EA013614B1 - Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения - Google Patents

Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения Download PDF

Info

Publication number
EA013614B1
EA013614B1 EA200600254A EA200600254A EA013614B1 EA 013614 B1 EA013614 B1 EA 013614B1 EA 200600254 A EA200600254 A EA 200600254A EA 200600254 A EA200600254 A EA 200600254A EA 013614 B1 EA013614 B1 EA 013614B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
heavy chain
light chain
Prior art date
Application number
EA200600254A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600254A1 (ru
Inventor
Кеннет Д. мл. Уайлд
Джеймс Дж. С. Тринор
Хайчунь Хуан
Хизер Иноу
Те Дж. Чжан
Франк Мартин
Original Assignee
Амджен Инк.
Медарекс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амджен Инк., Медарекс Инк. filed Critical Амджен Инк.
Publication of EA200600254A1 publication Critical patent/EA200600254A1/ru
Publication of EA013614B1 publication Critical patent/EA013614B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Abstract

В данном изобретении предложены антитела, которые взаимодействуют или связываются с фактором роста нервов (NGF) человека и посредством этого нейтрализуют функцию NGF. В изобретении также предложены фармацевтические композиции указанных антител и способы нейтрализации функции NGF, в частности, с целью лечения связанных с NGF расстройств (например, хронической боли) путем введения фармацевтически эффективного количества антител к NGF. Также предложены способы определения количества NGF в образце с использованием антител к NGF.

Description

Данная заявка является родственной временной заявке США № 60/487431, поданной 15 июля 2003 г., по которой и испрашивается приоритет и описание которой включено сюда путем ссылки.
Область изобретения
Изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связывают фактор роста нервов (ΝΟΕ). Также раскрыты композиции и способы лечения боли и расстройств, связанных с болью.
Предшествующий уровень техники
Ежедневно более двух миллионов человек в США теряют трудоспособность по причине хронической боли (беззеИ апб Ке11у, 1991, Рат апб АпаЦема ίη РКЖС1РЬЕ§ ОЕ ΝΕυΚΑΤ 8ΟΙΕΝΟΕ, 3тб Еб. (Капбе1, 8е11\\'аг1х. апб Йс55с11. еб.), Е15е\зег. №\ν Уотк). К сожалению, современные варианты терапевтического лечения боли эффективны лишь отчасти, и многие из этих методов сами по себе вызывают расстройства или дают вредные побочные эффекты. Так, несмотря на то, что нестероидные противовоспалительные лекарства (НСПВЛ), такие как аспирин, ибупрофен и индометацин, являются умеренно эффективными против воспалительной боли, они также токсичны для почек и в высоких дозах имеют тенденцию вызывать желудочно-кишечное раздражение, язвы, кровотечение, а также спутанность сознания. Пациенты, которых лечат опиоидами, также часто испытывают спутанность сознания, а долгосрочное применение опиоидов связано с толерантностью и зависимостью. Местные анестетики, такие как лидокаин и мексилетин, ингибируют боль и одновременно вызывают потерю нормальной чувствительности.
Боль представляет собой восприятие, основанное на сигналах, полученных из окружающей среды и передаваемых и интерпретируемых нервной системой (в качестве обзора см. М111ап, 1999, Ргод. №итоЬю1. 57: 1-164). Повреждающие стимулы, такие как тепло и прикосновение, заставляют специализированные сенсорные рецепторы в коже посылать сигналы в центральную нервную систему (ЦНС). Этот процесс называется ноцицепцией, и периферические сенсорные нейроны, которые опосредуют его, представляют собой ноцицепторы. В зависимости от силы сигнала от ноцицептора(ов) и абстрагирования и обработки этого сигнала ЦНС человек может воспринимать или не воспринимать повреждающий стимул как болезненный. Когда чье-либо восприятие боли точно калибровано по интенсивности стимула, боль выполняет предназначенную ей защитную функцию. Однако некоторые типы повреждения ткани вызывают явление, известное как гипералгезия или проноцицепция, при котором относительно безвредные стимулы воспринимаются как интенсивно болезненные, поскольку болевые пороги человека снижены. Как воспаление, так и повреждение нерва может вызвать гипералгезию. Лица, пораженные воспалительными состояниями, такими как солнечный ожог, остеоартрит, колит, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы (которые включают ревматоидный артрит и волчанку) и тому подобное, часто испытывают повышенную чувствительность к боли. Подобным образом, травма, операция, ампутация, абсцесс, каузалгия, сосудистые коллагенозы, демиелинизирующие заболевания, невралгия тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, инфекционный герпес, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапия вызывают повреждения нервов, которые приводят к обширной боли.
Поскольку механизмы, посредством которых ноцицепторы передают внешние сигналы в нормальном состоянии и в состоянии гипералгезии, становятся более понятными, процессы, вовлеченные в гипералгезию, могут быть мишенями ингибирования снижения болевого порога и посредством этого уменьшить количество испытываемой боли.
Показано, что нейротрофические факторы играют значительные роли в передаче физиологической и патологической боли. Фактор роста нервов (ΝΟΕ) оказывается особенно важным (в качестве обзора см. МсМаНоп, 1996, РЫ1. Ттапк. К. 8ос. Ьопб. 351: 431-40 и Ар1е1, 2000, ТНе СБшса1 Йоитпа1 οί Раш 16 : 87811). Показано, что как местное, так и системное введение ΝΟΕ вызывает гипералгезию и аллодинию (Ъе\\зп е! а1., 1994, Еиг. ί. №иго8С1. 6: 1903-1912). Внутривенная инфузия ΝΟΕ приводит у людей к миалгии всего тела, тогда как местное введение вызывает гипералгезию и аллодинию места инъекции помимо системных эффектов (Αрίе1 е! а1., 1998, №ито1оду 51: 695-702).
Существует также значительная масса данных о вовлечении эндогенного ΝΟΕ в состояния, при которых боль является существенным признаком. Например, ΝΟΕ положительно регулируется в Шванновских клетках спинного корневого ганглия (ИКС, бог§а1 гоо1 дапдБоп) в течение по меньшей мере 2 месяцев после повреждения периферического нерва, и сообщалось о повышенных уровнях в суставах животных, страдающих рядом моделей артрита (например, А1ое е! а1., 1993, Сго\\1Н РасЮг5 9: 149-155). Что касается людей, уровни ΝΟΕ повышены в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным или другими типами артрита (например, А1ое е! а1.,1992. АтШпШ апб Кбеитайкт 35: 351-355). Кроме того, продемонстрировано, что антагонизм функции ΝΟΕ предупреждает гипералгезию и аллодинию в моделях невропатологической и хронической воспалительной боли. Например, в животных моделях невропатологической боли (например, лигирование нервного ствола или спинно-мозгового нерва) системная инъекция нейтрализующих антител к ΝΟΕ предупреждает как аллодинию, так и гипералгезию (Катет е! а1., 1999, Еиг. 1. №иго8С1. 11: 837-846 и Ко е! а1., 1999, Рат 79: 265-274). Примеры антител к ΝΟΕ, известных в данной области, включают, например, РСТ публикации АО 01/78698, АО 01/64247, АО 02/096458 и АО 2004/032870; патенты США №№ 5844092, 5877016 и 6153189; Нопдо с! а1., 2000, НуЬпбота 19: 215
- 1 013614
227; Нопдо е!а1., 1993, Се11. Мо1. Βίο1. 13: 559-568 и СепВапк Лссеззюп№№И39608, И39609, Й17078 или Й17077.
Понятно, что существует необходимость в новых безопасных и эффективных методах терапии боли, в частности, направленных на низкомолекулярные медиаторы или агенты, обостряющие боль, такие как ΝΟΡ.
Краткое изложение сущности изобретения
В данном изобретении предложены новые человеческие моноклональные антитела, которые являются терапевтически полезными для устранения боли. Конкретно, согласно изобретению, предложены моноклональные антитела, которые связываются с фактором роста нервной ткани (ΝΟΡ). Предпочтительно эти моноклональные антитела представляют собой человеческие моноклональные антитела и нейтрализуют биологическую активность ΝΟΡ, а также являются полезными для облегчения эффектов ΝΟΡ-опосредованных болевых ответов. Также изобретением предложены клетки, которые продуцируют и наиболее предпочтительно секретируют в клеточную культуральную среду моноклональные антитела по изобретению. Помимо их применения для лечения и устранения боли, антитела по изобретению полезны для лечения невропатологических и воспалительных ответов, связанных с болью.
Далее согласно изобретению предложены слитые белки, содержащие последовательность Есучастка антитела и одну или более чем одну последовательность, идентифицированную как 8ЕО ГО N0: 10, 81Т) ГО N0: 12, 81Т) ГО N0: 14, 8Ер ГО N0: 16, 81Т) ГО N0: 18, 81Т) ГО N0: 20, 81Т) ГО N0: 22 и 8Е0 ГО N0: 79-130. Такие молекулы могут быть получены методами, описанными, например, в заявке \У0 00/24782, которая включена сюда путем ссылки. Такие молекулы можно экспрессировать, например, в клетках млекопитающих (например, в клетках яичника китайского хомячка) или в бактериальных клетках (например, в клетках Е. сой).
В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие антитела и человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4 или 8Е0 ГО N0: 6, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Предпочтительно тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 4.
В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно человеческие антитела и более предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из константных областей тяжелой цепи 1дС1, 1дС2. 1дС3. 1дС4. 1дМ, 1дЛ и 1дЕ или любых их аллельных вариантов (как раскрыто в Кайа! е! а1., 1991, Зециепсек οί Рто1еш8 οί 1ттипо1ощса1 1п1еге81, Е1йй Ебйюп, и. 8. Эераг1теп1 οί Неайй апб Нитап 8егу1се5, МН Риййсайоп №. 91-3242), включенной сюда путем ссылки, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Предпочтительно антитело по изобретению содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи 1дС2, показанной 8Е0 ГО N0: 4, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно человеческие антитела и более предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 8, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах антитела по изобретению содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В других аспектах вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В дополнительных аспектах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из 8Е0 ГО N0: 14, 8Е0 ГО N0: 18 или 8Е0 ГО N0: 20, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В следующих дополнительных аспектах легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из 8Е0 ГО N0: 16, 20, 24, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Изобретением также предложены антитела, которые специфично связываются с НСЕ, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в
- 2 013614
8ЕО Ш N0: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Далее согласно изобретению предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связываются с ΝΟΕ, содержащие:
(а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 79, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 80, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина;
(б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 81, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 82, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина;
(в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 83, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 84, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина; либо (г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 86, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 87, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах изобретения также предложены антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, причем эта вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 Ш N0: 10, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, причем эта вариабельная область легкой цепи включает в себя последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 Ш N0: 12, причем указанное антитело специфично связывается с NСΕ.
В изобретении также предложены антитела, которые специфично связываются с NСΕ. в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную 8Е0 Ш N0: 14, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную 8Е0 Ш N0: 16, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
В некоторых аспектах в изобретении также предложены антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, причем эта вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из 8Е0 Ш N0: 14, 8Е0 Ш N0: 18 или 8Е0 Ш N0: 22, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, причем эта вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 Ш N0: 16, где это антитело специфично связывается с NСΕ.
В изобретении также предложены одноцепочечные антитела, одноцепочечные Εν-антитела, Е(аЬ)антитела, Е(аЬ)'-антитела и (ЕаЬ')2-антитела.
В конкретных аспектах изобретения предложена легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 Ш N0: 16, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Кроме того, в изобретении предложена тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в любой из 8Е0 Ш N0: 14, 8Е0 Ш N0: 18 или 8Е0 Ш N0: 22, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Изобретение также относится к изолированным человеческим антителам, которые специфично свя
- 3 013614 зывают ΝΟΕ, содержащим: (а) каркасные участки тяжелой цепи человека, СЭК1 область тяжелой цепи человека, СЭК2 область тяжелой цепи человека и СЭКЗ область тяжелой цепи человека; и (б) каркасные участки легкой цепи человека, СЭК1 область легкой цепи человека, СЭК2 область легкой цепи человека и СЭКЗ область легкой цепи человека. В некоторых аспектах СЭК1 область тяжелой цепи человека может представлять собой СОК! область тяжелой цепи моноклонального антитела (шЛЬ), обозначенную как 4Ό4, показанную в 8ЕО ГО N0: 22, и СЭК1 область легкой цепи человека может представлять собой СОК! область легкой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Е0 ГО N0: 24. В других аспектах СЭК 2 область тяжелой цепи человека может представлять собой ί'ΌΒ2 область тяжелой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Е0 ГО N0: 18, и СЭК2 область легкой цепи человека может представлять собой СЭК2 область легкой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Е0 ГО N0: 20. В некоторых других аспектах СЭКЗ область тяжелой цепи человека представляет собой СЭКЗ область тяжелой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Е0 ГО N0: 14, и СЭКЗ область легкой цепи человека представляет собой СЭКЗ область легкой цепи тАЬ 4Ό4, показанную в 8Е0 ГО N0: 16.
В изобретении также предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связывают фактор роста нервов, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ГО N0: 10, 8Е0 ГО N0: 79, 8ЕО ГО N0: 81, 8ЕО ГО N0: 83, 8ЕО ГО N0: 85 или 8ЕО ГО N0: 87, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Далее в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связывают NСΕ, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь включает в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 80, 81А) ГО N0: 82, 8ЕО ГО N0: 84, 81А) ГО N0: 86, 8ЕО ГО N0: 88, 8ЕО ГО N0: 89, 81А) ГО N0: 90, 8Е0 ГО N0: 91 или 8Е0 ГО N0: 131, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Антитела по изобретению характеризуются способностью антагонизировать по меньшей мере одну активность ίη νίίτο и/или ίη νίνο, связанную с полипептидами NСΕ. Предпочтительно в изобретении предложены изолированные человеческие антитела к человеческому NСΕ с высоким аффинитетом связывания с этими полипептидами NСΕ, причем указанные антитела связываются с человеческим полипептидом NСΕ и диссоциируют от человеческого полипептида NСΕ с константой диссоциации (Кс) примерно 50х10-12 М или менее, как определено с помощью КшЕхА, или антитела, которые ингибируют индуцированное NСΕ выживание в анализе нейтрализации ίη νίίτο при 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
В предпочтительном воплощении изобретения предложено изолированное человеческое антитело к человеческому NСΕ, которое имеет приведенные ниже характеристики:
а) ингибирует индуцированное NСΕ выживание в анализе нейтрализации ίη νίίτο при 1С50 примерно 1 х 10-9 М или менее;
б) имеют СЭКЗ тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 14, и
в) имеют СЭКЗ легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 16.
В изобретении также предложены изолированные человеческие антитела или их антигенсвязывающие или иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулина, которые специфично связываются с NСΕ с высоким аффинитетом, прчием указанные антитела или фрагменты диссоциируют от человеческого полипептида NСΕ при Кс примерно 1х10-9 или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого NСΕ в стандартном анализе ίη νίίτο при 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее, и где указанные антитела или фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя:
а) область СЭКЕ содержащую аминокислотную последовательность формулы
где а1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а2 представляет собой ароматический аминокислотный остаток; а3 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный, ароматический аминокислотный остаток; а4 представляет собой нейтральный гидрофобный или алифатический аминокислотный остаток и а5 представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток;
б) область ί'ΌΒ2. содержащую аминокислотную последовательность формулы
Ь1Ь2Ь3Ь4Ь5Ь6Ь7ЬеЬ9Ь10Ь11Ь12Ь13Ь14Ь15Ь16Ь17 где Ь1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь3 представляет собой полярный гидрофильный или ароматический аминокислотный остаток; Ь4 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; Ь5-Ь9 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические аминокислотные остатки; Ь10 представляет собой полярный гидрофильный, ароматический или алифатический аминокислотный остаток; Ь11 представляет собой ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь12 представляет собой
- 4 013614 алифатический гидрофобный или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь13 представляет собой алифатический, гидрофобный или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь14 и Ь16 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; Ь15 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток и Ь17 представляет собой алифатический кислый аминокислотный остаток и
в) область ί.ΌΡ3. содержащую аминокислотную последовательность формулы
где с1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с2 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с3 и с4 независимо отсутствуют или представляют собой полярные гидрофильные. ароматические гидрофобные или алифатические аминокислотные остатки; с5 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный. алифатический или ароматический аминокислотный остаток; с6 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с7 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с8 представляет собой полярный гидрофильный. гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; с9 представляет собой полярный гидрофильный. алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с10 представляет собой полярный гидрофильный. ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с11-с13 независимо представляют собой полярные гидрофильные или ароматические гидрофобные аминокислотные остатки; с14 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с15 представляет собой полярный гидрофильный или нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; с16 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и с17 представляет собой ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток.
В одном аспекте а1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а2 представляет собой ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; а3 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; а4 представляет собой нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; а5 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь1 представляет собой алифатический или ароматический аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой 11е; Ь3 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь4 представляет собой полярный гидрофильный или ароматический аминокислотный остаток; Ь5-Ь9 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические аминокислотные остатки; Ь10 представляет собой алифатический аминокислотный остаток; Ь11 представляет собой Туг; Ь12 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь13 представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; Ь14 и Ь16 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; Ь15 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь17 представляет собой алифатический кислый аминокислотный остаток; с1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с2 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с3 и с4 независимо отсутствуют или представляют собой полярные гидрофильные. ароматические гидрофобные или алифатические аминокислотные остатки; с5 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; с6 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с7 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с8 представляет собой полярный гидрофильный. гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; с9 представляет собой полярный гидрофильный. алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с10 представляет собой полярный гидрофильный. ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с11-с13 независимо представляют собой полярные гидрофильные или ароматические гидрофобные аминокислотные остатки; с14 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с15 представляет собой полярный гидрофильный или нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; с16 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и с17 представляет собой ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток.
В конкретном аспекте а1 представляет собой 8ег. Абр или ТЬг; а2 представляет собой Туг; а3 представляет собой А1а. 8ег. Тгр или 61у; а4 представляет собой Ме! или 11е; а5 представляет собой Н1б. 61у или Абп; Ь1 представляет собой Туг. 61у. 11е или Абр; Ь2 представляет собой 11е; Ь3 представляет собой 8ег. ТЬг. Туг или Абп; Ь4 представляет собой Тгр. Агд или Рго; Ь5 представляет собой 8ег. Абп или 61у; Ь6 представляет собой 8ег. Агд. Абр или 61у; Ь7 представляет собой 8ег. Н1б или 61у; Ь8 представляет собой 8ег. 11е. Абр или ТЬг; Ь9 представляет собой Ьеи. 11е или ТЬг; Ь10 представляет собой 61у. Ьуб или РЬе; Ь11 представляет собой Туг; Ь12 представляет собой А1а или 8ег; Ь13 представляет собой Абр. 61у или Рго; Ь14 представляет собой 8ег; Ь15 представляет собой Уа1 или РЬе; Ь16 представляет собой Ьуб или 61п; Ь17 представляет собой С1у; с1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с2 отсутствует или представляет собой Туг; с3 и с4 независимо отсутствуют. представляют собой Туг. Абп. Уа1 или С1и; с5 отсутствует. представляет собой 8ег. С1у или Тгр; с6 отсутствует. представляет собой 8ег.
- 5 013614
01у, С1и или Ьеи; с7 представляет собой 01у, Агд или Акр; с8 представляет собой Тгр, Рго, 8ег или Тйг; с9 представляет собой Н1к, 01у или Туг; с10 представляет собой Уа1, Туг или Агд; с-с13 независимо представляют собой 8ег, Рке. Туг, Акр или Акп; с14 представляет собой Рке. Уа1 или 01у; с15 представляет собой Ме! или Акр; с16 отсутствует, представляет собой Акр или Акп и с17 представляет собой Туг или Уа1.
В другом конкретном аспекте а1 представляет собой 8ег или Акр; а2 представляет собой Туг; а3 представляет собой А1а или 8ег; а4 представляет собой Ме! или Не; а5 представляет собой Н1к или Акп; Ь1 представляет собой Туг или 01у; Ь2 представляет собой Не; Ь3 представляет собой 8ег, Ткг, Туг или Акп; Ь4 представляет собой Тгр, Агд или Рго; Ь5 представляет собой 8ег или Акп; Ь6 представляет собой 8ег или Агд; Ь7 представляет собой Н1к или 01у; Ь3 представляет собой 11е или Ткг; Ь9 представляет собой Ьеи, 11е или Ткг; Ь10 представляет собой 01у или Рке; Ь11 представляет собой Туг; Ь12 представляет собой А1а или 8ег; Ь13 представляет собой Акр или 01у; Ь14 представляет собой 8ег; Ь15 представляет собой Уа1 или Рке; Ь16 представляет собой Ьук или С1п; Ь17 представляет собой 01у; с1 отсутствует или представляет собой 01у; с2 отсутствует или представляет собой Туг; с3 и с4 независимо отсутствуют, представляют собой Туг, 01у или Уа1; с5 отсутствует или представляет собой 8ег; с6 представляет собой 8ег или 01у; с7 представляет собой 01у или Агд; с8 представляет собой Тгр или Рго; с9 представляет собой Н1к, 01у или Туг; с10 представляет собой Уа1 или Туг; с11-с13 независимо представляют собой 8ег, Туг, Рке или Акр; с14 представляет собой Рке или Уа1; с15 представляет собой Ме! или Акр; с16 отсутствует или представляет собой Акр и с17 представляет собой Туг или Уа1.
В других конкретных аспектах изобретения:
а) СОРТ тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 22; ί.ΌΗ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 18; и СЭН3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 14;
б) ί.ΌΗ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 92; ί.ΌΗ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 93; и СЭН3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 94;
в) ί.ΌΗ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 98; ί.ΌΗ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 99; и СЭН3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 100;
г) ί.ΌΗ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 104; ί.ΌΗ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 105; и СЭН3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 106;
д) ί.ΌΗ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 110; ί.ΌΗ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 111; и СЭН3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 112; и
е) ί.ΌΗ1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 116; ί.ΌΗ2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 117; и СЭН3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 118.
В изобретении также предложено изолированное человеческое антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, которое специфично связывается с N0?, причем указанное антитело или фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, включающую в себя:
а) область СЭРЕ содержащую аминокислотную последовательность формулы
где а1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а2, а11 и а12 независимо представляют собой алифатические или гидрофобные аминокислотные остатки; а3, а5, а7 и а8 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; а4 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а6 представляет собой алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; а9 отсутствует или представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток и а10 представляет собой алифатический, ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток;
б) область СОК2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
Ь1Ь2Ь3Ь4Ь5Ь6Ь7 где Ь1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь3 и Ь4 независимо представляют собой полярные гидрофильные, алифатические или гидрофобные аминокислотные остатки; Ь5 представляет собой полярный гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь6 представляет собой полярный гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток и Ь7 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и
в) область СОК3, содержащую аминокислотную последовательность формулы
где с1 и с2 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; с3 пред
- 6 013614 ставляет собой полярный гидрофильный, алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; с4, с5 и с6 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; с7 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с8 представляет собой полярный гидрофильный или гидрофобный аминокислотный остаток и с9 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток, и где указанное антитело или фрагмент диссоциирует от человеческого полипептида ΝΟΕ с Кс примерно 1х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ΝΟΕ в стандартном анализе ίη νίίτο при 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
В одном аспекте а1, а3, а4, а7 и а8 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; а2, а6, а11 и а12 независимо представляют собой алифатические гидрофобные аминокислотные остатки; а5 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; а9 отсутствует или представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а10 представляет собой алифатический или ароматический аминокислотный остаток; Ь1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или гидрофобный аминокислотный остаток; Ь2 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; Ь3, Ь4 и Ь7 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; Ь5 и Ь6 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические гидрофобные аминокислотные остатки; с1 и с2 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; с3 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; с4, с5 и с6 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; с7 отсутствует или представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с8 представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток и с9 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток.
В частности, а1, а3, а4 и а7 представляют собой Агд, 8ет, С1п и 8ет соответственно; а2 представляет собой А1а; а5 представляет собой 61у или 8ет; а8 представляет собой 8ет или 11е; а9 отсутствует, представляет собой 8ет или 61у; а10 представляет собой А1а, Туг, Тгр или Р1е; Ь1 представляет собой Акр, 61у, А1а или Уа1; Ь2 и Ь3 представляют собой А1а и 8ет соответственно; Ь4 представляет собой 8ет или Акп; Ь5 представляет собой Ьеи или Агд; Ь6 представляет собой С1и. А1а или С1п; Ь7 представляет собой 8ет или Т1п; с1 и с2 представляют собой 61п; с3 представляет собой Р1е, Туг, Агд или А1а; с4 представляет собой Акп, 61у или 8ет; с5 представляет собой 8ет или Акп; с6 представляет собой Туг, 8ет, Тгр или Р1е; с7 отсутствует, представляет собой Рго или Ηίκ; с8 представляет собой Ьеи, Тгр, Туг или Агд и с9 представляет собой Т1г.
В другом частном случае а1, а2, а3, а4 и а7 представляют собой Агд, А1а, 8ет, 61п и 8ет соответственно; а5 представляет собой С1у или 8ет; а8 представляет собой 8ет или Не; а9 отсутствует, представляет собой 8ет или 61у; а10 представляет собой А1а или Туг; Ь1 представляет собой Акр или 61у; Ь2 и Ь3 представляют собой А1а и 8ет, соответственно; Ь4 представляет собой 8ет или Акп; Ь5 представляет собой Ьеи или Агд; Ь6 представляет собой 61и, А1а или 61п; Ь7 представляет собой 8ет или Т1г; с1 и с2 представляют собой 61п; с3 представляет собой Р1е, Туг, Агд или А1а; с4 представляет собой Акп, 61у или 8ет; с5 представляет собой 8ет или Акп; с6 представляет собой Туг, 8ет, Тгр или Р1е; с7 отсутствует, представляет собой Рго или Н1к; с8 представляет собой Ьеи, Тгр, Туг или Агд и с9 представляет собой Т1г. В других частных случаях изобретения:
а) СОРТ легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ N0: 24; СОРТ легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 20; и 0ΌΡ3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 16;
б) ί.ΌΡ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 95; ί.ΌΡ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 96; и СЭР3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 97;
в) ί.ΌΡ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 101; ί.ΌΡ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 102; и СЭР3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 103;
г) ί.ΌΡ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 107; ί.ΌΡ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 108; и СЭР3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 109;
д) ί.ΌΡ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 113; ί.ΌΡ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 114; и СЭР3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 115;
е) ί.ΌΡ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 119; ί.ΌΡ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 120; и СЭР3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 121;
ж) ί.ΌΡ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 122; ί.ΌΡ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 123; и СЭР3
- 7 013614 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 124;
з) СЭК1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 125; ί.ΌΚ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 126; и СЭК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 127;
и) ί.ΌΚ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 128; ί.ΌΚ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 129; и СЭК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 130 и
к) ί.ΌΚ1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 132; ί.ΌΚ2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 133; и СЭК3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 134.
Часть изобретения также составляют полинуклеотидные последовательности, которые кодируют новые человеческие антитела к человеческому N0?, векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие человеческие антитела к человеческому N0?, клетки-хозяева, трансформированные векторами, включающими полинуклеотиды, которые кодируют человеческие антитела к человеческому N0?, препараты, содержащие человеческие антитела к человеческому N0?, и способы их получения и применения.
В изобретении также предложены способы определения уровня N0? в биологическом образце, при котором этот образец приводят в контакт с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитело анти-Ы0Е по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы, анализы иммунопреципитации и твердофазные иммуноферментные анализы (ЕЬ18А) (см. 8о1а, 1987, Мопос1опа1 АибЬоЛек: А Мапиа1 о£ Тсс11пк|ис5. рр. 147-158, СЯС Ргс55. 1пс.) для обнаружения и количественного определения N0?. Указанные антитела могут связывать N0? с аффинитетом, который соответствует используемому способу анализа.
Кроме того, в изобретении предложены способы лечения заболевания, связанного с повышенным продуцированием N0? или с повышенной чувствительностью к N0?, при которых индивидууму, нуждающемуся в этом, вводят фармацевтически эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело по изобретению или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
Конкретные предпочтительные воплощения изобретения станут очевидны из приведенного ниже более подробного описания конкретных предпочтительных воплощений и формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлены графики, которые демонстрируют нейтрализацию активности N0? в основанном на нейронах ΌΚ0 количественном определении биологической активности моноклональными антителами 4Ό4, очищенными из кондиционированной среды гибридомы.
На фиг. 2 представлены графики, которые демонстрируют экспрессию УЯ1, стимулированную активностью человеческого N0?, и нейтрализацию активности N0? в основанном на нейронах ΌΚ0 количественном определении биологической активности моноклональным антителом к N0? (4Ό4), очищенным из кондиционированной среды гибридомы.
На фиг. 3 представлены графики, которые демонстрируют нейтрализацию активности N0? в основанном на нейронах ΌΚ0 количественном определении биологической активности транзитно экспрессирующимися рекомбинантными моноклональными антителами анти-Ы0Е 4Ό4, экспрессированными либо в виде 1д01, либо в виде 1д02, в клетках, выращенных либо в роллерной культуре (Я), либо в спинкультуре (с постоянным перемешиванием) (8).
На фиг. 4 представлено сопоставление последовательностей нейротрофинов. Цифры и элементы вторичной структуры над последовательностью относятся к зрелому человеческому N0?. Консервативные остатки отмечены звездочками, а области с низкой гомологией последовательности затемнены. N0? человека представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 135; N0? мыши представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 136; ВОЯ? представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 137; ЫТ3 представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 138.
На фиг. 5 показано сопоставление СОК! тяжелой цепи антитела к N0? и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕО ГО N0: 98), 6Н9 (8ЕО ГО N0: 104), 7Н2 (8ЕЕ) ГО N0: 110), 406 (8ЕО ГО N0: 116), 14Ό11 (8ЕЕ) ГО N0: 92) и 4Ό4 (8ЕЕ) ГО N0: 22).
На фиг. 6 показано сопоставление ί.ΌΚ2 тяжелой цепи анти-И0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕЕ) ГО N0: 99), 6Н9 (8ЕЕ) ГО N0: 105), 7Н2 (8 ЕС) ГО N0: 111), 406 (8 ЕС) ГО N0: 117), 14Ό11 (8ЕС) ГО N0: 93) и 4Ό4 (8Е() ГО N0: 18).
На фиг. 7 показано сопоставление С0Я3 тяжелой цепи анти-И0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕС) ГО N0: 100), 6Н9 (8Е() ГО N0: 106), 7Н2 (8ЕС) ГО N0: 112), 406 (8Е() ГО N0: 118), 14Ό11 (8Е() ГО N0: 94) и 4Ό4 (8Е() ГО N0: 14).
На фиг. 8 показано сопоставление ί.ΌΚ1 легкой цепи анти-И0Р и процент идентичности для антител 14Ό10 (8Е() ГО N0: 95), 6Н9 (8ЕС) ГО N0: 107), 7Н2 (8ЕС) ГО N0: 113), 406а (8ЕС) ГО N0: 119), 406Ь (8ЕС) ГО N0: 122), 406с (8Е() ГО N0: 125), 4066 (8Е() ГО N0: 128), 406с (8ЕС) ГО N0: 132), 14Ό11 (8ЕС) ГО N0: 95) и 4Ό4 (8ЕЦ ГО N0: 24) (406а обозначен на различных фигурах как 20031028340; 406Ь обо- 8 013614 значен на различных фигурах как 20031028351; 466с обозначен на различных фигурах как 20031071526; 4666 обозначен на различных фигурах как 20031028344; 466е обозначен на различных фигурах как 20031000528).
На фиг. 9 показано сопоставление СЭВ2 легкой цепи анти-ΝΟΕ и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕО ГО ΝΟ: 96), 6Н9 (8ЕО ГО ΝΟ: 108), 7Н2 (8ЕО ГО ΝΟ: 114), 466а (8ЕО ГО ΝΟ: 120), 466Ь (8ЕО ГО ΝΟ: 123), 466с (8ЕО ГО ΝΟ: 126), 4666 (8ЕО ГО ΝΟ: 129), 466е (8ЕО ГО ΝΟ: 133), 14Ό11 (8ЕО ГО ΝΟ: 96) и 4Ό4 (8Е0 ГО ΝΟ: 20) (466а обозначен на разных фигурах как 20031028340; 466Ь обозначен на разных фигурах как 20031028351; 466с обозначен на разных фигурах как 20031071526; 4666 обозначен на разных фигурах как 20031028344; 466е обозначен на разных фигурах как 20031000528).
На фиг. 10 показано сопоставление СЭК.3 легкой цепи анти-Ы6Е и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕО ГО ΝΟ: 97), 6Н9 (8ЕО ГО ΝΟ: 109), 7Н2 (8ЕО ГО ΝΟ: 115), 466а (8ЕО ГО ΝΟ: 121), 466Ь (8ЕО ГО ΝΟ: 124), 466с (8ЕО ГО ΝΟ: 127), 4666 (8ЕО ГО ΝΟ: 130), 466е (8ЕО ГО ΝΟ: 134), 14Ό11 (8ЕО ГО ΝΟ: 97) и 4Ό4 (8Е0 ГО ΝΟ: 16) (466а обозначен на разных фигурах как 20031028340; 466Ь обозначен на разных фигурах как 20031028351; 466с обозначен на разных фигурах как 20031071526; 4666 обозначен на разных фигурах как 20031028344; 466е обозначен на разных фигурах как 20031000528).
На фиг. 11 показано сопоставление легкой цепи анти-Ы6Е и процент идентичности для антител 14Ό10 (8ЕО ГО ΝΟ: 82), 6Н9 (8ЕО ГО ΝΟ: 84), 7Н2 (8ЕО ГО ΝΟ: 86), 466а (8ЕО ГО ΝΟ: 88), 466Ь (8ЕО ГО ΝΟ: 89), 466с (8ЕО ГО ΝΟ: 90), 4666 (8ЕО ГО ΝΟ: 91), 466е (8ЕО ГО ΝΟ: 131), 14Ό11 (8ЕО ГО ΝΟ: 80) и 4Ό4 (8Е6 ГО ΝΟ: 12) (466а обозначен на разных фигурах как 20031028340; 466Ь обозначен на разных фигурах как 20031028351; 466с обозначен на разных фигурах как 20031071526; 4666 обозначен на разных фигурах как 20031028344; 466е обозначен на разных фигурах как 20031000528).
На фиг. 12 показано сопоставление тяжелой цепи анти-Ы6Е и процент идентичности для антител 4Ό4 (8ЕО ГО ΝΟ: 10), 466 (8ЕО ГО ΝΟ: 87), 14Ό10 (8ЕО ГО ΝΟ: 81), 14Ό11 (8ЕО ГО ΝΟ: 79), 7Н2 (8ЕО ГО ΝΟ: 85) и 6Н9 (8ЕО ГО ΝΟ: 83).
Подробное описание определенных предпочтительных воплощений
Заголовки разделов, используемые здесь, предназначены только для целей организации текста и не должны рассматриваться как ограничивающие сущность предложенного изобретения. Все документы, цитируемые в данной заявке, включены сюда путем ссылки.
Определения.
Для работы с рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, для работы с культурой тканей, а также трансформации (например, электропорации, липофекции) могут быть применены традиционные методики.
Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить согласно указаниям фирмыпроизводителя, либо как их обычно выполняют в данной области или как описано в данной заявке. Вышеуказанные методики и процедуры можно, как правило, проводить хорошо известными в данной области способами и как описано в различных общих и более конкретных источниках, которые цитируются и обсуждаются на протяжении всего настоящего описания. См., например, 8ашЬгоок е! а1., 2001, ΜΟЕЕСЕЕЛН (ΤΟΧΙΧ6: Α ΕΑΒΟΗΑΤΟΗΥ ΜΑΝυΑΕ 36 е6.. Со16 8ргпщ НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге§5, Со16 δρπηρ НагЬог, Ν. Υ., которое включено сюда путем ссылки для любой цели. Если не приведены конкретные определения, номенклатура, а также лабораторные процедуры и методики аналитической химии, органического синтеза, а также медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, хорошо известны и общепринято используются в данной области. Подобным образом, традиционные методики можно использовать для химических синтезов, химических анализов, приготовления и доставки фармацевтических препаратов, а также для лечения пациентов.
В настоящем описании изобретения приведенные ниже термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие приведенные ниже значения. Выражения биологическое свойство, биологическая характеристика и термин активность в отношении антитела по настоящему изобретению используют здесь взаимозаменяемо, и они включают, но не ограничены этим, эпитопный аффинитет и специфичность (например: человеческое антитело к человеческому Ν6Ε, связывающееся с человеческим Ν6Ε), способность оказывать антагонистическое действие в отношении активности целевого полипептида (например, активность Ν6Ε), стабильность антитела ίη νί\Ό и иммуногенные свойства антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, признанные в данной области, включают, например, перекрестную реактивность (то есть с не человеческими гомологами целевого полипептида или с другими белками или тканями в целом) и способность к сохранению высоких уровней экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеупомянутые свойства или характеристики можно наблюдать или измерять, используя признанные в данной области методики, включая, но не ограничиваясь ими, ЕЬ18А, конкурентный ЕЫ8А, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализы нейтрализации ίη νίΙΐΌ и ίη νί\Ό (см., например, пример 2) и иммуногистохимию с тканевыми срезами из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник по мере необходимости. Конкретные активности и биологические свойства человеческих антител к человеческому Ν6Ε более подробно описаны в приведенных ниже примерах.
Термин изолированный полинуклеотид, как его используют здесь, означает полинуклеотид ге
- 9 013614 номного, кДНК- или синтетического происхождения или некоторую их комбинацию, где по своему происхождению изолированный полинуклеотид (1) не связан ни с целым полинуклеотидом, в котором этот изолированный полинуклеотид находится в природе, ни с его участком, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе или (3) не встречается в природе как часть большей последовательности.
Термин изолированный белок, используемый здесь, означает, что обсуждаемый белок (1) свободен, по меньшей мере, от нескольких других белков, с которыми он должен в норме находиться, (2) по существу, свободен от других белков из того же источника, например из того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, (4) отделен по меньшей мере от примерно 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе, (5) не связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с участками белка, с которыми изолированный белок связан в природе, (6) оперативно связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой изолированный белок может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другими РНК, иметь синтетическое происхождение, либо представлять собой любую их комбинацию. Предпочтительно изолированный белок по существу свободен от белков или полипептидов или других загрязнений, которые находятся в его природном окружении, которые препятствовали бы его применению (терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или другому).
Изолированное антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено от и/или выделено из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются вещества, которые препятствовали бы диагностическим или терапевтическим применениям этого антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие подобные или не подобные белку растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях антитело будет очищено (1) более чем до 95% мас./мас. антитела, как определено методом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем до 99% мас./мас., (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Νконцевой или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора с вращающимися лунками (φίηπίπβ сир 5сс.|испа1ог). либо (3) до гомогенности по ДСН-ПААГ электрофорезу в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях, используя окрашивание Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. К изолированным антителам относится антитело ίη Ши внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения этого антитела не будет присутствовать.
Термины полипептид или белок означают молекулы, имеющие последовательность нативных белков, то есть белков, продуцируемых природными, а именно нерекомбинантными клетками, либо полученных генно-инженерным путем или с использованием рекомбинантных клеткок, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты нативной последовательности. Термины полипептид и белок, конкретно, охватывают антитела к ΝΟΡ или последовательности, которые имеют делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты антитела к Ν6Ρ.
Термин полипептидный фрагмент относится к полипептиду, который имеет амино-концевую делецию, карбокси-концевую делецию и/или внутреннюю делецию. В некоторых воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере от 5 до примерно 500 аминокислот. Должно быть понятно, что в некоторых воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот. В частности, полезные полипептидные фрагменты включают функциональные домены, в т.ч. связывающие домены. В случае антитела к ΝΟΡ полезные фрагменты включают, но не ограничены ими, область СЭР, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, участок цепи антитела или именно ее вариабельную область, включающую две СОК, и тому подобное.
Термин специфичный связывающий агент относится к природной или неприродной молекуле, которая специфично связывается с мишенью. Примеры специфичных связывающих агентов включают, но не ограничены ими, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды. В некоторых воплощениях специфичный связывающий агент представляет собой антитело.
Термин специфичный связывающий агент к ΝΟΡ относится к специфичному связывающему агенту, который специфично связывается с любым участком ΝΟΡ. В некоторых воплощениях специфичный связывающий агент к ΝΟΡ представляет собой антитело, которое специфично связывается с ΝΟΡ.
Термин иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, как его используют здесь, относится к полипептидному фрагменту, который содержит, по меньшей мере, СОК тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению способен связываться с антигеном. В предпочтительных воплощениях антиген представляет собой лиганд, который специфично связывается с рецептором. В этих воплощениях связывание иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина по изобретению предотвращает связывание лиганда с его рецептором, прерывая биологический ответ, который произошел бы при связывании лиганда с рецептором. Предпочтительно иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению специфично связывается с ΝΟΡ. Наиболее предпочтительно фрагмент специфично свя
- 10 013614 зывается с человеческим ΝΟΡ.
Термин природный, как его используют здесь и применяют к объекту, определяет тот факт, что этот объект может быть обнаружен в природе. Например, речь может идти о полипептидной или полинуклеотидной последовательности, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из источника в природе и которая не была намеренно модифицирована человеком.
Термин функциональным образом сцепленный означает, что компоненты, к которым применяют этот термин, находятся во взаимоотношениях, которые дают им возможность осуществлять свойственные им функции в подходящих условиях. Например, регуляторная последовательность, которая функциональным образом сцеплена с последовательностью, кодирующей белок, лигирована с ней таким образом, что в условиях, совместимых с транскрипционной активностью регуляторных последовательностей, осуществляется экспрессия последовательности, кодирующей белок.
Термин регуляторная последовательность, как его используют здесь, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые могут осуществлять экспрессию, процессинг или внутриклеточную локализацию кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких регуляторных последовательностей может зависеть от организма-хозяина. В конкретных воплощениях регуляторные последовательности для прокариот могут включать промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции. В других конкретных воплощениях регуляторные последовательности для эукариот могут включать промоторы, содержащие один или множество сайтов распознавания для факторов транскрипции, последовательности транскрипционных энхансеров, последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования. В некоторых воплощениях регуляторные последовательности могут включать лидерные последовательности и/или последовательности партнеров слияния.
Термин полинуклеотид здесь означает однонитевые или двунитевые нуклеиново-кислотные полимеры, имеющие по меньшей мере 10 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды, или дезоксирибонуклеотиды, либо модифицированную форму любого типа нуклеотида. Указанные модификации включают модификации оснований, такие как бромуридин, модификации рибозы, такие как арабинозид и 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидной связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат и фосфороамидат. Термин полинуклеотид, конкретно, включает однонитевые и двунитевые формы ДНК.
Термин олигонуклеотид, как он употребляется здесь, включает природные и модифицированные нуклеотиды, сшитые вместе природными и/или неприродными олигонуклеотидными сшивками. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов, которые являются однонитевыми и имеют длину 200 нуклеотидов или менее. В некоторых воплощениях изобретения длина олигонуклеотидов составляет от 10 до 60 нуклеотидов. В некоторых воплощениях длина изобретения олигонуклеотидов составляет 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми, например, для использования при конструировании генетического мутанта. Олигонуклеотиды по изобретению могут представлять собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды по отношению к последовательности, кодирующей белок.
Термин природные нуклеотиды включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин модифицированные нуклеотиды включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобным. Термин олигонуклеотидные сшивки включает олигонуклеотидные сшивки, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат, фосфороамидат и тому подобные. См., например, ЬаР1апсйе е! а1., 1986, Νυοί. Αείάδ Век., 14: 9081; 8!ес е! а1., 1984, 1. Ат. Сйет. 8ос., 106: 6077: 8!еш е! а1., 1988, Νυο1. Αείάκ Век., 16: 3209: Ζοη е! а1., 1991, Αηΐί-Сапсег Όιυ§ Сектп. 6: 539: Ζοη е! а1., 1991, ОЫСОКГиСЕЕОТШЕ8 ΑΝΏ ΑΝΑΕΘΟυΕδ : Α ΡВΑСТIСΑ^ ΑΡΡΒΟΑ№, рр. 87-108 (Е. Ескк!ет, Еб.), ОхТогб Ишуегкйу Ргекк, ОхТогб Епд1апб: 8!ес е! а1., и. 8. Ра!. Νο. 5,151,510; ий1тапп апб Реутап, 1990, Сйет1са1 Веу1е^к, 90: 543, описания которых включены сюда путем ссылки для любой цели. Олигонуклеотид может включать детектируемую метку, чтобы обеспечить обнаружение олигонуклеотида или его гибридизации.
Термин вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой вектор сшит. Одним из типов вектора является плазмида, которая представляет собой двунитевуюй петлю ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клеткухозяина и посредством этого реплицируются параллельно с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно сцеплены. Такие векторы называют здесь рекомбинантными экспрессионными векторами (или просто экспрессионными векторами). Как правило, экспрессионные векторы, полезные в методиках рекомбинантных ДНК, часто нахо
- 11 013614 дятся в форме плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее используемой используемой формой вектора. Однако в изобретение следует включать также другие формы экспрессионных векторов, например вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) обозначает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Специалистам в данной области должно быть понятно, что такие термины следует относить не только к конкретной обсуждаемой клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут встречаться в последующих поколениях либо вследствие мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство в действительности может не быть идентично родительской клетке, но тем не менее включено в объем термина клетка-хозяин, как его используют здесь. Для экспрессии антител по настоящему изобретению можно использовать широкий ряд экспрессионных систем-хозяев, включая бактериальные, дрожжевые, бакуловирусные и экспрессионные системы млекопитающих (а также экспрессионные системы фагового дисплея). Примером подходящего бактериального экспрессионного вектора является рИС19. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфецируют одним или более чем одним рекомбинантным вектором экспрессии, несущим фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина антитела, так что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в этой клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой культивируют эти клетки-хозяева, причем из этой среды антитела можно выделить. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК используют для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, для включения этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения векторов в клетки-хозяева, такие как описаны в 8атЬгоок е! а1., 2001, МОТЕСиЬЛК. СЬОНШС, А ЬАВОКАΤΟΒΥ ΜΑΝυΑΕ, Со1б 8рг1пд НагЬог ЬаЬога!ог1е8, Аи8иЬе1, Е. М. е! а1. (еб§.) Сиггеи! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огееие РиЬЩЫид А88ос1а!е8 (1989) и в и. 8. Ра!еи! №. 4,816,397 !о Во§8 е! а1.
Термином клетка-хозяин обозначают клетку, которая трансформирована или способна быть трансформированной нуклеиново-кислотной последовательностью, а затем способна к экспрессии выбранного интересующего гена. Этот термин охватывает и потомство родительской клетки, независимо от того, является ли это потомство идентичным по морфологии или по генотипу исходному родителю, если присутствует выбранный ген.
Используемым термином трансдукция обозначают переносгенов из одной бактерии в другую, обычно посредством фага. Трансдукция также относится к приобретению и переносу эукариотических клеточных последовательностей ретровирусами.
Используемый термин трансфекция применяют к захвату чужеродной или экзогенной ДНК клеткой; клетка трансфецирована, когда экзогенная ДНК введена внутрь клеточной мембраны. Ряд методик трансфекции хорошо известен в данной области и раскрыт здесь. См., например, Огайат е! а1., 1973, VIго1оду 52: 456; 8атЬгоок е! а1., 2001, МОЕЕСЕЕАЕ СЬОМ^, А ЕАВО1С\ТО1А МАМУЛЕ, Сой 8ргшд НагЬог ЬаЬогайпек; ϋίΐνΐδ е! а1., 1986, ВА81С МЕТНОВ8 ΙΝ МОЕЕСЕЕАВ ВЮЕОСА. ЕЕемег; и Сйи е! а1.,1981. Оеие 13: 197. Такие методики можно использовать для введения одной или более молекул экзогенной ДНК в подходящие клетки-хозяева.
Термин трансформация, как его используют здесь, относится к изменению в генетических характеристиках клетки, а клетка является трансформированной, если она была модифицирована таким образом, что содержит новую ДНК. Например, клетка является трансформированной, когда она является генетически модифицированной по отношению к ее нативному состоянию. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может рекомбинировать с ДНК клетки посредством физической интеграции в хромосому клетки, либо может сохраняться транзитно в виде эписомного элемента, не реплицируясь, либо может реплицироваться независимо в виде плазмиды. Клетку считают стабильно трансформированной, когда ДНК реплицируется при делении клетки.
Термин природный или нативный, когда его используют в связи с биологическими веществами, такими как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и тому подобное, относится к веществам, которые обнаруживаются в природе, а не сконструированы человеком. Подобным образом, термин неприродный или ненативный, как используют здесь, относится к веществу, которое не обнаруживается в природе или которое структурно модифицировано или синтезировано человеком.
Термин антиген относится к молекуле или к участку молекулы, которые способны связываться с агентом избирательного связывания, таким как антитело, и, кроме того, могут быть использованию у животного для продуцирования антител, способных связываться с эпитопом такого антигена. Антиген может иметь один или более чем один эпитоп.
Термин идентичность, как известно в данной области, относится к соотношению между последовательностями двух или более полипептидных молекул или двух или более молекул нуклеиновой кислоты, определенному путем сравнения их последовательностей. В данной области идентичность также означает степень родства последовательности молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, при возможном положении, определенной при сопоставлении нитей двух или более нуклеотидных или двух или более аминокислотных последовательностей. Идентичность определяет процент идентичных совпаде- 12 013614 ний с наименьшей из двух или более последовательностей при выравнивании разрывов (если они есть) с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (то есть алгоритмов).
Термин подобие используют в данной области применительно к родственной концепции, но, в противоположность идентичности, подобие относится к мере родства, которая включает как идентичные совпадения, так и совпадения консервативных замен. Если две полипептидные последовательности имеют, например, 10/20 идентичных аминокислот, а остальные являются неконсервативными заменами, тогда и процент идентичности, и процент подобия будут равны 50%. Если в таком же примере имеется пять дополнительных положений, где существуют консервативные замены, тогда процент идентичности остается 50%, но процент подобия будет равен 75% (15/20). Следовательно, в случаях, когда имеются консервативные замены, процент подобия между двумя полипептидами будет выше, чем процент идентичности между этими двумя полипептидами.
Идентичность и подобие родственных нуклеиновых кислот и полипептидов можно легко вычислить известными способами. Такие способы включают, но не ограничены ими, способы, описанные в СОМΡυΤΑΤΙΟΝΑΕ \1О1.ЕСи1./Ш ВЮЬОСУ (Ьейк А.М., еб.), 1988, θχίοτά ИпВегййу Ргейй, Хеи Уотк; В1ОСОМРИТПХб: 1ХТСЖМАТ1С8 ΑΝΏ СЕХОМЕ РНО.1ЕСТ8 (8тИЬ Ό. \., еб.), 1993, Асабет1с Ргейй, Хеи Уотк; СОМРИТЕВ ΑΝΑΕΥδΙδ ОЕ 8ЕОИЕХСЕ ΌΑΤΑ, Рай 1 (Οτίίίίη А. М. апб Οτίίίίη Н. С., ебй.), 1994, Нитапа Ргейй, Хеи 1етйеу; νοη Непде, С., ^ЕОИЕХСЕ ΑΝΑΕΥ8Ι8 ΙΝ МΟ^ЕСυ^ΑВ ВЮЬОСУ, 1987, Αсабет^с Ргейй: ΞΕρυΕΝΟΕ ΑΝΑΕΥ8Ι8 РВ1МЕВ (СпЬйкот, М. апб Ведущих, 1., ебй.), 1991, М. 8!оск!оп Ргейй, Νονν Уогк; СатШо е! а1., 1988, δIΑМ 1. Αρρ^6 МаШ., 48: 1073 и ИитЫп е! а1., ΒЮ^ΟСIСΑ^ 8ЕСИЕНСЕ ΑΝΑΕΥ8Ι8. СатЬпбде Иптуегайу Ргейй.
Предпочтительные способы определения идентичности предназначены для получения наибольшего совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничены ими, пакет программ ССС, включая СΑΡ (^еνе^еиx е! а1., 1984, Ν^1. ΑΟ65 Рей., 12: 387; Сепейсй Сотри!ег Сгоир. ипВетййу οί \\'1йсопй1п. Маб1йоп, \Ι), ΒΕΑ8ΤΡ, ΒΕΑ8ΤΝ и ΕΑδΤΑ (Α1ί8Λϋ1 е! а1., 1990, 1. Мо1. Вю1., 215: 403-410). Программа ВЕ-ΑδΤΧ общедоступна от №1бопа1 Сеп!ег Гог Вю!есйпо1оду Шоттайоп (ИСВЦ и из других источников (ВЕ-ΑδΤ Мапиа1, Α1Η№ιι1 е! а1., NΟΒ/N^М/NIВ Ве!Нейба, МИ 20894; Α1Η№ιι1 е! а1., 1990. см. выше). Можно также использовать хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана для определения идентичности.
Результатом некоторых схем сопоставления для выравнивания двух аминокислотных последовательностей может быть совпадение только короткой области этих двух последовательностей, и эта небольшая выровненная область может иметь очень высокую идентичность последовательности, даже при отсутствии значительного родства между двумя полноразмерными последовательностями. Соответственно, в некоторых воплощениях изобретения результатом выбранного способа сопоставления (программа СΑΡ) будет сопоставление, которое перекрывает по меньшей мере 50 смежных аминокислот целевого полипептида.
Например, используя компьютерный алгоритм СΑΡ (Сепейсй Сотри!ег Сгоир, иптуетййу оГ \\1йсопйш, Маб1йоп, \Ι), два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательности, сопоставляют с оптимальным совпадением их соответствующих аминокислот (совпадающий промежуток, как определено с помощью этого алгоритма). В некоторых воплощениях при использовании этого алгоритма применяют штраф на внесение делеции в сопоставление (который вычисляют как трехкратную среднюю диагональ; где средняя диагональ представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ представляет собой балл или число, приписываемое каждому точному совпадению аминокислот по конкретной матрице сопоставления), и штраф на продолжение делеции (который обычно составляет одну десятую штрафа на внесение делеции в сопоставление), а также матрицу сравнения, такую как РАМ250 или ВЬО8ИМ 62. В некоторых воплощениях в алгоритме также используют стандартную матрицу сравнения (см. ВауНоЕ е! а1., 1978, ΑΐΕ« оГ Рто!еш 8есщепсе апб 8йис!иге, 5: 345-352 для матрицы сравнения РАМ250; ВешкоЕе! а1., 1992, Ргос. №111. Αсаб. δα υδΑ, 89: 10915-10919 для матрицы сравнения ВЬО8ИМ 62).
В некоторых воплощениях изобретения параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующие:
Алгоритм: №еб1етап е! а1., 1970, 1. Мо1. Вю1., 48: 443-453;
Матрица сравнения: ВЬО8ИМ 62 от ВешкоЕ е! а1., 1992, см. выше;
Штраф на внесение делеции в сопоставление: 12
Штраф на длину делеции: 4
Порог подобия: 0
При использовании вышеуказанных параметров полезно применять программу СΑΡ. В некоторых воплощениях изобретения вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнений полипептидов (параллельно с отсутствием штрафа на концевые делеции) с использованием алгоритма СΑΡ.
Термин гомология относится к степени подобия между последовательностями белков или нук
- 13 013614 леиновых кислот. Информация по гомологии полезна для понимания генетического происхождения определенных видов белков или нуклеиновых кислот. Гомологию можно определить путем сопоставления и сравнения последовательностей. Обычно, чтобы определить аминокислотную гомологию, последовательность белка сравнивают с базой данных известных последовательностей белков. Гомологичные последовательности имеют общие функциональные идентичности в каком-либо месте на протяжении их последовательностей. Высокая степень подобия или идентичности обычно является показателем гомологии, хотя низкая степень подобия или идентичности не обязательно является показателем отсутствия гомологии.
Несколько подходов можно использовать для сравнения аминокислот одной последовательности с аминокислотами другой последовательности с целью определения гомологии. Как правило, эти подходы попадают в две категории: (1) сравнение физических характеристик, таких как полярность, заряд и Вандер-Ваальсов объем, для создания матрицы подобия; и (2) сравнение вероятной замены аминокислоты в последовательности какой-либо другой аминокислотой, которое основано на наблюдении многих белковых последовательностей из известных гомологичных белков и для создания матрицы приемлемых точечных мутаций (Ροίηΐ Ассер1еб ΜιιΙαΙίοη Ма1пх. РАМ).
Процент идентичности можно также вычислить путем с использованием программы пееб1е (пакет ΕΜΒΟ88) или 51гс1с11сг (пакет ΕΜΒΟ88) либо программы айдп X в качестве можудя программного обеспечения ссс1ог ΝΊΊ кийе 9.0.0, используя параметры по умолчанию (например, штраф на делеции - 5, штраф на внесение делеции в выравнивание - 15, штраф на продолжение делеции - 6.6).
Здесь используется традиционное обозначение двадцати основных аминокислот и их сокращений. См. ΙΜΜυΝΟΕΟΟΥ-Α δΥΝΊΗΕδΙδ, 2ηά Εάίίίοη (Е.8. Оо1иЬ апб Ό.Κ. Степ, Εάδ.), 8таиет Аккос1а1ек: 8ипбет1апб, ΜΑ, 1991), включенную сюда путем ссылки для любой цели. Стереоизомеры (например, Όаминокислоты) двадцати основных аминокислот; неприродные аминокислоты, такие как α,αдвузамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие неосновные аминокислоты также могут быть пригодными компонентами полипептидов по изобретению. Примеры неосновных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбокситутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Νацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σΝ-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В обозначении полипептидов, используемом здесь, левое направление представляет собой аминоконцевое направление, а направление направо представляет собой карбоксилконцевое направление в соответствии с общепринятым использованием и соглашением.
Природные остатки можно разделить на классы на основании общих свойств боковой цепи:
1) гидрофобные: норлейцин (Νοτ), Μеΐ, А1а, Уа1, Ьеи, 11е, РЬе, Тгр, Туг, Рго;
2) полярные гидрофильные: Агд, Акп, Акр, С1п, С1и, Н1к, Ьук, Бет, ТЬг;
3) алифатические: А1а, С1у, 11е, Ьеи, Уа1, Рго;
4) алифатические гидрофобные: А1а, 11е, Ьеи, Уа1, Рго;
5) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ет, ТЬг, Акп, С1п;
6) кислотные: Акр, С1и;
7) основные: Н1к, Ьук, Агд;
8) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: С1у, Рго;
9) ароматические: Н1к, Тгр, Туг, РЬе и
10) ароматические гидрофобные: РЬе, Тгр, Туг.
Консервативные аминокислотные замены могут включать замену представителя одного из этих классов другим представителем того же класса. Консервативные аминокислотные замены могут охватывать неприродные аминокислотные остатки, которые обычно возникают и химическом пептидном синтезе, а не при синтезе в биологических системах. Эти остатки включают пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных группировок.
Неконсервативные замены могут включать замену представителя одного из этих классов представителем другого класса. Такие замещенные остатки можно вводить в области человеческого антитела, которые являются гомологичными нечеловеческим антителам, или в негомологичные области молекулы.
При получении таких замен согласно некоторым воплощениям изобретения можно учитывать показатель гидропатичности аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен показатель гидропатичности, определенный на основании ее гидрофобности и заряда. Эти показатели следующие: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).
В данной области известна важность показателя гидропатичности аминокислот в приписывании интерактивной биологической функции белку (см., например, Ку!е е! а1., 1982, 1. Μο1. Вю1. 157: 105-131). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, имеющими такой же показатель или балл гидропатичности, поскольку они сохраняют ту же биологическую активность. При создании замен на основании показателя гидропатичности в некоторых воплощениях изобре
- 14 013614 тения включена замена аминокислот, показатели гидропатичности которых находятся в пределах ±2. В некоторые воплощения изобретения включены замены в пределах ±1, а в некоторые воплощения включены замены в пределах ±0,5.
В данной области также известно, что замена подобных аминокислот может быть эффективно произведена на основании гидрофильности, в частности, когда биологически функциональный белок или пептид, сконструированный таким образом, предназначен для применения в иммунологических воплощениях как раскрыто для изобретения. В некоторых воплощениях самая высокая локальная средняя гидрофильность белка, которая определяется гидрофильностью соседних аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, то есть с биологическим свойством этого белка.
Этим аминокислотным остаткам приписаны следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При получении замен на основании подобных значений гидрофильности в некоторые воплощения изобретения включена замена аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в пределах ±2, в некоторые воплощения включены замены в пределах ±1, и в некоторые воплощения включены замены в пределах ±0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основании гидрофильности. Эти области также называются центральными областями эпитопов.
Примеры аминокислотных замен приведены в табл. 1.
Аминокислотные замены
Исходные остатки Примеры замен П редпочтител ьн ы е замены
А1а Ма1, Ьеи, Не Уа|
Агд Ьуз, <31п, Азп Ьуз
Азп С1п С!п
Азр <3(и С1и
Суз Зег, А1а Зег
6!п Азп Азп
СЮ Азр Азр
С1у Рго, А1а А1а
Ηϊδ Азп, С1п, Ьуз, Агд Агд
Не Ьеи, Уа!, Ме1, А1а, РЬе, Ыог1еис|пе Ьеи
Ьеи Ыог1еис1пе, Не, Уа1, Ме1, А1а, РЬе Не
Ьуз Агд, 1,4-диамино-масляная кислота, 31п, Азп Агд
Μβί Ьеи, РЬе, Не Ьеи
РЬе Ьеи, Уа1, Не, А!а, Туг Ьеи
Рго А!а С1у
8ег ТЬг, А1а, Суз ТЬг
ТЫ 8ег Зег
Тгр Туг, РЬе Туг
Туг Тгр, РЬе, ТЬг, 8ег РЬе
Уа1 Не, Ме1, Ьеи, РЬе, А1а, Νοήβυοίηβ Ьеи
Специалист в данной области сможет определить подходящие варианты полипептида, как изложено здесь, используя хорошо известные методики. В некоторых воплощениях специалист в данной области может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности направленными заменами в этих областях, не считающимися важными для активности. В других воплощениях изобретения специалист в данной области может идентифицировать остатки и участки молекул, которые являются консервативными среди подобных полипептидов. В других воплощениях одинаковые области, которые могут быть важны для биологической активности или для структуры, могут быть предметом консервативных аминокислотных замен без нарушения биологической активности или без вредного влияния на структуру полипептида.
Кроме того, специалист в данной области может сделать обзор структурно-функциональных исследований, идентифицирующих остатки в подобных полипептидах, которые являются важными для активности или структуры. В свете такого сравнения специалист в данной области может предсказать важность аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, важным для активности или структуры в подобных белках. Специалист в данной области может выбрать химически подобные аминокислотные замены для таких предсказанных важных аминокислотных остатков.
- 15 013614
Специалист в данной области может также провести анализ трехмерной структуры и аминокислотной последовательности структуры в подобных полипептидах. В свете такой информации специалист в данной области может предсказать результат сопоставления аминокислотных остатков антитела в отношении его трехмерной структуры. В некоторых воплощениях специалист в данной области может сделать выбор не производить радикальных изменений в аминокислотных остатках. для которых предсказано. что они находятся на поверхности белка. поскольку такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Кроме того. специалист в данной области может создать контрольные варианты. содержащие единственную аминокислотную замену в каждом желаемом аминокислотном остатке. Затем можно провести скрининг этих вариантов. используя анализы на активность. известные специалистам в данной области. Такие варианты можно использовать для сбора информации о подходящих вариантах. Например. если обнаружено. что замена конкретного аминокислотного остатка приводит в результате к нарушенной. нежелательно сниженной или непригодной активности. вариантов с такой заменой можно избежать. Иными словами. на основании информации. собранной в таких рутинных экспериментах. специалист в данной области может легко определить аминокислоты. для которых дополнительных замен следует избегать. либо самих по себе. либо в комбинации с другими мутациями.
Ряд научных публикаций посвящен предсказанию вторичной структуры. См. Мои1! 1996. Сигг. Ор. 1п В1о!есЬ. 7: 422-427; СЬои е! а1.. 1974. В1осЬеш1б!гу 13: 222-245; СЬои е! а1.. 1974. В1осЬеш1б1гу 113: 211222; СЬои е! а1.. 1978. Абу.Епхуто1. Ве1а!. Агеаб Мо1. Вю1. 47: 45-148; СЬои е! а1.. 1979. Апп. Веу. В1осЬет. 47: 251-276 и СЬои е! а1.. 1979. ВюрЬуб. 1. 26: 367-384. Кроме того. в настоящее время доступны компьютерные программы. помогающие предсказывать вторичную структуру. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например. два полипептида или белка. которые имеют идентичность последовательности выше 30%. или подобие выше 40%. часто имеют подобные структурные топологии. В последнее время пополнение базы данных структуры белков (РЭВ. рго!ет б!гис!ига1 ба!аЬабе) обеспечил повышенную предсказуемость вторичной структуры. включая возможное число складок в пределах структуры полипептида или белка. См. Но1т е! а1.. 1999. Ыис1. Ас1б. Веб. 27: 244-247. Сделано предположение (Вгеппег е! а1.. 1997. Сигг. Ор. 81гис!. Вю1. 7: 369-376). что существует ограниченное число складок в данном полипептиде или белке. и что. как только критическое число структур разрешено. предсказание структуры станет значительно точнее.
Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают нанизывание (1опеб. 1997. Сигг. Орт. 8!гис!. Вю1. 7: 377-87; 81рр1 е! а1.. 1996. 81гис!иге 4: 15-19). профильный анализ (Во\\эе е! а1.. 1991. 8с1епсе 253: 164-170; СпЬбкоу е! а1.. 1990. Ме!Ь. Епхут. 183: 146-159; СпЬбкоу е! а1.. 1987. Ргос. Иа!. Асаб. 8ск 84: 4355-4358) и эволюционую связь (см. Но1т. 1999. выше и Вгеппег. 1997. выше).
В некоторых воплощениях варианты антител включают варианты гликозилирования. где число и/или тип сайтов гликозилирования изменен по сравнению с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В некоторых воплощениях варианты белка содержат большее или меньшее число сайтов Ν-гликозилирования. чем нативный белок. Сайт Ν-гликозилирования характеризуется последовательностью: Абп-Х-8ег или Абп-Х-ТЬг. где аминокислотный остаток. обозначенный символом X. может представлять собой любой аминокислотный остаток. кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности создает новый потенциальный сайт для добавления Νсвязанной углеводной цепи. Или же замены. которые элиминируют эту последовательность. будут удалять существующую Ν-связанную углеводную цепь. Также предложена перестройка Ν-связанных углеводных цепей. где один или более чем один сайт Ν-гликозилирования (обычно тот. который встречается в природе) элиминируется. и один или более сайтов Ν-гликозилирования образуется. Предпочтительные дополнительные варианты антител включают цистеиновые варианты. где один или более чем один цистеиновый остаток делетирован или заменен другой аминокислотой (например. серином) по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть полезны. когда укладка антител должна быть изменена до биологически активной конформации. как. например. после выделения нерастворимых телец включения. Цистеиновые варианты. как правило. имеют меньше цистеиновых остатков. чем нативный белок. и обычно имеют именно такое число. чтобы свести к минимуму взаимодействия в результате неспаренных цистеинов.
В дополнительных воплощениях варианты антител могут включать антитела. содержащие модифицированный Ес-фрагмент или модифицированную константную область тяжелой цепи. Ес-фрагмент. что означает фрагмент. который кристаллизуется. или константную область тяжелой цепи. может быть модифицирован за счет мутации для придания антителу измененных характеристик связывания. См.. например. Вийоп апб \УооГ. 1992. Абуапсеб ш 1ттипо1оду 51: 1-84; Вауе!сЬ апб Во11апб. 2001. Аппи. Веу. 1ттипо1. 19: 275-90: 8Ые1бб е! а1.. 2001. 1оита1 оГ Вю1. СЬет. 276: 6591-6604; Те11етап апб бгтс|11апб. 2000. 1ттипо1оду 100: 245-251: Мебебап е! а1.. 1998. Еиг. 1. 1ттипо1. 28: 2092-2100; все включены сюда путем ссылки. Такие мутации могут включать замены. добавления. делеции или любую их комбинацию. и их обычно получают путем сайт-направленного мутагенеза. используя один или более чем один мутагенный олигонуклеотид. способами. описанными здесь. а также способами. известными в данной области (см.. например. 8атЬгоок е! а1.. МОЕЕСиЕАВ СЕОМХС: А ЬАВОВАТОВУ МАХЕ-АЕ 3гб Еб. 2001. Со1б 8оппд НагЬог. Ν. Υ. и Вегдег апб К1тте1. МЕТНОЭ8 ΙΝ Е^УМОЬОСУ. Уо1ите 152. Ошбе !о Мо
- 16 013614
1еси1аг С1ошпд Тесбтдиез, 1987. Асабетк Ргезз, 1пс., 8аи Ωίοβο. СА, которые включены сюда путем ссылки).
Согласно некоторым воплощениям изобретения, аминокислотные замены представляют собой те замены, которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинитет связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют аффинитеты связывания и/или (5) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. Согласно некоторым воплощениям одиночные или множественные аминокислотные замены (в некоторых воплощениях консервативные аминокислотные замены) могут быть получены в природной последовательности (в некоторых воплощениях в участке полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярного контакта). В предпочтительных воплощениях консервативная аминокислотная замена обычно не изменяет существенно структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна иметь склонность к разрыву спирали, которая встречается в исходной последовательности, или к прерыванию других типов вторичной структуры, которая характеризует исходную последовательность). Примеры известных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в РВ0ТЕШ8, 8ТВиСТиВЕ8 АN^ М0ЕЕСЕЕАН РВШС1РЬЕ8 (Сге1§ЬЮп, Еб.), 1984, А. Н. Егеетап апб Сотрапу, Уогк; 1УШ01)ЕСТI0N Т0 РВ0ТЕШ 8ТНЕСТЕНЕ (С. Вгапбеп апб .1. Тоо/е, ебз.), 1991, Саг1апб РиЬбзЫпд, Уогк, N.
Υ.: и ТбогпЮп е1 а1., 1991, №-11иге 354: 105, каждая из этих публикаций включена сюда путем ссылки.
Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств со свойствами, аналогичными свойствам первоначального пептида. Эти типы непептидных соединений обозначены термином миметики пептидов или пептидомиметики. См. Еаисбеге, 1986, Абν. Эгид Вез. 15: 29; УеЬег & Еге1бтдег, 1985, ТШ8 р. 392; и Етапз е1 а1., 1987, I. Меб. Сбет. 30: 1229, которые включены сюда путем ссылки для любой цели. Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно подобны терапевтически полезным пептидам, можно использовать для получения подобного терапевтического или профилактического эффекта. Как правило, пептидомиметики структурно подобны полипептиду-образцу (то есть полипептиду, который обладает биологическим свойством или фармакологической активностью), такому как человеческое антитело, но имеют одну или более чем одну пептидную связь, возможно замещенную связью, выбранной из: -СН2^Н-, -СН2-8-, -СН2-СН2-, -СН=СН- (цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН280-, способами, хорошо известными в данной области. Систематическую замену одной или более аминокислот согласованной последовательности Ό-аминокислотой такого же типа (например, Ό-лизин вместо Ь-лизина) можно использовать в некоторых воплощениях для создания более стабильных пептидов. Кроме того, искусственные пептиды, содержащие согласованную последовательность или, по существу, идентичный вариант согласованной последовательности, могут быть получены способами, известными в данной области (Εί/о & С1егазсб, 1992, Апп. Веν. Вюсбет. 61: 387, включено сюда путем ссылки для любой цели); например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных к образованию межмолекулярных дисульфидных мостиков, которые циклизуют пептид.
Термин антитело или антитело-пептид(ы) относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. В некоторых воплощениях связывающие фрагменты получают с помощью методик рекомбинантных ДНК. В дополнительных воплощениях связывающие фрагменты получают путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают, но не ограничены ими, Е(аЬ), Е(аЬ'), Е(аЬ')2, Εν и одноцепочечные антитела.
Термин тяжелая цепь включает любой иммуноглобулиновый полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к NСΕ. Термин легкая цепь включает любой иммуноглобулиновый полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к NСΕ. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области, УН, и три домена константной области, СН1, СН2 и СН3. Домен УН находится при аминоконце полипептида, а домен СН3 находится при карбоксиконце. Термин тяжелая цепь, как его используют здесь, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области, Уь и домен константной области, Сь. Подобно тяжелой цепи, домен вариабельной области легкой цепи находится при аминоконце полипептида. Термин легкая цепь, как его используют здесь, охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. Е(аЬ) фрагмент состоит из одной легкой цепи и СН1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Е(аЬ) молекулы не может образовать связь с другой молекулой тяжелой цепи. Е(аЬ') фрагмент содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую часть константной области, между доменами СН1 и СН2, так что межцепочечная дисульфидная связь может образоваться между двумя тяжелыми цепями с образованием Е(аЬ')2 молекулы. Область Εν содержит вариабельные области из обеих цепей, тяжелой и легкой, но не содержит константные области. Одноцепочечные антитела представляют собой Εν молекулы, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединены подвижным линкером с образованием единой полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область.
- 17 013614
Одноцепочечные антитела подробно обсуждаются в публикации международной патентной заявки № \\'0 88/01649 и в патентах США №№ 4946778 и 5260203.
Под бивалентным антителом, не являющимся многоспецифичным или многофункциональным антителом, в некоторых воплощениях понимают как антитело, содержащее сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность.
При оценке связывания и специфичности антитела по изобретению считают, что антитело, по существу, ингибирует адгезию лиганда к рецептору, когда избыток антитела уменьшает количество лиганда, связанного с рецептором, по меньшей мере примерно на 20, 40, 60, 80, 85% или более (при измереннии, среди прочего, с использованием конкурентного анализа связывания ίη νίΐΓο).
Под нейтрализующим антителом подразумевают молекулу антитела, которая способна блокировать или существенно снижать эффекторную функцию антигена-мишени, с которым оно связывается. Соответственно, нейтрализующее антитело к NСЕ способно блокировать или существенно снижать эффекторную функцию, такую как связывание рецептора и/или провокацию клеточного ответа NСЕ. Под понятием существенно снизить следует понимать по меньшей мере примерно 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 75%, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% снижение эффекторной функции антигена-мишени (например, человеческого NСЕ).
Термин эпитоп включает любой детерминант, предпочтительно полипептидный детерминант, способный к специфичному связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. В некоторых воплощениях эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, а в некоторых воплощениях могут иметь специфичные структурные трехмерные характеристики и/или специфичные характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается с антителом. В некоторых воплощениях указано, что антитело специфично связывает антиген, когда оно предпочтительно распознает его антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В предпочтительных воплощениях указано, что антитело специфично связывает антиген, когда равновесная константа диссоциации составляет <10-8 М, более предпочтительно, когда равновесная константа диссоциации составляет <10-9 М, и наиболее предпочтительно, когда константа диссоциации составляет <10-1 М.
Считают, что антитело связывает по существу тот же эпитоп, что и антитело сравнения, когда эти два антитела распознают идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами определения, связываются ли два антитела с идентичными или пространственно перекрывающимися эпитопами, являются конкурентные анализы, которые проектируют в ряде различных форм, используя либо меченый антиген, либо меченое антитело. Обычно антиген иммобилизуют на субстрате, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют, используя радиоактивные или ферментативные метки.
Термин агент используют здесь для обозначения химического соединения, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов.
Как используются здесь, термины метка или меченый относятся к включению детектируемого маркера, например, путем включения радиоактивно меченой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых группировок, которые можно обнаружить с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, предпочтительно содержащего детектируемый маркер, такой как флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер или ферментативная активность, которые можно обнаружить оптическими или колориметрическими способами). В некоторых воплощениях метка может быть также терапевтической. В данной области известны различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов и они могут быть выгодно использованы в способах, раскрытых в описании изобретения. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничены ими, приведенные ниже радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15И 358, 90Υ, 99тТс, ш1п, 1251, 1311), флуоресцентные метки (например, флуоресцеинизотиоцианат или ФИТЦ, родамин или лантаноидные фосфоры), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные метки, гаптеновые метки, такие как биотинильные группы, и предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, домены связывания металлов или эпитопные выступы). В некоторых воплощениях метки присоединяют с помощью спейсерных плеч (таких как (СН2)п, где п< примерно 20) различной длины для уменьшения возможного стерического препятствия.
Термин биологический образец, как его используют здесь, включает, но не ограничен этим, любое количество вещества из живого организма или прежде жившего организма. Такие живые организмы включают, но не ограничены ими, людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных. Указанные вещества включают, но не ограничены ими, кровь, сыворотку, мочу, клетки, органы, ткани, кость, костный мозг, лимфатические узлы и кожу.
- 18 013614
Термин фармацевтический агент или лекарство, как его используют здесь, относится к химическому соединению или композиции, которые способны индуцировать желаемый терапевтический эффект при правильном введении пациенту. Выражение фармацевтически эффективное количество в отношении фармацевтической композиции, содержащей одно антитело или множество антител по изобретению, понимают как означающее согласно изобретению количество указанной фармацевтической композиции, которое способно прекратить у рассматриваемого пациента повышение порога чувствительности к внешним стимулам с возвратом порога чувствительности к уровню, сравнимому с уровнем, наблюдаемым у здоровых субъектов.
Расстройство представляет собой любое состояние, для которого будет благоприятным лечение по настоящему изобретению. Термины расстройство и состояние здесь используют взаимозаменяемо, и они охватывают хронические и острые ΝΟΕ-опосредованные расстройства или ΝΟΕ-опосредованные заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к обсуждаемому расстройству.
Термины ΝΟΕ-опосредованное заболевание и ΝΟΕ-опосредованное расстройство охватывают любое медицинское состояние или расстройство, связанное с повышенными уровнями ΝΟΕ или с повышенной чувствительностью к ΝΟΕ, включая, но не ограничиваясь ими, острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапию, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные и неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные жалобы с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, боль при диабетической невропатии, каузалгию, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочнокишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочнопищеводный рефлюкс, панкреатит и висцералгию.
Как их используют здесь, термины эффективное количество и терапевтически эффективное количество при использовании в отношении носителя или фармацевтической композиции, которые содержат одно или более чем одно человеческое антитело к человеческому ΝΟΕ, относятся к количеству или дозировке, которые достаточны для получения желаемого результата (то есть когда для терапии антителом с носителем или человеческими антителами к человеческому ΝΟΕ по настоящему изобретению желаемым результатом является желаемое уменьшение воспаления и/или боли, например) или для поддержания наблюдаемого снижения уровня одной или более чем одной биологической активности ΝΟΕ. Более конкретно, терапевтически эффективное количество представляет собой количество человеческого антитела (человеческих антител) к человеческому ΝΟΕ, достаточное для ингибирования в течение некоторого периода времени одного или более клинически определенных патологических процессов, связанных с обсуждаемым состоянием, например, воспаления или боли, у субъекта, которого лечат ίη νίνο этим агентом. В настоящем изобретении эффективное количество антитела к ΝΟΕ может предупреждать, останавливать, регулировать или уменьшать восприятие боли, связанное с каким-либо болезненным медицинским состоянием. В способах по настоящему изобретению термин регулировать и его грамматические варианты используют для обозначения предупреждения, частичного или полного ингибирования, уменьшения, задержки или замедления нежелательного события, например боли. Эффективное количество может варьировать в зависимости от конкретного выбранного антитела с носителем или человеческого антитела (человеческих антител) к человеческому ΝΟΕ, а также зависит от ряда факторов и условий, связанных с субъектом, подлежащим лечению, и от тяжести расстройства. Например, если антитело с носителем или человеческое антитело (человеческие антитела) к человеческому ΝΟΕ нужно вводить ίη νίνο, среди учитываемых факторов будут такие факторы, как возраст, масса и состояние здоровья пациента, а также кривые доза-ответ и данные по токсичности, полученные в доклинической работе на животных. Если агент нужно приводить с клетками в контакт ίη νίΐτο, можно также разработать ряд доклинических исследований ίη νίΐτο для оценки таких параметров, как захват, период полураспада, доза, токсичность и т.д. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества для данного агента хорошо известно в пределах компетенции специалиста в данной области.
Как их используют здесь, термины фактор роста нервной ткани и ΝΟΕ обозначают все виды нативной последовательности ΝΟΕ млекопитающих, включая рекомбинантный человеческий ΝΟΕ 1-120, показанный 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30.
- 19 013614
Как используют здесь, термины по существу чистый или по существу очищенный означают соединение или тип молекулы, то есть присутствующий преобладающий тип молекулы (то есть молекулярно его больше чем любых других отдельных типов молекул в композиции). В некоторых воплощениях изобретения, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, в которой эти молекулы составляют по меньшей мере примерно 50% (молекулярно) присутствующих типов макромолекул. В некоторых воплощениях, по существу, чистая композиция будет составлять более чем примерно 80, 85, 90, 95 или 99% всех типов макромолекул, присутствующих в композиции. В некоторых воплощениях этот тип молекул очищен, по существу, до гомогенности (молекулы примесей невозможно обнаружить в композиции общепринятыми способами обнаружения), где композиция состоит, по существу, из единственного типа макромолекул.
Термин пациент включает субъектов людей и животных.
Термины лечение и лечить относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. К тем, кто нуждается в лечении, относят как тех, кто уже страдает этим расстройством, так и тех, кто склонен к этому расстройству, либо тех, у кого это расстройство нужно предупреждать.
Если контекст не требует иного, информация об объектах в единственном числе относится и к объектам во множественном числе, а объекты во множественном числе охватывают и объекты в единственном числе.
Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитела к ΝΟΕ могут применяться для лечения невропатологической и воспалительной боли и ΝΟΕ-опосредованных заболеваний, включающих, но не ограниченных ими, упомянутые выше.
В одном аспекте изобретения предложены полностью человеческие моноклональные антитела против человеческого ΝΟΕ, обладающие биологической и иммунологической специфичностью к его связыванию. В одном аспекте в изобретении предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности для тяжелой и легкой цепи молекул иммуноглобулина, в частности, последовательности, соответствующие их вариабельным областям. Конкретными воплощениями данного аспекта изобретения являются последовательности, соответствующие областям, определяющим комплементарность (СИК), конкретно областям 0ΌΒ1-0ΌΒ3 тяжелой и легкой цепей, предложенных изобретением. Еще в одном аспекте изобретения предложены клетки и клеточные линии гибридомы, которые экспрессируют молекулы иммуноглобулина и антитела, предпочтительно моноклональные антитела по изобретению. В изобретении также предложены биологически и иммунологически очищенные препараты антител, предпочтительно моноклональных антител против человеческого ΝΟΕ, обладающих биологической и иммунологической специфичностью связывания с человеческим ΝΟΕ.
Возможность клонировать и реконструировать человеческий локус размером порядка мегабаз в дрожжевых искусственных хромосомах (УАС) и вводить их в линию зародышевых клеток мыши обеспечивает преимущественный подход к исследованию функциональных компонентов очень больших или приблизительно картированных локусов, а также к созданию полезных моделей заболевания человека. Кроме того, использование такой технологии для замещения мышиных локусов их человеческими эквивалентами обеспечивает уникальную возможность понимания экспрессии и регуляции человеческих генных продуктов в процессе развития, их взаимоотношения с другими системами и их вовлеченность в индукцию и прогрессирование заболевания.
Важным практическим применением такой стратегии является гуманизация мышиной гуморальной иммунной системы. Введение локусов человеческих иммуноглобулинов (1д) мышам, у которых эндогенные гены 1д инактивированы, дает возможность исследовать механизмы, лежащие в основе программируемой экспрессии и сборки антител, а также их роли в развитии В-клеток. Кроме того, такая стратегия обеспечивает источник получения полностью человеческих моноклональных антител (МАЬ).
Термин человеческое антитело охватывает антитела, имеющие вариабельные и константные области, по существу, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевых клеток человека. В некоторых воплощениях человеческие антитела продуцируют с использованием млекопитающих, не представляющих собой человека, включая, но не ограничиваясь ими, грызунов, таких как мыши и крысы, и зайцеобразных, таких как кролики. В некоторых воплощениях изобретения человеческие антитела продуцируют в клетках гибридомы. В некоторых воплощениях изобретения человеческие антитела продуцируют рекомбинантным путем.
Термин рекомбинантный применительно к антителу включает антитела, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными способами. Репрезентативные примеры включают антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфецированного в клетку-хозяина; антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител; антитела, выделенные из животного (например мыши), которое является трансгенным по человеческим генам иммуноглобулинов (см., например, Тау1ог, Ь.Р., е! а1., №с1. Ас1бк Кек. 20: 6287-6295 (1992)); или антитела, полученные, экспрессированные, сконструированные или выделенные любыми способами, в которые вовлечен сплайсинг последовательностей генов человеческих
- 20 013614 иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.
Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, имеющие происхождение от последовательностей иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека.
Человеческие антитела обладают по меньшей мере тремя преимуществами по сравнению с нечеловеческими и химерными антителами для применения в терапии человека:
1) в связи с тем, что эффекторный участок антитела является человеческим, он может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, разрушать клетки-мишени более эффективно посредством комплементзависимой цитотоксичности (СЭС) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (АОСС.'));
2) иммунная система человека не должна распознавать человеческое антитело как чужеродное и, следовательно, ответ антител против такого инъецированного антитела будет меньше, чем против полностью чужеродного нечеловеческого антитела или частично чужеродного химерного антитела;
3) сообщалось, что инъецированные нечеловеческие антитела обладают значительно более коротким периодом полураспада в системе кровообращения человека чем период полураспада человеческих антител. Инъецированные человеческие антитела будут обладать периодом полураспада, по существу, идентичным природным человеческим антителам, что дает возможность давать меньшие и менее частые дозы.
Таким образом, ожидают, что полностью человеческие антитела минимизируют иммуногенные и аллергические ответы, свойственные мышиным ΜΑΒ или ΜΑΒ мышиного происхождения, и, следовательно, повышают эффективность и безопасность вводимых антител. Полностью человеческие антитела по изобретению, следовательно, можно применять при лечении хронической и рецидивирующей боли, когда ее лечение требует повторного введения антител. Таким образом, одно из конкретных преимуществ антител к ΝΟΡ по изобретению состоит в том, что эти антитела являются полностью человеческими и их можно вводить пациентам неострым способом, при этом сводя к минимуму вредные реакции, обычно связанные с антителами человек-против-мыши или другими описанными ранее неполностью человеческими антителами из видов, не представляющих собой человека.
Специалист в данной области может сконструировать линии мышей с недостаточным продуцированием мышиных антител с большими фрагментами человеческих локусов 1д таким образом, что эти мыши будут продуцировать человеческие антитела при отсутствии мышиных антител. Большие фрагменты человеческих 1д могут сохранить как большое различие в вариабельных генах, так и правильную регуляцию продуцирования и экспрессии антител. При использовании мышиного клеточного аппарата для диверсификации и отбора антител и при отсутствии иммунологической толерантности к человеческим белкам воспроизводимый спектр человеческих антител в этих линиях мышей дает антитела с высоким аффинитетом против любого интересующего антигена, включая человеческие антигены. Используя гибридомную технологию, можно продуцировать и отбирать антигенспецифичные человеческие ΜΑΒ с желаемой специфичностью.
Можно использовать трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител без продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Перенос множества генов иммуноглобулинов клеток зародышевой линии человека в клетки зародышевой линии таких мутантных мышей приведет в результате к продуцированию человеческих антител после провокации антигеном (см., например, ИкоЬоуйк е! а1., Ргос. №111. Αсаб. 8с1. υ8Α, 90: 25512555 (1993); 1акоЬоуйк е! а1., №11иге. 362: 255-258 (1993); Вгиддетапп е! а1., Уеаг ίη 1ттип., 7: 33 (1993); №11иге 148: 1547-1553 (1994), №11иге Вю!есйпо1оду 14: 826 (1996); Сгокк, I. Α., е! а1., №!иге, 404: 995-999 (2000) и патенты США №№ 5877397, 5874299, 5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126, 5569825 и 5545806 (каждая из этих публикаций включена сюда путем ссылки в полном объеме для любых целей)). Человеческие антитела можно также продуцировать в библиотеках фагового дисплея (НоодепЬоот апб №т!ег, I. Мо1. Вю1., 227: 381 (1992); Магкк е! а1., I. Мо1. Вю1., 222: 581 (1991)). Методики Со1е е! а1. и Воегпег е! а1. также доступны для получения человеческих моноклональных антител (Со1е е! а1., Мопос1опа1 Αηί^Ьοб^ек апб Сапсег Тйегар, Α1ηη В. Ыкк, р. 77 (1985) и Воегпег е! а1., I. 1ттипо1., 147(1): 86-95 (1991)).
Рекомбинантные человеческие антитела можно также подвергать мутагенезу ίη νίίΐΌ (или когда используют трансгенное по последовательностям человеческих 1д животное - соматическому мутагенезу ίη У1уо) и, таким образом, аминокислотные последовательности УН И Уь областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей, родственных последовательностям УН и Уь линии зародышевых клеток человека, могут не существовать в природе в спектре антител линии зародышевых клеток человека ίη у1уо.
В некоторых воплощениях специалист в данной области может использовать константные области от видов, иных, чем человек, параллельно с человеческой(ими) вариабельной(ыми) областью(ями) у таких мышей для получения химерных антител.
Структура природных антител.
Структура природного антитела обычно представляет собой тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну полнораз
- 21 013614 мерную легкую цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область из примерно от 100 до 110 или более аминокислот, которая обычно ответственна за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи обычно определяет константную область, ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи обычно классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи обычно классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и изотип антитела определяют как 1дМ, 1дЭ, 1дС, 1дА и 1дЕ соответственно. 1дС имеет несколько подклассов, включающих, но не ограничиваясь ими, 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. 1дМ имеет подклассы, включающие, но не ограниченные ими, 1дМ1 и 1дМ2. 1дА, подобным образом, подразделяют на подклассы, включающие, но не ограниченные ими, 1дА1 и 1дА2. Внутри полноразмерных легких и тяжелых цепей обычно вариабельные и константные области соединены областью 1 примерно из 12 или более аминокислот, где тяжелая цепь также включает область Ό примерно из 10 или более аминокислот. См., например, ЕυN^АΜЕNΤА^ IММυNΟ^ΟСΥ, СИ. 7, 2п6 еб. (Раи1. \., еб.), 1989, Катен Ргекк. N. Υ. (включена путем ссылки в полном объеме для любой цели).
Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий сайт.
Вариабельные области обычно имеют такую же общую структуру относительно консервативных каркасных участков (ЕК, Γπ·ιιικ\\όγ1< ш^юпк), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (СЭК). СЭК от двух цепей каждой пары обычно выровнены по каркасным участкам, которые могут обеспечить связывание со специфичным эпитопом. От №конца к С-концу вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно содержат домены ЕК1, СЭКЕ ЕК2, СЭК2, ЕКЗ, СЭК3 и ЕК4. Распределение аминокислот по каждому домену обычно находится в соответствии с определениями КаЬаί Зесц-Ювеек οΓ РгсЛеиъ οΓ Ιιηιηιιηοίορίοαΐ КИегеЧ (1987 аиб 1991, №·ιΙίοηΗ1 ИъбЦЦек οΓ Неа1111, ВеШекба, Мб.) или С1ю11иа & Ьекк, 1987, 1. Μοί. Βίο1. 196: 901-917; С^Ыа е1 а1., 1989, Уинге 342: 878-883.
Антитела двойной специфичности или бифункциональные антитела.
Антитело двойной специфичности или бифункциональное антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных сайта связывания. Антитела двойной специфичности могут быть получены с помощью ряда методик, включая, но не ограничиваясь ими, слияние гибридом или сшивку Е(аЬ') фрагментов. См., например, 8οη§5ίνί1ηί & ^асйтаηη, 1990, С1ш. Ехр. Iттиηο1. 79: 315-321: Κοδί^ΐηγ еί а1., 1992, 1. Iттиηο1. 148: 1547-1553.
Получение антител.
В изобретении предложены антитела, которые связываются с человеческим NСЕ. Эти антитела могут быть получены путем иммунизации полноразмерным NСЕ или его фрагментами. Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными и/или могут представлять собой рекомбинантные антитела. В предпочтительных воплощениях антитела по изобретению представляют собой человеческие антитела, полученные, например, путем иммунизации трансгенных животных, способных к продуцированию человеческих антител (см., например, публикацию международной патентной заявки \\Ό 93/12227).
Области, определяющие комплементарность (СЭЯ), вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к NСЕ по изобретению, могут быть перенесены в каркасные участки (ЕК) от того же или другого вида. В некоторых воплощениях СЭК вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к NСЕ могут быть перенесены в согласованные человеческие ЕК. Для создания согласованных ЕК человека ЕК из нескольких аминокислотных последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи человека выравнивают, чтобы идентифицировать согласованную аминокислотную последовательность. ЕК тяжелой цепи или легкой цепи антитела к NСЕ могут быть замещены ЕК из другой тяжелой цепи или легкой цепи. Редкие аминокислоты в ЕК тяжелых и легких цепей антитела к NСЕ обычно не заменяют, тогда как остальные аминокислоты ЕК могут быть заменены. Редкие аминокислоты представляют собой специфичные аминокислоты, которые находятся в положениях, в которых они не обязательно находятся в ЕК. Перенесенные вариабельные области из антител к NСЕ по изобретению можно использовать с константной областью, которая является отличной от константной области антитела к NСЕ. Альтернативно перенесенные вариабельные области составляют часть единственной цепи Ет антитела. Перенос СЭК описан, например, в патентах США №№ 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101, которые включены сюда путем ссылки для любой цели.
Антитела по изобретению предпочтительно получают, используя трансгенных мышей, у которых существенная часть локуса, продуцирующего человеческое антитело, встроена в клетки мышей, продуцирующие антитела, и у которых, кроме того, генно-инженерным путем создана недостаточность продуцирования эндогенных мышиных антител. Такие мыши способны к продуцированию молекул человеческих иммуноглобулинов и антител и не продуцируют или продуцируют значительно сниженные количества молекул мышиных иммуноглобулинов и антител. Технологии, используемые для достижения этого результата, раскрыты в патентах, заявках и ссылках, приведенных здесь в описании. В предпочтитель
- 22 013614 ных воплощениях специалист в данной области может использовать способы, как описано в публикации международной патентной заявки № \¥О 98/24893, которая включена сюда путем ссылки для любой цели. См. также Меибех е! а1., 1997, Ыа1иге Сеиебск 15: 146-156, которая включена сюда путем ссылки для любой цели.
Моноклональные антитела (тАЬ) по изобретению могут быть получены с помощью ряда методик, включая традиционную технологию моноклональных антител, например стандартную методику гибридизации соматических клеток КоЫег аиб М11к!ет (1975, №11иге 256: 495). Хотя методики гибридизации соматических клеток предпочтительны, в принципе, можно использовать другие методики для получения моноклональных антител, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышь. Получение гибридомы мыши очень хорошо отработано, и протоколы и методики иммунизации для выделения иммунизированных спленоцитов для слияния хорошо известны в данной области. Партнеры слияния (например, клетки миеломы мыши) и методики слияния также известны.
В предпочтительном воплощении человеческие моноклональные антитела, направленные против ΝΟΡ, могут быть получены с использованием трансгенных мышей, несущих части человеческой иммунной системы вероятнее, чем мышиной системы. Эти трансгенные мыши, называемые здесь мышами НиМаЬ, содержат мини-локус гена иммуноглобулина человека, который кодирует не перестроенные последовательности тяжелых (μ и γ) и легкой к цепей иммуноглобулина человека вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ и к цепей (ЬоиЬегд е! а1., 1994, №11иге 368: 856-859). Соответственно, эти мыши проявляют сниженную экспрессию мышиных 1дМ или к и в ответ на иммунизацию внедренные трансгены тяжелой цепи и легкой цепи человека претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием человеческих моноклональных антител 1дС к высокого аффинитета (ЬоиЬегд е! а1., см. выше; ЬоиЬегд аиб Никхаг, 1995, 1и!ет. Кем. 1ттиио1. 13: 65-93; Нагбтд аиб ЬоиЬегд, 1995, Аии. Ν. Υ. Асаб. 8с1. 764: 536-546). Получение мышей НиМаЬ подробно описано в Тау1ог е! а1., 1992, М1с1е1с Ас1бк Кек. 20: 6287-6295; Сйеи е! а1., 1993, 1и!ета!юиа1 1ттиио1оду 5: 647-656; ТиаШои е! а1., 1994, I 1ттиио1. 152: 2912-2920; ЬоиЬегд е! а1., 1994, №11иге 368: 856-859; ЬоиЬегд, 1994, НаибЬоок ок Ехр. РБагтасо1оду 113: 49-101: Тау1ог е! а1., 1994, 1и!етабоиа1 1ттиио1оду 6: 579591; ЬоиЬегд & Никхаг 1995, 1и!еги. Кем. 1ттиио1. 13: 65-93; Нагбшд & ЬоиЬегд, 1995, Аии. Ν. Υ. Асаб. δα 764: 536-546; ИккМ1б е! а1., 1996. №11иге Β^о!есйηо1оду 14: 845-851; содержание всех этих публикаций включено в данное описание изобретения путем ссылки в полном объеме. См. дополнительно патенты США №№ 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; авторы всех ЬоиЬегд и Кау, а также патент США № 5545807, авторы 8игаш е! а1.; публикации международных патентных заявок №№ \¥О 93/1227, опубликованной 24 июня 1993; \УО 92/22646, опубликованной 23 декабря 1992, и \УО 92/03918, опубликованной 19 марта 1992, причем содержание всех вышеуказанных документов включено сюда путем ссылки в полном объеме. Или же трансгенные линии мышей НСо7, Нсо12 и КМ, описанные ниже в примерах, можно использовать для создания человеческих антител к Ν6Ρ.
Настоящим изобретением предложены человеческие моноклональные антитела, которые являются специфичными к биологически активным полипептидам человеческого ΝΟΡ и нейтрализуют их. Предложены также аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антител, которые являются высокоспецифичными к полипептидам ΝΟΡ и нейтрализуют их при связывании с ними. Эта высокая специфичность обеспечивает человеческим антителам к человеческому ΝΟΡ и человеческим моноклональным антителам с подобной специфичностью эффективность при иммунотерапии заболеваний, связанных с Ν6Ρ.
В одном аспекте в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, которые связывают такой же или, по существу, такой же эпитоп, что и антитело 4Ό4, предложенное здесь.
В одном аспекте в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, содержащие по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, показанных в 8ЕО Ш NО: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 79-130, которые связывают эпитоп полипептида ΝΟΡ с высоким аффинитетом и обладают способностью антагонизировать активность полипептида ΝΟΡ. Предпочтительно эти антитела связывают такой же или, по существу, такой же эпитоп, что и антитело 4Ό4, предложенное здесь.
В предпочтительных воплощениях изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом ΝΟΡ с константой диссоциации (Кс) 1 х 10-9 М или менее и ингибируют индуцированное ΝΟΡ выживание в анализе нейтрализации ш νίΙΐΌ при 1С50 1х10-7 М или менее. В более предпочтительных воплощениях изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом ΝΟΡ с константой диссоциации (Кс) 1х10-10 М или менее и ингибируют индуцированное ΝΟΡ выживание в анализе нейтрализации 1и νίΙΐΌ при 1С50 1 х 10-8 М или менее. В еще более предпочтительном воплощении изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом ΝΟΡ с константой диссоциации (Кс) 1х10-11 М или менее и ингибируют индуцированное ΝΟΡ выживание в анализе нейтрализации 1и νίΙΐΌ при 1С50 1 х 10-9 М или менее. Примеры человеческих антител к человеческому ΝΟΡ, которые соответствуют вышеупомянутым критериям связывания и нейтрализации, приведены здесь.
- 23 013614
Наиболее предпочтительное человеческое антитело к человеческому N0? по настоящему изобретению называется здесь 4Ό4 и имеет полипептидные последовательности У|, и УН, как показано в 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 10 соответственно. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая Уъ и УН 4Ό4, показана в 8Е0 ΙΌ N0: 11 и 8Е0 ΙΌ N0: 9 соответственно. Свойства человеческих антител к человеческому N0? по настоящему изобретению конкретно раскрыты в примерах. Особенно важным является высокий аффинитет к полипептиду N0? и высокая способность антагонизировать активность полипептида N0?, продемонстрированная здесь.
Константу диссоциации (Кс) человеческого антитела к человеческому N0? можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса, как в общих чертах описано в примере 9. В общих чертах анализ поверхностного плазмонного резонанса измеряет взаимодействия связывания в реальном времени между лигандом (рекомбинантным полипептидом N0?, иммобилизованном на биосенсорной матрице) и анализируемым веществом (антителами в растворе) с помощью поверхностного плазмонного резонанса (8РК, кигГасе р1актоп гекопапсе), используя систему ЫАсоге (Ркагташа Вюкепког, Р1кса!а^ау, N1). Поверхностный плазмонный анализ можно также проводить путем иммобилизации анализируемого вещества (антител на биосенсорном матриксе) и презентации лиганда (рекомбинантного У в растворе). Константу диссоциации (Кс) человеческого антитела к человеческому N0? можно также определить с использованием методологии К1пЕхА. В некоторых воплощениях изобретения антитела связываются с N0? с Си между примерно 10-8 М и 10-12 М. Термин Кс, как его используют здесь, следует относить к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Для целей настоящего изобретения 1<и определяют, как показано в примере 9.
В предпочтительном воплощении антитела по изобретению относятся к изотипу ^01, ^02, ^03 или ^04. Предпочтительно антитела относятся к изотипу ^03. Более предпочтительно антитела относятся к изотипу ^01. Наиболее предпочтительно антитела относятся к изотипу ^02. В других воплощениях антитела по изобретению относятся к изотипу ^М, ^А, [дЕ или !дЭ. В предпочтительных воплощениях изобретения антитела содержат легкую цепь каппа человека и тяжелую цепь ^01, ^02, ^03 или ^04 человека. Экспрессия антител по изобретению, содержащих константную область тяжелой цепи ^01 или ^02, описана в приведенных ниже примерах. В конкретных воплощениях вариабельные области антител лигированы с константной областью, иной, чем константная область для изотипа ^01, ^02, ^03 или ^04. В некоторых воплощениях антитела по изобретению клонированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
В некоторых воплощениях консервативные модификации тяжелых цепей и легких цепей антител к N0? (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидов) будут давать антитела к N0?, обладающие функциональными и химическими характеристиками, подобными характеристикам антител к N0?, раскрытых здесь. Напротив, существенные модификации в функциональных и/или химических характеристиках антител к N0? можно осуществить путем отбора замен в аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей, которые значительно отличаются по их воздействию на сохранение (а) структуры молекулярного каркаса в области замены, например, в виде листовой или спиральной конформации, (б) изменение гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (в) объем боковой цепи.
Например, консервативная аминокислотная замена может включать замену нативного аминокислотного остатка ненативным остатком, которая оказывает небольшое или не оказывает воздействие на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Кроме того, любой нативный остаток в полипептиде может быть также заменен аланином, как описано ранее для аланинового сканирующего мутагенеза.
Желаемые аминокислотные замены (либо консервативные, либо неконсервативные) могут быть определены специалистом в данной области в тот момент, когда такие замены желательны. В некоторых воплощениях аминокислотные замены можно использовать для идентификации важных остатков антитела к N0?, либо для повышения или снижения аффинитета антител к N0?, описанных здесь.
Как хорошо известно, минорные изменения аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, немногих или даже нескольких аминокислот, может привести к аллельной форме исходного белка, которая обладает, по существу, идентичными свойствами. Следовательно, в дополнение к антителам, конкретно описанным здесь, можно легко разрабатывать и производить другие по существу гомологичные антитела, используя различные методики рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалистам в данной области. В целом модификации генов можно легко осуществить с помощью ряда хорошо известных методик, таких как сайт-направленный мутагенез. Поэтому в настоящем изобретении рассмотрены варианты или мутанты человеческих антител к N0?, обладающие характеристиками, по существу, подобными характеристикам человеческих антител к N0?, раскрытым здесь (см., например, \¥0 00/56772, которая полностью включена сюда путем ссылки). Таким образом, под термином вариант или мутант в отношении человеческого антитела к N0? подразумевают любую связывающую молекулу (молекулу X), (1) в которой гипервариабельные области СЭК1, СЭР2 и СЭК3 тяжелой цепи или гипервариабельные области СОРТ, СЭК2 и СЭК3 легкой цепи, взятые в целом, по меньшей мере на 80% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичны, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны гипервариабельным областям, показан
- 24 013614 ным в 8Е0 ΙΌ N0: 22, 18 и 14 или 8Е0 ΙΌ N0: 24, 20 и 16 соответственно, и (й) где вариант или мутант способен к ингибированию активности человеческого N0? в той же степени, что и сравнительное человеческое антитело к N0?, имеющего каркасные участки, идентичные каркасным участкам молекулы X.
Обычно вариант человеческого антитела к N0? будет иметь СПИ легкой и/или тяжелой цепи, при рассмотрении вместе имеющие по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 14, 18 и 22 и/или 8Е0 ΙΌ N0: 16, 20 и 24 соответственно.
Более предпочтительно вариант человеческого антитела к N0? будет иметь вариабельные области легкой цепи, при рассмотрении вместе имеющие по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, как показано в 8Е0 ΙΌ N0: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 или 91, и/или вариабельную область тяжелой цепи, взятую в целом, которая имеет по меньшей мере примерно 70% идентичности аминокислотной последовательности, предпочтительно по меньшей мере примерно 75% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 10, 81, 83, 85 или 87.
Термин вариант применительно к полинуклеотиду следует относить к молекуле нуклеиновой ки
- 25 013614 слоты, имеющей по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности с полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. Обычно полинуклеотидный вариант будет иметь по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности с новой нуклеиново-кислотной последовательностью, раскрытой в данной заявке.
В конкретных воплощениях изобретения предложены антитела, которые имеют процент идентичности с антителом по изобретению, или антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, СЭРЕ СЭР2 или СЭР3 область, которые имеют процент идентичности с вариабельной областью тяжелой цепи, вариабельной областью легкой цепи, СЭРЕ СЭР2 или ί.ΌΡ3 областью по изобретению, как показано здесь в примере 10 и на фиг. 5-10.
В некоторых воплощениях изобретения предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервов и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 75% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 10, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 85 или 95% гомологичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 81, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 85 или 95% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 83, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 85, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 75 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 87, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 56% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 79, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В некоторых воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70, 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 12, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 80, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 74, 90 или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 88, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 85 или 87% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ: 89, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85, 90 или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕО ΙΌ NΟ:
- 26 013614
90, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85, 90, 95 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 91, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 96% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 82, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 84, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; или по меньшей мере на 70, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 86, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В некоторых других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СОК! тяжелой цепи человека, где СОК! тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40 или 60% идентична аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 98, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 105, 8ΕΟ ГО ΝΟ: 110 или 8ΕΟ ГО ΝΟ: 22, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОК2 тяжелой цепи человека, где СГОК2 тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70, 82 или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 99, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 76% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 106, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 59% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 18, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 117, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70, 75 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 111, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
Еще в других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СОК! легкой цепи человека, где СОК! легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ:
101, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 95, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 119, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 122, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 125, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 24, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 107, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 113, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В дополнительных воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СГОК2 легкой цепи человека, где СГОК2 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ:
102, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 96, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 120, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 123, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, пока
- 27 013614 занной в 8ЕО ΙΌ N0: 126, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 129, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 20, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 108, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 133, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 114, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
В других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит СЭК3 легкой цепи человека, где СЭК3 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 103, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 97, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8>Е0 ΙΌ N0: 121, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 127, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 130, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 16, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 109, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 134, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 115, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина.
Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела 4Ό4 показаны в БЕЦ ΙΌ N0: 10 и 12 соответственно. Однако многие из потенциальных СЭК-контактных остатков могут быть заменены другими аминокислотами и все же дают возможность антителу сохранять существенный аффинитет к антигену. Подобным образом многие из структурных остатков, не находящихся в контакте с СОК в тяжелой и легкой цепях, могут приобретать замены аминокислот из соответствующих положений из других человеческих антител согласованными аминокислотами человека или из других мышиных антител без значительной потери аффинитета или неиммуногенности человеческого антитела. Можно использовать разные альтернативные аминокислоты для получения вариантов описанных антител к NСЕ и их фрагментов, имеющих варьирующие комбинации аффинитета, специфичности, неиммуногенности, простоты производства и других желаемых свойств.
В альтернативных воплощениях изобретения антитела по изобретению можно экспрессировать в клеточных линиях, иных, чем клеточные линии гибридомы. В этих воплощениях последовательности, кодирующие конкретные антитела, можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего. В соответствии с этими воплощениями трансформация может быть достигнута любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукцию клетки-хозяина этим вирусом (или вектором), либо с помощью методик трансфекции, известных в данной области, примеры которых приведены в патентах США №№ 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (все источники включены сюда путем ссылки для любой цели). Как правило, используемая методика трансформации может зависеть от хозяина, подлежащего трансформации. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают, но не ограничены ими, трансфекцию, опосредованную декстраном, кальцийфосфатную преципитацию, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, константной области легкой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела NСЕ по изобретению, встраивают в подходящий экспрессионный вектор, используя стандартные методики лигирования. В предпочтительном воплощении констант
- 28 013614 ную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела к ΝΟΓ присоединяют к С-концу соответствующей вариабельной области и лигируют в экспрессионный вектор. Этот вектор обычно выбран как функциональный в конкретной используемой клетке-хозяине (то есть этот вектор является совместимым с аппаратом клетки-хозяина, так чтобы могла проходить амплификация гена и/или экспрессия гена). В качестве обзора экспрессионных векторов см. МЕТН. Е№. 185 (Соеббе1, еб.), 1990, Асабепнс Ргекк.
Обычно экспрессионные векторы, используемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать последовательности для поддержания плазмид и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, все вместе называемые фланкирующими последовательностями, в некоторых воплощениях будут обычно включать одну или более чем одну из следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или более чем одну энхансерную последовательность, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полноразмерную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подлежащий экспрессии, и селективный маркерный элемент. Каждая из этих последовательностей обсуждается ниже.
Возможно, вектор может содержать последовательность, кодирующую выступ, то есть олигонуклеотидную молекулу, локализованную при 5' или 3' конце кодирующей последовательности полипептида антитела к ΝΟΓ; эта олигонуклеотидная последовательность кодирует поли-Нб (такой как гекса-Нщ) или другой выступ, такой как ЕЬАС, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или тус, для которых существуют имеющиеся в продаже антитела. Этот выступ обычно сливается с полипептидом при экспрессии этого полипептида и может служить в качестве средства для аффинной очистки или обнаружения антитела ΝΟΓ из клетки-хозяина. Аффинную очистку можно проводить, например, с помощью колоночной хроматографии, используя антитела против выступа в качестве матрицы аффинитета. Возможно, этот выступ можно впоследствии удалить из очищенного полипептида антитела к ΝΟΓ различными способами, такими как использование некоторых пептидаз для расщепления.
Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (то есть из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (то есть из видов, иных, чем вид или штамм клеткихозяина), гибридными (то есть комбинация фланкирующих последовательностей более чем из одного источника), синтетическими или нативными. Как таковой, источник фланкирующей последовательности может представлять собой любой прокариотический или эукариотический организм, любой организм позвоночного или беспозвоночного или любого растения при условии, что фланкирующая последовательность является функциональной в этом организме, и может активироваться аппаратом клеткихозяина.
Фланкирующие последовательности, применимые в векторах по данному изобретению, могут быть получены любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области. Обычно фланкирующие последовательности, применимые здесь, будут представлять собой идентифицированные ранее путем картирования и/или ферментативного гидролиза эндонуклеазами рестрикции и, таким образом, могут быть выделены из подходящей ткани-источника с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции. В некоторых случаях полноразмерная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности может быть известна. Поэтому фланкирующую последовательность можно синтезировать, используя способы, описанные здесь для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.
Независимо от того, известна ли вся фланкирующая последовательность или только ее участок, она может быть получена с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или путем скрининга геномной библиотеки подходящим зондом, таким как олигонуклеотид и/или фрагмент фланкирующей последовательности из того же или из другого вида. Где фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, можно выделить из большего участка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение можно осуществить с помощью гидролиза эндонуклеазами рестрикции с получением верного фрагмента ДНК с последующим выделением, используя очистку из агарозного геля, хроматографию на колонке 01адеп (ОиЛклуоПк СА) или другие способы, известные специалистам в данной области. Выбор подходящих ферментов для осуществления этой цели будет легко очевиден специалисту в данной области.
Точка начала репликации обычно представляет собой часть тех прокариотических векторов, которые имеются в продаже, и точка начала репликации способствует амплификации вектора в клеткехозяине. Если выбранный вектор не содержит сайт точки начала репликации, его можно синтезировать химическим путем на основании известной последовательности и лигировать в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды рВК322 (№\ν Епд1апб В1о1аЬ§, Веуег1у, МА) является пригодной для большинства грамотрицательных бактерий, а различные точки начала репликации вирусного происхождения (например, 8У40, вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (У8У) или вирусов папилломы, таких как НРУ или ВРУ) полезна для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, компонент точки начала репликации не требуется для экспрессионных векторов млекопи
- 29 013614 тающих (например, точку начала репликации 8У40 часто используют только потому, что она также содержит ранний промотор этого вируса).
Последовательность терминации транскрипции обычно локализована 3' к концу кодирующей области полипептида и служит для терминации транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой С-С богатый фрагмент, за которым следует последовательность поли-Т. Хотя эту последовательность легко клонируют из библиотеки или даже приобретают коммерческим путем в виде части вектора, ее также можно легко синтезировать, используя способы синтеза нуклеиновых кислот, такие как описаны здесь.
Селективный маркерный ген кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, растущей в селективной культуральной среде. Типичные селективные маркерные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или к другим токсинам, например к ампициллину, тетрациклину или канамицину для прокариотических клеток-хозяев; (б) комлементируют ауксотрофные дефициты клетки или (в) обеспечивают критические питательные вещества, недоступные из комплексной или определенной среды. Предпочтительными селективными маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Предпочтительно ген устойчивости к неомицину можно также использовать для селекции как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах.
Другие селективные гены можно использовать для амплификации гена, который будет экспрессироваться. Амплификация представляет собой процесс, где гены, которые требуются для продуцирования белка, критичного для роста или выживания клетки, тандемно повторяются в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примеры пригодных селективных маркеров для клеток млекопитающих включают гены дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) и беспромоторные гены тимидинкиназ. Трансформанты клеток млекопитающих помещают в условия давления отбора, где трансформанты уникально адаптированы к выживанию только благодаря присутствию селективного гена в векторе. Давление отбора создают путем культивирования трансформированных клеток в условиях, в которых концентрацию селективного агента в среде постепенно повышают, что приводит в результате к амплификации как селективного гена, так и ДНК, которая кодирует другой ген, такой как антитело, связывающееся с полипептидом NСΕ. В результате с амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества полипептида, такого как антитело к NСΕ.
Сайт связывания рибосомы обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-Далгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты). Этот элемент обычно локализован 3' к промотору и 5' к кодирующей последовательности полипептида, подлежащего экспрессии.
В некоторых случаях, например, где желательно гликозилирование в экспрессионной системе эукариотической клетки-хозяина, можно манипулировать с различными пре- или пропоследовательностями для улучшения гликозилирования или выхода. Например, можно изменить сайт расщепления пептидазы конкретного сигнального пептида или добавить пропоследовательности, которые могут также влиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может иметь в положении -1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или более чем одну дополнительную аминокислоту, несущественную для экспрессии, которая может не быть полностью удалена. Например, конечный белковый продукт может иметь один или два аминокислотных остатка, находящихся в сайте расщепления пептидазы, присоединенных к аминоконцу. Альтернативно результатом использования некоторых сайтов ферментативного расщепления может быть слегка укороченная форма желаемого полипептида, если фермент режет в такой области внутри зрелого полипептида.
Векторы экспрессии и клонирования по изобретению будут обычно содержать промотор, который распознается организмом-хозяином и оперативно сцеплен с молекулой, кодирующей антитело к NСΕ. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, локализованные вверх по течению (то есть 5') к стартовому кодону структурного гена (обычно в пределах примерно от 100 до 1000 п.о.), которые регулируют транскрипцию структурного гена. Промоторы общепринято группируют в один из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции с ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение условий культивирования, такое как наличие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. Конститутивные промоторы, с другой стороны, однородно транскрибируют ген, с которым они оперативно сцеплены, то есть при небольшом или при отсутствии контроля над экспрессией гена. Известно большое число промоторов, распознаваемых рядом потенциальных клеток-хозяев. Подходящий промотор оперативно сшивают с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, составляющие антитело к NСΕ по изобретению, путем удаления промотора из источника ДНК путем гидролиза ферментом рестрикции и встраивания желаемой промоторной последовательности в этот вектор.
Подходящие промоторы для использования в дрожжевых хозяевах хорошо известны в данной области. Дрожжевые энхансеры предпочтительно используют с дрожжевыми промоторами. Подходящие промоторы для использования с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны и включают, но не ограничены ими, те, которые получены из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вируса ίοΜροχ,
- 30 013614 аденовируса (такого как аденовирус 2), вируса бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса, ретровирусов, вируса гепатита В и наиболее предпочтительно вируса обезьян 40 (δν40). Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например термошоковые промоторы и промотор актина.
Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес, включают, но не ограничены ими, ранний промотор 8У40 (Вето18! ан6 СЕатЬон. 1981, №11иге 290: 304-10); промотор СМУ (ТЕопъен е! а1., 1984, Ргос. ИаИ. Аса6. υδΑ 81: 659-663); промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (ХапатоЮ, е! а1., 1980, Се11 22: 787-97); промотор тимидинкиназы герпеса (\¥адиег е! а1., 1981, Ргос. №111. Αса6. δα. υ. δ. Α. 78: 1444-45); промотор и регуляторные последовательности из гена металлотионеина (Впп51ег е! а1., 1982, №11иге 296: 39-42); и прокариотические промоторы, такие как промотор β-лактамазы (УШа-КатагоГГ е! а1., 1978, Ргос. №111. Αса6. δα. υ.δ.Α., 75: 3727-31) или промотор !ас (ИеВоег е! а1., 1983, Ргос. Νηΐΐ. Αса6. δα. υ. δ. Α., 80: 21-25). Интерес также представляют перечисленные ниже контролирующие области транскрипции животных, которые проявляют тканеспецифичность и использовались в трансгенных животных: контролирующая область гена эластазы I, которая активна в ацинарных клетках поджелудочной железы (δχνίΠ е! а1., 1984, Се11 38: 639-46: Ογπι!ζ е! а1., 1986, Со16 δρπη§ НагЬог δутρ. ОнагИ. Вю1. 50: 399-409 (1986): МасИот^, 1987, Нера!о1оду 7: 425-515); контролирующая область гена инсулина, которая активна в β-клетках поджелудочной железы (НапаЕап,
1985, ΝιΙιιιό 315: 115-22); контролирующая область гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (6го88сЕе61 е! а1., 1984, Се11 38: 647-58; Α6ате8 е! а1., 1985, ΝιΙιιιό 318: 533-38; ΛΕχιι^γ е! а1., 1987, Мо1. Се11. Вю1., 7: 1436-44): контролирующая область вируса опухоли молочной железы мыши, которая активна в клетках семенников, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Ье6ег е! а1.,
1986, Се11 45: 485-95); контролирующая область гена альбумина, которая активна в печени (Р^пке^( е! а1.,
1987, 6еηе8 1п6 ЭеуеЕ 1: 268-76); контролирующая область гена α-фето-протеина, которая активна в печени (Кгит1аи£ е! а1., 1985, Мо1. Се11. Вю1., 5: 1639-48; Наттег е! а1., 1987, δ^ι^ 235: 53-58); контролирующая область гена α-1-антитрипсина, которая активна в печени (КеИеу е! а1., 1987, 6еηе8 1п6 ЭеуеЕ 1: 161-71); контролирующая область гена β-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Модгат е! а1. 1985, ΝιΙιιιό 315: 338-40; КоШаз е! а1., 1986, Се11 46: 89-94); контролирующая область гена основного белка миелина, которая активна в олигодендроцитах в головном мозге (Веа6Ееа6 е! а1., 1987, Се11 48: 70312); контролирующая область гена легкой цепи-2 миозина, которая активна в скелетных мышцах (ЬанЕ 1985, ΝιΙιιιό 314: 283-86), и контролирующая область гена гормона, высвобождающего гонадотропин, которая активна в гипоталамусе (Махон е! а1., 1986, δ^ι^ 234:1372-78).
Энхансерная последовательность может быть встроена в вектор для усиления транскрипции ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, составляющие антитело к Ν6Ρ по изобретению, высшими эукариотами. Энхансеры представляют собой цис-активные элементы ДНК, обычно примерно 10-300 п.о. в длину, которые действуют на промотор с усилением транскрипции. Энхансеры являются относительно независимыми от ориентации и положения, обнаруженные в положениях как 5', так и 3' к транскрипционной единице. Некоторые энхансерные последовательности, доступные из генов млекопитающих, известны (например, глобина, эластазы, альбумина, α-фето-протеина и инсулина). Обычно, однако, используют энхансер из вируса. Энхансер δν40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы и энхансеры аденовируса, известные в данной области, являются примерными энхансерными элементами для активации эукариотических промоторов. Хотя энхансер может быть расположен в векторе либо 5', либо 3' к кодирующей последовательности, он обычно локализован в сайте 5' от промотора.
Экспрессионные векторы по изобретению можно конструировать из исходного вектора, такого как вектор, имеющийся в продаже. Такие векторы могут содержать или не содержать все желаемые фланкирующие последовательности. Где одна или более чем одна из фланкирующих последовательностей, описанных здесь, еще не присутствует в векторе, ее можно получить индивидуально и лигировать в вектор. Способы, используемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалистам в данной области.
После того как вектор сконструирован, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, тяжелую цепь или легкую цепь и тяжелую цепь, составляющие антитело к Ν6Γ, встроена в правильный сайт этого вектора, законченный вектор можно вводить в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформацию экспрессионного вектора для антитела к Ν6Γ в выбранную клетку-хозяина можно осуществить хорошо известными способами, включая трансфекцию, инфекцию, кальцийфосфатную копреципитацию, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, трансфекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном, или другие известные методики. Выбранный способ отчасти будет функцией от типа клетки-хозяина, которую нужно использовать. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту в данной области и описаны, например, в δатЬ^оок е! а1., см. выше.
Клетка-хозяин, когда ее культивируют в подходящих условиях, синтезирует антитело к Ν6Γ, которое затем можно собрать из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или не
- 31 013614 посредственно из клетки-хозяина. продуцирующей его (если оно не секретируется). Выбор подходящей клетки-хозяина будет зависеть от ряда факторов. таких как желаемые уровни экспрессии. модификации полипептида. которые являются желательными или необходимыми для активности (такие как гликозилирование или фосфорилирование). и простота упаковки в биологически активную молекулу.
Клеточные линии млекопитающих. доступные в качестве хозяев для экспрессии. хорошо известны в данной области и включают. но не ограничены ими. бессмертные клеточные линии. доступные из Американской коллекции типовых клеточных культур (АТСС. Атепсап Туре Си1!иге Со11ес!юп). включающие. но не ограниченные ими. клетки яичника китайского хомячка (СНО). клетки НеЬа. клетки почек новорожденного хомячка (ВНК). клетки почек обезьяны (СО8). клетки печеночно-клеточного рака человека (например. Нер 02) и ряд других клеточных линий. В некоторых воплощениях клеточные линии могут быть выбраны на основании определения. какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и конститутивно продуцируют антитела с ΝΟΡ-связывающими свойствами. В другом воплощении может быть выбрана клеточная линия из линии В клеток. которые не продуцируют собственное антитело. но обладают способностью продуцировать и секретировать гетерологичное антитело.
Антитела по изобретению полезны для обнаружения ΝΟΕ в биологических образцах и идентификации клеток или тканей. которые продуцируют белок ΝΟΡ. Антитела по изобретению. которые специфично связываются с ΝΟΡ. могут быть полезны при лечении опосредованных ΝΟΡ заболеваний. Указанные антитела можно использовать в анализах связывания для обнаружения ΝΟΡ и для ингибирования ΝΟΡ в результате образования комплекса с рецепторами ΝΟΡ. Указанные антитела. которые связываются с ΝΟΡ и блокируют взаимодействие с другими связывающими соединениями. могут обладать терапевтической пользой при модулировании опосредованных ΝΟΡ заболеваний. В предпочтительных воплощениях антитела к ΝΟΡ могут блокировать связывание ΝΟΡ с его рецептором. результатом чего может быть прерывание индуцированного ΝΟΡ каскада преобразования сигнала.
Настоящее изобретение также относится к применению одного или более антител по настоящему изобретению в производстве лекарства для лечения у пациента болезненного расстройства или состояния. вызванного повышенной экспрессией ΝΟΡ или повышенной чувствительностью к ΝΟΡ. такого как любое из расстройств или состояний. раскрытых здесь.
В предпочтительных воплощениях в изобретении предложены фармацевтические композиции. содержащие терапевтически эффективное количество одного или множества антител по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем. носителем. солюбилизирующим агентом. эмульгирующим агентом. консервантом и/или адъювантом. Предпочтительно приемлемые вещества для препаратов нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях. В предпочтительных воплощениях предложены фармацевтические композиции. содержащие терапевтически эффективное количество антител к ΝΟΡ.
В некоторых воплощениях приемлемые вещества для препаратов предпочтительно нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция может содержать вещества для препаратов для модификации. сохранения и консервации. например. рН. осмолярности. вязкости. прозрачности. цвета. изотонических свойств. запаха. стерильности. стабильности. скорости растворения или высвобождения. адсорбции или всасывания композиции. В таких воплощениях подходящие вещества для препаратов включают. но не ограничены ими. аминокислоты (такие как глицин. глутамин. аспарагин. аргинин или лизин); противомикробные агенты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота. сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат. бикарбонат. трис-НС1. цитраты. фосфаты или другие органические кислоты); объемные агенты (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин. поливинилпирролидон. β-циклодекстрин или гидроксипропил-в-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза. манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин. желатин или иммуноглобулины); красящие. корригирующие и разбавляющие агенты; эмульгирующие агенты; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как бензалкония хлорид. бензойная кислота. салициловая кислота. тимеросал. фенетиловый спирт. метипарабен. пропилпарабен. хлоргексидин. сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин. пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажняющие агенты (такие как Р1итошсб. ПЭГ. эфиры сорбитана. полисорбаты. такие как полисорбат 20. полисорбат 80. тритон. трометамин. лецитин. холестерин. тилоксапал); агенты. усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит); агенты. усиливающие тонические свойства (такие как галогениды щелочных металлов. предпочтительно хлорид натрия или калия. маннит. сорбит); носители для доставки; разбавители; эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты. См. ВЕМIN6ТОN'8 РНАВМАСЕИПСАЕ 8СIЕNСЕ8. 18 Ебйюп. (А. В. Оеппато. еб.). 1990. Маск РиЬНбЫпр Сотрапу.
В некоторых воплощениях оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области в зависимости. например. от назначенного пути введения. формы доставки и
- 32 013614 желаемой дозировки. См., например, ВЕМГЫ6ТО№8 ΡНΑВΜΑСΕυТIСΑ^ 8СIΕNСΕ8, выше. В некоторых воплощениях такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίη у1уо и скорость клиренса ίη у1уо антител по изобретению.
В некоторых воплощениях основной растворитель или носитель в фармацевтической композиции может быть либо водным, либо неводным по природе. Например, подходящий растворитель или носитель может представлять собой воду для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственную спинно-мозговую жидкость, в которые возможно добавлены другие вещества, общие в композициях для парентерального введения. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, являются примерными дополнительными растворителями. В предпочтительных воплощениях фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат трисбуфер рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер рН примерно 4,0-5,5, и могут дополнительно включать сорбит, сахарозу, твин-20 и/или их подходящий заменитель. В некоторых воплощениях изобретения композиции антитела к ΝΟΕ можно готовить для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с возможными агентами для препаратов (ВЕМГЫСТО№8 ΡΗΑΕΜΑСΕυТIСΑ^ 8СIΕNСΕ8, см. выше) в форме лиофилизированного кека или водного раствора. Кроме того, в некоторых воплощениях препарат продукта, представляющего собой антитело к ΝΟΕ, можно готовить в виде лиофилизата, используя подходящие эксципиенты, такие как сахароза.
Фармацевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены для парентерального введения. Или же композиции могут быть составлены для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например перорально. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций входит в компетенцию специалиста в данной области.
Компоненты для препаратов предпочтительно находятся в концентрациях, которые приемлемы для места введения. В некоторых воплощениях изобретения буферы используют для поддержания композиции при физиологическом рН или при несколько более низком рН, обычно в пределах интервала рН от примерно 5 до примерно 8.
Когда рассматривают парентеральное введение, терапевтические композиции для применения по данному изобретению могут быть представлены в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, содержащего желаемое антитело к ΝΟΕ в фармацевтически приемлемом растворителе. Особенно подходящим растворителем для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которой готовят препарат антитела к ΝΟΕ в виде стерильного, изотонического раствора, правильно законсервированного. В некоторых воплощениях в изготовление этого препарата можно включать препарат желаемой молекулы с агентом, таким как инъекционные микрошарики, биологически разрушаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут обеспечить регулируемое или пролонгированное высвобождение продукта, который можно доставлять посредством инъекции депо. В некоторых воплощениях можно также использовать гиалуроновую кислоту, обладающую эффектом, способствующим пролонгированному периоду в кровообращении. В некоторых воплощениях для введения желаемой молекулы антитела можно применять имплантационные устройства для доставки лекарства.
Препараты фармацевтических композиций по изобретению можно готовить для ингаляции. В этих воплощениях препараты антител к ΝΟΕ предпочтительно готовят в виде сухого ингаляционного порошка. В предпочтительных воплощениях можно также готовить препараты антитела к ΝΟΕ в виде ингаляционных растворов с пропеллентом для аэрозольной доставки. В некоторых воплощениях растворы могут быть распыляемыми. Легочное введение и способы изготовления препаратов для него дополнительно описаны в международной патентной заявке № РСТ/и8 94/001875, которая включена путем ссылки и в которой описана легочная доставка химически модифицированных белков.
Рассматривается также, что препараты можно вводить перорально. Препараты антител к ΝΟΕ, которые вводят таким способом, можно готовить без носителей или с носителями, общепринято используемыми при компаундинге твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. В некоторых воплощениях капсула может быть предназначена для высвобождения активной части препарата в точке желудочно-кишечного тракта, где биодоступность является максимальной, а досистемный распад является минимальным. Можно включать дополнительные агенты для облегчения всасывания антитела к ΝΟΕ. Разбавители, корригенты, легкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие агенты, суспендирующие агенты, разрыхляющие агенты для таблеток и связующие агенты можно также использовать.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно обеспечивает содержание эффективного количества одного или множества антител к ΝΟΕ в смеси с нетоксичными эксципиентами, которые являются пригодными для производства таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или в другом подходящем растворителе можно готовить растворы в форме стандартной дозы. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничены ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Дополнительные фармацевтические композиции будут очевидны специалистам в данной области,
- 33 013614 включая препараты, содержащие антитела к N0? в препаратах пролонгированной или регулируемой доставки. Методики изготовления других разнообразных средств пролонгированной или регулируемой доставки, таких как липосомные носители, биологически разрушаемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекции депо, также известны специалистам в данной области. См., например, Международную патентную заявку № РСТ/и8 93/00829, которая включена путем ссылки и в которой описано регулируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Препараты пролонгированного высвобождения могут включать полупроницаемые полимерные основы в форме формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Основы пролонгированного высвобождения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (как описано в патенте США № 3773919 и в публикации европейской патентной заявки № ЕР 058481, каждая из которых включена путем ссылки), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (81бтап с! а1., 1983, Вюро1утст8 22: 547556), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Ьапдсг с! а1., 1981, Т Вютсб. Ма!сг. Яск. 15: 167-277 и Ьапдсг, 1982, СНст. ТссН. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Ьапдсг с! а1., см. выше) или поли-Э-(-)-3гидроксимасляную кислоту (публикация европейской патентной заявки № ЕР 133988). Композиции пролонгированного высвобождения могут также включать липосомы, которые можно изготовить любым из нескольких способов, известных в данной области. См., например, Еррк!ст с! а1., 1985, Ргос. Наб. Асаб. 8с1. И8А 82: 3688-3692; публикации европейских патентных заявок ЕР 036676; ЕР 088046 и ЕР 143949, включенные сюда путем ссылки.
Фармацевтические композиции, применяемые для введения ш утуо, обычно представлены в виде стерильных препаратов. Стерилизацию можно осуществить путем фильтрования через стерильные фильтрационные мембраны. Когда композиция лиофилизирована, стерилизацию с использованием этого способа можно проводить либо до, либо после лиофилизации и восстановления. Композиции для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе. Парентеральные композиции, как правило, помещают в контейнер, имеющий отверстие для стерильного доступа, например пакет или флакон для внутривенного раствора, имеющий пробку, протыкаемую подкожной инъекционной иглой.
Когда препарат фармацевтической композиции изготовлен, его можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества либо в виде дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты можно хранить либо в готовой к употреблению форме, либо в форме (например, лиофилизированной), которую восстанавливают перед введением.
В изобретении также предложены наборы для получения стандартной дозы однократного введения. Каждый набор по изобретению может содержать как первый контейнер, содержащий высушенный белок, так и второй контейнер, содержащий водный препарат. В некоторых воплощениях данного изобретения предложены наборы, содержащие однокамерные и многокамерные предварительно наполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и лиошприцы).
Эффективное количество фармацевтической композиции, содержащей антитело к N0? для терапевтического применения, будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целей. Специалисту в данной области будет понятно, что подходящие уровни дозировки для лечения будут варьировать в зависимости отчасти от доставляемой молекулы, от показания, для которого применяют антитело к N0?, от пути введения и размера (массы тела, поверхности тела или размера органа) и/или от состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. В некоторых воплощениях врач может титровать дозировку и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Типичная дозировка может находиться в интервале от примерно 0,1 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг или более в зависимости от факторов, упомянутых выше. В предпочтительных воплощениях дозировка может находиться в интервале от 0,1 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг; более предпочтительно от 1 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг или даже более предпочтительно от 5 мкг/кг вплоть до примерно 30 мг/кг.
Частота дозировки будет зависеть от фармакокинетических параметров конкретного антитела к N0? в применяемом препарате. Обычно врач вводит композицию до получения дозировки, при которой достигается желаемый эффект. Композицию можно, таким образом, вводить в виде однократной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать или не содержать одинаковое количество желаемой молекулы) за период времени или в виде непрерывной инфузии через имплантационное устройство или катетер. Дополнительное уточнение соответствующей дозировки рутинно проводится специалистами в данной области и находится в пределах рутинно решаемых ими задач. Подходящие дозировки можно установить путем использования соответствующих данных доза-ответ. В некоторых воплощениях антитела по изобретению можно вводить пациентам на протяжении длительного периода времени. Хроническое введение антитела по изобретению минимизирует вредный иммунный или аллергический ответ, обычно связанный с антителами, которые образуются против человеческого антигена у животного, не представляющего собой человека, например, не полностью человеческим антителом, продуцируемом в видах, не представляющих собой человека.
Путь введения фармацевтической композиции находится в соответствии с известными способами, например, пероральным, посредством инъекции внутривенным, внутрибрюшинным, интрацеребральным (интрапаренхимальным), интрацеребровентрикулярным, внутримышечным, внутриглазным, внутриарте
- 34 013614 риальным, интрапортальным путем или внутрь поражения; с помощью систем пролонгированного высвобождения или с помощью имплантационных устройств. В некоторых воплощениях композиции можно вводить путем болюсной инъекции, либо непрерывно путем инфузии, либо с помощью имплантационного устройства.
Композицию можно также вводить местным путем с помощью имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором адсорбирована или в котором инкапсулирована желаемая молекула. В некоторых воплощениях, где применяют имплантационное устройство, это устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка желаемой молекулы может происходить посредством диффузии, болюса, высвобождаемого со временем или непрерывного введения.
Может быть также желательно применять фармацевтические композиции антитела к N0? по изобретению ех νίνο. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые извлечены из пациента, подвергают воздействию фармацевтических композиций антитела к N0?, после чего эти клетки, ткани и/или органы последовательно имплантируют обратно пациенту.
В частности, антитела к N0? можно доставлять путем имплантации определенных клеток, которые сконструированы генно-инженерным путем, используя способы, такие как описаны здесь, для экспрессии и секреции полипептида. В некоторых воплощениях такие клетки могут представлять собой животные или человеческие клетки и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В некоторых воплощениях такие клетки могут представлять собой бессмертные клетки. В других воплощениях, чтобы уменьшить вероятность иммунологического ответа, клетки могут быть инкапсулированы во избежание инфильтрации окружающих тканей. В следующих воплощениях инкапсулирующие материалы обычно представляют собой биосовместимые, полупроницаемые полимерные капсулы или мембраны, которые дают возможность высвобождения белкового(ых) продукта(ов), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими повреждающими факторами из окружающих тканей.
Примеры
Приведенные ниже примеры, включая проведенные эксперименты и полученные результаты, предложены только в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение.
Пример 1. Получение человеческого белка N0? из клеток Е. со11.
Клонирование гНц^0? (1-120).
Нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий N0?, амплифицировали с кДНК, используя олигонуклеотидные праймеры с последовательностями, показанными в 8ЕЦ ΙΌ N0: 27 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 28, и применяя стандартную технологию ПЦР. 5'-Праймер образует сайт рестрикции NάеI и кодон инициации метионина, непосредственно предшествующий кодону 1 (серин) зрелой последовательности. 3' Праймер образует сайт рестрикции ВатН сразу после кодона терминации. Полученный продукт ПЦР очищали из геля, переваривали эндонуклеазами рестрикции NάеI и ВатШ, а затем лигировали в вектор рС?М1656, также переваренный NάеI и ВатШ.
Лигированную ДНК трансформировали в компетентные клетки-хозяева Е. сой штамм 657. Проводили скрининг клонов на способность продуцировать рекомбинантный белковый продукт и на содержание плазмиды, имеющей правильную нуклеотидную последовательность (то есть 8ЕЦ ΙΌ N0: 29). Аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого N0? 1-120 показана как 8ЕЦ ΙΌ N0: 30.
Экспрессионный вектор рС?М1656 (АТСС #69576) является производным экспрессионной векторной системы, описанной в патенте США № 4710473. Плазмида рС?М1656 может быть получена на основе описанной плазмиды рС?М836 (патент № 4710473) путем: (а) разрушения двух эндогенных сайтов рестрикции NάеI путем заполнения концов ферментом полимеразой Т4 с последующим лигированием по тупым концам; (б) замены последовательности ДНК между двумя уникальными сайтами рестрикции АаШ и СШ, содержащей синтетический промотор Ръ, подобным фрагментом, полученным из рС?М636 (патент № 4710473), содержащим промотор Рь, а затем (в) замещения небольшой последовательности ДНК между уникальными сайтами рестрикции С1а! и КрЛ олигонуклеотидом, полученным в результате отжига двух проб, имеющих нуклеотидные последовательности, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 31 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 32.
Штамм-хозяин Е. сой К12 (штамм Атдеп 657) является производным Е. сой ^1485 (штамм К12), полученного из Е. сой Сепейс 81оск СегИег Уа1е иптцегкйу, №\ν Нацеп, СТ (С08С штамм 6159).
Экспрессия гНи^0? (1-120).
Клетки Е. сой, содержащие конструкцию экспрессии N0? (как описано выше) ферментировали в обогащенной среде в режиме подпитываемой культуры. Клетки выращивали при 30°С до 0Ό 49 при 600 нм, а затем индуцировали температурным сдвигом до 42°С. Клетки собирали центрифугированием через 4 ч после индукции. Конечная 0Ό составляла 75. Выход экспрессии определили как примерно 0,15 г/л.
Вторичная укладка и очистка гНц^0? (1-120).
Клеточную массу лизировали в М1сгоДи1б1/ег, центрифугировали при 10000 х д в течение 30 мин, осадок промывали 1% дезоксихолевой кислотой, центрифугировали, как описано выше, а затем получен
- 35 013614 ный осадок промывали холодной водой и повторно центрифугировали. Полученный в результате осадок (А1Вз, гоазбеб шс1изтсе Ьоб1ез - промытые тельца включения) ресуспендировали в денатурирующем буфере 8М гуанидин-НС1, 50 мМ Трис рН 8,5, содержащем 10 мМ ОТТ, и солюбилизировали при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугировали при 10000хд в течение 30 мин, и супернатант осторожно декантировали, а затем разбавляли в 25 раз в водном буфере, содержащем окислительновосстановительную пару, при 4°С в течение 5 суток. Затем полученную в результате вторичную структуру титровали до рН 3,0, фильтровали через 0,45 цМ фильтр. Вторичную структуру очищали, используя колонку быстрого тока с δρ-сефарозой с использованием стандартного градиента №С1. Затем пул с катионообменной колонки концентрировали, и аликвоты замораживали при -80°С. Чистоту белка оценивали с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) и анализировали с помощью окрашивания Кумасси голубым. Очищенный таким способом белок составлял более чем 90% главной полосы.
Пример 2. Продуцирование человеческих моноклональных антител к фактору роста нервов (N66). Трансгенные мыши НиМаЬ и КМ.
Полностью человеческие моноклональные антитела N66 получили, используя линии трансгенных мышей НСо7, НСо12, НСо7+НСо12 и КМ, каждая из которых экспрессирует гены человеческого антитела. В каждой из этих линий мышей было получено гомозиготное прерывание эндогенного мышиного гена легкой цепи каппа, как описано в Сбеп е! а1. (1993, ЕМВ0 I. 12: 811-820), и гомозиготное прерывание эндогенного мышиного гена тяжелой цепи было получено, как описано в примере 1 публикации международной патентной заявки № А0 01/09187 (включена путем ссылки). Каждая из этих линий мышей несет трансген легкой цепи каппа человека КСо5, как описано в Е1збго11б е! а1. (1996, №1иге Вю1есбпо1оду 14: 845-851). Линия НСо7 несет трансген тяжелой цепи человека НСо7, как описано в патентах США №№ 5545806, 5625825 и 5545807 (включены путем ссылки). Линия НСо12 несет трансген тяжелой цепи человека НСо12, как описано в примере 2 публикации международной патентной заявки № А0 01/09187 (включена путем ссылки). Линия НСо7+НСо12 несет оба трансгена тяжелой цепи НСо7 и НСо12 и является гемизиготной по каждому трансгену. Мыши КМ содержат трансген тяжелой цепи 8С20, как описано в Топи/ика е! а1. (1997, №1иге 6епе!. 16, 133-143 и 2000, Ргос. №111. Асаб. δα, 97, 722-727). Этот трансген не интегрирован в хромосому мыши, а вместо этого передается как независимый фрагмент хромосомы. Этот фрагмент включает примерно 15 МВ хромосомы 14 человека. Он содержит полноразмерный локус тяжелой цепи человека, включая все участки генов УН, Ό и Ш и все изотипы константной области тяжелой цепи. Все эти линии называют мышами НиМаЬ.
Иммунизация НиМаЬ.
Для получения полностью человеческих антител к N6Ε мышей НиМаЬ иммунизировали очищенным рекомбинантным N6Ε, полученным из клеток Е. со11, в качестве антигена (пример 1). Общие схемы иммунизации мышей НиМаЬ описаны в ЬопЬегд е! а1., 1994, ^Шге 368: 856-859; Е|збго|1б е! а1., см. выше, и в А0 98/24884, выводы каждой из которой включены сюда путем ссылки. Возраст мышей составлял 616 недель в момент первой инфузии антигена. Очищенный рекомбинантный препарат (25-100 мкг) антигена N6Ε использовали для иммунизации мышей НиМаЬ внутрибрюшинно (1Р) или подкожно (8С).
Трансгенных мышей НиМаЬ иммунизировали с использованием антигена в полном адъюванте Фрейнда и двух инъекций с последующими иммунизациями 1Р через 2-4 недели (всего вплоть до 9 иммунизации) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. На каждый антиген иммунизировали несколько дюжин мышей. Всего 118 мышей линий НСо7, НСо12, НСо7+НСо12 и КМ проиммунизировали антигеном N6Ε. Мониторинг иммунного ответа проводили путем ретроорбитального забора крови.
Для отбора мышей НиМаЬ, продуцирующих антитела, которые связывают человеческий N6Ε, сыворотку от иммунизированных мышей тестировали с помощью ЕЬ18А (твердофазного иммуноферментного анализа), как описано Е1збго11б е! а1., см. выше. Кратко, микротитровальные планшеты покрывали очищенным рекомбинантным N6Ε из Е. со11 (пример 1) в концентрации 1-2 мкг/мл в ФСБ м 50 мкл/лунка инкубировали при 4°С в течение ночи, затем блокировали 200 мкл/лунка 5% сыворотки цыпленка в ФСБ/твин (0,05%).
Разведения плазмы от N6Ε-иммунизированных мышей добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1-2 ч при температуре окружающей среды. Планшеты отмывали ФСБ/твин, а затем инкубировали с 1д6 Ес-специфичным поликлональным реагентом коза-против-человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (НКР), в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки планшеты проявляли субстратом АВТ8 (81дта Сбет1са1 Со., 8ΐ. Ьошз, М0, № по каталогу А-1888, 0,22 мг/мл) и анализировали спектрофотометрически путем определения оптической плотности (0Ό) при длинах волны 415-495 нм. Мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина анти^бЕ использовали для продуцирования моноклональных антител, как описано ниже.
Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к N6Ε.
Мышей готовили для продуцирования моноклональных антител путем повторной вакцинации антигеном внутривенно в течение 2 суток, после чего их умерщвляли, а затем извлекали селезенки. Из мышей НиМаЬ выделяли мышиные спленоциты и осуществляли их слияние с помощью ПЭГ, с клеточной линией миеломы мыши, используя стандартные протоколы. Обычно проводили 10-20 слияний для каж
- 36 013614 дого антигена.
Кратко, моноклеточные суспензии лимфоцитов селезенки от иммунизированных мышей сливали до одной четверти от числа несекретирующих клеток миеломы мыши Ρ3Χ63-Α§8.653 (ΑΤ^, № по каталогу СВЬ 1580) с 50% ПЭГ (§1дта). Клетки высевали в концентрации примерно 1/105/лунка в микротитровальные планшеты с плоским дном с последующей примерно двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка, кондиционированную среду 10% Р388Э1-(АТСС, № по каталогу СВЬ ИВ-63), 3-5% ориген (ЮЕИ) в ЭМЕМ (Меб1а!есН, № по каталогу СВЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата натрия) плюс 5 мМ ГЭПЭС, 0,055 мМ 2меркаптоэтанол, 50 мг/мл гентамицина и 1хНАТ (§1дта, № по каталогу СВЬ Ρ-7185). После 1-2 недель клетки культивировали в среде, в которой ΗΑΤ заменяли НТ.
Проводили скрининг полученных в результате гибридом на продуцирование антигенспецифичных антител. Скрининг индивидуальных лунок проводили с помощью ЕЫ8Л (описано выше) на человеческие моноклональные ЦС антитела к NСΕ. Как только происходил интенсивный рост гибридомы, проводили мониторинг среды, обычно после 10-14 суток. Гибридомы, секретирующие антитела, пересевали, снова проводили скрининг и, если они все еще были положительными по человеческим моноклональным ЦС антителам анти-ЫСЕ, субклонировали по меньшей мере дважды путем ограниченного разведения. Затем стабильные субклоны культивировали ш νίΙΐΌ для получения небольших количеств антитела в среде для тканевых культур для характеристики.
Отбор человеческих моноклональных антител, которые связываются с NСΕ.
Анализ ΞΟδΑ, как описано выше, использовали для скрининга на гибридомы, которые проявляют положительную реактивность с иммуногеном NСΕ. Гибридомы, секретирующие моноклональное антитело, которое связывается с высоким сродством с NСΕ, субклонировали и дополнительно определяли их характеристики. Один клон от каждой гибридомы, которая сохраняла реактивность исходных клеток (как определено с помощью ΒΟδΑ), выбирали для получения клеточного банка 5-10 флаконов, который хранили в жидком азоте.
Изотипспецифичный ЕГ-ΙδΑ проводили для определения изотипа моноклональных антител, полученных, как описано здесь. В этих экспериментах лунки микротитровальных планшетов покрывали 50 мкл/лунка раствора 1 мкг/мл легкой цепи каппа мышь против человека в ФСБ и инкубировали при 4°С в течение ночи. После блокирования 5% сывороткой цыпленка планшеты подвергали взаимодействию с надосадочной жидкостью от каждого тестируемого моноклонального антитела и очищенного контроля на изотип. Планшеты инкубировали при температуре окружающей среды в течение 1-2 ч. Затем лунки подвергали взаимодействию с различными человеческими ^С-специфичными поликлональными антисыворотками коза-против-человека, конъюгированными с пероксидазой хрена, и планшеты проявляли и анализировали, как описано выше.
Моноклональные антитела, очищенные из надосадочных жидкостей гибридом, которые проявили значительное связывание с NСΕ, как определено путем Β^IδΑ, дополнительно тестировали на биологическую активность, используя ряд количественных определений биологической активности, как описано ниже.
Пример 3. Селекция и клонирование антител к NСΕ с сильной нейтрализующей активностью в отношении NСΕ.
Эффективность антител, первоначально идентифицированных в примере 2 в качестве ингибиторов активности NСΕ (то есть «нейтрализацию» NСΕ), оценивали путем измерения способности каждого модифицированного пептида к блокированию индукции фактором NСΕ экспрессии рецептора ваниллоида1 (УВ1).
Культуры нейронов спинного корневого ганглия.
Спинные корневые ганглии (ЭВС) вырезали один за другим в асептических условиях из всех спинно-мозговых сегментов 19-суточного эмбриона (Е19) крыс, который хирургическим путем извлекали из матки крыс δр^адие-^аи1еу с зафиксированной датой беременности под терминальной анестезией (СНаг1ей Вгуег, \11тшд!оп, МΑ). ЭВС собирали в охлажденной во льду среде Ь-15 (С1ЬсоВКЬ, Сгапб Ыапб, ΝΥ), содержащей 5% инактивированную нагреванием лошадиную сыворотку (С1ЬсоВВЬ), и удаляли какую-либо рыхлую соединительную ткань и кровеносные сосуды. ЭВС дважды промывали в свободном от Са2+ и Мд2+ забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко (^ΡΒδ), рН 7,4 (С1ЬсоВВЬ). Затем проводили диссоциирование ЭВС до моноклеточной суспензии, используя папаиновую систему диссоциации (\ойЫпд!оп ВюсБетюа1 Согр., ЕгееНо1б, ΝΓ). Кратко, ЭВС инкубировали в переваривающем растворе, содержащем 20 ед/мл папаина в сбалансированном солевом растворе Эрла (ΒΒδδ) при 37°С в течение 50 мин. Проводили диссоциирование клеток путем пипетирования через отполированные в пламени пастеровские пипетки в среде для диссоциации, состоящей из МЕМ/Нат'й Е12, 1:1, 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% дезоксирибонуклеазы Ι (ДНКазы).
Диссоциированные клетки осаждали при 200/д в течение 5 мин и ресуспендировали в ΒΒδδ, содержащем 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% ДНКазы. Клеточную суспензию центрифугировали через градиентный раствор, содержащий 10 мг/мл ингибитора овомукоида и 10
- 37 013614 мг/мл овальбумина, при 200хд в течение 6 мин для удаления клеточных обломков, а затем фильтровали через 88 мкм нейлоновое сито (Ешйег 8с1еиййс, РйбЬигдй, РА) для удаления каких-либо комков. Число клеток определяли гемоцитометром и клетки высевали в покрытые полиорнитином 100 мкг/мл (81дта, 8!. Ьошк, МО) и мышиным ламинином 1 мкг/мл (С1ЬсоВРЬ) 96-луночные планшеты при концентрации 10х 103 клеток/лунка в полной среде. Полная среда состояла из минимальной эссенциальной среды (МЕМ) и среды Нат'к Е12, 1:1, пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и 10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки (61ЬсоВРЕ). Культуры держали при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности. Для предотвращения роста клеток, не являющихся нейронами, в среду включали 5-фтор-2'дезоксиуридин (75 мкМ) и уридин (180 мкМ).
Обработка ΝΟΕ и анти-ΝΟΕ.
Через 2 ч после посева клетки обрабатывали рекомбинантным человеческим β-ΝΟΕ (Атдеи) или рекомбинантным крысиным β-ΝΟΕ (Р & Ό 8у5!ет5, МшиеароЩ, МИ) при концентрации 10 нг/мл (0,38 нМ). Положительные контроли, содержащие серийно разведенное антитело к ΝΟΕ (К & Ό 8у51ет5) наносили на каждый культуральный планшет. Тестируемые антитела добавляли в десятикратных концентрациях, используя 3,16-кратные серийные разведения. Все образцы разводили в полной среде перед добавлением к культурам. Время инкубации составляло 40 ч до измерения экспрессии νΡ1.
Измерение экспрессии νΡ1 в нейронах ΌΡΟ.
Культуры фиксировали 4% параформальдегидом в сбалансированном солевом растворе Хенкса в течение 15 мин, блокировали 8ирегЬ1оск (Р1егсе, РоскЕогб, ГЬ) и делали проницаемыми 0,25% №шбе! Р40 (81дта) в забуференном Трис-НС1 (81дта) солевом растворе (ТСБ) в течение одного часа при комнатной температуре. Культуры промывали один раз ТСБ, содержащим 0,1% твин 20 (81дта), и инкубировали с ЦС кролика против νΡ1 в течение 1,5 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали со вторыми Еи-мечеными антителами против кролика (^а11ас Оу, Тигки, Е1и1аиб) в течение 1 ч при комнатной температуре. Отмывки ТСБ (3х 5 мин с медленным встряхиванием) применяли для каждой инкубации с антителом. К культурам добавляли усиливающий раствор (150 мкл/лунка, \Ха11ас Оу). Затем измеряли сигнал флуоресценции в фотометре с временным разрешением (^а11ас Оу). Экспрессию νΡ1 в образцах, обработанных модифицированными пептидами, определяли путем сравнения со стандартной кривой титрования ΝΟΕ от 0 до 1000 нг/мл. Процент ингибирующего эффекта ΝΟΕ (по сравнению с максимально возможным ингибированием) в отношении экспрессии νΡ1 в нейронах ΌΡΟ определяли по сравнению с контролями, которые не были обработаны ΝΟΕ. Результаты представлены в табл. 2 и 5.
Клеточные линии обозначали номерами от 110 до 129. Антитела из клеточных линий №№ 119, 124 и 125 продемонстрировали крайне сильную нейтрализующую активность в отношении ΝΟΕ (фиг. 1). Клеточная линия № 124 представляла собой родительскую клеточную линию, также называемую 4Ό4. Клеточные линии №№ 119 и 125 представляли собой субклоны родителя 4Ό4. Дополнительный образец из исходного флакона, содержащего гибридому № 124 (4Ό4), вырастили и обозначили как № 167 (4Ό4).
Антитела, образованные гибридомой № 167 (4Ό4), подвергали такому же анализу на нейтрализацию ΝΟΕ на основе нейронов ΌΡΟ, как и предыдущие образцы. Антитело № 167 (4Ό4) продемонстрировало сильную активность против ΝΟΕ при Ιί.'50 0,50 нМ (фиг. 2), которая совпадала с активностью образцов №№ 119, 124 и 125. Активности 4 образцов показаны в табл. 2.
Таблица 2 Активность антитела к человеческому ΝΟΕ (11ΝΟΕ) в клетках ΌΡΟ с использованием 0,38 нМ 11ΝΟΕ
Номер Ю50
119 Из № 124 1,2 нМ
124 Родитель 0,57 нМ
125 Из №124 0,3 нМ
167 Из того же образца, что и №124 0,50 нМ
Ν-Концевое секвенирование и масс-спектрометрия.
Очищенные образцы антител к ΝΟΕ из гибридомы готовили для белкового секвенирования и анализа БС/М8 (жидкостная хроматография-масс-спектрометрия). Антитела очищали от кондиционированной среды концентрированием среды, с использованием Аписом Сеи1пргер-30, до объема менее чем 15 мл. Навеску смолы гРгоА (Рйагтааа) промывали 4хФСБ и готовили 50% суспензию в ФСБ после последней отмывки. Подходящее количество смолы гРгоА (примерно 5 мкг антитела/мкл смолы, но использовали не менее чем 50 мкл смолы) добавляли к образцу антитела и инкубировали в течение ночи при 4°С. Смесь антитело-смола центрифугировали и собирали несвязавшуюся фракцию. После добавления 0,5 мл ФСБ и переноса в 0,45 мкм пробирку 8рт-Х (Со81аг) образец центрифугировали при 10000 об/мин в течение 3 мин. Затем смолу промывали по меньшей мере 3 раза 0,5 мл ФСБ, а затем добавляли 0,1 М глицин (рН 2,7) в количестве 1,5хобъем смолы и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем снова центрифугировали в течение 3 мин при 10000 об/мин, собирая надосадочную жидкость. Эту стадию элюции повторяли еще два раза, а затем объединенную надосадочную жидкость нейтрализовали 1/25 объема 1,0 М Трис (рН 9,2). После конечной стадии фильтрования через новую про
- 38 013614 бирку δρίη-Χ (0,2 мкм) антитело определяли количественно, используя стандартный анализ по Брэдфорду с использованием человеческого 1дС в качестве стандарта или альтернативно поглощение при 280 нм для больших образцов. Также проводили электрофорез в геле, используя 2 мкг каждого образца параллельно с 2 мкг человеческого 1дС1, к. Для масс-спектрометрии 4 мкг образцов дегликозилировали, восстанавливали и загружали на ВЭЖХ (НР1090), соединенную в одновременном режиме с массспектрометром Είηίη^αη ЬСЦ. Легкую цепь отделяли от тяжелой цепи с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Легкие цепи и тяжелые цепи также собирали для анализа Ν-концевого секвенирования белка.
Секвенирование обеих Ν-концов легкой цепи и тяжелой цепи образца антитела к ЫСЕ № 167 (4Ό4) выявило совпадение с обеими Ν-концевыми последовательностями образца антитела к ЫСЕ № 119 (4Ό4). Кроме того, измеренная масса антител показала, что изолированные антитела из гибридом № 167 и № 119 являются одинаковыми. Измеренная развернутая масса (23096) легкой цепи анти-ЫСЕ № 167 совпадала с измеренной массой (23096) легкой цепи анти-ЫСЕ АЬ № 119.
Клонирование тяжелой и легкой цепей антитела к NСЕ.
Гибридому, экспрессирующую наиболее сильно связывающее NСЕ моноклональное антитело, 4Ό4.Ό7, использовали в качестве источников для выделения суммарной РНК с использованием реагента ΤΚΙζοΙ® (Ιηνίΐτο^βη). Первую нить кДНК синтезировали, используя случайный праймер с адаптером элонгации (5'-ССС ССС АТА ССС СТС САN ΝΝΝ ЫЫТ-3') (8ЕЦ ΙΌ νΟ: 33) и проводили препаративный анализ 5' КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК), используя набор ΟοηοΚκοΓ™ (ΙηνίΙΐΌβοη) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Для получения кДНК, кодирующей полноразмерную легкую цепь, прямой праймер представлял собой внутренний праймер Сспс^сст™, а обратный праймер представлял собой 5'-ССС СТС АСС СТС САА СтС АСС-3' (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 34). Для получения кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, прямой праймер представлял собой внутренний праймер Сспс^сст™, а обратный праймер представлял собой 5'-ТСА ССА ССС ТСА ССА САС С3' (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 35). Продукты КАСЕ клонировали в рСК4-ТОРО (ΙηνίΙΐΌβοη) и определяли последовательности. Согласованные последовательности использовали для дизайна праймеров для ПЦР амплификации полноразмерной цепи антитела.
Для получения кДНК, кодирующей легкую цепь каппа анти-ЫСЕ 4Ό4.Ό7, 5'ПЦР праймер кодировал аминоконец сигнальной последовательности, сайт фермента рестрикции ХЬаЕ и оптимизированную последовательность Козака (5'-САС САС ААС СТТ СТА САС САС САТ ССА САТ САС ССТ ССС ССС ТСА ССТ ССТ ССС-3'; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 36). 3' Праймер кодировал карбоксиконец и кодон терминации, а также сайт рестрикции 8аП (5'-СТТ СТС САС ТСА АСА СТС ТСС ССТ СТТ САА ССТС-3'; 5ЕС) ΙΌ ΝΟ: 37). Полученный в результате фрагмент, являющийся продуктом ПЦР, очищали, переваривали ХЬа! и 8аИ, а затем выделяли из геля и лигировали в экспрессионный вектор млекопитающих рО8Ка20 (см. публикацию международной заявки № XVΟ 90/14363, которая включена сюда путем ссылки для любой цели. рО8Ка20 получили путем изменения нуклеотида 2563 в ρΩδΕα 19 с гуанозина на аденозин путем сайт-направленного мутагенеза).
Для получения кДНК, кодирующей тяжелую цепь антитела к ЫСЕ 4Ό4.Ό7 5' ПЦР праймер кодировали аминоконец сигнальной последовательности, сайт фермента рестрикции ΧΕαΙ и оптимизированную последовательность Козака (5'-САС САС ААС СТТ СТА САС САС САТ ССА СТТ ССС ССТ СТС СТС ССТ ТТТ ССТ ТСТТ-3'; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 38). Праймер 3' кодировал карбоксиконец и кодон терминации, а также сайт рестрикции 8аИ (5'-ССА ТСТ ССА СТС АТТ ТАС ССС САС АСА ССС АСАС-3'; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 39). Полученный в результате продукт очищали, переваривали ХЬаЕ и 8аИ, выделяли из геля и лигировали в вектор рО8Ка20.
Вычисленная масса (23099), как определено путем трансляции нуклеотидной последовательности в предсказанные аминокислоты и сложения вместе молекулярных масс аминокислот последовательности ДНК легкой цепи анти-ЫСЕ клона АЬ 4Ό4 совпала с измеренной массой, как определено с помощью масс-спектрометрии. Измеренная развернутая масса (49479) тяжелой цепи анти-ЫСЕ АЬ № 167 совпала с измеренной массой (49484) тяжелой цепи анти-ЫСЕ АЬ № 119, а также совпала с теоретической массой (49484) последовательности ДНК тяжелой цепи анти-ЫСЕ клона АЬ 4Ό4 (табл. 3) с отклонением на приборы.
Данные Ν-концевой последовательности белка и ЬС/М8 подтвердили, что гибридома № 119 экспрессирует такое же антитело, что и гибридома № 167. Кроме того, вычисленная масса антител на основании последовательности дополнительно подтвердила это наблюдение.
- 39 013614
Таблица 3
Суммирование данных масс-спектрометрии
АЬ κΝΟΕ Измеренная масса АЬ№167 Измеренная масса АЬ №119 Теоретическая масса, выведенная из последовательности ДНКАЬ404
Легкая цель 23096 23096 23099
Тяжелая цепь 49479 49484 49484
Пример 4. Экспрессия антител к NСЕ в клетках яичника китайского хомячка (СНО).
Стабильная экспрессия 4Ό4 анти^СЕ тАЬ была достигнута путем котрансфекции плазмид 4Ό4тяжелая цепь/рО8Ка19 1дС2 или 4Э4-тяжелая цепь/рО§Ка19 1дС1 и N6Е-каппа/р^8Кα19 в клетки яичника китайского хомячка (СНО), дефицитные по дигидрофолатредуктазе (ОНЕК-), адаптированные к отсутствию сыворотки, используя кальцийфосфатный способ.
Трансфецированные клетки отбирали на среде, содержащей диализованную сыворотку, но не содержащей гипоксантин-тимидин, для обеспечения роста клеток, экспрессирующих фермент ЭНЕЕ. Скрининг трансфецированных клонов проводили, используя анализы, такие как ЕЫ8А, с целью обнаружения экспрессии 4Ό4 анти^СЕ тАЬ в кондиционированной среде. Клоны с самой высокой экспрессией подвергали воздействию возрастающих концентраций метотрексата (МТХ) для амплификации ЭНЕК. Амплифицированные МТХ клоны подвергали скринингу, используя анализы, такие как ЕЫ8А, с целью определения самой высокой экспрессии 4Ό4 анти^СЕ тАЬ в кондиционированной среде. Клоны с самой высокой экспрессией подвергали субклонированию с получением однородной популяции и созданием клеточных банков.
Рекомбинантные антитела к NСЕ по изобретению можно получить в клетках яичника китайского хомячка, дефицитных по ЭНЕЯ используя такой же протокол, как описано выше для моноклонального антитела к NСЕ. Последовательности ДНК, кодирующие полноразмерную тяжелую цепь или легкую цепь каждого антитела к NСЕ по изобретению, клонируют в экспрессионные векторы. Клетки СН0б котрансфецируют экспрессионным вектором, способным к экспрессии полноразмерной тяжелой цепи, и экспрессионным вектором, способным к экспрессии полноразмерной легкой цепи соответствующего антитела к NСЕ. Например, для получения антитела к NСЕ клетки котрансфецируют вектором, способным к экспрессии полноразмерной тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 40, и вектором, способным к экспрессии полноразмерной легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 44. В табл. 4 суммированы полноразмерные тяжелые и полноразмерные легкие цепи для антител 4Ό4, имеющие различные константные области тяжелой цепи 1§С.
Таблица 4
I Антитело Вариабельная область тяжелой цепи + константная область тяжелой цепи Полноразмерная тяжелая цепь
4ϋ4 (!дО2) ЗЕО Ю N0: 10 + 3ΕΟΙϋΝΟ: 4 ЗЕО Ю N0: 40
4ϋ4 (1дС1) ЗЕО Ю N0: 10 + ЗЕО Ю N0: 2 ЗЕО Ю N0: 41
Антитело Вариабельная область тяжелой цепи + константная область тяжелой цепи Полноразмерная тяжелая цепь
4Ю4 (1д64) ЗЕО ΙϋΝΟ: 10 +ЗЕО Ю N0: 6 ЗЕО Ю N0: 42
4ϋ4 (!д(ЭЗ) ЗЕО Ю N0:10 + ЗЕО Ю N0: 26 ЗЕО Ю N0: 43
Антитело Вариабельная область легкой цепи Полноразмерная легкая цепь
константная область легкой цепи
4ϋ4 3Ε0Ι0Ν0: 12 +ЗЕО Ю N0: 8 ЗЕО Ю N0: 44
- 40 013614
Пример 5. Характеристика активности антител к ΝΟΕ 4Ό4.
Транзитно экспрессируемые антитела к ΝΟΕ 4Ό4, полученные в клетках, выращенных в условиях спин-культуры (с постоянным перемешиванием) (8) или роллерной культуры (К) тестировали на подтверждение их способности к нейтрализации ΝΟΕ в количественном определении биологической активности нейтрализации ΝΟΕ на основании нейронов ΌΡΟ, проведенном, как описано выше (пример 3).
Антитела к ΝΟΕ транзитно экспрессировали в суспензии адаптированных к отсутствию сыворотки клеток 293Т. Трансфекции проводили либо в 500 мл, либо в 1 л культуры. Кратко, клеточный инокулят (5,0х105 клеток/млх объем культуры) центрифугировали при 2500 об./мин в течение 10 мин при 4°С для удаления кондиционированной среды. Клетки ресуспендировали в свободной от сыворотки ΌΜΕΜ (модифицированной Дельбрюкком среде Игла) и снова центрифугировали при 2500 об./мин в течение 10 мин при 4°С. После отсасывания промывочного раствора клетки ресуспендировали в ростовой среде [ΌΜΕΜ/Ε12 (3:1) + 1х добавка инсулин-трансферрин-селен + 1х пенициллин, стрептомицин, глутамин + 2 мМ Ь-глутамин + 20 мМ ГЭПЭС + 0,01% Р1игошс Ε68] в 1 л или 3 л спин-культуры. Спин-культуру держали на платформе магнитной мешалки при 125 об./мин, которую помещали в увлажненный инкубатор, поддерживаемый при 37°С и 5% СО2. Получали комплекс плазмидной ДНК с реагентом трансфекции в конической пробирке на 50 мл. Комплекс ДНК-реагент трансфекции получали в 5% конечного объема культуры в свободной от сыворотки ΌΜΕΜ. Сначала 1 мкг плазмидной ДНК/мл культуры добавляли в свободную от сыворотки ΌΜΕΜ, после чего добавляли 1 мкл Х-ТгетеСепе ΡΌ-1539/мл культуры. Комплексы инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 30 мин, а затем добавляли к клеткам в спин-культуре. Трансфекцию/экспрессию проводили в течение 7 суток, после чего кондиционированную среду собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 мин при 4°С.
Для транзитных трансфекций в роллерной культуре авторы изобретения использовали прикрепленные клетки 293Т, выращенные и поддерживаемые в ΌΜΕΜ с добавками 5% ΕΒ8 + 1х неэссенциальные аминокислоты + 1х пенициллин, стрептомицин, глутамин + 1х пируват натрия. Примерно 4-5х107 клеток 293Т высевали в 850 см2 роллерные сосуды на ночь. Затем ранее засеянные клетки трансфецировали на следующие сутки, используя реагент трансфекции ЕиСепе6. Смесь ДНК-реагент трансфекции готовили примерно в 6,75 мл свободной от сыворотки ΌΜΕΜ. Сначала добавляли 675 мкл реагента трансфекции ЕиСепе6 с последующим добавлением 112,5 мкг плазмидной ДНК. Этот комплекс инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем всю смесь добавляли в роллерный сосуд. Этот роллерный сосуд газировали газовой смесью 5% СО2, плотно закрывали крышкой и помещали в инкубатор на 37°С во вращающийся штатив, вращаемый при 0,35 об./мин, трансфекцию проводили в течение 24 ч, после чего среду заменяли на 100 мл ΌΜΕΜ + 1х добавка инсулин-трансферрин-селен + 1х пенициллин, стрептомицин, глутамин + 1х неэссенциальные аминокислоты + 1х пируват натрия. Обычно получали две 48-часовые культуры по 100 мл для каждой роллерной культуры. Собранную свободную от сыворотки кондиционированную среду объединяли вместе и центрифугировали при 4000 об./мин в течение 30 мин при 4°С.
Как 4Ό4.Ι§Ο1, так и 4Ό4.Ι§Ο2 показали сильную активность со значениями 1С50 от примерно 0,14 до примерно 0,2 нМ против человеческого ΝΟΕ (фиг. 2). Результаты этого анализа на активность суммировали в табл. 5. Антитела показали небольшую активность против крысиного ΝΟΕ (фиг. 3). Эти результаты напоминают активность антител, тестируемых непосредственно из гибридом, описанных выше.
Таблица 5
АЬ 1СМ ΚΝΟΕ (нМ) 1С50 γΝΟΕ (нМ)
404.1д61.К 0,1488 > 34 нМ
404.1дС1.5 0,1587 > 45 нМ
404.1дС2.К 0,2047 > 59 нМ
404.1дО2.8 0,2063 > 37 нМ
11ΝΟΕ = человеческий ΝΟΕ, γΝΟΕ = крысиный ΝΟΕ, К = роллерная культура, 8 = спин-культура (с постоянным перемешиванием)
Пример 6. Продуцирование антитела к ΝΟΕ.
Антитело к ΝΟΕ продуцируют, осуществляя экспрессию в клональной линии клеток СНО. Для каждого цикла продуцирования клетки из одного флакона оттаивают в свободной от сыворотки среде для клеточных культур. Клетки сначала выращивают в Т-образной колбе, затем в спин-культуре, а затем выращивают в реакторах из нержавеющей стали, увеличивая масштаб вплоть до 2000 л биореактора. Продуцирование осуществляют в 2000 л биореакторе, используя подпитываемую культуру, в которую добавляют концентрированную среду, содержащую питательные компоненты, для поддержания роста клеток и жизнеспособности культуры. Продуцирование продолжают в течение примерно двух недель, в течение которых антитело к ΝΟΕ конститутивно продуцируется клетками и секретируется в клеточную культуральную среду.
- 41 013614
В реакторе для продуцирования контролируют предопределенный рН, температуру и уровень растворенного кислорода: рН контролируют газом диоксидом углерода и добавлением карбоната натрия; растворенный кислород контролируют газовыми потоками воздуха, азота и кислорода.
В конце продуцирования клеточный бульон загружают в центрифугу с комплектом дисков и надосадочную жидкость культуры отделяют от клеток. Концентрат дополнительно очищают через фильтр с толстым слоем, а затем через 0,2 мкм фильтр. Затем очищенную кондиционированную среду концентрируют путем ультрафильтрации в тангенциальном потоке. Кондиционированную среду концентрируют в 15-30 раз. Затем полученную в результате концентрированную кондиционированную среду либо обрабатывают очисткой, либо замораживают для последующей очистки.
Пример 7. Перекрестная реактивность с другими нейротрофинами.
Антитела 4Ό4 тестировали на их перекрестную реактивность против человеческого N13 или человеческого ВЭНЕ в различных анализах количественного определения биологической активности, включая анализ на выживание нейронов ΌΚ0 для человеческого NТ3 и анализ захвата ϋΛ в культивируемых нейронах ЭА для человеческого ВП№.
Обработка культур ΌΚ0 N13, антителами к N13 и N0?.
Через 2 ч после посева клетки ΌΚ0 (методика выделения описана выше в примере 3) обрабатывали рекомбинантными человеческими №Г-3 (кЯТ-3) 100 нг/мл (3,8 нМ). Серийно разведенное антитело г кЫТ3 (Р & Ό) использовали в качестве положительного контроля. Неизвестные образцы (образцы антител к N0?) добавляли в различных концентрациях на 10 точек 3,16-кратных серийных разведений. Все образцы разводили в полной среде перед добавлением в культуры.
Измерение экспрессии МАР2 в нейронах ΌΚ0.
Культуры фиксировали 4% параформальдегидом в сбалансированном солевом растворе Хенкса в течение 15 мин, блокировали 8ирегЬ1оск (Р1егсе) в течение 1 ч и делали проницаемыми 0,25% №шбе1 Р40 (81дта) в забуференном Трис-НС1 (81дта) солевом растворе (ТСБ) в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Культуры промывали один раз ТСБ, содержащим 0,1% твин 20 (81дта), и инкубировали с мышиным анти-МАР2 ^0 (Скетюоп, Тетеси1а, СА) в течение 1,5 ч при комнатной температуре с последующей инкубации с Еи-меченым вторым антителом против мыши (\Уа11ас 0у, Тигки, ?ш1аиб) в течение 1 ч при комнатной температуре. Отмывки ТСБ (3x5 мин при мягком встряхивании) применяли после каждой инкубации с антителом. К культурам добавляли усиливающий раствор (150 мл/лунка, \Уа11ас 0у), а затем измеряли сигнал флуоресценции в фотометре с временным разрешением (^а11ас 0у).
Культура эмбрионального среднего мозгового пузыря.
Использовали эмбрионы крыс 8ргадие-ЭаМеу (1асккоп ЬаЬк) в возрасте 19 суток (Е19). Ткань вентрального среднего мозга, обогащенную дофаминергическими нейронами, извлекали и переносили в холодный забуференный фосфатом солевой раствор Дульбекко (ИРВ8), рН 7,4, без Са++ и Мд44 (01Ьсо). Фрагменты ткани диссоциировали до одноклеточной суспензии, используя папаиновую систему диссоциации (\Уог11ипд1оп ВюсЬетюа1 Согр., ?гееко1б, N1). Кратко, фрагменты ткани инкубировали в переваривающем растворе, содержащем 20 ед/мл папаина в сбалансированном солевом растворе Эрла (ЕВ88) при 37°С в течение 50 мин. Клетки диссоциировали путем пипетирования через отполированные в пламени пастеровские пипетки в среде для диссоциации, состоящей из МЕМ/Нат'к ?12, 1:1, 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% дезоксирибонуклеазы Ι (ДНКазы). Диссоциированные клетки осаждали при 200хд в течение 5 мин и ресуспендировали в ЕВ88, содержащем 1 мг/мл ингибитора овомукоида и 1 мг/мл овальбумина и 0,005% ДНКазы. Клеточную суспензию центрифугировали через градиентный раствор, содержащий 10 мг/мл ингибитора овомукоида и 10 мг/мл овальбумина, при 200хд в течение 6 мин для удаления клеточных обломков, а затем фильтровали через 25 мкг нейлоновое сито №!ех (Те!ко, Шс.) для удаления комков. Диссоциированные клетки высевали в планшеты для тканевых культур при густоте 100000/см2. Планшеты были предварительно покрыты поли-орнитином 100 мкг/мл (81дта) и мышиным ламинином 1 мкг/мл (01ЬсоВКЕ), как описано ранее (Ьошк 1С е! а1., 1. РЬагтасо1. Ехр. ТЬег. 1992; 262: 1274-1283). Культуральная среда состояла из минимальной эссенциальной среды (МЕМ)/Нат'к ?12, 1:1, 12% лошадиной сыворотки (01Ьсо), 100 мкг/мл трансферрина и 2,5 мкг/мл инсулина (81дта). Культуры держали при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности в течение 6 суток.
Обработка культур среднего мозгового пузыря ВИИР и антителами кВИИР или «N0?.
ВИИР в концентрации 10 нг/мл добавляли в клетки через 2 ч после посева с последующим добавлением серийных концентраций образцов анти-Ы0? АЬ. Антитело к ВИЦ? (полученное Атдеп) использовали в качестве положительного контроля.
Захват ИА в нейронах среднего мозгового пузыря.
Анализ на захват дофамина проводили, как описано ранее (?пебтап, Ь. Апб МуШтеои, С., №игокаепсе Ье!!егк 1987; 79: 65-72). На шестые сутки культуры промывали один раз предварительно подогретым фосфатным буфером Кребса-Рингера (рН 7,4), содержащим 5,6 мМ глюкозу, 1,3 мМ ЭДТА и 0,5 мМ паргилин, ингибитор моноаминоксидазы. Культуры инкубировали в буфере захвата, содержащем 50 нМ [3Н] ИА (NЕN), в течение 60 мин при 37°С. Захват останавливали путем удаления буфера захвата и культуры промывали три раза фосфатным буфером Кребса-Рингера. Клетки лизировали для высвобождения
- 42 013614 [3Н] ΌΑ путем добавления жидкой сцинтилляционной смеси, Орйсрйаке 8ирегт1х (\а11ас), непосредственно в культуры. Затем радиоактивность клеточных лизатов считали в счетчике жидкостной сцинтилляции микробета-плюс (\а11ас, 1пс.). Захват ΌΑ низкого аффинитета оценивали путем добавления 0,5 мМ СВВ12909, специфичного ингибитора сайтов захвата ΌΑ высокого аффинитета (Не1ккйа ВЕ апб Махто Ь, Еигореап 1оигпа1 оТРйагтасо1оду 1984; 103: 241-8), в буфер захвата и вычитали из количества суммарного захвата для получения значения захвата ΌΑ высокого аффинитета.
Таблица 6
Антитело 1С60 ΗΝΤ-3 (нМ) 1С60 ΗΒΌΝΕ (нМ)
4Ό4 (1дО2) > 13,75 > 13,75
Пример 8. Идентификация эпитопа для антител к ΝΟΕ.
Картирование эпитопа путем ограниченного протеолиза.
Пять микрограммов (мкг) ΝΟΕ инкубировали с 4Ό4 (11 мкг) в течение 30 мин при 4°С в 0,1 М Трис-буфере, рН 7,5. Затем комплекс переваривали протеазой (субтилизином) 1 мкг при 37°С в течение 1 и 2 ч. Карты пептидов по ВЭЖХ сравнивали друг с другом, чтобы найти пептиды, которые были защищены антителами 4Ό4. Ограниченный протеолиз ΝΟΕ показал, что первоначально из ΝΟΕ высвобождалось несколько основных пептидов. Особый интерес представляют пептиды 818.3, 818.5 и 834.4, полученные и защищенные антителом от протеолиза. Другие пики не были значительно сформированы или защищены. Защищенные пептиды из двух экспериментов (1-часовое и 2-часовое переваривание) представлены в табл. 7.
Таблица 7
% защиты
1-часовое переваривание 2-часовое переваривание
816.1 ОАА (96-98) С-концевой - 57
318.3 РЕЕТК (53-57) (ЗЕО Ю N0:45) Область петли 40 45
818.5 868ΗΡΙΕΗΚ (1- 9) (8ЕО Ю N0:46) (Η\Λ/Ν8Υ)* (8ЕО Ю N0:47) Ν-концевой 40 50
834.4 Ν8νΕΚ0ΥΕΕΕΤΚ (46-57) (ЗЕО ГО N0:48) Область петли 69 38
Процент защиты вычисляли на основании высоты пептидного пика 818.5, содержащего два пептида, но только один пептид (888НР1ЕНВ; 8ЕО ГО NΟ: 46) был защищен антителом 4Ό4, поскольку пик другого пептида (Н\К8У; 8ЕО ГО NΟ: 47) был не изменен добавлением антител 4Ό4, как определено на основании поглощения при 280 нм. Пептид 818.3 представлял собой С-концевой участок 834.4, оба из одной и той же области петли. Ν-Концевая область и центральная область петли также являются возможными эпитопами.
Разделение переваренных пептидов на Мюгосоп.
Материал, переваренный субтилизином (3 мкг каждого), инкубировали с активными антителами 4Ό4 и с неактивным моноклональным антителом (№ 162) (8 мкг) в течение 30 мин при 4°С в 0,1 М Трис буфере, рН 7,5. Связанные/несвязанные пептиды разделяли с помощью Мюгосоп 10 (Мййроге Согр., ВебТогб, Макк), и обе фракции (связанную и несвязанную) анализировали с помощью ВЭЖХ, чтобы найти пептиды, связанные с антителами. Выделили два истощенных пика, идентифицированных путем сравнения ВЭЖХ несвязанных фракций после обработки антителами 4Ό4 и № 162 и разделения Мюгосоп, указывающие на пептиды, связанные с антителами. Связанные 4Ό4 пептиды представляли собой (4.4) ----8ВКΑVВВ (113-119) (8ЕО ГО ИО: 49), С-концевая область и (28.3) ----ЕУМУЬ (35-39) (8ЕО ГО ЫО: 50), область петли.
Образец ΝΟΕ альтернативно переваривали Ьук-С (К) в течение 24 ч. Цистеиновые остатки восстанавливали и подвергали карбоксиметилированию без денатурирующего агента. Образец инкубировали с моноклональными антителами 4Ό4 и ΑΜС162. а затем разделяли Мюгосоп 100. Связанные и несвязанные фракции анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Только два пептида были идентифицированы как связывающие антитело К-пептиды, как показано ниже. Вычисленная масса для этих пептидов, определенная путем анализа последовательности, и масс-спектрометрия пептидов совпадали. Пептиды, как показано ниже, картировались в Ν-концевой и С-концевой области.
К1 (37.6) ---88811Р1ЕНВС1ЕЕ8\П)8У8\Л\УС11Ж (8ЕО ГО ЦО: 51)
Вычисленная масса = 2821; наблюдаемая масса = 2828,2; Ν-концевой
К2 (39.5) ----^ΑΑ\ВΡIВI^ТΑСVСV^8ВК (8ЕО ГО ЫО: 52)
- 43 013614
Вычисленная масса = 2452; наблюдаемая масса = 2459,5; С-концевой.
Предшествующие эксперименты по картированию эпитопов показали, что по меньшей мере три области являются возможными эпитопами для антител 4Ό4, включая Ν-концевую (1-9), внутреннюю (4657) и С-концевую (96-98) области. Кроме того, переваривание Акрб выявило, что пептидный фрагмент, состоящий из —88НР1ЕНКСЕЕ8УС— (8ЕЦ ΙΌ NО: 53), был защищен антителом 4Ό4, тогда как переваривание трипсином показало, что пептидный фрагмент, состоящий из —88НР1ЕНК— (8ЕЦ ΙΌ NО: 54), не был защищен антителом 4Ό4. Таким образом, в Ν-конце последовательность СЕЕ8УС (8ЕЦ ΙΌ NО: 55) является наиболее важной для связывания с антителами 4Ό4.
С целью более точного определения эпитопа для антитела к ΝΟΕ 4Ό4.Ι§Ο1, суммарно синтетическим путем получили 23 пептида, используя стандартные методики, на основании полноразмерной последовательности человеческого зрелого ΝΟΕ (11ΝΟΕ) (табл. 8). Длина этих пептидов составляла 15 аминокислот, перекрывающихся на 10 аминокислот, и с цистеиновыми хвостами на С-концах, чтобы дать возможность конъюгации с матриксом. Для эксперимента по картированию использовали человеческое анти-ΙιΝΟΕ АЬ 4Ό4.Ι§Ο1, описанное выше.
Таблица 8
Пептид # Поел едовател ьность 3ΕΟ Ю ΝΟ
33582-27-01 ЗЗЗНР1ЕНКСЕРЗУС (1-15) 56
33582-27-02 ΙΕΗΚΟΕΡδνΑΟ$ν$νθ (6-20) 57
33582-27-03 ЕРЗУАО5У5\МЛЛЗОКС (11-25) 58
33582-27-04 ΟβνβννννΘϋΚΤΤΑΤΟΟ (16-30) 59
33582-27-05 \ЛЛ/ЗОКТТАТО1К(ЗКЕС (21-35) 60
33582-27-06 ΤΤΑΤϋ1ΚΘΚΕνΜνΐ.ΘΟ (26-40) 61
33582-27-07 ΙΚΟΚΕνΜνί-ΟΕνΝΙΝ (31-45) 62
33582-27-08 νΜνίΟΕνΝΙΝΝβνΓΚΟ (36-50) 63
33582-27-09 ΕνΝΙΝΝβνΡΚΟΥΕΕΕΘ (41-55) 64
33582-27-10 ызуркоургеткапос (4β-βθ) 65
33582-27-11 ΟΥΓΕΕΤΚΑΚΟΡΝΡνϋΟ (51-65) 66
33582-27-12 ΤΚΑΚ0ΡΝΡν03ΘΑΚϋ0 (56-70) 67
33582-27-13 ΡΝΡνοεΘΑΗΟΙϋβΚΗΟ (61-75) 68
33582-27-14 3ΘΑΚΟΙϋ3ΚΗννΝ3ΥΟ (66-80) 69
33582-27-15 Γπ5ΚΗννΝ3ΥΑΪΤΤΗΤ0 (71-85) 70
33582-27-16 ν\/Ν3ΥΑΤΤΤΗΤΕνΚΑΕ0 (76-90) 71
33562-27-17 ΤΤΤΗΤΕνΚΑΕΤΜϋΘΚΘ (81-95) 72
33582-27-18 ΕνΚΑίΤΜΟΟΚΟΑΑννΗΟ (86-100) 73
33582-27-19 ТМОСКОАААЕЕ1КЮС (91-105) 74
33582-27-20 ОАААРНРЮТААУС (96-110) 75
33582-27-21 Е1Б1ЮТААУА71.8ККС (101-115) 76
33582-27-22 ΤΑΑνΑνίδΑΚΑνΚΕΑΰ (106-120) 77
33582-27-23 ΟΑΑνΑνίδΚΚΑνΗΗΑ (107-120) 78
Пептидные фрагменты человеческого ΝΟΕ разводили в ФСБ с 5% ДМСО, 1 мМ ЭДТА, рН 6,23. Конечная концентрация пептида была нормализована до одинаковой молярной концентрации при 55 мкМ (примерно 100 мкг/мл). Пептиды инкубировали в активированных Кеасб-Вшб Ма1е1т1бе 96луночных микротитровальных планшетах (Р1егсе, № по каталогу 15150), 100 мкл/лунка, при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при 4°С в течение ночи при качании. Человеческий ΝΟΕ (100 мкг/мл) использовали в качестве положительного контроля. Планшеты отмывали отмывочным буфером (КРЬ) и блокировали 0,2% обезжиренного сухого молока (в буфере ФСБ-ЭДТА, рН 6,23) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дополнительно блокисровали 5% БСА в течение 1 ч. Затем планшеты инкубировали с человеческим антителом анти-ΝΟΕ при различных концентрациях (0, 3, 10, 30 мкг/мл), а затем с антителом коза против ЬЕсАЬ-НКР (КРЬ) в течение 2 ч. Сигнал проявляли субстратом ТМВ и считывали при 450 нм после добавления останавливающего раствора (КРЬ).
По всем 23 пептидам человеческого ΝΟΕ наблюдали по меньшей мере 4 главных пика, указывающих на связывание 4Ό4. Эти пики соответствовали следующим пептидам: пептид № 1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΌ: 56),
- 44 013614
888НР[ЕНКСЕЕ8УС (1-15); пептид № 10 (8ЕО ΙΌ N0: 65), N§VЕК^ΥЕЕЕТКΑК^ (46-60); пептиды № 16-17 (81 У) ΙΌ N0: 71-8ЕР ΙΌ N0: 72), \\'\№’АТТТ11ТЕУКА1.--- (76-95) и пептиды № 18-21 (8 ЕС) ΙΌ N0: 73-8ЕР ΙΌ N0: 76), ТТТ11Т---1.8ККС (100-115).
Четыре пика связывания 4Ό4 картировались в Мконцевом, С-концевом, внутренних доменах, а также в петлях Ь2 и Ь4 в NСЕ, как описано в \е18тапп е! а1. (1999, №11иге 401: 184-8). Эти результаты суммированы в табл. 9.
Таблица 9
Эпитопы ΠΝΘΕ Ν-конец !_2 Внутренний 1.4 Внутренний С-конец
пептид # пептид # 1 (ЗЕО Ю ΝΟ: 56), 338ΗΡΙ--, 1-15 пептид #10 (ЗЕО Ю N0: 65). ЫЗУГКО—. 46-60 пептид #16 (ЗЕО Ю N0: 71). тэуд—. 76-90 пептид #17 (ЗЕО Ю N0: 72). ТМОСКО- 81-95 пептид #19 (ЗЕО Ю N0: 74). ТМООК— 91- 105 пептиды # 20-21 (ЗЕО Ю N0: 75 ЗЕО Ю N0:76).
Сигнал связывания АЬ +++ + ++ ++ +++ ++
\1е§тапп е! а1. раскрыли кристаллическую структуру йЫСЕ, связанного с рецептором 1гкА, показав, что Мконец (остатки 2-9) важен для связывания с рецептором (\1е§тапп е! а1., 1999, №1иге 401: 184-8). Остатки данного сегмента в NСЕ также важны для специфичности к 1гкЛ по сравнению с рецепторами 1гкВ или 1гкС. Антитело 4Ό4 является селективным для человеческого NСЕ по сравнению с мышиным/крысиным NСЕ, а также с ΒΌΚΡ и ХТ-3, скорее всего, благодаря Мконцевым различиям между человеческим NСЕ и другими нейротрофинами.
Антитело 4Ό4 связывается с пептидом № 10 (8ЕЦ ΙΌ N0: 65) (ЖУЕК—, 46-60) и с пептидом № 17 (8ЕЦ ΙΌ N0: 72) (ТТТНТРУКЛЬТМОСКС, 81-95), соответствующим петлям Ь2 и Ь4 соответственно, которые представляют собой две отдельные области с различиями последовательностей выше среднего среди нейротрофинов. Эксперименты по обмену между NСΡ и ΒΌΚΡ этих семи областей показали, что Ь2 и Ь4 важны для биологической активности NСΡ. Кроме того, замена пяти остатков ХТ3 в петлях Ь2 и Ь4 остатками NСΡ придавала NСΡ-подобную активность при сохранении активности ХТ3. Таким образом, Ь2 и Ь4 являются вероятными областями, где антитело 4Ό4 селективно связывается с NСΡ вероятнее, чем с ΒΌΚΡ или №-3.
Антитело 4Ό4 также связывается с пептидом № 16 (8ЕЦ ΙΌ N0: 71) (\МетЛТТТНТРУКЛЬ, 7690), совпадающим с внутренним доменом кристаллической структуры NСΡ. Эта область является на 100% гомологичной между человеческим NСΡ и мышиным NСΡ, но отличной от других нейротрофинов. 4Ό4 показал значительно более слабую активность против крысиного/мышиного NСΡ по сравнению с его активностью против человеческого NСΡ. Следовательно, связывание с этим участком NСΡ вероятнее всего не является критическим для видоспецифичности, но является важным для селективности среди нейротрофинов.
Антитело 4Ό4 также связывается с С-концевой областью NСΡ (пептиды № 19-21 (8ЕЦ ΙΌ N0:748ЕЦ ΙΌ N0: 76) ТМОСК—Ь8ККС, 91-115), которая является одной из областей человеческого NСΡ, которая отличает NСΡ от других нейротрофинов (ΒΌΚΡ и ХТ3). Связывание с этой областью помогает объяснить, почему 4Ό4 не является активными против других нейротрофинов. Кроме того, существует отличие по единственной аминокислоте между человеческим NСΡ и мышиным NСΡ в С-конце, что позволяет предположить, что эта единственная аминокислота может быть одной из причин селективности 4Ό4 к человеческому NСΡ по сравнению с крысиным/мышиным NСΡ, подобно Мконцу, где наблюдаются видовые различия.
Наконец, 4Ό4 также взаимодействует с внутренним доменом, описанным пептидом № 10 (8ЕЦ ΙΌ N0: 65) (—КАКОС, 50-60) человеческого NСΡ, который является важной областью для связывания NСΡ преимущественно с 1гкА вероятнее, чем с 1гкВ или 1гкС, что дополнительно объясняет его селективную активность по нейтрализации против человеческого NСΡ.
Пример 9. Измерение аффинитета моноклональных антител с помощью КшЕхА.
Связывание Ай 4Ό4 (38859-80) с йцЫСР (29714-91) тестировали на КшЕхА. Кратко, Кеасй-Се1 6х (Р1егсе) предварительно покрывали йцЫСР и блокировали БСА. 10 пМ и 30 пМ образцов Ай 4Ό4 инкубировали с различной концентрацией йиЫСР (Атдеп) при комнатной температуре в течение 8 ч, после чего пропускали через покрытые йиЫСР шарики. Количество антитела, связавшегося с шариками, количественно определяли с помощью меченого флуоресцентной меткой (Су5) антитела козы против человеческого ЦС (Даскюп бппите Кекеагсй). Сигнал связывания был пропорционален концентрации свободного антитела при равновесии. Равновесную константу диссоциации (Кс) получили на основании нелинейной регрессии кривых конкуренции, используя модель двойных кривых одноточечного однородного связывания (программное обеспечение К1пЕх). Кс составляла примерно 4 пМ для связывания Ай 4Ό4 с
- 45 013614
Ιιιι\61;.
Пример 10. Идентификация дополнительных антител к N0?.
Дополнительные антитела к N0? (обозначенные 14Ό10, 609, 7Н2, 14Р11 и 406), полученные и идентифицированные, как описано в примерах 2 и 3 выше, отобрали для дальнейшего исследования. Кратко, кондиционированную среду тестировали на биологическую активность. Антитела из среды очищали и секвенировали. Предсказанную массу сравнивали с данными масс-спектрометрии антител из кондиционированной среды. Эти антитела клонировали. Два из этих клонов экспрессировали в клетках СНО и тестировали на активность, как описано выше. Результаты показаны в табл. 10.
Таблица 10
КЛОН !С50 6ΝΘΡ (нМ) 1С50 ΓΝΟΡ (нМ) Примечания Молекуля рный кППН Юво ΙηΝΘΡ ΙΟίο γΝ6Ε ωΛΐ)
7Н2 3.294 1.748 Клониоован 7Н2-гРс 0.963 0.792
6Н9 3.172 1.699 Клониоован 6Н9-гРс 13.93 (Р653
14Ό10 0.3918 >13 Клониоован
14011 0.2803 >20 Клонирован
466 0,414 >10 Клонирован
Затем последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей этих антител сравнивали с последовательностью антитела 4Ό4, а также каждую друг с другом (фиг. 5 и 6). Проценты гомологий вариабельных областей тяжелой цепи, как идентифицировано на основании этих сравнений, показаны в табл. 11. Проценты гомологии вариабельных областей легкой цепи показаны в табл. 12. Кроме того, проценты гомологии СИЯ областей различных антител показаны на фиг. 5-10.
Таблица 11
4Ό4 УН 14ϋ10νΗ 6Η9 νΗ 7Η2 νΗ 14Э11 νΗ 466 νΗ
4ϋ4 УН 100% 70,9% 70,1% 75,6% 47,2.% 73,4%
14ϋ ЮУН 100% 95,3% 85% 54,3% 81,1%
6Н9УН 100% 86,6% 54,3% 81,1%
7Н2УН 100% 51,2% 79,8%
14011 УН 100% 56,8%
466 УН 100%
ν4ϋ4 νκ 1401 1 РС 466а 1_С 466Ь 1.С 466с ЬС 14010 Ю бНЭЬ С 4666 1.С 7Н21С 466е
ν4ϋ 4УК 100% 89% 91% 72% 74% 69% 71% 71% 70% 73%
1401 1 1С 100% 94% 68% 71% 67% 68% 68% 68% 70%
466а Ю 100% 69% 74% 68% 70% 70% 69% 71%
466Ь 1 С 100% 87% 83% 86% 86% 86% 96%
466с ЬС 100 % 91% 94% 94% 94% 91%
1401 0 ьс 100% 91% 94% 94% 86%
6Н9 ! С 100% 99% 98% 89%
4666 I С 100% 99% 89%
7Н2 1.0 100%
466е 100%
Таблица 12
Должно быть понятно, что в приведенном выше описании сделан акцент на некоторые конкретные воплощения изобретения, и что все эквивалентные модификации или альтернативы входят в объем изо- 46 013614 бретения и прилагаемой формулы изобретения.
02-1240.8Т25
Перечень последовательностей <110> УАЙЛД Кеннет Д.
ТРИНОР Джеймс Дж, с.
ХУАН Хайчунь иноу Хизер
ЧЖАН Те Дж.
МАРТИН Франк <120> Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ΝΟΓ) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ИСЕ <130> 02-1240 <150> 05 60/487,431 <151> 2003-07-15 <160>138 <170> РабеггЫп уегзтоп 3.0 <210> 1 <211>990 <212> ДНК <213> Ното йар1епе <400>1
дссЬссасса адддсссабс ддТсРЪсссс сбддсасссЪ ссбссаадад сассъсбддд 60
ддсасадсдд сссьдддсбд ссЬддбсаад дасЪасббсс ссдаассддр дасддбдбсд 120
ТддаасЕсад дсдсссбдас садсддсдбд сасассббсс сддсЕдЪссТ. асадбссбса 180
ддасбсТаср сссЬсадсад сдрддрдасс дТдсссРсса дсадсббддд сасссадасс 240
РасаРсбдса асдтдаабса саадсссадс аасассаадд Ьддасаадаа адТРдадссс 300
аааСсТРдбд асаааасбса сасабдссса ссдбдсссад сассРдаасР ссРдддддда 360
ссдТсадЕсб СссСсЕТссс сссаааассс ааддасассс СсабдаСсГс ссддассссб 420
даддЬсасаб дсдбддбддб ддасдТдадс сасдаадасс сРдаддЪсаа дГЕсаасбдд 480
- 47 013614
£асдкддасд дсдрддаддр дсакаакдсс аадасааадс сдсдддадда дсадкасаас 540
адсасдбасс дкдкддксад сдкссксасс дксскдсасс аддаскддск даакддсаад 600
дадкасаадк дсааддРсбс саасааадсс сксссадссс ссаксдадаа аассаксксс 660
ааадссааад ддсадссссд адаассасад дкдкасассс кдсссссакс ссдддакдад 720
скдассаада ассаддрсад сскдасскдс скддксааад дсккскаксс садсдасакс 730
дссдкддадк дддададсаа Рдддсадссд дадаасааск асаадассас дссксссдкд 840
скддаскссд асддсксскк сЫсскскак адсаадскса ссдкддасаа дадсаддкдд 900
садсадддда асдксккскс акдскссдкд акдсакдадд скскдсасаа ссаскасасд 960
садаададсс Гскссскдкс кссдддкааа 990
<210> 2
<211> 330
<212> ПРТ
<213> Ното заргепз
<400> 2
Λ Ί —. л±а 1 СС1 Фк — 1_1Ь Ьуз 61у 5 РхО З&х ТТ—. Ί να± Г.1. —. С 4Г= Гэ„._ Г1 и 10 Ьеи ΛΊ πια ЗвЕ е> —. 15 Ьуз
Зег Ткг Зег 61у 61 у ТЬг А1а А1а Ьеи 61у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг
20 25 30
РЬе Рго 61и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 61у А1а Ьеи ТЬг Зег
35 40 45
61у Уа1 ΗΪ3 Ткг Рке Рго А1а Уа1 Ьеи 61п Зег Зег 61у Ьеи Туг Зег
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи 61у ТЫ 61п ТЬг
65 70 75 80
Туг Не Суз Азп Уа1 Азп Н13 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
85 90 95
Ьуз Уа1 6111 Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н13 ТЬг Суз Рго Рго Суз
100 105 110
Рго А1а Рго 61и Ьеи Ьеи 61у 61у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго
115 120 125
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз
130 135 140
Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 61и Азр Рго 61и Уа1 Ьуз Рке Азп Тгр
145 150 155 160
- 48 013614
Туг νβΐ Азр С1у Уа1 165 С1и Уа1 Н1з Азп А1а 170 Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 175 С1и
С1и С1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
180 185 190
Н13 С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп
195 200 205
Еуз А1а Ьеи Рго А1а Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у
210 215 220
С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и
225 230 235 240
Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг
245 250 255
Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп <51у С1п Рго С1и Азп
260 265 270
Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе
275 280 285
Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп
290 295 300
νβΐ РЬе 8ег Суз Зег Уа1 Ме£ ΗΪ3 61и А1а Ьеи Н15 Азп Н15 Туг ТЬг
305 310 315 320
С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
32 5 330
<210> 3
<211> 978
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 3
дссЬссасса адддсссаСс дд+сЁССссс сЬддсдсссЬ дсПссаддад сассбссдад 60
адсасадсдд сссЬдддсЕд сстддбсаад дасЬасЬЬсс ссдаассддЕ дасддЕдИсд 120
ЕддаасЕсад дсдсЕсЕдас садсддсдбд сасасстьсс садсТдЬссЪ асадЬссТса 180
ддасбсЬасЬ сссЬсадсад сдЬддбдасс дЬдсссЬсса дсаасЬЬсдд сасссадасс 240
ЬасассЬдса асдЬада+са саадсссадс аасассаадд Ьддасаадас адЬХдадсдс 300
аааЬдЬСдТд Ьсдад+дссс ассдбдссса дсассассЬд Тддсаддасс д^садЬсббс 360
с£сЫ:ссссс саааасссаа ддасасссЬс аЬдаЬсЬссс ддассссбда ддЬсасдбдс 420
- 49 013614
дЕддЕддЕдд асдЕдадсса сдаадасссс даддЬссадЬ ЕсаасЕддЕа сдЕддасддс 480
д-ЕддаддЕдс аСааЕдссаа дасааадсса сдддаддадс адЕЕсаасад сасдЕЕссдЕ 540
дЕддЕсадсд ЕссЕсассдЕ ЕдЕдсассад дасЕддсСда асддсаадда дЕасаадЕдс 600
ааддЕсЕсса асаааддссУ сссадссссс аЕсдадаааа ссаЕсЕссаа аассаааддд 660
садссссдад аассасаддЕ. дЕасасссЕд сссссаЕссс дддаддадаЕ дассаадаас 720
саддЬсадсс ЕдассЕдссЪ ддЕсаааддс ЕЕсЕассОса дсдасаЕсдс сдЕддадЕдд 780
дададсааЕд ддсадссдда даасаасЕас аадассасас сЕсссаЕдсЕ ддасЕссдас 840
ддсОсО.С'1'.. ЬссЕЫасад саадс-Есасс дЕддасаада дсаддЕддса дсаддддаас 900
дг-ЕЕсЕса* дсЕссдЕдаЬ дсаьдаддсь сидсасаасс асЕасасдса даададссЕс 960
ЕсссЕдЕсЕс сдддЕааа 978
<210> 4 <211> 326 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400 4
А1а 1 Зег ТЬг Ьуз С1у 5 Рго Зег Уа1 РЬе Рго 10 Ьеи А1а РГО Суз Зег 15 Агд
Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а А1а Ьеи 61 у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг
20 25 30
РЬе Рго С1и РГО Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег
35 40 45
С1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи εΐη Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Азп РЬе 61у ТЬг 61п ТЬг
65 70 75 80
Туг ТЫ Суз Азп Уа1 Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
85 90 95
ТЫ Уа1 С1и Агд Ьуз Суз Суз Уа1 С1и Суз Рго Рго Суз РГО А1а Рго
100 105 110
Рго νβΐ А1а С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз РГО Ьуз Азр
115 120 125
ТЬг Ьеи МеЕ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр
130 135 140
- 50 013614
Уа1 145 Зег Н1з С1и Азр Рго 150 С1и Уа1 С1п РЬе Азп 155 Тгр Туг Уа1 Азр 61у 160
Уа1 С1и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп
165 170 175
Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Уа1 Н13 С1п АЗр тгр
180 18 5 190
Ьеи Азп С1у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 61 у Ьеи Рго
195 200 205
А1а Рго Не С1и Ьуз ТЬг Пе Зег Ьуз ТЬг Ьуз С1у 61п Рго Агд 61и
210 215 220
Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Б1и Б1и Мес ТЬг Ьуз Азп
225 230 235 240
61п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е
245 250 255
А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг
260 265 270
ТЬг Рго РГО МеС Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз
275 280 285
Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п 61 у Азп Уа1 РЬе Зег Суз
290 295 300
Зег Уа1 МеС ΗΪ3 61и А1а Ьеи Н13 АЗП Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи
305 310 315 320
Зег Ьеи Зег Рго 61у Ьуз
325
<210> 5
<211> 981
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 5
дссадсасса аддддссаСс сдссССсссс сСддсдсссС дсСссаддад сасссссдад 60
адсасадссд сссСдддсСд ссСддСсаад дасСасССсс ссдаассддС дасддСдСсд 120
СддаасСсад дсдсссСдас садсддсдСд сасассССсс сддсСдСссС асадСссСса 180
ддасСсСасС сссСсадсад сдСддСдасс дСдсссСсса дсадсССддд сасдаадасс 240
СасассСдса асдСадаСса саадсссадс аасассаадд Сддасаадад адССдадСсс 300
аааСаСддСс ссссаСдссс аСсаСдссса дсассСдадС СссСдддддд ассаСсадСс 360
- 51 013614
СЬссЬдЫхсс ссссаааасс сааддасасЬ сЕсаЬдаЬсЬ сссддасссс ЬдаддЬсасд 420
ЬдсдЬддЬдд ЬддасдЬдад ссаддаадас сссдаддЬсс адЬЬсаасЬд дЬасдЪддаЕ 480
ддсдЬддадд ЬдсаЬааЬдс саадасааад ссдсдддадд адсадььсаа садсасдрас 540
сдЬдЬддЬса дсдЬссЬсас сдЬссЬдсас саддасЬддс Ьдаасддсаа ддадЬасаад 600
ЬдсааддЬсЬ ссаасааадд ссЕсссдОсс ЬссаЬсдада ааасса1сЕс сааадссааа 660
дддсадсссс дададссаса ддЬдЬасасс сЬдсссссаЬ сссаддадда даЬдассаад 720
аассаддбса дссЕдассЬд ссЬддЬсааа ддсЬЬсЬасс ссадсдасаЬ сдссдЬддад 780
Ьдддададса аЬдддсадсс ддадаасаас Ьасаадасса сдссТсссдЬ дсЬддасЬсс 840
дасддсЬссЬ ЬсЫзссЬсЕа садсаддсЪа ассдЬдгаса ададсаддрд дсаддадддд 900
ааЪдбсЬЬсЬ саЬдсЬссдЬ дакдсаЬдад дсксЬдсаса ассасЬасас асадаададс 960
сЬсЬсссЬдЬ сЬсЬдддЬаа а 981 <210> 6 <211> 327 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 6
А1а 1 Зег ТЬг Ьуз С1у 5 Рго Зег Уа1 РЬе Рго 10 Ьеи А1а Рго Суз Зег 15 Агд
Зег ТЬг Зег 61и Зег ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг
20 25 30
РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег
35 40 45
С1у Уа1 ΗΪ3 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Бег Зег С1у Ьеи Туг Бег
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг
65 70 75 80
Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Н1з Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
85 90 95
Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг б1у Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго А1а Рго
100 105 110
С1и РЬе Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьу5
115 120 125
Азр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1
130 135 140
- 52 013614
Азр 145 Уа1 Зег С1п С1и Азр Рго 150 С1и Уа1 (31п РЬе Азп 155 Тгр Туг Уа1 Азр 160
С1у Уа1 С1и Уа1 Н1Э Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд (31и (31и (31п РЬе
165 170 175
Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр
180 185 190
Тгр Ьеи Азп (31 у Ьуз С31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз (31 у Ьеи
195 200 205
Рго Зег Зег Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз (31 у С1п Рго Агд
210 215 220
(31и Рго (31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег <31п (31и С1и Мер ТЬг Ьуз
225 230 235 240
Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго Зег Азр
245 250 255
Ые А1а Уа1 С1и Тгр (31и Зег Азп (31 у (31п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз
260 265 270
ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег
275 280 285
Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр (31п (31и (31у Азп Уа1 РЬе Зег
290 295 300
Суз Зег Уа1 Мер ΗΪ3 61и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Н1з Туг ТЬг (31п Ьуз Зег
305 310 315 320
Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи (31у Ьуз
325
<210> 7
<211> 321
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 7
сдаасрдрдд сРдсассаРс РдРсРРсаРс РРсссдссаР срдардадса дРРдаааРсР 60
ддаасРдссР срдррдрдрд ссРдсРдааР аасРРсРаРс ссадададдс сааадрасад 120
РддааддРдд араасдссср ссааРсдддР аасРсссадд ададрдрсас ададсаддас 180
адсааддаса дсассРасад ссРсадсадс асссрдасдс Рдадсааадс адасРасдад 240
ааасасааад РсРасдссРд сдаадРсасс саРсадддсо рдадсРсдсс сдРсасааад 300
адсРРсааса ддддададРд Р 321
- 53 013614
<210> 8
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното
<400> 8
Агд ТЬг 1 Уа1 А1а А1а 5 Рго Зег Уа1 РЬе Не 10 РЬе Рго Рго Зег Азр 15 С1и
εΐη Ьеи Ьуз 5ег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе
20 25 30
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п
35 40 45
Зег Й1У АЗП Зег Θΐη С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег
50 55 60
ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и
65 70 75 80
Ьуз ΗΪ3 Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Н15 С1п С1у Ьеи Зег Зег
85 90 95
Рго 7а1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
100 105
<210> 9
<211> 369
<212> ДНК
<213> Ното
<400> 9
даддЬдсадс СддСддадБс Ьдддддаддс Ьрддрасадс сЬддддддЬс ссЬдадасРс60
ЬссЬдЬдсад ссЬсЬддсШ: сассЬЬаада адЬЬаЬадса ЬдаасЬдддЬ ЬсдссаддсЬ120 ссадддаадд ддсбддадЬд ддЬДЬсабас аЬЬадЬсдЬа дЬад'ЬсаЬас саЬаЬЬсЬас180 дсадасЬсЬд Ьдаадддссд аЬЬсассаЬс Ьссададаса ардссаадаа ЬЬсасЬдЬаЬ240 сЬдсаааЬдд асадссЬдад адасдаддас асддсбаЬдЬ аЬЬаспдЬдс дададбаЬаЬ300 адсадСддсС ддсасдпсБс ЬдасгаЬЬЫ: дасЬасЬддд дссадддааЬ ссЬддЬсасс360 дЬХЬссЬса369
- 54 013614
<210> 10
<211> 123
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 10
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи УаЬ 5 С1и Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи 10 УаЬ СЬп Рго СЬу 15 СЬу
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу Рке Ткг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег Мек Азп Тгр Уа1 Агд С1п АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи б1и Тгр УаЬ
35 40 45
Зег Туг Пе Зег Агд Зег Зег НЬз Ткг 11е Рке Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз СЬу Агд Рке Ткг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мек Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр Ткг АЬа Мек Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег СЬу Тгр ΗΪ3 УаЬ Зег Азр Туг Рке Азр Туг
100 105 НО
Тгр СЬу СЬп С1у Не Ьеи УаЬ ткг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 11
<211> 321
<212> ДНК
<213> Ното зарЬепз
<400> 11
дссакссадк кдасссадкс кссакссксс скдк.сЬдса'Ь скдкаддада сададксасс 60
аЬсасккдсс дддсаадкса дддсаккадс адкдсЬЫад сс+ддРакса дсадааасса 120
дддааадскс скаадсксск дакскакдак дсскссадкЬ Ьддааадкдд ддксссакса 180
аддЬксадсд дсадкддакс кдддасадак ГХсаскскса ссаксадсад сскдсадсск 240
даадакк+Ьд сааскЪакка скдксаасад ЬЬЬааг.адг.Ь асссдсксас ЬНсддсдда 300
дддассаадд Ьддадаксаа а 321
- 55 013614
<210> 12
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ното
<400> 12
А1а 1 Не С1п Ьеи ТЬг 5 61п Зег РГО Зег Зег Ьеи 10 Зег А1а Бег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Бег С1п С1у 11е Бег Зег А1а
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг (31п 61п Ьуз Рго (31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи С1и Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Бег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи (51п Рго
65 70 75 80
61и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1П С1п РЬе Азп Бег Туг Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ца1 (31и Не Ьуз
100 105
<210> 13
<211> 42
<212> ДНК
<213> Ното
<4 00> 13
дЪаЕаЪадса дЬддсЬддса сдрсЬсгдаР ьанЬЬЬдасЬ ас <210>14 <211>14 <212> ПРТ <213> Ното зарьепз <4С0>14
17а1 Туг Зег Бег О1у Тгр Ηίβ Уа1 Бег Азр Туг РЬе Азр Туг 1510 <210>15 <211>27 <212> ДНК
- 56 013614 <213> Ното зар1епз <400>15 саасадРЬка акадккассс дсксаск27 <210> 16 <211>9 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <4С0>16
С1п С1п Рке Азп Зег Туг Рго Ьеи Ткг <210>17 <211>51 <212> ДНК <213> Ното зар!епз <400>17
ЪасаСкадкс дкадкадкса кассакаккс касдсадаск скдкдааддд с51 <210> 18 <211>17 <212> ПРТ <213> Ното зараепз <400> 18
Туг Не Зег Агд Зег Зег Н1э Ткг 11е Рке Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 5 10 15
С1у
<210> 19
<211> 21
<212> ДНК
<213> Ното зартепз
<400> 19
дакдссксса дкккддааад 5; 21
- 57 013614
<210> 20
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ното
<4 00> 20
Азр А1а Зег Зег Ъеи С1и Зег <210> 21 <211>15 <212> ДНК <213> Ното зардепз <400>21 адТЛабадса Тдаас15 <210> 22 <211>5 <212> ПРТ <213> Ното зартепз <400>22
Зег Туг Зег МеТ Азп <210>23 <211>33 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400>23 сдддсаадЕс адддсаЪЪад садбдсЪЕба дсс33 <210>24 <211> 11 <212> ПРТ <213> Ното зардепз <400>24
Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Зег А1а Ьеи А1а
- 58 013614
10
<210> 25
<211> 1131
<212> ДНК
<213> Ното зар!епз
<400> 25
дссРссасса адддсссаЕс ддРсЕ^сссс сЬддсдсссР дсРссаддад сассСсРддд 60
ддсасадсдд сссРдддсРд ссЪддРсаад дасРасРЕсс ссдаассддр дасддЕдРсд 120
рддаасрсад дсдсссбдас садсддсдЕд сасассСЕсс сддсЪдЪсс! асадСссСса 180
ддасЕсГасЕ сссъсадсад сдбддЕдасс дСдсссСсса дсадсЪЪддд сасссадасс 240
РасассЕдса асдЕдааРса саадсссадс аасассаадд Еддасаадад адЕИдадсЕс 300
аааассссас РРддЬдасас аасЕсасаса РдсссасддЕ дсссададсс саааЕсЪЕдЬ 360
дасасассЕс ссссдрдссс асддрдосса дадсссаааР с^ЬдРдасас ассгсссссд 420
Едсссасдд! дсссададсс саааЕсРЪдб дасасассЕс ссссаЕдссс асддЕдссса 480
дсассЬдаас бссРдддадд ассдЕсадРс РбссЕсЕбсс ссссаааасс сааддаЪасс 540
сРСаЕдар-ЬР сссддасссс рдаддЕсасд ЕдсдЕддГдд ЕддасдЕдад ссасдаадас 600
сссдаддЕсс адЕЕсаадЕд дЕасдЕддас ддсд^ддадд Едсабааьдс саадасааад 660
ссдсдддадд адсадЕЕсаа садсасдбЕс сдЕдРддЕса дсдЕссЕсас сд±ссЕдсас 720
саддасРддс Рдаасддсаа ддадРасаад ЕдсааддРсР ссаасааадс ссРсссадсс 730
сссаЬсдада ааассаЕсРс саааассааа ддасадсссс дадаассаса ддрдрасасс 840
сЕдссссса! сссдддадда даЪдассаад аассадд^са дссРдассЪд ссРддРсааа 900
ддсЕЕсЕасс ссадсдасаЬ сдссдЕддад Едддададса дсдддсадсс ддадаасаас 960
Расаасасса сдссЕсссаЬ дсРддасРсс дасддсРссР РсЪРссРсСа садсаадсРс 1020
ассдрддаса ададсаддьд дсадсадддд аасаРсЕЕсР саРдсЕссдР даРдсаЕдад 1080
дсЮРдсаса ассдсРРсас дсадаададс сЕсЕсссЕдЕ с^ссдддЕаа а 1131
<210> 26 <211> 376 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз
- 59 013614 <400> 26
А1а 1 Зег ТЬг Ьуз 61у 5 Рго Зег Уа1 Рке Рго 10 Ьеи А1а Рго Суз Зег 15 Агд
Зег ТЬг Бег 61у 61у ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг
20 25 30
РЬе Рго 61и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег
35 40 45
С1у Уа1 Н1з ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи 61п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег
50 55 60
Ьеи 8ег Зег Уа1 7а1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи 61у ТЬг 61п ТЬг
65 70 75 80
Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азп ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп Ткг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
85 90 95
Агд Уа1 61и Ьеи Ьуз ТЬг Рго Ьеи С1у Азр ТЬг ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго
100 105 110
Агд Суз Рго 61и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ткг Рго Рго Рго Суз Рго Агд
115 120 125
Суз Рго С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр ТЬг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз
130 135 140
Рго 61и Рго Ьуз Зег Суз Азр ТЬг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго
145 150 155 160
А1а Рго 61 и Ьеи Ьеи 61 у 61у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз
165 170 175
Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1
180 185 190
νβΐ Уа1 Азр νβΐ Зег ΗΪ3 61и Азр Рго 61и Уа1 61п РЬе Ьуз Тгр Туг
195 200 205
Уа1 Азр 61 у νβΐ 61и Уа1 Н13 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 61и С1и
210 215 220
61η РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ3
225 230 235 240
61η Азр Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз
245 250 255
А1а Ьеи Рго А1а Рго Не 61 и Ьуз Ткг 11е Зег Ьуз ТЬг Ьуз 61у 61п
260 265 270
Рго Агд 61и Рго 61п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд 61и 61и Мек
275 280 285
ТЬг Ьуз Азп 61п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго
- 60 013614
290 295 300
Зег Азр Не А1а УаЬ 61и Тгр С1и Зег Зег С1у С1п Рго С1и Азп Азп
305 310 315 320
Туг Азп ТЬг ТЬг Рго Рго Мек Ьеи Азр 5ег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи
325 330 335
Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п 61у Азп 11е
340 345 350
РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мек Н13 С1и А1а Ьеи Н13 Азп Агд РЬе ТЬг <Э1п
355 360 365
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 01 у
370 375 <210> 27 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР-праймер для человеческого Ν6Ε1 <40027 асассасака ЬдЬсаЬсаЬс ссаксссаЬ29 <21023 <211>40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР-праймер для человеческого ΝΟΓ <40028 ассасаддаЬ ссЬссЬЬаЬд сасдасдсас адсЬЬЬасдд40 <21029 <211>375 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 .
- 61 013614 <223> Нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный человеческий мет-ИСЕ <400> 29
саЬаЬдЬсаГ саьсссаьсс саЬсЬЬссас аддддсдааЬ ЬсЬсддЬдЬд ЬдасадЬдЬс 60
адсдбдрддд ЫддддаРаа дассассдсс асадасаЬса адддсаадда ддсдабддЪд 120
ЬЬдддададд ЬдаасаЬЬаа саасадбдЬа РСсааасадД а с: ГД; С ЪСЬда дассаад£дс 130
сдддасссаа аСсссдЬЬда садсдддЬдс сддддсаЬЪд асЬсааадса сЬддаасТса 240
ЬаЫгдЬасса сдасъсасас сЬЫдЬсаад дсдсбдасса Г;ддаЬддсаа дсаддсГдсс 300
ЬддсддЬЬба ЬссддаРада ЬасддссЬдГ дЬдрдЬдЬдс СсадссдЬаа адсЬдЬдсдб 360
сдЬдсаЬаад даЬсс 375
<210> 30 <211> 121 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность рекомбинантного человеческого мет-ЫСГ (1-120) <400 30
МеЬ 1 Зег Зег Зег ΗΪ5 5 Рго 11е РЬе Н1з Агд 61у 10 61и РЬе Зег Уа1 15 Суз
АЗр Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр Уа1 61у Азр Ьуз ТЬг ТЬг А1а ТЬг Азр Не
20 25 30
Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 Ме-Ь Уа1 Ьеи 61 у 61и Уа1 Азп Не Азп Азп Зег
35 40 45
Уа1 РЬе Ьуз е1п Туг РЬе РЬе С1и ТЬг Ьуз Суз Агд Азр Рго Азп Рго
50 55 60
Уа1 Азр Зег 61у Суз Агд С1у Не Азр Зег Ьуз ΗΪ3 Тгр Азп Зег Туг
65 70 75 80
Суз ТЬг ТЬг ТЬг Н13 ТЬг РЬе Уа1 Ьуз А1а Ьеи ТЬг Меб Азр 61у Ьуз
85 90 95
61п А1а А1а Тгр Агд РЬе Не Агд Не Азр ТЬг А1а Суз Уа1 Суз Уа1
100 105 110
Ьеи Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Агд А1а
115 120
- 62 013614 <210> 31 <211> 55 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность 5'-праймера для генераций экспрессии вектора рСРМ1656 (АТСС # 69576 <400>31 сдаЪДЪдаЁЪ сЬадааддад даакаасака ГддВЬаасдс дЪЪддаа^Ъс ддкас55 <210>32 <211>49 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность 3'-праймера для генерации экспрессии вектора рСГМ1656 (АТСС # 69576 <400>32
ДааасЬаада ксЪЪссЬссС каГЪдСа^ас сааСДдсдса асс££аадс49 <210>33 <211>24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <220>
<221> ипзиге <222> (18)..(23) <223> η 1з а, с, И, ог д <400> 33 ддссддаЪад дсскссаппп ηηηί 24
- 63 013614 <210> 34 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>34 ддддЬсаддс РддаасЬдад д21 <210>35 <211>19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>35
РдаддасдсД дассасасд19 <210>36 <211>54 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР-праймер <40036 садсадаадс РЪсРадасса ссаЬддасаЬ дадддрдссс дсДсадсДсс Ъддд54 <21037 <211>34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР-праймер <400 37
- 64 013614 сЕбдСсдасх саасасбсСс сссидыдаа дсьс <2ΐο> за <211> 55 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 38 садсадаадс ЫзсЬадасса ссаЪддады: ддддсьдЬдс ДдддТ+ъьсс I. (.дГ.Ь <210> 39 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 39 дсабдЬсдас ЬсаииЬассс ддадасаддд адад <210> 40 <211> 449 <212> ПРТ <213> Ното зартепз <400> 40
С1и 1 Уа1 С1п Ъеи Уа1 5 С1и Зег С1у СЬу СЬу 10 Ьеи УаЬ СЬп Рго СЬу 15 СЬу
Зег Ъеи Агд Ъеи Зег Суз АЬа А1а Зег СЬу РЬе ТЬг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег Меи Азп Тгр Уа1 Агд С1п АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Агд Зег Зег ΗΪ3 ТЬг 11е РЬе Туг А1а Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 50
- 65 013614
Ьеи СЬп Мек Азр Зег Ьеи 85 Агд Азр СЬи Азр Ткг АЬа Мек 90 Туг Туг 95 Суз
АЬа Агд УаЬ Туг Зег Зег СЬу Тгр НЬз УаЬ Зег Азр Туг РЬе Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у СЬп С1у 11е Ьеи УаЬ Ткг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу
115 120 125
Рго Зег УаЬ Рке Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Бег Ткг Зег СЬи Зег
130 135 140
Ткг АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ
145 150 155 160
Ткг УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи Ткг Бег СЬу УаЬ НЬз Ткг Рке
165 170 175
Рго А1а УаЬ Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ
180 195 190
Ткг УаЬ Рго Зег Зег Азп РЬе СЬу Ткг СЬп ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1
195 200 205
Азр НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз ТЬг УаЬ СЬи Агд Ьуз
210 215 220
Суз Суз УаЬ СЬи Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго Рго УаЬ АЬа СЬу Рго
225 230 235 240
Зег УаЬ Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек Не Зег
245 250 255
Агд Ткг Рго СЬи УаЬ Ткг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег НЬз СЬи Азр
260 265 270
Рго 51и УаЬ СЬп Рке Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп
275 280 285
А1а Ьуз Ткг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Рке Азп Бег ТЬг РЬе Агд Уа1
290 295 300
УаЬ Зег УаЬ Ьеи ТЫ УаЬ УаЬ НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи
305 310 315 320
Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго АЬа Рго Не СЬи Ьуз
325 330 335
ты Не Зег Ьуз ТЬг Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг Ткг
340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег Агд СЬи СЬи Мек Ткг Ьуз Азп СЬп УаЬ Бег Ьеи Ткг
355 360 365
Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а УаЬ СЬи Тгр СЬи
370 375 380
- 66 013614
Зег 335 Азп С1у С1п Его С1и 390 Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг 395 Рго Рго МеЬ Ьеи 400
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Тгр С1п С1п 51 у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Н1з С1и
420 425 430
А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
435 440 445
Ьуз
<210> 41
<211> 453
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 41
51и Уа1 1 С1п Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег МеС Азп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго Е1у Ьуз Е1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Агд Зег Зег ΗίΞ ТЬг Не РЬе Туг А1а А5р Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи Е1п МеЬ Азр Зег Ьеи Агд Азр Е1и Азр ТЬг А1а МеР Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег С1у Тгр ΗΪ3 Уа1 Зег Азр Туг РЬе Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у Б1п 61у Не Ьеи Уа1 ТЬг 7а1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Зег Зег Ьуз Зег ТЬг Зег С1у 61у
130 135 140
ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1
145 150 155 160
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе
165 170 175
- 67 013614
Рго А1а Уа1 Ьеи С1п 160 Зег Зег 61у Ьеи 185 Туг Зег Ьеи Зег Зег 190 Уа1 Уа1
Ткг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у Ткг С1п Ткг Туг Не Суз Азп Уа1
195 200 205
АЗП ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп Ткг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз Уа1 61и Рго Ьуз
210 215 220
Зег Суз Азр Ьуз Ткг Н1з Ткг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго 61и Ьеи
225 230 235 240
Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр Ткг
245 250 255
ьеи Мек Не Зег Агд Ткг Рго 61и Уа1 Ткг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
260 265 270
Зег Н1з 61и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз Рке Азп Тгр Туг Уа1 Азр 61у Уа1
275 280 285
С1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз Ткг Ьуз Рго Агд 61 и 61 и 61п Туг Азп Зег
290 295 300
Ткг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи Ткг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи
305 310 315 320
Азп 61у Ьуз 61 и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
325 330 335
Рго Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз 61у 61 п Рго Агд 61и Рго
340 345 350
61п Уа1 Туг Ткг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр 61и Ьеи Ткг Ьуз Азп 61п
355 360 365
Уа1 Зег Ьеи Ткг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у Рке Туг Рго Зег Азр Не А1а
370 375 380
Уа1 С1и Тгр 61и Зег Азп О1у 61п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз Ткг Ткг
365 390 395 400
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег Рке Рке Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
405 410 415
Ткг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр 61п 61п 61у Азп Уа1 Рке Зег Суз Зег
420 425 430
Уа1 Мек ΗΪ5 61и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Η13 Туг Ткг 61п Ьуз Зег Ьеи Зег
435 440 445
Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
450
- 68 013614
<210> 42
<211> 450
<212> ПРТ
<213> Ното
<400> 42
01 и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 С1и Зег О1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у Рйе Тйг Ьеи Агд Зег Туг
20 25 30
Зег Мек Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 01у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Агд Зег Зег Н13 Тйг Не Рйе Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд Рйе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мек Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр Тйг А1а Мек Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег С1у Тгр Нгз Уа1 Зег Азр Туг Рке Азр Туг
100 105 110
Тгр С1у С1п С1у 11е Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 Рйе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег Тйг Зег С1и Зег
130 135 140
Тйг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг Рйе Рго 61и Рго Уа1
145 150 155 160
Тйг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи Тйг Зег С1у Уа1 Н13 Тйг РНе
165 170 175
Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
180 185 190
тйг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи б1у ТЬг Ьуз Тйг Туг ТНг Суз Азп Уа1
195 200 205
Азр Н13 Ьуз Рго Зег Азп Тйг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд νβΐ О1и Зег Ьуз
210 215 220
Туг С1у Рго Рго Суз Рго Зег Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи С1у С1у
225 230 235 240
Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мек Не
245 250 255
- 69 013614
Зег Агд ТЬг Рго 260 С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 265 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 270 С1п С1и
Азр Рго С1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у νβΐ С1и Уа1 Н13
275 280 285
Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 61и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр Тгр Ьеи Азп 01 у Ьуз
305 310 315 320
61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег 11е С1и
325 330 335
Ьуз ТЬг Пе Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд 51и Рго С1п Уа1 Туг
340 345 350
ТЬг Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и Меи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи
355 360 365
ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр
370 375 380
С1и Зег Азп 61у Θΐη Рго С1и АЗП Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1
385 390 395 400
Ьеи Азр Зег Азр 51у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр
405 410 415
Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1и С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег νβΐ Меи Н1з
420 425 430
61и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи
435 440 445
С1у Ьуз
450 <210> 43 <211> 499 <212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 43
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег 20 Суэ А1а А1а Зег 25 61у РЬе ТЬг Ьеи Агд 30 Зег Туг
Зег Меи Азп Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
40 45
- 70 013614
Зег Туг 11е Зег Агд Зег Зег Нгз 55 ТЬг 11е РЬе Туг А1а 60 Азр Зег Уа1
50
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азр Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а МеЕ Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Уа1 Туг Зег Зег 61у Тгр ΗΪ3 Уа1 Зег Азр Туг РЬе Азр Туг
100 105 НО
Тгр С1у С1п С1у Не Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у
115 120 125
Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1у С1у
130 135 140
ТЬг А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1
145 150 155 160
ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Н1з ТЬг РЬе
165 170 175
Рго А1а Уа1 Ьеи С1П Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1
180 185 190
ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг С1п ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1
195 200 205
Азп ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Ьеи Ьуз
210 215 220
ТЬг Рго Ьеи С1у Азр ТЬг ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Агд Суз Рго С1и Рго
225 230 235 240
Ьуз Зег Суз Азр ТЬг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго С1и Рго Ьуз
245 250 255
Зег Суз Азр ТЬг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго С1и Рго Ьуз Зег
260 265 270
Суз Азр ТЬг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго А1а Рго 61ц Ьеи Ьеи
275 280 285
С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи
290 295 300
МеЕ 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег
305 310 315 320
Ηίδ С1и Азр Рго С1и Уа1 С1п РЬе Ьуз Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и
325 330 335
Уа1 ΗΪ5 Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг
340 345 350
- 71 013614
РЬе Агд Уа1 7а1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 360 Ъеи ΗΪ3 С1п Азр 365 Тгр Ьеи Азп
355
С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго
370 375 380
Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз ТЬг Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п
385 390 395 400
Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и МеС ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1
405 410 415
Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1
420 425 430
С1и Тгр б1и Зег Зег С1у б1п Рго С1и Азп Азп Туг Азп ТЬг ТЬг Рго
435 440 445
Рго МеС Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг
450 455 4 60
Уа1 Азр Ьуэ Зег Агд Тгр С1п е1п С1у Азп Не РЬе Зег Суз Зег Уа1
465 470 475 460
МеС НЪз С1и А1а Ьеи ΗΪ5 Азп Агд РЬе ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи
485 490 495
Зег Рго С1у
<210> 44 <211> 214 <212> ПРТ
<213> ] Ното зар1еп.5
<400> 44
А1а Не С1п Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Зег А1а
20 25 30
Ьеи А1а Тгр туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ъеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи 61и Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ъеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п РЬе Азп Зег Туг Рго Ьеи
85 90 95
- 72 013614
ТЫ РЬе С1у С1у 100 С1у ТЬг Ъуз νΑΙ С1и 105 11е Ьуз Агд ТЬг Уа1 110 А1а А1а
Рго Бег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьуз Зег С1у
115 120 125
ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а
130 135 140
Ъуз Уа1 С1п Тгр Ъуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Бег С1у Азп Зег С1п
145 150 155 160
С1и Зег 7а1 ТЬг С1и С1п Азр Бег Ьуз Азр Бег ТЬг Туг Бег Ьеи Бег
165 170 175
Бег ТЬг Ъеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз Н1з Ьуз Уа1 Туг
180 195 190
А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Н1з С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег
195 200 205
РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
210
<210> 45
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното
<400> 45
РЬе РЬе 61и ТЬг Ьуз 15 <210>46 <211>9 <212> ПРТ
<213> Ното зарьепз
<400> 46
Зег Зег Зег Нтз Рго 11е РЬе ΗΪ3 Агд
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното зарЪепз
<400> 47
- 73 013614
ΗΪ3 Тгр Азп Зег Туг
<210> 48
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Ното зарьепз
<400> 48
Азп Зег Уа1 С1и Ьуз 31п Туг РЬе РЬе С1и ТЬг Ьуз
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> прт
<213> Ното зархепз
<400> 49
Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Ахд
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400 50
С1и Уа1 . Ме1: Уа1 Ьеи
1 5
<210> 51
<211> 25
<212> ПРТ
<213> Ното зарьепз
<400>51
Зег 5ег Зег ΗΪ3 Рго 11е РЬе Нхз Агд С1у С1и РЬе Зег Уа1 Суз Азр
Ю15
Зег νβΐ Зег '/а! Тгр Уа1 С1у Азр Ьуз
2025
- 74 013614
<210 52
<211> 20
<212> ПРТ
<213> Ногао зар1епз
<400 52
С1п А1а А1а Тгр .Агд РЬе 11е Агд 11е Азр ТЬг А1а Суз 7а1 Суз 7а1
1015
Ьеи Зег Агд Ьуз <21053 <211-14 <212> ПРТ χώιϋ/ Нолю зархепз <40053
Зег 5ег Н13 Рго 11е РЬе ΗΪ5 Агд 61у 61и РЬе Зег 7=11 Суз
1510
<210> 54
<211> 8
<212> ПРТ
<213> Ното зараепз
<400> 54
Зег Зег ΗΪ3 Рго 11е РЬе Н1э Агд
1 5
<210> 55
<211> 6
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400>55
С1у С1и РЬе Зег 7а1 Суз <210>56 <211>15 <212> ПРТ
- 75 013614
<210> 61
<211> 16
<212> ПРТ
- 76 013614 < 213 > Ното зэк х ег.а <400> 61
ТИг ТЬг А1а ТЬг Азр 11е Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 МеЬ Уа1 Ьеи С1у Суз
1 <210> <211> <212> <213> 62 15 ПРТ Ното 5 зархепз 10 15
<400> 62
Не Ьуз С1у Ьуз С1и Уа1 Меи Уа1 Ьеи С1у С1и Уа1 Азп Не Азп
1 <210> 63 5 10 15
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 63
Уа1 МеН Уа1 Ьеи С1у 61и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег Уа1 РЬе Ьуз Суз
1 <210> 64 5 10 15
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 64
С1и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег Уа1 РЬе Ьуз С1п Туг РЬе РЬе С1и Суз
1 <210> 65 5 10 15
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зархепз
<400> 65
Азп Зег Уа1 РЬе Ьуз С1п Туг РЬе РЬе С1и ТЬг Ьуз А1а Агд Азр Суз
1 5 10 15
<210> 66
<211> 16
<212> ПРТ
- 77 013614 <213> Ното зараепз <400>66
С1п Туг РЬе РЬе С1и ТЬг Ьуз А1а Агд Азр Рго Азп 1510 <210>67
Рго Уа1 Азр Суз <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното зар!епз <400>67
ТЬг Ьуз А1а Агд Азр Рго Азп Рго Уа1 Азр Зег С1у А1а Агд Азр Суз
1015 <210> 68 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400>68
Ргл йчп Ргп Т,7я 1 Д<=1г> ΓΖΊ ν Д1л Ατγύ Дяп Т1 <=> Дяп Яаг Т.УЯ Н1Я ·** ···*·“ - — чг · — — — — — — — Л — Σ’ ··—ΊΓ — — - -ΙΓ — ' —Е— ---15 1015 <210>69 <211>15 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400>69
Зег С1у А1а Агд Азр Не Азр Зег Ьуз Н13 Тгр Азп Зег Туг Суз 15 1015 <210>70 <211> 16 <212> ПРТ <213> Ното заргепз <400>70
Не Азр Зег Ьуз НЬз Тгр Азп Зег Туг А1а ТЬг ТЬг ТЬг Н13 ТЬг Суз 15 1015 <210>71 <211> 16 <212> ПРТ
- 78 013614
- 79 013614
<400> 76
РЬе Не : Агд 11е Азр ТНг А1а А1а УаЬ А1а УаЬ Ьеи Зег Агд Ьуз Суз
1 5 10 15
<210> 77
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬепз
<400>77
ТЬг АЬа АЬа УаЬ АЬа УаЬ Ьеи Зег Агд Ьуз А1а УаЬ Агд Агд АЬа Суз
1015 <210>73 <211>15 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400>78
Суз АЬа А1а УаЬ АЬа УаЬ Ьеи Зег Агд Ьуз А1а УаЬ Агд Агд АЬа
1015 <210>79 <211>125 <212> ПРТ <213> Ното зарЬеп <400> 79
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег СЬу А1а СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго СЬу 15 СЬи
1 5 10
Зег Ьеи Ьуз 1Ье Зег Суз Ьуз СЬу Зег СЬу Туг Авп РЬе ТЬг ТЬг Туг
20 25 30
Тгр Пе СЬу Тгр УаЬ Агд СЬп Мек Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр МеЕ
35 40 45
СЬу 11е Пе Туг Рго СЬу Азр Зег Азр ТЬг Ьуз Туг Зег Рго Зег РЬе
50 55 60
СЬп СЬу СЬп УаЬ ТЬг 1Ье Зег АЬа Аэр Ьуз Зег 1Ье Зег ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз АЬа Зег Азр ТЬг АЬа Мек Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд Азп Туг Туг СЬу Зег СЬу ТЬг Туг Туг Туг Туг Туг СЬу МеЕ
100 Ь05 110
- 80 013614
Азп
<210> 80
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ьото заргеп
<400> 80
Азр 1 Не 61п Мек ТЬг 5 61п Бег Рго Зег Зег 10 Уа1 Зег А1а Бег Уа1 15 61у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег 61п 61у 11е Зег Не Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п Н1з Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Бег Бег Ьеи 61п Зег 61 у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 61у
50 55 60
Бег С1у Бег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Бег Ьеи 61п Рго
65 70 75 80
61и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п 61 η А1а Азп Зег Рке Рго Тгр
85 90 95
ТЫ РЬе 61у С1п 61у ТЬг Ьуз Уа1 61и Не Ьуз
100 105
<210> 81
<211> 127
<212> ПРТ
<213> кото
<400> 81
61и Уа1 1 61п Ьеи Уа1 5 61 и Зег 61у 61у 61у Ьеи 10 Уа1 61п Рго 61у 15 Агд
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз ТЫ А1а Бег 61у Рке Ткг Рке 61и Азр Туг
20 25 30
А1а Мек ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго 61у Ьуз 61 у Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Бег С1у 11е Зег Тгр Азп Агд С1у Не Не 61 у Туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд Рке Ткг Уа1 Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Бег Ьеи Туг
70 75 80
- 81 013614
Ьеи С1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1и С1у Туг Туг С1у Зег С1у Агд Рго С1у Туг РЬе Туг Туг
100 105 110
Уа1 Мес Азр Уа1 Тгр 61у С1п 61у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 32
<211> 108
<212> ПРТ
<213> Ьото зарбеп
<400> 82
61и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
61и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег С1у
20 25 30
РЬе Ьеи А1а Тгр РЬе С1п 61п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг А1а 11е Рго Азр Агд РЬе Зег
г- 1“ л
аи за ои
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п 51п Туг С1у Зег Зег Рго
85 90 95
Туг ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 83
<211> 127
<212> : ПРТ
<213> ' Ьото зар!еп
<400> 83
<31и 7а1 С1л Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у Агд
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61 у РЬе Не РЬе Азр Азр Туг
20 25 30
А1а МеЬ ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 61у Ьуз С1у Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
- 82 013614
Зег 61у 11е Зег Тгр Азп Агд С1у 11е 11е 61у Туг А1а 61у Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд Рке Ткг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п ме+ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр Ткг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
Уа1 Ьуз 31и 61 у Туг Туг С1у Зег 61у Агд Рго 61у Туг Рке Туг Туг
100 105 110
Уа1 меи Азр Уа1 Тгр 61у С1п 61у Ткг Ткг Уа1 Ткг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 84
<211> 108
<212> ПРТ
<213> кото зар!еп
<4С0> 84
61и Не Уа1 Ьеи Ткг 61п Зег Рго 61у Ткг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
1 5 10 15
С1и Агд А1а Ткг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго 61у 61п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
11е Туг Уа1 А1а Зег Зег Агд А1а Ткг 61у 11е Рго Азр Агд Рке Зег
50 55 60
01 у Зег С1у Зег 61у Ткг Азр Рке Ткг Ьеи Ткг 11е Зег Агд Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго С1и Азр Рке А1а Уа1 Туг Туг Суз 61п 61п Туг 61у Зег Зег Рго
85 90 95
Туг Ткг Рке С1у С1п С1у Ткг Ьуз Ьеи 61и 11е Ьуз
100 105
<210> 85
<211> 121
<212> : ПРТ
<21з> : кото зарйеп
<400> 85
С1и Уа1 61п Ьеи Уа1 С1и Зег 61у 61у 61 у Ьеи Уа1 С1п Рго 61 у Агд
- 83 013614
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег С1у 25 РЬе 11е РЬе Азр 30 Азр Туг
А1а МеС Н13 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз 61 у Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Зег С1у Не ТЬг Тгр Азп Зег С1у Не Ьеи С1у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61 у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1и <31и С1у Зег 61 у Агд Туг Туг Азп РЬе Азр Туг Тгр 61 у
100 105 110
С1п 61у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 86
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ьото
<400> 86
С1и 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п 5 Зег Рго 61у ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 61 у
61и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго 61у 61п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
Не Туг 61у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг 61у Не Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
61у Зег 61у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго 61и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз (31п 61п Туг 61у Зег Зег Туг
85 90 95
ТЬг РЬе 61у 61п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 87
<211> 124
<212> ПРТ
- 84 013614
<213> кото зарЬеп
<400> 87
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу УаЬ УаЬ Агд Рго СЬу СЬу
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа А1а Зег СЬу Рке ТЬг Рке Азр Азр Туг
20 25 30
СЬу Мек Азп Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
Зег Азр Не Азп Тгр Азп СЬу СЬу Зег Ткг СЬу Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз СЬу Агд Рке ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп Мек Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Аэр Ткг АЬа Ьеи Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд СЬи СЬп Тгр Ьеи Азр Рго Туг Туг Туг Туг Туг СЬу Мек Азр
100 105 110
УаЬ Тгр СЬу СЬп 61у Ткг Ткг УаЬ Ткг УаЬ Зег Зег
115 120
<210> : 88
<211> 107
<212> 1 ПРТ
<213> 1 кото зар1еп
<400> 1 88
Азр ЬЬе СЬп Мек Ткг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ Ткг Не Ткг Суз Агд АЬа Зег СЬп СЬу 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬи Ьуз АЬа Рго Ьуз Зег Ьеи Не
35 40 45
Туг АЬа АЬа Зег Зег Ьеи СЬп Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд Рке Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег С1у Ткг Азр Рке Ткг Ьеи Ткг 11е Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр Рке АЬа Ткг Туг Туг Суз СЬп СЬп Туг Азп Зег Туг Рго Тгр
85 90 95
Ткг Рке СЬу СЬп СЬу Ткг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз
- 85 013614
100 105
<210> 89
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ьото
<400> 89
61и 1 Не Уа1 Ъеи ТЬг 5 61 п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Зег Ъеи Зег Рго 15 61у
61и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п 61у Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п С1п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг 61у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег 61у
50 55 60
Зег 61у Рго 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 61и Рго
65 70 75 80
61и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз 61 п 61п Агд Зег Азп Тгр Н13 Агд
85 90 95
ТЬг РЬе 61у Θ1Π 61у ТЬг Ьуз νβΐ 61и 11е Ьуз
100 105
<210> 90
<211> 108
<212> 1 ПРТ
<213> 1 Ьото зархеп
<400> 90
61 и 11е Уа1 Ъеи ТЬг 61п Зег Рго 61у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
1 5 10 15
61 и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61 п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго 61у 61 п А1а Рго Агд Ъеи Ьеи
35 40 45
11е Туг 61у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг 61у Не Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
61у Зег 61у Зег 61у ТЬг 61у РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 61и
65 70 75 80
Рго 61и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п 61п Туг Азп Зег Туг Рго
- 86 013614
90 95
Тгр ТИг РЬе 61у 61п О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 91
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Ьото
<400> 91
0111 1 Не Уа1 Ьеи ТЬг 5 О1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи 10 Зег Ьеи Зег Рго 15 01 у
0111 Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рю 01 у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Бег Азп Агд А1а ТЬг 61у Не Рго А1а Агд РЬе Зег 61 у
50 55 60
5ег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 01 и Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Тгр
85 90 95
ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105
<210> 92
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Ьото
<400> 92
ТЬг Туг Тгр Не 61у
1
<210> 93
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ьото
<400> 93
- 87 013614
Не Ь1е 1 Туг Рго 61у Авр Зег Азр ТЫ Ьуз Туг Зег Рго Зег РЬе С1п 5 Ю 15
С1у
<210> 94
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Ьото зарЬеп
<4 00> 94
Азп Туг Туг С1у Зег С1у ТЬг Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеЕ Азп Уа1
1 5 10 1 =
<210> 95
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ьото зарЬеп
<400> 95
Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Не Тгр Ьеи А1а ι 5 10
<210> 96
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ното зарьеп
<400> 96
А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ното зарЬеп
<400> 97
61п С1п А1а Азп Зег РЬе Рго Тгр ТЬг
1 5
<210> 98
<211> 5
<212> ПРТ
- 88 013614 <213> кото заргеп <400>98
Азр Туг А1а Мек Н1з 15 <210>99 <211>17 <212> ПРТ <213> Ьото зараеп
<400> 99
С1у Не : Бег Тгр Азп Агд С1у 11е Не С1у Туг А1а Азр Бег Уа1 Ьуз
1 С1у <210> 100 5 10 15
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Ьото зарЬеп
<400> 100
С1у Туг Туг 61у Зег С1у Агд Рго С1 у Туг РЬе Туг Туг Уа1 Мек Азр
1 5 10 15
Уа1
<210> 101
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Ьото зарЬеп
<400>101
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег С1у Рйе Ьеи А1а 1510 <210> 102 <211>7 <212> ПРТ <213> кото зарЬеп <400>102
С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг <210>103 <211>9 <212> ПРТ
- 89 013614
<213> кото зархеп
<400> 103
С1п 61п Туг б1у Зег Зег Рго Туг Ткг
1 5
<210> 104
<211> 5
<212> ПРТ
<213> кото зар1еп
<400>104
Азр Туг А1а Мек Н13 <210>105 <211>17 <212> ПРТ
<213> кото зархеп
<400> 105
61у 11е Зег Тгр Азп Агд С1у 11е Не С1у Туг А1а 31у Зег Уа1 Ьуз
1 5 10 15
С1у
<210> 106
<211> 17
<212> ПРТ
<213> кото заргеп
<400> 106
С1у Туг Туг С1у 8ег С1у Агд Рго С1у Туг Рке Туг Туг Уа1 Мек Азр
1 5 10 15
Уа1
<210> 107
<211> 12
<212> ПРТ
<213> кото зархеп
<400> 107
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи А1а
10 <210> 108
- 90 013614 <211>7 <212> ПРТ <213> Ното зарЬеп <400>108
Уа1 А1а Зег Зег Агд А1а ТНг <210>109 <211>9 <212> ПРТ <213> Ното зар1еп <400>109
61п <31п Туг С1у Зег Зег Рго Туг ТЬг <210> 110 <211>5 <212> ПРТ <213> Ното зархеп <400>110
Азр Туг А1а Мек Нхз <210> 111 <211>17 <212> ПРТ <213> Ното зархеп
<400> 111
С1у Не 1 ТНг Тгр Азп Зег 31у 11е Ьеи С1у Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 5 10 15
61у
<210> 112
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ното зархеп
<400>112
С1и С1у Зег 61у Агд Туг Туг Азп РЬе Азр Туг
1510
- 91 013614
<210 113
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Ьото зархеп
<400>113
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Ьеи А1а 1 510 <210>114 <211>7 <212> ПРТ <213> Ьото заргеп <400>114
СГу А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг <210>115 <211> 8 <212> ПРТ <213> Ьото зархеп <400>115
С1п С1п Туг 61у Зег Зег Туг ТЬг 15 <210 116 <211>5 <212> ПРТ <213> Ьото зар!еп <400>116
Азр Туг 01у Мек Азп <210>117 <211>17 <212> ПРТ <213> Ьото зархеп <400>117
Азр 11е Азп Тгр Азп 01у С1у Зег ТЬг
61у
О1у Туг А1а Азр Зег νβΐ Ьуз
15
- 92 013614
<210> 118
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Пото зарЬеп
<400>118
СЬи СЬп Тгр Ьеи Азр Рго Туг Туг Туг Туг Туг СЬу МеЕ Азр УаЬ 15 1015 <210>119 <211> 11 <212> ПРТ <213> Ното зарЬеп <4Ό0>119
Агд АЬа Зег СЬп СЬу 1Ье Зег Зег Тгр Ьеи АЬа 1510 <210> 120 <211>7 <212> ПРТ <213> Ьото зарЬеп <400> 120
А1а АЬа Зег Зег Ьеи СЬп Зег
Ь <210> 121 5
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ьото зарЬеп
<400>121
СЬп СЬп Туг Азп Зег Туг Рго Тгр ТНг
1 <210> 122 5
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Ьото зар1еп
<400>122
Агд АЬа Зег СЬп СЬу УаЬ Зег Зег Туг Ьеи АЬа
15Ю
- 93 013614
<210> 123
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ьото заргеп
<400> 123
Азр А1а ; Зег Азп Агд А1а
1 <210> 124 5
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ьото заргеп
<400> 124
С1п (31п Агд Зег Азп Тгр
1 <210> 125 5
<211> 12
<212> ПРТ
<213> Ьото заргеп
<400> 125
Агд А1а . Зег С1п Зег Уа1
1 <210> 126 5
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Ьото заргеп
<400> 126
С1у А1а ϊ Зег Зег Агд А1а
1 <210> 127 5
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Ьото зар1еп
<400> 127
С1п С1п Туг Азп Зег Туг
1 5
ТЬг
Н1з Агд ТЬг
ТЬг
Бег Зег Зег Туг Ьеи А1а
Рго Тгр ТЬг
- 94 013614
<210> 128
<211> 11
<212> ПРТ
<213> кото
<400> 128
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг Ьеи А1а 1510 <210>129 <211>7 <212> ПРТ <213> кото зарЬеп <400>129
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг <210>130 <211>9 <212> ПРТ <213> кото заргеп <400>130
61п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Тгр Ткг <210>131 <211> 108 <212> ПРТ <213> кото зараеп
<400> 131
61и 11е Уа1 Ьеи Ткг С1п Зег Рго 61у Ткг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 61у
1 5 10 15
<31и Агд А1а Ткг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг 61п <31п Ьуз Рго 61у 61п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
11е Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а Ткг С1у 11е Рго Азр Агд Рке Зег
50 55 60
С1у Зег 61у Зег 61у Ткг Азр РЬе Ткг Ьеи Ткг 11е Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
- 95 013614
Рго С1и Азр Рке А1а νβΐ Туг Туг Суз С1п С1п Туг
85 90
Туг Ткг РЬе С1у Е1п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
у
105
100
Зег
Зег
Рго <210>
132 <211>
<212>
ПРТ <213>
кото зархеп <400>
132
Агд А1а Зег <210>
133 <211>
<212>
ПРТ <213>
кото <400>
133
С1у А1а Зег <210>
134 <211>
<212>
ПРТ <213>
кото <400>
134
С1п С1п Туг <210>
135 <211>
120 <212>
ПРТ <213>
кото
01п 61у зарЬеп
Зег Агд заргеп
С1у Зег зархеп
Уа1
А1а
Зег
Зег
ТЬг
Рго
Зег
Туг
Туг
Ткг
Ьеи
А1а
<400> 135
Зег Зег Зег ΗΪ3 Рго 11е Рке НЬз Агд С1у С1и Рке Зег Уа1 Суз Азр
1 5 10 15
Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр УаХ С1у Азр Ьуз Ткг Ткг А1а Ткг Азр 11е Ьуз
20 25 30
С1у Ьуз С1и Уа1 Мек Уа1 Ьеи С1у С1и Уа1 Азп 11е Азп Азп Зег Уа1
35 40 45
- 96 013614
Рке Ьуз 50 61п Туг Рке РЬе <31и 55 Ткг Ьуз Суз Агд Азр 60 Рго Азп Рго Уа1
Азр Зег 61у Суз Агд 61у Не Азр Зег Ьуз Н13 Тгр Азп Зег Туг Суз
65 70 75 80
Ткг Ткг Ткг Н13 Ткг РЬе Уа1 Ьуз А1а Ьеи Ткг Мек Азр С1у Ьуз 61п
85 90 95
А1а А1а Тгр Агд Рке Не Агд Не Азр Ткг А1а Суз Уа1 Суз Уа1 Ьеи
100 105 НО
Зег Агд Ьуз А1а Уа1 Агд Агд А1а
115 120
<210> 136
<211> 120
<212> ПРТ
<213> Домовая мышь
<400> 136
Зег Зег ТЬг Нхз 1 Рго Уа1 5 РЬе Н13 Мек 61у 10 С1и РЬе Зег Уа1 Суз 15 Азр
Зег Уа1 Зег Уа1 Тгр Уа1 61у Азр Ьуз Ткг ТЬг А1а ТЬг Азр Не Ьуз
20 25 30
61у Ьуз 61и Уа1 Ткг Уа1 Ьеи А1а 61и Уа1 Азп Не Азп Азп Зег Уа1
35 40 45
РЬе Агд 61п Туг Рке Рке 61и Ткг Ьуз Суз Агд А1а Зег Азп Рго Уа1
50 55 60
61и Зег 61у Суз Агд 61 у Не Азр Зег Ьуз Н13 Тгр Азп Зег Туг Суз
65 70 75 80
ТЬг Ткг Ткг Нхз Ткг Рке Уа1 Ьуз А1а Ьеи ТЬг ТЬг Азр 61и Ьуз С1п
85 90 95
А1а А1а Тгр Агд Рке Не Агд Не Азр Ткг А1а Суз Уа1 Суз Уа1 Ьеи
100 105 НО
Зег
120
115
<210> 137
<211> 126
<212> ПРТ
<213> Ьото зархеп
<400> 137
- 97 013614
Н1з 1 Зег Азр Рго А1а 5 Агд Агд Н13 Зег Азр Рго А1а Агд Агд С1у С1и
10 15
Ьеи Зег Уа1 Суз Азр Зег Не Зег С1и Тгр Уа1 ТЬг А1а А1а Азр Ьуз
20 25 30
Ьуз ТЬг А1а Уа1 Азр МеС Зег С1У С1у ТЬг 7а1 ТЬг Уа1 Ьеи С1и Ьуз
35 40 45
Уа1 Рго Уа1 Зег Ьуз С1у С1п Ьеи Ьуз С1п Туг РЬе Туг 61и ТЬг Ьуз
50 55 60
Суз Азп Рго МеС б1у Туг ТЫ Ьуз С1и С1у Суз Агд б1у Не Азр Ьуз
65 70 75 80
Агд Нхз Тгр Азп Зег С1п Суз Агд ТЬг ТЬг С1п Зег Туг Уа1 Агд А1а
85 90 95
Ьеи ТЬг Мес Азр Зег Ьуз Ьуз Агд Не С1у Тгр Агд РЬе Не Агд Не
100 105 110
Азр ТЫ Зег Суз Уа1 Суз ТЫ Ьеи ТЬг Не Ьуз Агд С1у Агд
115 120 125
<210> 138
<211> 119
<212> ПРТ
<213> Ьото
<400> 138
Туг 1 А1а С1и ΗΪ3 Ьуз 5 Зег ΗΪ3 Агд С1у С1и 10 Туг Зег Уа1 Суз Азр 15 Зег
С1и Зег Ьеи Тгр 20 Уа1 ТЬг Азр Ьуз Зег 25 Зег А1а Не Азр Не 30 Агд С1у
ΗΪ3 С1п Уа1 35 ТЬг Уа1 Ьеи С1у С1и 40 Не Ьуз ТЬг С1у Азп 45 Зег Рго Уа1
Ьуз С1п 50 Туг РЬе Туг С1и ТЬг 55 Агд Суз Ьуз С1и А1а 60 Агд Рго Уа1 Ьуз
Азп 65 С1у Суз Агд С1у Не 70 Азр Азр Ьуз ΗΪ3 Тгр 75 Азп Зег 61п Суз Ьуз 80
ТЬг Зег С1п ТЬг Туг 85 Уа1 Агд А1а Ьеи ТЬг 90 Зег С1и Азп Азп Ьуз 95 Ьеи
Уа1 С1у Тгр Агд 100 Тгр Не Агд Не Азр 105 ТЫ Зег Суз Уа1 Суз НО А1а Ьеи
Зег Агд Ьуз 115 Не С1у Агд ТЫ
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (98)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное антитело, которое специфично связывается с фактором роста нервов ^СЕ), содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 10, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  2. 2. Антитело по п.1, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последова- 98 013614 тельность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 12, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  3. 3. Антитело по п.1, где легкая цепь содержит первую область, определяющую комплементарность (СОВ1), легкой цепи антитела человека, которая имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 24, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  4. 4. Антитело по п.1, где легкая цепь содержит третью область, определяющую комплементарность (СОВ3), легкой цепи антитела человека, которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 16, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  5. 5. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, включающую в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 10, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  6. 6. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вторую область, определяющую комплементарность (СОВ2), тяжелой цепи антитела человека, которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 18, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  7. 7. Антитело по п.1, которое содержит:
    а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 10, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 12, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
    б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ3 8ЕЦ ПЭ NΟ: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ3 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 16, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
    в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ2 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 18, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ3 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 16, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент; либо
    г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ1 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 22, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ3 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 16, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент,
    д) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ3 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ1 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 24, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент,
    е) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ3 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность С1ЭВ2 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 20, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  8. 8. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 10, а легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 12.
  9. 9. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область, причем вариабельная область содержит аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 10, или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
  10. 10. Антитело по п.9, где тяжелая цепь содержит любую аминокислотную последовательность СЭВ3 (8ЕЦ ΙΌ NΟ: 14), СЭВ2 (8ЕЦ ΙΌ NΟ: 18) или СЭВ1 (8ЕЦ ΙΌ NΟ: 22) или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
  11. 11. Антитело по п.1, где легкая цепь содержит вариабельную область и константную область, причем вариабельная область содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ NΟ: 12, или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
  12. 12. Антитело по п.11, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность СЭВ3 (8ЕЦ ΙΌ NΟ: 16), или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
    - 99 013614
  13. 13. Изолированное антитело, которое связывается с фактором роста нервов (ЫСЕ), содержащее:
    а) каркасные участки тяжелой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую СЭК1 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 22), (ΌΗ2 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 18) и СОК3 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 14) последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 10; и
    б) каркасные участки легкой цепи, вариабельную область легкой цепи, содержащую СОК1 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 24), СОК2 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 20) и СОК3 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 16) последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 12.
  14. 14. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое диссоциирует от человеческого полипептида ЫСЕ с Кс примерно 1х10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ЫСЕ в стандартном анализе ίη νίΐΓο с Ιί.’50 примерно 1х 10-8 М или менее.
  15. 15. Антитело по п.14, которое диссоциирует от человеческого полипептида ЫСЕ с К.) примерно 1х10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ЫСЕ в стандартном анализе ίη νίΐΓο с ГС50 примерно 1х 10-9 М или менее.
  16. 16. Антитело по п.15, которое диссоциирует от человеческого полипептида ЫСЕ с К.) примерно 1х10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого ЫСЕ в стандартном анализе ίη νίΐΓο с ГС50 примерно 0,2х 10-9 М или менее.
  17. 17. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
  18. 18. Антитело по п.17, которое представляет собой одноцепочечное Еν-антитело.
  19. 19. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое представляет собой ЕаЬ-антитело.
  20. 20. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое представляет собой ЕаЬ'-антитело.
  21. 21. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое представляет собой (ЕаЬ')2-антитело.
  22. 22. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, представляющее собой полностью человеческое анти- тело.
  23. 23. Антитело по любому из пп.1, 2, 8, 13 или 77-81, ингибирующее передачу сигнала ЫСЕ.
  24. 24. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией ЫСЕ или повышенной чувствительностью к ЫСЕ, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитела по п.23.
  25. 25. Способ обнаружения ЫСЕ в биологическом образце ίη νίΐτο, при котором:
    а) образец приводят в контакт с антителом по пп.1, 2, 8 или 13 в условиях, обеспечивающих возможность связывания антитела с ЫСЕ; и
    б) измеряют уровень связанного антитела в образце.
  26. 26. Изолированное антитело, которое специфично связывается с ЫСЕ, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой аминокислотной последовательности из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 79, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 81, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 83, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 85 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 87, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  27. 27. Антитело по п.26, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 91% идентична любой аминокислотной последовательности из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 81, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 83, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 85, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 87 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 79, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  28. 28. Изолированное антитело, которое специфично связывается с ЫСЕ, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична любой аминокислотной последовательности из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 80, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 82, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 84, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 86, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 88, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 89, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 90, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 91 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 131, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  29. 29. Изолированное антитело по п.28, где легкая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 86% идентична любой аминокислотной последовательности из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 80, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 88, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 89, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 90, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 91, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 82, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 84, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 86 или δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 131, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  30. 30. Антитело по п.28, где легкая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая:
    а) по меньшей мере на 89 или на 94% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 80 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
    б) по меньшей мере на 91 или на 94% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:
    88 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
    в) по меньшей мере на 86 или на 87% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:
    89 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
    г) по меньшей мере на 87, 91 или 94% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ:
    90 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
    д) по меньшей мере на 86, 94, 96 или 99% идентична аминокислотной последовательности δΕΟ ΙΌ
    - 100 013614
    N0: 91 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
    е) по меньшей мере на 91, 95 или 96% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 82 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному иммуноглобулиновому фрагменту;
    ж) по меньшей мере на 86, 94, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 84 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
    з) по меньшей мере на 86, 94, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 86 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту; или
    и) по меньшей мере на 86, 89, 91 или 96% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 131 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту.
  31. 31. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N0?, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности СГОК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 14, СЭК2 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 18, СЭК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 22, СЭК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 92, СГОК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 93, СЭК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 94, СЭК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 98, СГОК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 99, СЭК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 100, СЭК1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 104, СЭК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 105, СЭК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 106, СЭК1 тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 110, СЭК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 111, СЭК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 112, СГОК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 116, СЭК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 117 или СЭК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 118, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  32. 32. Изолированное антитело по п.31, где тяжелая цепь содержит СГОК2 тяжелой цепи антитела человека с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 81% идентична любой аминокислотной последовательности из 8ЕЦ ΙΌ N0: 99, 8ЕЦ ΙΌ N0: 106, 8ЕЦ ΙΌ N0: 117, 8ЕЦ ΙΌ N0: 111, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  33. 33. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N0?, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности СГОК3 легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 16, СГОК2 легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 20, СЭК1 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 24, СЭК1 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 95, СЭК2 легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 96, СЭК3 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 97, СЭК1 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 101, СЭК2 легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 102, СГОК3 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 103, СГОК1 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 107, СГОК2 легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0: 108, СГОК3 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 109, СГОК1 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 113, СГОК2 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 114, СГОК3 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 115 или любой из области СЭК легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 119 - 8ЕЦ ГО N0: 134, либо его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  34. 34. Изолированное антитело по п.33, содержащее СГОК1 легкой цепи человека, где СГОК1 представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 86% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 101, 8ЕЦ ΙΌ N0: 95, 8ЕЦ ΙΌ N0: 119, 8ЕЦ ΙΌ N0: 122, 8ЕЦ ΙΌ N0: 125, 8ЕЦ ГО N0: 107 или 8ЕЦ ГО N0: 113, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  35. 35. Изолированное антитело по п.33, содержащее СИКЗ легкой цепи человека, где СГОК3 представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 86% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 103, 8ЕЦ ΙΌ N0: 97, 8ЕЦ ΙΌ N0: 121, 8ЕЦ ΙΌ N0: 127, 8ЕЦ ΙΌ N0: 130, 8Е0 ΙΌ N0: 109, 8ЕЦ ΙΌ N0: 115 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 134, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  36. 36. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N0?, содержащее СИКЗ, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 14, №С) ГО N0: 16, 8Ер ГО N0: 94, №С) ГО N0: 97, №С) ГО N0: 100, №С) ГО N0: 103, №С) ГО N0: 106, №С) ГО N0: 109, №С) ГО N0: 112, №С) ГО N0: 115, №С) ГО N0: 118, №С) ГО N0: 121, №С) ГО N0: 124, №С) ГО N0: 127, 8ЕЦ ГО N0: 130, 8ЕЦ ГО N0: 134, или вариант указанной последовательности, где указанный вариант содержит не более одной аминокислотной замены, инсерции или делеции.
  37. 37. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N0? и содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности вариабельной области тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 10, последовательности вариабельной области легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 12, последовательности СИКЗ тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 14, последовательности СГОК3 легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 16, последовательности СГОК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 18, последовательности СГОК2 легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 20, последовательности СГОК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ГО N0: 22 и последовательности СГОК1 легкой цепи 8ЕЦ ГО N0: 24, или их вариантов, где указанные варианты содержат не более одной аминокислотной замены, инсерции или делеции.
  38. 38. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
  39. 39. Антитело по п.38, которое представляет собой одноцепочечное Εν-антитело.
  40. 40. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой ?аЬ-антитело.
    - 101 013614
  41. 41. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой Рай'-антитело.
  42. 42. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой (Рай')2-антитело.
  43. 43. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой полностью человеческое антитело.
  44. 44. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, ингибирующее передачу сигнала NСΡ.
  45. 45. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией NСΡ или повышенной чувствительностью к NСΡ, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитела по пп.26, 28, 31, 33, 36, 37 или 44.
  46. 46. Способ обнаружения NСΡ в биологическом образце ίη νίίτο, при котором:
    а) образец приводят в контакт с антителом по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37 в условиях, обеспечивающих возможность связывания антитела с NСΡ; и
    б) измеряют уровень связанного антитела в образце.
  47. 47. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело по пп.26, 28, 31,33, 36 или 37.
  48. 48. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.47.
  49. 49. Изолированная клеточная линия, которая продуцирует антитело по любому из пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37.
  50. 50. Агент, специфично связывающий NСΡ, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, вариабельной области легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, области СЭК3 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 14, области 0ΌΚ3 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, области СЭК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 18, области СЭК2 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 20, области СЭК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 22 и любой из вариабельных областей или СОК тяжелой и легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 79-130, причем этот специфичный связывающий агент может связываться с NСΡ.
  51. 51. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией NСΡ или повышенной чувствительностью к NСΡ, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество связывающего агента по п.50.
  52. 52. Связывающий агент по п.50, который представляет собой белок.
  53. 53. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует связывающий агент по п.50.
  54. 54. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.53.
  55. 55. Изолированная клеточная линия, которая продуцирует связывающий агент по п.54.
  56. 56. Способ обнаружения NСΡ в биологическом образце ίη νίίτο, при котором:
    а) образец приводят в контакт со связывающим агентом по п.50 в условиях, обеспечивающих возможность его связывания с NСΡ; и
    б) измеряют уровень связанного агента в образце.
  57. 57. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует любую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, вариабельной области легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, СОК 3 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 14, СЭК легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, СЭК2 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 18, СЭК2 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 20, СЭК1 тяжелой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 22, СЭК1 легкой цепи 8ЕЦ ΙΌ N0: 24, 8ЕЦ ΙΌ N0: 40, 8ЕЦ ΙΌ N0: 41, 81 А) ΙΌ N0: 42, 81 А) ΙΌ N0: 43, 81 А) ΙΌ N0: 44 или любую из 81 А) ΙΌ N0: 79 - 81 А) ΙΌ N0: 134.
  58. 58. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, которые специфично связываются с NСΡ, где указанное антитело или фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя:
    а) область 0ΌΚ1, содержащую аминокислотную последовательность формулы
    б) область СПК2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
    Ь1Ь2Ь3Ь4Ь5Ь6Ь7Ь8Ь9Ь10Ь11Ь12Ь13Ь14Ь15Ь16Ь17
    в) область СЮНЗ, содержащую аминокислотную последовательность формулы где а1 представляет собой 8ег, Акр или Тйг;
    а2 представляет собой Туг;
    а3 представляет собой А1а, 8ег, Тгр или С1у; а4 представляет собой Ме! или Не;
    а5 представляет собой Н1к, С1у или Акп; й1 представляет собой Туг, С1у, Не или Акр; й2 представляет собой Не;
    й3 представляет собой 8ег, Тйг, Туг или Акп; й4 представляет собой Тгр, Агд или Рго; й5 представляет собой 8ег, Акп или С1у;
    й6 представляет собой 8ег, Агд, Акр или С1у;
    - 102 013614
    Ь7 представляет собой 8ег, Н1к или С1у;
    Ь8 представляет собой 8ег, Не, Акр или ТЬг;
    Ь9 представляет собой Ьеи, Не или ТЬг;
    Ь10 представляет собой С1у, Ьук или РЬе;
    Ь11 представляет собой Туг;
    Ь12 представляет собой А1а или 8ег;
    Ь13 представляет собой Акр, С1у или Рго;
    Ь14 представляет собой 8ег;
    Ь15 представляет собой Уа1 или РЬе;
    Ь16 представляет собой Ьук или С1п;
    Ь17 представляет собой С1у;
    с1 отсутствует или представляет собой С1у;
    с2 отсутствует или представляет собой Туг;
    с3 и с4 независимо отсутствуют, представляют собой Туг, Акп, Уа1 или С1и;
    с5 отсутствует или представляет собой 8ег, С1у или Тгр;
    с6 представляет собой 8ег, С1у, С1и или Ьеи;
    с7 представляет собой С1у, Агд или Акр;
    с8 представляет собой Тгр, Рго, 8ег или ТЬг;
    с9 представляет собой Н1к, С1у или Туг;
    с10 представляет собой Уа1, Туг или Агд;
    сп-с13 независимо представляют собой 8ег, Туг, РЬе, Акр или Акп;
    с14 представляет собой РЬе, Уа1 или С1у;
    с15 представляет собой Ме! или Акр;
    с16 отсутствует или представляет собой Акр или Акп и с17 представляет собой Туг или Уа1, и причем указанное антитело или фрагмент диссоциируют от человеческого полипептида ΝΟΕ с Кс примерно 1х10-9 или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого ΝΟΕ в стандартном анализе шуйго с ΙΟ50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
  59. 59. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, которые специфично связываются с ΝΟΕ, где указанное антитело или фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя:
    а) область СИК1, содержащую аминокислотную последовательность формулы а1 а2а3а4а5а6а7а8а9а1 °а11 а12
    б) область СИК2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
    Ь1Ь2Ь3Ь4Ь5Ь6Ь7
    в) область СИКЗ, содержащую аминокислотную последовательность формулы с1с2с3с4с5с6с7сес9с10с11с12с13с14с15с16с17 где а1, а3, а4 и а7 представляют собой Агд, 8ег, С1п и 8ег соответственно;
    а2 представляет собой А1а;
    а5 представляет собой С1у или 8ег;
    а8 представляет собой 8ег или Не;
    а9 отсутствует, представляет собой 8ег или С1у;
    а10 представляет собой А1а, Туг, Тгр или РЬе;
    Ь1 представляет собой Акр, С1у, А1а или Уа1;
    Ь2 и Ь3 представляют собой А1а и 8ег соответственно;
    Ь4 представляет собой 8ег или Акп;
    Ь5 представляет собой Ьеи или Агд;
    Ь6 представляет собой С1и, А1а или С1п;
    Ь7 представляет собой 8ег или ТЬг;
    с1 и с2 представляют собой С1п;
    с3 представляет собой РЬе, Туг, Агд или А1а;
    с4 представляет собой Акп, С1у или 8ег;
    с5 представляет собой 8ег или Акп;
    с6 представляет собой Туг, 8ег, Тгр или РЬе;
    с7 отсутствует, представляет собой Рго или Н1к;
    с8 представляет собой Ьеи, Тгр, Туг или Агд;
    с9 представляет собой Тйг; и причем указанное антитело или фрагмент диссоциируют от человеческого полипептида ΝΟΕ с Кс примерно 1х10-9 или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого ΝΟΕ в стандартном анализе шуйго с ΙΟ50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
  60. 60. Полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент по любому из пп.58 или 59.
    - 103 013614
  61. 61. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.60.
  62. 62. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.61.
  63. 63. Клетка-хозяин по п.62, которая представляет собой эукариотическую клетку.
  64. 64. Клетка-хозяин по п.63, где эта клетка представляет собой клетку СНО.
  65. 65. Лекарственное средство для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией Ν6Ε или с повышенной чувствительностью к Ν6Ε, содержащее фармацевтически эффективное количество антитела или его иммунологически функционального фрагмента или фармацевтически приемлемые соли указанного моноклонального антитела или фрагмента, где указанное моноклональное антитело представляет собой антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
  66. 66. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую вариабельную область с аминокислотной последовательностью δερ ΙΌ ΝΟ: 10, или ее антигенсвязывающий либо иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, содержащую вариабельную область с аминокислотной последовательностью δερ ΙΌ ΝΟ: 12, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  67. 67. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида Ν6Ε с Кс примерно 1х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого Ν6Ε в стандартном анализе ίη νίίΐΌ с 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
  68. 68. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида Ν6Ε с Кс примерно 1 х 10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого Ν6Ε в стандартном анализе ίη νίίΐΌ с 1С50 примерно 1 х 10-9 М или менее.
  69. 69. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида Ν6Ε с Кс примерно 1 х 10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого Ν6Ε в стандартном анализе ίη νίίΐΌ с 1С50 примерно 0,2х10-9 М или менее.
  70. 70. Применение фармацевтически эффективного количества антитела по любому из пп.1, 2, 8, 13, 26, 28, 31, 33, 36, 37, 50 или 75-81 для производства лекарственного средства, пригодного для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией Ν6Ε или с повышенной чувствительностью к Ν6Ε.
  71. 71. Применение по п.70, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида Ν6Ε с Ии примерно 1х 10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого Ν6Ε в стандартном анализе ίη У1!го с 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
  72. 72. Применение по п.70, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида Ν6Ε с Ни примерно 1х 10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого Ν6Ε в стандартном анализе ίη У1!го с 1С50 примерно 1 х 10-9 М или менее.
  73. 73. Применение по п.70, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида Ν6Ε с К|.) примерно 1х 10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого Ν6Ε в стандартном анализе ίη У1!го с 1С50 примерно 0,2х10-9 М или менее.
  74. 74. Применение по п.73, где указанное болезненное расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из состояния, представляющего собой острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины, химиотерапию, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные или неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные жалобы с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию или аллодинию, боль при диабетической невропатии, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочно-кишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочно-пищеводный рефлюкс, панкреатит или висцералгию.
  75. 75. Изолированное антитело, которое специфично связывается с Ν6Ε, содержащее:
    (а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность δερ ΙΌ ΝΟ: 79, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность δερ ΙΌ ΝΟ: 80, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
    - 104 013614 (б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 81, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 82, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
    (в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 83, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 84, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
    (г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 85, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 86, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
    (д) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 87, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 88, 8Е0 ГО N0: 89, 8Е0 ГО N0: 90 или 8Е0 ГО N0: 91, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
  76. 76. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N6Ε, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую 8Е0 ГО N0: 10.
  77. 77. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N6Ε, содержащее вариабельную область легкой цепи, включающую 8Е0 ГО N0: 12.
  78. 78. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N6Ε, содержащее легкую цепь, включающую 8Е0 ГО N0: 44.
  79. 79. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N6Ε, содержащее тяжелую цепь, включающую 8Е0 ГО N0: 40.
  80. 80. Изолированное антитело, которое специфично связывается с N6Ε, содержащее легкую цепь, включающую 8Е0 ГО N0: 44, и тяжелую цепь, включающую 8Е0 ГО N0: 40.
  81. 81. Антитело по любому из пп.76-80, которое диссоциирует от человеческого полипептида N6Ε с 1<и примерно 1х10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого N6Ε в стандартном анализе ш ν^ι^ο с 1С50 примерно 1 х 10-8 М или менее.
  82. 82. Антитело по любому из пп.76-80, которое диссоциирует от человеческого полипептида N6Ε с 1<и примерно 1х10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого N6Ε в стандартном анализе ш ν^ι^ο с 1С50 примерно 1 х 10-9 М или менее.
  83. 83. Антитело по любому из пп.76-80, которое диссоциирует от человеческого полипептида N6Ε с 1<и примерно 1х10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого N6Ε в стандартном анализе ш ν^ι^ο с 1С50 примерно 0,2х10-9 М или менее.
  84. 84. Антитело по п.76 или 79, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
  85. 85. Антитело по п.77 или 78, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
  86. 86. Антитело по п.84 или 85, которое представляет собой ЕаЬ-антитело.
  87. 87. Антитело по п.84 или 85, которое представляет собой ЕаЬ'-антитело.
  88. 88. Антитело по п.84 или 85, которое представляет собой (ЕаЬ')2-антитело.
  89. 89. Антитело по любому из пп.76-80, представляющее собой полностью человеческое антитело.
  90. 90. Антитело по любому из пп.76-80, которое ингибирует передачу сигнала N6Ε.
  91. 91. Полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из пп.76-80.
  92. 92. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.91.
  93. 93. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.92.
  94. 94. Клетка-хозяин по п.93, которая представляет собой эукариотическую клетку.
  95. 95. Клетка-хозяин по п.94, где эта клетка представляет собой клетку СНО.
  96. 96. Лекарственное средство для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией N6Ε или с повышенной чувствительностью к N6Ε, содержащее фармацевтически эффективное количество антитела или его иммунологически функционального фрагмента или фармацевтически приемлемые соли указанного моноклонального антитела или фрагмента, где указанное моноклональное антитело представляет собой антитело по любому из пп.76-80, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
  97. 97. Применение фармацевтически эффективного количества антитела по любому из пп.76-80 для производства лекарственного средства, пригодного для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией N6Ε или с повышенной чувствительностью к N6Ε.
  98. 98. Применение по п.97, где указанное болезненное расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из состояния, представляющего собой острую боль, зубную боль, боль в результате трав
    - 105 013614 мы. операционную боль. боль в результате ампутации или абсцесса. каузалгию. демиелинизирующие заболевания. невралгию тройничного нерва. рак. хронический алкоголизм. удар. таламический болевой синдром. диабет. синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). токсины. химиотерапию. общую головную боль. мигрень. кластерную головную боль. смешанно-васкулярные или неваскулярные синдромы. головную боль напряжения. общее воспаление. артрит. ревматические заболевания. волчанку. остеоартрит. воспалительные кишечные расстройства. синдром раздраженной кишки. воспалительные глазные расстройства. воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря. псориаз. кожные жалобы с воспалительными компонентами. солнечный ожог. кардит. дерматит. миозит. неврит. сосудистые коллагенозы. хронические воспалительные состояния. воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию. невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию или аллодинию. боль при диабетической невропатии. симпатически поддерживаемую боль. синдромы деафферентации. астму. повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани. простой герпес. расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной. мочеполовой. желудочно-кишечной или сосудистой систем. раны. ожоги. аллергические кожные реакции. зуд. витилиго. общие желудочно-кишечные расстройства. колит. язву желудка. язвы двенадцатиперстной кишки. вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства. дисменорею. диспепсию. желудочно-пищеводный рефлюкс. панкреатит или висцералгию.
EA200600254A 2003-07-15 2004-07-15 Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения EA013614B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48743103P 2003-07-15 2003-07-15
PCT/US2004/022876 WO2005019266A2 (en) 2003-07-15 2004-07-15 Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600254A1 EA200600254A1 (ru) 2006-12-29
EA013614B1 true EA013614B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=34215825

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600254A EA013614B1 (ru) 2003-07-15 2004-07-15 Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения
EA201000245A EA030259B8 (ru) 2003-07-15 2004-07-15 Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000245A EA030259B8 (ru) 2003-07-15 2004-07-15 Человеческие нейтрализующие антитела к фактору роста нервов (ngf) в качестве селективных ингибиторов метаболического пути ngf

Country Status (31)

Country Link
US (7) US7601818B2 (ru)
EP (2) EP1648509B8 (ru)
JP (8) JP4489077B2 (ru)
CN (3) CN102358903B (ru)
AR (2) AR045056A1 (ru)
AU (2) AU2004267030B2 (ru)
BR (1) BRPI0412567B1 (ru)
CA (1) CA2534585C (ru)
CY (1) CY1113167T1 (ru)
DK (1) DK1648509T3 (ru)
EA (2) EA013614B1 (ru)
ES (1) ES2392954T3 (ru)
GE (3) GEP20146050B (ru)
HK (2) HK1088534A1 (ru)
HR (2) HRP20060033B1 (ru)
IL (5) IL173076A (ru)
MA (1) MA27952A1 (ru)
ME (2) ME02785B (ru)
MX (2) MXPA06000583A (ru)
NO (1) NO20060381L (ru)
NZ (3) NZ544751A (ru)
PL (1) PL1648509T3 (ru)
PT (1) PT1648509E (ru)
RS (2) RS52332B (ru)
SG (1) SG10201404744RA (ru)
SI (1) SI1648509T1 (ru)
TN (1) TNSN06010A1 (ru)
TW (4) TWI385180B (ru)
UA (2) UA115960C2 (ru)
WO (1) WO2005019266A2 (ru)
ZA (1) ZA200600847B (ru)

Families Citing this family (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0367170A (ja) * 1989-08-04 1991-03-22 Nippon Steel Corp 金属試料中の微量炭素，硫黄，燐の分析方法
UA80447C2 (en) * 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
WO2005000194A2 (en) * 2002-10-08 2005-01-06 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody and compositions containing the same
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
CN102746399B (zh) 2002-12-24 2016-03-02 里纳特神经系统学公司 抗ngf抗体及其使用方法
US9498530B2 (en) 2002-12-24 2016-11-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
AU2004213044A1 (en) 2003-02-19 2004-09-02 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating pain by administering a nerve growth factor antagonist and an NSAID and compositions containing the same
WO2005019266A2 (en) * 2003-07-15 2005-03-03 Amgen Inc. Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
SI1732949T1 (sl) * 2004-04-07 2010-05-31 Rinat Neuroscience Corp Postopki za zdravljenje bolečine kostnega raka zdajanjem antagonista živčnega rastnega faktorja
US7725178B2 (en) 2004-06-30 2010-05-25 Cedars-Sinai Medical Center Method and system for the prediction of cardiac arrhythmias, myocardial ischemia, and other diseased condition of the heart associated with elevated sympathetic neural discharges
ME00226B (me) * 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
TW200902555A (en) * 2005-01-03 2009-01-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof
BRPI0606933B8 (pt) * 2005-01-24 2021-05-25 Cambridge Antibody Tech Limited membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado, composição e uso de um membro de ligação específico
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
US20080311078A1 (en) 2005-06-14 2008-12-18 Gokarn Yatin R Self-Buffering Protein Formulations
JP2009502972A (ja) * 2005-07-29 2009-01-29 アムジエン・インコーポレーテツド タンパク質凝集を抑制する製剤
CA2628843A1 (en) 2005-11-07 2007-05-10 Copenhagen University Neurotrophin-derived peptide sequences
US7822474B2 (en) * 2005-11-30 2010-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Methods for the prediction of arrhythmias and prevention of sudden cardiac death
US8207304B2 (en) * 2006-10-19 2012-06-26 Csl Limited Antibody antagonists of interleukin-13 receptor α1
CA2669921A1 (en) 2006-11-15 2008-06-26 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to btla and methods of use
AU2007338791B2 (en) * 2006-12-21 2014-03-13 Amgen Inc Stable buffered formulations containing polypeptides
JP2010520748A (ja) * 2007-02-20 2010-06-17 アナプティスバイオ インコーポレイティッド 体細胞超変異系
KR101709495B1 (ko) 2007-08-10 2017-02-23 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 인간 신경성장인자에 대한 고친화성 인간 항체
US8309088B2 (en) * 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
AU2012216653B2 (en) * 2007-08-10 2013-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
MX2010002249A (es) * 2007-08-31 2010-03-17 Amgen Inc Formulacion de proteina de estado solido.
US8383114B2 (en) * 2007-09-27 2013-02-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
AU2008337100B2 (en) * 2007-12-17 2013-02-28 Pfizer Limited Treatment of interstitial cystitis
MX2010012031A (es) * 2008-05-13 2011-01-20 Novimmune Sa Anticuerpos anti-il-6/il-6r y metodos de uso de los mismos.
WO2009150623A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Pfizer Inc Treatment of chronic prostatitis
US8287861B2 (en) * 2008-06-30 2012-10-16 Novo Nordisk A/S Anti-human interleukin-20 antibodies
SI2331090T1 (en) 2008-09-19 2018-04-30 Pfizer Inc. Stable liquid antibody formulation
CA2952692C (en) 2008-09-22 2020-04-28 Array Biopharma Inc. Substituted imidazo[1,2b]pyridazine compounds
HUE037716T2 (hu) 2008-10-22 2018-09-28 Array Biopharma Inc Szubsztituált pirazolo[l,5-a]pirimidin vegyületek mint TRK kináz inhibitorok
BRPI0922224A2 (pt) * 2008-12-08 2016-08-02 Vm Pharma Llc composições de inibidores de proteína tirosina quiinase receptora.
EP2448970B1 (en) 2009-05-04 2014-07-09 Abbott Research B.V. Antibodies against nerve growth factor (ngf) with enhanced in vivo stability
WO2010146511A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Pfizer Limited Treatment of overactive bladder
AR077468A1 (es) 2009-07-09 2011-08-31 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo (1,5 -a) pirimidina sustituidos como inhibidores de trk- quinasa
WO2011050333A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Amgen Inc. Vial adapter and system
US10471212B2 (en) * 2009-10-29 2019-11-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Silicone free drug delivery devices
US9597458B2 (en) 2009-10-29 2017-03-21 W. L. Gore & Associates, Inc. Fluoropolymer barrier materials for containers
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
KR20120130757A (ko) 2010-02-26 2012-12-03 노보 노르디스크 에이/에스 안정한 항체 함유 조성물
CA2976671C (en) 2010-03-01 2021-01-12 Bayer Healthcare Llc Optimized monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
JP2013522313A (ja) 2010-03-17 2013-06-13 アボツト・リサーチ・ベー・フエー 抗神経成長因子（ｎｇｆ）抗体組成物
MY191934A (en) 2010-05-20 2022-07-19 Array Biopharma Inc Macrocyclic compounds as trk kinase inhibitors
CA2800188A1 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Novo Nordisk A/S Stable multi-dose compositions comprising an antibody and a preservative
ES2545411T5 (es) 2010-06-07 2024-04-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármaco
ES2910305T3 (es) 2010-08-19 2022-05-12 Zoetis Belgium S A Anticuerpos anti-NGF y su uso
US11612697B2 (en) 2010-10-29 2023-03-28 W. L. Gore & Associates, Inc. Non-fluoropolymer tie layer and fluoropolymer barrier layer
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9783602B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
AU2012245231B2 (en) 2011-04-20 2016-10-13 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
WO2013009582A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
ME02944B (me) 2011-08-11 2018-04-20 Astellas Pharma Inc Novo antitelo protiv humanog ngf
CN103930142B (zh) 2011-10-14 2016-12-14 安姆根有限公司 注射器和装配方法
US8926978B2 (en) 2011-10-25 2015-01-06 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against nerve growth factor (NGF)
EP2858501A4 (en) 2012-05-22 2015-12-09 Merck Sharp & Dohme TRK-A KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
US9708401B2 (en) 2012-05-22 2017-07-18 Bristol-Myers Squibb Company IL-17A/F cross-reactive monoclonal antibodies and methods of using the same
EP2859018B1 (en) 2012-06-06 2021-09-22 Zoetis Services LLC Caninized anti-ngf antibodies and methods thereof
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
JP6135161B2 (ja) * 2013-02-08 2017-05-31 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
JP6768501B2 (ja) 2013-03-15 2020-10-14 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入機、および自動注入機システム
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
EP3712166A1 (en) 2013-09-05 2020-09-23 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
WO2015039333A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015039334A1 (en) 2013-09-22 2015-03-26 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
PL3060275T3 (pl) 2013-10-24 2019-12-31 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
ES2923641T3 (es) 2013-12-30 2022-09-29 Epimab Biotherapeutics Inc Inmunoglobulina con Fabs en tándem y usos de la misma
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN106029614B (zh) 2014-02-05 2019-05-31 Vm肿瘤药物有限责任公司 化合物的组合物及其用途
WO2015143653A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143654A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
WO2015143652A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS,COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
AU2015256082C1 (en) 2014-05-07 2020-09-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
JP6671298B2 (ja) 2014-05-16 2020-03-25 アムジェン インコーポレイテッド Ｔｈ１及びｔｈ２細胞集団を検出するためのアッセイ
CN112237662B (zh) 2014-06-03 2022-10-21 安姆根有限公司 药物递送系统和使用方法
WO2016035052A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies for treating itching
AU2015332557B2 (en) 2014-10-14 2020-05-14 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
SI3699181T1 (sl) 2014-11-16 2023-06-30 Array Biopharma, Inc. Kristalinična oblika(s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorofenil)- pirolidin-1-il)-pirazolo(1,5-a)pirimidin-3-il)-3-hidroksipirolidin-1 -karboksamid hidrogen sulfata
JP6716566B2 (ja) 2014-12-19 2020-07-01 アムジエン・インコーポレーテツド 近接センサ付き薬物送達装置
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
CN104774265B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体11f1及其杂交瘤细胞株
CN104910274B (zh) * 2015-02-12 2018-05-04 北京华安科创生物技术有限公司 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12c11及其杂交瘤细胞株
CA2976935C (en) 2015-02-17 2020-03-10 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
ES2905870T3 (es) 2015-02-27 2022-04-12 Amgen Inc Dispositivo de suministro de fármacos que tiene un mecanismo de protección de aguja con un umbral de resistencia ajustable al movimiento de la protección de aguja
WO2016146730A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-22 Neuheart S.R.L. PEPTIDES HAVING TrkA-RECEPTOR-AGONISTIC ACTIVITY OR HAVING NGF-ANTAGONISTIC ACTIVITY
MA41842A (fr) 2015-03-31 2018-02-06 Oblique Therapeutics Ab Nouveaux procédés de sélection d'épitope
WO2016161572A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. TrkA KINASE INHIBITORS, COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
TWI706959B (zh) 2015-05-22 2020-10-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎抗人類ＮＧＦ抗體Ｆａｂ片段
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
EP3334747B1 (en) 2015-08-13 2023-09-27 Amgen Inc. Charged depth filtration of antigen-binding proteins
WO2017027805A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 University Of Massachusetts Human antibodies against rabies and uses thereof
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
TN2018000138A1 (en) 2015-10-26 2019-10-04 Array Biopharma Inc Point mutations in trk inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
CA3010224A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-coagulation factor xi antibodies
NZ743881A (en) 2016-02-06 2023-11-24 Epimab Biotherapeutics Inc Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
EP3429663B1 (en) 2016-03-15 2020-07-15 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US10045991B2 (en) 2016-04-04 2018-08-14 Loxo Oncology, Inc. Methods of treating pediatric cancers
TN2018000335A1 (en) 2016-04-04 2020-01-16 Loxo Oncology Inc Liquid formulations of (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
WO2017192287A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
ES2952056T3 (es) 2016-05-18 2023-10-26 Loxo Oncology Inc Preparación de (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorofenil)pirrolidin-1-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-3-hidroxipirrolidina-1-carboxamida
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EA201892716A1 (ru) 2016-06-14 2019-05-31 Мерк Шарп И Доум Корп. Антитела к фактору свертывания xi
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
JP7161266B2 (ja) 2016-08-05 2022-10-26 メディミューン，エルエルシー 抗ｏ２抗体およびその使用
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
GB201614884D0 (en) * 2016-09-01 2016-10-19 Oblique Therapeutics Ab Method
GB201617002D0 (en) * 2016-10-06 2016-11-23 Oblique Therapeutics Ab Multi-protease method
SG11201903063UA (en) * 2016-10-19 2019-05-30 Medimmune Llc Anti-o1 antibodies and uses thereof
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
GB201621907D0 (en) * 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
WO2018151890A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
EP3592403A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
IL268478B2 (en) 2017-03-07 2023-10-01 Amgen Inc Inserting a needle using super pressure
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
SG11201908328XA (en) 2017-03-14 2019-10-30 Amgen Inc Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
EP4241807A3 (en) 2017-03-28 2023-10-11 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018282077B2 (en) 2017-06-08 2023-11-23 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
US11541183B2 (en) 2017-06-22 2023-01-03 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
JP7475860B2 (ja) 2017-06-23 2024-04-30 アムジエン・インコーポレーテツド スイッチアセンブリにより起動されるキャップを含む電子薬物送達デバイス
ES2972207T3 (es) 2017-07-14 2024-06-11 Amgen Inc Sistema de inserción-retracción de agujas con sistema de resorte de torsión doble
MA49626A (fr) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage
EP3658206A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019070472A1 (en) 2017-10-04 2019-04-11 Amgen Inc. FLOW ADAPTER FOR MEDICATION DELIVERY DEVICE
IL272636B1 (en) 2017-10-06 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with combination assembly and related assembly method
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
WO2019090303A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
WO2019089178A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
SG11202002966QA (en) 2017-11-10 2020-05-28 Amgen Inc Plungers for drug delivery devices
IL273638B1 (en) 2017-11-16 2024-06-01 Amgen Inc Door lock mechanism for drug delivery device
SG11202002772VA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Autoinjector with stall and end point detection
AR114110A1 (es) 2018-02-28 2020-07-22 Lilly Co Eli Anticuerpo anti-trka
KR20200130696A (ko) 2018-03-12 2020-11-19 조에티스 서비시즈 엘엘씨 항-ngf 항체 및 이의 방법
BR112020019559A2 (pt) 2018-03-26 2021-01-12 Amgen Inc. Glicoformas afucosiladas totais de anticorpos produzidos em cultura de células
CN108623687A (zh) * 2018-04-17 2018-10-09 中山康方生物医药有限公司 神经生长因子的单克隆抗体及其编码基因和应用
JPWO2019221097A1 (ja) 2018-05-15 2021-05-27 アステラス製薬株式会社 抗ヒトｎｇｆ抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分とする心房細動の抑制用医薬組成物
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MX2021000749A (es) 2018-07-24 2021-03-29 Amgen Inc Dispositivos de suministro para administrar farmacos.
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020028009A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
EP3860685A1 (en) 2018-10-02 2021-08-11 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
EP3860686A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
IT201800009384A1 (it) 2018-10-11 2020-04-11 Cosmo Srl Peptide for cosmetic application
CA3109988A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
MA53912A (fr) 2018-10-15 2022-01-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un mécanisme d'amortissement
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MX2021012557A (es) 2019-04-24 2021-11-12 Amgen Inc Conjuntos y metodos de verificacion de esterilizacion de jeringuillas.
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
CN117003868B (zh) * 2020-04-17 2024-04-16 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
CN113527483B (zh) * 2020-04-17 2023-09-22 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 抗人神经生长因子的抗体
US20230220057A1 (en) * 2020-05-27 2023-07-13 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
TW202210467A (zh) 2020-05-28 2022-03-16 美商美國禮來大藥廠 TrkA抑制劑
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
AU2020204105B2 (en) * 2020-06-19 2023-06-08 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human ngf antibodies and methods using same
US11655292B2 (en) 2020-06-23 2023-05-23 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human NGF antibodies and methods using same
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023111153A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Intervet International B.V. Caninized antibodies to human ngf
WO2023212586A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for selecting patients for treatment with an ngf antagonist
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001078698A2 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Warner-Lambert Company Use of ngf-antagonists for the prevention or treatment of chronic visceral pain
US20010046959A1 (en) * 2000-02-29 2001-11-29 Buchkovich Karen J. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
WO2002096458A1 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230691A (en) 1978-05-23 1980-10-28 The Massachusetts General Hospital Nerve growth factor antibody and process
GB2077573A (en) 1980-06-10 1981-12-23 Kangol Magnet Ltd Vehicle seat belt connection device
US4786593A (en) 1985-04-16 1988-11-22 Wistar Institute Of Anatomy And Biology Diagnostic method for detection of neural crest disease
JP2969647B2 (ja) 1988-09-14 1999-11-02 東ソー株式会社 モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法
SE465573B (sv) 1989-03-14 1991-09-30 Lope Medicine Ab Nervtillvaextfaktorpeptider, motsvarande antikroppar och foerfarande foer bestaemning av nativ nervtillvaextfaktor
ATE160288T1 (de) 1989-08-28 1997-12-15 Takeda Chemical Industries Ltd Antikörper, ihre herstellung und verwendung
US5656435A (en) 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
JPH03163095A (ja) 1989-08-28 1991-07-15 Takeda Chem Ind Ltd ヒト神経成長因子の部分ペプチド、抗体およびその用途
US6300129B1 (en) * 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JP3232415B2 (ja) 1990-08-29 2001-11-26 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体，その製造法および用途
JPH06317587A (ja) 1990-08-31 1994-11-15 Takeda Chem Ind Ltd 抗体およびその用途
US5147294A (en) 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
JPH0576384A (ja) 1991-09-20 1993-03-30 Hitachi Ltd 抗ヒト神経成長因子モノクローナル抗体
JP3519096B2 (ja) 1992-07-02 2004-04-12 武田薬品工業株式会社 モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびそれらの用途
US5844092A (en) 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9616105D0 (en) 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
US7322122B2 (en) 1997-01-15 2008-01-29 Draka Comteq B.V. Method and apparatus for curing a fiber having at least two fiber coating curing stages
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
KR20090024308A (ko) * 1999-08-27 2009-03-06 제넨테크, 인크. 항-ＥｒｂＢ2 항체 투여 치료 방법
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
EP1369431A4 (en) 2001-10-15 2005-01-12 Kirin Brewery ANTI-HLA-DR ANTIBODIES
EP1467756A4 (en) 2001-12-28 2007-03-21 Abgenix Inc METHODS OF USING ANTI-MUC18 ANTIBODIES
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
CA2501626A1 (en) * 2002-10-08 2004-04-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
CN102746399B (zh) 2002-12-24 2016-03-02 里纳特神经系统学公司 抗ngf抗体及其使用方法
EP1468999A1 (en) * 2003-03-20 2004-10-20 MyoContract Ltd. Substituted piperidine and piperazine derivatives as melanocortin-4 receptor modulators
WO2005019266A2 (en) * 2003-07-15 2005-03-03 Amgen Inc. Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
BRPI0606933B8 (pt) 2005-01-24 2021-05-25 Cambridge Antibody Tech Limited membro de ligação específico isolado para fator de crescimento de nervos, molécula de anticorpo isolado, composição e uso de um membro de ligação específico

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010046959A1 (en) * 2000-02-29 2001-11-29 Buchkovich Karen J. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
WO2001078698A2 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Warner-Lambert Company Use of ngf-antagonists for the prevention or treatment of chronic visceral pain
WO2002096458A1 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Genentech, Inc. Anti-ngf antibodies for the treatment of various disorders

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOLT L.J. ET AL.: "Domain antibodies: proteins for therapy" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 11, November 2003 (2003-11), pages 484-490, XP004467495 ISSN: 0167-7799 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102358903A (zh) 2012-02-22
CN1849138A (zh) 2006-10-18
RS52332B (en) 2012-12-31
IL241874A0 (en) 2015-11-30
EA201000245A1 (ru) 2010-12-30
TW200911833A (en) 2009-03-16
NZ544751A (en) 2009-05-31
EP1648509A2 (en) 2006-04-26
HRP20120882T1 (hr) 2013-02-28
TWI385180B (zh) 2013-02-11
CN102408483A (zh) 2012-04-11
HK1096310A1 (en) 2007-06-01
JP2017079782A (ja) 2017-05-18
JP5965964B2 (ja) 2016-08-10
NZ588527A (en) 2012-06-29
RS20100555A (en) 2011-08-31
IL206823A0 (en) 2011-08-01
TWI635096B (zh) 2018-09-11
JP2015155413A (ja) 2015-08-27
JP2012250986A (ja) 2012-12-20
TW201311721A (zh) 2013-03-16
SG10201404744RA (en) 2014-10-30
IL173076A0 (en) 2006-06-11
JP4489077B2 (ja) 2010-06-23
JP2015042670A (ja) 2015-03-05
CN102408483B (zh) 2016-06-08
JP2010006812A (ja) 2010-01-14
AR075790A2 (es) 2011-04-27
TWI382031B (zh) 2013-01-11
EP1648509B1 (en) 2012-09-12
ES2392954T3 (es) 2012-12-17
AU2004267030A1 (en) 2005-03-03
RS20060022A (en) 2008-06-05
JP2012161316A (ja) 2012-08-30
US20110040076A1 (en) 2011-02-17
GEP20104887B (en) 2010-02-10
PT1648509E (pt) 2012-10-18
HRP20060033B1 (hr) 2014-02-28
NZ599196A (en) 2014-01-31
EA200600254A1 (ru) 2006-12-29
ZA200600847B (en) 2007-01-31
US7601818B2 (en) 2009-10-13
IL214281A (en) 2016-07-31
EP1648509B8 (en) 2012-10-24
US7795413B2 (en) 2010-09-14
US20090155274A1 (en) 2009-06-18
AU2010202177A1 (en) 2010-06-17
IL214281A0 (en) 2011-08-31
TNSN06010A1 (en) 2007-10-03
DK1648509T3 (da) 2013-01-07
JP2007537703A (ja) 2007-12-27
UA97086C2 (ru) 2012-01-10
US20050074821A1 (en) 2005-04-07
GEP20196963B (en) 2019-04-10
MX341869B (es) 2016-09-06
CN1849138B (zh) 2011-11-30
CN102358903B (zh) 2017-04-26
TW200513468A (en) 2005-04-16
EA030259B8 (ru) 2018-09-28
US20160304596A1 (en) 2016-10-20
US8106167B2 (en) 2012-01-31
AR045056A1 (es) 2005-10-12
US8198410B2 (en) 2012-06-12
AU2004267030B2 (en) 2010-06-17
BRPI0412567B1 (pt) 2017-03-21
TW201534621A (zh) 2015-09-16
CY1113167T1 (el) 2016-04-13
BRPI0412567A (pt) 2006-09-19
GEP20146050B (en) 2014-03-10
TWI503328B (zh) 2015-10-11
JP2010162028A (ja) 2010-07-29
EA030259B1 (ru) 2018-07-31
WO2005019266A3 (en) 2005-04-28
SI1648509T1 (sl) 2012-12-31
JP5264798B2 (ja) 2013-08-14
UA115960C2 (uk) 2018-01-25
IL173076A (en) 2015-10-29
HK1088534A1 (en) 2006-11-10
PL1648509T3 (pl) 2013-02-28
NO20060381L (no) 2006-03-22
MEP31508A (en) 2010-10-10
WO2005019266A2 (en) 2005-03-03
US20110091476A1 (en) 2011-04-21
EP2364728A1 (en) 2011-09-14
MA27952A1 (fr) 2006-06-01
US20160237147A1 (en) 2016-08-18
IL214280A0 (en) 2011-08-31
MXPA06000583A (es) 2006-03-30
US20080033157A1 (en) 2008-02-07
CA2534585C (en) 2012-02-21
HRP20060033A2 (en) 2007-04-30
CA2534585A1 (en) 2005-03-03
AU2010202177B2 (en) 2013-12-12
ME02785B (me) 2012-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013614B1 (ru) Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения
AU2014203316B2 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
JP5594982B2 (ja) 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
EA011876B1 (ru) АНТИТЕЛА К IFN-γ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ
CN118063612B (zh) 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途
CN118063612A (zh) 抗ror1抗体或其抗原结合片段及其用途
AU2016247195A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors
AU2013260740A1 (en) Human Anti-NGF Neutralizing Antibodies as Selective NGF Pathway Inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU