EA030259B1 - Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf - Google Patents

Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf Download PDF

Info

Publication number
EA030259B1
EA030259B1 EA201000245A EA201000245A EA030259B1 EA 030259 B1 EA030259 B1 EA 030259B1 EA 201000245 A EA201000245 A EA 201000245A EA 201000245 A EA201000245 A EA 201000245A EA 030259 B1 EA030259 B1 EA 030259B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
pain
human
amino acid
antibodies
Prior art date
Application number
EA201000245A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201000245A1 (ru
EA030259B8 (ru
Inventor
Кеннет Д. мл. Уайлд
Джеймс Дж. С. Тринор
Хайчунь Хуан
Хизер Иноу
Те Дж. Чжан
Франк Мартин
Original Assignee
Амджен Инк.
МЕДАРЕКС Л.Л.Си.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амджен Инк., МЕДАРЕКС Л.Л.Си. filed Critical Амджен Инк.
Publication of EA201000245A1 publication Critical patent/EA201000245A1/ru
Publication of EA030259B1 publication Critical patent/EA030259B1/ru
Publication of EA030259B8 publication Critical patent/EA030259B8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

В изобретении предложено антитело, которое связывается с фактором роста нервов (NGF) человека и посредством этого нейтрализует функцию NGF. В изобретении также предложена фармацевтическая композиция указанного антитела и ее применение для производства лекарства для лечения связанных с NGF расстройств. Также предложен способ обнаружения NGF в биологическом образце с использованием указанного антитела.

Description

Изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связывают фактор роста нервов (ΝΟΡ). Также раскрыты композиции и способы лечения боли и расстройств, связанных с болью.
Предшествующий уровень техники
Ежедневно более двух миллионов человек в США теряют трудоспособность по причине хронической боли (1е88е11 апб Ке11у, 1991, Раш апб Апа1де81а ίη РКШС1РЬЕБ ОР ИЕиКАЬ δΟΙΕΝΟΕ, 3гб Еб. (Капбе1, БсНиаП/, апб 1е88е11, еб.), Екеу1ег, №ν Уогк). К сожалению, современные варианты терапевтического лечения боли эффективны лишь отчасти, и многие из этих методов сами по себе вызывают расстройства или дают вредные побочные эффекты. Так, несмотря на то, что нестероидные противовоспалительные лекарства (НСПВЛ), такие как аспирин, ибупрофен и индометацин являются умеренно эффективными против воспалительной боли, они, также, токсичны для почек и в высоких дозах имеют тенденцию вызывать желудочно-кишечное раздражение, язвы, кровотечение, а также спутанность сознания. Пациенты, которых лечат опиоидами, также часто испытывают спутанность сознания, а долгосрочное применение опиоидов связано с толерантностью и зависимостью. Местные анестетики, такие как лидокаин и мексилетин, ингибируют боль и одновременно вызывают потерю нормальной чувствительности.
Боль представляет собой восприятие, основанное на сигналах, полученных из окружающей среды и передаваемых и интерпретируемых нервной системой (в качестве обзора см. Мй1ап, 1999, Ргод. №игоЪю1. 57: 1-164). Повреждающие стимулы, такие как тепло и прикосновение, заставляют специализированные сенсорные рецепторы в коже посылать сигналы в центральную нервную систему (ЦНС). Этот процесс называется ноцицепцией, и периферические сенсорные нейроны, которые опосредуют его, представляют собой ноцицепторы. В зависимости от силы сигнала от ноцицептора(ов) и абстрагирования и обработки этого сигнала ЦНС человек может воспринимать или не воспринимать повреждающий стимул как болезненный. Когда чье-либо восприятие боли точно калибровано по интенсивности стимула, боль выполняет предназначенную ей защитную функцию. Однако некоторые типы повреждения ткани вызывают явление, известное как гипералгезия или проноцицепция, при котором относительно безвредные стимулы воспринимаются как интенсивно болезненные, поскольку болевые пороги человека снижены. Как воспаление, так и повреждение нерва может вызвать гипералгезию. Лица, пораженные воспалительными состояниями, такими как солнечный ожог, остеоартрит, колит, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы (которые включают ревматоидный артрит и волчанку) и тому подобное, часто испытывают повышенную чувствительность к боли. Подобным образом, травма, операция, ампутация, абсцесс, каузалгия, сосудистые коллагенозы, демиелинизирующие заболевания, невралгия тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, инфекционный герпес, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапия вызывают повреждения нервов, которые приводят к обширной боли.
Поскольку механизмы, посредством которых ноцицепторы передают внешние сигналы в нормальном состоянии и в состоянии гипералгезии, становятся более понятными, процессы, вовлеченные в гипералгезию, могут быть мишенями ингибирования снижения болевого порога и посредством этого уменьшить количество испытываемой боли.
Показано, что нейротрофические факторы играют значительные роли в передаче физиологической и патологической боли. Фактор роста нервов (ΝΟΡ) оказывается особенно важным (в качестве обзора см. МсМайоп, 1996, РЫ1. Тгап8. К. Бое. Ьопб. 351: 431-40 и Ар£е1, 2000, Тйе СНтса1 1оигпа1 о£ Раш 16 : δ7δ11). Показано, что как местное, так и системное введение ΝΟΡ вызывает гипералгезию и аллодинию (Ъе\уи1 е! а1., 1994, Еиг. 1. №иго8С1. 6: 1903-1912). Внутривенная инфузия ΝΟΡ приводит у людей к миалгии всего тела, тогда как местное введение вызывает гипералгезию и аллодинию места инъекции помимо системных эффектов (Ар£е1 е! а1., 1998, №иго1оду 51: 695-702).
Существует также значительная масса данных о вовлечении эндогенного ΝΟΡ в состояния, при которых боль является существенным признаком. Например, ΝΟΡ положительно регулируется в Шванновских клетках спинного корневого ганглия (ИКС, бог8а1 гоо! дапдйоп) в течение по меньшей мере 2 месяцев после повреждения периферического нерва, и сообщалось о повышенных уровнях в суставах животных, страдающих рядом моделей артрита (например, А1ое е! а1., 1993, ОгоМй Рас!ог8 9: 149-155). Что касается людей, уровни ΝΟΡ повышены в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным или другими типами артрита (например, А1ое е! а1., 1992, Аг1НпО8 апб КйеитаЩт 35: 351-355). Кроме того, продемонстрировано, что антагонизм функции ΝΟΡ предупреждает гипералгезию и аллодинию в моделях невропатологической и хронической воспалительной боли. Например, в животных моделях невропатологической боли (например, лигирование нервного ствола или спинномозгового нерва) системная инъекция нейтрализующих антител к ΝΟΡ предупреждает как аллодинию, так и гипералгезию (Катег е! а1., 1999, Еиг. 1. №иго8С1. 11: 837-846 и Ко е! а1., 1999, Рат 79: 265-274). Примеры антител к ΝΟΡ, известных в данной области, включают, например, РСТ публикации АО 01/78698, АО 01/64247, АО 02/096458 и АО 2004/032870; патенты США № 5844092, 5877016 и 6153189; Нопдо е! а1., 2000, НуЪпбота 19: 215- 1 030259
227; Ноидо е! а1., 1993, Се11. Μοί. Βΐοί. 13: 559-568 и ОепВапк Лсеезяоп № И39608, И39609, Й17078 или Й17077.
Понятно, что существует необходимость в новых безопасных и эффективных методах терапии боли, в частности, направленных на низкомолекулярные медиаторы или агенты, обостряющие боль, такие как ΝΟΡ.
Краткое изложение сущности изобретения
В данном изобретении предложены новые человеческие моноклональные антитела, которые являются терапевтически полезными для устранения боли. Конкретно, согласно изобретению, предложены моноклональные антитела, которые связываются с фактором роста нервной ткани (ΝΟΡ). Предпочтительно эти моноклональные антитела представляют собой человеческие моноклональные антитела и нейтрализуют биологическую активность ΝΟΡ, а также являются полезными для облегчения эффектов ΝΟΡ-опосредованных болевых ответов. Также изобретением предложены клетки, которые продуцируют и наиболее предпочтительно секретируют в клеточную культуральную среду моноклональные антитела по изобретению. Помимо их применения для лечения и устранения боли, антитела по изобретению полезны для лечения невропатологических и воспалительных ответов, связанных с болью.
Далее согласно изобретению предложены слитые белки, содержащие последовательность Рсучастка антитела и одну или более чем одну последовательность, идентифицированную как 8ЕО ГО N0: 10, 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 16, 8ЕО ГО N0: 18, 8ЕО ГО N0: 20, 8ЕО ГО N0: 22 и 8Е0 ГО N0: 79-130. Такие молекулы могут быть получены методами, описанными, например, в заявке \У0 00/24782, которая включена сюда путем ссылки. Такие молекулы можно экспрессировать, например, в клетках млекопитающих (например в клетках яичника китайского хомячка) или в бактериальных клетках (например, в клетках Е. сой).
В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие антитела и человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4 или 8Е0 ГО N0: 6, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Предпочтительно тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 4.
В некоторых аспектах изобретении предложены антитела, предпочтительно человеческие антитела и более предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из константных областей тяжелой цепи 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4, 1дМ, 1дА и 1дЕ или любых их аллельных вариантов (как раскрыто в Кайа! е! а1., 1991, 8ес.|иепсе5 о! Рго1еш8 о! 1ттиио1одюа1 йИегеЧ. ΡίΓιΠ Ебйюп, и. 8. Оераптеи! о! НеаИй апб Нитап 8егу1се8, №Н РиЪйсайоп № 91-3242), включенной сюда путем ссылки, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Предпочтительно антитело по изобретению содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи 1дО2, показанной 8Е0 ГО N0: 4, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно человеческие антитела и более предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 8, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах антитела по изобретению содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В других аспектах вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В дополнительных аспектах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из 8Е0 ГО N0: 14, 8Е0 ГО N0: 18 или 8Е0 ГО N0: 20, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В следующих дополнительных аспектах легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из 8Е0 ГО N0: 16, 20, 24, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Изобретением также предложены антитела, которые специфично связываются с NΟΡ, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в
- 2 030259 δΕφ ΙΌ N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Далее, согласно изобретению предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связываются с ΝΟΡ, содержащие: (а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 79, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 80, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина; (б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 81, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 82, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина; (в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 83, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 84, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина; либо (г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 86, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 87, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах изобретении также предложены антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, причем эта вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в δΕφ ΙΌ N0: 10, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, причем эта вариабельная область легкой цепи включает в себя последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в δΕφ ΙΌ N0: 12, причем указанное антитело специфично связывается с N0?.
В изобретении также предложены антитела, которые специфично связываются с N0?, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную δΕφ ΙΌ N0: 14, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную δΕφ ΙΌ N0: 16, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах в изобретении также предложены антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, причем эта вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из δΕφ ΙΌ N0: 14, δΕφ ΙΌ N0: 18 или δΕφ ΙΌ N0: 22, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, причем эта вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентичности аминокислотной последовательности, показанной в δΕφ ΙΌ N0: 16, где это антитело специфично связывается с N0?.
В изобретении также предложены одноцепочечные антитела, одноцепочечные Ρν-антитела, Р(аЬ)антитела, Р(аЬ)'-антитела и (РаЬ')2-антитела.
В конкретных аспектах изобретения предложена легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ΙΌ N0: 16, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Кроме того, в изобретении предложена тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в любой из δΕφ ΙΌ N0: 14, δΕφ ΙΌ N0: 18 или δΕφ ΙΌ N0: 22, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Изобретение также относится к изолированным человеческим антителам, которые специфично связывают N0?, содержащим: (а) каркасные участки тяжелой цепи человека, 0ΌΚ1 область тяжелой цепи
- 3 030259 человека, СЭК2 область тяжелой цепи человека и СЭК3 область тяжелой цепи человека; и (б) каркасные участки легкой цепи человека, СЭК1 область легкой цепи человека, СЭК2 область легкой цепи человека и СЭК3 область легкой цепи человека. В некоторых аспектах СЭК1 область тяжелой цепи человека может представлять собой СГОК1 область тяжелой цепи моноклонального антитела (тАЬ), обозначенную как 4Ό4, показанную в 8Еф ГО N0: 22, и СЭК1 область легкой цепи человека может представлять собой СОК! область легкой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Еф ГО N0: 24. В других аспектах СГОК2 область тяжелой цепи человека может представлять собой СГОК2 область тяжелой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Е0 ГО N0: 18, и СГОК2 область легкой цепи человека может представлять собой СГОК2 область легкой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Еф ГО N0: 20. В некоторых других аспектах СГОК3 область тяжелой цепи человека представляет собой СГОК3 область тяжелой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Еф ГО N0: 14, и СГОК3 область легкой цепи человека представляет собой СГОК3 область легкой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Еф ГО N0: 16.
В изобретении также предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связывают фактор роста нервов, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8ΕΩ ГО N0: 10, 5ЕО ГО N0: 79, 5ЕО ГО N0: 81, 5ЕО ГО N0: 83, 5ЕО ГО N0: 85 или 5ЕО ГО N0: 87, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Далее, в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связывают ЬСЕ. содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь включает в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в δΕφ ГО N0: 12, 5ЕО ГО N0: 80, 5ЕО ГО N0: 82, 5ЕО ГО N0: 84, 5ЕО ГО N0: 86, 5ЕО ГО N0: 88, 5ЕО ГО N0: 89, 5ЕО ГО N0: 90, 8Е0 ГО N0: 91 или 8Еф ГО N0: 131, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Антитела по изобретению характеризуются способностью антагонизировать по меньшей мере одну активность ίη νίίτο и/или ίη νίνο, связанную с полипептидами NСЕ. Предпочтительно в изобретении предложены изолированные человеческие антитела к человеческому NСЕ с высоким аффинитетом связывания с этими полипептидами NСЕ, причем указанные антитела связываются с человеческим полипептидом NСЕ и диссоциируют от человеческого полипептида NСЕ с константой диссоциации (Кс) примерно 50х10-12 М или менее, как определено с помощью КшЕхА, или антитела, которые ингибируют индуцированное NСЕ выживание в анализе нейтрализации ίη νίίτο при 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
В предпочтительном воплощении изобретения предложено изолированное человеческое антитело к человеческому NСЕ, которое имеет приведенные ниже характеристики:
а) ингибирует индуцированное NСЕ выживание в анализе нейтрализации ίη νίίτο при 1С50 примерно 1 х 10-9 М или менее;
б) имеют СГОК3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 14, и
в) имеют СГОК3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 16.
В изобретении также предложены изолированные человеческие антитела или их антигенсвязывающие или иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулина, которые специфично связываются с NСЕ с высоким аффинитетом, причем указанные антитела или фрагменты диссоциируют от человеческого полипептида NСЕ при Кс примерно 1 х 10-9 или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого NСЕ в стандартном анализе ίη νίίτο при 1С50 примерно 1х10-8 М или менее, и где указанные антитела или фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя:
а) область СГОКЕ содержащую аминокислотную последовательность формулы
где а1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а2 представляет собой ароматический аминокислотный остаток; а3 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный, ароматический аминокислотный остаток; а4 представляет собой нейтральный гидрофобный или алифатический аминокислотный остаток и а5 представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток;
б) область С0К2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
где
Ь1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь3 представляет собой полярный гидрофильный или ароматический аминокислотный остаток; Ь4 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; Ь5-Ь9 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические аминокислотные остатки; Ь10 представ- 4 030259 ляет собой полярный гидрофильный, ароматический или алифатический аминокислотный остаток; Ь11 представляет собой ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь12 представляет собой алифатический гидрофобный или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь13 представляет собой алифатический, гидрофобный или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь14 и Ь16 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; Ь15 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток и Ь17 представляет собой алифатический кислый аминокислотный остаток и
в) область СЭКЗ. содержащую аминокислотную последовательность формулы
где с1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с2 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с3 и с4 независимо отсутствуют или представляют собой полярные гидрофильные, ароматические гидрофобные или алифатические аминокислотные остатки; с5 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или ароматический аминокислотный остаток; с6 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с7 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с8 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; с9 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с10 представляет собой полярный гидрофильный, ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с11-с13 независимо представляют собой полярные гидрофильные или ароматические гидрофобные аминокислотные остатки; с14 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с15 представляет собой полярный гидрофильный или нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; с16 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и с17 представляет собой ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток.
В одном аспекте а1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а2 представляет собой ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; а3 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; а4 представляет собой нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; а5 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь1 представляет собой алифатический или ароматический аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой 11е; Ь3 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь4 представляет собой полярный гидрофильный или ароматический аминокислотный остаток; Ь5-Ь9 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические аминокислотные остатки; Ь10 представляет собой алифатический аминокислотный остаток; Ь11 представляет собой Туг; Ь12 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь13 представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь14 и Ь16 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; Ь15 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь17 представляет собой алифатический кислый аминокислотный остаток; с1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с2 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с3 и с4 независимо отсутствуют или представляют собой полярные гидрофильные, ароматические гидрофобные или алифатические аминокислотные остатки; с5 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; с6 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с7 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с8 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; с9 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с10 представляет собой полярный гидрофильный, ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с11-с13 независимо представляют собой полярные гидрофильные или ароматические гидрофобные аминокислотные остатки; с14 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с15 представляет собой полярный гидрофильный или нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; с16 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и с17 представляет собой ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток.
В конкретном аспекте а1 представляет собой 8ег, Акр или ТЬг; а2 представляет собой Туг; а3 представляет собой А1а, 8ег, Тгр или С1у; а4 представляет собой Ме! или 11е; а5 представляет собой Ηίκ, С1у или Акп; Ь1 представляет собой Туг, С1у, 11е или Акр; Ь2 представляет собой 11е; Ь3 представляет собой 8ет, ТЬт, Туг или Акп; Ь4 представляет собой Тгр, Агд или Рго; Ь5 представляет собой 8ег, Акп или С1у; Ь6 представляет собой 8ег, Агд, Акр или С1у; Ь7 представляет собой 8ег, Шк или С1у; Ь8 представляет собой 8ег, 11е, Акр или ТЬг; Ь9 представляет собой Ьеи, 11е или ТЬг; Ь10 представляет собой С1у, Ьук или РЬе; Ь11 представляет собой Туг; Ь12 представляет собой А1а или 8ег; Ь13 представляет собой Акр, С1у или Рго; Ь14
- 5 030259 представляет собой 8ег; Ь15 представляет собой Уа1 или РЬе; Ь16 представляет собой Ьук или О1и; Ь17 представляет собой О1у; с1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с2 отсутствует или представляет собой Туг; с3 и с4 независимо отсутствуют, представляют собой Туг, Аки, Уа1 или О1и; с5 отсутствует, представляет собой 8ег, О1у или Тгр; с6 отсутствует, представляет собой 8ег, О1у, О1и или Ьеи; с7 представляет собой О1у, Агд или Акр; с8 представляет собой Тгр, Рго, 8ег или ТЬг; с9 представляет собой Ηίκ. О1у или Туг; с10 представляет собой Уа1, Туг или Агд; с11-с13 независимо представляют собой 8ег, РИе, Туг, Акр или Акп; с14 представляет собой РИе, Уа1 или О1у; с15 представляет собой Ме! или Акр; с16 отсутствует, представляет собой Акр или Акп и с17 представляет собой Туг или Уа1.
В другом конкретном аспекте а1 представляет собой 8ег или Акр; а2 представляет собой Туг; а3 представляет собой А1а или 8ег; а4 представляет собой Ме! или 11е; а5 представляет собой Нк или Акп; Ь1 представляет собой Туг или О1у; Ь2 представляет собой 11е; Ь3 представляет собой 8ег, ТЬг, Туг или Акп; Ь4 представляет собой Тгр, Агд или Рго; Ь5 представляет собой 8ег или Акп; Ь6 представляет собой 8ег или Агд; Ь7 представляет собой Нк или О1у; Ь3 представляет собой 11е или ТЬг; Ь9 представляет собой Ьеи, 11е или ТЬг; Ь10 представляет собой О1у или РЬе; Ь11 представляет собой Туг; Ь12 представляет собой А1а или 8ег; Ь13 представляет собой Акр или О1у; Ь14 представляет собой 8ег; Ь15 представляет собой Уа1 или РЬе; Ь16 представляет собой Ьук или О1п; Ь17 представляет собой О1у; с1 отсутствует или представляет собой О1у; с2 отсутствует или представляет собой Туг; с3 и с4 независимо отсутствуют, представляют собой Туг, О1у или Уа1; с5 отсутствует или представляет собой 8ег; с6 представляет собой 8ег или О1у; с7 представляет собой О1у или Агд; с8 представляет собой Тгр или Рго; с9 представляет собой Нк, О1у или Туг; с10 представляет собой Уа1 или Туг; с11-с13 независимо представляют собой 8ег, Туг, РЬе или Акр; с14 представляет собой РЬе или Уа1; с15 представляет собой Ме! или Акр; с16 отсутствует или представляет собой Акр и с17 представляет собой Туг или Уа1.
В других конкретных аспектах изобретения:
а) СИРТ тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 22; СГОР2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 18; и СИР 3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 14;
б) СГОР1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 92; СГОР2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 93; и СИР 3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 94;
в) СГОР1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 98; СГОР2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 99; и СИР 3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 100;
г) СГОР1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 104; СГОР2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 105; и СИР 3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 106;
д) СГОР1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 110; СГОР2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 111; и СИР 3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 112; и
е) СГОР1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 116; СГОР2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 117; и СИР 3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Еф ГО N0: 118.
В изобретении также предложено изолированное человеческое антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, которое специфично связывается с N0?, причем указанное антитело или фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, включающую в себя:
а) область СГОРЕ содержащую аминокислотную последовательность формулы
где а1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а2, а11 и а12 независимо представляют собой алифатические или гидрофобные аминокислотные остатки; а3, а5, а7 и а8 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; а4 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а6 представляет собой алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; а9 отсутствует или представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток и а10 представляет собой алифатический, ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток;
б) область СГОР2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
где
Ь1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь3 и Ь4 неза- 6 030259 висимо представляют собой полярные гидрофильные, алифатические или гидрофобные аминокислотные остатки; Ь5 представляет собой полярный гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь6 представляет собой полярный гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток и Ь7 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и
в) область СЭРЗ. содержащую аминокислотную последовательность формулы
где с1 и с2 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; с3 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; с4, с5 и с6 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; с7 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с8 представляет собой полярный гидрофильный или гидрофобный аминокислотный остаток и с9 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток, и где указанное антитело или фрагмент диссоциирует от человеческого полипептида ΝΟΡ с Кс примерно 1х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ΝΟΡ в стандартном анализе ίη νίΐτο при 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
В одном аспекте а1, а3, а4, а7 и а8 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; а2, а6, а11 и а12 независимо представляют собой алифатические гидрофобные аминокислотные остатки; а5 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; а9 отсутствует или представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а10 представляет собой алифатический или ароматический аминокислотный остаток; Ь1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь3, Ь4 и Ь7 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; Ь5 и Ь6 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические гидрофобные аминокислотные остатки; с1 и с2 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; с3 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; с4, с5 и с6 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; с7 отсутствует или представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с8 представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток и с9 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток.
В частности, а1, а3, а4 и а7 представляют собой Лтд, Зег, Οίη и Зег соответственно; а2 представляет собой А1а; а5 представляет собой О1у или Зег; а8 представляет собой Зег или 11е а9 отсутствует, представляет собой Зег или О1у; а10 представляет собой А1а, Туг, Тгр или РИе; Ь1 представляет собой Акр, О1у, А1а или Уа1; Ь2 и Ь3 представляют собой А1а и Зег соответственно; Ь4 представляет собой Зег или Акп; Ь5 представляет собой Ьеи или Агд; Ь6 представляет собой О1и, А1а или Ο1η; Ь7 представляет собой Зег или ТИг; с1 и с2 представляют собой Ο1η; с3 представляет собой РИе, Туг, Агд или А1а; с4 представляет собой Акп, О1у или Зег; с5 представляет собой Зег или Акп; с6 представляет собой Туг, Зег, Тгр или РИе; с7 отсутствует, представляет собой Рго или Ηίκ; с8 представляет собой Ьеи, Тгр, Туг или Агд и с9 представляет собой ТИг.
В другом частном случае а1, а2, а3, а4 и а7 представляют собой Агд, А1а, Зег, Ο1η и Зет соответственно; а5 представляет собой О1у или Зег; а8 представляет собой Зег или 11е; а9 отсутствует, представляет собой Зег или О1у; а10 представляет собой А1а или Туг; Ь1 представляет собой Акр или О1у; Ь2 и Ь3 представляют собой А1а и Зег соответственно; Ь4 представляет собой Зег или Акп; Ь5 представляет собой Ьеи или Агд; Ь6 представляет собой О1и, А1а или Ο1η; Ь7 представляет собой Зег или ТИг; с1 и с2 представляют собой Ο1η; с3 представляет собой РИе, Туг, Агд или А1а; с4 представляет собой Акп, О1у или Зег; с5 представляет собой Зег или Акп; с6 представляет собой Туг, Зег, Тгр или РИе; с7 отсутствует, представляет собой Рго или Шк; с8 представляет собой Ьеи, Тгр, Туг или Агд и с9 представляет собой ТИг.
В других частных случаях изобретения:
а) СОРТ легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 24; СГОР2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 20; и СОР 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 16;
б) СГОР1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 95; СГОР2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 96; и СОР 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 97;
в) СГОР1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 101; СГОР2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 102; и СОР 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 103;
г) СГОР1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 107; СГОР2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕО ГО N0: 108; и СОР 3
- 7 030259 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 109;
д) СГОВ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 113; СГОВ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 114; и СГОК 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 115;
е) СГОР1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 119; СГОВ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 120; и СОК 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 121;
ж) СГОВ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 122; СГОВ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 123; и СОК 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 124;
з) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 125; СГОВ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 126; и СОК 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 127;
и) СГОК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 128; СГОК2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 129; и СОК 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 130 и
к) СГОР1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 132; СГОР2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 133; и СОК 3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 134.
Часть изобретения также составляют полинуклеотидные последовательности, которые кодируют новые человеческие антитела к человеческому ЬСЕ. векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие человеческие антитела к человеческому NΟЕ, клетки-хозяева, трансформированные векторами, включающими полинуклеотиды, которые кодируют человеческие антитела к человеческому NΟЕ, препараты, содержащие человеческие антитела к человеческому NΟЕ, и способы их получения и применения.
В изобретении также предложены способы определения уровня NΟЕ в биологическом образце, при котором этот образец приводят в контакт с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитело анти-ЫОЕ по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы, анализы иммунопреципитации и твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЫ8А) (см. 8о1а, 1987, Мопос1опа1 ЛпВЬобГ: А Мапиа1 оЕ ТесНпищеь рр. 147-158, СКС Рге88, 1пс.) для обнаружения и количественного определения NΟЕ. Указанные антитела могут связывать NΟЕ с аффинитетом, который соответствует используемому способу анализа.
Кроме того, в изобретении предложены способы лечения заболевания, связанного с повышенным продуцированием NΟЕ или с повышенной чувствительностью к NΟЕ, при которых индивидууму, нуждающемуся в этом, вводят фармацевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело по изобретению или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Конкретные предпочтительные воплощения изобретения станут очевидны из приведенного ниже более подробного описания конкретных предпочтительных воплощений и формулы изобретения.
Краткое описание графических матеиралов
На фиг. 1 представлены графики, которые демонстрируют нейтрализацию активности NΟЕ в основанном на нейронах ОКО количественном определении биологической активности моноклональными антителами 4Ό4, очищенными из кондиционированной среды гибридомы.
На фиг. 2 представлены графики, которые демонстрируют экспрессию УК1, стимулированную активностью человеческого NОЕ, и нейтрализацию активности NОЕ в основанном на нейронах ОКО количественном определении биологической активности моноклональным антителом к NОЕ (4Ό4), очищенным из кондиционированной среды гибридомы.
На фиг. 3 представлены графики, которые демонстрируют нейтрализацию активности NОЕ в основанном на нейронах ОКО количественном определении биологической активности транзитно экспрессирующимися рекомбинантными моноклональными антителами анти-ЫОЕ 4Ό4, экспрессированными либо в виде 1дО1, либо в виде 1дО2, в клетках, выращенных либо в роллерной культуре (К), либо в спинкультуре (с постоянным перемешиванием) (§).
На фиг. 4 представлено сопоставление последовательностей нейротрофинов. Цифры и элементы вторичной структуры над последовательностью относятся к зрелому человеческому NОЕ. Консервативные остатки отмечены звездочками, а области с низкой гомологией последовательности затемнены. NОЕ человека представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 135; NОЕ мыши представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 136; ВОЬЕ представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 137; ЬТ3 представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 138.
На фиг. 5 показано сопоставление СГОВ1 тяжелой цепи антитела к NОЕ и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕЦ ГО N0: 98), 6Н9 (8ЕЦ ГО N0: 104), 7Н2 (81+) ГО N0: 110), 4О6 (81+) ГО N0: 116), 141)11 (81+) ГО N0: 92) и 4Ό4 (81+) ГО N0: 22).
На фиг. 6 показано сопоставление СГОВ2 тяжелой цепи анти-ЫОЕ и процент идентичности для ан- 8 030259 тител 14Ό10 (516) ΙΌ N0: 99), 6Н9 (516) ΙΌ N0: 105), 7Н2 (516) ΙΌ N0: 111), 406 (516) ΙΌ N0: 117), 14Ό11 (516) ΙΌ N0: 93) и 4Ό4 (516) ΙΌ N0: 18).
На фиг. 7 показано сопоставление СГОР3 тяжелой цепи анги-ИОР и процент идентичности для антител 14Ό10 (516) ГО N0: 100), 6Н9 (516) ГО N0: 106), 7Н2 (516) ГО N0: 112), 406 (516) ГО N0: 118), 141)11 (516) ГО N0: 94) и 4Ό4 (516) ГО N0: 14).
На фиг. 8 показано сопоставление СГОР1 легкой цепи анти-Ы0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (516) ГО N0: 95), 6Н9 (516) ГО N0: 107), 7Н2 (516) ГО N0: 113), 406а (516) ГО N0: 119), 4О6Ь (516) ГО N0: 122), 406с (516) ГО N0: 125), 4066 (516) ГО N0: 128), 4О6е (516) ГО N0: 132), 14Ό11 (516) ГО N0: 95) и 4Ό4 (5Е0 ГО N0: 24) (406а обозначен на различных фиг. как 20031028340; 4О6Ь обозначен на различных фиг. как 20031028351; 406с обозначен на различных фиг. как 20031071526; 4066 обозначен на различных фиг. как 20031028344; 406е обозначен на различных фиг. как 20031000528).
На фиг. 9 показано сопоставление СГОР2 легкой цепи анти-Ы0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (516) ГО N0: 96), 6Н9 (516) ГО N0: 108), 7Н2 (516) ГО N0: 114), 406а (516) ГО N0: 120), 406Ь (516) ГО N0: 123), 406с (516) ГО N0: 126), 4066 (516) ГО N0: 129), 406е (516) ГО N0: 133), 14Ό11 (516) ГО N0: 96) и 4Ό4 (5Е0 ГО N0: 20) (406а обозначен на разных фиг. как 20031028340; 406Ь обозначен на разных фиг. как 20031028351; 406с обозначен на разных фиг. как 20031071526; 4066 обозначен на разных фиг. как 20031028344; 406е обозначен на разных фиг. как 20031000528).
На фиг. 10 показано сопоставление СГОР3 легкой цепи анти-Ы0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (516) ГО N0: 97), 6Н9 (516) ГО N0: 109), 7Н2 (516) ГО N0: 115), 406а (516) ГО N0: 121), 406Ь (516) ГО N0: 124), 406с (516) ГО N0: 127), 4066 (516) ГО N0: 130), 406е (516) ГО N0: 134), 14Ό11 (516) ГО N0: 97) и 4О4(8Ер ГО N0: 16) (406а обозначен на разных фиг. как 20031028340; 406Ь обозначен на разных фиг. как 20031028351; 406с обозначен на разных фиг. как 20031071526; 4066 обозначен на разных фиг. как 20031028344; 406е обозначен на разных фиг. как 20031000528).
На фиг. 11 показано сопоставление легкой цепи анти-Ы0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (516) ГО N0: 82), 6Н9 (516) ГО N0: 84), 7Н2 (516) ГО N0: 86), 406а (516) ГО N0: 88), 406Ь (516) ГО N0: 89), 406с (516) ГО N0: 90), 4066 (516) ГО N0: 91), 406е (516) ГО N0: 131), 14Ό11 (516) ГО N0: 80) и 4Ό4 (5Е0 ГО N0: 12) (406а обозначен на разных фиг. как 20031028340; 406Ь обозначен на разных фиг. как 20031028351; 406с обозначен на разных фиг. как 20031071526; 4066 обозначен на разных фиг. как 20031028344; 406е обозначен на разных фиг. как 20031000528).
На фиг. 12 показано сопоставление тяжелой цепи анти-Ы0Р и процент идентичности для антител 4Ό4 (516) ГО N0: 10), 406 (516) ГО N0:87), 14Ό10 (516) ГО N0: 81), 14Ό11 (516) ГО N0: 79), 7Н2 (516) ГО N0:85) и 6Н9 (516) ГО N0: 83).
Подробное описание определенных предпочтительных воплощений
Заголовки разделов, используемые здесь, предназначены только для целей организации текста и не должны рассматриваться как ограничивающие сущность предложенного изобретения. Все документы, цитируемые в данной заявке, включены сюда путем ссылки.
Определения
Для работы с рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, для работы с культурой тканей, а также трансформации (например, электропорации, липофекции) могут быть применены традиционные методики.
Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить согласно указаниям фирмыпроизводителя, либо как их обычно выполняют в данной области или как описано в данной заявке. Вышеуказанные методики и процедуры можно, как правило, проводить хорошо известными в данной области способами и как описано в различных общих и более конкретных источниках, которые цитируются и обсуждаются на протяжении всего настоящего описания. См., например, 8атЬгоок е! а1., 2001, М0ЬЕСиРАК С1.0М60: Α ΡΛΒ0ΚΑΤ0ΚΥ МА6ЕАЕ. 36 е6., Со16 5ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге§5, Со16 8ргшд НагЬог, N. Υ., которое включено сюда путем ссылки для любой цели. Если не приведены конкретные определения, номенклатура, а также лабораторные процедуры и методики аналитической химии, органического синтеза, а также медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, хорошо известны и общепринято используются в данной области. Подобным образом, традиционные методики можно использовать для химических синтезов, химических анализов, приготовления и доставки фармацевтических препаратов, а также для лечения пациентов.
В настоящем описании изобретения приведенные ниже термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие приведенные ниже значения. Выражения биологическое свойство, биологическая характеристика и термин активность в отношении антитела по настоящему изобретению используют здесь взаимозаменяемо, и они включают, но не ограничены этим, эпитопный аффинитет и специфичность (например: человеческое антитело к человеческому NОР, связывающееся с человеческим NОР), способность оказывать антагонистическое действие в отношении активности целевого полипептида (например, активность NОР), стабильность антитела ίη У1уо и иммуногенные свойства антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, признанные в данной области, включают, например, перекрестную реактивность (то есть с не человеческими гомологами целевого полипептида или с другими белками или тканями в целом) и способность к сохранению высоких
- 9 030259 уровней экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеупомянутые свойства или характеристики можно наблюдать или измерять, используя признанные в данной области методики, включая, но не ограничиваясь ими, ЕЫ8А, конкурентный ЕЫ8А, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализы нейтрализации ίη νίίτο и ίη νίνο (см., например, Пример 2) и иммуногистохимию с тканевыми срезами из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник по мере необходимости. Конкретные активности и биологические свойства человеческих антител к человеческому ΝΟΡ более подробно описаны в приведенных ниже примерах.
Термин изолированный полинуклеотид, как его используют здесь, означает полинуклеотид геномного, кДНК- или синтетического происхождения или некоторую их комбинацию, где по своему происхождению изолированный полинуклеотид (1) не связан ни с целым полинуклеотидом, в котором этот изолированный полинуклеотид находится в природе, ни с его участком, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе или (3) не встречается в природе как часть большей последовательности.
Термин изолированный белок, используемый здесь, означает, что обсуждаемый белок (1) свободен по меньшей мере от нескольких других белков, с которыми он должен в норме находиться, (2) по существу свободен от других белков из того же источника, например, из того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, (4) отделен по меньшей мере от примерно 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе, (5) не связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с участками белка, с которыми изолированный белок связан в природе, (6) оперативно связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой изолированный белок может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другими РНК, иметь синтетическое происхождение, либо представлять собой любую их комбинацию. Предпочтительно изолированный белок по существу свободен от белков или полипептидов или других загрязнений, которые находятся в его природном окружении, которые препятствовали бы его применению (терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или другому).
Изолированное антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено от и/или выделено из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются вещества, которые препятствовали бы диагностическим или терапевтическим применениям этого антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие подобные или не подобные белку растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях антитело будет очищено (1) более чем до 95% мас./мас. антитела, как определено методом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем до 99% мас./мас., (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Νконцевой или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора с вращающимися лунками (крииипд сир кециепа1ог), либо (3) до гомогенности по ДСН-ПААГ электрофорезу в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях, используя окрашивание Кумасси голубым или предпочтительно серебром. К изолированным антителам относится антитело ш кЬи внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения этого антитела не будет присутствовать.
Термины полипептид или белок означают молекулы, имеющие последовательность нативных белков, то есть белков, продуцируемых природными, а именно нерекомбинантными клетками, либо полученных генно-инженерным путем или с использованием рекомбинантных клеткок, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты нативной последовательности. Термины полипептид и белок, конкретно, охватывают антитела к ΝΟΡ или последовательности, которые имеют делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты антитела к ΝΟΡ.
Термин полипептидный фрагмент относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую делецию, карбоксиконцевую делецию и/или внутреннюю делецию. В некоторых воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере от 5 до примерно 500 аминокислот. Должно быть понятно, что в некоторых воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот. В частности, полезные полипептидные фрагменты включают функциональные домены, в т.ч. связывающие домены. В случае антитела к ΝΟΡ полезные фрагменты включают, но не ограничены ими, область СЭР, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, участок цепи антитела или именно ее вариабельную область, включающую две СИР, и тому подобное.
Термин специфичный связывающий агент относится к природной или неприродной молекуле, которая специфично связывается с мишенью. Примеры специфичных связывающих агентов включают, но не ограничены ими, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды. В некоторых воплощениях специфичный связывающий агент представляет собой антитело.
Термин специфичный связывающий агент к ΝΟΡ относится к специфичному связывающему агенту, который специфично связывается с любым участком ΝΟΡ. В некоторых воплощениях специфичный связывающий агент к ΝΟΡ представляет собой антитело, которое специфично связывается с ΝΟΡ.
Термин иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, как его используют
- 10 030259 здесь, относится к полипептидному фрагменту, который содержит по меньшей мере СИР тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению способен связываться с антигеном. В предпочтительных воплощениях антиген представляет собой лиганд, который специфично связывается с рецептором. В этих воплощениях связывание иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина по изобретению предотвращает связывание лиганда с его рецептором, прерывая биологический ответ, который произошел бы при связывании лиганда с рецептором. Предпочтительно иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению специфично связывается с ΝΟΡ. Наиболее предпочтительно фрагмент специфично связывается с человеческим ΝΟΡ.
Термин природный, как его используют здесь и применяют к объекту, определяет тот факт, что этот объект может быть обнаружен в природе. Например, речь может идти о полипептидной или полинуклеотидной последовательности, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из источника в природе и которая не была намеренно модифицирована человеком.
Термин функциональным образом сцепленный означает, что компоненты, к которым применяют этот термин, находятся во взаимоотношениях, которые дают им возможность осуществлять свойственные им функции в подходящих условиях. Например, регуляторная последовательность, которая функциональным образом сцеплена с последовательностью, кодирующей белок, лигирована с ней таким образом, что в условиях, совместимых с транскрипционной активностью регуляторных последовательностей, осуществляется экспрессия последовательности, кодирующей белок.
Термин регуляторная последовательность, как его используют здесь, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые могут осуществлять экспрессию, процессинг или внутриклеточную локализацию кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких регуляторных последовательностей может зависеть от организма-хозяина. В конкретных воплощениях регуляторные последовательности для прокариот могут включать промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции. В других конкретных воплощениях регуляторные последовательности для эукариот могут включать промоторы, содержащие один или множество сайтов распознавания для факторов транскрипции, последовательности транскрипционных энхансеров, последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования. В некоторых воплощениях регуляторные последовательности могут включать лидерные последовательности и/или последовательности партнеров слияния.
Термин полинуклеотид здесь означает однонитевые или двунитевые нуклеиново-кислотные полимеры, имеющие по меньшей мере 10 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды, или дезоксирибонуклеотиды, либо модифицированную форму любого типа нуклеотида. Указанные модификации включают модификации оснований, такие как бромуридин, модификации рибозы, такие как арабинозид и 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидной связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат и фосфороамидат. Термин полинуклеотид, конкретно, включает однонитевые и двунитевые формы ДНК.
Термин олигонуклеотид, как он употребляется здесь, включает природные и модифицированные нуклеотиды, сшитые вместе природными и/или неприродными олигонуклеотидными сшивками. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов, которые являются однонитевыми и имеют длину 200 нуклеотидов или менее. В некоторых воплощениях изобретения длина олигонуклеотидов составляет от 10 до 60 нуклеотидов. В некоторых воплощениях длина изобретения олигонуклеотидов составляет 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми, например, для использования при конструировании генетического мутанта. Олигонуклеотиды по изобретению могут представлять собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды по отношению к последовательности, кодирующей белок.
Термин природные нуклеотиды включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин модифицированные нуклеотиды включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобным. Термин олигонуклеотидные сшивки включает олигонуклеотидные сшивки, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат, фосфороамидат и тому подобные. См., например, БаР1аисНе е! а1., 1986, №с1. Лс1Й8 Рек., 14: 9081; §1ес е! а1., 1984, 1. Ат. СНет. 8ос., 106: 6077; §1еш е! а1., 1988, №с1. Аайк Рек., 16: 3209; Ζοη е! а1., 1991, Аий-Саисег Игид Иек1ди, 6: 539; Ζοη е! а1., 1991, ОЬЮО^СРЕОТГОЕЗ ΑΝΌ ΑΝΑΕΟΟυΕδ: А РРАСТ1САЬ АРРРОАСН, рр. 87-108 (Р. Ескк!еш. Ей.), Ох&гй Еи1\егкИ\ Ргекк, Ох&гй Еид1аий; 8!ес е! а1., υδ № 5151510; иЬ1таии аий Реутаи, 1990, СЬетюа1 Ре\ае\\'5. 90: 543, описания которых включены сюда путем ссылки для любой цели. Олигонуклеотид может включать детектируемую метку, чтобы обеспечить обнаружение олигонуклеотида или его гибридизации.
Термин вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой вектор сшит. Одним из типов вектора является плазмида, которая представляет собой двунитевуюй петлю ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут
- 11 030259 быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клеткухозяина и посредством этого реплицируются параллельно с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно сцеплены. Такие векторы называют здесь рекомбинантными экспрессионными векторами (или просто экспрессионными векторами). Как правило, экспрессионные векторы, полезные в методиках рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее используемой используемой формой вектора. Однако в изобретение следует включать также другие формы экспрессионных векторов, например вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) обозначает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Специалистам в данной области должно быть понятно, что такие термины следует относить не только к конкретной обсуждаемой клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут встречаться в последующих поколениях либо вследствие мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство в действительности может не быть идентично родительской клетке, но тем не менее включено в объем термина клетка-хозяин, как его используют здесь. Для экспрессии антител по настоящему изобретению можно использовать широкий ряд экспрессионных систем-хозяев, включая бактериальные, дрожжевые, бакуловирусные и экспрессионные системы млекопитающих (а также экспрессионные системы фагового дисплея). Примером подходящего бактериального экспрессионного вектора является рИС19. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфецируют одним или более чем одним рекомбинантным вектором экспрессии, несущим фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина антитела, так что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в этой клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой культивируют эти клетки-хозяева, причем из этой среды антитела можно выделить. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК используют для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, для включения этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения векторов в клетки-хозяева, такие как описаны в 8атЬгоок е! а1., 2001, М0РРСиРАР С^0NIN0, А ЬАВ0КАΤ0ΚΥ ΜАNυА^, Со1д Зргшд НагЬог ЬаЬогаЮпек, Аи8иЬе1, Ρ. Μ. е! а1. (ед8.) Сиггеи! РгоЮсоР ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬНзЫпд А88оаа!е8 (1989) и в И8 № 4816397 !о Во88 е! а1.
Термином клетка-хозяин обозначают клетку, которая трансформирована или способна быть трансформированной нуклеиново-кислотной последовательностью, а затем способна к экспрессии выбранного интересующего гена. Этот термин охватывает и потомство родительской клетки, независимо от того, является ли это потомство идентичным по морфологии или по генотипу исходному родителю, если присутствует выбранный ген.
Используемым термином трансдукция обозначают перенос генов из одной бактерии в другую, обычно посредством фага. Трансдукция также относится к приобретению и переносу эукариотических клеточных последовательностей ретровирусами.
Используемый термин трансфекция применяют к захвату чужеродной или экзогенной ДНК клеткой; клетка трансфецирована, когда экзогенная ДНК введена внутрь клеточной мембраны. Ряд методик трансфекции хорошо известен в данной области и раскрыт здесь. См., например, ОгаЬат е! а1., 1973, VIго1оду 52: 456; ЗатЬгоок е! а1., 2001, М01.РСР1.АР СЬ0№^, А ЬАВ0РАТ0РУ МАМСАР. Сок! Зргшд НагЬог ЬаЬогаЮпез; Вата е! а1., 1986, ВА8Ю ΜΕΤΗ0Ό8 Ш М0РНСРРАР ΒΙ0Ε00Υ, Нкемег; и СЬи е! а1., 1981, Оепе 13: 197. Такие методики можно использовать для введения одной или более молекул экзогенной ДНК в подходящие клетки-хозяева.
Термин трансформация, как его используют здесь, относится к изменению в генетических характеристиках клетки, а клетка является трансформированной, если она была модифицирована таким образом, что содержит новую ДНК. Например, клетка является трансформированной, когда она является генетически модифицированной по отношению к ее нативному состоянию. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может рекомбинировать с ДНК клетки посредством физической интеграции в хромосому клетки, либо может сохраняться транзитно в виде эписомного элемента, не реплицируясь, либо может реплицироваться независимо в виде плазмиды. Клетку считают стабильно трансформированной, когда ДНК реплицируется при делении клетки.
Термин природный или нативный, когда его используют в связи с биологическими веществами, такими как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и тому подобное, относится к веществам, которые обнаруживаются в природе, а не сконструированы человеком. Подобным образом, термин неприродный или ненативный, как используют здесь, относится к веществу, которое не обнаруживается в природе или которое структурно модифицировано или синтезировано человеком.
Термин антиген относится к молекуле или к участку молекулы, которые способны связываться с агентом избирательного связывания, таким как антитело, и, кроме того, могут быть использованию у
- 12 030259 животного для продуцирования антител, способных связываться с эпитопом такого антигена. Антиген может иметь один или более чем один эпитоп.
Термин идентичность, как известно в данной области, относится к соотношению между последовательностями двух или более полипептидных молекул или двух или более молекул нуклеиновой кислоты, определенному путем сравнения их последовательностей. В данной области идентичность также означает степень родства последовательности молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, при возможном положении, определденной при сопоставлении нитей двух или более нуклеотидных или двух или более аминокислотных последовательностей. Идентичность определяет процент идентичных совпадений с наименьшей из двух или более последовательностей при выравнивании разрывов (если они есть) с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (то есть алгоритмов).
Термин подобие используют в данной области применительно к родственной концепции, но, в противоположность идентичности, подобие относится к мере родства, которая включает как идентичные совпадения, так и совпадения консервативных замен. Если две полипептидные последовательности имеют, например, 10/20 идентичных аминокислот, а остальные являются неконсервативными заменами, тогда и процент идентичности, и процент подобия будут равны 50%. Если в таком же примере имеется пять дополнительных положений, где существуют консервативные замены, тогда процент идентичности остается 50%, но процент подобия будет равен 75% (15/20). Следовательно, в случаях, когда имеются консервативные замены, процент подобия между двумя полипептидами будет выше, чем процент идентичности между этими двумя полипептидами.
Идентичность и подобие родственных нуклеиновых кислот и полипептидов можно легко вычислить известными способами. Такие способы включают, но не ограничены ими, способы, описанные в СОМРиТАТЮИАЬ МОЬЕСиЬАК ВЮЬОСУ (Ьекк А. М., ей.), 1988, ОхГогй ИшуегеНу Рге88, Хеи Уогк; В1ОСОМРИТПХС: 1ХРОКМАТ1СЗ АИИ СЕХОМЕ РКО.1ЕСТЗ (ЗпшП И. №., ей.), 1993, Асайет1с Рге88, Хеи Уогк; СОМРИТЕК ΆΧΆΕΥ3Ι3 ОР ЗЕСЕЕХСЕ ИАТА, Рай 1 (С.п1Тш А. М. апй СпП'ш Н. С., ей8.), 1994, Нитапа Рге88, Хеи Егееу; νοη Неще, С., ЗЕСЕЕХСЕ ΛΧΛΕΥ3Ι3 ΙΝ МОЬЕСИЬАК ВЮЬОСУ, 1987, Асайетю Рге88; ЗЕриЕХСЕ АХАЬУЗ1З РК1МЕК (ΟπΕΈον. М. апй Ое\'егеих. 1., ейь.), 1991, М. З!оск!оп Рге88, Хеи Уогк; Сай11о е! а1., 1988, З1АМ 1. Аррйей Ма1й., 48: 1073 и ИитЫп е! а1., ВЮЕОС1САЬ ЗЕриЕХСЕ АХАЬУЗ1З, СатЬпйде ипЫегейу Рте88.
Предпочтительные способы определения идентичности предназначены для получения наибольшего совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничены ими, пакет программ ССО, включая САР (Ие\'егеих е! а1., 1984, Хис1. Аай8 Ре8., 12: 387; Сепейс8 Сотри!ег Сгоир, ипЫегейу оГ ^18соп81п, Май18оп, №Ι), ВЬАЗТР, ВЬАЗТХ и РАЗТА (А1!8сйи1 е! а1., 1990, 1. Мо1. Вю1., 215: 403-410). Программа ВЬАЗТХ общедоступна от Хайопа1 Сеп!ег Гог Вю!есйпо1оду 1пГоттайоп (ХСВ1) и из других источников (ВЬАЗТ Мапиа1, А1Есйи1 е! а1., ХСВ/ХЪМ/ХИ Ве!йе8йа, МИ 20894; А1Есйи1 е! а1., 1990, см. выше). Можно также использовать хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана для определения идентичности.
Результатом некоторых схем сопоставления для выравнивания двух аминокислотных последовательностей может быть совпадение только короткой области этих двух последовательностей, и эта небольшая выровненная область может иметь очень высокую идентичность последовательности, даже при отсутствии значительного родства между двумя полноразмерными последовательностями. Соответственно, в некоторых воплощениях изобретения результатом выбранного способа сопоставления (программа САР) будет сопоставление, которое перекрывает по меньшей мере 50 смежных аминокислот целевого полипептида.
Например, используя компьютерный алгоритм САР (Сепейс8 Сотри!ег Сгоир, Ипщегейу оГ \У18соп81п, Май18оп, ^Ι), два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательности, сопоставляют с оптимальным совпадением их соответствующих аминокислот (совпадающий промежуток, как определено с помощью этого алгоритма). В некоторых воплощениях при использовании этого алгоритма применяют штраф на внесение делеции в сопоставление (который вычисляют как трехкратную среднюю диагональ; где средняя диагональ представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ представляет собой балл или число, приписываемое каждому точному совпадению аминокислот по конкретной матрице сопоставления), и штраф на продолжение делеции (который обычно составляет одну десятую штрафа на внесение делеции в сопоставление), а также матрицу сравнения, такую как РАМ250 или ВЬОЗИМ 62. В некоторых воплощениях в алгоритме также используют стандартную матрицу сравнения (см. ИаукоГГ е! а1., 1978, А!1а8 оГ Рто!еш Зесщепсе апй ЗйисЫте, 5: 345-352 для матрицы сравнения РАМ250; НешкоГГ е! а1., 1992, Ргос. Ха!1. Асай. За ИЗА, 89: 10915-10919 для матрицы сравнения ВЬОЗИМ 62).
В некоторых воплощениях изобретения параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующие:
Алгоритм: №ей1етап е! а1., 1970, 1. Мо1. Вю1., 48: 443-453;
- 13 030259
Матрица сравнения: ВЬ08ИМ 62 от НешкоГГ е! а1., 1992, см. выше;
Штраф на внесение делеции в сопоставление: 12
Штраф на длину делеции: 4
Порог подобия: 0
При использовании вышеуказанных параметров полезно применять программу ОАР можно. В некоторых воплощениях изобретения вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнений полипептидов (параллельно с отсутствием штрафа на концевые делеции) с использованием алгоритма ОАР.
Термин гомология относится к степени подобия между последовательностями белков или нуклеиновых кислот. Информация по гомологии полезна для понимания генетического происхождения определенных видов белков или нуклеиновых кислот. Гомологию можно определить путем сопоставления и сравнения последовательностей. Обычно, чтобы определить аминокислотную гомологию, последовательность белка сравнивают с базой данных известных последовательностей белков. Гомологичные последовательности имеют общие функциональные идентичности в каком-либо месте на протяжении их последовательностей. Высокая степень подобия или идентичности обычно является показателем гомологии, хотя низкая степень подобия или идентичности не обязательно является показателем отсутствия гомологии.
Несколько подходов можно использовать для сравнения аминокислот одной последовательности с аминокислотами другой последовательности с целью определения гомологии. Как правило, эти подходы попадают в две категории: (1) сравнение физических характеристик, таких как полярность, заряд и Вандер-ваальсов объем, для создания матрицы подобия; и (2) сравнение вероятной замены аминокислоты в последовательности какой-либо другой аминокислотой, которое основано на наблюдении многих белковых последовательностей из известных гомологичных белков и для создания матрицы приемлемых точечных мутаций (Рош! Ассер!е6 Ми1айоп Майтх, РАМ).
Процент идентичности можно также вычислить путем с использованием программы пее61е (пакет ЕМВ088) или к!ге!сйег (пакет ЕМВ088) либо программы айдп X в качестве модуля программного обеспечения уес!ог N71 кш!е 9.0.0, используя параметры по умолчанию (например, штраф на делеции - 5, штраф на внесение делеции в выравнивание - 15, штраф на продолжение делеции - 6.6).
Здесь используется традиционное обозначение двадцати основных аминокислот и их сокращений. См. ]ММЕ\0Е0О¥--А 8¥ЭТНЕ818, 2п6 Е6йюп (Е. 8. Оо1иЪ апб Ό. К. Огеп, Е6к.), 8шаиег Аккос1а!ек: 81.11^6:1116, МА, 1991), включенную сюда путем ссылки для любой цели. Стереоизомеры (например, Όаминокислоты) двадцати основных аминокислот; неприродные аминокислоты, такие как α,αдвузамещенные аминокислоты, ^алкиламинокислоты, молочная кислота и другие неосновные аминокислоты также могут быть пригодными компонентами полипептидов по изобретению. Примеры неосновных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, е-Ы^^-триметиллизин, е-Ыацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ^метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В обозначении полипептидов, используемом здесь, левое направление представляет собой аминоконцевое направление, а направление направо представляет собой карбоксил-концевое направление в соответствии с общепринятым использованием и соглашением.
Природные остатки можно разделить на классы на основании общих свойств боковой цепи:
1) гидрофобные: норлейцин (Щог), Ме!, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, Рйе, Тгр, Туг, Рго;
2) полярные гидрофильные: Агд, Акп, Акр, О1п, О1и, Н15, Ьук, 8ег, Тйг;
3) алифатические: А1а, О1у, 11е, Ьеи, Уа1, Рго;
4) алифатические гидрофобные: А1а, 11е, Ьеи, Уа1, Рго;
5) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ег, Тйг, Акп, О1п;
6) кислотные: Акр, О1и;
7) основные: Шк, Ьук, Агд;
8) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: О1у, Рго;
9) ароматические: Шк, Тгр, Туг, Рйе и
10) ароматические гидрофобные: Рйе, Тгр, Туг.
Консервативные аминокислотные замены могут включать замену представителя одного из этих классов другим представителем того же класса. Консервативные аминокислотные замены могут охватывать неприродные аминокислотные остатки, которые обычно возникают и химическом пептидном синтезе, а не при синтезе в биологических системах. Эти остатки включают пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных группировок.
Неконсервативные замены могут включать замену представителя одного из этих классов представителем другого класса. Такие замещенные остатки можно вводить в области человеческого антитела, которые являются гомологичными нечеловеческим антителам, или в негомологичные области молекулы.
При получении таких замен согласно некоторым воплощениям изобретения можно учитывать показатель гидропатичности аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен показатель гидропатичности, оп- 14 030259 ределенный на основании ее гидрофобности и заряда. Эти показатели следующие: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).
В данной области известна важность показателя гидропатичности аминокислот в приписывании интерактивной биологической функции белку (см., например, Ку!е е! а1., 1982. I. Мо1. Бю1. 157: 105-131). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, имеющими такой же показатель или балл гидропатичности, поскольку они сохраняют ту же биологическую активность. При создании замен на основании показателя гидропатичности в некоторых воплощениях изобретения включена замена аминокислот, показатели гидропатичности которых находятся в пределах ±2. В некоторые воплощения изобретения включены замены в пределах ±1, а в некоторые воплощения включены замены в пределах ±0,5.
В данной области также известно, что замена подобных аминокислот может быть эффективно произведена на основании гидрофильности, в частности, когда биологически функциональный белок или пептид, сконструированный таким образом, предназначен для применения в иммунологических воплощениях как раскрыто для изобретения. В некоторых воплощениях самая высокая локальная средняя гидрофильность белка, которая определяется гидрофильностью соседних аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, то есть с биологическим свойством этого белка.
Этим аминокислотным остаткам приписаны следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0+1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При получении замен на основании подобных значений гидрофильности в некоторые воплощения изобретения включена замена аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в пределах ±2, в некоторые воплощения включены замены в пределах ±1, и в некоторые воплощения включены замены в пределах ±0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основании гидрофильности. Эти области также называются центральными областями эпитопов.
Примеры аминокислотных замен приведены в табл. 1.
Аминокислотные замены
Исходные остатки Примеры замен Предпочтительные замены
А1а Уа1, Беи, Не Уа1
Агд Ьуз, ΘΙη, Азп Ьуз
Азп ΘΙη ΘΙη
Азр 61и ΘΙιι
Суз Зег, А1а Зег
О1п Азп Азп
ΘΙιι Азр Азр
<31у Рго, А1а А1а
ΗΪ5 Азп, С1п, Ьуз, Агд Агд
Не Ьеи, \/а1, Ме!, А1а, РИе, Νοιίβιιοίηβ Ьеи
Ьеи Мог1еис1пе, Не, \/а1, Ме!, А1а, РИе Не
Ьуз Агд, 1,4-диамино-масляная кислота, ΘΙη, Азп Агд
Ме! 1 еи, РИе, Не Ьеи
РИе 1 еи, Уа1, Не, А1а, Туг Ьеи
Рго А1а С1у
Зег ТИг, А1а, Суз ТИг
ТИг Зег Зег
Тгр Туг, РИе Туг
Туг Тгр, РИе, ТИг, Зег РИе
Уа1 Не, Ме!, 1_еи, РИе, А1а, ΝοΓίβιιάηβ Ьеи
Специалист в данной области сможет определить подходящие варианты полипептида, как изложено здесь, используя хорошо известные методики. В некоторых воплощениях специалист в данной области может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности направленными заменами в этих областях, не считающимися важными для активности. В других воплощениях изобретения специалист в данной области может идентифицировать остатки и участки молекул, которые являются консервативными среди подобных полипептидов. В других воплощениях одинаковые области, которые могут быть важны для биологической активности или для структуры, могут быть предметом консервативных аминокислотных замен без нарушения биологической активно- 15 030259 сти или без вредного влияния на структуру полипептида.
Кроме того, специалист в данной области может сделать обзор структурно-функциональных исследований, идентифицирующих остатки в подобных полипептидах, которые являются важными для активности или структуры. В свете такого сравнения специалист в данной области может предсказать важность аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, важным для активности или структуры в подобных белках. Специалист в данной области может выбрать химически подобные аминокислотные замены для таких предсказанных важных аминокислотных остатков.
Специалист в данной области может также провести анализ трехмерной структуры и аминокислотной последовательности структуры в подобных полипептидах. В свете такой информации специалист в данной области может предсказать результат сопоставления аминокислотных остатков антитела в отношении его трехмерной структуры. В некоторых воплощениях специалист в данной области может сделать выбор не производить радикальных изменений в аминокислотных остатках, для которых предсказано, что они находятся на поверхности белка, поскольку такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Кроме того, специалист в данной области может создать контрольные варианты, содержащие единственную аминокислотную замену в каждом желаемом аминокислотном остатке. Затем можно провести скрининг этих вариантов, используя анализы на активность, известные специалистам в данной области. Такие варианты можно использовать для сбора информации о подходящих вариантах. Например, если обнаружено, что замена конкретного аминокислотного остатка приводит в результате к нарушенной, нежелательно сниженной или непригодной активности, вариантов с такой заменой можно избежать. Иными словами, на основании информации, собранной в таких рутинных экспериментах, специалист в данной области может легко определить аминокислоты, для которых дополнительных замен следует избегать, либо самих по себе, либо в комбинации с другими мутациями.
Ряд научных публикаций посвящен предсказанию вторичной структуры. См. Мои1!, 1996, Сигг. 0р. ίη Вю!есИ. 7: 422-427; СИои е! а1., 1974, ВюскешЫгу 13: 222-245; СИои е! а1., 1974, Вюскет1к1ту 113: 211222; СИои е! а1., 1978, Λάν. Еп7уто1. Ре1а!. Агеак Мо1. Вю1. 47: 45-148; СИои е! а1., 1979, Апп. Ке\: ВюсИет. 47: 251-276 и СИои е! а1., 1979, ВюрИук. 1. 26: 367-384. Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы, помогающие предсказывать вторичную структуру. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательности выше 30%, или подобие выше 40%, часто имеют подобные структурные топологии. В последнее время пополнение базы данных структуры белков (РИВ, рто!еш к!гис!ига1 ба!аЬаке) обеспечил повышенную предсказуемость вторичной структуры, включая возможное число складок в пределах структуры полипептида или белка. См. Но1т е! а1., 1999, №с1. Ас1б. Рек. 27: 244-247. Сделано предположение (Вгеппег е! а1., 1997, Сигг. 0р. З!гис!. Вю1. 7: 369-376), что существует ограниченное число складок в данном полипептиде или белке, и что, как только критическое число структур разрешено, предсказание структуры станет значительно точнее.
Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают нанизывание (1опек, 1997, Сигг. 0рш. З!гис!. Вю1. 7: 377-87; З1рр1 е! а1., 1996, З1гис!иге 4: 75-79), профильный анализ (Во\\зе е! а1., 1991, Заепсе 253: 164-170; ОпЬккот е! а1., 1990, МеШ Εηζνιη. 183: 146-159; ОпЬккот е! а1., 1987, Ргос. №ιΙ. Асаб. Зск 84: 4355-4358) и эволюционую связь (см. Но1т, 1999, выше и Вгеппег, 1997, выше).
В некоторых воплощениях варианты антител включают варианты гликозилирования, где число и/или тип сайтов гликозилирования изменен по сравнению с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В некоторых воплощениях варианты белка содержат большее или меньшее число сайтов ^гликозилирования, чем нативный белок. Сайт ^гликозилирования характеризуется последовательностью: Акп-Х-Зег или Акп-Х-ТИг, где аминокислотный остаток, обозначенный символом X может представлять собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности создает новый потенциальный сайт для добавления N связанной углеводной цепи. Или же, замены, которые элиминируют эту последовательность, будут удалять существующую ^связанную углеводную цепь. Также предложена перестройка ^связанных углеводных цепей, где один или более чем один сайт ^гликозилирования (обычно тот, который встречается в природе) элиминируется, и один или более сайтов ^гликозилирования образуется. Предпочтительные дополнительные варианты антител включают цистеиновые варианты, где один или более чем один цистеиновый остаток делетирован или заменен другой аминокислотой (например, серином) по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть полезны, когда укладка антител должна быть изменена до биологически активной конформации, как, например, после выделения нерастворимых телец включения. Цистеиновые варианты, как правило, имеют меньше цистеиновых остатков, чем нативный белок, и обычно имеют именно такое число, чтобы свести к минимуму взаимодействия в результате неспаренных цистеинов.
В дополнительных воплощениях варианты антител могут включать антитела, содержащие модифицированный Рс-фрагмент или модифицированную константную область тяжелой цепи. Рс-фрагмент, что означает фрагмент, который кристаллизуется, или константную область тяжелой цепи, может быть модифицирован за счет мутации для придания антителу измененных характеристик связывания. См., например, Вийоп апб \УооГ 1992, Абνаηсек ίη 1ттипо1оду 51: 1-84; Раνе!сЬ апб Во11апб, 2001, Аппи. Реν.
- 16 030259
1ттипо1. 19: 275-90; Б1йе1б8 е! а1., 2001, 1оигпа1 о£ Вю1. СЬет. 276: 6591-6604; Те11етап апб 1ипдЬап8, 2000, 1ттипо1оду 100: 245-251; Мебе8ап е! а1., 1998, Еиг. 1. 1ттипо1. 28: 2092-2100; все включены сюда путем ссылки). Такие мутации могут включать замены, добавления, делеции или любую их комбинацию, и их обычно получают путем сайт-направленного мутагенеза, используя один или более чем один мутагенный олигонуклеотид, способами, описанными здесь, а также способами, известными в данной области (см., например, БатЪгоок е! а1., МОЬЕСиЬАК СРОМХС.: А ЬАВОКАТОКУ МАХиАЪ 3гб Еб., 2001, Со1б Брппд НагЪог, Ν. Υ. и Вегдег апб Каттек МЕТНОИБ ΙΝ ЕЖУМОЬООУ, Уо1ите 152, Ошбе !о Мо1еси1аг С1отпд ТесЬтдие8, 1987, Асабетю Рге88, 1пс., Бап П1едо, СА, которые включены сюда путем ссылки).
Согласно некоторым воплощениям изобретения, аминокислотные замены представляют собой тезамены, которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинитет связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют аффинитеты связывания и/или (5) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. Согласно некоторым воплощениям одиночные или множественные аминокислотные замены (в некоторых воплощениях консервативные аминокислотные замены) могут быть получены в природной последовательности (в некоторых воплощениях в участке полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярного контакта). В предпочтительных воплощениях консервативная аминокислотная замена обычно не изменяет существенно структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна иметь склонность к разрыву спирали, которая встречается в исходной последовательности, или к прерыванию других типов вторичной структуры, которая характеризует исходную последовательность). Примеры известных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в РКОТЕГЫБ, БТКиСТиКЕБ АЫЭ МОЬЕСиЬАК РКШС1РЬЕБ (Сге1дЬ!оп, Еб.), 1984, А. Н. Ргеетап апб Сотрапу, Νβν Уогк; 1\ТКОШ,'СТЮЫ ТО РКОТЕкЫ БТКк'СТк'КЕ (С. Вгапбеп апб .1. Тоо/и еб8.), 1991, Оаг1апб РиЪ118Ыпд, Νβν Уогк, Ν. У.; и ТЬот!оп е! а1., 1991, №Лиге 354: 105, каждая из этих публикаций включена сюда путем ссылки.
Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств со свойствами, аналогичными свойствам первоначального пептида. Эти типы непептидных соединений обозначены термином миметики пептидов или пептидомиметики. См. РаисЬеге, 1986, Абу. Эгид Ке8. 15: 29; УеЪег & Рге1бшдег, 1985, ΉΝδ р. 392; и Еуап8 е! а1., 1987, 1. Меб. СЬет. 30: 1229, которые включены сюда путем ссылки для любой цели. Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно подобны терапевтически полезным пептидам, можно использовать для получения подобного терапевтического или профилактического эффекта. Как правило, пептидомиметики структурно подобны полипептиду-образцу (то есть полипептиду, который обладает биологическим свойством или фармакологической активностью), такому как человеческое антитело, но имеют одну или более чем одну пептидную связь, возможно замещенную связью, выбранной из: -СЩ-ΝΗ-, -СН2-Б-, -СН2-СН2-, -СН=СН- (цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН2БО-, способами, хорошо известными в данной области. Систематическую замену одной или более аминокислот согласованной последовательности Ό-аминокислотой такого же типа (например, Ό-лизин вместо Ь-лизина) можно использовать в некоторых воплощениях для создания более стабильных пептидов. Кроме того, искусственные пептиды, содержащие согласованную последовательность или по существу идентичный вариант согласованной последовательности, могут быть получены способами, известными в данной области (Κί/о & 01ега8сЬ, 1992, Апп. Кем. ВюсЬет. 61: 387, включено сюда путем ссылки для любой цели); например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных к образованию межмолекулярных дисульфидных мостиков, которые циклизуют пептид.
Термин антитело или антитело-пептид(ы) относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. В некоторых воплощениях связывающие фрагменты получают с помощью методик рекомбинантных ДНК. В дополнительных воплощениях связывающие фрагменты получают путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают, но не ограничены ими, Р(аЪ), Р(аЪ'), Р(аЪ')2, Ρν и одноцепочечные антитела.
Термин тяжелая цепь включает любой иммуноглобулиновый полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к ΝΟΡ. Термин легкая цепь включает любой иммуноглобулиновый полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к ΝΟΡ. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области, УН, и три домена константной области, СН1, СН2 и СН3. Домен УН находится при аминоконце полипептида, а домен СН3 находится при карбоксиконце. Термин тяжелая цепь, как его используют здесь, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области, Уъ, и домен константной области, Сь. Подобно тяжелой цепи, домен вариабельной области легкой цепи находится при аминоконце полипептида. Термин легкая цепь, как его используют здесь, охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. Р(аЪ) фрагмент состоит из одной легкой цепи и СН1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Р(аЪ) молекулы не может образовать связь с другой молекулой тяжелой цепи. Р(аЪ') фрагмент содержит
- 17 030259 одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую часть константной области, между доменами СН1 и Сн2, так что межцепочечная дисульфидная связь может образоваться между двумя тяжелыми цепями с образованием Р(аЬ')2 молекулы. Область Ρν содержит вариабельные области из обеих цепей, тяжелой и легкой, но не содержит константные области. Одноцепочечные антитела представляют собой Ρν молекулы, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединены подвижным линкером с образованием единой полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область. Одноцепочечные антитела подробно обсуждаются в публикации международной патентной заявки № АО 88/01649 и в патентах США № 4946778 и 5260203.
Под бивалентным антителом, не являющимся многоспецифичным или многофункциональным антителом, в некоторых воплощениях понимают как антитело, содержащее сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность.
При оценке связывания и специфичности антитела по изобретению считают, что антитело по существу ингибирует адгезию лиганда к рецептору, когда избыток антитела уменьшает количество лиганда, связанного с рецептором, по меньшей мере примерно на 20%, 40%, 60%, 80%, 85% или более (при измерении, среди прочего, с использованием конкурентного анализа связывания ш νίΐτο).
Под нейтрализующим антителом подразумевают молекулу антитела, которая способна блокировать или существенно снижать эффекторную функцию антигена-мишени, с которым оно связывается. Соответственно, нейтрализующее антитело к ΝΟΡ способно блокировать или существенно снижать эффекторную функцию, такую как связывание рецептора и/или провокацию клеточного ответа ΝΟΡ. Под понятием существенно снизить следует понимать по меньшей мере примерно 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 75%, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% снижение эффекторной функции антигена-мишени (например, человеческого ΝΟΡ).
Термин эпитоп включает любой детерминант, предпочтительно полипептидный детерминант, способный к специфичному связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. В некоторых воплощениях эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, а в некоторых воплощениях могут иметь специфичные структурные трехмерные характеристики и/или специфичные характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается с антителом. В некоторых воплощениях указано, что антитело специфично связывает антиген, когда оно предпочтительно распознает его антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В предпочтительных воплощениях указано, что антитело специфично связывает антиген, когда равновесная константа диссоциации составляет <10-8 М, более предпочтительно, когда равновесная константа диссоциации составляет <10-9 М, и наиболее предпочтительно, когда константа диссоциации составляет <10-1 М.
Считают, что антитело связывает по существу тот же эпитоп, что и антитело сравнения, когда эти два антитела распознают идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами определения, связываются ли два антитела с идентичными или пространственно перекрывающимися эпитопами, являются конкурентные анализы, которые проектируют в ряде различных форм, используя либо меченый антиген, либо меченое антитело. Обычно антиген иммобилизуют на субстрате, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют, используя радиоактивные или ферментативные метки.
Термин агент используют здесь для обозначения химического соединения, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов.
Как используются здесь, термины метка или меченый относятся к включению детектируемого маркера, например, путем включения радиоактивно меченой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых группировок, которые можно обнаружить с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, предпочтительно содержащего детектируемый маркер, такой как флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер или ферментативная активность, которые можно обнаружить оптическими или колориметрическими способами). В некоторых воплощениях метка может быть также терапевтической. В данной области известны различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов и они могут быть выгодно использованы в способах, раскрытых в описании изобретения. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничены ими, приведенные ниже радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15Ν, 358 , 90Υ, 99тТс, 1111п, 1251, 1311), флуоресцентные метки (например, флуоресцеинизотиоцианат или ФИТЦ, родамин или лантаноидные фосфоры), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные метки, гаптеновые метки, такие как биотинильные группы, и предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, домены связывания металлов или эпитопные выступы). В некоторых воплощениях метки присоединяют с помощью спейсерных плеч (таких как (СН2)п, где
- 18 030259 η < примерно 20) различной длины для уменьшения возможного стерического препятствия.
Термин биологический образец, как его используют здесь, включает, но не ограничен этим, любое количество вещества из живого организма или прежде жившего организма. Такие живые организмы включают, но не ограничены ими, людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных. Указанные вещества включают, но не ограничены ими, кровь, сыворотку, мочу, клетки, органы, ткани, кость, костный мозг, лимфатические узлы и кожу.
Термин фармацевтический агент или лекарство, как его используют здесь, относится к химическому соединению или композиции, которые способны индуцировать желаемый терапевтический эффект при правильном введении пациенту. Выражение фармацевтически эффективное количество в отношении фармацевтической композиции, содержащей одно антитело или множество антител по изобретению, понимают как означающее согласно изобретению количество указанной фармацевтической композиции, которое способно прекратить у рассматриваемого пациента повышение порога чувствительности к внешним стимулам с возвратом порога чувствительности к уровню, сравнимому с уровнем, наблюдаемым у здоровых субъектов.
Расстройство представляет собой любое состояние, для которого будет благоприятным лечение по настоящему изобретению. Термины расстройство и состояние здесь используют взаимозаменяемо, и они охватывают хронические и острые NΟЕ-опосредованные расстройства или NΟЕ-опосредованные заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к обсуждаемому расстройству.
Термины ’^ОЕ-опосредованное заболевание и ЧСЕ-опосредованное расстройство охватывают любое медицинское состояние или расстройство, связанное с повышенными уровнями NСЕ или с повышенной чувствительностью к NСЕ, включая, но не ограничиваясь ими, острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапию, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные и неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные жалобы с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, боль при диабетической невропатии, каузалгию, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочнокишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочнопищеводный рефлюкс, панкреатит и висцералгию.
Как их используют здесь, термины эффективное количество и терапевтически эффективное количество при использовании в отношении носителя или фармацевтической композиции, которые содержат одно или более чем одно человеческое антитело к человеческому NСЕ, относятся к количеству или дозировке, которые достаточны для получения желаемого результата (то есть когда для терапии антителом с носителем или человеческими антителами к человеческому NСЕ по настоящему изобретению желаемым результатом является желаемое уменьшение воспаления и/или боли, например) или для поддержания наблюдаемого снижения уровня одной или более чем одной биологической активности NСЕ. Более конкретно, терапевтически эффективное количество представляет собой количество человеческого антитела (человеческих антител) к человеческому NСЕ, достаточное для ингибирования в течение некоторого периода времени одного или более клинически определенных патологических процессов, связанных с обсуждаемым состоянием, например, воспаления или боли, у субъекта, которого лечат ίη νίνο этим агентом. В настоящем изобретении эффективное количество антитела к NСЕ может предупреждать, останавливать, регулировать или уменьшать восприятие боли, связанное с каким-либо болезненным медицинским состоянием. В способах по настоящему изобретению термин регулировать и его грамматические варианты используют для обозначения предупреждения, частичного или полного ингибирования, уменьшения, задержки или замедления нежелательного события, например боли. Эффективное количество может варьировать в зависимости от конкретного выбранного антитела с носителем или человеческого антитела (человеческих антител) к человеческому NСЕ, а также зависит от ряда факторов и условий, связанных с субъектом, подлежащим лечению, и от тяжести расстройства. Например, если антитело с носителем или человеческое антитело (человеческие антитела) к человеческому NСЕ нужно вводить ίη νίνο, среди учитываемых факторов будут такие факторы, как возраст, масса и состояние здоровья пациента, а также кривые доза-ответ и данные по токсичности, полученные в доклинической работе на животных. Если агент нужно приводить с клетками в контакт ίη νίίτο, можно также разработать ряд докли- 19 030259 нических исследований ш νίΙΐΌ для оценки таких параметров, как захват, период полураспада, доза, токсичность и т. д. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества для данного агента хорошо известно в пределах компетенции специалиста в данной области.
Как их используют здесь, термины фактор роста нервной ткани и КОЕ обозначают все виды нативной последовательности NОЕ млекопитающих, включая рекомбинантный человеческий NОЕ 1-120, показанный 8ЕО ГО N0: 30.
Как используют здесь, термины по существу чистый или по существу очищенный означают соединение или тип молекулы, то есть присутствующий преобладающий тип молекулы (то есть молекулярно его больше чем любых других отдельных типов молекул в композиции). В некоторых воплощениях изобретения по существу очищенная фракция представляет собой композицию, в которой эти молекулы составляют по меньшей мере примерно 50 процентов (молекулярно) присутствующих типов макромолекул. В некоторых воплощениях по существу чистая композиция будет составлять более чем примерно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% всех типов макромолекул, присутствующих в композиции. В некоторых воплощениях этот тип молекул очищен по существу до гомогенности (молекулы примесей невозможно обнаружить в композиции общепринятыми способами обнаружения), где композиция состоит по существу из единственного типа макромолекул.
Термин пациент включает субъектов людей и животных.
Термины Лечение и лечить относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. К тем, кто нуждается в лечении, относят как тех, кто уже страдает этим расстройством, так и тех, кто склонен к этому расстройству, либо тех, у кого это расстройство нужно предупреждать.
Если контекст не требует иного, информация об объектах в единственном числе относится и к объектам во множественном числе, а объекты во множественном числе охватывают и объекты в единственном числе.
Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитела к NОЕ могут применяться для лечения невропатологической и воспалительной боли и NОЕ-опосредованных заболеваний, включающих, но не ограниченных ими, упомянутые выше.
В одном аспекте изобретения предложены полностью человеческие моноклональные антитела против человеческого NОЕ, обладающие биологической и иммунологической специфичностью к его связыванию. В одном аспекте в изобретении предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности для тяжелой и легкой цепи молекул иммуноглобулина, в частности, последовательности, соответствующие их вариабельным областям. Конкретными воплощениями данного аспекта изобретения являются последовательности, соответствующие областям, определяющим комплементарность (СОК), конкретно областям СГОК1 - СГОК3 тяжелой и легкой цепей, предложенных изобретением. Еще в одном аспекте изобретения предложены клетки и клеточные линии гибридомы, которые экспрессируют молекулы иммуноглобулина и антитела, предпочтительно моноклональные антитела по изобретению. В изобретении также предложены биологически и иммунологически очищенные препараты антител, предпочтительно моноклональных антител против человеческого NОЕ, обладающих биологической и иммунологической специфичностью связывания с человеческим NОЕ.
Возможность клонировать и реконструировать человеческий локус размером порядка мегабаз в дрожжевых искусственных хромосомах (УАС) и вводить их в линию зародышевых клеток мыши обеспечивает преимущественный подход к исследованию функциональных компонентов очень больших или приблизительно картированных локусов, а также к созданию полезных моделей заболевания человека. Кроме того, использование такой технологии для замещения мышиных локусов их человеческими эквивалентами обеспечивает уникальную возможность понимания экспрессии и регуляции человеческих генных продуктов в процессе развития, их взаимоотношения с другими системами и их вовлеченность в индукцию и прогрессирование заболевания.
Важным практическим применением такой стратегии является гуманизация мышиной гуморальной иммунной системы. Введение локусов человеческих иммуноглобулинов (1д) мышам, у которых эндогенные гены 1д инактивированы, дает возможность исследовать механизмы, лежащие в основе программируемой экспрессии и сборки антител, а также их роли в развитии В-клеток. Кроме того, такая стратегия обеспечивает источник получения полностью человеческих моноклональных антител (МАЬ).
Термин человеческое антитело охватывает антитела, имеющие вариабельные и константные области, по существу соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевых клеток человека. В некоторых воплощениях человеческие антитела продуцируют с использованием млекопитающих, не представляющих собой человека, включая, но не ограничиваясь ими, грызунов, таких как мыши и крысы, и зайцеобразных, таких как кролики. В некоторых воплощениях изобретения человеческие антитела продуцируют в клетках гибридомы. В некоторых воплощениях изобретения человеческие антитела продуцируют рекомбинантным путем.
Термин рекомбинантный применительно к антителу включает антитела, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными способами. Репрезентативные примеры
- 20 030259 включают антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфецированного в клетку-хозяина; антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител; антитела, выделенные из животного (например мыши), которое является трансгенным по человеческим генам иммуноглобулинов (см., например, Тау1ог, Ь. Р., е! а1., Νιιοί. Άοίάδ Ке8. 20: 6287-6295 (1992)); или антитела, полученные, экспрессированные, сконструированные или выделенные любыми способами, в которые вовлечен сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.
Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, имеющие происхождение от последовательностей иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека.
Человеческие антитела обладают по меньшей мере тремя преимуществами по сравнению с нечеловеческими и химерными антителами для применения в терапии человека:
1) в связи с тем, что эффекторный участок антитела является человеческим, он может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, разрушать клетки-мишени более эффективно посредством комплементзависимой цитотоксичности (СБС) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС));
2) иммунная система человека не должна распознавать человеческое антитело как чужеродное и, следовательно, ответ антител против такого инъецированного антитела будет меньше, чем против полностью чужеродного нечеловеческого антитела или частично чужеродного химерного антитела;
3) сообщалось, что инъецированные нечеловеческие антитела обладают значительно более коротким периодом полураспада в системе кровообращения человека, чем период полураспада человеческих антител. Инъецированные человеческие антитела будут обладать периодом полураспада, по существу, идентичным природным человеческим антителам, что дает возможность давать меньшие и менее частые дозы.
Таким образом, ожидают, что полностью человеческие антитела минимизируют иммуногенные и аллергические ответы, свойственные мышиным МЛЬ или МЛЬ мышиного происхождения, и, следовательно, повышают эффективность и безопасность вводимых антител. Полностью человеческие антитела по изобретению, следовательно, можно применять при лечении хронической и рецидивирующей боли, когда ее лечение требует повторного введения антител. Таким образом, одно из конкретных преимуществ антител к ΝΟΡ по изобретению состоит в том, что эти антитела являются полностью человеческими и их можно вводить пациентам неострым способом, при этом сводя к минимуму вредные реакции, обычно связанные с антителами человек-против-мыши или другими описанными ранее неполностью человеческими антителами из видов, не представляющих собой человека.
Специалист в данной области может сконструировать линии мышей с недостаточным продуцированием мышиных антител с большими фрагментами человеческих локусов 1д таким образом, что эти мыши будут продуцировать человеческие антитела при отсутствии мышиных антител. Большие фрагменты человеческих 1д могут сохранить как большое различие в вариабельных генах, так и правильную регуляцию продуцирования и экспрессии антител. При использовании мышиного клеточного аппарата для диверсификации и отбора антител и при отсутствии иммунологической толерантности к человеческим белкам воспроизводимый спектр человеческих антител в этих линиях мышей дает антитела с высоким аффинитетом против любого интересующего антигена, включая человеческие антигены. Используя гибридомную технологию, можно продуцировать и отбирать антигенспецифичные человеческие МАЬ с желаемой специфичностью.
Можно использовать трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител без продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Перенос множества генов иммуноглобулинов клеток зародышевой линии человека в клетки зародышевой линии таких мутантных мышей приведет в результате к продуцированию человеческих антител после провокации антигеном (см., например, 1акоЬоуЙ8 е! а1., Ргос. Ναΐί. Асаб. δα. И8А, 90: 25512555 (1993); 1акоЬоуЙ8 е! а1., ШШге. 362: 255-258 (1993); Вгиддетапп е! а1., Уеаг ίη 1ттип., 7: 33 (1993); №-Циге 148: 1547-1553 (1994), №ш.1ге Вю!есйпо1оду 14: 826 (1996); Сго88, 1. А., е! а1., №ш.1ге, 404: 995-999 (2000) и патенты США № 5877397, 5874299, 5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126, 5569825 и 5545806 (каждая из этих публикаций включена сюда путем ссылки в полном объеме для любых целей)). Человеческие антитела можно также продуцировать в библиотеках фагового дисплея (НоодепЬоот апб \Ут1ег, 1. Мо1. Вю1., 227: 381 (1992); Магкк е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222: 581 (1991)). Методики Со1е е! а1. и Воегпег е! а1. также доступны для получения человеческих моноклональных антител (Со1е е! а1., Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1е8 апб Сапсег Тйегар, А1ап К. Ь188, р. 77 (1985) и Воегпег е! а1., 1. 1ттипо1., 147(1): 86-95 (1991)).
Рекомбинантные человеческие антитела можно также подвергать мутагенезу ш уйто (или, когда используют трансгенное по последовательностям человеческих 1д животное - соматическому мутагенезу ш У1уо) и, таким образом, аминокислотные последовательности УН и Уь областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей, родственных последовательностям УН и Уъ линии зародышевых клеток человека, могут не существовать в природе в спектре антител линии зародышевых клеток человека ш У1уо.
- 21 030259
В некоторых воплощениях специалист в данной области может использовать константные области от видов, иных, чем человек, параллельно с человеческой(ими) вариабельной(ыми) областью(ями) у таких мышей для получения химерных антител.
Структура природных антител
Структура природного антитела обычно представляет собой тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну полноразмерную легкую цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область из примерно от 100 до 110 или более аминокислот, которая обычно ответственна за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи обычно определяет константную область, ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи обычно классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и изотип антитела определяют как 1дМ, 1дИ, 1дО, 1дА и 1дЕ соответственно. 1дО имеет несколько подклассов, включающих, но не ограничиваясь ими, 1дО1, 1дО2, 1дО3 и 1дО4. 1дМ имеет подклассы, включающие, но не ограниченные ими, 1дМ1 и 1дМ2. 1дА, подобным образом, подразделяют на подклассы, включающие, но не ограниченные ими, 1дА1 и 1дА2. Внутри полноразмерных легких и тяжелых цепей обычно вариабельные и константные области соединены областью 1 примерно из 12 или более аминокислот, где тяжелая цепь также включает область И примерно из 10 или более аминокислот. См., например, РиЫИАМЕЭТАЬ 1ММидаЬООУ, СЬ. 7, 2ий ей. (Раи1, ей.), 1989, Рауеи Ргекк, Ν. Υ. (включена путем ссылки в полном объеме для любой цели).
Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий сайт.
Вариабельные области обычно имеют такую же общую структуру относительно консервативных каркасных участков (РР, Ггате\\'огк гедюик), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (СИР). СИР от двух цепей каждой пары обычно выровнены по каркасным участкам, которые могут обеспечить связывание со специфичным эпитопом. От Ν-конца к С-концу вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно содержат домены РР1, СИР1, РР2, СИР2, РР3, СИР3 и РР4. Распределение аминокислот по каждому домену обычно находится в соответствии с определениями КаЬа! Зедиеисек оГ РгоЮтк оГ 1ттиио1одюа1 1и!егек! (1987 аий 1991, №!юиа1 1икШи!ек оГ Неа1!Ь, ВеЛекйа, Мй.) или СЬо!Ыа & Ьекк, 1987, 1. Мо1. Вю1. 196: 901-917; СЬо!Ыа е! а1., 1989, ХаПие 342: 878-883.
Антитела двойной специфичности или бифункциональные антитела
Антитело двойной специфичности или бифункциональное антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных сайта связывания. Антитела двойной специфичности могут быть получены с помощью ряда методик, включая, но не ограничиваясь ими, слияние гибридом или сшивку Р(аЬ') фрагментов. См., например, 8оидкгу11а1 & РасЬтаии, 1990, С1ш. Ехр. 1ттиио1. 79: 315-321; Кок!е1иу е! а1., 1992, 1. 1ттиио1. 148: 1547-1553.
Получение антител
В изобретении предложены антитела, которые связываются с человеческим NΟР. Эти антитела могут быть получены путем иммунизации полноразмерным NΟР или его фрагментами. Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными и/или могут представлять собой рекомбинантные антитела. В предпочтительных воплощениях антитела по изобретению представляют собой человеческие антитела, полученные, например, путем иммунизации трансгенных животных, способных к продуцированию человеческих антител (см., например, публикацию международной патентной заявки \\'О 93/12227).
Области, определяющие комплементарность (СИР), вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к NΟР по изобретению, могут быть перенесены в каркасные участки (РР) от того же или другого вида. В некоторых воплощениях СИР вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к NΟР могут быть перенесены в согласованные человеческие РР. Для создания согласованных РР человека РР из нескольких аминокислотных последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи человека выравнивают, чтобы идентифицировать согласованную аминокислотную последовательность. РР тяжелой цепи или легкой цепи антитела к NΟР могут быть замещены РР из другой тяжелой цепи или легкой цепи. Редкие аминокислоты в РР тяжелых и легких цепей антитела к NΟР обычно не заменяют, тогда как остальные аминокислоты РР могут быть заменены. Редкие аминокислоты представляют собой специфичные аминокислоты, которые находятся в положениях, в которых они не обязательно находятся в РР. Перенесенные вариабельные области из антител к NΟР по изобретению можно использовать с константной областью, которая является отличной от константной области антитела к NΟР. Альтернативно перенесенные вариабельные области составляют часть единственной цепи Ру антитела. Перенос СИР описан, например, в патентах США № 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101, которые включены сюда путем ссылки для любой цели.
Антитела по изобретению предпочтительно получают, используя трансгенных мышей, у которых
- 22 030259 существенная часть локуса, продуцирующего человеческое антитело, встроена в клетки мышей, продуцирующие антитела, и у которых, кроме того, генно-инженерным путем создана недостаточность продуцирования эндогенных мышиных антител. Такие мыши способны к продуцированию молекул человеческих иммуноглобулинов и антител и не продуцируют или продуцируют значительно сниженные количества молекул мышиных иммуноглобулинов и антител. Технологии, используемые для достижения этого результата, раскрыты в патентах, заявках и ссылках, приведенных здесь в описании. В предпочтительных воплощениях специалист в данной области может использовать способы, как описано в публикации Международной патентной заявки № \У0 98/24893, которая включена сюда путем ссылки для любой цели. См. также Мепбе/ е! а1., 1997, №Циге Оепейск 15:146-156, которая включена сюда путем ссылки для любой цели.
Моноклональные антитела (тАЪ) по изобретению могут быть получены с помощью ряда методик, включая традиционную технологию моноклональных антител, например, стандартную методику гибридизации соматических клеток КоЫег апб МПк!еш (1975, №Циге 256: 495). Хотя методики гибридизации соматических клеток предпочтительны, в принципе, можно использовать другие методики для получения моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышь. Получение гибридомы мыши очень хорошо отработано, и протоколы и методики иммунизации для выделения иммунизированных спленоцитов для слияния хорошо известны в данной области. Партнеры слияния (например, клетки миеломы мыши) и методики слияния также известны.
В предпочтительном воплощении человеческие моноклональные антитела, направленные против NΟΡ, могут быть получены с использованием трансгенных мышей, несущих части человеческой иммунной системы вероятнее, чем мышиной системы. Эти трансгенные мыши, называемые здесь мышами НиМаЪ, содержат мини-локус гена иммуноглобулина человека, который кодирует не перестроенные последовательности тяжелых (μ и γ) и легкой к цепей иммуноглобулина человека вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ и к цепей (ЬопЪегд е! а1., 1994, №Циге 368: 856-859). Соответственно, эти мыши проявляют сниженную экспрессию мышиных 1дМ или к и в ответ на иммунизацию внедренные трансгены тяжелой цепи и легкой цепи человека претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием человеческих моноклональных антител 1дО к высокого аффинитета (ЬопЪегд е! а1., см. выше: ЬопЪега апб Ник/аг, 1995, 1п!ет. Кеу. 1ттипо1. 13: 65-93; Нагбшд апб ЬопЪегд, 1995, Апп. N. Υ. Асаб. 8сг 764: 536-546). Получение мышей НиМаЪ подробно описано в Тау1ог е! а1., 1992, №.1с1ею Лабк Кек. 20: 6287-6295; Сйеп е! а1., 1993, Iи!е^иа!^οиа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1., 1994, I. ]ттипо1. 152: 2912-2920; ЬопЪега е! а1., 1994, №Циге 368: 856-859; ЬопЪегд, 1994, НапбЬоок оГ Ехр. Рйагтасо1оду 113: 49-101; Тау1ог е! а1., 1994, Iи!е^иаί^οиа1 1ттипо1оду 6: 579591; ЬопЪегд & Ник/аг, 1995, 1п!ет. Кеу. ]ттипо1. 13: 65-93; Нагбшд & ЬопЪегд, 1995, Апп. N. Υ. Асаб. 8с1 764: 536-546; РЫцуПб е! а1., 1996, №Циге Вю1ес1то1оду 14: 845-851; содержание всех этих публикаций включено в данное описание изобретения путем ссылки в полном объеме. См. дополнительно патенты США № 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; авторы всех ЬопЪегд и Кау, а также патент США № 5545807, авторы 8игаш е! а1.; публикации Международных патентных заявок № \У0 93/1227, опубликованной 24 июня 1993; \У0 92/22646, опубликованной 23 декабря 1992, и \У0 92/03918, опубликованной 19 марта 1992, причем содержание всех вышеуказанных документов включено сюда путем ссылки в полном объеме. Или же трансгенные линии мышей НСо7, Нсо12 и КМ, описанные ниже в Примерах, можно использовать для создания человеческих антител к NΟΡ.
Настоящим изобретением предложены человеческие моноклональные антитела, которые являются специфичными к биологически активным полипептидам человеческого NΟΡ и нейтрализуют их. Предложены также аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антител, которые являются высоко специфичными к полипептидам NΟΡ и нейтрализуют их при связывании с ними. Эта высокая специфичность обеспечивает человеческим антителам к человеческому NΟΡ и человеческим моноклональным антителам с подобной специфичностью эффективность при иммунотерапии заболеваний, связанных с NΟΡ.
В одном аспекте в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, которые связывают такой же или по существу такой же эпитоп, что и антитело 4Ό4, предложенное здесь.
В одном аспекте в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, содержащие по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, показанных в 8ЕО ГО N0: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 79-130, которые связывают эпитоп полипептида NΟΡ с высоким аффинитетом и обладают способностью антагонизировать активность полипептида NΟΡ. Предпочтительно эти антитела связывают такой же или по существу такой же эпитоп, что и антитело 4Ό4, предложенное здесь.
В предпочтительных воплощениях изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом NΟΡ с константой диссоциации (Кс) 1 х 10-9 М или менее и ингибируют индуцированное NΟΡ выживание в анализе нейтрализации ш уйго при 1С50 1х10-7 М или менее. В более предпочтительных воплощениях изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом NΟΡ с константой дис- 23 030259 социации (Кс) 1х10-10 М или менее и ингибируют индуцированное ΝΟΡ выживание в анализе нейтрализации ίη νίΐτο при 1С50 1 х 10-8 М или менее. В еще более предпочтительном воплощении изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом ΝΟΡ с константой диссоциации (Кс) 1х10-11 М или менее и ингибируют индуцированное ΝΟΡ выживание в анализе нейтрализации ίη νίΐτο при 1С50 1 х 10-9 М или менее. Примеры человеческих антител к человеческому ΝΟΡ, которые соответствуют вышеупомянутым критериям связывания и нейтрализации, приведены здесь.
Наиболее предпочтительное человеческое антитело к человеческому ΝΟΡ по настоящему изобретению называется здесь 4Ό4 и имеет полипептидные последовательности Уь и Ун, как показано в 8ЕО ГО ΝΟ: 12 и 8ЕО ГО ΝΟ: 10 соответственно. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая Уъ и Ун 4Ό4, показана в 8ЕО ГО ΝΟ: 11 и 8ЕО ГО ΝΟ: 9 соответственно. Свойства человеческих антител к человеческому ΝΟΡ по настоящему изобретению конкретно раскрыты в Примерах. Особенно важным является высокий аффинитет к полипептиду ΝΟΡ и высокая способность антагонизировать активность полипептида ΝΟΡ, продемонстрированная здесь.
Константу диссоциации (Кс) человеческого антитела к человеческому ΝΟΡ можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса, как в общих чертах описано в Примере 9. В общих чертах анализ поверхностного плазмонного резонанса измеряет взаимодействия связывания в реальном времени между лигандом (рекомбинантным полипептидом ΝΟΡ, иммобилизованном на биосенсорной матрице) и анализируемым веществом (антителами в растворе) с помощью поверхностного плазмонного резонанса (8РЕ, кигГасе р1актоп гекопапсе), используя систему В1Асоге (Рйатшааа Вюкепкот, РРса1а\уау. Νΐ). Поверхностный плазмонный анализ можно также проводить путем иммобилизации анализируемого вещества (антител на биосенсорном матриксе) и презентации лиганда (рекомбинантного V в растворе). Константу диссоциации (Кс) человеческого антитела к человеческому ΝΟΡ можно также определить с использованием методологии К1пЕхА. В некоторых воплощениях изобретения антитела связываются с ΝΟΡ с Кс между примерно 10-8 М и 10-12 М. Термин Кс, как его используют здесь, следует относить к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Для целей настоящего изобретения К определяют, как показано в Примере 9.
В предпочтительном воплощении антитела по изобретению относятся к изотипу 1§О1, 1дО2, 1§О3 или 1дО4. Предпочтительно антитела относятся к изотипу 1дО3. Более предпочтительно антитела относятся к изотипу 1§О1. Наиболее предпочтительно антитела относятся к изотипу 1дО2. В других воплощениях антитела по изобретению относятся к изотипу 1дМ, 1дА, 1дЕ или 1§ϋ. В предпочтительных воплощениях изобретения антитела содержат легкую цепь каппа человека и тяжелую цепь 1§О1, 1дО2, 1§О3 или 1§О4 человека. Экспрессия антител по изобретению, содержащих константную область тяжелой цепи 1§О1 или 1дО2, описана в приведенных ниже Примерах. В конкретных воплощениях вариабельные области антител лигированы с константной областью, иной, чем константная область для изотипа 1§О1, 1дО2, 1§О3 или 1дО4. В некоторых воплощениях антитела по изобретению клонированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
В некоторых воплощениях консервативные модификации тяжелых цепей и легких цепей антител к ΝΟΡ (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидов) будут давать антитела к ΝΟΡ, обладающие функциональными и химическими характеристиками, подобными характеристикам антител к ΝΟΡ, раскрытых здесь. Напротив, существенные модификации в функциональных и/или химических характеристиках антител к ΝΟΡ можно осуществить путем отбора замен в аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей, которые значительно отличаются по их воздействию на сохранение (а) структуры молекулярного каркаса в области замены, например, в виде листовой или спиральной конформации, (б) изменение гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (в) объем боковой цепи.
Например, консервативная аминокислотная замена может включать замену нативного аминокислотного остатка ненативным остатком, которая оказывает небольшое или не оказывает воздействие на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Кроме того, любой нативный остаток в полипептиде может быть также заменен аланином, как описано ранее для аланинового сканирующего мутагенеза.
Желаемые аминокислотные замены (либо консервативные, либо неконсервативные) могут быть определены специалистом в данной области в тот момент, когда такие замены желательны. В некоторых воплощениях аминокислотные замены можно использовать для идентификации важных остатков антитела к ΝΟΡ, либо для повышения или снижения аффинитета антител к ΝΟΡ, описанных здесь.
Как хорошо известно, минорные изменения аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, немногих или даже нескольких аминокислот, может привести к аллельной форме исходного белка, которая обладает по существу идентичными свойствами. Следовательно, в дополнение к антителам, конкретно описанным здесь, можно легко разрабатывать и производить другие по существу гомологичные антитела, используя различные методики рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалистам в данной области. В целом модификации, генов можно легко осуществить с помощью ряда хорошо известных методик, таких как сайт-направленный мутагенез. Поэтому в настоящем изобретении рассмотрены варианты или мутанты человеческих антител к ΝΟΡ, обладаю- 24 030259 щие характеристиками, по существу подобными характеристикам человеческих антител к N0?, раскрытым здесь (см., например, А0 00/56772, которая полностью включена сюда путем ссылки). Таким образом, под термином вариант или мутант в отношении человеческого антитела к N0? подразумевают любую связывающую молекулу (молекулу X) (ί) в которой гипервариабельные области СГОРЕ СЭР2 и СГОР3 тяжелой цепи или гипервариабельные области СЭРЕ СЭР2 и СЭР3 легкой цепи, взятые в целом, по меньшей мере на 80% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичны, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны гипервариабельным областям, показанным в 8Ε0 ГО N0: 14, 18 и 22 или δΕφ ΙΌ N0: 16, 20 и 24 соответственно, и (ΐΐ) где вариант или мутант способен к ингибированию активности человеческого N0? в той же степени, что и сравнительное человеческое антитело к N0?, имеющего каркасные участки, идентичные каркасным участкам молекулы X.
Обычно вариант человеческого антитела к N0? будет иметь СОК легкой и/или тяжелой цепи, ри рассмотрении вместе имеющие по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в δΕφ ГО N0: 14, 18 и 22 и/или δΕφ ГО N0: 16, 20 и 24 соответственно.
Более предпочтительно вариант человеческого антитела к N0? будет иметь вариабельные области легкой цепи, при рассмотрении вместе имеющие по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, как показано в δΕφ ГО N0: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 или 91, и/или вариабельную область тяжелой цепи, взятую в целом, которая имеет по меньшей мере примерно 70% идентичности аминокислотной последовательности, предпочтительно по меньшей мере примерно 75% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности,
- 25 030259 еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в 8Еф ГО N0: 10, 81, 83, 85 или 87.
Термин вариант применительно к полинуклеотиду следует относить к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности с полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. Обычно полинуклеотидный вариант будет иметь по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности с новой нуклеиново-кислотной последовательностью, раскрытой в данной заявке.
В конкретных воплощениях изобретения предложены антитела, которые имеют процент идентичности с антителом по изобретению, или антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, СЭР.1, СГОР2 или СЭР3 область, которые имеют процент идентичности с вариабельной областью тяжелой цепи, вариабельной областью легкой цепи, СЭР.1, СЭР2 или СГОР3 областью по изобретению, как показано здесь в Примере 10 и на фиг. 5-10.
В некоторых воплощениях изобретения предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервов и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является: по меньшей мере на 70% или 75% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 80%, 85% или 95% гомологичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 81, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 80%, 85% или 95% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 83, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75%, 80% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 85, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 75% или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 87, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 56% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 79, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В некоторых воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является: по меньшей мере на 70%, 75%, 80% или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Еф ГО N0: 12, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически
- 26 030259 функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 85% или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 80, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 74%, 90% или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 88, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 80%, 85% или 87% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 89, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 85%, 90% или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 90, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 91, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95% или 96% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 82, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 84, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; или по меньшей мере на 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 86, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В некоторых других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОК1 тяжелой цепи человека, где СГОК1 тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% или 60% идентична аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 98, 8ЕО ГО ΝΟ: 105, 8ЕО ГО ΝΟ: 110 или 8ЕО ГО ΝΟ: 22, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОК2 тяжелой цепи человека, где СГОК2 тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является: по меньшей мере на 70%, 82% или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 99, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 76% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 106, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 59% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 18, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 117, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70%, 75% или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 111, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
Еще в других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОК1 легкой цепи человека, где СГОК1 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является: по меньшей мере на 70% или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 101, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70%, 75%, 80% или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 95, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75%, 80% или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 119, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75%, 80% или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 122, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 125, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75%, 80% или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 24, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 107, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70% или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО ΝΟ: 113, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В дополнительных воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОК2 легкой цепи человека, где
- 27 030259
0ΌΚ2 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является: по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ГО N0: 102, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 96, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 120, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 123, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 126, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 129, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 20, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 108, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 133, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 114, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОВ3 легкой цепи человека, где 0ΌΚ3 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является: по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 103, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 97, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 121, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 127, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 130, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 16, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 109, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 134, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 115, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела 4Ό4 показаны в 8Е0 ГО N0: 10 и 12 соответственно. Однако многие из потенциальных ΟΌΚ-контактных остатков могут быть заменены другими аминокислотами, и все же дают возможность антителу сохранять существенный аффинитет к антигену. Подобным образом многие из структурных остатков, не находящихся в контакте с 0ΌΚ в тяжелой и легкой цепях, могут приобретать замены аминокислот из соответствующих положений из других человеческих антител согласованными аминокислотами человека или из других мышиных антител без значительной потери аффинитета или неиммуногенности человеческого антитела. Можно использовать разные альтернативные аминокислоты для получения вариантов описанных антител к ЪСЕ и их фрагментов, имеющих варьирующие комбинации аффинитета, специфичности, неиммуногенности, простоты производства и других желаемых свойств.
В альтернативных воплощениях изобретения антитела по изобретению можно экспрессировать в клеточных линиях, иных, чем клеточные линии гибридомы. В этих воплощениях последовательности, кодирующие конкретные антитела, можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего. В соответствии с этими воплощениями трансформация может быть достигнута любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукцию клетки-хозяина этим вирусом (или вектором), либо с помощью методик трансфекции, известных в данной области, примеры которых приведены в патентах США № 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (все источники включены сюда путем ссылки
- 28 030259 для любой цели). Как правило, используемая методика трансформации может зависеть от хозяина, подлежащего трансформации. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают, но не ограничены ими, трансфекцию, опосредованную декстраном, кальцийфосфатную преципитацию, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, константной области легкой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела ΝΟΡ по изобретению, встраивают в подходящий экспрессионный вектор, используя стандартные методики лигирования. В предпочтительном воплощении константную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела к ΝΟΡ присоединяют к С-концу соответствующей вариабельной области и лигируют в экспрессионный вектор. Этот вектор обычно выбран как функциональный в конкретной используемой клетке-хозяине (то есть этот вектор является совместимым с аппаратом клетки-хозяина, так чтобы могла проходить амплификация гена и/или экспрессия гена). В качестве обзора экспрессионных векторов см. МЕТН. ΕΝΖ. 185 (Соеййек ей.), 1990, Леайеш1с ΡϊΌδδ.
Обычно экспрессионные векторы, используемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать последовательности для поддержания плазмид и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, все вместе называемые фланкирующими последовательностями, в некоторых воплощениях будут обычно включать одну или более чем одну из следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или более чем одну энхансерную последовательность, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полноразмерную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подлежащий экспрессии, и селективный маркерный элемент. Каждая из этих последовательностей обсуждается ниже.
Возможно, вектор может содержать последовательность, кодирующую выступ, то есть олигонуклеотидную молекулу, локализованную при 5' или 3' конце кодирующей последовательности полипептида антитела к ΝΟΡ; эта олигонуклеотидная последовательность кодирует поли-Ηίδ (такой как гекса-Ηίδ) или другой выступ, такой как РЬЛО, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или тус, для которых существуют имеющиеся в продаже антитела. Этот выступ обычно сливается с полипептидом при экспрессии этого полипептида и может служить в качестве средства для аффинной очистки или обнаружения антитела ΝΟΡ из клетки-хозяина. Аффинную очистку можно проводить, например, с помощью колоночной хроматографии, используя антитела против выступа в качестве матрицы аффинитета. Возможно, этот выступ можно впоследствии удалить из очищенного полипептида антитела к ΝΟΡ различными способами, такими как использование некоторых пептидаз для расщепления.
Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (то есть из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (то есть из видов, иных, чем вид или штамм клеткихозяина), гибридными (то есть комбинация фланкирующих последовательностей более чем из одного источника), синтетическими или нативными. Как таковой, источник фланкирующей последовательности может представлять собой любой прокариотический или эукариотический организм, любой организм позвоночного или беспозвоночного или любого растения при условии, что фланкирующая последовательность является функциональной в этом организме, и может активироваться аппаратом клеткихозяина.
Фланкирующие последовательности, применимые в векторах по данному изобретению, могут быть получены любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области. Обычно фланкирующие последовательности, применимые здесь, будут представлять собой идентифицированные ранее путем картирования и/или ферментативного гидролиза эндонуклеазами рестрикции и, таким образом, могут быть выделены из подходящей ткани-источника с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции. В некоторых случаях полноразмерная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности может быть известна. Поэтому фланкирующую последовательность можно синтезировать, используя способы, описанные здесь для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.
Независимо от того, известна ли вся фланкирующая последовательность или только ее участок, она может быть получена с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или путем скрининга геномной библиотеки подходящим зондом, таким как олигонуклеотид и/или фрагмент фланкирующей последовательности из того же или из другого вида. Где фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, можно выделить из большего участка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение можно осуществить с помощью гидролиза эндонуклеазами рестрикции с получением верного фрагмента ДНК с последующим выделением, используя очистку из агарозного геля, хроматографию на колонке 01адеп (СкаШзуоПк СА) или другие способы, известные специалистам в данной области. Выбор подходящих ферментов для осуществления этой цели будет легко очевиден специалисту в
- 29 030259 данной области.
Точка начала репликации обычно представляет собой часть тех прокариотических векторов, которые имеются в продаже, и точка начала репликации способствует амплификации вектора в клеткехозяине. Если выбранный вектор не содержит сайт точки начала репликации, его можно синтезировать химическим путем на основании известной последовательности и лигировать в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды рВК322 (Яете Еп§1апб Вю1аЬ8, Веует1у, МА) является пригодной для большинства грамотрицательных бактерий, а различные точки начала репликации вирусного происхождения (например, 8У40, вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (У8У) или вирусов папилломы, таких как НРУ или ВРУ) полезна для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, компонент точки начала репликации не требуется для экспрессионных векторов млекопитающих (например, точку начала репликации 8У40 часто используют только потому, что она также содержит ранний промотор этого вируса).
Последовательность терминации транскрипции обычно локализована 3' к концу кодирующей области полипептида и служит для терминации транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой О-С богатый фрагмент, за которым следует последовательность поли-Т. Хотя эту последовательность легко клонируют из библиотеки или даже приобретают коммерческим путем в виде части вектора, ее также можно легко синтезировать, используя способы синтеза нуклеиновых кислот, такие как описаны здесь.
Селективный маркерный ген кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, растущей в селективной культуральной среде. Типичные селективные маркерные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или к другим токсинам, например, к ампициллину, тетрациклину или канамицину для прокариотических клеток-хозяев; (б) комлементируют ауксотрофные дефициты клетки или (в) обеспечивают критические питательные вещества, недоступные из комплексной или определенной среды. Предпочтительными селективными маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Предпочтительно ген устойчивости к неомицину можно также использовать для селекции как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах.
Другие селективные гены можно использовать для амплификации гена, который будет экспрессироваться. Амплификация представляет собой процесс, где гены, которые требуются для продуцирования белка, критичного для роста или выживания клетки, тандемно повторяются в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примеры пригодных селективных маркеров для клеток млекопитающих включают гены дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΡ) и беспромоторные гены тимидинкиназ. Трансформанты клеток млекопитающих помещают в условия давления отбора, где трансформанты уникально адаптированы к выживанию только благодаря присутствию селективного гена в векторе. Давление отбора создают путем культивирования трансформированных клеток в условиях, в которых концентрацию селективного агента в среде постепенно повышают, что приводит в результате к амплификации как селективного гена, так и ДНК, которая кодирует другой ген, такой как антитело, связывающееся с полипептидом NОЕ. В результате с амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества полипептида, такого как антитело к NОЕ.
Сайт связывания рибосомы обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-Далгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты). Этот элемент обычно локализован 3' к промотору и 5' к кодирующей последовательности полипептида, подлежащего экспрессии.
В некоторых случаях, например, где желательно гликозилирование в экспрессионной системе эукариотической клетки-хозяина, можно манипулировать с различными пре- или пропоследовательностями для улучшения гликозилирования или выхода. Например, можно изменить сайт расщепления пептидазы конкретного сигнального пептида или добавить пропоследовательности, которые могут также влиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может иметь в положении -1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или более чем одну дополнительную аминокислоту, несущественную для экспрессии, которая может не быть полностью удалена. Например, конечный белковый продукт может иметь один или два аминокислотных остатка, находящихся в сайте расщепления пептидазы, присоединенных к аминоконцу. Альтернативно результатом использования некоторых сайтов ферментативного расщепления может быть слегка укороченная форма желаемого полипептида, если фермент режет в такой области внутри зрелого полипептида.
Векторы экспрессии и клонирования по изобретению будут обычно содержать промотор, который распознается организмом-хозяином и оперативно сцеплен с молекулой, кодирующей антитело к NОЕ. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, локализованные вверх по течению (то есть 5') к стартовому кодону структурного гена (обычно в пределах примерно от 100 до 1000 п.о.), которые регулируют транскрипцию структурного гена. Промоторы общепринято группируют в один из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции с ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение условий культивирования, такое как наличие или отсутствие питательного вещества или изме- 30 030259 нение температуры. Конститутивные промоторы, с другой стороны, однородно транскрибируют ген, с которым они оперативно сцеплены, то есть при небольшом или при отсутствии контроля над экспрессией гена. Известно большое число промоторов, распознаваемых рядом потенциальных клеток-хозяев. Подходящий промотор оперативно сшивают с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, составляющие антитело к NСЕ по изобретению, путем удаления промотора из источника ДНК путем гидролиза ферментом рестрикции и встраивания желаемой промоторной последовательности в этот вектор.
Подходящие промоторы для использования в дрожжевых хозяевах хорошо известны в данной области. Дрожжевые энхансеры предпочтительно используют с дрожжевыми промоторами. Подходящие промоторы для использования с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны и включают, но не ограничены ими, те, которые получены из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вируса Γο\ν1ροχ, аденовируса (такого как Аденовирус 2), вируса бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса, ретровирусов, вируса гепатита В и наиболее предпочтительно вируса обезьян 40 (ЗУ40). Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например, термошоковые промоторы и промотор актина.
Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес, включают, но не ограничены ими: ранний промотор ЗУ40 (ΒβΓηοίδΐ апй СЬатЬοη, 1981, Шипе 290: 304-10); промотор СМУ (Τΐιοιηδοη с1 а1., 1984, Ргос. №к1. Асай. ИЗА 81: 659-663); промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Υататοкο, е1 а1., 1980, Се11 22: 787-97); промотор тимидинкиназы герпеса (\Уадпсг е1 а1., 1981, Ргос. №·ιΐ1. Асай. Зс1. ИЗА 78: 1444-45); промотор и регуляторные последовательности из гена металлотионеина (Вг1П81сг е1 а1., 1982, Шипе 296: 39-42); и прокариотические промоторы, такие как промотор бета-лактамазы (Уй1а-КатагоГГ е1 а1., 1978, Ргос. №к1. Асай. Зск ИЗА 75: 3727-31) или промотор 1ас (^еΒοе^ е1 а1., 1983, Ргос. №11. Асай. Зст ИЗА, 80: 21-25). Интерес также представляют перечисленные ниже контролирующие области транскрипции животных, которые проявляют тканеспецифичность и использовались в трансгенных животных: контролирующая область гена эластазы I, которая активна в ацинарных клетках поджелудочной железы (З\\аП е1 а1., 1984, Се11 38: 639-46; 0пи1/ е1 а1., 1986, Сс1й Зргшд НаЛсг Зутр. ОнаШ. Βίο1. 50: 399-409 (1986); Μас^οηа1й. 1987, НераГОкду 7: 425-515); контролирующая область гена инсулина, которая активна в бета-клетках поджелудочной железы (Наткай
1985, Шипе 315: 115-22); контролирующая область гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (СгоззсНеШ ек а1., 1984, Се11 38: 647-58; Айатез ек а1., 1985, Шипе 318: 533-38; АкхаМег ек а1., 1987, Μο1. Се11. Βίο1., 7: 1436-44); контролирующая область вируса опухоли молочной железы мыши, которая активна в клетках семенников, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Ьейег е1 а1.,
1986, Се11 45: 485-95); контролирующая область гена альбумина, которая активна в печени (РткеП е1 а1.,
1987, Сспсз апй Эетек 1: 268-76); контролирующая область гена альфа-фето-протеина, которая активна в печени (Кгит1аиГ ек а1., 1985, Μο1. Се11. Βίο1., 5: 1639-48; Наттег ек а1., 1987, Зскисе 235: 53-58); контролирующая область гена альфа-1-антитрипсина, которая активна в печени (Ке1зеу е1 а1., 1987, Сспсз апй Эссек 1: 161-71); контролирующая область гена бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Μοд^ат ек а1., 1985, Шипе 315: 338-40; КсШаз ек а1., 1986, Се11 46: 89-94); контролирующая область гена основного белка миелина, которая активна в олигодендроцитах в головном мозге (КеайНеай ек а1., 1987, Се11 48: 703-12); контролирующая область гена легкой цепи-2 миозина, которая активна в скелетных мышцах (Зат, 1985, Шипе 314: 283-86) и контролирующая область гена гормона, высвобождающего гонадотропин, которая активна в гипоталамусе (Μазοη ек а1., 1986, 8сюпсс 234:1372-78).
Энхансерная последовательность может быть встроена в вектор для усиления транскрипции ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, составляющие антитело к NСЕ по изобретению, высшими эукариотами. Энхансеры представляют собой цис-активные элементы ДНК, обычно примерно 10-300 п.о. в длину, которые действуют на промотор с усилением транскрипции. Энхансеры являются относительно независимыми от ориентации и положения, обнаруженные в положениях как 5', так и 3' к транскрипционной единице. Некоторые энхансерные последовательности, доступные из генов млекопитающих, известны (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фето-протеина и инсулина). Обычно, однако, используют энхансер из вируса. Энхансер ЗУ40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы и энхансеры аденовируса, известные в данной области, являются примерными энхансерными элементами для активации эукариотических промоторов. Хотя энхансер может быть расположен в векторе либо 5', либо 3' к кодирующей последовательности, он обычно локализован в сайте 5' от промотора.
Экспрессионные векторы по изобретению можно конструировать из исходного вектора, такого как вектор, имеющийся в продаже. Такие векторы могут содержать или не содержать все желаемые фланкирующие последовательности. Где одна или более чем одна из фланкирующих последовательностей, описанных здесь, еще не присутствует в векторе, ее можно получить индивидуально и лигировать в вектор. Способы, используемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалистам в данной области.
После того, как вектор сконструирован, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, тяжелую цепь или легкую цепь и тяжелую цепь, составляющие антитело к NСЕ, встроена в правильный сайт этого вектора, законченный вектор можно вводить в подходящую клетку-хозяина для ам- 31 030259 плификации и/или экспрессии полипептида. Трансформацию экспрессионного вектора для антитела к NΟР в выбранную клетку-хозяина можно осуществить хорошо известными способами, включая трансфекцию, инфекцию, кальцийфосфатную ко-преципитацию, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном, или другие известные методики. Выбранный способ отчасти будет функцией от типа клетки-хозяина, которую нужно использовать. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту в данной области и описаны, например, в ЗатЬгоок е! а1., см. выше.
Клетка-хозяин, когда ее культивируют в подходящих условиях, синтезирует антитело к NΟР, которое затем можно собрать из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если оно не секретируется). Выбор подходящей клетки-хозяина будет зависеть от ряда факторов, таких как желаемые уровни экспрессии, модификации полипептида, которые являются желательными или необходимыми для активности (такие как гликозилирование или фосфорилирование), и простота упаковки в биологически активную молекулу.
Клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничены ими, бессмертные клеточные линии, доступные из Американской коллекции типовых клеточных культур (АТСС, Атепсап Туре Си1!ите Со11ес!юп), включающие, но не ограниченные ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек новорожденного хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (С0З), клетки печеночно-клеточного рака человека (например, Нер Ο2) и ряд других клеточных линий. В некоторых воплощениях клеточные линии могут быть выбраны на основании определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и конститутивно продуцируют антитела с NΟР-связывающими свойствами. В другом воплощении может быть выбрана клеточная линия из линии В клеток, которые не продуцируют собственное антитело, но обладают способностью продуцировать и секретировать гетерологичное антитело.
Антитела по изобретению полезны для обнаружения NΟР в биологических образцах и идентификации клеток или тканей, которые продуцируют белок NΟР. Антитела по изобретению, которые специфично связываются с NΟР, могут быть полезны при лечении опосредованных NΟР заболеваний. Указанные антитела можно использовать в анализах связывания для обнаружения NΟР и для ингибирования NΟР в результате образования комплекса с рецепторами NΟР. Указанные антитела, которые связываются с NΟР и блокируют взаимодействие с другими связывающими соединениями, могут обладать терапевтической пользой при модулировании опосредованных NΟР заболеваний. В предпочтительных воплощениях антитела к NΟР могут блокировать связывание NΟР с его рецептором, результатом чего может быть прерывание индуцированного NΟР каскада преобразования сигнала.
Настоящее изобретение также относится к применению одного или более антител по настоящему изобретению в производстве лекарства для лечения у пациента болезненного расстройства или состояния, вызванного повышенной экспрессией NΟР или повышенной чувствительностью к NΟР, такого как любое из расстройств или состояний, раскрытых здесь.
В предпочтительных воплощениях в изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество одного или множества антител по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солюбилизирующим агентом, эмульгирующим агентом, консервантом и/или адъювантом. Предпочтительно приемлемые вещества для препаратов нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях. В предпочтительных воплощениях предложены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество антител к NΟР.
В некоторых воплощениях приемлемые вещества для препаратов предпочтительно нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция может содержать вещества для препаратов для модификации, сохранения и консервации, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотонических свойств, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или всасывания композиции. В таких воплощениях подходящие вещества для препаратов включают, но не ограничены ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); противомикробные агенты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-НС1, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты); объемные агенты (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красящие, корригирующие и разбавляющие агенты; эмульгирующие агенты; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метипарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или
- 32 030259 сорбит); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажняющие агенты (такие как Р1игошс8, ПЭГ, эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит); агенты, усиливающие тонические свойства (такие как галогениды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит, сорбит); носители для доставки; разбавители; эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты. См. ΚΕΜΙΝΟΤΟΝ’δ Р11ЛК\1ЛСТТ.'Т1СЛ1. δΟΕΝΟΕδ, 18 Εάίΐίοη, (А. К. Сеииаго, ей.), 1990, Маск РиЫЫипд Сотрапу.
В некоторых воплощениях оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области в зависимости, например, от назначенного пути введения, формы доставки и желаемой дозировки. См., например, ΚΕΜΙΝΟΤΟΝ’δ РНАКМАСЕиТ1САЬ δСIΕNСΕδ, выше. В некоторых воплощениях такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίη νίνο и скорость клиренса ίη νίνο антител по изобретению.
В некоторых воплощениях основной растворитель или носитель в фармацевтической композиции может быть либо водным, либо неводным по природе. Например, подходящий растворитель или носитель может представлять собой воду для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственную спинномозговую жидкость, в которые возможно добавлены другие вещества, общие в композициях для парентерального введения. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, являются примерными дополнительными растворителями. В предпочтительных воплощениях фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат трис буфер рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер рН примерно 4,0-5,5 и могут дополнительно включать сорбит, сахарозу, твин-20 и/или их подходящий заменитель. В некоторых воплощениях изобретения композиции антитела к ΝΟΡ можно готовить для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с возможными агентами для препаратов (ΚΕΜΙΝΟΤΟΝ’δ РНАКМАСЕиТ1САЬ δΟΕΝΟΕδ, см. выше) в форме лиофилизированного кека или водного раствора. Кроме того, в некоторых воплощениях препарат продукта, представляющего собой антитело к ΝΟΡ, можно готовить в виде лиофилизата, используя подходящие эксципиенты, такие как сахароза.
Фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены для парентерального введения. Или же композиции могут быть составлены для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций входит в компетенцию специалиста в данной области.
Компоненты для препаратов предпочтительно находятся в концентрациях, которые приемлемы для места введения. В некоторых воплощениях изобретения буферы используют для поддержания композиции при физиологическом рН или при несколько более низком рН, обычно в пределах интервала рН от примерно 5 до примерно 8.
Когда рассматривают парентеральное введение, терапевтические композиции для применения по данному изобретению могут быть представлены в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, содержащего желаемое антитело к ΝΟΡ в фармацевтически приемлемом растворителе. Особенно подходящим растворителем для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которой готовят препарат антитела к ΝΟΡ в виде стерильного, изотонического раствора, правильно законсервированного. В некоторых воплощениях в изготовление этого препарата можно включать препарат желаемой молекулы с агентом, таким как инъекционные микрошарики, биологически разрушаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут обеспечить регулируемое или пролонгированное высвобождение продукта, который можно доставлять посредством инъекции депо. В некоторых воплощениях можно также использовать гиалуроновую кислоту, обладающую эффектом, способствующим пролонгированному периоду в кровообращении. В некоторых воплощениях для введения желаемой молекулы антитела можно применять имплантационные устройства для доставки лекарства.
Препараты фармацевтических композиций по изобретению можно готовить для ингаляции. В этих воплощениях препараты антител к ΝΟΡ предпочтительно готовят в виде сухого ингаляционного порошка. В предпочтительных воплощениях можно также готовить препараты антитела к ΝΟΡ в виде ингаляционных растворов с пропеллентом для аэрозольной доставки. В некоторых воплощениях растворы могут быть распыляемыми. Легочное введение и способы изготовления препаратов для него дополнительно описаны в Международной патентной заявке № РСТ/υδ 94/001875, которая включена путем ссылки и в которой описана легочная доставка химически модифицированных белков.
Рассматривается также, что препараты можно вводить перорально. Препараты антител к ΝΟΡ, которые вводят таким способом, можно готовить без носителей или с носителями, общепринято используемыми при компаундинге твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. В некоторых воплощениях капсула может быть предназначена для высвобождения активной части препарата в точке желудочно-кишечного тракта, где биодоступность является максимальной, а досистемный распад является минимальным. Можно включать дополнительные агенты для облегчения всасывания антитела к ΝΟΡ. Разбавители, корригенты, легкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие агенты, суспендирующие агенты, разрыхляющие агенты для таблеток и связующие агенты можно также использовать.
- 33 030259
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно обеспечивает содержание эффективного количества одного или множества антител к NОР в смеси с нетоксичными эксципиентами, которые являются пригодными для производства таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или в другом подходящем растворителе можно готовить растворы в форме стандартной дозы. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничены ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Дополнительные фармацевтические композиции будут очевидны специалистам в данной области, включая препараты, содержащие антитела к NОР в препаратах пролонгированной или регулируемой доставки. Методики изготовления других разнообразных средств пролонгированной или регулируемой доставки, таких как липосомные носители, биологически разрушаемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекции депо, также известны специалистам в данной области. См., например, Международную патентную заявку № РСТ/ϋδ 93/00829, которая включена путем ссылки и в которой описано регулируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Препараты пролонгированного высвобождения могут включать полупроницаемые полимерные основы в форме формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Основы пролонгированного высвобождения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (как описано в патенте США № 3773919 и в публикации Европейской патентной заявки № ЕР 058481, каждая из которых включена путем ссылки), сополимеры ϋ-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (816тап е! а1., 1983, Вюро1утегк 22: 547-556), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Ьапдег е! а1., 1981, 1. Вюте6. Ма!ег. Кек. 15: 167-277 и Ьапдег, 1982, СНет. ТесН. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., см. выше) или поли-Э-(-)-3гидроксимасляную кислоту (публикация Европейской патентной заявки № ЕР 133988). Композиции пролонгированного высвобождения могут также включать липосомы, которые можно изготовить любым из нескольких способов, известных в данной области. См., например, Еррк!еш е! а1., 1985, Ргос. №!1. Аса6. δα. И8А 82: 3688-3692; публикации Европейских патентных заявок № ЕР 036676; ЕР 088046 и ЕР 143949, включенные сюда путем ссылки.
Фармацевтические композиции, применяемые для введения ίη νί\Ό. обычно представлены в виде стерильных препаратов. Стерилизацию можно осуществить путем фильтрования через стерильные фильтрационные мембраны. Когда композиция лиофилизирована, стерилизацию с использованием этого способа можно проводить либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиции для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе. Парентеральные композиции, как правило, помещают в контейнер, имеющий отверстие для стерильного доступа, например, пакет или флакон для внутривенного раствора, имеющий пробку, протыкаемую подкожной инъекционной иглой.
Когда препарат фармацевтической композиции изготовлен, его можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, либо в виде дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты можно хранить либо в готовой к употреблению форме, либо в форме (например, лиофилизированной), которую восстанавливают перед введением.
В изобретении также предложены наборы для получения стандартной дозы однократного введения. Каждый набор по изобретению может содержать как первый контейнер, содержащий высушенный белок, так и второй контейнер, содержащий водный препарат. В некоторых воплощениях данного изобретения предложены наборы, содержащие однокамерные и многокамерные предварительно наполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и лиошприцы).
Эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей антитело к NОР для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целей. Специалисту в данной области будет понятно, что подходящие уровни дозировки для лечения будут варьировать в зависимости отчасти от доставляемой молекулы, от показания, для которого применяют антитело к NОР, от пути введения и размера (массы тела, поверхности тела или размера органа) и/или от состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. В некоторых воплощениях врач может титровать дозировку и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Типичная дозировка может находиться в интервале от примерно 0,1 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг или более в зависимости от факторов, упомянутых выше. В предпочтительных воплощениях дозировка может находиться в интервале от 0,1 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг; более предпочтительно от 1 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг или даже более предпочтительно от 5 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг.
Частота дозировки будет зависеть от фармакокинетических параметров конкретного антитела к NОР в применяемом препарате. Обычно врач вводит композицию до получения дозировки, при которой достигается желаемый эффект. Композицию можно, таким образом, вводить в виде однократной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать или не содержать одинаковое количество желаемой молекулы) за период времени или в виде непрерывной инфузии через имплантационное устройство или катетер. Дополнительное уточнение соответствующей дозировки рутинно проводится специалистами в данной области и находится в пределах рутинно решаемых ими задач. Подходящие дозировки
- 34 030259 можно установить путем использования соответствующих данных доза-ответ. В некоторых воплощениях антитела по изобретению можно вводить пациентам на протяжении длительного периода времени. Хроническое введение антитела по изобретению минимизирует вредный иммунный или аллергический ответ, обычно связанный с антителами, которые образуются против человеческого антигена у животного, не представляющего собой человека, например, не полностью человеческим антителом, продуцируемом в видах, не представляющих собой человека.
Путь введения фармацевтической композиции находится в соответствии с известными способами, например, пероральным, посредством инъекции внутривенным, внутрибрюшинным, интрацеребральным (интрапаренхимальным), интрацеребровентрикулярным, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным, интрапортальным путем или внутрь поражения; с помощью систем пролонгированного высвобождения или с помощью имплантационных устройств. В некоторых воплощениях композиции можно вводить путем болюсной инъекции, либо непрерывно путем инфузии, либо с помощью имплантационного устройства.
Композицию можно также вводить местным путем с помощью имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором адсорбирована или в котором инкапсулирована желаемая молекула. В некоторых воплощениях, где применяют имплантационное устройство, это устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка желаемой молекулы может происходить посредством диффузии, болюса, высвобождаемого со временем или непрерывного введения.
Может быть также желательно применять фармацевтические композиции антитела к ΝΟΡ по изобретению ех νί\Ό. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые извлечены из пациента, подвергают воздействию фармацевтических композиций антитела к ΝΟΡ, после чего эти клетки, ткани и/или органы последовательно имплантируют обратно пациенту.
В частности, антитела к ΝΟΡ можно доставлять путем имплантации определенных клеток, которые сконструированы генно-инженерным путем, используя способы, такие как описаны здесь, для экспрессии и секреции полипептида. В некоторых воплощениях такие клетки могут представлять собой животные или человеческие клетки и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В некоторых воплощениях такие клетки могут представлять собой бессмертные клетки. В других воплощениях, чтобы уменьшить вероятность иммунологического ответа, клетки могут быть инкапсулированы во избежание инфильтрации окружающих тканей. В следующих воплощениях инкапсулирующие материалы обычно представляют собой биосовместимые, полупроницаемые полимерные капсулы или мембраны, которые дают возможность высвобождения белкового(ых) продукта(ов), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими повреждающими факторами из окружающих тканей.
Примеры
Приведенные ниже примеры, включая проведенные эксперименты и полученные результаты, предложены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение.
Пример 1
Получение человеческого белка ΝΟΡ из клеток Е. сой
Клонирование гНи-ΝΟΡ (1-120)
Нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий ΝΟΡ, амплифицировали с кДНК, используя олигонуклеотидные праймеры с последовательностями, показанными в БЕЦ ГО NО: 27 и БЕЦ ГО NО: 28, и применяя стандартную технологию ПЦР. 5'-Праймер образует сайт рестрикции Ьбе1 и кодон инициации метионина, непосредственно предшествующий кодону 1 (серин) зрелой последовательности. 3' Праймер образует сайт рестрикции ВатН1 сразу после кодона терминации. Полученный продукт ПЦР очищали из геля, переваривали эндонуклеазами рестрикции Ьбе1 и ВатН1, а затем лигировали в вектор рСРМ1656, также переваренный Ьбе1 и ВатН1.
Лигированную ДНК трансформировали в компетентные клетки-хозяева Е. сой штамм 657. Проводили скрининг клонов на способность продуцировать рекомбинантный белковый продукт и на содержание плазмиды, имеющей правильную нуклеотидную последовательность (то есть БЕЦ ГО NО: 29). Аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого ΝΟΡ 1-120 показана как БЕЦ ГО NО: 30.
Экспрессионный вектор рСРМ1656 (АТСС #69576) является производным экспрессионной векторной системы, описанной в патенте США № 4710473. Плазмида рСРМ1656 может быть получена на основе описанной плазмиды рСРМ836 (патент № 4710473) путем: (а) разрушения двух эндогенных сайтов рестрикции Ьбе1 путем заполнения концов ферментом полимеразой Т4 с последующим лигированием по тупым концам; (б) замены последовательности ДНК между двумя уникальными сайтами рестрикции Аа!11 и С1а1, содержащей синтетический промотор Рь, подобным фрагментом, полученным из рСРМ636 (патент № 4710473), содержащим промотор Рь, а затем (в) замещения небольшой последовательности ДНК между уникальными сайтами рестрикции С1а1 и Крп1 олигонуклеотидом, полученным в результате отжига двух проб, имеющих нуклеотидные последовательности, показанной в БЕЦ ГО NО: 31 и БЕЦ ГО ΝΘ: 32.
- 35 030259
Штамм-хозяин Е.сой К12 (штамм Атдеп 657) является производным Е сой ^1485 (штамм К12), полученного из Е. сой Сепейс З!оск Сеп!ег, Уа1е Ипиегейу, Хеи Наνеη, СТ (ССЗС штамм 6159).
Экспрессия гНи-ХСР (1-120)
Клетки Е. сой, содержащие конструкцию экспрессии ХСР (как описано выше) ферментировали в обогащенной среде в режиме подпитываемой культуры. Клетки выращивали при 30°С до ОИ 49 при 600 нм, а затем индуцировали температурным сдвигом до 42°С. Клетки собирали центрифугированием через четыре часа после индукции. Конечная ОИ составляла 75. Выход экспрессии определили как примерно 0,15 г/л.
Вторичная укладка и очистка гНи-ХСР (1-120)
Клеточную массу лизировали в МюгоЯшФ/ег, центрифугировали при 10000 х д в течение 30 мин, осадок промывали 1% дезоксихолевой кислотой, центрифугировали, как описано выше, а затем полученный осадок промывали холодной водой и повторно центрифугировали. Полученный в результате осадок (^1В8, иа8Йей шс1и8ие ЪоФе8 - промытые тельца включения) ресуспендировали в денатурирующем буфере 8М гуанидин-НС1, 50 мМ Трис рН 8,5, содержащем 10 мМ ИТТ, и солюбилизировали при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугировали при 10000 х д в течение 30 мин, и супернатант осторожно декантировали, а затем разбавляли в 25 раз в водном буфере, содержащем окислительновосстановительную пару, при 4°С в течение 5 суток. Затем полученную в результате вторичную структуру титровали до рН 3,0, фильтровали через 0,45 рМ фильтр. Вторичную структуру очищали, используя колонку быстрого тока с Зр-сефарозой с использованием стандартного градиента ХаС1. Затем пул с катионообменной колонки концентрировали, и аликвоты замораживали при -80°С. Чистоту белка оценивали с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) и анализировали с помощью окрашивания Кумасси голубым. Очищенный таким способом белок составлял более чем 90% главной полосы.
Пример 2
Продуцирование человеческих моноклональных антител к фактору роста нервов (ХСР)
Трансгенные мыши НиМаЪ и КМ
Полностью человеческие моноклональные антитела ХСР получили, используя линии трансгенных мышей НСо7, НСо12, НСо7+НСо12 и КМ, каждая из которых экспрессирует гены человеческого антитела. В каждой из этих линий мышей было получено гомозиготное прерывание эндогенного мышиного гена легкой цепи каппа, как описано в Сйеп е! а1. (1993, ЕМВО 1. 12: 811-820), и гомозиготное прерывание эндогенного мышиного гена тяжелой цепи было получено, как описано в Примере 1 публикации Международной патентной заявки № \УО 01/09187 (включена путем ссылки). Каждая из этих линий мышей несет трансген легкой цепи каппа человека КСо5, как описано в Р18йийй е! а1. (1996, Ха!иге Вю!есйпо1оду 14: 845-851). Линия НСо7 несет трансген тяжелой цепи человека НСо7, как описано в патентах США № 5545806, 5625825 и 5545807 (включены путем ссылки). Линия НСо12 несет трансген тяжелой цепи человека НСо12, как описано в Примере 2 публикации Международной патентной заявки № \УО 01/09187 (включена путем ссылки). Линия НСо7+НСо12 несет оба трансгена тяжелой цепи НСо7 и НСо12 и является гемизиготной по каждому трансгену. Мыши КМ содержат трансген тяжелой цепи ЗС20, как описано в Топи/ика е! а1. (1997, Ха!иге Сепе!. 16, 133-143 и 2000, Ргос. Ха!1. Асай. δοΐ, 97, 722727). Этот трансген не интегрирован в хромосому мыши, а вместо этого передается как независимый фрагмент хромосомы. Этот фрагмент включает примерно 15 МВ хромосомы 14 человека. Он содержит полноразмерный локус тяжелой цепи человека, включая все участки генов УН, И и ДН и все изотипы константной области тяжелой цепи. Все эти линии называют мышами НиМаЪ.
Иммунизация НиМаЪ
Для получения полностью человеческих антител к ХСР мышей НиМаЪ иммунизировали очищенным рекомбинантным ХСР, полученным из клеток Е. сой, в качестве антигена (Пример 1). Общие схемы иммунизации мышей НиМаЪ описаны в ЬопЪегд е! а1. 1994, Ха!иге 368: 856-859; Р18йийй е! а1., см. выше, и в \УО 98/24884, выводы каждой из которой включены сюда путем ссылки. Возраст мышей составлял 616 недель в момент первой инфузии антигена. Очищенный рекомбинантный препарат (25-100 мкг) антигена ХСР использовали для иммунизации мышей НиМаЪ внутрибрюшинно (1Р) или подкожно (ЗС).
Трансгенных мышей НиМаЪ иммунизировали с использованием антигена в полном адъюванте Фрейнда и двух инъекций с последующими иммунизациями 1Р через 2-4 недели (всего вплоть до 9 иммунизаций) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. На каждый антиген иммунизировали несколько дюжин мышей. Всего 118 мышей линий НСо7, НСо12, НСо7+НСо12 и КМ проиммунизировали антигеном ХСР. Мониторинг иммунного ответа проводили путем ретроорбитального забора крови.
Для отбора мышей НиМаЪ, продуцирующих антитела, которые связывают человеческий ХСР, сыворотку от иммунизированных мышей тестировали с помощью ЕЫЗА (твердофазного иммуноферментного анализа), как описано Р18йийй е! а1., см. выше. Кратко, микротитровальные планшеты покрывали очищенным рекомбинантным ХСР из Е. сой (Пример 1) в концентрации 1-2 мкг/мл в ФСБ м 50 мкл/лунка инкубировали при 4°С в течение ночи, затем блокировали 200 мкл/лунка 5% сыворотки цыпленка в ФСБ/твин (0,05%).
- 36 030259
Разведения плазмы от NО?-иммунизированных мышей добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1-2 ч при температуре окружающей среды. Планшеты отмывали ФСБ/твин, а затем инкубировали с Ι§0 ?с-специфичным поликлональным реагентом коза-против-человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (НРР), в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки планшеты проявляли субстратом АВТЗ (§1§та СЬетюа1 Со., δΐ. Ьош8, М0, № по каталогу А-1888, 0,22 мг/мл) и анализировали спектрофотометрически путем определения оптической плотности (0Ό) при длинах волны 415-495 нм. Мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина анти^0? использовали для продуцирования моноклональных антител, как описано ниже.
Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к N0?
Мышей готовили для продуцирования моноклональных антител путем повторной вакцинации антигеном внутривенно в течение 2 суток, после чего их умерщвляли, а затем извлекали селезенки. Из мышей НиМаЬ выделяли мышиные спленоциты и осуществляли их слияние, с помощью ПЭГ, с клеточной линией миеломы мыши, используя стандартные протоколы. Обычно проводили 10-20 слияний для каждого антигена.
Кратко, моноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки от иммунизированных мышей сливали до одной четверти от числа несекретирующих клеток миеломы мыши Р3Х63-Ад8.653 (АТСС, № по каталогу СРБ 1580) с 50% ПЭГ (§1§та). Клетки высевали в концентрации примерно 1х105/лунка в микротитровальные планшеты с плоским дном с последующей примерно двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка, кондиционированную среду 10% Р388О1-(АТСС, № по каталогу СРБ ТГО-63), 3-5% ориген (ΜΕ^ в ΌΜΕΜ (МеФа!еск № по каталогу СРБ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата натрия) плюс 5 мМ ГЭПЭС, 0,055 мМ 2меркаптоэтанол, 50 мг/мл гентамицина и 1хНАТ (§1§та, № по каталогу СРЬ Р-7185). После 1-2 недель клетки культивировали в среде, в которой НАТ заменяли НТ.
Проводили скрининг полученных в результате гибридом на продуцирование антигенспецифичных антител. Скрининг индивидуальных лунок проводили с помощью РМЗА (описано выше) на человеческие моноклональные Ι§0 антитела к N0?. Как только происходил интенсивный рост гибридомы, проводили мониторинг среды, обычно после 10-14 суток. Гибридомы, секретирующие антитела, пересевали, снова проводили скрининг и, если они все еще были положительными по человеческим моноклональным Ι§0 антителам анти^0?, субклонировали по меньшей мере дважды путем ограниченного разведения. Затем стабильные субклоны культивировали ίη νίίΐΌ для получения небольших количеств антитела в среде для тканевых культур для характеристики.
Отбор человеческих моноклональных антител, которые связываются с N0?
Анализ НиЗА, как описано выше, использовали для скрининга на гибридомы, которые проявляют положительную реактивность с иммуногеном N0?. Гибридомы, секретирующие моноклональное антитело, которое связывается с высоким сродством с N0?, субклонировали и дополнительно определяли их характеристики. Один клон от каждой гибридомы, которая сохраняла реактивность исходных клеток (как определено с помощью ВиЗА), выбирали для получения клеточного банка 5-10 флаконов, который хранили в жидком азоте.
Изотип-специфичный РМЗА проводили для определения изотипа моноклональных антител, полученных, как описано здесь. В этих экспериментах лунки микротитровальных планшетов покрывали 50 мкл/лунка раствора 1 мкг/мл легкой цепи каппа мышь против человека в ФСБ и инкубировали при 4°С в течение ночи. После блокирования 5% сывороткой цыпленка планшеты подвергали взаимодействию с надосадочной жидкостью от каждого тестируемого моноклонального антитела и очищенного контроля на изотип. Планшеты инкубировали при температуре окружающей среды в течение 1-2 ч. Затем лунки подвергали взаимодействию с различными человеческими поликлональными антисыворотками коза-против-человека, конъюгированными с пероксидазой хрена, и планшеты проявляли и анализировали, как описано выше.
Моноклональные антитела, очищенные из надосадочных жидкостей гибридом, которые проявили значительное связывание с N0?, как определено путем РБ^А, дополнительно тестировали на биологическую активность, используя ряд количественных определений биологической активности, как описано ниже.
Пример 3
Селекция и клонирование антител к N0? с сильной нейтрализующей активностью в отношении
N0?
Эффективность антител, первоначально идентифицированных в Примере 2 в качестве ингибиторов активности N0?, (то есть нейтрализацию N0?) оценивали путем измерения способности каждого модифицированного пептида к блокированию индукции фактором N0? экспрессии рецептора ваниллоида1 (νΗ1).
Культуры нейронов спинного корневого ганглия
Спинные корневые ганглии (НР0) вырезали один за другим в асептических условиях из всех спинномозговых сегментов 19-суточного эмбриона (Е19) крыс, который хирургическим путем извлекали из
- 37 030259 матки крыс 8ргадие-0аМеу с зафиксированной датой беременности под терминальной анестезией (СЬаг1ек РУег, ХУПттдЮп, МА). ЭР0 собирали в охлажденной во льду среде Ь-15 (01ЬсоВРЬ, Огапб 1к1апб, ΗΥ), содержащей 5% инактивированную нагреванием лошадиную сыворотку (01ЬсоВРЬ), и удаляли какую-либо рыхлую соединительную ткань и кровеносные сосуды. ЭР0 дважды промывали в свободном от Са2+ и Мд24 забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко (ГОРВ8), рН 7,4 (01ЬсоВРЬ). Затем проводили диссоциирование ЭР0 до моноклеточной суспензии, используя папаиновую систему диссоциации (\Уог11йпд1оп ВюсЬетюа1 Согр., РгееЬоМ, N1). Кратко, ЭР0 инкубировали в переваривающем растворе, содержащем 20 ед./мл папаина в сбалансированном солевом растворе Эрла (ЕВ88) при 37°С в течение пятидесяти минут. Проводили диссоциирование клеток путем пипетирования через отполированные в пламени пастеровские пипетки в среде для диссоциации, состоящей из МЕМ/Нат'к Р12, 1:1, 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы).
Диссоциированные клетки осаждали при 200хд в течение пяти минут и ресуспендировали в ЕВ88, содержащем 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% ДНКазы. Клеточную суспензию центрифугировали через градиентный раствор, содержащий 10 мг/мл ингибитора овомукоида и 10 мг/мл овальбумина, при 200хд в течение шести минут для удаления клеточных обломков, а затем фильтровали через 88 мкм нейлоновое сито (ИкЬег 8с1епЬйс, РШкЬигдЬ, РА) для удаления каких-либо комков. Число клеток определяли гемоцитометром, и клетки высевали в покрытые поли-орнитином 100 мкг/мл (81дта, 8!. Ьошк, МО) и мышиным ламинином 1 мкг/мл (ОгЬсоВРР) 96-луночные планшеты при концентрации 10х103 клеток/лунка в полной среде. Полная среда состояла из минимальной эссенциальной среды (МЕМ) и среды Нат'к Р12, 1:1, пенициллина (100 ед./мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и 10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки (ОгЬсоВРР). Культуры держали при 37°С, 5% С02 и 100% влажности. Для предотвращения роста клеток, не являющихся нейронами, в среду включали 5-фтор-2'-дезоксиуридин (75 мкМ) и уридин (180 мкМ).
Обработка N0? и анти-Ы0?
Через два часа после посева клетки обрабатывали рекомбинантным человеческим /-N0? (Атдеп) или рекомбинантным крысиным /-N0? (Р & Ό 8ук!етк, МгппеароЬк, МХ) при концентрации 10 нг/мл (0,38 нМ). Положительные контроли, содержащие серийно разведенное антитело к N0? (Р & Ό 8ук!етк) наносили на каждый культуральный планшет. Тестируемые антитела добавляли в десятикратных концентрациях, используя 3,16-кратные серийные разведения. Все образцы разводили в полной среде перед добавлением к культурам. Время инкубации составляло 40 ч до измерения экспрессии УР1.
Измерение экспрессии УР1 в нейронах ЭРС
Культуры фиксировали 4% параформальдегидом в сбалансированном солевом растворе Хенкса в течение пятнадцати минут, блокировали 8ирегЬ1оск (Ргегсе, РоскГогД 1Ь) и делали проницаемыми 0,25% №ш<1е1 Р-40 (81дта) в забуференном Трис-НС1 (81дта) солевом растворе (ТСБ) в течение одного часа при комнатной температуре. Культуры промывали один раз ТСБ, содержащим 0,1% твин 20 (81дта), и инкубировали с 1д0 кролика против УР1 в течение полутора часов при комнатной температуре, а затем инкубировали со вторыми Еи-мечеными антителами против кролика (^а11ас 0у, Тигки, Нп1ап0) в течение одного часа при комнатной температуре. Отмывки ТСБ (3 х пять минут с медленным встряхиванием) применяли для каждой инкубации с антителом. К культурам добавляли усиливающий раствор (150 мкл/лунка, \Уа11ас 0у). Затем измеряли сигнал флуоресценции в фотометре с временным разрешением (^а11ас 0у). Экспрессию УР1 в образцах, обработанных модифицированными пептидами, определяли путем сравнения со стандартной кривой титрования N0? от 0 до 1000 нг/мл. Процент ингибирующего эффекта N0? (по сравнению с максимально возможным ингибированием) в отношении экспрессии УР1 в нейронах ЭР0 определяли по сравнению с контролями, которые не были обработаны N0?. Результаты представлены в табл. 2 и 5.
Клеточные линии обозначали номерами от 110 до 129. Антитела из клеточных линий № 119, 124 и 125 продемонстрировали крайне сильную нейтрализующую активность в отношении N0? (фиг. 1). Клеточная линия № 124 представляла собой родительскую клеточную линию, также называемую 4Ό4. Клеточные линии № 119 и 125 представляли собой субклоны родителя 4Ό4. Дополнительный образец из исходного флакона, содержащего гибридому № 124 (4Ό4), вырастили и обозначили как № 167 (4Ό4).
Антитела, образованные гибридомой № 167 (4Ό4), подвергали такому же анализу на нейтрализацию N0? на основе нейронов 0Р0, как и предыдущие образцы. Антитело № 167 (4Ό4) продемонстрировало сильную активность против N0? при 1С50 0,50 нМ (фиг. 2), которая совпадала с активностью образцов № 119, 124 и 125. Активности 4 образцов показаны в табл. 2.
- 38 030259
Таблица 2. Активность антитела к человеческому NΟР (ΙιΝΚΙΙ·') в клетках ПРО с использованием 0,38 нМ Η\(.Π;
Номер Юбо
119 Из № 124 1,2 нМ
124 Родитель 0,57 нМ
125 Из №124 0,3 нМ
167 Из того же образца, что и №124 0,50 нМ
Ν-Концевое секвенирование и масс-спектрометрия
Очищенные образцы антител к NΟР из гибридомы готовили для белкового секвенирования и анализа БС/МЗ (жидкостная хроматография -масс-спектрометрия). Антитела очищали от кондиционированной среды концентрированием среды, с использованием Ат1сои Сеи!пргер-30, до объема менее чем 15 мл. Навеску смолы гРгоА (РЬагтас1а) промывали 4 х ФСБ и готовили 50% суспензию в ФСБ после последней отмывки. Подходящее количество смолы гРгоА (примерно 5 мкг антитела/мкл смолы, но использовали не менее чем 50 мкл смолы) добавляли к образцу антитела и инкубировали в течение ночи при 4°С. Смесь антитело-смола центрифугировали и собирали несвязавшуюся фракцию. После добавления 0,5 мл ФСБ и переноса в 0,45 мкм пробирку Зрт-Х (СоЗ!аг) образец центрифугировали при 10000 об/мин в течение 3 мин. Затем смолу промывали по меньшей мере 3 раза 0,5 мл ФСБ, а затем добавляли 0,1 М глицин (рН 2,7) в количестве 1,5х объем смолы и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем снова центрифугировали в течение 3 минут при 10000 об/мин, собирая надосадочную жидкость. Эту стадию элюции повторяли еще два раза, а затем объединенную надосадочную жидкость нейтрализовали 1/25 объема 1,0 М Трис (рН 9,2). После конечной стадии фильтрования через новую пробирку Зрт-Х (0,2 мкм) антитело определяли количественно, используя стандартный анализ по Брэдфорду с использованием человеческого 1дО в качестве стандарта или альтернативно поглощение при 280 нм для больших образцов. Также проводили электрофорез в геле, используя 2 мкг каждого образца параллельно с 2 мкг человеческого 1дО1, к (Зщта). Для масс-спектрометрии четыре микрограмма образцов дегликозилировали, восстанавливали и загружали на ВЭЖХ (НР1090), соединенную в одновременном режиме с масс-спектрометром Рттдаи БСр. Легкую цепь отделяли от тяжелой цепи с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Легкие цепи и тяжелые цепи также собирали для анализа Ν-концевого секвенирования белка.
Секвенирование обеих Ν-концов легкой цепи и тяжелой цепи образца антитела к NΟР № 167 (404) выявило совпадение с обеими Ν-концевыми последовательностями образца антитела к NΟР № 119 (404). Кроме того, измеренная масса антител показала, что изолированные антитела из гибридом № 167 и № 119 являются одинаковыми. Измеренная развернутая масса (23096) легкой цепи анти-УОИ’ № 167 совпадала с измеренной массой (23096) легкой цепи анти-NΟР АЬ № 119.
Клонирование тяжелой и легкой цепей антитела к NΟР
Гибридому, экспрессирующую наиболее сильно связывающее NΟР моноклональное антитело, 4Ώ4.Ώ7, использовали в качестве источников для выделения суммарной РНК с использованием реагента ТШ/оО (1иу1!го§еи). Первую нить кДНК синтезировали, используя случайный праймер с адаптором элонгации (5'-ООС СОО АТА ООС СТС САN ΝΝΝ ΝΝ^3') (ЗЕР ГО NΟ: 33) и проводили препаративный анализ 5' РАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК), используя набор ОеиеРасег™ Циуйгодеи) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Для получения кДНК, кодирующей полноразмерную легкую цепь, прямой праймер представлял собой внутренний праймер ОеиеРасег™, а обратный праймер представлял собой 5'-ООО ОТС АОО СТО ОАА СТО АОО-3' (ЗЕР ГО NΟ: 34). Для получения кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, прямой праймер представлял собой внутренний праймер ОеиеРасег™, а обратный праймер представлял собой 5'-ТОА ООА СОС ТОА ССА САС О3' (ЗЕР ГО NΟ 35). Продукты РАСЕ клонировали в рСР4-ТОРО (1иу1!го§еи) и определяли последовательности. Согласованные последовательности использовали для дизайна праймеров для ПЦР амплификации полноразмерной цепи антитела.
Для получения кДНК, кодирующей легкую цепь каппа анти-NΟР 41)4.1)7, 5'ПЦР праймер кодировал аминоконец сигнальной последовательности, сайт фермента рестрикции ХЬа1 и оптимизированную последовательность Козака (5'-САО САО ААО СТТ СТА ОАС САС САТ ООА САТ ОАО ООТ ОСС СОС ТСА ОСТ ССТООО-3'; ЗЕО ГО NΟ: 36). 3' праймер кодировал карбоксиконец и кодон терминации, а также сайт рестрикции За11 (5-СТТ ОТС ОАС ТСА АСА СТС ТСС ССТ ОТТ ОАА ОСТС-3'; ЗЕО ГО NΟ: 37). Полученный в результате фрагмент, являющийся продуктом ПЦР, очищали, переваривали ХЬа1 и За11, а затем выделяли из геля и лигировали в 'жспрессионный вектор млекопитающих р[)З1Р'/20 (см. публикацию международной заявки № \О 90/14363, которая включена сюда путем ссылки для любой цели. рОЗРа20 получили путем изменения нуклеотида 2563 в рОЗРа19 с гуанозина на аденозин путем сайт-направленного мутагенеза).
Для получения кДНК, кодирующей тяжелую цепь антитела к NΟР 41)4.1)7 5'ПЦР праймер кодировали аминоконец сигнальной последовательности, сайт фермента рестрикции ХЬа1 и оптимизированную последовательность Козака (5'-САО САО ААО СТТ СТА ОАС САС САТ ООА ОТТ ООО ОСТ ОТО
- 39 030259
СТО ООТ ТТТ ССТ ТОТТ-3'; 80) ГО N0: 38). Праймер 3' кодировал карбоксиконец и кодон терминации, а также сайт рестрикции 8а11 (5'-ОСА ТОТ СОА СТС АТТ ТАС ССО ОАО АСА ООО АОАО-3'; 8Е0 ГО N0: 39). Полученный в результате продукт очищали, переваривали ХЬа1 и 8а11, выделяли из геля и лигировали в вектор ρΌ8Κα20.
Вычисленная масса (23099), как определено путем трансляции нуклеотидной последовательности в предсказанные аминокислоты и сложения вместе молекулярных масс аминокислот последовательности ДНК легкой цепи антиШОР клона АЬ 4Ό4 совпала с измеренной массой, как определено с помощью масс-спектрометрии. Измеренная развернутая масса (49479) тяжелой цепи антиШОР АЬ № 167 совпала с измеренной массой (49484) тяжелой цепи антиШОР АЬ #119, а также совпала с теоретической массой (49484) последовательности ДНК тяжелой цепи антиШОР клона АЬ 4Ό4 (табл. 3) с отклонением на приборы.
Данные Ν-концевой последовательности белка и ЬС/М8 подтвердили, что гибридома № 119 экспрессирует такое же антитело, что и гибридома № 167. Кроме того, вычисленная масса антител на основании последовательности дополнительно подтвердила это наблюдение.
Таблица 3. Суммирование данных масс-спектрометрии
АЬ к ΝΟΡ Измеренная масса АЬ№167 Измеренная масса АЬ №119 Теоретическая масса, выведенная из последовательности ДНК АЬ 404
Легкая цепь 23096 23096 23099
Тяжелая цепь 49479 49484 49484
Пример 4
Экспрессия антител к NОР в клетках яичника китайского хомячка (СНО)
Стабильная экспрессия 4Ό4 антиШОР тАЬ была достигнута путем котрансфекции плазмид 4Ό4тяжелая цепь/рЭ8Ка19 1дО2 или 4Э4-тяжелая цепь/рЭ8Ка19 1дО1 и NОР-каппа/р^8Кα19 в клетки яичника китайского хомячка (СНО), дефицитные по дигидрофолатредуктазе (ЭНРК-), адаптированные к отсутствию сыворотки, используя кальцийфосфатный способ.
Трансфецированные клетки отбирали на среде, содержащей диализованную сыворотку, но не содержащей гипоксантин-тимидин, для обеспечения роста клеток, экспрессирующих фермент ЭНРК. Скрининг трансфецированных клонов проводили, используя анализы, такие как ЕЫ8А, с целью обнаружения экспрессии 4Ό4 антиШОР тАЬ в кондиционированной среде. Клоны с самой высокой экспрессией подвергали воздействию возрастающих концентраций метотрексата (МТХ) для амплификации ЭНРК. Амплифицированные МТХ клоны подвергали скринингу, используя анализы, такие как ЕЫ8А, с целью определения самой высокой экспрессии 4Ό4 антиШОР тАЬ в кондиционированной среде. Клоны с самой высокой экспрессией подвергали субклонированию с получением однородной популяции и созданием клеточных банков.
Рекомбинантные антитела к NОР по изобретению можно получить в клетках яичника китайского хомячка, дефицитных по ЭНРК, используя такой же протокол, как описано выше для моноклонального антитела к NОР. Последовательности ДНК, кодирующие полноразмерную тяжелую цепь или легкую цепь каждого антитела к NОР по изобретению, клонируют в экспрессионные векторы. Клетки СН0б котрансфецируют экспрессионным вектором, способным к экспрессии полноразмерной тяжелой цепи, и экспрессионным вектором, способным к экспрессии полноразмерной легкой цепи соответствующего антитела к NОР. Например, для получения антитела к NОР клетки котрансфецируют вектором, способным к экспрессии полноразмерной тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 40, и вектором, способным к экспрессии полноразмерной легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 44. В табл. 4 суммированы полноразмерные тяжелые и полноразмерные легкие цепи для антител 4Ό4, имеющие различные константные области тяжелой цепи 1дО.
- 40 030259
Таблица 4
Антитело Вариабельная область тяжелой цепи + константная область тяжелой цепи Полноразмерная тяжелая цепь
4ϋ4 (1дС2) δΕΟ ГО ΝΟ: Ю + δΕΟ ГО ΝΟ: 4 δΕΟ ГО ΝΟ: 40
404 (1дО1) δΕΟ ГО ΝΟ: Ю + δΕΟ ГО ΝΟ: 2 δΕΟ ГО ΝΟ: 41
Антитело Вариабельная область тяжелой цепи + константная область тяжелой цепи Полноразмерная тяжелая цепь
404 (1дО4) δΕΟ ГО ΝΟ: 10 +δΕΟ ГО ΝΟ: 6 δΕΟ ГО ΝΟ: 42
404 (1дОЗ) δΕΟ ГО ΝΟ: 10 +δΕΟ ГО ΝΟ: 26 δΕΟ ГО ΝΟ: 43
Антитело Вариабельная область легкой цепи + константная область легкой цепи Полноразмерная легкая цепь
4ϋ4 δΕΟ ГО ΝΟ: 12 + δΕΟ ГО ΝΟ: 8 δΕΟ ГО ΝΟ: 44
Пример 5
Характеристика активности антител к ΝΟΡ 4Ό4
Транзитно экспрессируемые антитела к ΝΟΡ 4Ό4, полученные в клетках, выращенных в условиях спин-культуры (с постоянным перемешиванием) (δ) или роллерной культуры (К) тестировали на подтверждение их способности к нейтрализации ΝΟΡ в количественном определении биологической активности нейтрализации ΝΟΡ на основании нейронов ΌΚΟ, проведенном, как описано выше (Пример 3).
Антитела к ΝΟΡ транзитно экспрессировали в суспензии адаптированных к отсутствию сыворотки клеток 293Т. Трансфекции проводили либо в 500 мл, либо в 1 л культуры. Кратко, клеточный инокулят (5,0 х 105 клеток/мл х объем культуры) центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин при 4°С для удаления кондиционированной среды. Клетки ресуспендировали в свободной от сыворотки ΌΜΕΜ (модифицированной Дельбрюкком среде Игла) и снова центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 минут при 4°С. После отсасывания промывочного раствора клетки ресуспендировали в ростовой среде [ΌΜΕΜ/Ρ12 (3:1) + 1х добавка инсулин-трансферрин-селен + 1х Пенициллин, Стрептомицин, Глутамин + 2 мМ Ь-глутамин + 20 мМ ГЭПЭС + 0,01% Р1игошс Ρ68] в 1 л или 3 л спин-культуры. Спин-культуру держали на платформе магнитной мешалки при 125 об/мин, которую помещали в увлажненный инкубатор, поддерживаемый при 37°С и 5% СО2. Получали комплекс плазмидной ДНК с реагентом трансфекции в конической пробирке на 50 мл. Комплекс ДНК-реагент трансфекции получали в 5% конечного объема культуры в свободной от сыворотки ΌΜΕΜ. Сначала 1 мкг плазмидной ДНК/мл культуры добавляли в свободную от сыворотки ΌΜΕΜ, после чего добавляли 1 мкл Х-ТгетеОепе КО-1539/мл культуры. Комплексы инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 30 мин, а затем добавляли к клеткам в спин-культуре. Трансфекцию/экспрессию проводили в течение 7 суток, после чего кондиционированную среду собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 мин при 4°С.
Для транзитных трансфекций в роллерной культуре авторы изобретения использовали прикрепленные клетки 293Т, выращенные и поддерживаемые в ΌΜΕΜ с добавками 5% ΡΒδ + 1х неэссенциальные аминокислоты + 1х Пенициллин, Стрептомицин, Глутамин + 1х пируват натрия. Примерно 4-5х107 клеток 293Т высевали в 850 см2 роллерные сосуды на ночь. Затем ранее засеянные клетки трансфецировали на следующие сутки, используя реагент трансфекции РиОепеб. Смесь ДНК-реагент трансфекции готовили примерно в 6,75 мл свободной от сыворотки ΌΜΕΜ. Сначала добавляли 675 мкл реагента трансфекции РиОепеб с последующим добавлением 112,5 мкг плазмидной ДНК. Этот комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем всю смесь добавляли в роллерный сосуд. Этот роллерный сосуд газировали газовой смесью 5% СО2, плотно закрывали крышкой и помещали в инкубатор на 37°С во вращающийся штатив, вращаемый при 0,35 об/мин, трансфекцию проводили в течение 24 ч, после чего среду заменяли на 100 мл ΌΜΕΜ + 1х добавка инсулин-трансферрин-селен + 1х Пенициллин, Стрептомицин, Глутамин + 1х неэссенциальные аминокислоты + 1х пируват натрия. Обычно получали две 48-часовые культуры по 100 мл для каждой роллерной культуры. Собранную свободную от сыворотки кондиционированную среду объединяли вместе и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 мин при 4°С.
Как 4Ό4.Ι§Ο1, так и 4Ό4.Ι§Ο2 показали сильную активность со значениями 1С50 от примерно 0,14 нМ до примерно 0,2 нМ против человеческого ΝΟΡ (фиг. 2). Результаты этого анализа на активность
- 41 030259 суммировали в табл. 5. Антитела показали небольшую активность против крысиного NОЕ (фиг. 3). Эти результаты напоминают активность антител, тестируемых непосредственно из гибридом, описанных выше.
__Таблица 5
АЬ 1С50 ΚΝΘΡ (нМ) 1С50 γΝΘΡ (нМ)
404.1д61.Р 0,1488 > 34 нМ
4О4.1дС1.3 0,1587 > 45 нМ
4О4.1дС2.К 0,2047 > 59 нМ
404.1д62.3 0,2063 >37 нМ
ШСЕ = человеческий ЫСЕ, г\(.тЕ = крысиный ЫСЕ, К = роллерная культура, 8 = спин-культура (с постоянным перемешиванием)
Пример 6
Продуцирование антитела к NОЕ
Антитело к NОЕ продуцируют, осуществляя экспрессию в клональной линии клеток СНО. Для каждого цикла продуцирования клетки из одного флакона оттаивают в свободной от сыворотки среде для клеточных культур. Клетки сначала выращивают в Т-образной колбе, затем в спин-культуре, а затем выращивают в реакторах из нержавеющей стали, увеличивая масштаб вплоть до 2000 л биореактора. Продуцирование осуществляют в 2000 л биореакторе, используя подпитываемую культуру, в которую добавляют концентрированную среду, содержащую питательные компоненты, для поддержания роста клеток и жизнеспособности культуры. Продуцирование продолжают в течение примерно двух недель, в течение которых антитело к NОЕ конститутивно продуцируется клетками и секретируется в клеточную культуральную среду.
В реакторе для продуцирования контролируют предопределенный рН, температуру и уровень растворенного кислорода: рН контролируют газом диоксидом углерода и добавлением карбоната натрия; растворенный кислород контролируют газовыми потоками воздуха, азота и кислорода.
В конце продуцирования клеточный бульон загружают в центрифугу с комплектом дисков, и надосадочную жидкость культуры отделяют от клеток. Концентрат дополнительно очищают через фильтр с толстым слоем, а затем через 0,2-мкм фильтр. Затем очищенную кондиционированную среду концентрируют путем ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Кондиционированную среду концентрируют в 15-30 раз. Затем полученную в результате концентрированную кондиционированную среду либо обрабатывают очисткой, либо замораживают для последующей очистки.
Пример 7
Перекрестная реактивность с другими нейротрофинами
Антитела 404 тестировали на их перекрестную реактивность против человеческого NТ3 или человеческого ВОАН в различных анализах количественного определения биологической активности, включая анализ на выживание нейронов ОКО для человеческого NТ3 и анализ захвата ОА в культивируемых нейронах ΏΑ для человеческого ВОАН.
Обработка культур ОКО NТ3, антителами к NТ3 и NОЕ
Через два часа после посева клетки ОКО (методика выделения описана выше в Примере 3) обрабатывали рекомбинантным человеческим №Г-3 (ЬNТ-3) 100 нг/мл (3,8 нМ). Серийно разведенное антитело г НАТ3 (К & О) использовали в качестве положительного контроля. Неизвестные образцы (образцы антител к NОЕ) добавляли в различных концентрациях на 10 точек 3,16-кратных серийных разведений. Все образцы разводили в полной среде перед добавлением в культуры.
Измерение экспрессии МАР2 в нейронах ОКО
Культуры фиксировали 4% параформальдегидом в сбалансированном солевом растворе Хенкса в течение 15 мин, блокировали ЗирегЫоск (РЁегсе) в течение 1 ч и делали проницаемыми 0,25% Аопккй Р40 (8шта) в забуференном Трис-НС1 (8шта) солевом растворе (ТСБ) в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Культуры промывали один раз ТСБ, содержащим 0,1% твин 20 (ЗЁдша), и инкубировали с мышиным анти-МАР2 1дО (СЬешЁсоп, Тетеси1а, СА) в течение 1,5 ч при комнатной температуре с последующей инкубации с Еи-меченым вторым антителом против мыши (^а11ас 0у, Тигки, Ет1ап1) в течение 1 ч при комнатной температуре. Отмывки ТСБ (3x5 мин при мягком встряхивании) применяли после каждой инкубации с антителом. К культурам добавляли усиливающий раствор (150 мл/лунка, \Аа11ас 0у), а затем измеряли сигнал флуоресценции в фотометре с временным разрешением (^а11ас 0у).
Культура эмбрионального среднего мозгового пузыря
Использовали эмбрионы крыс 8ргацие-0а^1еу (1аск§оп БаЬ§) в возрасте 19 суток (Е19). Ткань вентрального среднего мозга, обогащенную дофаминергическими нейронами, извлекали и переносили в холодный забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко (ЭРВ8), рН 7,4, без Са++ и Мд (ОЁЬсо). Фрагменты ткани диссоциировали до одноклеточной суспензии, используя папаиновую систему диссоциации (ААогЙнпЩоп ВюсЬет1са1 Согр., ЕгееЬоМ, N1). Кратко, фрагменты ткани инкубировали в переваривающем растворе, содержащем 20 ед./мл папаина в сбалансированном солевом растворе Эрла (ЕВ88) при 37°С в течение 50 мин. Клетки диссоциировали путем пипетирования через отполированные в пламени пастеровские пипетки в среде для диссоциации, состоящей из МЕМ/Нат'§ Е12, 1:1, 1 мг/мл ингиби- 42 030259 тора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы). Диссоциированные клетки осаждали при 200хд в течение 5 мин и ресуспендировали в ЕВЗЗ, содержащем 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% ДНКазы. Клеточную суспензию центрифугировали через градиентный раствор, содержащий 10 мг/мл ингибитора овомукоида и 10 мг/мл овальбумина, при 200хд в течение 6 мин для удаления клеточных обломков, а затем фильтровали через 25 мкг нейлоновое сито №!ех (Те!ко, 1пс.) для удаления комков. Диссоциированные клетки высевали в планшеты для тканевых культур при густоте 100000/см2. Планшеты были предварительно покрыты поли-орнитином 100 мкг/мл (З1дта) и мышиным ламинином 1 мкг/мл (ОхЬсоВРЬ), как описано ранее (Ьошк 1С е! а1., I. РИагтасо1. Ехр. ТИег. 1992; 262: 1274-1283). Культуральная среда состояла из минимальной эссенциальной среды (МЕМ)/ Нат'к Р12, 1:1, 12% лошадиной сыворотки (О£Ьсо), 100 мкг/мл трансферрина и 2,5 мкг/мл инсулина (З1дта). Культуры держали при 37°С, 5% С02 и 100% влажности в течение 6 суток.
Обработка культур среднего мозгового пузыря ВОА и антителами к ВОА' или к N0?
ВБА в концентрации 10 нг/мл добавляли в клетки через 2 ч после посева с последующим добавлением серийных концентраций образцов анти-Ж'тР АЬ. Антитело к ВБА (полученное Атдеп) использовали в качестве положительного контроля.
Захват БА в нейронах среднего мозгового пузыря
Анализ на захват дофамина проводили, как описано ранее (Рпебтап, Р. Апб МуШтеол, С., Аигокаепсе Ьейегк 1987; 79: 65-72). На шестые сутки культуры промывали один раз предварительно подогретым фосфатным буфером Кребса-Рингера (рН 7,4), содержащим 5,6 мМ глюкозу, 1,3 мМ ЭДТА и 0,5 мМ паргилин, ингибитор моноаминоксидазы. Культуры инкубировали в буфере захвата, содержащем 50 нМ [3Н] БА (АХ), в течение 60 мин при 37°С. Захват останавливали путем удаления буфера захвата, и культуры промывали три раза фосфатным буфером Кребса-Рингера. Клетки лизировали для высвобождения [3Н] БА путем добавления жидкой сцинтилляционной смеси, 0рйсрИаке Злрегт1х (^а11ас), непосредственно в культуры. Затем радиоактивность клеточных лизатов считали в счетчике жидкостной сцинтилляции микробета-плюс (^а11ас, 1пс.). Захват БА низкого аффинитета оценивали путем добавления 0,5 мМ 0ВР12909, специфичного ингибитора сайтов захвата БА высокого аффинитета (Не1ккПа РЕ апб Маζ^ηο Ь, Еигореап 1оита1 о£ РИагтасо1оду 1984; 103: 241-8), в буфер захвата, и вычитали из количества суммарного захвата для получения значения захвата БА высокого аффинитета.
Таблица 6
Антитело 1С50 ΜΝΤ-3 (нМ) 1С50 ΜΒϋΝΡ (нМ)
4ϋ4 (1д62) > 13,75 > 13,75
Пример 8
Идентификация эпитопа для антител к N0'
Картирование эпитопа путем ограниченного протеолиза
Пять микрограммов (мкг) N0' инкубировали с 4Ό4 (11 мкг) в течение 30 мин при 4°С в 0,1 М Трис буфере, рН 7,5. Затем комплекс переваривали протеазой (субтилизином) 1 мкг при 37°С в течение 1 и 2 ч. Карты пептидов по ВЭЖХ сравнивали друг с другом, чтобы найти пептиды, которые были защищены антителами 4Ό4. Ограниченный протеолиз N0' показал, что первоначально из N0' высвобождалось несколько основных пептидов. Особый интерес представляют пептиды З18.3, З18.5 и З34.4, полученные и защищенные антителом от протеолиза. Другие пики не были значительно сформированы или защищены. Защищенные пептиды из двух экспериментов (1-часовое и 2-часовое переваривание) представлены в табл. 7.
Таблица 7
% защиты
1-часовое переваривание 2-часовое переваривание
816.1 ОАА (96-98) С-концевой - 57
818.3 РРЕТК (53-57) (ЗЕО Ю N0:45) Область петли 40 45
818.5 888ΗΡΙΡΗΚ (19) (ЗЕО Ю N0:46) (Η\Λ/Ν3Υ)* (8ЕО Ю N0:47) Ν-концевой 40 50
834.4 ΝδνΕΚΟΥΡΡΕΤΚ (46-57) (ЗЕО Ю N0:48) Область петли 69 38
Процент защиты вычисляли на основании высоты пептидного пика З18.5, содержащего два пептида, но только один пептид (ЗЗЗНР1РНР; ЗЕО ГО N0: 46) был защищен антителом 4Ό4, поскольку пик другого пептида (ΗШNЗΥ; ЗЕО ГО N0: 47) был не изменен добавлением антител 4Ό4, как определено на основании поглощения при 280 нм. Пептид З18.3 представлял собой С-концевой участок З34.4, оба из одной и той же области петли. Жконцевая область и центральная область петли также являются возможными эпитопами.
- 43 030259
Разделение переваренных пептидов на Мгсгосоп
Материал, переваренный субтилизином (3 мкг каждого), инкубировали с активными антителами 4Ό4 и с неактивным моноклональным антителом (#162) (8 мкг) в течение 30 мин при 4°С в 0,1 М Трис буфере, рН 7,5. Связанные/несвязанные пептиды разделяли с помощью Мюгосоп 10 (Мййроге Согр., ВебГогб, Макк), и обе фракции (связанную и несвязанную) анализировали с помощью ВЭЖХ, чтобы найти пептиды, связанные с антителами. Выделили два истощенных пика, идентифицированных путем сравнения ВЭЖХ несвязанных фракций после обработки антителами 4Ό4 и #162 и разделения
Мюгосоп, указывающие на пептиды, связанные с антителами. Связанные 4Ό4 пептиды представляли собой (4.4) -___8ККМ/КК (113-119) (8ΕΩ Ю ΝΟ: 49), С-концевая область и 32 (28.3) ΕνΜνΐ_ (35-39) (5ΕΩ Ю ΝΟ: 50), область петли.
Образец NΟΡ альтернативно переваривали Ьук-С (К) в течение 24 ч. Цистеиновые остатки восстанавливали и подвергали карбоксиметилированию без денатурирующего агента. Образец инкубировали с моноклональными антителами 4Ό4 и АМО162, а затем разделяли Мюгосоп 100. Связанные и несвязанные фракции анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Только два пептида были идентифицированы как связывающие антитело К-пептиды, как показано ниже. Вычисленная масса для этих пептидов, определенная путем анализа последовательности, и масс-спектрометрия пептидов совпадали. Пептиды, как показано ниже, картировались в ^концевой и С-концевой области.
К1 (37.6) —553ΗΡ1ΕΗΚ0ΕΕ3ν005ν3νν\/ν00Κ (8ΕΩ Ю ΝΟ: 51)
Вычисленная масса = 2821; Наблюдаемая масса = 2828,2; Ν-концевой К2 (39.5) — ΩΑΑννΚΡΙΡΙ0ΤΑ0ν0νί.3ΚΚ (8ΕΩ Ю ΝΟ; 52)
Вычисленная масса = 2452; Наблюдаемая масса = 2459,5; С-концевой
Предшествующие эксперименты по картированию эпитопов показали, что по меньшей мере три области являются возможными эпитопами для антител 4Ό4, включая ^концевую (1-9), внутреннюю (4657) и С-концевую (96-98) области. Кроме того, переваривание ЛкрN выявило, что пептидный фрагмент, состоящий из —88НР1РНКОЕР8УС— (8ЕР ГО N0: 53), был защищен антителом 4Ό4, тогда как переваривание трипсином показало, что пептидный фрагмент, состоящий из —88НР1РНК— (8ЕР ГО N0: 54), не был защищен антителом 4Ό4. Таким образом, в Оконце последовательность ОЕР8УС (8ЕР ГО N0: 55) является наиболее важной для связывания с антителами 4Ό4.
С целью более точного определения эпитопа для антитела к NΟΡ 4Ό4.Ι§Ο1, суммарно синтетическим путем получили 23 пептида, используя стандартные методики, на основании полноразмерной последовательности человеческого зрелого NΟΡ (йNΟΡ) (табл. 8). Длина этих пептидов составляла 15 аминокислот, перекрывающихся на 10 аминокислот, и с цистеиновыми хвостами на С-концах, чтобы дать возможность конъюгации с матриксом. Для эксперимента по картированию использовали человеческое анти-йNΟΡ АЪ 4Ό4.Ι§Ο1, описанное выше.
Таблица 8
Пептид # Последовательность 5ΕΟ Ю ΝΟ
33582-27-01 δδδΗΡΙΓΗΗΘΕΡδνΟ (1-15) 56
33582-27-02 ΙΡΗΗΟΕΡδνΑΟδνδνΟ (6-20) 57
33582-27-03 ΕΡδνΑϋδνδννννΟΟΚΟ (11-25) 58
33582-27-04 ϋδνδννννΘΟΚΤΤΑΤΟΟ (16-30) 59
33582-27-05 νννΟϋΚΤΤΑΤΟΙΚΟΚΕΟ (21-35) 60
33582-27-06 ΤΤΑΤ0ΙΚ6ΚΕνΜνΐ_6δ (26-40) 61
33582-27-07 ΙΚΘΚΕνΜ\/Ι_ΟΕνΝΙΝ (31-45) 62
33582-27-08 νΜνΐ_ΟΕ\/ΝΙΝΝδνΡΚΟ (36-50) 63
33582-27-09 ΕνΝΙΝΝδνΡΚΩΥΡΡΕΟ (41-55) 64
33582-27-10 ΝδνΡΚΩΥΡΡΕΤΚΑΒϋΟ (46-60) 65
33582-27-11 ΩΥΡΡΕΤΚΑΚΟΡΝΡνϋΟ (51-65) 66
33582-27-12 ΤΚΑΚΟΡΝΡνϋδΟΑΡϋΟ (56-70) 67
33582-27-13 ΡΝΡνΟδΘΑΡϋΙϋδΚΗΟ (61-75) 68
33582-27-14 δΟΑΡϋΙϋδΚΗννΝδΥΟ (66-80) 69
33582-27-15 ΠΊδΚΗ\Λ/ΝδΥΑΤΤΤΗΤΟ (71-85) 70
33582-27-16 ννΝδΥΑΤΤΤΗΤΡνΚΑΙ-С (76-90) 71
33582-27-17 ТТТНТРХ/КАЬТМОСКС (81-95) 72
33582-27-18 ΡνΚΑΙΤΜϋΟΚΩΑΑννΡΟ (86-100) 73
33582-27-19 ТМОСКОАА\Л/РР1РЮС (91-105) 74
33582-27-20 ΩΑΑννΡΡΙΡΙΟΤΑΑνΟ (96-110) 75
33582-27-21 Р1РЮТАА\/А\/1_6РКС (101-115) 76
33582-27-22 ΤΑΑνΑνί,δΡΚΑνΚΡΑΟ (106-120) 77
33582-27-23 ΟΑΑνΑνίδΡΚΑνΡΡΑ (107-120) 78
- 44 030259
Пептидные фрагменты человеческого ΝΘΡ разводили в ФСБ с 5% ДМСО, 1 мМ ЭДТА, рН 6,23. Конечная концентрация пептида была нормализована до одинаковой молярной концентрации при 55 мкМ (примерно 100 мкг/мл). Пептиды инкубировали в активированных КеасБ-Втб Ма1е1т1бе 96луночных микротитровальных планшетах (Р1егсе, № по каталогу 15150), 100 мкл/лунка, при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при 4°С в течение ночи при качании. Человеческий ΝΘΡ (100 мкг/мл) использовали в качестве положительного контроля. Планшеты отмывали отмывочным буфером (КРБ) и блокировали 0,2% обезжиренного сухого молока (в буфере ФСБ-ЭДТА, рН 6,23) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дополнительно блокировали 5% БСА в течение 1 ч. Затем планшеты инкубировали с человеческим антителом анти-ΝΘΡ при различных концентрациях (0, 3, 10, 30 мкг/мл), а затем с антителом коза против ЬРсАЬ-НКР (КРБ) в течение 2 ч. Сигнал проявляли субстратом ТМВ и считывали при 450 нм после добавления останавливающего раствора (КРБ).
По всем 23 пептидам человеческого ΝΘΡ наблюдали по меньшей мере 4 главных пика, указывающих на связывание 4Ώ4. Эти пики соответствовали следующим пептидам: пептид #1 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 56), 888НР1РНКОЕР8УС (1-15); пептид #10 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 65), N8VΡΚ^ΥΡΡЕТΚАК^ (46-60); пептиды #16-17 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 71-8ЕЭ ГО ΝΟ: 72), ΑΧ8ΥΛΪΊ Π ΓΙΤνΚΛΙ.--- (76-95) и пептиды #18-21 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 738ЕО ГО ΝΟ: 76), ТТТНТ---Б8ККС (100-115).
Четыре пика связывания 4Г)4 картировались в Ν-концевом, С-концевом, внутренних доменах, а также в петлях Б2 и Б4 в ΝΘΡ, как описано в Аещтапп е! а1. (1999, ЫаШге 401: 184-8). Эти результаты суммированы в табл. 9.
Таблица 9
Эпитопы ΚΝΟΕ Ν-конец Ь2 Внутренний Ι.4 Внутренний С-конец
пептид # пептид # 1 (δΕΟ ГО ΝΟ: 56), δδδΗΡΙ-, 1-15 пептид #10 (δΕΟ ГО ΝΟ: 65). ΝδνΕΚΟ—. 46-60 пептид #16 (δΕΟ ГО ΝΟ: 71)· ννΝδΥΑ—. 76-90 пептид #17 (δΕΟ ГО ΝΟ: 72). ΤΜΌΘΚΟ- 81-95 пептид #19 (δΕΟ ГО ΝΟ; 74). ΤΜϋΟΚ— 91105 пептиды # 20-21 (6ЕО ГО ΝΟ; 75 δΕΟ ГО N0:76).
Сигнал связывания АЬ +++ + ++ ++ +++ ++
Аюктапп е! а1. раскрыли кристаллическую структуру ΗΝΘΡ, связанного с рецептором !гкА, показав, что Ν-конец (остатки 2-9) важен для связывания с рецептором (Аюктапп е! а1., 1999, №1иге 401: 184-8). Остатки данного сегмента в ΝΘΡ также важны для специфичности к !гкА по сравнению с рецепторами !гкВ или !гкС. Антитело 4Г)4 является селективным для человеческого ΝΘΡ по сравнению с мышиным/крысиным ΝΘΡ, а также с ΒΏΝΡ и ΝΨ-3, скорее всего, благодаря Ν-концевым различиям между человеческим ΝΘΡ и другими нейротрофинами.
Антитело 4Г)4 связывается с пептидом № 10 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 65) ί^νίΆ---, 46-60) и с пептидом № 17 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 72) (ТТТНТРУКАБТМПОКС, 81-95), соответствующим петлям Б2 и Б4 соответственно, которые представляют собой две отдельные области с различиями последовательностей выше среднего среди нейротрофинов. Эксперименты по обмену между ΝΘΡ и ΒΏΝΡ этих семи областей показали, что Б2 и Б4 важны для биологической активности ΝΘΡ. Кроме того, замена пяти остатков Ν'1'3 в петлях Б2 и Б4 остатками ΝΘΡ придавала ΝΘΡ-подобную активность при сохранении активности Ν'1'3. Таким образом, Б2 и Б4 являются вероятными областями, где антитело 4Г)4 селективно связывается с ΝΘΡ вероятнее, чем с ΒΏΝΡ или ΝΨ-3.
Антитело 4Г)4 также связывается с пептидом № 16 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 71) (АN8ΥАТТТΗТΡVΚА^, 7690), совпадающим с внутренним доменом кристаллической структуры ΝΘΡ. Эта область является на 100% гомологичной между человеческим ΝΘΡ и мышиным ΝΘΡ, но отличной от других нейротрофинов. 4Г)4 показал значительно более слабую активность против крысиного/мышиного ΝΘΡ по сравнению с его активностью против человеческого ΝΘΡ. Следовательно, связывание с этим участком ΝΘΡ вероятнее всего не является критическим для видоспецифичности, но является важным для селективности среди нейротрофинов.
Антитело 4Г)4 также связывается с С-концевой областью ΝΘΡ (пептиды № 19-21 (8ЕЭ ГО ΝΟ:748НС) ΙΌ ΝΟ: 76) ТМ^ΘΚ---^8КΚС, 91-115), которая является одной из областей человеческого ΝΘΡ, которая отличает ΝΘΡ от других нейротрофинов (ΒΏΝΡ и ΝΨ3). Связывание с этой областью помогает объяснить, почему 4Г)4 не является активными против других нейротрофинов. Кроме того, существует отличие по единственной аминокислоте между человеческим ΝΘΡ и мышиным ΝΘΡ в С-конце, что позволяет предположить, что эта единственная аминокислота может быть одной из причин селективности 4Г)4 к человеческому ΝΘΡ по сравнению с крысиным/мышиным ΝΘΡ, подобно Ν-концу, где наблюдаются видовые различия.
Наконец, 4Г)4 также взаимодействует с внутренним доменом, описанным пептидом № 10 (8ЕЭ ГО ΝΟ: 65) (—КАКБС, 50-60) человеческого ΝΘΡ, который является важной областью для связывания ΝΘΡ преимущественно с !гкА вероятнее, чем с !гкВ или !гкС, что дополнительно объясняет его селективную активность по нейтрализации против человеческого ΝΘΡ.
- 45 030259
Пример 9
Измерение аффинитета моноклональных антител с помощью КшЕхА
Связывание АЬ 4Ό4 (38859-80) с ΙκιΝΟΙ·' (29714-91) тестировали на КшЕхА. Кратко, КеасИ-Ое1 6х (Ргегсе) предварительно покрывали ΙκιΝΟΙ·' и блокировали БСА. 10 и 30 пМ образцов АЬ 4Ό4 инкубировали с различной концентрацией ΙιιιΝίιΙ·' (Атдеп) при комнатной температуре в течение 8 ч, после чего пропускали через покрытые ΙιιιΝίιΙ·' шарики. Количество антитела, связавшегося с шариками, количественно определяли с помощью меченого флуоресцентной меткой (Су5) антитела козы против человеческого 1§О (1аск§оп 1ттипе Кезеагсй). Сигнал связывания был пропорционален концентрации свободного антитела при равновесии. Равновесную константу диссоциации (Ко) получили на основании нелинейной регрессии кривых конкуренции, используя модель двойных кривых одноточечного однородного связывания (программное обеспечение КшЕх). Ко составляла примерно 4 пМ для связывания АЬ 4Ό4 с Η4ΝΘΡ.
Пример 10
Идентификация дополнительных антител к ΝΘΡ
Дополнительные антитела к ΝΘΡ (обозначенные 14Ό10, 6Θ9, 7Н2, 14Ρ11 и 4Θ6), полученные и идентифицированные, как описано в Примерах 2 и 3 выше, отобрали для дальнейшего исследования. Кратко, кондиционированную среду тестировали на биологическую активность. Антитела из среды очищали и секвенировали. Предсказанную массу сравнивали с данными масс-спектрометрии антител из кондиционированной среды. Эти антитела клонировали. Два из этих клонов экспрессировали в клетках СНО и тестировали на активность, как описано выше. Результаты показаны в табл. 10.
_ Таблица 10
клон 1С50 ΚΝΘΡ (нМ) 1С50 ΓΝΘΡ (нМ) Примечания Молекуля рный иппи 1С50 ΚΝΘΡ 1С5о γΝΘΡ
7Н2 3.294 1.748 Клониоован 7Н2-гРс 0.963 0.792
6Н9 3.172 1.699 Клониоован 6Н9-гРс 1зяа 0.653
14010 0.3918 >13 Клониоован
14011 0.2803 >20 Клониоован
4С6 0,414 >10 Клонирован
Затем последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей этих антител сравнивали с последовательностью антитела 4Ό4, а также каждую друг с другом (фиг. 5 и 6). Проценты гомологий вариабельных областей тяжелой цепи, как идентифицировано на основании этих сравнений, показаны в табл. 11. Проценты гомологии вариабельных областей легкой цепи показаны в табл. 12. Кроме того, проценты гомологий СОН областей различных антител показаны на фиг. 5-10.
Таблица 11
404 νΗ 14ϋ10νΗ 6Η9 νΗ 7Η2 νΗ 14011 νΗ 4Θ6 νΗ
404 УН 100% 70,9% 70,1% 75,6% 47,2.% 73,4%
14ϋ 10νΗ 100% 95,3% 85% 54,3% 81,1%
6Н9 УН 100% 86,6% 54,3% 81,1%
7Н2 УН 100% 51,2% 79,8%
14011 νΗ 100% 56,8%
4(36 νΗ 100%
Таблица 12
ν4ϋ4 νκ 1401 1 ЬС 466а 1_С 4<36Ь 1_С 4(36с Ю 14010 Ю 6Η9Ι- С 4Θ6ά 1_С 7Н21_С 466е
ν4ϋ 4УК 100% 89% 91% 72% 74% 69% 71% 71% 70% 73%
1401 1 Ю 100% 94% 68% 71% 67% 68% 68% 68% 70%
4(36а 1.С 100% 69% 74% 68% 70% 70% 69% 71%
4(36Ь 1 С 100% 87% 83% 86% 86% 86% 96%
4С6с ЬС 100 % 91% 94% 94% 94% 91%
1401 01 С 100% 91% 94% 94% 86%
6Н9 I С, 100% 99% 98% 89%
4060 I С 100% 99% 89%
7Н2 I С 100%
4С6е 100%
- 46 030259
Должно быть понятно, что в приведенном выше описании сделан акцент на некоторые конкретные воплощения изобретения и что все эквивалентные модификации или альтернативы входят в объем изобретения прилагаемой формуле изобретения.
Перечень последовательностей <110> УАЙЛД Кеннет Д.
ТРИНОР Джеймс Дж. С.
ХУАН Хайчунь ИНОУ Хизер
ЧЖАН Те Дж.
МАРТИН Франк <120> Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ΝΟΡ) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ΝΟΓ <130> 02-1240 <150> из 60/487,431 <151> 2003-07-15 <160> 138 <170> РаРепР1п чегзЬоп 3.0 <210> 1 <211> 990 <212> ДНК <213> Ношо зартепз <400> 1
дссрссасса адддсссаРс ддРсРРсссс сРддсасссР ссРссаадад сассРсРддд 60
ддсасадсдд сссРдддсРд ссРддРсаад дасРасРРсс ссдаассддр дасддрдрсд 120
РддаасРсад дсдсссРдас садсддсдрд сасассРРсс сддсРдРссР асадРссРса 180
ддасРсРасР сссРсадсад сдРддРдасс дрдсссрсса дсадсРРддд сасссадасс 240
РасаРсРдса асдРдааРса саадсссадс аасассаадд Рддасаадаа адРРдадссс 300
аааРсРРдРд асаааасРса сасаРдссса ссдРдсссад сассРдаасР ссРдддддда 360
ссдРсадРсР РссРсРРссс сссаааассс ааддасассс РсаРдаРсРс ссддассссР 420
даддРсасаР дсдРддРддР ддасдрдадс сасдаадасс срдаддрсаа дРРсаасРдд 480
РасдРддасд дсдрддаддр дсаРааРдсс аадасааадс сдсдддадда дсадРасаас 540
адсасдРасс дрдрддрсад сдРссРсасс дРссРдсасс аддасРддсР дааРддсаад 600
дадРасаадР дсааддРсРс саасааадсс сРсссадссс ссаРсдадаа аассаРсРсс 660
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дрдрасассс РдсссссаРс ссдддаРдад 720
сРдассаада ассаддРсад ссРдассРдс сРддРсааад дсРРсРаРсс садсдасаРс 780
дссдрддадр дддададсаа Рдддсадссд дадаасаасР асаадассас дссРсссдРд 840
сРддасРссд асддсРссРР сРРссРсРаР адсаадсРса ссдрддасаа дадсаддрдд 900
садсадддда асдРсРРсРс аРдсРссдРд аРдсаРдадд сРсРдсасаа ссасРасасд 960
садаададсс РсРсссРдРс РссдддРааа 990
<210> 2
<211> 330
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 2
А1а Зег ТЪг Ьуз 61у Рго Зег Уа1 РЪе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз
1 5 10 15
Зег ТЪг Зег С1у 61у ТЪг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг
20 25 30
РЪе Рго 61и Рго Уа1 ТЪг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЪг Зег
35 40 45
С1у Уа1 ΗΪ8 ТЪг РЪе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЪг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЪг С1п ТЪг
65 70 75 80
Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Н1з Ьуз Рго Зег Азп ТЪг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
85 90 95
Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЪг ΗΪ3 ТЪг Суз Рго Рго Суз
100 105 110
Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 61у С1у Рго Зег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго
115 120 125
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЪг Ьеи Мер 11е Зег Агд ТЪг Рго С1и Уа1 ТЪг Суз
130 135 140
Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ5 С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр
145 150 155 160
- 47 030259
Туг Уа1 Азр С1у Уа1 61и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и
165 170 175
С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 \7а1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
180 185 190
Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп
195 200 205
Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не 61и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз 61у 210 215 220
С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и
225 230 235 240
Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг
245 250 255
Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп 260 265 270
Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РНе 275 280 285
Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61п С1п С1у Азп 290 295 300
Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Низ С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг Ткг 305 310 315 320
С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
325 330
<210> 3 <211> 978 <212> ДНК <213> Ното зариепз
<400> 3
дссЬссасса адддсссаЬс дд-ЬсЫзсссс сЬддсдсссЬ дсЬссаддад сассЬссдад 60
адсасадсдд сссЬдддсЬд ссЬдд-Ьсаад дасЬасЬЬсс ссдаассддЬ дасддЬдЬсд 120
ЬддаасЬсад дсдсЬсЬдас садсддсдЬд сасассЬЬсс садсЬдЬссЬ асадЬссЬса 180
ддасЬсЬасЬ сссЬсадсад сдЬддЬдасс дРдсссЬсса дсаасЬЬсдд сасссадасс 240
ЬасассЬдса асдЬадаЬса саадсссадс аасассаадд Ьддасаадас адЬЬдадсдс 300
аааЬдЬЬд'Ьд ЬсдадЬдссс ассдЬдссса дсассассЬд Ьддсаддасс дЬсадЬсЬЬс 360
сЬсЬЬссссс саааасссаа ддасасссЬс аЬдаЬсЬссс ддассссЬда ддЪсасдЪдс 420
дЬддЬддЬдд асдЬдадсса сдаадасссс даддЬссадЬ ЬсаасЬддЬа сдЬддасддс 480
дЬддаддЬдс аЬааЬдссаа дасааадсса сдддаддадс адЬЬсаасад сасдЬЬссдЬ 540
дЬддЬсадсд ЬссЬсассдЬ ЬдЬдсассад дасЬддсЬда асддсаадда дЬасаадЬдс 600
ааддЬсЬсса асаааддссЬ сссадссссс аЬсдадаааа ссаЬсЬссаа аассаааддд 660
садссссдад аассасаддЬ дРасасссЬд сссссаЬссс дддаддадаЬ дассаадаас 720
саддЬсадсс ЬдассЬдссЬ ддЬсаааддс ЬЬсЬасссса дсдасаЬсдс сдЬддадЬдд 780
дададсааЬд ддсадссдда даасаасЬас аадассасас сЬсссаЬдсЬ ддасЬссдас 840
ддсЬссЬЬсЬ ЬссЬсЬасад саадсЬсасс дЬддасаада дсаддЬддса дсаддддаас 900
дЬсЬЬсЬсаЬ дсЬссдЬдаЬ дсайдаддсЬ сЬдсасаасс асЬасасдса даададссЬс 960
ЬсссЬдЬсЬс сдддЬааа 978 <210> 4 <211> 326 <212> ПРТ <213> Ното зариепз <400> 4
А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд
10 15
Зег ТЬг Зег С1и Зег Ткг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг 20 25 30
Рпе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи Ткг Зег 35 40 45
С1у Уа1 Низ ТЬг Рке Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег 50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 Ткг Уа1 Рго Зег Зег Азп РЬе С1у ТНг С1п ТЬг
70 75 80
Туг ТЪг Суз Азп Уа1 Азр Низ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
90 95
ТНг Уа1 С1и Агд Ьуз Суз Суз Уа1 С1и Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго 100 105 110
Рго Уа1 А1а С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 115 120 125
ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр 130 135 140
- 48 030259
Уа1 Зег ΗΪ3 61и Азр Рго С1и Уа1 С1п РЪе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у
145 150 155 160
Уа1 61и Уа1 Ηίβ Азп А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЪе Азп
165 170 175
Зег ТЪг РЪе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Уа1 Н1з 61η Азр Тгр 180 185 190
Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго 195 200 205
А1а Рго Не 61и Ьуз ТЪг 11е Зег Ьуз ТЪг Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и 210 215 220
Рго С1п Уа1 Туг ТЪг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и Мер ТЪг Ьуз Азп
225 230 235 240
С1п Уа1 Зег Ьеи ТЪг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЪе Туг Рго Зег Азр 11е
245 250 255
А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг 260 265 270
ТЪг Рго Рго Мер Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЪе РЪе Ьеи Туг Зег Ьуз 275 280 285
Ьеи ТЪг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЪе Зег Суз 290 295 300
Зег Уа1 Мер ΗΪ3 С1и А1а Ьеи НЬз Азп Ηίβ Туг ТЪг С1п Ьуз Зег Ьеи 305 310 315 320
Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз 325 <210> 5 <211> 981 <212> ДНК <213> Ното зариепз <400> 5
дссадсасса аддддссаРс сдРсРРсссс сРддсдсссР дсРссаддад сассРссдад 60
адсасадссд сссРдддсРд ссРддРсаад дасРасРРсс ссдаассддР дасддРдРсд 120
РддаасРсад дсдсссРдас садсддсдРд сасассРРсс сддсРдРссР асадРссРса 180
ддасРсРасР сссРсадсад сдрддрдасс дРдсссРсса дсадсРРддд сасдаадасс 240
РасассРдса асдРадаРса саадсссадс аасассаадд Рддасаадад адРРдадРсс 300
аааРаРддРс ссссаРдссс аРсаРдссса дсассРдадР РссРдддддд ассаРсадРс 360
РРссРдРРсс ссссаааасс сааддасасР сРсаРдаРсР сссддасссс РдаддРсасд 420
РдсдРддРдд РддасдРдад ссаддаадас сссдаддРсс адРРсаасРд дРасдРддаР 480
ддсдрддадд РдсаРааРдс саадасааад ссдсдддадд адсадРРсаа садсасдРас 540
сдрдрддрса дсдРссРсас сдРссРдсас саддасРддс Рдаасддсаа ддадРасаад 600
РдсааддРсР ссаасааадд ссРсссдРсс РссаРсдада ааассаРсРс сааадссааа 660
дддсадсссс дададссаса ддрдрасасс сРдсссссаР сссаддадда дардассаад 720
аассаддРса дссРдассРд ссРддРсааа ддсРРсРасс ссадсдасар сдссдРддад 780
Рдддададса аРдддсадсс ддадаасаас Расаадасса сдссРсссдР дсРддасРсс 840
дасддсРссР РсРРссРсРа садсаддсРа ассдрдгаса ададсаддРд дсаддадддд 900
ааРдРсРРсР саРдсРссдР дакдсаРдад дсРсРдсаса ассасРасас асадаададс 960
сРсРсссРдР сРсРдддРаа а 981
<210> 6 <211> 327 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 6
А1а Зег ТЪг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РЪе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд 15 10 15
Зег ТЪг Зег С1и Зег ТЪг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг 20 25 30
РЪе Рго С1и Рго Уа1 ТЪг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЪг Зег 35 40 45
С1у Уа1 ΗΪ3 ТЪг РЪе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег 50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЪг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи 61у ТЪг Ьуз ТЪг
70 75 80
Туг ТЪг Суз Азп νβΐ Азр Н1з Ьуз Рго Зег Азп ТЪг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
90 95
Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг С1у Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго А1а Рго 100 105 110
С1и РЪе Ьеи С1у С1у Рго Зег νβΐ РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз 115 120 125
Азр ТЪг Ьеи Мер 11е Зег Агд ТЪг Рго С1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1 Уа1 130 135 140
- 49 030259
Азр 145 Уа1 Зег С1п С1и Азр 150 Рго С1и Уа1 С1п РЪе Азп Тгр Туг Уа1 Азр
155 160
С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ5 Азп А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЪе
165 170 175
Азп Зег ТЪг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр
180 185 190
Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи
195 200 205
Рго Зег Зег 11е С1и Ьуз ТЪг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд
210 215 220
С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЪг Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и МеЕ ТЪг Ьуз
225 230 235 240
Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЪг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЪе Туг Рго Зег Азр
245 250 255
Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
260 265 270
ТЪг ТЪг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЪе РЪе Ьеи Туг Зег
275 280 285
Агд Ьеи ТЪг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1и С1у Азп Уа1 РЪе Зег
290 295 300
Суз Зег Уа1 МеЕ ΗΪ5 61и А1а Ьеи ΗΪ5 Азп ΗΪ3 Туг ТЪг С1п Ьуз Зег
305 310 315 320
Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз 325 <210> 7 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зариепз <400> 7
сдаасЕдЕдд сЕдсассаЕс ЕдЕсЕЕсаЕс ЕЕсссдссаЕ сЕдаЕдадса дЕЕдаааЕсЕ 60
ддаасЕдссЕ сЕдЕЕдЕдЕд ссЕдсЕдааЕ аасЕЕсЕаЕс ссадададдс сааадЕасад 120
ЕддааддЕдд аЕаасдсссЕ ссааЕсдддЕ аасЕсссадд ададЕдЕсас ададсаддас 180
адсааддаса дсассЕасад ссЕсадсадс асссЕдасдс Едадсааадс адасЕасдад 240
ааасасааад ЕсЕасдссЕд сдаадЕсасс саЕсадддсс ЕдадсЕсдсс сдЕсасааад 300
адсЕЕсааса ддддададЕд Е 321
<210> 8 <211> 107 <212> ПРТ <213> Ното зариепз <400> 8
Агд ТЪг Уа1 А1а А1а Рго Зег УаЬ РЪе 11е 10 РЪе Рго Рго Зег Азр 15 С1и
1 5
С1п Ьеи Ьуз Зег С1у ТЪг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЪе
20 25 30
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п
35 40 45
Зег С1у Азп Зег С1п С1и Зег Уа1 ТЪг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег
50 55 60
ТЪг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЪг Ьеи ТЪг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и
65 70 75 80
Ьуз Ηί3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЪг ΗΪ3 61п С1у Ьеи Зег Зег
85 90 95
Рго Уа1 ТЪг Ьуз Зег РЪе Азп Агд С1у С1и Суз
100 105
<210> 9
<211> 369
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 9
даддЕдсадс ЕддЕддадЕс Едддддаддс ЕЕддЕасадс сЕддддддЕс ссЕдадасЕс 60
ЕссЕдЕдсад ссЕсЕддсЕЕ сассЕЕаада адЕЕаЕадса ЕдаасЕдддЕ ЕсдссаддсЕ 120
ссадддаадд ддсЕддадЕд ддЕЕЕсаЕас аЕЕадЕсдЕа дЕадЕсаЕас саЕаЕЕсЕас 180
дсадасЕсЕд Едаадддссд аЕЕсассаЕс Ессададаса аЕдссаадаа ЕЕсасЕдЕаЕ 240
сЕдсаааЕдд асадссЕдад адасдаддас асддсЕаЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дададЕаЕаЕ 300
адсадЕддсЕ ддсасдЕсЕс ЕдаЕЕаЕЕЕЕ дасЕасЕддд дссадддааЕ ссЕддЕсасс 360
дЕЕЕссЕса 369
- 50 030259 <210> 10 <211> 123 <212> ΠΡΤ <213> Ното зарчепз <400> 10
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЪе ТЪг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег Мер Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Агд Зег Зег Нчз ТЪг Не РЪе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЪе ТЪг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЪг А1а Мер Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег С1у Тгр Нчз Уа1 Зег Азр Туг РЪе Азр Туг
100 105 НО
Тгр С1у С1п С1у Не Ьеи Уа1 ТЪг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 11 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното зарчепз <400> 11
дссаРссадР РдасссадРс РссаРссРсс сРдРсРдсаР сРдРаддада сададРсасс 60
аРсасРРдсс дддсаадРса дддсаРРадс адРдсРРРад ссРддРаРса дсадааасса 120
дддааадсРс сРаадсРссР даРсРаРдаР дссРссадРР РддааадРдд ддРсссаРса 180
аддРРсадсд дсадРддаРс РдддасадаР РРсасРсРса ссаРсадсад ссРдсадссР 240
даадаРРРРд саасРРаРРа сРдРсаасад РРРааРадРР асссдсРсас РРРсддсдда 300
дддассаадд РддадаРсаа а 321
<210> 12
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното зарчепз
<400> 12
А1а Не С1п Ьеи ТЪг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 61у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЪг Не ТЪг Суз Агд А1а 25 Зег С1п С1у Не Зег 30 Зег А1а
20
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи С1и Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЪе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз С1п С1п РЪе Азп Зег Туг Рго Ьеи
85 90 95
ТЪг РЪе С1у С1у 61у ТЪг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105
<210> 13
<211> 42
<212> , ЦНК
<213> Ното зарчепз <400> 13 дРаРаРадса дрддсрддса сдРсРсРдаР РаРРРРдасР ас 42 <210> 14 <211> 14 <212> ПРТ <213> Ното зарчепз <400> 14
Уа1 Туг Зег Зег С1у Тгр Нчз Уа1 Зег Азр Туг РЪе Азр Туг
10 <210> 15 <211> 27 <212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 15
саасадРРРа аРадРРассс дсРсасР 27
<210> 16
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 16
61п С1п РНе Азп Зег Туг Рго Ьеи ТНг
1 5
<210> 17
<211> 51
<212> ДНК
<213> Ното заргепз
<4 00> 17
РасаРРадРс дРадРадРса РассаРаРРс РасдсадасР сРдРдааддд с 51
<210> 18
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 18
Туг Не Зег Агд Зег Зег ΗΪ5 ТПг 11е РНе Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
С1у
<210> 19
<211> 21
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 19
даРдссРсса дРРРддааад Р 21
<210> 20
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 20
Азр А1а Зег Зег Ьеи С1и Зег
1 5
<210> 21
<211> 15
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 21
адРРаРадса Рдаас 15
<210> 22
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното зараепз
<400> 22
Зег Туг Зег Мер Азп 1 5
<210> 23
<211> 33
<212> ДНК
<213> Ното зараепз
<400> 23
сдддсаадРс адддсаРРад садРдсРРРа дсс 33
<210> 24
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 24
Агд А1а Зег 61п С1у 11е Зег Зег А1а Ьеи А1а
- 52 030259
10 <210> 25 <2Ы> 1131 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз
<400> 25
дссНссасса адддсссаРс ддРсРРсссс сРддсдсссР дсРссаддад сассРсРддд 60
ддсасадсдд сссРдддсРд ссРддРсаад дасРасРРсс ссдаассддр дасддрдрсд 120
НддаасНсад дсдсссРдас садсддсдрд сасассРРсс сддсРдРссР асадРссРса 180
ддасНсНасН сссРсадсад сдРддРдасс дРдсссРсса дсадсРРддд сасссадасс 240
НасассНдса асдРдааРса саадсссадс аасассаадд Рддасаадад адРРдадсРс 300
аааассссас РРддРдасас аасРсасаса РдсссасддР дсссададсс саааРсРРдР 360
дасасассНс ссссдрдссс асддрдссса дадсссаааР сРРдРдасас ассРсссссд 420
РдсссасддР дсссададсс саааРсРРдР дасасассРс ссссаРдссс асддрдссса 480
дсассНдаас РссРдддадд ассдРсадРс РРссРсРРсс ссссаааасс сааддаРасс 540
сННаНдаННН сссддасссс РдаддРсасд РдсдРддРдд РддасдРдад ссасдаадас 600
сссдаддНсс адРРсаадРд драсдрддас ддсдРддадд РдсаРааРдс саадасааад 660
ссдсдддадд адсадННсаа садсасдРРс сдРдРддРса дсдРссРсас сдРссРдсас 720
саддасНддс Рдаасддсаа ддадРасаад РдсааддРсР ссаасааадс ссРсссадсс 780
сссаНсдада ааассаНсНс саааассааа ддасадсссс дадаассаса ддрдрасасс 840
сНдсссссаН сссдддадда даРдассаад аассаддРса дссРдассРд ссРддРсааа 900
ддсННсНасс ссадсдасаР сдссдрддад Рдддададса дсдддсадсс ддадаасаас 960
Насаасасса сдссРсссаР дсРддасРсс дасддсРссР РсРРссРсРа садсаадсРс 1020
ассдрддаса ададсаддРд дсадсадддд аасаРсРРсР саРдсРссдР даРдсаРдад 1080
дсРсРдсаса ассдсРРсас дсадаададс сРсРсссРдР сРссдддРаа а 1131
<210> 26 <211> 376 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 26
АЬа Зег ТНг Ьуз СЬу Рго Зег УаЬ РНе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд
1 5 10 15
Зег ТНг Зег СЬу СЬу ТНг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг
20 25 30
РНе Рго СЬи Рго УаЬ ТНг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТНг Зег
35 40 45
СЬу УаЬ НЬз ТНг РНе Рго АЬа УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег
50 55 60
Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТНг УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТНг СЬп ТНг
65 70 75 80
Туг ТНг Суз Азп УаЬ Азп НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз УаЬ Азр Ьуз
85 90 95
Агд УаЬ СЬи Ьеи Ьуз ТНг Рго Ьеи СЬу Азр ТНг ТНг НЬз ТНг Суз Рго
100 105 110
Агд Суз Рго СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр ТНг Рго Рго Рго Суз Рго Агд
115 120 125
Суз Рго СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр ТНг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз
130 135 140
Рго СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр ТНг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго
145 150 155 160
АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз
165 170 175
Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи Мер Не Зег Агд ТНг Рго СЬи УаЬ ТНг Суз УаЬ
180 185 190
УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр Рго СЬи 7а1 СЬп РНе Ьуз Тгр Туг
195 200 205
УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи
210 215 220
СЬп РНе Азп Зег ТНг РНе Агд УаЬ УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТНг УаЬ Ьеи НЬз
225 230 235 240
СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз
245 250 255
АЬа Ьеи Рго АЬа Рго Не СЬи Ьуз ТНг Не Зег Ьуз ТНг Ьуз СЬу СЬп
260 265 270
Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи Мер
275 280 285
ТНг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РНе Туг Рго
- 53 030259
290 295 300
Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Зег 61у С1п Рго С1и Азп Азп
305 310 315 320
Туг Азп ТЪг ТНг Рго Рго Меб Ьей Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьей
325 330 335
Туг Зег Ьуз Ьей ТНг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп 11е
340 345 350
РНе Зег Суз Зег Уа1 Меб ΗΪ3 С1и А1а Ьей Нбз Азп Агд РНе ТНг С1п
355 360 365
Ьуз Зег Ьей Зег Ьей Зег Рго С1у
370 375
<210> 27 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для человеческого ΝΟΓ <400> 27 асассасаба бдбсабсабс ссабсссаб 29 <210> 28 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер для человеческого ЫСГ <400> 28 ассасаддаб ссбссббабд сасдасдсас адсбббасдд 40 <210> 29 <211> 375 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный человеческий мет-ΝΘΡ <400> 29
сабабдбсаб сабсссабсс сабсббссас аддддсдааб бсбсддбдбд бдасадбдбс 60
адсдбдбддд ббддддабаа дассассдсс асадасабса адддсаадда ддбдабддбд 120
ббдддададд бдаасаббаа саасадбдба ббсааасадб асббббббда дассаадбдс 180
сдддасссаа абсссдббда садсдддбдс сддддсаббд асбсааадса сбддаасбса 240
баббдбасса сдасбсасас сбббдбсаад дсдсбдасса бддабддсаа дсаддсбдсс 300
бддсддббба бссддабада басддссбдб дбдбдбдбдс бсадссдбаа адсбдбдсдб 360
сдбдсабаад дабсс 375
<210> 30 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого мет-ЫСЕ (1-120) <400> 30
Меб Зег Зег Зег ΗΪ5 Рго 11е РНе ΗΪ3 Агд С1у С1и РНе Зег Уа1 Суз
1 5 10 15
Азр Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр Уа1 61у Азр Ьуз ТНг ТНг А1а ТНг Азр 11е
20 25 30
Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 Меб Уа1 Ьей С1у С1и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег
35 40 45
Уа1 РНе Ьуз С1п Туг РНе РЪе С1и ТНг Ьуз Суз Агд Азр Рго Азп Рго
50 55 60
Уа1 Азр Зег С1у Суз Агд С1у 11е Азр Зег Ьуз ΗΪ3 Тгр Азп Зег Туг
65 70 75 80
Суз ТНг ТНг ТНг ΗΪ5 ТНг РНе Уа1 Ьуз А1а Ьей ТНг Меб Азр С1у Ьуз
85 90 95
С1п А1а А1а Тгр Агд РНе 11е Агд 11е Азр ТНг А1а Суз Ча1 Суз Уа1
100 105 110
Ьей Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Агд А1а
115 120
- 54 030259
<210> 31
<211> 55
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность 5'-праймера для генераций экспрессии вектора рСРМ1656 (АТСС # 69576 <400> 31 сдаЕЕЕдаЕЕ сЕадааддад дааЕаасаЕа ЕддЕЕаасдс дЕЕддааЕЕс ддЕас 55
<210> 32
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность 3'-праймера для генерации экспрессии вектора рСГМ1656 (АТСС # 69576 <400> 32
ЕааасЕаада ЕсЕЕссЕссЕ ЕаЕЕдЕаЕас сааЕЕдсдса ассЕЕаадс 49
<210> 33
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<220>
<221> ипзиге
<222> (18) .. (23)
<223> η 13 а, с, Е, ог д
<400> 33
ддссддаЕад дссЕссаппп пппЕ 24
<210> 34
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 34
ддддЕсаддс ЕддаасЕдад д 21
<210> 35
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 35
ЕдаддасдсЕ дассасасд 19
<210> 36
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 36
садсадаадс ЕЕсЕадасса ссаЕддасаЕ дадддЕдссс дсЕсадсЕсс Еддд 54
<210> 37
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 37
- 55 030259 сННдНсдасН саасасНсНс сссНдННдаа дсНс 34 <210> 38 <211> 55 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 38 садсадаадс ННсНадасса ссаНддадНН ддддсНдНдс НдддННННсс ННдНН 55 <210> 39 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 39 дсаНдНсдас НсаНННассс ддадасаддд адад 34 <210> 40 <211> 449 <212> ПРТ <213> Ното зартепз <400> 40
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 61и Зег С1у С1у 61у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег МеН Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Агд Зег Зег ΗΪ3 ТНг 11е РНе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеН Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТНг А1а МеН Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег С1у Тгр ΗΪ3 Уа1 Зег Азр Туг РНе Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у С1п 61у 11е Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТНг Зег С1и Зег
130 135 140
ТНг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго Уа1
145 150 155 160
ТНг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у Уа1 ΗΪ3 ТНг РНе
165 170 175
Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
180 185 190
ТНг Уа1 Рго Зег Зег Азп РНе С1у ТНг С1п ТНг Туг ТНг Суз Азп Уа1
195 200 205
Азр Низ Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз ТНг Уа1 С1и Агд Ьуз
210 215 220
Суз Суз Уа1 С1и Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а С1у Рго
225 230 235 240
Зег Уа1 РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи МеН 11е Зег
245 250 255
Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр
260 265 270
Рго С1и Уа1 С1п РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп
275 280 285
А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РНе Азп Зег ТНг РНе Агд Уа1
290 295 300
Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Уа1 Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и
305 310 315 320
Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз
325 330 335
ТНг Не Зег Ьуз ТНг Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Ча1 Туг ТНг
340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеН ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТНг
355 360 365
Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 61и Тгр С1и
370 375 380
- 56 030259
Зег Азп С1у С1п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго МеЬ Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ ΗΪ3 С1и
420 425 430
А1а Ьеи ΗΪ3 Азп ΗΪ3 Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
435 440 445
Ьуз <210> 41 <211> 453 <212> ПРТ
<213> 1 1опю зариепз
<400> 41
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у 61у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Агд Зег Зег ΗΪ3 ТЬг 11е РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а МеЬ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег 61у Тгр Ηίδ Уа1 Зег Азр Туг РЬе Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у С1п С1у Не Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у С1у
130 135 140
ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 61и Рго Уа1
145 150 155 160
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 ΗΪ3 ТЬг РЬе
165 170 175
Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
180 185 190
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг Туг 11е Суз Азп Уа1
195 200 205
Азп ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 С1и Рго Ьуз
210 215 220
Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи
225 230 235 240
Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
245 250 255
Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
260 265 270
Зег ΗΪ3 С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1
275 280 285
С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Зег
290 295 300
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи
305 310 315 320
Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
325 330 335
Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго
340 345 350
С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п
355 360 365
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а
370 375 380
Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
385 390 395 400
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
405 410 415
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
420 425 430
Уа1 Мек НЬз С1и А1а Ьеи Низ Азп ΗΪ3 Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег
435 440 445
Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 450
- 57 030259 <210> 42 <211> 450 <212> ΠΡΤ
<213> Ното зариепз
<400> 42
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Агд Зег Зег ΗΪ3 ТЬг Не РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЬ Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а МеЬ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег С1у Тгр Нйз Уа1 Зег Азр Туг РЬе Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у С1п С1у 11е Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег
130 135 140
ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 61и Рго ν3ΐ
145 150 155 160
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЫ Зег С1у Уа1 Низ ТЬг РЬе
165 170 175
Рго А1а Уа1 Ьеи 61п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
180 185 190
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег 5ег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп \/а1
195 200 205
Азр Низ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз
210 215 220
Туг С1у Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи 61у 61у
225 230 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не
245 250 255
Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег С1п С1и
260 265 270
Азр Рго С1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг 7а1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ
275 280 285
Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 61и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Низ С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз
305 310 315 320
С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег Не С1и
325 330 335
Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Зег 61п С1и С1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а \7а1 С1и Тгр
370 375 380
С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1и 61у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Низ
420 425 430
С1и А1а Ьеи Низ Азп Низ Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи
435 440 445
С1у Ьуз
450
<210> 43
<211> 499
<212> ПРТ
<213> ] Ното зариепз
<400> 43
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег МеЬ Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
- 58 030259
Зег Туг 11е Зег 50 Агд Зег Зег НЬз ТНг 11е 55 РНе Туг А1а Азр Зег УаЬ 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеН Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТНг А1а МеН Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд УаЬ Туг Зег Зег С1у Тгр НЬз Уа1 Зег Азр Туг РНе Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у С1п С1у 11е Ьеи 7а1 ТНг УаЬ Зег Зег А1а Зег ТНг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 РНе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТНг Зег С1у С1у
130 135 140
ТНг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РНе Рго С1и Рго УаЬ
145 150 155 160
ТНг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТНг Зег С1у УаЬ НЬз ТНг РНе
165 170 175
Рго А1а νβΐ Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ
180 185 190
ТНг Е/а1 Рго Зег Зег Зег Ьеи 61у ТНг С1п ТНг Туг ТНг Суз Азп УаЬ
195 200 205
Азп НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТНг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ 61и Ьеи Ьуз
210 215 220
ТНг Рго Ьеи С1у Азр ТНг ТНг НЬз ТНг Суз Рго Агд Суз Рго С1и Рго
225 230 235 240
Ьуз Зег Суз Азр ТНг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго С1и Рго Ьуз
245 250 255
Зег Суз Азр ТНг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго С1и Рго Ьуз Зег
260 265 270
Суз Азр ТНг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи
275 280 285
61у С1у Рго Зег УаЬ РНе Ьеи РНе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТНг Ьеи
290 295 300
МеН 11е Зег Агд ТНг Рго С1и Уа1 ТНг Суз Уа1 УаЬ Уа1 Азр УаЬ Зег
305 310 315 320
НЬз С1и Азр Рго 61и УаЬ С1п РНе Ьуз Тгр Туг УаЬ Азр 61у Уа1 61и
325 330 335
Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РНе Азп Зег ТНг
340 345 350
РНе Агд Уа1 УаЬ Зег Уа1 Ьеи ТНг \7а1 Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп
355 360 365
С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго
370 375 380
Не С1и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз ТНг Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п
385 390 395 400
Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеН ТНг Ьуз Азп С1п УаЬ
405 410 415
Зег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1
420 425 430
С1и Тгр С1и Зег Зег С1у 61п Рго С1и Азп Азп Туг Азп ТНг ТНг Рго
435 440 445
Рго МеН Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РНе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг
450 455 460
Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п 61п С1у Азп Не РНе Зег Суз Зег УаЬ
465 470 475 480
МеН НЬз С1и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Агд РНе ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи
485 490 495
Зег Рго С1у
<210> 44 <211> 214 <212> ΠΡΤ
<213> Ното зарЬепз
<400> 44
А1а 11е С1п Ьеи ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег УаЬ С1у
1 5 10 15
Азр Агд 7а1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег С1п 61у 11е Зег Зег А1а
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи С1и Зег С1у УаЬ Рго Зег Агд РНе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз 61п С1п РНе Азп Зег Туг Рго Ьеи
90 95
- 59 030259
ТЪг РЪе С1у С1у 100 С1у ТЪг Ьуз Уа1 С1и 105 11е Ьуз Агд ТЪг Уа1 110 А1а А1а
Рго Зег Уа1 115 РЪе 11е РЪе Рго Рго 120 Зег Азр С1и С1п Ьеи 125 Ьуз Зег С1у
ТЪг А1а 130 Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи 135 Ьеи Азп Азп РЪе Туг 140 Рго Агд 61и А1а
Ьуз 145 Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 150 Азр Азп А1а Ьеи С1п 155 Зег С1у Азп Зег С1п 160
С1и Зег Уа1 ТЪг С1и 165 С1п Азр Зег Ьуз Азр 170 Зег ТЪг Туг Зег Ьеи 175 Зег
Зег ТЪг Ьеи ТЪг 180 Ьеи Зег Ьуз А1а Азр 185 Туг С1и Ьуз ΗΪ3 Ьуз 190 Уа1 Туг
А1а Суз С1и 195 Уа1 ТЪг ΗΪ3 С1п С1у 200 Ьеи Зег Зег Рго Уа1 205 ТЪг Ьуз Зег
РЪе Азп 210 Агд С1у С1и Суз
<210> 45
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното заргепз
<400> 45
РЪе РЪе С1и ТЪг Ьуз 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ното зариепз <400> 46
Зег Зег Зег ΗΪ3 Рго Не РЪе ΗΪ3 Агд 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> ПРТ <213> Ното зарлепз <400> 47
ΗΪ3 Тгр Азп Зег Туг
5 <210> 48 <211> 12 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 48
Азп Зег \7а1 61и Ьуз С1п Туг РЪе РЪе С1и ТЪг Ьуз 15 10 <210> 49 <211> 7 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 49
Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Агд
5 <210> 50 <211> 5 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 50
С1и Уа1 МеЪ Уа1 Ьеи
5 <210> 51 <211> 25 <212> ПРТ <213> Ното зариепз <400> 51
Зег Зег Зег ΗΪ3 Рго 11е РЪе ΗΪ3 Агд С1у С1и РЪе Зег Уа1 Суз Азр 15 10 15
Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр Уа1 С1у Азр Ьуз 20 25
- 60 030259
<213> Ното зарЬепз
<400> 61
ТЪг ТЪг А1а ТЪг Азр Не Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 МеЪ Уа1 Ьеи С1у Суз
1 <210> 5 10 15 62
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 62
11е Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 МеЪ Уа1 Ьеи С1у С1и Уа1 Азп 11е Азп 15 10 15
<210> 63
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зариепз
<400> 63
Уа1 МеЪ Уа1 Ьеи С1у С1и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег Уа1 РЪе Ьуз Суз 15 10 15
<210> 64
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зариепз
<400> 64
61и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег Уа1 РЪе Ьуз С1п Туг РЪе РЪе С1и Суз 15 10 15
<210> 65
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зариепз
<400> 65
Азп Зег Уа1 РЪе Ьуз С1п Туг РЪе РЪе С1и ТЪг Ьуз А1а Агд Азр Суз 15 10 15
<210> 66
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 66
С1п Туг РЪе РЪе С1и ТЪг Ьуз А1а Агд Азр Рго Азп Рго Уа1 Азр Суз 15 10 15
<210> 67
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното заргепз
<400> 67
ТЪг Ьуз А1а Агд Азр Рго Азп Рго Уа1 Азр Зег С1у А1а Агд Азр Суз 15 10 15
<210> 68
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното заргепз
<400> 68
Рго Азп Рго Уа1 Азр Зег С1у А1а Агд Азр 11е Азр Зег Ьуз ΗΪ5 Суз
1 <210> 5 10 15 69
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Ното зариепз
<400> 69
Зег С1у А1а Агд Азр 11е Азр Зег Ьуз ΗΪ5 Тгр Азп Зег Туг Суз 15 10 15
<210> 70
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зариепз
<400> 70
11е Азр Зег Ьуз Низ Тгр Азп Зег Туг А1а ТЪг ТЪг ТЪг ΗΪ3 ТЪг Суз 15 10 15
<210> 71
<211> 16
<212> ПРТ
- 62 030259 <213> Ното зарЬепз
Тгр Азп Зег Туг А1а ТЪг ТЪг ТЪг ΗΪ5 ТЪг РЪе Уа1 Ьуз А1а Ьеи Суз 15 10 15 <210> 72 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз
ТЪг ТЪг ТЪг ΗΪ3 ТЪг РЪе Уа1 Ьуз А1а Ьеи ТЪг Мер Азр С1у Ьуз Суз 15 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз
РЪе Уа1 Ьуз А1а Ьеи ТЪг Мер Азр С1у Ьуз С1п А1а А1а Тгр Агд Суз 15 10 15 <210> 74 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното заргепз
ТЪг Мер Азр 61у Ьуз С1п А1а А1а Тгр Агд РЪе Не Агд Не Азр Суз 15 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> ПРТ <213> Ното зариепз
С1п А1а А1а Тгр Агд РЪе Не Агд 11е Азр ТЪг А1а А1а Уа1 Суз 15 10 15 <210> 76 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното зариепз <400> 76
РЪе 11е Агд 11е Азр ТЪг А1а А1а Уа1 А1а Уа1 Ьеи Зег Агд Ьуз Суз
5 <210> 77 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз
ТЪг А1а А1а Уа1 А1а Уа1 Ьеи
Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Агд А1а Суз 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Ното зарйепз
<400> 78
Суз А1а А1а Уа1 А1а Уа1 Ьеи 1 5 <210> 79 <211> 125 <212> ПРТ <213> Ъото зархеп
Зег Агд Ьуз А1а УаЬ Агд Агд А1а 10 15 <400> 79
С1и УаЬ С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а 61и УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у С1и
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Азп РЪе ТЪг ТЪг Туг
20 25 30
Тгр 11е С1у Тгр Уа1 Агд С1п Мер Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Мер
35 40 45
С1у Не Не Туг Рго С1у Азр Зег Азр ТЪг Ьуз Туг Зег Рго Зег РЪе
50 55 60
С1п С1у 61п Уа1 ТЪг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег 11е Зег ТЪг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЪг А1а МеР Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азп Туг Туг С1у Зег С1у ТЪг Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мер
100 105 110
Азп Уа1 Тгр (Пу б1п (Пу ТНг ТНг Ча1 ТНг Ча1 Зег Зег
115 120 125
<210> 80
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬеп
<400> 80
Азр Не С1п МеН ТНг (Пп Зег Рго Зег Зег Уа1 Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег (Пп С1у Не Зег Не Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п Низ Ьуз Рго (Пу Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег (Пу Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег (Пу
50 55 60
Зег 61у Зег (Пу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи (Пп Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз (Пп (Пп А1а Азп Зег РНе Рго Тгр
85 90 95
ТНг РЪе (Пу С1п (Пу ТНг Ьуз Уа1 (Ли Не Ьуз
100 105
<210> 81
<211> 127
<212> ПРТ
<213> Ното зариеп
<400> 81
(Ли Уа1 С1п Ьеи Уа1 (Ли Зег (Пу (Пу (Пу Ьеи Уа1 (Пп Рго (Пу Агд
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз ТНг А1а Зег (Пу РНе ТНг РНе (Пи Азр Туг
20 25 30
А1а МеН ΗΪ5 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго (Пу Ьуз (Пу Ьеи (Пи Тгр Ча1
35 40 45
Зег С1у Не Зег Тгр Азп Агд СЛу Не Не (Пу Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз (Пу Агд РНе ТНг Уа1 Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи Агд А1а (Ли Азр ТНг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз (Ли (Пу Туг Туг (Пу Зег (Пу Агд Рго (Пу Туг РНе Туг Туг
100 105 НО
Уа1 МеН Азр Уа1 Тгр (Ну С1п (Пу ТНг ТНг Уа1 ТНг Ча1 Зег Зег
115 120 125
<210> : 82
<211> 108
<212> ] ПРТ
<213> Ното зартеп
<400> 82
(Пи Не Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго (Пу ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго (Пу
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег (Пп Зег Уа1 Зег Зег (Пу
20 25 30
РНе Ьеи А1а Тгр РНе (Пп (Пп Ьуз Рго (Пу (Пп А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг (Пу А1а Зег Зег Агд А1а ТНг А1а Не Рго Азр Агд РНе Зег
50 55 60
С1у Зег (Пу Зег (Пу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Агд Ьеи (Ли
65 70 75 80
Рго (Ли Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз (Пп (Пп Туг (Пу Зег Зег Рго
85 90 95
Туг ТНг РНе 61у С1п (Пу ТНг Ьуз Ьеи (Ли Не Ьуз
100 105
<210> 83
<211> 127
<212> ПРТ
<213> Ното
<400> 83
(Пи 1 Уа1 (Пп Ьеи Уа1 (Пи Зег (Пу (Пу (Пу Ьеи Уа1 61п Рго (Пу Агд
5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РНе Не РНе Азр Азр Туг
20 25 30
А1а МеН ΗΪ5 Тгр Уа1 Агд (Пп А1а Рго (Пу Ьуз (Пу Ьеи (Пи Тгр Уа1
35 40 45
- 64 030259
Зег С1у Не Зег Тгр Азп Агд С1у Не Не С1у Туг А1а С1у Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РПе ТПг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТПг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
Уа1 Ьуз С1и С1у Туг Туг С1у Зег С1у Агд Рго С1у Туг РПе Туг Туг
100 105 но
Уа1 Мер Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТПг ТПг Уа1 ТПг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 84
<211> 108
<212> ПРТ
<213> Ното зараеп
<400> 84
61и Не Уа1 Ьеи ТПг 61п Зег Рго С1у ТПг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТПг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
11е Туг Уа1 А1а Зег Зег Агд А1а ТПг С1у Не Рго Азр Агд РПе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТПг Азр РПе ТПг Ьеи ТПг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РПе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг С1у Зег Зег Рго
85 90 95
Туг ТПг РПе С1у С1п С1у ТПг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 85
<211> 121
<212> ПРТ
<213> Пото зарЬеп
<400> 85
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у 61у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у Агд
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РПе Не РПе Азр Азр Туг
20 25 30
А1а Мер ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег 61у Не ТПг Тгр Азп Зег С1у Не Ьеи С1у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РПе ТПг Не Зег Агд Азр Азр А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТПг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1и С1и 61у Зег С1у Агд Туг Туг Азп РПе Азр Туг Тгр С1у
100 105 110
С1п С1у ТПг Ьеи Уа1 ТПг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 86 <211> 107 <212> ПРТ
<213> 1 лото зарЬеп
<400> ί 36
С1и Не Уа1 Ьеи ТПг С1п Зег Рго С1у ТПг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТПг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТПг С1у Не Рго Азр Агд РПе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТПг Азр РПе ТПг Ьеи ТПг Не Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РПе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг С1у Зег Зег Туг
85 90 95
ТПг РПе С1у С1п С1у ТПг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105 <210> 87 <211> 124 <212> ПРТ
- 65 030259 <213> Ното зарЬеп <400> 87
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 Агд Рго 61у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе Азр Азр Туг
20 25 30
С1у МеН Азп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Азр Не Азп Тгр Азп С1у С1у Зег ТНг С1у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеН Азп Зег Ьеи 85 Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Ьеи Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд С1и С1п Тгр Ьеи Азр Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеН Азр
100 105 но
Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 88
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬеп
<400> 88
Азр Не С1п МеН ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у
55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Тгр
85 90 95
ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105
<210> 89
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното зараеп
<400> 89
С1и Не νηΐ Ьеи ТНг 61п Зег Рго А1а ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п С1у νηΐ Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТНг С1у Не Рго А1а Агд РНе Зег С1у
50 55 60
Зег 61у Рго С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Низ Агд
85 90 95
ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105
<210> 90
<211> 108
<212> ПРТ
<213> Ното зариеп
<400> 90
С1и Не Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго С1у ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 15 10 15
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег 20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у 61п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 35 40 45
Не Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТНг С1у Не Рго Азр 60 Агд РНе Зег
50 55
С1у Зег С1у Зег С1у ТНг С1у РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго
- 66 030259
90 95
Тгр ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 91
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬеп
<400> 91
С1и 11е Уа1 Ьеи ТНг С1п Зег Рго А1а ТНг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТНг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТНг С1у 11е Рго А1а Агд РНе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Тгр
85 90 95
ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 61и 11е Ьуз
100 105
<210> 92
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното зархеп
<400> 92
ТНг Туг Тгр 11е С1у
1 5
<210> 93
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ното зархеп
<400> 93
11е 11е ! Туг Рго С1у Азр Зег Азр ТНг Ьуз Туг Зег Рго Зег РНе С1п
1 5 10 15
С1у
<210> 94
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното заргеп
<400> 94
Азп Туг Туг С1у Зег С1у ТНг Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеЕ Азп Уа1
1 5 10 15
<210> 95 <211> 11 <212> ПРТ <213> Нолю заргеп <400> 95
Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег 11е Тгр Ьеи А1а 15 10 <210> 96 <211> 7 <212> ПРТ <213> Ното зархеп <400> 96
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
5 <210> 97 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ното зарЬеп <400> 97
С1п С1п А1а Азп Зег РЬе Рго Тгр ТНг 1 5 <210> 98 <211> 5 <212> ПРТ
- 67 030259
<213> Ъото зариеп
<400> 98
Азр Туг А1а 1 <210> 99 Мер Ηί: 5
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ъото зариеп
<400> 99
С1у 11е Зег Тгр Азп Агд С1у 11е 11е 61у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 С1у <210> 100 5 10 15
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 100
С1у Туг Туг С1у Зег С1у Агд Рго С1у Туг РЪе Туг Туг Уа1 Мер Азр 15 10 15
Уа1 <210> 101 <211> 12 <212> ПРТ <213> Ъото зарлеп <400> 101
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег С1у РЪе Ьеи А1а
10 <210> 102 <211> 7 <212> ПРТ <213> Ъото зарлеп
- 68 030259
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬеп
<400> 108
Уа1 А1а Зег Зег Агд А1а ТНг
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ното зараеп
<400> 109
61п С1п Туг С1у Зег Зег Рго Туг ТНг
1 5
<210> 110
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното зархеп
<400> 110
Азр Туг А1а Меб ΗΪ3 1 5
<210> 111
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ното зархеп
<400> 111
61у Не ТНг Тгр Азп Зег 61у 11е Ьеи С1у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
61у
<210> 112
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬеп
<400> 112
61и С1у Зег С1у Агд Туг Туг Азп РНе Азр Туг 15 10
<210> 113
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Ното зариеп
<400> 113
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10
<210> 114
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ното зариеп
<400> 114
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТНг
1 5
<210> 115
<211> 8
<212> ПРТ
<213> Ното зариеп
<400> 115
С1п 61п Туг С1у Зег Зег Туг ТНг 1 5
<210> 116
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното зариеп
<400> 116
Азр Туг С1у МеН Азп 1 5
<210> 117
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ното зархеп
<400> 117
Азр 11е Азп Тгр Азп С1у С1у Зег ТНг С1у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
С1у
- 69 030259
<210> 118
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 118
С1и С1п Тгр Ьеи Азр Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мер Азр Уа1
1 <210> 5 10 15 119
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 119
Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а 15 10
<210> 120
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ъото зариеп
<400> 120
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ъото зар1еп
<400> 121
С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Тгр ТЪг
1 5
<210> 122
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 122
Агд А1а Зег 61п С1у Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10
<210> 123
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ъото зар1еп
<400> 123
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЪг 1 5
<210> 124
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ъото зариеп
<400> 124
61п С1п Агд Зег Азп Тгр Низ Агд ТЪг 1 5
<210> 125
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 125
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10
<210> 126
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 126
А1а Зег Зег Агд А1а ТЪг
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ъото зариеп
<400> 127
С1п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Тгр ТЪг 1 5
- 70 030259 <210> 128 <211> 11 <212> ΠΡΤ <213> Ъото зарЬеп <400> 128
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а
1 <210> 129 5 10
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ъото зарЬеп
<400> 129
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЪг 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ъото зархеп <400> 130
С1п 61п Агд Зег Азп Тгр Рго Тгр ТЪг
5 <210> 131 <211> 108 <212> ПРТ <213> Ъото зарлеп <400> 131
С1и 11е Уа1 Ьеи ТЪг С1п Зег Рго С1у ТЪг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТЪг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
40 45
11е Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЪг С1у 11е Рго Азр Агд РЪе Зег 50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 11е Зег Агд Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЪе А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п 61п Туг 61у Зег Зег Рго
85 90 95
Туг ТЪг РЪе С1у 61п 61 у ТЪг Ьуз Ьеи 61и Пе Ьуз
100 105 <210> 132 <211> 11 <212> ПРТ <213> Ъото зарЬеп <400> 132
Агд А1а Зег С1п С1у Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а 15 10 <210> 133 <211> 7 <212> ПРТ <213> Ъото зархеп <400> 133
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЪг
5 <210> 134 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ъото зарЬеп <400> 134
С1п С1п Туг С1у Зег Зег Рго Туг ТЪг 1 5 <210> 135 <211> 120 <212> ПРТ <213> Ъото зариеп <400> 135
Зег Зег Зег 1 Низ Рго 5 11е РЪе Ηίδ Агд 61у 61и РЪе Зег Уа1 Суз Азр
10 15
Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр Уа1 С1у Азр Ьуз ТЪг ТЪг А1а ТЪг Азр Не Ьуз
20 25 30
61у Ьуз 61и Уа1 МеЪ Уа1 Ьеи 61у 61и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег Уа1
35 40 45
РЪе Ьуз С1п 50 Туг РЪе РЪе С1и ТЪг Ьуз 55 Суз Агд Азр Рго Азп Рго Уа1 60
Азр Зег С1у Суз Агд С1у Не Азр Зег Ьуз Низ Тгр Азп Зег Туг Суз
65 70 75 80
ТЪг ТЪг ТЪг Низ ТЪг РЪе Уа1 Ьуз А1а Ьеи ТЪг МеЪ Азр С1у Ьуз С1п
85 90 95
А1а А1а Тгр Агд РЪе Не Агд Не Азр ТЪг А1а Суз Уа1 Суз Уа1 Ьеи
100 105 НО
Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Агд А1а
115 120
<210> 136
<211> 120
<212> ПРТ
<213> Домовая мышь
<400> 136
Зег Зег ТЪг Низ Рго Уа1 РЪе Низ МеЪ С1у 61и РЪе Зег Ча1 Суз Азр
1 5 10 15
Зег Ча1 Зег Уа1 Тгр Уа1 С1у Азр Ьуз ТЪг ТЪг А1а ТЪг Азр Не Ьуз
20 25 30
С1у Ьуз С1и Уа1 ТЪг Уа1 Ьеи А1а С1и Уа1 Азп Не Азп Азп Зег Уа1
35 40 45
РЪе Агд С1п Туг РЪе РЪе С1и ТЪг Ьуз Суз Агд А1а Зег Азп Рго Уа1
50 55 60
С1и Зег С1у Суз Агд С1у Не Азр Зег Ьуз Низ Тгр Азп Зег Туг Суз
65 70 75 80
ТЪг ТЪг ТЪг Низ ТЪг РЪе \7а1 Ьуз А1а Ьеи ТЪг ТЪг Азр С1и Ьуз С1п
85 90 95
А1а А1а Тгр Агд РЪе Не Агд Не Азр ТЪг А1а Суз Уа1 Суз Уа1 Ьеи
100 105 НО
Зег Агд Ьуз А1а ТЪг Агд Агд А1а
115 120
<210> 137
<211> 126
<212> ПРТ
<213> Ъото зариеп
<400> 137
Низ Зег Азр Рго А1а Агд Агд Низ Зег Азр Рго А1а Агд Агд С1у С1и
1 5 10 15
Ьеи Зег Уа1 Суз Азр Зег Не Зег С1и Тгр \7а1 ТЪг А1а А1а Азр Ьуз
20 25 30
Ьуз ТЪг А1а Уа1 Азр МеЪ Зег 61у С1у ТЪг Уа1 ТЪг Уа1 Ьеи С1и Ьуз
35 40 45
Уа1 Рго Уа1 Зег Ьуз С1у С1п Ьеи Ьуз 61п Туг РЪе Туг С1и ТЪг Ьуз
50 55 60
Суз Азп Рго МеЪ С1у Туг ТЪг Ьуз С1и 61у Суз Агд С1у Не Азр Ьуз
65 70 75 80
Агд Низ Тгр Азп Зег С1п Суз Агд ТЪг ТЪг С1п Зег Туг Уа1 Агд А1а
85 90 95
Ьеи ТЪг МеЪ Азр Зег Ьуз Ьуз Агд Не 61у Тгр Агд РЪе Не Агд Не
100 105 НО
Азр ТЪг Зег Суз Уа1 Суз ТЪг Ьеи ТЪг Не Ьуз Агд С1у Агд
115 120 125 <210> 138 <211> 119 <212> ПРТ
<213> Ъото зариеп
<400> 138
Туг А1а С1и Низ Ьуз Зег Низ Агд С1у С1и Туг Зег Уа1 Суз Азр Зег
1 5 10 15
С1и Зег Ьеи Тгр Уа1 ТЪг Азр Ьуз Зег Зег А1а Не Азр Не Агд С1у
20 25 30
Низ С1п Уа1 ТЪг Уа1 Ьеи С1у С1и Не Ьуз ТЪг С1у Азп Зег Рго Уа1
35 40 45
Ьуз 61п Туг РЪе Туг 61и ТЪг Агд Суз Ьуз С1и А1а Агд Рго Уа1 Ьуз
50 55 60
Азп С1у Суз Агд С1у Не Азр Азр Ьуз Низ Тгр Азп Зег 61п Суз Ьуз
65 70 75 80
ТЪг Зег С1п ТЪг Туг Уа1 Агд А1а Ьеи ТЪг Зег С1и Азп Азп Ьуз Ьеи
85 90 95
7а1 С1у Тгр Агд Тгр Не Агд Не Азр ТЪг Зег Суз Уа1 Суз А1а Ьеи
100 105 110
Зег Агд Ьуз 11е С1у Агд ТЪг 115
- 72 030259

Claims (55)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное антитело, специфично связывающееся с фактором роста нервов (ΝΟΡ), которое содержит легкую цепь, содержащую последовательность δΕφ ΙΌ ΝΟ: 44, и тяжелую цепь, содержащую последовательность δΕφ ΙΌ ΝΟ: 40.
  2. 2. Антитело по п.1, где тяжелая цепь и легкая цепь антитела соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
  3. 3. Антитело по п.2, которое представляет собой одноцепочечное Ρν-антитело.
  4. 4. Антитело по п.1, которое представляет собой РаЪ-антитело.
  5. 5. Антитело по п.1, которое представляет собой РаЪ'-антитело.
  6. 6. Антитело по п.1, которое представляет собой (РаЪ')2-антитело.
  7. 7. Антитело по п.1, представляющее собой полностью человеческое антитело.
  8. 8. Антитело по п.1, которое диссоциирует от человеческого полипептида ΝΟΡ с Кс примерно 1 х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ΝΟΡ в стандартном анализе ίη νίΐτο с Ιί%0 примерно 1 х 10-8 или менее.
  9. 9. Антитело по п.1, которое диссоциирует от человеческого полипептида ΝΟΡ с К примерно 1 х 1010 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ΝΟΡ в стандартном анализе ίη νίΐτο с Ιί.’50 примерно 1 х 10-9 или менее.
  10. 10. Антитело по п.1, которое диссоциирует от человеческого полипептида ΝΟΡ с К примерно 1 х 10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ΝΟΡ в стандартном анализе ίη νίΐτο с Ιί.’50 примерно 0,2х10-9 или менее.
  11. 11. Антитело по п.1, которое ингибирует передачу сигнала ΝΟΡ.
  12. 12. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело по любому из пп.1-11.
  13. 13. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.12.
  14. 14. Изолированная клеточная линия, которая продуцирует антитело по любому из пп.1-11.
  15. 15. Применение фармацевтически эффективного количества антитела по п.11 для производства лекарства для лечения острой боли, зубной боли, боли в результате травмы, операционной боли, боли в результате ампутации или абсцесса, каузалгии, демиелинизирующих заболеваний, невралгии тройничного нерва, рака, хронического алкоголизма, удара, таламического болевого синдрома, диабета, синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), боли в результате повреждений нервов, вызванных токсинами или химиотерапией, общей головной боли, мигрени, кластерной головной боли, смешанноваскулярных или неваскулярных синдромов, головной боли напряжения, общего воспаления, артрита, ревматических заболеваний, волчанки, остеоартрита, фибромиалгии, воспалительных кишечных расстройств, синдрома раздраженной кишки, воспалительных глазных расстройств, воспалительных или нестабильных расстройств мочевого пузыря, псориаза, кожных заболеваний с воспалительными компонентами, солнечного ожога, кардита, дерматита, миозита, неврита, сосудистых коллагенозов, хронических воспалительных состояний, воспалительной боли и сочетанной гипералгезии и аллодинии, невропатологической боли и сочетанной гипералгезии или аллодинии, боли при диабетической невропатии, симпатически поддерживаемой боли, синдромов деафферентации, астмы, повреждения или дисфункции эпителиальной ткани, простого герпеса, расстройств двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочно-кишечной или сосудистой систем, ран, ожогов, аллергических кожных реакций, зуда, витилиго, общих желудочно-кишечных расстройств, колита, язвы желудка, язв двенадцатиперстной кишки, вазомоторного или аллергического ринита или бронхиальных расстройств, дисменореи, диспепсии, желудочно-пищеводного рефлюкса, панкреатита или висцералгии.
  16. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитела по п.11.
  17. 17. Применение фармацевтической композиции по п.16 для производства лекарства для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией ΝΟΡ или повышенной чувствительностью к ΝΟΡ, где указанное состояние представляет собой острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), боль в результате повреждений нервов, вызванных токсинами или химиотерапией, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные или неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, фибромиалгию, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные заболевания с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию или аллодинию, боль при диабетической невропатии, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыха- 73 030259 тельной, мочеполовой, желудочно-кишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочно-пищеводный рефлюкс, панкреатит или висцералгию.
  18. 18. Применение по п.15 или 17, где боль является следствием остеоартрита.
  19. 19. Применение по п.15 или 17, где лекарство предназначено для перорального введения.
  20. 20. Применение по п.15 или 17, где лекарство предназначено для введения с помощью инъекции внутривенным, внутрибрюшинным, интрацеребральным (интрапаренхимальным), интрацеребровентрикулярным, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным, интрапортальным, подкожным путем или внутрь поражения; с помощью систем пролонгированного высвобождения или с помощью имплантационных устройств.
  21. 21. Применение по п.20, где лекарство предназначено для введения путем подкожной инъекции.
  22. 22. Применение по п.21, где фармацевтически эффективное количество указанного антитела составляет от примерно 3 мг до примерно 30 мг из расчета на подкожную инъекцию.
  23. 23. Применение по п.22, где подкожная инъекция включает множественные подкожные инъекции.
  24. 24. Способ обнаружения ΝΟΡ в биологических образцах, включающий:
    а) приведение в контакт указанного образца с антителом по п.1 в условиях, которые позволяют указанному антителу связываться с ΝΟΡ; и
    б) измерение уровня связанного антитела в образце.
  25. 25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий:
    а) вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, включающей 8ЕС ГО N0: 9; и
    б) вариабельную область легкой цепи, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, включающей 8ЕС) ГО N0: 11;
    где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает фактор роста нервов (ΝΟΡ).
  26. 26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий:
    а) вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает области СЭК.1, СГОЕ2 и СЭК.3, кодируемые изолированными молекулами нуклеиновой кислоты, включающими 8ЕС ГО N0: 21, 8ЕС ГО N0: 17, 8ЕС ГО N0: 13; и
    б) вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи включает области СЭК.1, СГОЕ2 и СЭК.3, кодируемые изолированными молекулами нуклеиновой кислоты, включающими 8ЕС ГО N0: 23; 8ЕС ГО N0: 19 и 8ЕС ГО N0: 15;
    где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает (N0?).
  27. 27. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, включающая:
    а) 8ЕС ГО N0: 9 и
    б) 8ЕС ГО N0: 11.
  28. 28. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.26, включающая:
    а) 8ЕС ГО N0: 21, 8ЕС ГО N0: 17 и 8ЕС ГО N0: 13; и
    б) 8ЕС ГО N0: 23, 8ЕС ГО N0: 19 и 8ЕС ГО N0: 15.
  29. 29. Изолированная клетка-хозяин, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.27 или 28.
  30. 30. Изолированная клеточная линия, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.27 или 28.
  31. 31. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, содержащее:
    а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую 8Еф ГО N0: 10; и
    б) вариабельную область легкой цепи, включающую 8ЕС ГО N0: 12.
  32. 32. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, содержащее:
    а) вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает области СИК1, С12Н2 и СИК3, имеющие 8ЕС ГО N0: 22, 8ЕС ГО N0: 18, 8ЕС ГО N0: 14; и
    б) вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи включает области СЭК.1, С12Н2 и СИК3, имеющие 8ЕС ГО N0: 24; 8ЕС ГО N0: 20 и 8ЕС ГО N0: 16.
  33. 33. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее:
    а) тяжелую цепь, включающую 8ЕС ГО N0: 40; и
    б) легкую цепь, включающую 8ЕС ГО N0: 44.
  34. 34. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащее:
    а) тяжелую цепь, включающую 8ЕС ГО N0: 41, 8ЕС ГО N0: 42 или 8ЕС ГО N0: 43; и
    б) легкую цепь, включающую 8ЕС ГО N0: 44.
  35. 35. Изолированная клетка-хозяин, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из
    - 74 030259 пп.31-34.
  36. 36. Изолированная клеточная линия, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.31-34.
  37. 37. Изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывает эпитоп человеческого фактора роста нервов (ЪСЕ). включающее вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает последовательность СЭК1, по меньшей мере на 80% идентичную 8Еф ГО N0: 22; последовательность СИК2, по меньшей мере на 80% идентичную 8Еф ГО N0: 18, и последовательность СЭК3, по меньшей мере на 80% идентичную 8Еф ГО N0: 14, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи включает последовательность СГОКЕ по меньшей мере на 80% идентичную 8Е0 ГО N0: 24; последовательность СИК2, по меньшей мере на 80% идентичную 8Еф ГО N0: 20, и последовательность СИК3, по меньшей мере на 80% идентичную 8Еф ГО N0: 16; и где антитело диссоциирует от человеческого полипептида NСЕ с Кс примерно 1х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NСЕ в стандартном анализе ίη νίίΓΟ с 1С50 примерно 1х10-8 или менее.
  38. 38. Изолированное моноклональное антитело по п.37, где указанный эпитоп NСЕ включает множество детерминант, содержащих аминокислотные последовательности 8Е0 ГО N0: 56, 65, 71, 72, 74, 75 и 76.
  39. 39. Антигенсвязывающий фрагмент изолированного моноклонального антитела по п.37.
  40. 40. Изолированное моноклональное антитело по п.37, которое представляет собой одноцепочечное Εν-антитело.
  41. 41. Изолированное моноклональное антитело по п.37, которое представляет собой химерное или человеческое антитело.
  42. 42. Изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывает эпитоп человеческого фактора роста нервов ЩСЕ), где указанный эпитоп включает множество детерминант, содержащих аминокислотные последовательности 8Е0 ГО N0: 56, 65, 71, 72, 74, 75 и 76, и где указанное моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую СГОКЕ СГОК2, СГОК3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую СГОКЕ СГОК2, СГОК3, кодируемые изолированными молекулами нуклеиновой кислоты, включающими последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные 8ЕО ГО N0: 21; 81+) ГО N0: 17; + ГО ГО N0: 13; 8ЕО ГО N0: 23; + ГО ГО N0: 19 и 8ЕО ГО N0: 15; и где антитело диссоциирует от человеческого полипептида NСΕ с Кс примерно 1х10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NСΕ в стандартном анализе ίη νίίτο с 1С50 примерно 1 х10-8 или менее.
  43. 43. Изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывает эпитоп человеческого фактора роста нервов ЩСЕ), где указанный эпитоп включает множество детерминант, содержащих аминокислотные последовательности 8Еф ГО N0: 56, 65, 71, 72, 74, 75 и 76, и где указанное моноклональное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, по меньшей мере на 75% идентичную 8Еф ГО N0: 9, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную 8Е0 ГО N0: 11, и где антитело диссоциирует от человеческого полипептида NСΕ с Кс примерно 1 х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NСΕ в стандартном анализе ίη νίίτο с 1С50 примерно 1х 10-8 или менее.
  44. 44. Применение антитела по п.25 или 26 для лечения боли.
  45. 45. Применение по п.44, где боль является следствием рака, остеоартрита, боли при диабетической невропатии или невропатологической боли.
  46. 46. Применение по п.45, где боль является следствием остеоартрита.
  47. 47. Применение по п.45, где боль является следствием боли при диабетической невропатии.
  48. 48. Применение по п.45, где боль является следствием невропатологической боли.
  49. 49. Применение по п.44, где боль является следствием рака.
  50. 50. Применение антител по пп.37, 42 или 43 для лечения боли.
  51. 51. Применение по п.50, где боль является следствием рака, остеоартрита, боли при диабетической невропатии или невропатологической боли.
  52. 52. Применение по п.51, где боль является следствием остеоартрита.
  53. 53. Применение по п.51, где боль является следствием боли при диабетической невропатии.
  54. 54. Применение по п.51, где боль является следствием невропатологической боли.
  55. 55. Применение по п.51, где боль является следствием рака.
    - 75 030259
EA201000245A 2003-07-15 2004-07-15 Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf EA030259B8 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48743103P 2003-07-15 2003-07-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201000245A1 EA201000245A1 (ru) 2010-12-30
EA030259B1 true EA030259B1 (ru) 2018-07-31
EA030259B8 EA030259B8 (ru) 2018-09-28

Family

ID=34215825

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000245A EA030259B8 (ru) 2003-07-15 2004-07-15 Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf
EA200600254A EA013614B1 (ru) 2003-07-15 2004-07-15 Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600254A EA013614B1 (ru) 2003-07-15 2004-07-15 Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения

Country Status (31)

Country Link
US (7) US7601818B2 (ru)
EP (2) EP2364728A1 (ru)
JP (8) JP4489077B2 (ru)
CN (3) CN102408483B (ru)
AR (2) AR045056A1 (ru)
AU (2) AU2004267030B2 (ru)
BR (1) BRPI0412567B1 (ru)
CA (1) CA2534585C (ru)
CY (1) CY1113167T1 (ru)
DK (1) DK1648509T3 (ru)
EA (2) EA030259B8 (ru)
ES (1) ES2392954T3 (ru)
GE (3) GEP20104887B (ru)
HK (2) HK1088534A1 (ru)
HR (2) HRP20060033B1 (ru)
IL (5) IL173076A (ru)
MA (1) MA27952A1 (ru)
ME (2) MEP31508A (ru)
MX (2) MXPA06000583A (ru)
NO (1) NO20060381L (ru)
NZ (3) NZ588527A (ru)
PL (1) PL1648509T3 (ru)
PT (1) PT1648509E (ru)
RS (2) RS20100555A (ru)
SG (1) SG10201404744RA (ru)
SI (1) SI1648509T1 (ru)
TN (1) TNSN06010A1 (ru)
TW (4) TWI635096B (ru)
UA (2) UA115960C2 (ru)
WO (1) WO2005019266A2 (ru)
ZA (1) ZA200600847B (ru)

Families Citing this family (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0367170A (ja) * 1989-08-04 1991-03-22 Nippon Steel Corp 金属試料中の微量炭素，硫黄，燐の分析方法
US7255860B2 (en) * 2002-10-08 2007-08-14 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody
UA80447C2 (en) * 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
CA2921578C (en) 2002-12-24 2017-02-14 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
EP1594441B1 (en) 2003-02-19 2010-12-15 Rinat Neuroscience Corp. Method for treating pain by administering a nerve growth factor antagonist and an nsaid and composition containing the same
DK1648509T3 (da) * 2003-07-15 2013-01-07 Amgen Inc Humane anti-NGF-neutraliserende antistoffer som selektive NGF-pathway-inhibitorer
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
KR20060135060A (ko) 2004-04-07 2006-12-28 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 신경성장인자 길항제의 투여에 의한 골암 통증의 치료방법
US7725178B2 (en) * 2004-06-30 2010-05-25 Cedars-Sinai Medical Center Method and system for the prediction of cardiac arrhythmias, myocardial ischemia, and other diseased condition of the heart associated with elevated sympathetic neural discharges
ME00226B (me) * 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
TW200902555A (en) 2005-01-03 2009-01-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof
JP5096167B2 (ja) 2005-01-24 2012-12-12 メドイミューン リミテッド Ｎｇｆに対する特異的結合メンバー
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
CA2615731A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Amgen Inc. Formulations that inhibit protein aggregation
BRPI0618315A2 (pt) * 2005-11-07 2011-08-23 Copenhagen University seqüências de peptìdeo derivadas de neurotrofina
US7822474B2 (en) * 2005-11-30 2010-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Methods for the prediction of arrhythmias and prevention of sudden cardiac death
WO2008049098A2 (en) * 2006-10-19 2008-04-24 Merck & Co., Inc. ANTIBODY ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-13 RECEPTOR α1
CA2669921A1 (en) 2006-11-15 2008-06-26 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to btla and methods of use
WO2008079290A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Amgen Inc Stable buffered formulations containing polypeptides
US8603950B2 (en) 2007-02-20 2013-12-10 Anaptysbio, Inc. Methods of generating libraries and uses thereof
AU2012216653B2 (en) * 2007-08-10 2013-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
EP2572729A3 (en) 2007-08-10 2013-06-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
EP2197421A1 (en) * 2007-08-31 2010-06-23 Amgen, Inc Solid-state protein formulation
ES2750254T3 (es) * 2007-09-27 2020-03-25 Amgen Inc Formulaciones farmacéuticas
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
WO2009077993A2 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Pfizer Limited Treatment of interstitial cystitis
CN102089326B (zh) * 2008-05-13 2014-12-31 诺维莫尼公司 抗白细胞介素-6/白细胞介素-6受体的抗体及其使用方法
WO2009150623A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Pfizer Inc Treatment of chronic prostatitis
EP2297203A1 (en) * 2008-06-30 2011-03-23 Novo Nordisk A/S Anti-human interleukin-20 antibodies
ES2658596T3 (es) 2008-09-19 2018-03-12 Pfizer Inc. Formulación líquida estable de anticuerpos
CN103965200B (zh) 2008-09-22 2016-06-08 阵列生物制药公司 作为trk激酶抑制剂的取代的咪唑并[1,2-b]哒嗪化合物
RS57221B2 (sr) 2008-10-22 2020-08-31 Array Biopharma Inc Jedinjenja supstituisanog pirazolo[1,5-]pirimidina kao inhibitori trk kinaze
KR101805754B1 (ko) * 2008-12-08 2017-12-07 먼디파머 인터내셔널 코포레이션 리미티드 단백질 수용체 티로신 키나아제 억제제의 조성물
AR076650A1 (es) 2009-05-04 2011-06-29 Pangenetics 110 B V Anticuerpos contra el factor de crecimiento nervioso (ngf) con una estabilidad in vivo mejorada
WO2010146511A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Pfizer Limited Treatment of overactive bladder
AR077468A1 (es) 2009-07-09 2011-08-31 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo (1,5 -a) pirimidina sustituidos como inhibidores de trk- quinasa
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
US10471212B2 (en) * 2009-10-29 2019-11-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Silicone free drug delivery devices
US9597458B2 (en) 2009-10-29 2017-03-21 W. L. Gore & Associates, Inc. Fluoropolymer barrier materials for containers
TWI505838B (zh) 2010-01-20 2015-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Stabilized antibody solution containing
JP2013520476A (ja) 2010-02-26 2013-06-06 ノヴォ ノルディスク アー／エス 安定な抗体含有組成物
MX2012010198A (es) 2010-03-01 2012-10-03 Bayer Healthcare Llc Anticuerpos monoclonales optimizados contra el inhibidor de la via del factor tisular (tfpi).
US20110256135A1 (en) 2010-03-17 2011-10-20 Wolfgang Fraunhofer Anti-nerve growth factor (ngf) antibody compositions
RU2735545C2 (ru) 2010-05-20 2020-11-03 Эррэй Биофарма Инк. Макроциклические соединения в качестве ингибиторов киназы trk
WO2011147921A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Novo Nordisk A/S Stable multi-dose compositions comprising an antibody and a preservative
SG194370A1 (en) 2010-06-07 2013-11-29 Amgen Inc Drug delivery device
AU2011291462A1 (en) 2010-08-19 2013-03-14 Zoetis Belgium S.A. Anti-NGF antibodies and their use
US11612697B2 (en) 2010-10-29 2023-03-28 W. L. Gore & Associates, Inc. Non-fluoropolymer tie layer and fluoropolymer barrier layer
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9783601B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
PT2699293T (pt) 2011-04-20 2019-05-21 Amgen Inc Aparelho de autoinjeção
EP2731439A4 (en) 2011-07-12 2014-12-03 Merck Sharp & Dohme TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS CONTAINING SAME, AND ASSOCIATED METHODS
RS56876B1 (sr) 2011-08-11 2018-04-30 Astellas Pharma Inc Novo antitelo protiv humanog ngf
AU2012322796B2 (en) 2011-10-14 2017-03-16 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US8926978B2 (en) 2011-10-25 2015-01-06 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against nerve growth factor (NGF)
US9181261B2 (en) 2012-05-22 2015-11-10 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA kinase inhibitors, compositions and methods thereof
JP6362587B2 (ja) 2012-05-22 2018-07-25 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｌ−１７ａ／ｆｉｌ−２３二重特異性抗体およびその使用
EP2859018B1 (en) 2012-06-06 2021-09-22 Zoetis Services LLC Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
JP2015535464A (ja) 2012-11-21 2015-12-14 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
JP6135161B2 (ja) * 2013-02-08 2017-05-31 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
EP2968760B1 (en) 2013-03-15 2024-01-03 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
TWI639449B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
LT2976117T (lt) 2013-03-22 2021-02-25 Amgen Inc. Purkštuvas ir surinkimo būdas
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
AU2014318017B2 (en) 2013-09-05 2020-02-06 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
WO2015039333A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015039334A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
EP3789064A1 (en) 2013-10-24 2021-03-10 Amgen, Inc Injector and method of assembly
EP3501575B1 (en) 2013-10-24 2021-12-01 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive-control
CN106459182B (zh) * 2013-12-30 2021-09-03 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
WO2015120136A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 VM Oncology LLC Compositions of compounds and uses thereof
WO2015143652A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143654A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143653A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
CA2945026C (en) 2014-05-07 2023-10-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
EP3143404B1 (en) 2014-05-16 2018-08-29 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
CA2948003C (en) 2014-06-03 2023-06-27 Amgen Inc. Drug delivery system and method of use
WO2016035052A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies for treating itching
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
SG11201703962XA (en) 2014-11-16 2017-06-29 Array Biopharma Inc Crystalline form of (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide hydrogen sulfate
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
CN104774265B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体11f1及其杂交瘤细胞株
CN104910274B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12c11及其杂交瘤细胞株
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2016146730A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Neuheart S.R.L. PEPTIDES HAVING TrkA-RECEPTOR-AGONISTIC ACTIVITY OR HAVING NGF-ANTAGONISTIC ACTIVITY
MA41842A (fr) 2015-03-31 2018-02-06 Oblique Therapeutics Ab Nouveaux procédés de sélection d'épitope
WO2016161572A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
US11260124B2 (en) 2015-05-22 2022-03-01 Astellas Pharma Inc. Anti-human NGF antibody Fab fragment and methods for treating postoperative pain related to NGF
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
LT3334747T (lt) 2015-08-13 2023-12-27 Amgen Inc. Įkrautas giluminis antigeną surišančio baltymo filtravimas
US10450367B2 (en) 2015-08-13 2019-10-22 University Of Massachusetts Human antibodies against rabies and uses thereof
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
RU2744852C2 (ru) 2015-10-26 2021-03-16 Локсо Онколоджи, Инк. Точечные мутации в устойчивых к ингибитору trk злокачественных опухолях и связанные с ними способы
JP7082568B2 (ja) 2015-12-09 2022-06-08 アムジエン・インコーポレーテツド 信号伝達キャップ付き自動注射器
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
RU2757314C2 (ru) 2016-01-22 2021-10-13 Мерк Шарп И Доум Корп. Антитела против фактора свертывания xi
CU24613B1 (es) 2016-02-06 2022-07-08 Epimab Biotherapeutics Inc Proteínas de unión a inmunoglobulinas fabs en tandem (fit-ig) biespecíficas que se unen a cmet y egfr
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US10045991B2 (en) 2016-04-04 2018-08-14 Loxo Oncology, Inc. Methods of treating pediatric cancers
KR102400423B1 (ko) 2016-04-04 2022-05-19 록쏘 온콜로지, 인코포레이티드 (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-디플루오로페닐)-피롤리딘-1-일)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)-3-하이드록시피롤리딘-1-카복사미드의 액체 제형
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
LT3800189T (lt) 2016-05-18 2023-10-10 Loxo Oncology, Inc. (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorfenil)pirolidin-1-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3- il)-3-hidroksipirolidin-1-karboksamido gavimas
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
TWI752964B (zh) 2016-06-14 2022-01-21 美商默沙東藥廠 抗凝血因子ｘｉ抗體
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
AU2017306709A1 (en) 2016-08-05 2019-03-14 Humabs, BioMed SA Anti-o2 antibodies and uses thereof
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
GB201614884D0 (en) * 2016-09-01 2016-10-19 Oblique Therapeutics Ab Method
GB201617002D0 (en) 2016-10-06 2016-11-23 Oblique Therapeutics Ab Multi-protease method
EA201990895A1 (ru) 2016-10-19 2019-10-31 Антитела к о1 и варианты их применения
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
JP7280189B2 (ja) 2017-02-17 2023-05-23 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置用の挿入機構
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
KR102627069B1 (ko) 2017-03-07 2024-01-18 암겐 인코포레이티드 과압에 의한 바늘 삽입
JP2020509837A (ja) 2017-03-09 2020-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 薬剤送達装置のための挿入機構
SG11201908328XA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Amgen Inc Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
LT3600491T (lt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc. Stūmoklio koto ir švirkšto konstrukcinė sistema ir būdas
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3641857A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
EP3641861A1 (en) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
IL271173B2 (en) 2017-07-21 2024-04-01 Amgen Inc Gas permeable sealing element for drug container and methods of assembly
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
WO2019090086A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
SG11202003004RA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Door latch mechanism for drug delivery device
MX2020005066A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Amgen Inc Autoinyector con deteccion de detencion y punto final.
AR114110A1 (es) 2018-02-28 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpo anti-trka
BR112020017701A2 (pt) 2018-03-12 2020-12-29 Zoetis Services Llc Anticorpos anti-ngf e métodos dos mesmos
KR20200135781A (ko) 2018-03-26 2020-12-03 암젠 인크 세포 배양에서 생산된 항체의 총 비푸코실화 당형태
CN108623687A (zh) 2018-04-17 2018-10-09 中山康方生物医药有限公司 神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用
JPWO2019221097A1 (ja) 2018-05-15 2021-05-27 アステラス製薬株式会社 抗ヒトｎｇｆ抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分とする心房細動の抑制用医薬組成物
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US20210128844A1 (en) 2018-07-24 2021-05-06 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US20210260279A1 (en) 2018-07-24 2021-08-26 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
WO2020023444A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710A1 (en) 2018-09-24 2021-02-04 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072577A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
MA53818A (fr) 2018-10-05 2022-01-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament ayant un indicateur de dose
IT201800009384A1 (it) 2018-10-11 2020-04-11 Cosmo Srl Peptide for cosmetic application
EP3866889A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
EA202191037A1 (ru) 2018-10-15 2021-08-05 Эмджен Инк. Устройство доставки лекарственного средства, имеющее демпферный механизм
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
US20220031939A1 (en) 2018-11-01 2022-02-03 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
AU2020263289A1 (en) 2019-04-24 2021-09-16 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
CA3152547A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN117050175A (zh) * 2020-04-17 2023-11-14 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
CN117003868B (zh) 2020-04-17 2024-04-16 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
US20230220057A1 (en) 2020-05-27 2023-07-13 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
TW202210467A (zh) 2020-05-28 2022-03-16 美商美國禮來大藥廠 TrkA抑制劑
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
AU2020204105B2 (en) * 2020-06-19 2023-06-08 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human ngf antibodies and methods using same
US11655292B2 (en) 2020-06-23 2023-05-23 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human NGF antibodies and methods using same
WO2022081824A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AU2022279223A1 (en) 2021-05-21 2023-10-19 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
AU2022289365A1 (en) 2021-06-07 2023-12-14 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023111157A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Intervet International B.V. Caninized and felinized antibodies to human ngf
WO2023212586A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting patients for treatment with an ngf antagonist
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001078698A2 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Warner-Lambert Company Use of ngf-antagonists for the prevention or treatment of chronic visceral pain
US20010046959A1 (en) * 2000-02-29 2001-11-29 Buchkovich Karen J. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
WO2002096458A1 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230691A (en) * 1978-05-23 1980-10-28 The Massachusetts General Hospital Nerve growth factor antibody and process
GB2077573A (en) 1980-06-10 1981-12-23 Kangol Magnet Ltd Vehicle seat belt connection device
US4786593A (en) * 1985-04-16 1988-11-22 Wistar Institute Of Anatomy And Biology Diagnostic method for detection of neural crest disease
JP2969647B2 (ja) 1988-09-14 1999-11-02 東ソー株式会社 モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法
SE465573B (sv) 1989-03-14 1991-09-30 Lope Medicine Ab Nervtillvaextfaktorpeptider, motsvarande antikroppar och foerfarande foer bestaemning av nativ nervtillvaextfaktor
US5656435A (en) * 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
ES2109225T3 (es) 1989-08-28 1998-01-16 Takeda Chemical Industries Ltd Anticuerpos, su produccion y uso.
JPH03163095A (ja) 1989-08-28 1991-07-15 Takeda Chem Ind Ltd ヒト神経成長因子の部分ペプチド、抗体およびその用途
JP3232415B2 (ja) 1990-08-29 2001-11-26 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体，その製造法および用途
US6300129B1 (en) * 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JPH06317587A (ja) 1990-08-31 1994-11-15 Takeda Chem Ind Ltd 抗体およびその用途
US5147294A (en) * 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
JPH0576384A (ja) 1991-09-20 1993-03-30 Hitachi Ltd 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体
JP3519096B2 (ja) 1992-07-02 2004-04-12 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途
US5844092A (en) * 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5877016A (en) * 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9616105D0 (en) * 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
US7322122B2 (en) 1997-01-15 2008-01-29 Draka Comteq B.V. Method and apparatus for curing a fiber having at least two fiber coating curing stages
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
NZ517150A (en) * 1999-08-27 2005-01-28 Genentech Inc Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
WO2004006955A1 (en) * 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
WO2003033538A1 (fr) 2001-10-15 2003-04-24 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Anticorps anti-hlr-dr
JP2005516965A (ja) * 2001-12-28 2005-06-09 アブジェニックス・インコーポレーテッド 抗ｍｕｃ１８抗体を使用する方法
US6919426B2 (en) * 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
DE60335957D1 (de) 2002-10-08 2011-03-17 Rinat Neuroscience Corp Verfahren zur behandlung von postoperativen schmerzen durch verabreichung eines antikörpers gegen nervenwachstumsfaktor und diesen enthaltende zusammensetzungen
CA2921578C (en) * 2002-12-24 2017-02-14 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
EP1468999A1 (en) * 2003-03-20 2004-10-20 MyoContract Ltd. Substituted piperidine and piperazine derivatives as melanocortin-4 receptor modulators
DK1648509T3 (da) 2003-07-15 2013-01-07 Amgen Inc Humane anti-NGF-neutraliserende antistoffer som selektive NGF-pathway-inhibitorer
JP5096167B2 (ja) 2005-01-24 2012-12-12 メドイミューン リミテッド Ｎｇｆに対する特異的結合メンバー

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010046959A1 (en) * 2000-02-29 2001-11-29 Buchkovich Karen J. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
WO2001078698A2 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Warner-Lambert Company Use of ngf-antagonists for the prevention or treatment of chronic visceral pain
WO2002096458A1 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLT, L.J. HERRING, C. JESPERS, L.S. WOOLVEN, B.P. TOMLINSON, I.M.: "Domain antibodies: proteins for therapy", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY., ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE., GB, vol. 21, no. 11, 1 November 2003 (2003-11-01), GB, pages 484 - 490, XP004467495, ISSN: 0167-7799, DOI: 10.1016/j.tibtech.2003.08.007 *

Also Published As

Publication number Publication date
US8198410B2 (en) 2012-06-12
IL173076A0 (en) 2006-06-11
IL214281A0 (en) 2011-08-31
WO2005019266A2 (en) 2005-03-03
HK1088534A1 (en) 2006-11-10
MXPA06000583A (es) 2006-03-30
CA2534585A1 (en) 2005-03-03
CA2534585C (en) 2012-02-21
EA201000245A1 (ru) 2010-12-30
JP2012161316A (ja) 2012-08-30
RS20060022A (en) 2008-06-05
TW201534621A (zh) 2015-09-16
US7795413B2 (en) 2010-09-14
TW200513468A (en) 2005-04-16
US20050074821A1 (en) 2005-04-07
US20090155274A1 (en) 2009-06-18
US7601818B2 (en) 2009-10-13
PT1648509E (pt) 2012-10-18
JP2010162028A (ja) 2010-07-29
IL173076A (en) 2015-10-29
CN102358903B (zh) 2017-04-26
UA115960C2 (uk) 2018-01-25
GEP20146050B (en) 2014-03-10
US20080033157A1 (en) 2008-02-07
BRPI0412567B1 (pt) 2017-03-21
GEP20196963B (en) 2019-04-10
JP2007537703A (ja) 2007-12-27
AR075790A2 (es) 2011-04-27
TW201311721A (zh) 2013-03-16
IL214280A0 (en) 2011-08-31
TW200911833A (en) 2009-03-16
ZA200600847B (en) 2007-01-31
IL214281A (en) 2016-07-31
CN1849138A (zh) 2006-10-18
AU2004267030A1 (en) 2005-03-03
EA200600254A1 (ru) 2006-12-29
PL1648509T3 (pl) 2013-02-28
US20110040076A1 (en) 2011-02-17
JP2017079782A (ja) 2017-05-18
AR045056A1 (es) 2005-10-12
EA030259B8 (ru) 2018-09-28
IL206823A0 (en) 2011-08-01
MEP31508A (en) 2010-10-10
EP1648509B8 (en) 2012-10-24
US20160304596A1 (en) 2016-10-20
JP5264798B2 (ja) 2013-08-14
MX341869B (es) 2016-09-06
CY1113167T1 (el) 2016-04-13
WO2005019266A3 (en) 2005-04-28
JP2015042670A (ja) 2015-03-05
ME02785B (me) 2012-12-31
NO20060381L (no) 2006-03-22
US20160237147A1 (en) 2016-08-18
TWI635096B (zh) 2018-09-11
EA013614B1 (ru) 2010-06-30
DK1648509T3 (da) 2013-01-07
CN102408483A (zh) 2012-04-11
HRP20060033A2 (en) 2007-04-30
HK1096310A1 (en) 2007-06-01
UA97086C2 (ru) 2012-01-10
TNSN06010A1 (en) 2007-10-03
CN1849138B (zh) 2011-11-30
CN102358903A (zh) 2012-02-22
EP1648509B1 (en) 2012-09-12
JP2012250986A (ja) 2012-12-20
TWI382031B (zh) 2013-01-11
TWI503328B (zh) 2015-10-11
NZ544751A (en) 2009-05-31
JP5965964B2 (ja) 2016-08-10
TWI385180B (zh) 2013-02-11
AU2010202177A1 (en) 2010-06-17
NZ599196A (en) 2014-01-31
NZ588527A (en) 2012-06-29
JP4489077B2 (ja) 2010-06-23
EP1648509A2 (en) 2006-04-26
HRP20120882T1 (hr) 2013-02-28
US8106167B2 (en) 2012-01-31
RS52332B (en) 2012-12-31
JP2010006812A (ja) 2010-01-14
SI1648509T1 (sl) 2012-12-31
MA27952A1 (fr) 2006-06-01
CN102408483B (zh) 2016-06-08
BRPI0412567A (pt) 2006-09-19
HRP20060033B1 (hr) 2014-02-28
AU2010202177B2 (en) 2013-12-12
ES2392954T3 (es) 2012-12-17
GEP20104887B (en) 2010-02-10
AU2004267030B2 (en) 2010-06-17
IL241874A0 (en) 2015-11-30
EP2364728A1 (en) 2011-09-14
US20110091476A1 (en) 2011-04-21
JP2015155413A (ja) 2015-08-27
RS20100555A (en) 2011-08-31
SG10201404744RA (en) 2014-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030259B1 (ru) Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf
JP5594982B2 (ja) 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
ES2863626T3 (es) Anticuerpos DKK1 y métodos de uso
EA011876B1 (ru) АНТИТЕЛА К IFN-γ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ
EA021669B1 (ru) Нейтрализующие антитела человека против b7rp1
KR20120117007A (ko) 선택적인 ngf 경로 억제제로서의 인간 항-ngf 중화 항체
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
EA015916B1 (ru) Моноклональные антитела к миостатину и их применения
EA015589B1 (ru) Антитела против миостатина и их применение
CN101970472A (zh) Rtef-1变体及其用于抑制血管发生的用途
CN118063612A (zh) 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途
AU2016247195A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
AU2013260740A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU