, кто склонен к этому расстройству, или тех, у кого нужно предупреждать это расстройство.
Если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают термины во множественном числе, а термины во множественном числе включают термины в единственном числе.
Согласно определенным воплощениям изобретения антитела, направленные на В7КР1, можно применять для лечения расстройств иммунной системы и заболеваний иммунной системы, включая, но не ограничиваясь ими, упомянутые выше.
В одном аспекте изобретения предложены полностью человеческие моноклональные антитела, вызванные против В7КР1 человека и обладающие биологической и иммунологической специфичностью связывания с ним. В другом аспекте в изобретении предложены нуклеиновые кислоты, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности для тяжелых и легких цепей молекул иммуноглобулина, в частности последовательности, соответствующие их вариабельным областям. Конкретные воплощения данного аспекта изобретения представляют собой последовательности, соответствующие гипервариабельным участкам (СЭВ), а именно СОВ1-СЭВ3. тяжелых и легких цепей, предложенных изобретением. Еще в одном аспекте в изобретении предложены клетки и клеточные линии гибридом, которые экспрессируют молекулы иммуноглобулина и антитела, такие как моноклональные антитела по изобретению. В изобретении также предложены биологически и иммунологически очищенные препараты антител, таких как моноклональные антитела, вызванные против В7ВР1 человека и обладающие биологической и иммунологической специфичностью связывания с ним.
Возможность клонировать и реконструировать человеческие локусы размера мегабаз в искусственных хромосомах дрожжей (УАС) и вводить их в эмбриональные линии мыши обеспечивает выгодный подход к объяснению роли функциональных компонентов очень больших или грубо картированных локусов, а также для создания полезных моделей заболевания человека. Кроме того, использование такой технологии для замены локусов мыши их человеческими эквивалентами обеспечивает уникальные возможности проникновения в суть экспрессии и регуляции человеческих генных продуктов в процессе развития, их взаимодействия с другими системами и их вовлеченность в возникновение и прогрессирование заболевания.
Важным практическим применением такой стратегии является гуманизация гуморальной иммунной системы мыши. Введение локусов иммуноглобулина человека (1д) в мышей, у которых инактивированы эндогенные гены 1д, дает возможность изучить механизмы, лежащие в основе программируемой экспрессии и сборки антител, а также их роли в развитии В-клеток. Кроме того, такая стратегия предоставляет источник получения полностью человеческих моноклональных антител (тАЬ).
Термин человеческое антитело включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, существенно соответствующие последовательностям иммуноглобулина гаметического типа человека. В определенных воплощениях антитела человека получают в млекопитающих, кроме человека, включая, но не ограничиваясь, грызунов, таких как мыши и крысы, а также зайцеобразных, таких как кролики. В определенных воплощениях человеческие антитела продуцируют в клетках гибридом. В определенных воплощениях человеческие антитела получают рекомбинантным путем.
Термин рекомбинантный в отношении антитела включает антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами. Репрезентативные примеры включают антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфецированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулина человека (см., например, Тау1ог е! а1., 1992, Ыис1. Ашбк Кек. 20: 6287-6295); или антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены любыми способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, образованные из последовательностей иммуноглобулина человека гаметического типа.
Антитела человека имеют по меньшей мере три преимущества перед нечеловеческими и химерными антителами при применении в терапии человека
1) поскольку эффекторный участок антитела является человеческим, он может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, более эффективно разрушать клеткимишени за счет комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЭСС));
2) иммунная система человека не должна распознавать антитело человека как чужеродное, и поэтому ответ антитела против такого инъецированного антитела должен быть меньше, чем против полностью чужеродного нечеловеческого антитела или частично чужеродного химерного антитела;
3) сообщали, что инъецированные нечеловеческие антитела обладают значительно более коротким периодом полувыведения в системе кровообращения человека, чем период полувыведения антител человека. Инъецированные антитела человека будут иметь период полувыведения, по существу, идентичный антителам человека естественного происхождения, позволяя давать меньшие и менее частые дозы.
- 13 021669
Таким образом, полностью человеческие антитела, как ожидают, минимизируют иммуногенные и аллергические ответы, свойственные мышиным шЛЬ или шЛЬ мышиного происхождения, и таким образом увеличат эффективность и безопасность вводимых антител. Полностью человеческие антитела по изобретению, следовательно, можно применять при лечении заболеваний и расстройств, обусловленных неадекватным иммунным ответом, лечение которых требует повторного введения антитела. Таким образом, одно из конкретных преимуществ антител анти-В7КР1 по изобретению состоит в том, что эти антитела являются полностью человеческими, и их можно вводить пациентам неострым методом, при этом сводя к минимуму неблагоприятные реакции, обычно связанные с антителами человека против мыши или с другими ранее описанными не полностью человеческими антителами, полученными из вида, кроме человека.
Специалист в данной области техники может сконструировать линии мыши, дефектные по продуцированию антител мыши, с большими фрагментами локусов 1д человека, так что такие мыши продуцируют человеческие антитела в отсутствие мышиных антител. Большие фрагменты 1д человека могут сохранять большое разнообразие вариабельных генов, а также правильную регуляцию продуцирования и экспрессии антител. В результате использования мышиных клеточных механизмов для диверсификации и селекции антитела, а также отсутствия иммунологической толерантности к человеческим белкам воспроизведенный спектр антител человека в этих линиях мыши дает антитела с высоким сродством против любого интересующего антигена, включая антигены человека. Используя гибридомную технологию, можно продуцировать и отбирать специфичные человеческие тАЬ желаемой антигенной специфичности.
Трансгенных животных (например, мышей) можно также использовать для продуцирования антител человека в отсутствие эндогенного продуцирования иммуноглобулина. Например, перенос ряда генов иммуноглобулина человека гаметического типа в зародышевые линии таких мутантных мышей приводит в результате к продуцированию антител человека после антигенной стимуляции (см., например, публикации 1акоЬоуЙ8 εΐ а1., 1993, Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб δει. υδΑ 90: 2551-2555; .ТакоЬоуИь εΐ а1., 1993, ИаШге 362: 255-258; Вгиддетаии еΐ а1., 1993, Уеат ίη 1ттип. 7: 33, 1994, ИаШге 148: 1547-1553 и 1996, ИаШге Вю1ес1то1оду 14: 826; Ото88 еΐ а1., 2000, ИаШге 404:995-999; а также патенты США № 5877397, 5874299, 5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126, 5569825 и 5545806 (каждая из которых полностью включена здесь путем ссылки для всех целей)). Антитела человека можно также продуцировать в библиотеках фагового дисплея (НоодепЬоот апб ХУиНег. 1992, ί. Мо1. Вю1. 227: 381; Матке еΐ а1., 1991, ί. Мо1. Вю1. 222: 581). Методы Со1е еΐ а1. и Воегпег еΐ а1. также доступны для получения моноклональных антител человека (Со1е εΐ а1., 1985, \Ю\ОС1.О\А1. ΑΝΤΙΒΟΌΙΕδ ΑΝΏ САИСЕК ТНЕКАРУ А1ап К. Είδδ, р. 77; и Воегпег еΐ а1., 1991, I. 1ттипо1. 147: 86-95).
Рекомбинантные антитела человека также могут быть подвергнуты мутагенезу ш уПго (или, когда используют животное, трансгенное по последовательностям 1д человека, то соматическому мутагенезу ш У1уо), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей УН и Уъ рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя имеют происхождение от последовательностей, родственных последовательностям человеческих УН и Уъ гаметического типа, могут не существовать в природе в спектре человеческих антител гаметического типа ш У1уо.
В определенных воплощениях специалист в данной области техники может использовать константные области от видов, отличных от человека, параллельно с человеческой вариабельной областью(ями) в таких мышах для продуцирования химерных антител.
Антитело двойной специфичности или гетеровалентное антитело типично представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжелой цепи/легкой цепи и два различных сайта связывания. Антитела двойной специфичности могут быть получены разнообразными методами, включая, но не ограничиваясь, слияние гибридом или сшивание фрагментов Р(аЬ') (см., например, δоηд8^ν^1а^ & ЬасЬтапп, 1990, С1т. Ехр 1ттипо1. 79: 315-321; Κо8ΐе1ηу еΐ а1., 1992, I. 1ттипо1. 148: 15471553).
В изобретении предложены антитела, которые связываются с В7КР1 человека. Эти антитела могут быть получены путем иммунизации полноразмерным В7КР1 или его фрагментами. Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными и/или могут представлять собой рекомбинантные антитела. В предпочтительных воплощениях антитела по изобретению представляют собой антитела человека, полученные, например, путем иммунизации трансгенных животных, способных к продуцированию антител человека (см., например, международную заявку на патент, номер публикации УО 93/12227).
Гипервариабельные участки (СИК) вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител анти-В7КР1 по изобретению могут быть привиты к каркасным областям (РК) того же или другого вида. В определенных воплощениях СИК вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антитела антиВ7КР1 могут быть привиты к согласованным человеческим областям РК. Для создания согласованных человеческих областей РК области РК от нескольких аминокислотных последовательностей тяжелых цепей или легких цепей человека выравнивают для идентификации согласованной аминокислотной последовательности. Области РК тяжелой цепи или легкой цепи антитела анти-В7КР1 могут быть замене- 14 021669 ны областями РК от другой тяжелой цепи или легкой цепи. Редкие аминокислоты в областях РК тяжелых и легких цепей антитела анти-В7КР1 обычно не заменяют, хотя остальные аминокислоты области РК могут быть заменены. Редкие аминокислоты представляют собой специфичные аминокислоты, которые находятся в положениях, в которых они обычно не находятся в областях РК. Привитые вариабельные области от антител анти-В7КР1 по изобретению можно использовать с константной областью, которая отличается от константной области антитела анти-В7КР1. Альтернативно, привитые вариабельные области составляют часть одноцепочечного антитела Ρν. Прививание СОК описано, например, в патентах США № 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101, которые включены здесь путем ссылки для любой цели.
Антитела по изобретению могут быть получены с использованием трансгенных мышей, у которых существенная часть локуса, продуцирующего антитело человека, встроена в клетки мышей, продуцирующие антитело, и у которых, кроме того, генно-инженерным путем сконструирован дефицит по продуцированию эндогенных мышиных антител. Такие мыши способны к продуцированию молекул иммуноглобулина и антител человека и не продуцируют или продуцируют существенно сниженные количества молекул иммуноглобулина и антител мыши. Технологии, используемые для достижения этого результата, раскрыты в патентах, заявках и ссылках, приведенных в данном описании. В определенных воплощениях специалист в данной области техники может использовать методы, раскрытые в международной заявке на патент, номер публикации \УО 98/24893, которая включена здесь путем ссылки для любой цели (см. также публикацию Мепбе/ е1 а1., 1997, №Гиге Сепебск 15:146-156, которая включена здесь путем ссылки для любой цели).
Моноклональные антитела (тАЬ) по изобретению могут быть получены разнообразными методами, включая общепринятую методологию моноклональных антител, например стандартную методику соматической гибридизации клеток КоЫег апб МПкГеш (1975, №Циге 256: 495). Можно использовать другие методы продуцирования моноклональных антител, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов.
Примерной животной системой для получения гибридом является мышь. Получение гибридомы у мыши известно в данной области техники, и протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния также известны в данной области техники. Сливающиеся клетки (например, клетки миеломы мыши) и методы слияния также известны.
В определенном воплощении моноклональные антитела человека, направленные против В7КР1, могут быть получены с использованием трансгенных мышей, вероятнее несущих части иммунной системы человека, чем систему мыши. Эти трансгенные мыши, упоминаемые здесь как мыши НиМаЬ, содержат минилокус генов иммуноглобулина человека, который кодирует не перегруппированные последовательности тяжелой (μ и γ) и κ-легкой цепи иммуноглобулина человека, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют локусы эндогенных μ- и κ-цепей (ЬопЬегд е1 а1., 1994, №Гиге 368: 856859). Соответственно, эти мыши проявляют сниженную экспрессию 1дМ или κ-цепи мыши, и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепи человека претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием моноклональных антител 1дС к человеку с высоким сродством (ЬопЬегд е1 а1., см. выше; ЬопЬегд апб Нн5/аг. 1995, 1пГегп. Кем. 1ттипо1. 13: 65-93; Нагбшд апб ЬопЬегд, 1995, Апп. ΝΥ. Асаб. δα. 764:536-546). Получение НиМаЬ мышей подробно описано в публикациях (см. Тау1ог еГ а1., 1992, ШсШс Аабк Ке8. 20: 6287-6295; Скеп еГ а1., 1993, 1пГегпакопа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп еГ а1., 1994, I. 1ттипо1. 152: 2912-2920; ЬопЬегд еГ а1., 1994, №Циге 368: 856-859; ЬопЬегд, 1994, НапбЬоок о£ Ехр. Ркагтасо1оду 113: 49-101; Тау1ог еГ а1., 1994, 1пГегпакопа1 1ттипо1оду 6: 579-591; ЬопЬегд & Ник/аг 1995, 1пГет. Кем. 1ттипо1. 13: 65-93; Нагбшд & ЬопЬегд, 1995, Апп. Ν.Υ. Асаб. 8с1 764: 536-546; р15кМ1б еГ а1., 1996, №Циге ВюГескпо1оду 14: 845-851, содержание которых включено здесь путем ссылки в полном объеме). См. дополнительно патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все от авторов ЬопЬегд и Кау, а также патент США 5545807, διικπιί еГ а1.; международные заявки на патент, номер публикации \УО 93/1227, опубликована 24 июня 1993; \УО 92/22646, опубликована 23 декабря 1992; и \УО 92/03918, опубликована 19 марта 1992, описание которых для всех включено здесь путем ссылки в их полном объеме. Альтернативно, трансгенные линии мышей, описанные в примерах ниже, можно использовать для получения человеческих антител против В7КР1 человека.
В настоящем изобретении предложены человеческие моноклональные антитела, которые являются специфичными к биологически активным полипептидам В7КР1 человека и нейтрализуют их. Также предложены аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи антитела, которые являются высокоспецифичными к полипептидам В7КР1 и нейтрализуют их при связывании с ними. Эта высокая специфичность обеспечивает эффективную иммунотерапию для заболеваний, связанных с В7КР1, человеческими антителами против В7КР1 человека и моноклональными антителами человека с подобной специфичностью.
В одном аспекте в изобретении предложены изолированные антитела человека, которые связываются с тем же или, по существу, с тем же эпитопом, что и предложенное здесь антитело 16Н.
- 15 021669
В одном аспекте в изобретении предложены изолированные антитела человека, включающие по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, представленных в последовательностях §ЕЦ ГО N0: 1-40 или 44-58, которые связываются с эпитопом полипептида В7РР1 с высоким сродством и обладают способностью антагонизировать активность полипептида В7РР1. Эти антитела могут связаться с тем же или, по существу, с тем же эпитопом, что и антитела анти-В7КР1, показанные здесь в примерах.
В определенных воплощениях изолированные антитела связываются с полипептидом В7КР1 с константой диссоциации (Кс), примерно равной 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М или менее, и ингибируют индуцированное В7КР1 выживание в анализе нейтрализации ίη νίΐτο со значением ЕС50, примерно равным 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М или менее. Примеры человеческих антител против В7КР1 человека, которые соответствуют вышеупомянутым критериям связывания и нейтрализации, представлены здесь.
В определенных воплощениях человеческие антитела против В7РР1 человека по изобретению упоминаются здесь как 16Н, 16Нд (гаметический тип), 5Ό, 2Н, 2Нд (гаметический тип), 15Н, 41Н и 43Н. Антитело 16Н включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 7 и §ЕЦ ГО N0: 1, соответственно. Антитело 16Нд включает полипептидные последовательности вариабельной области легкой цепи (Уъ) и вариабельной области тяжелой цепи (УН), как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 и §ЕЦ ГО N0: 8 соответственно. Антитело 5Ό включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 2 и §ЕЦ ГО N0: 9 соответственно. Антитело 2Н включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 3 и §ЕЦ ГО N0: 10 соответственно. Антитело 2Н§ включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 3 и §ЕЦ ГО N0: 11 соответственно. Антитело 15Н включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 4 и §ЕЦ ГО N0: 12 соответственно. Антитело 41Н включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 5 и §ЕЦ ГО N0: 13 соответственно. Антитело 43Н включает полипептидные последовательности Уъ и УН, как представлено в последовательности §ЕЦ ГО N0: 6 и §ЕЦ ГО N0: 14 соответственно. Свойства человеческих антител против В7КР1 человека по настоящему изобретению конкретно раскрыты в примерах. Особенно примечательно высокое сродство к полипептиду В7КР1 и высокая способность к антагонизации активности полипептида В7КР1, как продемонстрировано здесь.
Константа диссоциации (Кс) человеческого антитела против В7КР1 человека может быть определена с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии, описанной в общих чертах в примерах ниже. Обычно при анализе с применением поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии в реальном масштабе времени измеряют связывающие взаимодействия между лигандом (рекомбинантным полипептидом В7РР1, иммобилизованным на матрице биодатчика) и анализируемым веществом (антителами в растворе) с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии (ППР спектроскопии) с использованием системы В1Асоге® (РЬагтааа Вюкепког, РксаЦпуау, N1). Анализ с применением поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии также может быть выполнен путем иммобилизации анализируемого вещества (антител на матрице биодатчика) и презентирования лиганда (рекомбинантного У в растворе). Константу диссоциации (Кс) человеческого антитела против В7РР1 человека также можно определить с использованием методологии К1пЕхА. В определенных воплощениях изобретения антитела связываются с В7КР1 с Кс, примерно равной 10-5 М, 10-6 М, 10-7 М, 10-8 М, 10-9 М, 10-10 М, 10-11 М или 10-12 М. Термин Кс, используемый здесь, следует относить к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Для целей настоящего изобретения Кс определяли, как показано в примерах ниже.
В определенных воплощениях антитела по изобретению относятся к изотипу 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4. Антитела могут относиться к изотипу 1дО2 или 1дО1. В других воплощениях антитела по изобретению могут относиться к изотипу 1дМ, 1§А, 1дЕ или ί§ϋ. В определенных воплощениях изобретения антитела включают легкую цепь каппа и тяжелую цепь ί§01, ί§02, 1дС3 или 1дС4 человека. Экспрессия антител по изобретению, включающих константную область тяжелой цепи ί§01 или ί§02, описана в примерах ниже. В конкретных воплощениях вариабельные области антител лигированы с константной областью, отличной от константной области для изотипа ί§01, ί§02, ί§03 или ί§04. В определенных воплощениях антитела по изобретению клонированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
В определенных воплощениях в результате консервативных модификаций тяжелых цепей и легких цепей антител анти-В7РР1 (и соответствующих модификаций кодирования нуклеотидов) получают антитела анти-В7РР1, обладающие функциональными и химическими характеристиками, подобными таковым для антител анти-В7РР1, раскрытых здесь. Напротив, существенные модификации функциональных и/или химических характеристик антител анти-В7КР1 могут быть выполнены путем отбора замен в аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей, которые значительно отличаются по своему воздействию на сохранение (а) структуры молекулярного каркаса в области замещения, например, в виде пластинчатой или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (в) объема боковой цепи.
- 16 021669
Например, консервативная аминокислотная замена может включать замену нативного аминокислотного остатка ненативным остатком таким образом, что эффект на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении является небольшим или отсутствует. Кроме того, любой нативный остаток в полипептиде может быть также заменен аланином, как описано ранее для сканирующего аланином мутагенеза.
Аминокислотные замены (консервативные или неконсервативные) могут быть определены специалистом в данной области техники тогда, когда такие замены желательны. В определенных воплощениях аминокислотные замены можно использовать для идентификации тех аминокислотных остатков антитела анти-В7КР1, которые вовлечены в специфичность связывания и/или сродство антитела к В7КР1 (например, остатки, которые вовлечены в связывание антитела с конкретным эпитопом), таких как аминокислотные остатки в СГОК1, СЭК2 и/или СЭК3 областях легких или тяжелых цепей, как описано здесь. Такие аминокислотные замены могут увеличить или уменьшить сродство антител анти-В7КР1, описанных здесь.
Минорные изменения в аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, немногих или даже нескольких аминокислот могут привести к аллельной форме исходного белка, которая обладает, по существу, идентичными свойствами. Поэтому, в дополнение к антителам, конкретно описанным здесь, другие по существу, гомологичные антитела могут быть легко сконструированы и изготовлены с использованием различных методов рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам в данной области техники. Вообще, модификации генов могут быть легко осуществлены разнообразными хорошо известными способами, такими как сайт-направленный мутагенез. Поэтому в настоящем изобретении рассмотрены вариантные или мутантные человеческие антитела антиВ7КР1, обладающие характеристиками, по существу, подобными человеческим антителам анти-В7КР1, раскрытым здесь (см., например, публикацию АО 00/56772, которая включена здесь путем ссылки полностью). Таким образом, термин вариантный или мутантный по отношению к человеческому антителу анти-В7КР1 означает любую связывающую молекулу (молекулу X) (ί) в которой гипервариабельные участки СГОК1, СЭК2 и СЭК3 тяжелой цепи или гипервариабельные участки СГОК1, СЭК2 и СЭК3 легкой цепи, взятые вместе, являются по меньшей мере примерно на 80% гомологичными, по меньшей мере примерно на 90% гомологичными или по меньшей мере примерно на 95% гомологичными гипервариабельным участкам, как представлено в последовательностях §ЕЦ ГО N0: 15-8ЕЦ ГО N0: 26 или §ЕЦ ГО N0: 27-8ЕЦ ГО N0: 40 соответственно, и (ίί) где вариант или мутант способны к ингибированию активности В7КР1 человека до такой же степени, что и эталонное человеческое антитело анти-В7КР1, каркасные области которого идентичны таковым молекулы X. Такие антитела могут связываться с В7КР1 человека или с В7КР1 мыши или с тем и с другим. Последовательность В7КР1 мыши описана в публикации АО 00/46240, которая включена путем ссылки.
Обычно вариант человеческого антитела анти-В7КР1 имеет области СОК легкой и/или тяжелой цепи, которые взятые вместе имеют по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в последовательностях §ЕЦ ГО N0: 15-8ЕЦ ГО N0: 26 и/или §ЕЦ ГО N0: 27-8ЕЦ ГО N0: 40 соответственно. Такие антитела могут связываться либо с человеческим В7КР1, либо с мышиным В7КР1, либо с обоими.
Вариант человеческого антитела анти-В7КР1 имеет вариабельную область легкой цепи, которая взятая в целом имеет по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной
- 17 021669 последовательностью, представленной в последовательностях 8ЕО ГО N0: 1-8Е0 ГО N0: 6, и/или вариабельную область тяжелой цепи, которая взятая в целом имеет по меньшей мере примерно 70% идентичности аминокислотной последовательности, по меньшей мере примерно 75% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности или по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в последовательностях 8Е0 ГО N0: 7-8ЕО ГО N0: 14. Такие антитела могут связываться с человеческим В7КР1 и/или с мышиным В7КР1.
Как понятно специалистам в данной области техники, многие из потенциальных остатков, контактирующих с СГОК, поддаются замене другими аминокислотами и при этом позволяют сохранять существенное сродство антитела к антигену. Подобным образом, многие из остатков каркасной области, не находящиеся в контакте с СОК в тяжелых и легких цепях, могут приспособиться к заменам аминокислот из соответствующих положений других антител человека аминокислотами согласованной последовательности человека или из других антител мыши без значительной потери сродства или неиммуногенности человеческого антитела. Можно использовать отбор различных альтернативных аминокислот, чтобы предложить варианты раскрытых антител анти-В7КР1 и их фрагментов, которые имеют варьирующие комбинации сродства, специфичности, отсутствия иммуногенности, легкости изготовления и других желательных свойств.
Вариант по отношению к полинуклеотиду следует относить к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере примерно 75% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. Обычно вариант полинуклеотида имеет по меньшей мере примерно 75% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты или по меньшей мере примерно 99% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты с новой последовательностью нуклеиновой кислоты, раскрытой здесь.
В альтернативных воплощениях антитела по изобретению можно экспрессировать в иных клеточных линиях, чем гибридомные клеточные линии. В этих воплощениях последовательности, кодирующие конкретные антитела, можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающих. Согласно этим воплощениям трансформация может быть достигнута с использованием любого известного метода введения полинуклеотидов в клетку-хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансформацию клетки-хозяина вирусом (или вектором), либо в соответствии с методиками трансфекции, известными в данной области техники, примеры которой приведены в патентах США № 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (все из которых включены здесь путем ссылки для любой цели). Вообще используемая методика трансформации может зависеть от хозяина, подлежащего трансформации. Методы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки мле- 18 021669 копитающих хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничены, трансфекцию, опосредованную декстраном, кальций-фосфатную преципитацию, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, константной области легкой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела анти-В7КР1 по изобретению, встраивают в соответствующий экспрессионный вектор с использованием стандартных методик лигирования. В одном воплощении константную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела анти-В7КР1 присоединяют к С-концу соответствующей вариабельной области и лигируют в экспрессионный вектор. Этот вектор типично выбран таким образом, чтобы он был функциональным в конкретной используемой клетке-хозяине (то есть вектор совместим с клеточным аппаратом клетки-хозяина таким образом, чтобы могла происходить амплификация гена и/или экспрессия гена). Для обзора экспрессионных векторов см. МЕТН0Э8 ГЫ ЕН2УМ0Ь00Υ 185 (Соеййе1, ей., 1990, Асайетю Ртекк).
Как правило, экспрессионные векторы, используемые в любой из клеток-хозяев, содержат последовательности для поддержания плазмиды и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, все вместе называемые фланкирующими последовательностями, в определенных воплощениях обычно включают одну или более чем одну из приведенных ниже нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или более чем одну энхансерную последовательность, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полноразмерную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей экспрессируемый полипептид, и селективный маркерный элемент. Каждая из этих последовательностей обсуждена ниже.
Возможно вектор может содержать последовательность, кодирующую метку, то есть олигонуклеотидную молекулу, расположенную при 5' или 3' конце кодирующей последовательности полипептида антитела анти-В7КР1; эта олигонуклеотидная последовательность кодирует ροΙγΗίκ (такой как ЬехаШк) или другую метку, такую как РЬАС, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или ΜΥΤ', для которых существуют имеющиеся в продаже антитела. Эту метку обычно сливают с полипептидом при экспрессии полипептида, и она может служить средством для аффинной очистки или обнаружения антитела антиВ7КР1 в клетке-хозяине. Аффинную очистку можно осуществлять, например, путем колоночной хроматографии с использованием антител против метки в качестве аффинной матрицы. Возможно метку впоследствии можно удалить из очищенного полипептида антитела анти-В7КР1 различными способами, такими как использование определенных пептидаз для отщепления.
Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (то есть от того же вида и/или линии, что и клетка-хозяин), гетерологичными (то есть от вида или линии, отличных от вида или линии клетки-хозяина), гибридными (то есть комбинацией фланкирующих последовательностей более чем из одного источника), синтетическими или нативными. Источником фланкирующей последовательности как таковым может быть любой прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организм или любое растение при условии, что фланкирующая последовательность функциональна в клетке-хозяине и может быть активирована ее механизмом.
Фланкирующие последовательности, полезные в векторах по данному изобретению, могут быть получены с помощью любого из нескольких методов, хорошо известных в данной области техники. Как правило, фланкирующие последовательности, используемые здесь, предварительно идентифицируют путем картирования и/или переваривания рестрикционной эндонуклеазой и могут, таким образом, быть выделены из соответствующего источника ткани с использованием подходящих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях может быть известна полноразмерная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности. Здесь фланкирующую последовательность можно синтезировать с использованием методов, описанных здесь для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.
Независимо от того, известна вся фланкирующая последовательность или только ее часть, она может быть получена с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или путем скрининга геномной библиотеки подходящим зондом, например фрагментом олигонуклеотидной и/или фланкирующей последовательности из того же или другого вида. Если фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащей фланкирующую последовательность, может быть выделен из большего участка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение можно осуществить путем переваривания рестрикционной эндонуклеазой с получением правильного фрагмента ДНК с последующим выделением, используя очистку из агарозного геля, колоночную хроматографию Цьадеп® (СЬаΐ5№Ο^ΐЬ, СА) или другие методы, известные специалистам в данной области техники. Выбор подходящих ферментов для достижения этой цели легко очевиден для обычного специалиста в данной области техники.
Точка начала репликации обычно представляет собой участок тех прокариотических экспрессион- 19 021669 ных векторов, которые имеются в продаже, и эта точка начала репликации способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Если выбранный вектор не содержит точку начала репликации, ее можно синтезировать химическим путем на основе известной последовательности и лигировать в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды рВЕ322 (Иете Еп§1апй Вю1аЪ8, Веует1у, МА) является пригодной для большинства грамотрицательных бактерий, а различные точки начала репликации вирусов (например, 8У40, вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (У8У) или вирусов папилломы, например НРУ или ВРУ) полезны при клонировании векторов в клетках млекопитающих. Вообще компонент точки начала репликации не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих (например, точку начала репликации 8У40 часто используют только потому, что она также содержит ранний промотор этого вируса).
Последовательность терминации транскрипции обычно располагается в 3' направлении от конца кодирующей области полипептида и служит для терминации транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой О-С-обогащенный фрагмент, за которым следует поли-Т последовательность. Хотя эту последовательность легко клонировать из библиотеки или даже приобрести из коммерческих источников как часть вектора, ее можно также легко синтезировать, используя методы синтеза нуклеиновых кислот, таких как описаны здесь.
Ген селективного маркера кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина в селективной культурной среде. Типичные гены селективных маркеров кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, тетрациклину или канамицину для прокариотических клеток-хозяев; (б) комплементируют ауксотрофные дефициты клетки или (в) поставляют наиболее важные питательные вещества, недоступные из сложных питательных сред или питательных сред определенного состава. Примерами селективных маркеров являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Преимущественно ген устойчивости к неомицину можно также использовать для отбора и в прокариотических, и в эукариотических клетках-хозяевах.
Другие селективные гены можно использовать для амплификации гена, который нужно экспрессировать. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, требуемые для продуцирования белка, наиболее важного для роста или выживания клетки, повторно воспроизводятся в тандеме в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примеры подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают дигидрофолатредуктазу (БИРЕ) и гены тимидинкиназы без промотора. Трансформанты клеток млекопитающих помещают в условия давления отбора, при которых только трансформанты являются уникально адаптированными к выживанию благодаря селективному гену, присутствующему в векторе. Давление отбора прилагают путем культивирования трансформированных клеток в условиях, в которых концентрация селективного агента в среде последовательно возрастает, таким образом, приводя к амплификации как селективного гена, так и ДНК, которая кодирует другой ген, такой как антитело, которое связывается с полипептидом В7ЕР1. В результате с амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества полипептида, например антитела анти-В7ЕР1.
Сайт связывания рибосомы обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-Дальгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты). Этот элемент типично локализован в 3' направлении к промотору и в 5' направлении к кодирующей последовательности экспрессируемого полипептида.
В некоторых случаях, например, если гликозилирование желательно в экспрессионной системе эукариотической клетки-хозяина, можно манипулировать с различными пре- или пропоследовательностями для улучшения гликозилирования или выхода. Например, можно изменить участок отщепления пептидазой конкретного сигнального пептида или добавить пропоследовательности, которые также могут влиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может иметь в положении 1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или более чем одну дополнительную аминокислоту, свойственную экспрессии, которая может не быть полностью удалена. Например, конечный белковый продукт может иметь один или два аминокислотных остатка, обнаруживаемых в сайте отщепления пептидазы, присоединенных к аминоконцу. Альтернативно, использование некоторых сайтов отщепления ферментом может привести к слегка укороченной форме желаемого полипептида, если этот фермент режет в такой области зрелого полипептида.
Векторы экспрессии и клонирования по изобретению обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и оперативно сцеплен с молекулой, кодирующей антитело анти-В7ЕР1. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, расположенные выше (то есть в 5' направлении) от стартового кодона структурного гена (вообще в пределах примерно 100-1000 п.н.), который регулирует транскрипцию структурного гена. Промоторы традиционно относят к одному из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции с ДНК под своим контролем в ответ на некоторое изменение в условиях культивирования, такое как присутствие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. Конститутивные промоторы, с другой стороны, однородно транскрибируют гены, с которыми они оперативно сцеплены, то есть при незначительном контроле или отсутствием кон- 20 021669 троля генной экспрессии. Хорошо известно большое количество промоторов, распознаваемых разнообразными потенциальными клетками-хозяевами. Подходящий промотор оперативно сцеплен с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, включая антитело анти-В7КР1 по изобретению, путем удаления промотора из исходной ДНК путем переваривания ферментом рестрикции и вставки желаемой последовательности промотора в вектор.
Подходящие промоторы для использования с клетками-хозяевами дрожжей также хорошо известны в данной области техники. С промоторами дрожжей преимущественно используют дрожжевые энхансеры. Подходящие промоторы для использования с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны и включают, но не ограничены, промоторы, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы птиц, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и вирус обезьян 40 (§У40). Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например промоторы теплового шока и актиновый промотор.
Дополнительные промоторы, которые могут быть интересны, включают, но не ограничены: ранний промотор 8У40 (Вегио1к! аиб СЬатЬои, 1981, ЫаШге 290: 304-10); промотор СМУ (ТНоткеи е! а1., 1984, Ргос. Νηΐ1. Асаб. δα. υδΑ 81; 659-663); промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (УататоЮ е! а1., 1980, Се11 22: 787-97); промотор тимидинкиназы вируса герпеса (^адиег е! а1., 1981, Ргос. Ν:·ιΐ1. Асаб. δα. υ.δ.Α. 78: 1444-45); промотор и регуляторные последовательности из гена металлотионеина (Вгшк!ег е! а1., 1982, №!иге 296: 39-42) и прокариотические промоторы, такие как промотор бета-лактамазы (УШа-КатагоГГ е! а1., 1978, Ргос. №-Н1. Асаб. δα υ.δ.Λ., 75: 3727-31); или (аспромотор (ЭеВоег е! а1., 1983, Ргос. Ν:·ιΐ1. Асаб δ^. υ.δΑ., 80: 21-25). Также представляют интерес следующие области регуляции транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность и используются в трансгенных животных: регуляторная область гена эластазы I, которая является активной в панкреатических ацинарных клетках (δ\νίΠ е! а1., 1984, Се11 38: 639-46; ОгпП/ е! а1., 1986, Со1б δρτίη§ НагЬог δутρ. Циаи! Вю1. 50: 399-409 (1986); МасПоиа1б, 1987, Нера!о1оду 7: 425-515); регуляторная область гена инсулина, которая активна в панкреатических бета-клетках (НаиаЬаи, 1985, №!иге 315: 115-22); регуляторная область гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (СгокксЬеб1 е! а1., 1984, Се11 38: 647-58; Абатек е! а1., 1985, №Лиге 318: 533-38; А1ехаибег е! а1., 1987, Мо1. Се11. Вю1., 7: 1436-44); регуляторная область вируса опухоли молочной железы мышей, которая активна в клетках семенников, молочной железы, лимфоидных клетках и мастоцитах (Ьебег е! а1., 1986, Се11 45: 485-95); регуляторная область гена альбумина, которая активна в печени (Ршкей е! а1., 1987, Сеиек аиб Эеуе1 1; 268-76); регуляторная область гена альфа-фетопротеина, которая активна в печени (Кгит1аиГ е! а1., 1985, Мо1. Се11 Вю1., 5: 1639-48; Наттег е! а1., 1987, δ^ιτ^ 235: 53-58); регуляторная область гена альфа 1-антитрипсина, которая активна в печени (Ке1кеу е! а1., 1987, Сеиек аиб Эеуе1. 1. 161-71); регуляторная область гена бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Модгат е! а1., 1985, №!иге 315: 338-40; КоШак е! а1., 1986, Се11 46: 89-94); регуляторная область гена основного белка миелина, которая активна в клетках олигодендроцитах в головном мозге (КеабЬеаб е! а1., 1987, Се11 48: 703-12); регуляторная область гена легкой цепи-2 миозина, которая активна в скелетных мышцах (δαυ, 1985, №Лиге 314: 283-86); и регуляторная область гена рилизинг-фактора гормона гонадотропина, которая активна в гипоталамусе (Макои е! а1., 1986, δ^ι^ 234: 1372-78).
Энхансерная последовательность может быть встроена в вектор для усиления транскрипции ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь, составляющие антитело анти-В7КР1 по изобретению, высшими эукариотами. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной примерно 10-300 п.н., которые действуют на промотор с усилением транскрипции. Энхансеры относительно независимы от ориентации и положения, находясь в положениях как 5', так и 3' к единице транскрипции. Известно несколько энхансерных последовательностей, доступных из генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Однако обычно используют энхансер из вируса. Энхансер δν40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы и энхансеры аденовируса, известные в данной области техники, представляют собой примеры энхансерных элементов для эукариотических промоторов. Хотя энхансер может быть расположен в векторе либо 5', либо 3' к кодирующей последовательности, он обычно расположен в сайте в 5' направлении от промотора.
Экспрессионные векторы по изобретению могут быть сконструированы из исходного вектора, например, имеющегося в продаже вектора. Такие векторы могут содержать или не содержать все желаемые фланкирующие последовательности. Если одна или более чем одна фланкирующая последовательность, описанная здесь, еще отсутствует в векторе, она может быть получена индивидуально и лигирована в вектор. Методы, используемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалистам в данной области техники.
После того как вектор уже построен и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, тяжелую цепь или легкую и тяжелую цепь и включающая анти-В7КР1 антитело, введена в подходящий участок вектора, законченный вектор может быть введен в подходящую клетку-хозяина для усиления и/или экспрессии полипептида. Трансформацию вектора экспрессии для анти-В7КР1 антитела в выбран- 21 021669 ную клетку-хозяина можно осуществить известными методами, включающими трансфекцию, инфекцию, соосаждение фосфатом кальция, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, ΌΕΑΕ-декстранопосредованную трансфекцию или другие известные методы. Выбранный метод частично зависит от типа используемой клетки-хозяина. Эти методы и другие подходящие методы известны квалифицированному специалисту в данной области и сформулированы (см., например, в публикации δαιηόΐΌοΚ с1 а1., см. выше).
Клетка-хозяин при культивировании в соответствующих условиях синтезирует антитело антиВ7КР1, которое затем можно собрать из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если она не секретирует). Выбор соответствующей клетки-хозяина зависит от различных факторов, например, желаемых уровней экспрессии, модификаций полипептида, которые являются желательными или необходимыми для активности (например, гликозилирования или фосфорилирования) и легкости укладки в биологически активную молекулу.
Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничены, иммортализованные линии клеток, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячков (ВНК), клетки почек обезьян (СО8), клетки гепатоцеллюлярной карциномы (например, НерО2) и ряд других линий клеток. В определенных воплощениях линии клеток могут быть выбраны посредством определения того, какие линии клеток имеют высокие уровни экспрессии и конститутивно продуцируют антитела с В7КР1-связывающими свойствами. В другом воплощении может быть выбрана линия клеток из В-клеточной линии, которая не производит свое собственное антитело, но обладает способностью производить и секретировать гетерологичное антитело.
Антитела по изобретению полезны для обнаружения В7КР1 в биологических образцах и идентификации клеток или тканей, которые продуцируют белок В7КР1. Антитела по изобретению, которые специфично связываются с В7КР1, могут быть полезными при лечении В7КР1-опосредованных заболеваний. Указанные антитела можно использовать в анализах связывания для обнаружения В7КР1 и для ингибирования образования комплекса В7КР1 с рецепторами В7КР1. Указанные антитела, которые связываются с В7КР1 и блокируют взаимодействие с другими связывающими соединениями, могут найти терапевтическое применение при модулировании В7КР1-опосредованных заболеваний. В определенных воплощениях антитела к В7КР1 могут блокировать связывание В7КР1 с его рецептором, что может привести к разрушению В7КР1-индуцированного каскада преобразования сигнала.
Настоящее изобретение также относится к применению одного или более чем одного антитела по настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для лечения расстройства или состояния, вызванного повышенной экспрессией В7КР1 или повышенной чувствительностью к В7КР1 у пациента, например, любого из расстройств или состояний, раскрытых здесь.
В определенных воплощениях в изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество одного или множества антител по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солюбилизатором, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом. Приемлемые вещества для препаратов нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях. В предпочтительных воплощениях предложены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество антител анти-В7КР1.
В определенных воплощениях вещества для препаратов нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях.
В определенных воплощениях фармацевтическая композиция может содержать вещества для препарата для модифицирования, поддержания или сохранения, например, значения рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проницаемости композиции. В таких воплощениях пригодные вещества для препаратов включают, но не ограничены, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антибактериальные препараты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферные вещества (например, борат, бикарбонат, ТрисНС1, соли лимонной кислоты, фосфаты или другие органические кислоты); наполнители (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); добавки; моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин); красители, корригенты и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как ион натрия); консерванты (такие как бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажняющие агенты (такие как
- 22 021669 плюроники, ПЭГ, эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит); агенты, усиливающие тоничность (такие как галогениды щелочных металлов, например, хлорид натрия или калия, маннит, сорбит); носители для доставки; разбавители; эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты (см. КЕМШ0Т0№8 РНАКМАСЕИТГСАЬ 8СIЕNСЕ8, 18* ЕйШоп (Сеппаго А.Р., ей.), 1990, Маск РиЬккЫпд Сотрапу).
В определенных воплощениях оптимальную фармацевтическую композицию определяет специалист в данной области техники в зависимости, например, от назначенного пути введения, формата доставки и желательной дозировки (см., например, КЕМШСТ0№8 РНАКМАСЕИТГСАЬ 8СIЕNСЕ8, выше). В определенных воплощениях на такие композиции могут влиять физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш У1уо и скорость клиренса антител по изобретению ш У1уо.
В определенных воплощениях основной наполнитель или носитель в фармацевтической композиции может быть водным или неводным по природе. Например, подходящий наполнитель или носитель может представлять собой воду для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственную спинномозговую жидкость, возможно с добавлением других веществ, обычных в композициях для парентерального введения. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой дополнительные наполнители. В определенных воплощениях фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат Трис-буфер со значением рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер со значением рН примерно 4,0-5,5 и могут дополнительно включать сорбит, сахарозу, Твин-20 и/или их подходящий заменитель. В определенных воплощениях изобретения можно готовить композиции антитела анти-В7КР1 для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с дополнительными агентами для приготовления препарата (КЕМШСТ0№8 РНАКМАСЕИТГСАЬ 8СIЕNСЕ8, см. выше) в форме лиофилизированного кека или водного раствора. Далее, в определенных воплощениях продукт антитела анти-В7РР1 может быть приготовлен в виде лиофилизата с использованием соответствующих эксципиентов, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции по изобретению могут быть выбраны для парентеральной доставки. Альтернативно, композиции могут быть выбраны для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций находится в компетенции специалиста в данной области техники.
Компоненты препарата присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для сайта введения. В определенных воплощениях используют буферы для поддержания физиологического или несколько более низкого значения рН в композиции, обычно в пределах диапазона значений рН от примерно 5 до примерно 8.
При рассмотрении парентерального введения терапевтические композиции для применения в данном изобретении могут быть представлены в форме апирогенного парентерально приемлемого водного раствора, содержащего желаемое антитело анти-В7РР1 в фармацевтически приемлемом носителе. Особенно пригодным носителем для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которой антитело анти-В7РР1 включено в препарат в виде стерильного изотонического раствора, консервированного должным образом. В определенных воплощениях изготовление препарата может включать изготовление препарата желаемой молекулы с агентом, таким как инъекционные микросферы, биоразрушаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимер молочной кислоты или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут обеспечить регулируемое или пролонгированное высвобождение продукта, который можно доставить путем инъекции депонируемого препарата. В определенных воплощениях также можно использовать гиалуроновую кислоту, обладающую эффектом стимуляции пролонгированного пребывания в системе кровообращения. В определенных воплощениях можно использовать имплантируемые устройства доставки лекарственного средства для введения желаемой молекулы антитела.
Фармацевтические композиции по изобретению можно готовить для ингаляции. В этих воплощениях препарат антител анти-В7КР1 предпочтительно готовят в виде сухого ингаляционного порошка. В определенных воплощениях можно также готовить растворы антитела анти-В7КР1 для ингаляции с пропеллентом для доставки в виде аэрозоля. В определенных воплощениях растворы могут быть распыляемыми. Введение через легкие и способы изготовления препаратов дополнительно описаны в международной заявке на патент, номер публикации РСТ/И8 94/001875, которая включена здесь путем ссылки и описывает доставку химически модифицированных белков через легкие.
Также рассматривают, что препараты можно вводить перорально. Препараты антител анти-В7РР1, которые вводят этим способом, можно готовить с носителями или без носителей, обычно используемых при компаундировании твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. В определенных воплощениях может быть разработана капсула для высвобождения активной части препарата в таком месте желудочно-кишечного тракта, где биодоступность достигает максимума, а досистемный распад сведен к минимуму. Могут быть включены дополнительные агенты для облегчения всасывания антитела анти-В7РР1. Также можно использовать разбавители, корригенты, легкоплавкие воски, растительные
- 23 021669 масла, смазывающие агенты, суспендирующие агенты, разрыхлители для таблеток и связующие вещества.
Предложена фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая эффективное количество одного или множества антител анти-В7КР1 в смеси с нетоксичными эксципиентами, которые пригодны для изготовления таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другом подходящем растворителе могут быть получены растворы в виде разовой дозы. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничены, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Дополнительные фармацевтические композиции очевидны для специалистов в данной области техники, включая препараты, содержащие антитела анти-В7КР1 в препаратах пролонгированной или регулируемой доставки. Методики изготовления ряда других средств пролонгированной или регулируемой доставки, например липосомные носители, биоразрушаемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекция депонируемого препарата, также известны специалистам в данной области техники (см., например, международную заявку на патент, номер публикации РСТ/ϋδ 93/00829, которая включена здесь путем ссылки и описывает регулируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций). Препараты пролонгированного высвобождения могут включать полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Матрицы замедленного высвобождения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (как раскрыто в патенте США № 3773919 и заявке на европейский патент, номер публикации ЕР 058481, каждая из которых включена здесь путем ссылки), сополимеры ϋ-глутаминовой кислоты и гамма этил-Ьглутамата (δίάιη;·ιη е! а1., 1983, В^οрο1уте^8 22: 547-556), поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) (Еандег е! а1., 1981, I. Вютей. Ма!ег. Ке8. 15: 167-277 и ^аи§е^, 1982, СЬет. ТесЬ. 12: 98-105), этилена и винилацетата (Ε-апдег е! а1., выше) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляную кислоту (заявка на европейский патент, номер публикации ЕР 133988). Композиции пролонгированного высвобождения могут также включать липосомы, которые могут быть получены любым из нескольких методов, известных в данной области техники (см., например, публикацию Ερρδ^ίη е! а1., 1985, Ргос. №·ι(1. Асай. δα. ЬЗА 82: 3688-3692; заявки на европейский патент, номера публикаций ЕР 036676; ЕР 088046 и ЕР 143949, включенные путем ссылки).
Фармацевтические композиции, применяемые для введения ίη νΐνο, обычно поставляют в виде стерильных препаратов. Стерилизация может быть достигнута путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Когда композиция является лиофилизированной, стерилизацию с использованием этого метода можно провести либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиции для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе. Парентеральные композиции обычно помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например в пакет или флакон для внутривенного раствора, имеющий пробку, которую протыкают иглой для подкожной инъекции.
Приготовленную фармацевтическую композицию можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или в виде дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты можно хранить либо в форме, готовой к применению, либо в форме (например, лиофилизированной), которую восстанавливают перед введением.
В изобретении также предложены наборы для получения однократной вводимой дозы. Наборы по изобретению может каждый содержать первый контейнер, содержащий высушенный белок, и второй контейнер, содержащий водный препарат. В определенных воплощениях данного изобретения предложены наборы, содержащие однокамерные и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы для жидкостей и шприцы для лиофилизированных продуктов).
Эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей антитело анти-В7КР1, для терапевтического применения зависит, например, от терапевтической ситуации и целей. Специалист в данной области техники понимает, что соответствующие уровни дозировки для лечения варьируют в зависимости отчасти от доставляемой молекулы, от показания, для которого применяют антитело антиВ7КР1, от пути введения и от размера (массы тела, площади поверхности тела или размера органа) и/или состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. В определенных воплощениях врач может титровать дозировку и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Типичная дозировка может находиться в интервале от примерно 0,1 мкг/кг до примерно 30 мг/кг или более в зависимости от упомянутых выше факторов. В определенных воплощениях дозировка может находиться в интервале от 0,1 мкг/кг до примерно 30 мг/кг; от 1 мкг/кг до примерно 30 мг/кг или от 5 мкг/кг до примерно 30 мг/кг.
Частота дозирования зависит от фармакокинетических параметров конкретного антитела антиВ7КР1 в применяемом препарате. Как правило, врач назначает композицию до тех пор, пока не будет достигнута дозировка, при которой получают желаемый эффект. Поэтому композицию можно вводить в виде однократной дозы или в виде двух или более чем двух доз (которые могут содержать или не содержать одинаковое количество желаемой молекулы) за определенный промежуток времени, либо путем непрерывной инфузии через имплантированное устройство или катетер. Дальнейшее усовершенствова- 24 021669 ние соответствующей дозировки обычно проводят специалисты в данной области техники, и оно находится в рамках задач, обычно выполняемых ими.
Соответствующие дозировки могут быть установлены путем использования соответствующих данных доза-ответ. В определенных воплощениях антитела по изобретению можно вводить пациентам в течение продолжительного периода времени. Длительное введение антитела по изобретению сводит к минимуму неблагоприятный иммунный или аллергический ответ, обычно связанный с антителами, которые вызваны против антигена человека у животного, отличного от человека, например, не полностью человеческих антител, продуцируемых у вида, отличного от человека.
Путь введения фармацевтической композиции находится в соответствии с известными методами, например, перорально, путем внутривенной, внутрибрюшинной, внутримозговой (интрапаренхимной), интрацеребровентрикулярной, внутримышечной, внутриглазной, внутриартериальной инъекции, инъекции в воротную вену или внутрь поражённых тканей; с помощью систем пролонгированного высвобождения или имплантационных устройств. В определенных воплощениях композиции можно вводить путем болюсной инъекции или непрерывно путем инфузии, либо с помощью имплантационного устройства.
Композицию также можно вводить местным путем посредством имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на который адсорбирована или в который инкапсулирована желаемая молекула. В определенных воплощениях, где применяют имплантационное устройство, это устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка желаемой молекулы может быть осуществлена путем диффузии, болюсов с отсроченным высвобождением или непрерывного введения.
Может быть также желательным применение фармацевтических композиций антитела анти-В7РР1 согласно изобретению ех νί\Ό. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые извлечены у пациента, подвергают воздействию фармацевтических композиций антитела анти-В7РР1, после чего клетки, ткани и/или органы имплантируют обратно пациенту.
В частности, антитела анти-В7РР1 могут быть доставлены путем имплантации определенных клеток, которые сконструированы генно-инженерным путем, с использованием методов, таких как описаны здесь, для экспрессии и секреции полипептида. В определенных воплощениях такие клетки могут представлять собой клетки животных или человека и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В определенных воплощениях клетки могут быть иммортализованы. В других воплощениях для снижения вероятности иммунологического ответа клетки могут быть инкапсулированы, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. В следующих воплощениях материалы для инкапсуляции типично представляют собой биологически совместимые полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые допускают высвобождение белкового продукта(ов), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими вредными факторами из окружающих тканей.
Примеры
Следующие примеры, включая проводимые эксперименты и достигнутые результаты, представлены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение изобретения.
Пример 1
Получение моноклональных антител человека против В7-связанного белка-1 (В7РР1)
Антиген
В качестве антигена использовали очищенный рекомбинантный В7РР-1 человека (НВ7РР-1), полученный, как описано в международной заявке на патент, номер публикации \УО 00/46240, которая включена здесь путем ссылки, или клетки СНО, трансфецированные для экспрессии НВ7РР-1. Зрелый В7РР-1 человека имеет аминокислотную последовательность остатков от X до 302 в последовательности, представленной в публикации \УО 00/46240 как 8Еф ГО NО: 17, где X может представлять собой остаток 19, 20, 21, 22, 24 или 28.
Трансгенные мыши НиМаЬ
Полностью человеческие моноклональные антитела к В7РР-1 были получены с использованием линий НСо7 и НСо12 трансгенных мышей НиМаЬ, обе из которых экспрессируют гены антител человека. В обеих из этих линий мышей эндогенный ген легкой цепи каппа мыши прерван в гомозиготном состоянии, как описано в публикации (см. СНеп е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12: 811-820), а эндогенный ген тяжелой цепи мыши прерван в гомозиготном состоянии, как описано в примере 1 публикации РСТ \УО 01/09187. Каждая из этих линий мышей несет трансген легкой цепи каппа человека, КСо5, как описано в публикации (см. ΡίΦνίΜ е! а1. (1996) №Циге Вю1есНпо1оду 14: 845-851). Линия НСо7 несет трансген тяжелой цепи человека НСо7, как описано в патентах США № 5545806; 5625825 и 5545807. Линия НСо12 несет трансген тяжелой цепи человека НСо12, как описано в примере 2 публикации \УО 01/09187.
Иммунизации НиМаЬ
Для получения полностью человеческих моноклональных антител к В7РР-1 линии мышей НиМаЬ НСо7 или НСо12 иммунизировали очищенным рекомбинантным В7РР-1 или клетками СНО, трансфецированными для экспрессии В7РР-1. Общие схемы иммунизации мышей НиМаЬ описаны в публикациях (см. ЬопЬетд е! а1. (1994) №ΐωΌ 368 (6474): 856-859; ΡίΦνίΜ е! а1. (1996) НаЦие Вю1есНпо1оду 14: 845-851
- 25 021669 и в публикации РСТ \У0 98/24884). Возраст мышей в момент первой инфузии антигена составлял 6-16 недель. Очищенный рекомбинантный препарат антигена В7КР-1 (50 мкг) или препарат трансфецированных клеток СНО (3,5х106-1х107 клеток) использовали для внутрибрюшинной иммунизации мышей НиМаЬ.
Трансгенных мышей дважды иммунизировали очищенным антигеном в полном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно с последующими внутрибрюшинными иммунизациями через 2-4 недели (всего вплоть до 8 иммунизации) очищенным антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизацию трансфецированными клетками СНО для экспрессии В7КР-1 проводили так же, за исключением того, что с этими клетками не использовали полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда. Мониторинг иммунного ответа проводили путем забора крови из ретроорбитальных пазух. Скрининг плазмы проводили с помощью ЭЛАИЗА (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами иммуноглобулина человека анти-В7КР-1 использовали для слияния. Мышей повторно иммунизировали внутривенно антигеном за 3 и за 2 суток до умерщвления и извлечения селезенки. Как правило, проводили 10-20 слияний для каждого антигена. На каждый антиген иммунизировали несколько дюжин мышей. Всего 28 мышей линий НСо7 и НСо12 иммунизировали В7КР-1.
Отбор мышей НиМаЬ, продуцирующих антитела анти-В7КР-1
Для отбора мышей НиМаЬ, продуцирующих антитела, которые связывают В7КР-1, сыворотки от иммунизированных мышей тестировали с помощью ЭЛАИЗА, как описано ΡίδΚΜΙά с1 а1. (1996). Кратко, микротитрационные планшеты покрывали очищенным рекомбинантным В7КР-1 при концентрации 1-2 мкг/мл в буфере ФСБ, 50 мкл/лунка, инкубировали при 4°С в течение ночи, затем блокировали 200 мкл/лунка 5% сыворотки цыплят в буфере ФСБ/Твин (0,05%). Разведения плазмы от мышей, иммунизированных В7КР-1, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1-2 ч при температуре окружающей среды. Планшет промывали буфером ФСБ/Твин, а затем инкубировали с поликлональным антителом Рс коза против 1§О человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (НКР) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшеты проявляли субстратом АВТЗ (§1§ша, А-1888, 0,22 мг/мл) и анализировали с помощью спектрофотометра при оптической плотности 415-495. Мышей, которые проявляли самые высокие титры антител анти-В7КР-1, использовали для слияний. Слияния проводили, как описано ниже, и надосадочные жидкости гибридомы тестировали на активность против В7КР-1 с помощью ЭЛАИЗА.
Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека к В7КР-1
Спленоциты мыши, выделенные из мышей НиМаЬ, подвергали слиянию с помощью ПЭГ с клеточной линией миеломы мыши, основываясь на стандартных протоколах. Полученные в результате гибридомы подвергали скринингу на продуцирование антител, специфичных к антигену. Одноклеточные суспензии селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей подвергали слиянию с одной четвертью от числа ЗР2/0-несекретирующих клеток миеломы мыши (АТСС, СКЬ 1581) с помощью 50% ПЭГ (81дша). Клетки высевали в плоскодонный микротитрационный планшет в количестве примерно 1х105/лунка, после чего инкубировали в течение примерно двух недель в селективной среде, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, 10% среды, кондиционированной Р388Э1 (АТСС, СКЬ Т1В-63), 3-5% 0пдсп (ЮЕ^ в ЭМЕМ (МсФа1ссН, СКЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата натрия) с добавлением 5 мМ НЕРЕЗ, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мг/мл гентамицина и 1хНАТ (§1дша, СКЬ Р-7185). Через 1-2 недели клетки культивировали в среде, в которой НАТ был заменен НТ. Затем индивидуальные лунки подвергали скринингу с помощью ЭЛАИЗА (описан выше) на моноклональные антитела человека 1дО анти-В7КР-1. Как только появлялся интенсивный рост гибридомы, проводили мониторинг среды, обычно через 10-14 суток. Гибридомы, секретирующие антитела, пересевали, снова подвергали скринингу и, если оно проявляло положительную реакцию на 1дО человека, моноклональные антитела анти-В7КР-1 субклонировали по меньшей мере дважды путем предельного разведения. Затем стабильные субклоны культивировали ίη νίίτο с получением небольших количеств антитела в среде для тканевых культур для дальнейшей характеристики.
Пример 2
Клонирование тяжелых и легких цепей антитела анти-В7КР1
Гибридому, экспрессирующую В7КР1-связывающее моноклональное антитело 16Н, использовали в качестве источника для выделения суммарной РНК с использованием реагента ΤΡίζοΙ® (ίηνίίΓο^βη). Олигонуклеотиды 5' КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК) (5'-СОА СИО ОАО САС ОАО ОАС АСИ ОАС АИО ОАС ИОА АОО АОИ АОА АА-3'; ЗЕС ίΌ N0: 69) лигировали в РНК, используя компоненты и протокол набора ОепеКасег™ (ίηνίίτο^βη). Первую нить кДНК синтезировали с использованием случайного праймера с адаптером удлинения (5'-ООС СОО АТА ООС СТС САN NNN МЫТС) (8ЕЦ ίΌ N0: 59) и препаративный анализ 5' КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК) проводили с использованием набора Ое^^се^™ (ίηνίίτο^η) в соответствии с инструкциями от производителя. Для получения ДНК, кодирующей полноразмерную легкую цепь, прямой праймер представлял собой внутренний праймер из набора Ое^^се!™, а обратный праймер представлял собой (5'-ООО ОТС АОО СТО ОАА СТО АОО-3') (8ЕЦ ίΌ N0: 60). Для получения кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, пря- 26 021669 мой праймер представлял собой праймер из набора ОепеКасег™, а обратный праймер представлял собой (5'-ТОА ООА СОС ТОА ССА САС О-3') (ЗЕЦ ГО 61). Продукты КАСЕ клонировали в рСК4-ТОРО Дпуйгодеп) и определяли последовательности. Согласованные последовательности использовали для конструирования праймеров для ПЦР амплификации полноразмерной цепи антитела.
Для получения кДНК, кодирующей легкую цепь каппа 16Н анти-В7КР1, 5' праймер ПЦР кодировал аминоконец сигнальной последовательности, сайт рестрикции фермента ХЬа1 и оптимизированную последовательность Козака (5'-САО САО ААО СТТ СТА ОАС САС САТ ООА САТ ОАО ООТ ССТ СОС ТСА ОСТ ССТ ООО-3') (ЗЕЦ ГО NО: 62). Праймер 3' кодировал карбоксильный конец и кодон терминации, а также сайт рестрикции За11 (5'-СТТ ОТС ОАС ТСА АСА СТС ТСС ССТ ОТТ ОАА ОСТ С-3') (ЗЕЦ ГО NО: 63). Полученный в результате фрагмент продукта ПЦР очищали, переваривали ХЬа1 и За11, а затем выделяли из геля и лигировали в экспрессионном векторе млекопитающих рЭЗКа20 (см. международную заявку, номер публикации \УО 90/14363, которая включена здесь путем ссылки для любой цели. рЭЗКа20 получили путем замены нуклеотида 2563 в рЭЗКа19 с гуанозина на аденозин с помощью сайт-направленного мутагенеза).
Для получения кДНК, кодирующей тяжелую цепь 16Н анти-В7КР1, 5' праймер ПЦР кодировал аминоконец сигнальной последовательности, сайт рестрикции фермента ХЬа1 и оптимизированную последовательность Козака (5'-АСА АСА ААО СТТ СТА ОАС САС САТ ООА ОТТ ООО ОСТ ОАА СТО О-3') (ЗЕЦ ГО NО: 64). Праймер 3' кодировал карбоксильный конец вариабельной области, включая природный сайт смысловой нити ВктВ1 (5'-ОТО ОАО ОСА СТА ОАО АСО ОТО АСС АОО АТТ СС-3'; ЗЕЦ ГО NО: 65). Полученный в результате продукт очищали, переваривали ХЬа1 и ВктВЕ выделяли из геля и лигировали в векторе рЭЗКа20, содержащем константную область 1дО1 человека, а также в векторе рЭЗКа20, содержащем константную область 1дО2 человека. Все гибридомы, имеющие происхождение от вариабельных областей тяжелой цепи анти-В7КР1, независимо от ассоциированной нативной константной области клонировали, как описано выше, в обоих векторах рЭЗКа20, содержащих константные области 1дО1 человека и 1дО2 человека.
Пример 3
Экспрессия антител анти-В7КР1 в клетках яичников китайского хомячка (СНО)
Стабильная экспрессия тАЬ 16Н анти-В7КР1 была достигнута путем котрансфекции плазмид 16Нтяжелая цепь/рЭЗКа19 1дО2 В7КР1-каппа/рЭЗКа19 в свободные от сыворотки клетки яичников китайского хомячка (СНО), дефицитные по дигидрофолатредуктазе (ЭНРК-), с использованием кальцийфосфатного метода (полноразмерная последовательность тяжелой цепи 16Н представлена в последовательности ЗЕЦ ГО NО: 44; последовательность каппа-цепи 16Н представлена в последовательности ЗЕЦ ГО NО: 45). Трансфецированные клетки отбирали в среде, содержащей диализированную сыворотку, но не содержащей гипоксантин-тимидин, чтобы обеспечить рост клеток, экспрессирующих фермент ЭНРК (дигидрофолатредуктазу). Трансфецированные клоны подвергали скринингу с использованием анализов, таких как ЭЛАИЗА, для обнаружения экспрессии тАЬ 16Н анти-В7КР1 в кондиционированной среде. Клоны с самой высокой экспрессией подвергали воздействию возрастающих концентраций метотрексата (МТХ) для амплификации ЭНРК Амплифицированные с помощью МТХ клоны подвергали скринингу с использованием анализов, таких как ЭЛАИЗА, для обнаружения экспрессии тАЬ 16Н анти-В7КР1 в кондиционированной среде. Клоны с самой высокой экспрессией подвергали субклонированию для получения однородной популяции и создания клеточных банков.
Другие рекомбинантные антитела анти-В7КР1 по изобретению могут быть получены в клетках яичников китайского хомячка, дефицитных по ЭНРК, с использованием такого же протокола, как описано выше для моноклонального антитела анти-В7КР1. Последовательности ДНК, кодирующие полноразмерную тяжелую цепь или легкую цепь каждого антитела анти-В7КР1 по изобретению, клонировали в экспрессионных векторах. Клетки СНОй котрансфецируют экспрессионным вектором, способным к экспрессии полноразмерной тяжелой цепи, и экспрессионным вектором, экспрессирующим полноразмерную легкую цепь соответствующего антитела анти-В7КР1. Например, для образования антитела 5Ό анти-В7КР1 клетки котрансфецируют вектором, способным к экспрессии полноразмерной тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности ЗЕЦ ГО NО: 47, и вектором, способным к экспрессии полноразмерной легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, как представлено в последовательности ЗЕЦ ГО NО: 48. В табл. 2 суммированы примеры полноразмерных легких цепей и примеры полноразмерных тяжелых цепей для антител антиВ7КР1, имеющих константные области тяжелой цепи 1дО человека. Специалисту в данной области техники понятно, что 1дО1 или 1дО2 можно заменить друг на друга (то есть там, где в таблице приведен 1дО1, может присутствовать 1дО2, и наоборот). Альтернативно, любой другой иммуноглобулин (например, 1дМ, 1дА, 1дЕ или 1дН) можно использовать для получения антител по изобретению.
- 27 021669
Таблица 2
Антитело Вариабельная область тяжелой цепи + константная область тяжелой цепи Полноразмерная тяжелая цепь
16Н(1дС2) ЗЕО ГО N0: 7 + ЗЕО ГО ΝΟ: 41 ЗЕО ГО N0:44
16Н(1дС1) ЗЕО ГО ΝΟ: 7 + ЗЕО ГО ΝΟ: 42 ЗЕО ГО N0: 70
16Нд(1дС2) ЗЕО ГО N0: 8 + ЗЕО Ю ΝΟ: 41 ЗЕО ГО ΝΟ: 46
16Нд(1дС1> ЗЕО ГО N0; 8 + ЗЕО Ю ΝΟ. 42 ЗЕО ГО N0: 71
5ϋ(Ιρ61> ЗЕО ГО N0: 9 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0: 47
5ϋ(ΙρΟ2) ЗЕО Ю ΝΟ: 9 + ЗЕО ГО ΝΟ: 41 ЗЕО ГО N0: 72
2Н(1дО2) ЗЕО ГО N0: 10 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0: 49
2Н(1дО1) ЗЕО ГО N0: 10 + ЗЕО ГО ΝΟ: 42 ЗЕО ГО ΝΟ: 73
2Нд(1дС2) ЗЕО ГО N0:11+ ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0: 51
2Нд(1дС1) ЗЕО Ю N0:11 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0: 74
43Н(1дО2) ЗЕО ГО N0:14 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0: 52
43Ηθ4β1) ЗЕО ГО N0:14 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0: 75
41Н(1д62) ЗЕО ГО ΝΟ: 13 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0: 54
41Н(1д61) ЗЕО ГО N0:13 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0: 76
15Н(1д62) ЗЕО ГО N0: 12 + ЗЕО ГО ΝΟ: 41 ЗЕО ГО ΝΟ: 56
15Н(1дО1) ЗЕО ГО N0:12 + ЗЕО ГО ΝΟ: 42 ЗЕО ГО N0: 57
Антитело Вариабельная область легкой цепи + константная область легкой цепи Полноразмерная легкая цепь
16Н ЗЕО ГО N0:1 + ЗЕО ГО N0:43 ЗЕО ГО ΝΟ: 45
5Э ЗЕО ГО N0: 2 + ЗЕО ГО ΝΟ: 43 ЗЕО ГО N0: 48
2Н ЗЕО ГО ΝΟ: 3 + ЗЕО ГО N0:43 ЗЕО ГО N0: 50
43Н ЗЕО Ю N0: 6 + ЗЕО ГО ΝΟ: 43 ЗЕО ГО N0: 53
41Н ЗЕО ГО N0: 5 + ЗЕО Ю N0: 43 ЗЕО ГО N0: 55
15Н ЗЕО ГО N0: 4 + ЗЕО Ю N0:43 ЗЕО ГО N0: 58
Пример 4
Продуцирование антитела анти-В7КР1
Антитело анти-В7КР1 продуцируют путем экспрессии в клональной линии клеток СНО. Для каждого цикла продуцирования клетки из единственного флакона оттаивают в клеточной культуральной среде без сыворотки. Клетки выращивают первоначально в Т-образной колбе, затем во вращающихся колбах, а затем их выращивают в реакторах из нержавеющей стали возрастающего масштаба вплоть до биореактора на 2000 л. Продуцирование осуществляют в биореакторе на 2000 л с использованием культуры с подпиткой, в которую добавляют концентрированную среду, содержащую питательные вещества, для поддержания роста клеток и жизнеспособности культуры. Продуцирование длится в течение примерно двух недель, в течение которых антитело анти-В7КР1 конститутивно продуцируется клетками и секретируется в клеточную культуральную среду.
Реактором для продуцирования управляют при заранее определенных значениях рН, температуры и уровня растворенного кислорода: значение рН регулируют добавлением углекислого газа и карбоната натрия; растворенный кислород регулируют потоками газообразного воздуха, азота и кислорода.
В конце продуцирования клеточный бульон подают в тарелочный сепаратор, и надосадочную жидкость культуры отделяют от клеток. Концентрат далее осветляют, пропуская через объемный фильтр, а затем через фильтр 0,2 мкм. Затем осветленные кондиционированные среды концентрируют с помощью тангенциальной ультрафильтрации. Кондиционированные среды концентрируют в 15-30 раз. Затем полученную в результате концентрированную кондиционированную среду подвергают очистке или замораживают для последующей очистки.
Пример 5
Преобразование тАЬ 16Н в гаметический тип
Выравнивание последовательности антитела 16Н с последовательностями человека гаметического типа показало, что каркасная последовательность в вариабельной области антитела 16Н наиболее идентична последовательностям УН 3-07 и 1Н4 гаметического типа, только с тремя различиями в аминокислотах (фиг. 1А). Было обнаружено, что каркасная последовательность для области Ук антитела 16Н идентична последовательности Ук1-Ь15 гаметического типа. Теоретически возможно, что соматические сверхмутации распознаются иммунным ответом пациента как чужеродные; в таком случае у пациента генерируется антиидиотипический ответ, который может нейтрализовать терапевтический. Для уменьшения этой возможности три замены аминокислоты в каркасной области УН были преобразованы обратно в последовательности УН 3-07 и 1Н4 гаметического типа (фиг. 1А). Поскольку сегменты генов УН и 1Н гаметического типа присутствуют в каждом человеческом геноме, вариант 16Н гаметического типа маловероятно будет распознан иммунным ответом дозируемого пациента как чужеродный. Были проведены планшетные биологические анализы на костимуляцию, чтобы определить, могут ли антитела, преобразованные в гаметический тип, индуцировать пролиферацию Т-клеток при 1С50 подобной 1С50 антител, не преобразованных в гаметический тип. Анализ костимуляции, проведенный, как описано ниже, с использованием анти-СИ3 и гибридного белка ЬВ7КР-1-Рс, подтвердил, что это антитело, преобразованное в гаметический тип, называемое 16Ндегт1ше или 16Нд, сохраняет свою биологическую активность (фиг. 1Б).
- 28 021669
Пример 6
Измерение сродства моноклональных антител методами Вьасоге® и КьпЕхА
Три антитела (5Ό и 16Н, полученные, как описано в примере 1, и 16Н гаметического типа, полученное, как описано в примере 5) очищали и подвергали анализу на сродство связывания. В7КР1-Рс иммобилизовали при высокой плотности на чипе датчика СМ5 с использованием стандартной химии сочетания аминов. Затем фиксированную концентрацию тАЬ инкубировали с варьирующими концентрациями В7КР-1 или В7КР1-Рс в течение по меньшей мере 8 ч при комнатной температуре, чтобы дать им достичь равновесия. Затем образцы впрыскивали на поверхность В7КР1-Рс и наблюдали сигнал связывания, который дает свободное антитело, остающееся в растворе в равновесии. Путем использования двух различных концентраций антитела (0,2 нМ и 1 нМ) Кс взаимодействия между конкретным тАЬ и лигандом вычисляли на основании нелинейного регрессионного анализа кривых конкурирования, используя модель двойной кривой однородного связывания единственного участка (Абатс/ук е1 а1., 1999, Вюсоищда!е СЬет. 10: 1032-37; Абатс/ук е! а1., 2000, Ме!Ьоб8 20: 319-28). Как показано на фиг. 2 и в табл. 3, все тАЬ 16Н, 16Нд и 5Ό связываются растворимыми белками В7КР-1 и В7КР-1-Рс с высоким сродством. Кроме того, результаты показали, что 16Н (не гаметического типа) и 16Нд (гаметического типа) реагируют подобным образом, что указывает на то, что преобразование в гаметический тип не оказывает значительного влияния на связывание между антителом и лигандом.
Таблица 3
Итоговые значения Ко
В7КР-1 В7КР1-Рс
50 37 пМ 1,6 пМ
16Н 1,9 нМ 27 пМ
16Н (зародышевая линия) 2,7 нМ 17 пМ
Связывание антител гаметического типа 5Ό, 2Н и 2Н также проверяли с использованием технологии КапЕ.хА (анализа кинетического исключения). В этом испытании ЬВ7КР-1 связывали с агарозными гранулами. Эти гранулы использовали для создания колонки с гранулами. Затем образцы, содержащие антитело при фиксированной концентрации, которые оставляли для достижения равновесия с варьирующими концентрациями ЬВ7КР-1, пропускали через колонку с гранулами. Антитело, не образовавшее комплекс с лигандом, связывалось с покрытыми гранулами.
Вторичное антитело против Рс человека с флуоресцентной меткой использовали для обнаружения связанного тестируемого антитела. Полученный сигнал был пропорционален содержанию свободного антитела в растворе при данной концентрации лиганда. Используя две различных концентрации антитела, вычисляли Кс взаимодействия на основании нелинейного регрессионного анализа кривых конкурирования, используя модель двойной кривой однородного связывания единственного участка (Абатс/ук е! а1., 1999, Вюсоп)ида!е СЬет. 10: 1032-37; Абатс/ук е! а1., 2000, МеШобз 20: 319-28). На фиг. 3-5 показаны двойные кривые соответствия для антител 5Ό, 2Н и 2Н (гаметический тип). С использованием этой методики наблюдали примерно 10-кратное различие Кс для антител 5Ό и 2Н.
Результаты анализов Вьасоге® и КьпЕхА показали, что антитело 5Ό обладает более высоким сродством к ЬВ7КР-1, чем 2Н или 16Н. Кроме того, вариант антитела 2Н гаметического типа не проявляет существенного различия с конструкцией не гаметического типа.
Пример 7
Функциональные характеристики антител анти-В7КР1
Функциональные характеристики антител В7КР-1 по изобретению оценивали с использованием анализов конкурентного связывания, анализа костимуляции ш уЬго и анализа со столбнячным анатоксином ш уЬго.
Исследования конкурентного связывания
Исследования конкурентного связывания проводили с тАЬ 16Н, чтобы показать, что они могут конкурировать за связывание с В7КР-1 с 1С08. Клетки СНО, трансфецированные геном, кодирующим полноразмерный В7КР-1 человека, сначала инкубировали с понижающимися количествами немеченого тАЬ 16Н, а затем окрашивали гибридным белком 1С08-Рс с флуоресцентной меткой. Затем клетки анализировали с использованием проточной цитометрии. Как показано на фиг. 6, клетки СНО, трансфецированные В7КР-1, окрашены 1С08-Рс; 0,4 мкг/мл тАЬ 16Н не оказывают влияния на связывание 1С08Рс. Однако 6 и 25 мкг/мл 16Н эффективно конкурировали за связывание 1С08-Рс, что указывает на то, что тАЬ 16Н действительно конкурирует за связывание 1С08 на В7КР-1.
Анализ костимуляции
Планшеты для клеточных культур (Ра1соп, Са! №.353077, И-образное дно) покрывали 1 мкг/мл антител против СИ3 человека (РЬагМшдеп Са! №. 555336) и 10 мкг/мл антител против 1§О человека (Рсспецифичные, 8ьдта Са! №. 13391). Антитела анти-СИ3 и против иммуноглобулина человека в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) добавляли в каждую лунку (10 мкл/лунка). Покрытые планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты дважды промывали буфером ФСБ. После промывки в каждую лунку добавляли 1 мкг/мл В7-2Рс человека (К&И 8уз!ет, Са! №. 141-В2) или 5 мкг/мл ЬВ7КР1Рс, каждый растворен в ФСБ (10 мкл на лунку). Затем планшеты
- 29 021669 инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч, после чего дважды промывали ФСБ. Добавляли очищенные Т-клетки человека (1х 105 на лунку) в 20 мкл объема среды (КРМ1 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), пенициллина-стрептомицина-Ь-глутамина (Р8С), βмеркаптоэтанола (2-МЭ), N-ацетиласпартата (ХАА) и № пирувата) и инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 48 ч. 3-Н тимидин (IСN Саΐ №. 2404205) добавляли в количестве 1 мкКи/лунка, и клетки инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО2. Затем клетки собирали и считали.
Планшеты для клеточных культур (Ρ;·ιΚοη, Саΐ №.353077, И-образное дно) покрывали 0,1 мкг/мл анти-СГО3 человека, как описано выше. Клетки СНО, трансфецированные 1В7КР1 (облученные 5000 рад), добавляли в количестве 2х104 на лунку, а затем очищенные Т-клетки человека в количестве 1х105 на лунку в объеме 200 мкл. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 48 ч, как описано выше. 3-Н тимидин добавляли в количестве 1 мкКи/лунку. Клетки инкубировали в течение ночи, собирали и считали, как описано выше.
Анализ с помощью столбнячного анатоксина
Мононуклеары периферической крови (РВМС) очищали из человеческой крови, используя градиент Ρ^сο11-Ра^ие (АтегкЬаш Вюксьепсек), как описано ниже. Кровь разводили 1:2 ФСБ, разведенную кровь наслаивали на поверхность Ρκο11 (1/3 Ρκο11 комнатной температуры + 2/3 разведенной крови), центрифугировали при 2500 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре, верхний слой (плазма и тромбоциты) отсасывали, а слой, содержащий мононуклеарные клетки, переносили в новую пробирку на 50 мл. Выделенные РВМС промывали буфером ФСБ (3х объемом слоя, содержащего мононуклеарные клетки), центрифугировали в течение 10 мин при 1300 об/мин при комнатной температуре и промывали, как описано выше. РВМС ресуспендировали в среде (КРМ1 1640 + 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС) + 1х Р8С + 1х НЕЛА + 55 мкМ 2-МЭ), и клетки подсчитывали.
РМВС добавляли в лунки 96-луночного планшета с круглодонными лунками в количестве 100 мкл РВМС/лунка (3х106/мкл). Столбнячный анатоксин (20 мкг/мл; ипАегеПу οί МаккасЬикейх) добавляли до конечной концентрации 5 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 3 суток при 37°С; 100 мкл надосадочной жидкости отбирали и инкубировали дополнительно в течение 6-8 ч в присутствии 1 мкКи/лунку 3-Нтимидина (МР ВюсБетюак). Затем клетки собирали и считали.
В табл. 4 приведены функциональные характеристики некоторых антител по изобретению, определенные с использованием вышеописанных анализов.
Таблица 4
Пример 8
Картирование эпитопов
Были проведены эксперименты, чтобы идентифицировать область В7КР-1, с которой связываются моноклональные антитела 16Н/16Нд и 5Ό. Для осуществления этого был разработан новый анализ связывания с сортировкой клеток, активированных флюоресценцией (РАС8). Внеклеточный домен (ЕСГО) В7КР1 человека (8ЕЦ ГО N0: 66), а также укороченные формы В7КР-1, содержащие либо 1д1 (1§Уподобные; 8ЕЦ ГО N0: 67), либо 1д2 (ГдС-подобные; 8ЕЦ ГО N0: 68), экспрессировали в виде N концевых слияний в рамке считывания с авидином цыпленка.
5Е0 Ю ΝΟ: 66 (ΕΟϋ):
ОТОЕКЕУКАМТСЗОУЕЬгСАСРЕСЗКГОШОУУУУВДТЗЕЗКТУУТУН! ΡΏΝ53Ι,ΕΝν05ΡΥΚΝΚΑΙ,Μ5 ΡΑ0ΜΙ·ΚΘ0ϊ'8ΕΓ(Ι.ΕΝνΤΡ<2ΡΕζ5ΚΕΉ0Ι.νΐ,3(25Ι,5Ε,0Ενΐ15ν£νΤΙ,ΗνΑΑΝΕ5νρνν5ΑΡΗ8£'5ΏΡΕΙ.ΤΕ ΤΟΤΕΙΝΟΥΡΗΡΝνΥΜΝΚΤΕΝΒΕΕϋΟΑΙβΝϋΤνΓΙ,ΝΜΗΟΕΥΟννδνΐ,ΚΙΑΚΤΡΒνΝίαΟΟΙΕΝνί,ΕΟΟΝ ЬТУСЗСГСЫСИСЕКОКИЕМР
ЗЕО Ю N0: 67 (1д\/-подобная):
0Τζ3ΕΚΕνΚΑΜνα30νΕΒ3σΑ0ΡΕσ3ΡΕ0ΕΝ0νΥνΥΜζ3Τ3Ε3ΚΤννΤΥΗΙΡζίΜ£8ΕΕΝν03ΚΥΚΝΚΑΕΜ5
ΡΑΰΜΕΚ3ΡΕ3ΕΚΕΕΝνΤΡΜ)Ε<5ΚΕΗ0Ι.νΐ,3Ο3Ι.ΕΕ<2Ενΐ,8νΕνΤΙ,ΗνΑΑΝΕ8νΡνν5ΑΡΗ5Ρ3ζ)ϋΕΙ,ΤΓ
Τ δΕΟ Ю ΝΟ: 68 (1дС-подобная):
Ι,ΕΕ2Ενΐ,8νΕν:ΓΙΙΗνΑΑ№3νρνν3ΑΡΗ3Ρ3ι2ΟΕΕΤΕ·ΤΟΤ3Ι№3ΥΡΚΡΝνΥΜΙΝΚΤΟΝ3Ι,Ι,Οι2ΑΙΛ)ΝΒΤ
УГЬНМкеьУПУ73УЬК1АКТР8УЫ1ССС1ЕМУЬЬ2ОЫЬТУСЗСЗТСНО1СЕРОК1ТЕМР
Экспрессионные векторы, содержащие гены, кодирующие эти гибридные белки, индивидуально временно трансфецировали в клетки 293Т, и кондиционированные среды от этих клеточных линий ис- 30 021669 пользовали в качестве источника гибридного белка. Авидиновую метку использовали для захвата гибридных белков В7ЕР1 из раствора с использованием покрытых биотином гранул. Гибридные белки инкубировали либо с флуоресцентно мечеными тАЪ 16Н или 5Б, либо с флуоресцентно меченым гибридным белком 1СО8-Рс и инкубировали с гранулами, покрытыми биотином. Гранулы выделяли и анализировали с использованием проточной цитометрии на приборе Вес!оп-Бюкш8оп фирмы Вюкшепсе РАС8сап (ВБ, РгапкИп Ьаке8, N1). Как показано на фиг. 9А, флуоресцентное окрашивание гранул было обнаружено с реагентами 16Н, 5Б и 1СО8, когда был присоединен полноразмерный внеклеточный домен В7ЕР-1, что указывает на то, что все эти три реагента могут связываться с ЕСБ В7ЕР-1. Подобным образом все три реагента связываются с авидиновым гибридным белком, содержащим только домен 1д1, что указывает на то, что и 1СО8, и блокирующие тАЪ анти-В7ЕР-1 могут связываться с этой областью. Напротив, ни 1СО8, ни тАЪ анти-В7ЕР-1 не могут связываться с гибридным белком, содержащим только ближайший к мембране домен 1д2. Таким образом, участки связывания на В7ЕР-1 для 1СО8, 16Н и 5Б были локализованы в домене 1д1.
Антитела, полученные, как описано выше в примере 1 и протестированные на связывание с использованием анализа связывания с авидиновым гибридным белком, могут быть разделены на два класса эпитопов, Н и Б, как показано в табл. 5. Из этих 100 антител, первоначально отобранных на основе их способности связывать В7ЕР1, 15 были неспособны связываться в анализе связывания с авидиновым гибридным белком, наиболее вероятно вследствие деградации.
Таблица 5
Классификация тАЬ по эпитопу
Класс #
Н эпитоп 75
Э эпитоп 10
Новый эпитоп, являющийся блокатором 1СО5 0
Новый эпитоп, не являющийся блокатором 1СОЗ 0
Отсутствие обнаружимого связывания 15
Пример 9
Идентификация полиморфизма одного нуклеотида в ДНК (8ИР) и функциональный анализ
В В7ЕР-1 идентифицировали один основной вариант полиморфизма одного нуклеотида в ДНК (8ИР), который присутствует в популяции с частотой аллеля 28,4% (фиг. 7). Вариант идентифицировали в пределах кодирующей последовательности зрелого белка. Поиск в банке данных Национального центра биотехнологической информации (ИСВ1) показал второй потенциальный вариант 8ИР; второй вариант был идентифицирован в 1,5 индивидуальных (три хромосомы) анализах. Первый вариант 8ИР (У1281) был локализован в первом 1дУ-подобном домене, тогда как 8ИР вариант из ИСВ1 (Б221Р) был локализован во втором 1дС-подобном домене.
Как обсуждено выше, оба моноклональных антитела 16Н и 5Б связываются с первым 1дУподобным доменом, маловероятно, что последний вариант Б221Р оказывает воздействие на связывание или функцию тАЪ 16Н или 5Б. Тем не менее, чтобы определить, влияет ли какой-либо из этих вариантов 8ИР на связывание и/или функцию 16Н или 5Б, проводили два различных эксперимента. В первой серии экспериментов конструировали гибридные белки авидина с двумя вариантами 8ИР и тестировали на связывание с антителами 16Н или 5Б при помощи анализа с использованием проточной цитометрии, как описано выше. Эти репрезентативные тАЪ эпитопов классов Н и Б связывались с вариантами 8ИР с эффективностью, подобной В7ЕР-1 дикого типа (фиг. 9Б). Эти данные означают, что антитела к эпитопам обоих классов Н и Б связываются с вариантами 8ИР В7ЕР-1.
При втором подходе были сконструированы гибридные белки Рс с использованием последовательностей 8ИР вариантов В7ЕР-1 и сравнивали по способности этих белков стимулировать Т-клетки в планшетном анализе костимуляции (фиг. 9В). Антитела как 16Н, так и 5Б ингибировали костимуляцию, опосредованную гибридными белками Рс с вариантами 8ИР с такими же значениями ЕС50, как и опосредованную гибридным белком дикого типа. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что антителами по изобретению распознаются два потенциальных 8ИР варианта В7ЕР-1. Таким образом, антитела по изобретению могут связываться с мишенью у пациентов, содержащей эти варианты 8ИР.
Пример 10
Модели эффективности на животных ш У1уо
Способность антител к В7ЕР-1 ингибировать иммунный ответ анализировали с использованием муринизированного моноклинального антитела крысы против мышиного В7ЕР-1 (1В7у2) и стимуляции мышей ВАЬВ/с гемоцианином лимфы улитки (КЬН).
Получение муринизированного моноклонального антитела 1В7у2 крысы против мышиного В7ЕР-1
Клеточную линию яичников китайского хомячка с гиперэкспрессией полноразмерного мышиного В7ЕР-1 инъецировали крысам в качестве первичной иммунизации с последующей иммунизацией гибридным белком мышиный В7ЕР-1-Рс для усиления иммунного ответа. Селезенки собирали на 3 или 4
- 31 021669 сутки после внутривенной повторной иммунизации, и селезеночные В-клетки сливали с линией миеломы крысы Υ3-Ά§Ι.2.3 (АТСС СКЬ-1631). Затем клетки отбирали в средах с добавлением гипоксантинааминоптерина-тимидина (НАТ) в течение 2 недель, а затем субклонировали до одной клетки путем предельного разведения (эти методики описаны в Ргасйса1 1ттипо1оду, 2пй ей. ЬекБе Нийкоп апй Ргапк С. Нау; В1аскте11 8с1епййс РиЪНсайопк 1980).
Гены, кодирующие иммуноглобулин 1В7, клонировали из клеточной линии 1В7 с использованием стандартных методик (ЗатЪгоок е1 а1., 2001, М0ЬЕСиЬАК С^ОNINС: А ЬАБ0КАТ0КУ МАNυА^, 3й ей., Со1й δρπηβ НагЪог ЬаЪогаШгу Рге88, Со1й δρπηβ НагЪог, ΝΥ). Переключения изотипа человеческих тАЪ анти-ЬиВ7КР1 достигали путем клонирования фрагментов вариабельной области, содержащих липкие концы сайтов рестрикции ХЪа1 и В8тВ1, в векторе ρΌδΚα с константной областью 1§С1 или 1ш1дС2 человека, который также имеет концы ХЪа1 и ВятВР Для анти-тиВ7КР1 1В7 крысы образовали химерное антитело в процессе трех стадий перекрывающейся ПЦР. Вариабельную область крысы амплифицировали с помощью ПЦР с использованием 3' праймера, который содержал участок ~25-35 нуклеотидов мышиной константной области. Мышиную константную область амплифицировали с использованием 5' праймера, который содержал участок ~25-35 нуклеотидов вариабельной области крысы. Затем эти два фрагмента использовали в качестве матрицы, и 5' праймеры к вариабельной области крысы (содержащей ХЪа1) и 3' праймеры к константной области мыши (содержащей δа1I) использовали для получения полноразмерной легкой цепи или тяжелой цепи. Затем продукты ПЦР легкой цепи и тяжелой цепи переваривали ХЪа1 и δа1I и клонировали в ρΌδΚα19. Суммарно 25 мкг линеаризованной ДНК (12,5 мкг рОС323В ЬС + 12,5 мкг рОС324 НС) трансфецировали в клетки Сδ-9 с использованием электропорации, и клетки отбирали на среде с добавлением ΌΗΡΚ.
Для тестирования эффективности тАЪ 1В7у2 проводили планшетный анализ костимуляции с этим тАЪ. Результаты сравнивали с другими тАЪ против мышиного В7КР-1 (фиг. 10А). Как обсуждено выше, 1В7 представляет собой исходное тАЪ, продуцируемое гибридомой; тестировали два различных препарата (обозначенных 1.33 и 7.4). 5Е1 и 11С10 представляли собой другие моноклональные антитела анти-тБ7КР-1, полученные в слияниях, описанных выше. Наконец, НК5.3 представлял собой имеющееся в продаже анти-тБ7КР-1 (ЕЪюкаепсек # 16-5985-85).
МАЪ 1В7у2 блокировало Т-клеточную активацию в данном анализе в равной степени или лучше, чем любые другие тАЪ, и, таким образом, оно было отобрано в качестве суррогатного терапевтического антитела для дальнейших исследований.
Стимуляция антигеном у мышей
Гемоцианин лимфы улитки (КЕН) закупали в Р1егсе Вю1есЬпо1оду (КоскГогй, 1Шпо18). Дозируемый раствор #1 (КЬН 5 мг/кг в 1 мг АЬиМ/мышь) получали из равных частей 2х АЬиМ (500 мг АЬиМ и 50 мл ФСБ (фосфатно-солевого буфера)) и 2х КЬН (2,0 мл йН20 (свободной от РНКазы) смешивали с 20 мг лиофилизированного КЬН, доводили до 20 мл 1х ФСБ). Дозируемый раствор #2 (КЬН 1 мг/кг в 1 мг АЬиМ/мышь) готовили из 1 части 2х КЬН, смешанной с 4 частями 1х фосфатно-солевого буфера.
Самок мышей ВАЬВ/с примировали 1 мг/кг КЬН/АЕиМ и повторно иммунизировали на сутки 21 только 5 мг/кг КЬН, введенными внутрибрюшинно. Мышей обрабатывали путем внутрибрюшинной инъекции 1В7у.2, антитела контроля изотипа (анти-АСР3 РВ), или только одного носителя (ФСБ), начиная на сутки 1 (за один день до примирования КЬН/АЕиМ) в конечном объеме 200 мкл каждые 5 суток.
Каждые 7 суток у мышей забирали кровь из ретроорбитальной пазухи (примерно 200 мкл), чтобы получить примерно 50-100 мкл сыворотки для анализа на специфичную к антигену сыворотку 1дМ (фиг. 10Б), 1§С2а (фиг. 10В) и 1§С1 (фиг. 10Г). Как мыши с контролем изотипа, так и мыши, обработанные носителем, показали значимые первичные и вторичные иммунные ответы. На ответ 1дМ не влияла обработка, тогда как блокирование В7КР-1-IСОδ с помощью 1В7у2 статистически значимо снизило первичные и вторичные ответы 1§С2а и 1дС1.
ИЛ-5 представляет собой цитокин, высвобождаемый Т-клетками в ответ на антигенную стимуляцию, который индуцирует дифференциацию и функцию В-клеток. Поскольку взаимодействие В7КР1/Ιί'Όδ, как полагают, является критическим для зависимой от Т-клеток функции В-клеток, измерение уровней ИЛ-5 в сыворотке использовали для того, чтобы определить, действительно ли блокирование системы В7КР-1/IСОδ действует на функцию Т-клеток. Как ожидали, блокирование В7КР-1 также ингибировало индуцируемые антигеном уровни ИЛ-5 в сыворотке. Сыворотки были собраны от мышей в эксперименте по антигенной стимуляции, описанном выше, через 24 ч после антигенной стимуляции на сутки 21, и уровни ИЛ-5 в сыворотке определяли с помощью ЭЛАИЗА. Как показано на фиг. 11, повышенные уровни ИЛ-5 были обнаружены у испытуемых мышей уже спустя 9 ч после стимуляции; уровни начали уменьшаться через 48 ч и вернулись к базовому уровню через 72 ч. Обработка мышей тАЪ 1В7у2 приводит к статистически значимой репрессии уровней ИЛ-5 на 24 ч.
Пример 11
Связывание с В7КР-1 яванской макаки
Чтобы определить, связывается ли тАЪ анти-ЬБ7КР-1 также с В7КР-1 яванской макаки, проводили эксперименты проточной цитометрии на окрашивание с тАЪ 16Н и с В-клетками, очищенными из яван- 32 021669 ских макак и людей. Как показано на фиг. 12А, добавление флуоресцентно меченого 16Н к В-клеткам яванской макаки приводит к окрашиванию, что указывает на то, что 16Н действительно связывается с В7КР-1 яванской макаки (правая панель). Как ожидали, 16Н также окрашивает В-клетки человека (левая панель). Кроме того, 16Н, 16Нд и 5Ό тестировали в планшетном анализе костимуляции с использованием Т-клеток яванской макаки, В7КР-1-Рс яванской макаки и тАЬ анти-СО3. Как показано на фиг. 12Б, все три тАЬ ингибировали В7КР-1-зависимую активацию Т-клеток яванской макаки, что указывает на то, что эти тАЬ функционально блокируют взаимодействие с 1СО8-В7КР-1 яванской макаки.
Пример 12
Ответы на антиген, зависимые от Т-клеток, у яванской макаки после введения антител анти-В7КР-1
Исследование на яванской макаке проводили с двумя моноклональными антителами анти-В7КР-1 16Н и 5Ό, чтобы оценить способность этих антител ингибировать ответ В-клеток на антиген, зависимый от Т-клеток, который определяют на основании уровней специфичного к антигену антитела в сыворотке. Кратко, ответы на гемоцианин лимфы улитки (КЬН) и антитела против столбнячного анатоксина исследовали после антигенной стимуляции в присутствии антител к В7КР-1 у яванской макаки.
Объектом испытаний 1 было 16Н, а объектом испытаний 2 было 5Ό. Контрольным объектом был носитель для антитела В7КР-1 (0,01 М ацетат натрия, рН 5,0, 5% сорбит, 0,004% Твин 20). Гемоцианин лимфы улитки (КЬН) закупали в Р1егсе ВюГесЬпо1оду (Коск&гб, 1Шпо1к).
КЬН готовили путем восстановления стерильной водой с получением концентрированного раствора 10 мг/мл. Этот концентрированный раствор разводили стерильной водой с получением дозирующего раствора 1 мг/мл. Столбнячный анатоксин, использованный для этих экспериментов, представлял собой столбнячный анатоксин §ирег-ТеГ® \у/На\1одеп®, закупленный у фирмы 1п1егуе1™ 1пс. (МПкЬого, Эе1а\\аге). Уровень дозы для этих экспериментов составлял 75 М.Е. (0,5 мл, 150 М.Е./мл).
В табл. 6 представлено распределение 28 яванских макак по группам обработки.
Таблица 6
№ Группы Количество самцов/самок Объект испытаний Путь введе ния Уровень дозы (мг/кг) Объем дозы (мл/кг) Концентрация дозируемого раствора (мг/мл)
1 2/2 Контрольный в/в 0 1 0
2 2/2 В7РР-1 50 в/в 0,1 1 0,1
3 2/2 В7РР-1 50 в/в 1.0 1 1.0
4 2/2 В7РР-1 50 в/в 8,0 1 10,0
5 2/2 В7РР-1 16Н в/в 0.1 1 0,1
6 2/2 В7КР-1 16Н в/в 1.0 1 1.0
7 2/2 В7НР-1 16Н в/в 8.0 1 10,0
Дозы объектов испытаний вводили всем животным путем внутривенной инъекции на сутки 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50. Животные, намеченные для вскрытия в группах 1-4 (1/пол/группа), получали дополнительную дозу на сутки 57. Оценку иммунного ответа проводили на всех животных путем иммунизации КЬН и антигенами столбнячного анатоксина с последующим забором крови на специфичные к антигену иммуноглобулины (1дМ и 1дО).
Значения титров присутствовали после первичного введения как КЬН, так и антигенов столбняка. Для КЬН первичные значения титра находились в интервале от 0 до 900 как для 1дМ, так и для 1дС. Поскольку первичную стимуляцию КЬН проводили до введения объекта испытаний, влияние антител к В7КР-1 не оценивали. Для столбнячного анатоксина первичные значения титра находились в интервале от 0 до 50 для 1дМ и от 0 до 4050 для 1дС. Отсутствовали различия в первичном ответе на столбнячный анатоксин между группами антитела В7КР-1 и контрольной группой.
Как ожидали, значения титра для 1дС повышались после вторичного введения как КЬН, так и антигенов столбняка, по сравнению с первичными значениями титра. Для КЬН вторичные значения титра находились в интервале от 0 до 300 для 1дМ и от 0 до 8100 для 1дС. Однако не было никаких данных за ингибирование вторичного ответа КЬН вследствие введения антител В7КР-1.
Для столбнячного анатоксина вторичные значения титра были ниже 50 для 1дМ и находились в интервале от 1350 до 36450 для 1дС. Результаты для индивидуального животного и средние значения для группы представлены на фиг. 13А (антитело 16Н) и фиг. 13Б (антитело 5Ό) на сутки 53 и 57 после вторичной стимуляции столбнячным анатоксином на сутки 42.
На сутки 53 число животных, достигающих максимального ответа, составляло 3/4, 1/4 и 1/4 при уровнях дозы 0,1, 1 и 8 мг/кг 16Н соответственно и 1/4, 1/4 и 1/4 при уровнях дозы 0,1, 1 и 8 мг/кг 5Ό соответственно по сравнению с 2/4 в контрольной группе животных. Таким образом, в целом, число животных, достигающих высокого титра на сутки 53, было снижено в группах, обработанных антителом В7КР-1. На сутки 57 значения титра сохранились в контрольной группе животных, хотя значения титра для нескольких животных, обработанных антителом В7КР-1, отклонялись от значений для суток 53. Число животных с высокими титрами на сутки 57 составляло 0/4, 0/4 и 1/4 при уровнях дозы 0,1, 1 и 8 мг/кг 16Н соответственно и 0/4, 0/4 и 0/4 при уровнях дозы 0,1, 1 и 8 мг/кг 5Ό соответственно по сравнению с 2/4 в контрольной группе животных.
Эти результаты показали, что два антитела к В7КР-1, 16Н и 5Ό, ингибировали ответ В-клеток на антиген, зависимый от Т-клеток, у яванской макаки, как определено на основании уровней антитела,
- 33 021669 специфичного к столбнячному анатоксину, в сыворотке. Кроме того, присутствие антител В7КР-1 было важно для блокирования взаимодействия В7КР-1-1СОЗ при первичном ответе, чтобы обнаружить эффект после вторичной стимуляции.
Эти результаты и результаты примера 10 показали, что и суррогатные терапевтические агенты, и терапевтические агенты-кандидаты блокировали зависимые от Т- и В-клеток иммунные ответы в модельных системах мыши и обезьяны, что указывает на то, что блокирование этой системы костимуляции может быть эффективным при лечении заболеваний, опосредованных В-клетками, таких как системная красная волчанка (8ЬЕ), астма и ревматоидный артрит (РА).
Понятно, что в приведенном выше описании подчеркнуты определенные конкретные воплощения изобретения и что все модификации или альтернативы, эквивалентные им, находятся в пределах сущности и объема изобретения, как сформулировано в прилагаемой формуле изобретения.
Перечень последовательностей

Claims (34)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим В7КР1, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяже- 63 021669 лой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей 8ЕО ГО N0: 7-14.
  2. 2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей 8Е0 ГО N0: 7-14.
  3. 3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь включает СГОКЕ который имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, 30 или 35.
  4. 4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь включает СГОК3, который имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 29, 32, 34, 37, 38 или 40.
  5. 5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где тяжелая цепь включает СГОК2, который имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 28, 31, 33, 36 или 39.
  6. 6. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим В7КР1, содержащее:
    а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 7, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    б) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 8, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:
    1, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    в) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 9, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:
    2, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    г) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 10, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    д) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 11, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 3, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    е) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 12, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    ж) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 13, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 5, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    з) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 14, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 6, или ее антигенсвязывающий фрагмент.
  7. 7. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим В7КР1, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1-6.
  8. 8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где вариабельная область легкой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей 8Е0 ГО N0: 1-6.
  9. 9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где легкая цепь включает СГОКЕ который имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 15, 18 или 24.
  10. 10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где легкая цепь включает СГОК3, который имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 17, 20, 22, 23, 25 или 26.
  11. 11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где легкая цепь включает СГОК2, который имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 16, 19 или 21.
  12. 12. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим В7КР1, содержащие:
    а) СГОК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, СГОК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 28, и СГОК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 29; или
    б) СГОК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 30, СГОК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 31, и СГОК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 32; или
    в) СГОК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 27, СГОК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 33, и СГОК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 34; или
    г) СГОК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 35, СГОК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 36, и СГОК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 37; или
    - 64 021669
    д) СЭК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 27, СГОК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 33, и СГОК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 38; или
    е) СГОК1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 35, СГОК2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 39, и СГОК3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 40.
  13. 13. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим В7КР1, содержащее аминокислотную последовательность, как представлено в любой из последовательностей ЗЕЦ ГО NО: 44-58 или 70-76 согласно нижеследующей таблице:
    Антитело Вариабельная область тяжелой цепи + константная область тяжелой цепи Полноразмерная тяжелая цепь 16Н(к|С2) ЗЕО ГО N0:7 +ЗЕО ГО ΝΟ: 41 ЗЕО ГО N0 44 16Н(1дС1) ЗЕО ГО N0: 7 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 70 16НЯ(1ЯС2) ЗЕО ГО N0: 8 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0 46 16Ня(1яС1) ЗЕО ГО N0: 8 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 71 50(1яС1) ЗЕО ГО N0: 9 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 47 5ϋ(№2) ЗЕО ГО N0:9 +ЗЕО ГО N0:41 ЗЕО ГО N0 72 2Н(1яС2) ЗЕО ГО N0:10+ ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0 49 2Н(1яС1) ЗЕО ГО N0: 10 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 73 2Ня(1яС2) ЗЕО ГО N0:11 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0 51 2Ня(1яС1) ЗЕО ГО N0:11+ ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 74 43Η(ΙςΘ2) ЗЕО ГО N0: 14 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0 52 43Н(1дО1) ЗЕО ГО N0: 14 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 75 41Н(1яС2) ЗЕО ГО N0:13 + ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0 54 41Н(1дО1) ЗЕО ГО N0: 13 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 76 15Н(1дС2) ЗЕО ГО N0:12 +ЗЕО ГО N0: 41 ЗЕО ГО N0 56 15Н(1дО1) ЗЕО ГО N0: 12 + ЗЕО ГО N0: 42 ЗЕО ГО N0 57 Антитело Вариабельная область легкой цепи + константная область легкой цепи Полноразмерная легкая цепь 16Н ЗЕО ГО N0: 1 + ЗЕО ГО N0: 43 ЗЕО ГО N0 45 5ϋ ЗЕО ГО N0: 2 + ЗЕО ГО N0: 43 ЗЕО ГО N0 48 2Н ЗЕО ГО N0: 3 + ЗЕО ГО N0: 43 ЗЕО ГО N0 50 43Н ЗЕО ГО N0:6 +ЗЕО ГО N0: 43 ЗЕО ГО N0 53 41Н ЗЕО ГО N0: 5 + ЗЕО ГО N0: 43 ЗЕО ГО N0 55 15Н ЗЕО ГО N0: 4 +ЗЕО ГО N0: 43 ЗЕО ГО N0 58
  14. 14. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.13, содержащее:
    а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 44 или 70, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 45, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    б) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 46 или 71, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 45, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    в) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 47 или 72, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 48, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    г) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 49 или 73, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 50, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    д) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 51 или 74, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 50, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    е) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 56 или 57, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 58, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    ж) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 54 или 76, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 55, или ее антигенсвязывающий фрагмент; или
    з) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 52 или 75, или ее антигенсвязывающий фрагмент, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО NО: 53, или ее антигенсвязывающий фрагмент.
  15. 15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14, где вариабельные области тяжелой и легкой цепи образуют одноцепочечное антитело.
  16. 16. Антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14, который представляет собой Ρν, РаЬ, РаЬ' или (РаЬ')2 фрагмент.
  17. 17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14, где это антитело представляет собой полностью человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
  18. 18. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14, ингибирующие активность В7КР1.
  19. 19. Изолированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14, которые
    - 65 021669 специфично связываются с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 66, но не ЗЕО ГО N0: 67, внеклеточного домена человеческого В7КР1.
  20. 20. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1, 7 или 12, которое специфично связывается с человеческим В7КР1 и конкурирует за связывание с человеческим В7КР1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, имеющим тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 8, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность ЗЕО ίΌ N0: 1.
  21. 21. Способ лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного ответа у пациента, при котором пациенту вводят фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14.
  22. 22. Способ по п.21, где аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит или системную красную волчанку.
  23. 23. Способ по п.21, где воспалительный ответ представляет собой астму.
  24. 24. Способ ингибирования костимуляторного сигнала активации Т-клеток у пациента, при котором пациенту вводят фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14.
  25. 25. Способ лечения пациента, страдающего астмой, ревматоидным артритом или системной красной волчанкой, при котором пациенту вводят фармацевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14.
  26. 26. Композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-14.
  27. 27. Способ лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного ответа у пациента, при котором пациенту вводят композицию по п.26.
  28. 28. Способ обнаружения В7КР1 в биологическом образце, при котором:
    а) приводят в контакт образец с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.1-14 в условиях, которые обеспечивают возможность связывания антитела с В7КР1; и
    б) измеряют уровень связанного антитела в образце.
  29. 29. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14.
  30. 30. Экспрессирующий вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.29.
  31. 31. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.29 или экспрессирующий вектор по п.30.
  32. 32. Изолированная клеточная линия, которая продуцирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14.
  33. 33. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-19, при котором культивируют клетку-хозяин по п.31 или клеточную линию по п.32 и собирают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент из культуральной среды или из клетки-хозяина.
  34. 34. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученное способом по п.33.
EA200800355A 2005-07-18 2006-07-18 Нейтрализующие антитела человека против b7rp1 EA021669B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70026505P 2005-07-18 2005-07-18
PCT/US2006/027862 WO2007011941A2 (en) 2005-07-18 2006-07-18 Human anti-b7rp1 neutralizing antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800355A1 EA200800355A1 (ru) 2008-08-29
EA021669B1 true EA021669B1 (ru) 2015-08-31

Family

ID=37562100

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800355A EA021669B1 (ru) 2005-07-18 2006-07-18 Нейтрализующие антитела человека против b7rp1

Country Status (26)

Country Link
US (4) US7868140B2 (ru)
EP (7) EP2397498A3 (ru)
JP (1) JP5142998B2 (ru)
KR (4) KR20140097582A (ru)
CN (1) CN101321783B (ru)
AU (1) AU2006270009A1 (ru)
BR (1) BRPI0614040B8 (ru)
CA (2) CA2854576A1 (ru)
CR (1) CR9745A (ru)
DK (1) DK1915398T3 (ru)
EA (1) EA021669B1 (ru)
ES (1) ES2572177T3 (ru)
HK (1) HK1120049A1 (ru)
HR (1) HRP20160875T1 (ru)
HU (1) HUE028830T2 (ru)
IL (6) IL188642A (ru)
MX (1) MX2008000734A (ru)
NO (1) NO345593B1 (ru)
NZ (2) NZ604090A (ru)
PL (1) PL1915398T3 (ru)
RS (1) RS54984B1 (ru)
SG (2) SG164369A1 (ru)
SI (1) SI1915398T1 (ru)
UA (1) UA102667C2 (ru)
WO (1) WO2007011941A2 (ru)
ZA (1) ZA200801137B (ru)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8624010B1 (en) 1999-02-03 2014-01-07 Steven K. Yoshinaga Nucleic acids encoding B7RP1
CA2362126C (en) * 1999-02-03 2017-01-17 Amgen Inc. B7rp-1 polypeptides
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
MX2008000734A (es) * 2005-07-18 2008-03-19 Amgen Inc Anticuerpos neutralizadores humanos anti-b7rp1.
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
WO2009043049A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
AR074439A1 (es) * 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cmet (receptor c-met)
US9469691B2 (en) 2008-12-02 2016-10-18 Pierre Fabre Medicament Anti-cMET antibody
WO2010064090A1 (en) * 2008-12-02 2010-06-10 Pierre Fabre Medicament Process for the modulation of the antagonistic activity of a monoclonal antibody
AR074438A1 (es) * 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal
US8545839B2 (en) 2008-12-02 2013-10-01 Pierre Fabre Medicament Anti-c-Met antibody
WO2010117455A2 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Human monoclonal antibodies protective against bubonic plaque
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
FI2575935T4 (fi) 2010-06-07 2023-11-23 Amgen Inc Lääkeaineen vapautuslaite
ES2757857T3 (es) 2010-09-27 2020-04-30 Janssen Biotech Inc Anticuerpos de unión a colágeno II humano
US8906649B2 (en) 2010-09-27 2014-12-09 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
ES2725785T3 (es) 2011-04-20 2019-09-27 Amgen Inc Aparato autoinyector
EP3045190B1 (en) 2011-10-14 2022-06-15 Amgen Inc. Injector and method of assembly
EA034989B1 (ru) 2011-10-28 2020-04-15 Тева Фармасьютикал Австралия Пти Лтд Полипептидная конструкция для применения при лечении рака, включающая аттенуированный альфа-интерферон
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
AU2013348071B2 (en) 2012-11-21 2018-05-24 Amgen Inc. Drug delivery device
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) * 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
ES2973257T3 (es) 2013-03-15 2024-06-19 Amgen Inc Casete de fármaco, autoinyector y sistema de autoinyector
TWI580452B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒、注射器及使用包括自動注射器及匣盒之設備之方法
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
ES2853748T3 (es) 2013-03-22 2021-09-17 Amgen Inc Inyector y método de montaje
CA2909921C (en) 2013-04-23 2022-12-06 The University Court Of The University Of Aberdeen Synthetic library of specific binding molecules
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
DK3677591T5 (da) 2013-04-29 2024-08-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antistoffer og fusioner til svækket interferon alpha-2b
CA2923145A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
CN106103480B (zh) 2014-01-10 2021-10-22 安奈普泰斯生物有限公司 针对白介素-33(il-33)的抗体
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
BR112016022508A2 (pt) 2014-03-31 2017-10-10 Norinnova Tech Transfer As anticorpos contra hpa-1a
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
EP3139977B1 (en) 2014-05-07 2021-02-17 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
ES2981280T3 (es) 2014-06-03 2024-10-08 Amgen Inc Sistema de administración de fármacos controlable y método de uso
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
US20160145344A1 (en) * 2014-10-20 2016-05-26 University Of Southern California Murine and human innate lymphoid cells and lung inflammation
EP3212216A4 (en) 2014-10-29 2018-04-18 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha2b variants
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
US11357916B2 (en) 2014-12-19 2022-06-14 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
EP3258988B1 (en) 2015-02-17 2019-08-28 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
ITUB20151014A1 (it) * 2015-05-27 2016-11-27 Univ Degli Studi Del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro Ligandi del recettore b7h nel trattamento di osteopenia e osteoporosi
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
CA3004138A1 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding pd-1 and tim-3 and their uses
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
US11200298B2 (en) 2016-03-15 2021-12-14 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
MX2018012472A (es) 2016-04-15 2019-08-12 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras variantes de ligando icos y sus usos.
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
JP7309363B2 (ja) 2016-05-13 2023-07-18 アムジエン・インコーポレーテツド バイアル・スリーブ組立体
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3515489A4 (en) * 2016-09-19 2020-05-06 Oncoimmune, Inc. CD80 AND CD86 BINDING PROTEIN COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
AU2018221351B2 (en) 2017-02-17 2023-02-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
US11986624B2 (en) 2017-03-09 2024-05-21 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
AU2018235928B2 (en) 2017-03-14 2023-09-21 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
SG11201907676PA (en) 2017-03-28 2019-09-27 Amgen Inc Plunger rod and syringe assembly system and method
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
EP3634539A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
WO2019014014A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Amgen Inc. NEEDLE INSERTION-RETRACTING SYSTEM HAVING DOUBLE TORSION SPRING SYSTEM
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
MA50614A (fr) 2017-10-06 2020-08-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble de verrouillage et procédé d'assemblage associé
IL273323B2 (en) 2017-10-09 2024-10-01 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related assembly method
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
MA50569A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Ensembles de remplissage-finition et procédés associés
EP3706830B1 (en) 2017-11-06 2024-08-07 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
EP3706826A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
CN111278487B (zh) 2017-11-16 2022-06-24 安进公司 用于药物递送装置的门闩锁机构
KR20200135781A (ko) 2018-03-26 2020-12-03 암젠 인크 세포 배양에서 생산된 항체의 총 비푸코실화 당형태
KR20210005053A (ko) 2018-04-12 2021-01-13 암젠 인크 안정한 단백질 조성물의 제조 방법
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000748A (es) 2018-07-24 2021-03-26 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
MA53724A (fr) 2018-09-24 2021-12-29 Amgen Inc Systèmes et procédés de dosage interventionnel
WO2020068476A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
MX2021003492A (es) 2018-10-02 2021-06-18 Amgen Inc Sistemas de inyeccion para la administracion de farmacos con transmision de fuerza interna.
JP7547325B2 (ja) 2018-10-05 2024-09-09 アムジエン・インコーポレーテツド 投薬量インジケータを有する薬物送達デバイス
EP3866890A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
TWI846741B (zh) 2018-10-15 2024-07-01 美商安進公司 用於藥物遞送裝置之平台組裝方法
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
AU2019370159A1 (en) 2018-11-01 2021-04-22 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
KR20220069982A (ko) 2019-09-26 2022-05-27 암젠 인크 항체 조성물의 생산 방법
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN115925900B (zh) * 2020-08-19 2024-06-25 重庆医科大学 新型冠状病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
AU2021360897A1 (en) 2020-10-15 2023-05-25 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
IL307418A (en) 2021-05-21 2023-12-01 Amgen Inc A method for optimizing a filling recipe for a drug container
CA3222409A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
EP4413377A1 (en) 2021-10-05 2024-08-14 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046240A2 (en) * 1999-02-03 2000-08-10 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
WO2002044364A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
EP1374902A1 (en) * 2001-03-27 2004-01-02 Japan Tobacco Inc. Remedies for inflammatory bowel diseases
WO2006003999A1 (ja) * 2004-07-05 2006-01-12 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗ヒトb7rp-1抗体およびその抗体フラグメント

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990014363A1 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Amgen Inc. Metalloproteinase inhibitor
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
JPH06508035A (ja) 1991-06-14 1994-09-14 ディーエヌエックス　コーポレーション トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
ATE549918T1 (de) 1996-12-03 2012-04-15 Amgen Fremont Inc Menschliche antikörper, die ausdrücklich menschliches tnf alpha binden
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7435796B1 (en) * 1999-02-03 2008-10-14 Amgen Inc. Antibodies which bind B7RP1
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
TR200501367T2 (tr) 1999-03-25 2005-09-21 Abbott Gmbh & Co. Kg Beşeri IL-12'yi bağlayan beşeri antikorlar ve bunları üretmek için yöntemler.
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
WO2001014424A2 (en) * 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
AU7599500A (en) * 1999-09-21 2001-04-24 Genetics Institute Inc. Novel gl50 molecules and uses therefor
GB0016633D0 (en) 2000-07-07 2000-08-23 Bp Exploration Operating Process
AU2003295411A1 (en) 2002-11-07 2004-06-03 Celltech R & D Human monoclonal antibodies to heparanase
CA2523716C (en) 2003-05-31 2014-11-25 Micromet Ag Human anti-human cd3 binding molecules
US7271245B2 (en) * 2004-02-13 2007-09-18 The Scripps Research Institute Methods and compositions for inhibition of metastasis
MX2008000734A (es) * 2005-07-18 2008-03-19 Amgen Inc Anticuerpos neutralizadores humanos anti-b7rp1.
WO2013180295A1 (ja) 2012-06-01 2013-12-05 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046240A2 (en) * 1999-02-03 2000-08-10 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
WO2002044364A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
EP1374902A1 (en) * 2001-03-27 2004-01-02 Japan Tobacco Inc. Remedies for inflammatory bowel diseases
WO2006003999A1 (ja) * 2004-07-05 2006-01-12 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ヒト抗ヒトb7rp-1抗体およびその抗体フラグメント

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IWAI H. ET AL. "Amelioration of collagen-induced arthritis by blockade of inducible costimulator-B7 homologous protein costimulation". 15 October 2002 (2002-10-15), JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, PAGE(S) 4332-4339, XP002336753, ISSN: 0022-1767, see Materials and methods *
KHAYYAMIAN S. ET AL. "ICOS-ligand, expressed on human endothelial cells, costimulates h1 and Th2 cytokine secretion by memory CD4+ T cells". PNAS, vol. 99, no. 9, 2002, pages 6198-6203, XP002414707, see paragraph "Materials and methods" *
RICHTER G. ET AL. "Tumor Necrosis Factor-alpha regulates the expression of inducible costimulator receptor ligand on CD34+ progenitor cells during differentiation into antigen presenting cells". THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 49, 2001, pages 45686-45693, XP002414708, cf abstract and experimental procedures *
TOTSUKA TERUJI ET AL. "Ameliorating effect of anti-inducible costimulator monoclonal antibody in a murine model of chronic colitis". February 2003 (2003-02), GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER, PHILADELPHIA, PA, US, PAGE(S) 410-421, XP002297200, ISSN: 0016-5085, see Materials and methods *
WAHL P. ET AL. "Interaction of b7rp1 with ICOS nagatively regulates antigen presentation by B cells". INFLAMMATION, vol. 27, no. 4, 2003, pages 191-200, XP002414710, cf materials and methods *
WAHL P. ET AL. "Renal tubular epithelial expression of the costimulatory molecule b7rp1 (inducible costimulator ligand)". J AM SOC NEPHROL, vol. 13, 2002, pages 1517-1526, XP002414709, see materials and methods *

Also Published As

Publication number Publication date
SG164369A1 (en) 2010-09-29
US20110104757A1 (en) 2011-05-05
WO2007011941A2 (en) 2007-01-25
EA200800355A1 (ru) 2008-08-29
EP2397497A2 (en) 2011-12-21
EP2388276A3 (en) 2013-11-27
NO20080302L (no) 2008-04-15
BRPI0614040B8 (pt) 2021-05-25
RS54984B1 (sr) 2016-11-30
JP2009501549A (ja) 2009-01-22
CR9745A (es) 2008-07-22
WO2007011941A9 (en) 2008-02-21
KR20100101016A (ko) 2010-09-15
EP2397497A3 (en) 2013-11-27
CN101321783B (zh) 2015-08-26
BRPI0614040A2 (pt) 2011-03-09
EP2397498A3 (en) 2013-11-27
DK1915398T3 (en) 2016-07-04
EP2388277A3 (en) 2013-03-20
IL218889A0 (en) 2012-05-31
US8981071B2 (en) 2015-03-17
IL188642A (en) 2015-01-29
NZ604090A (en) 2014-07-25
EP2388276A2 (en) 2011-11-23
EP2397499A2 (en) 2011-12-21
IL218890A0 (en) 2012-05-31
NZ625807A (en) 2015-11-27
EP2397496A2 (en) 2011-12-21
EP2397498A2 (en) 2011-12-21
KR101024758B1 (ko) 2011-03-24
SI1915398T1 (sl) 2016-07-29
EP2397496A3 (en) 2013-05-29
IL218888A0 (en) 2012-05-31
IL218893A0 (en) 2012-05-31
WO2007011941A3 (en) 2007-05-03
ES2572177T3 (es) 2016-05-30
HUE028830T2 (en) 2017-01-30
US20080166352A1 (en) 2008-07-10
SG196835A1 (en) 2014-02-13
EP2397499A3 (en) 2013-12-25
CA2854576A1 (en) 2007-01-25
MX2008000734A (es) 2008-03-19
KR20130023356A (ko) 2013-03-07
US20160145345A1 (en) 2016-05-26
IL188642A0 (en) 2008-04-13
BRPI0614040B1 (pt) 2020-02-04
US7868140B2 (en) 2011-01-11
ZA200801137B (en) 2010-05-26
KR20140097582A (ko) 2014-08-06
HRP20160875T1 (hr) 2016-09-23
PL1915398T3 (pl) 2016-10-31
NO345593B1 (no) 2021-05-03
UA102667C2 (ru) 2013-08-12
IL218892A0 (en) 2012-05-31
US9266945B2 (en) 2016-02-23
EP2388277A2 (en) 2011-11-23
US20130171695A1 (en) 2013-07-04
KR20080049014A (ko) 2008-06-03
JP5142998B2 (ja) 2013-02-13
CA2614972C (en) 2014-08-19
AU2006270009A1 (en) 2007-01-25
CN101321783A (zh) 2008-12-10
HK1120049A1 (zh) 2009-03-20
CA2614972A1 (en) 2007-01-25
EP1915398B1 (en) 2016-04-20
EP1915398A2 (en) 2008-04-30
KR101263079B1 (ko) 2013-05-09
US10072090B2 (en) 2018-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021669B1 (ru) Нейтрализующие антитела человека против b7rp1
JP5594982B2 (ja) 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
CA2501653A1 (en) Human anti-ifn-.gamma. neutralizing antibodies as selective ifn-.gamma. pathway inhibitors
EA030259B1 (ru) Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf
AU2017200408B2 (en) Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
AU2011265342B2 (en) Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title