JP2969647B2

JP2969647B2 - モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法

Info

Publication number: JP2969647B2
Application number: JP1098823A
Authority: JP
Inventors: 悟大仲; 和秀吉川; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 1999-11-02
Anticipated expiration: 2014-11-02
Also published as: JPH02219593A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は神経成長因子（nerve growth factor,以下
NGFとする）βサブユニットを特異的に認識するモノク
ローナル抗体、それから成る阻害剤及びそれを用いた測
定方法に関するものである。

（従来の技術） NGFは、胎生期の知覚神経節および交感神経節神経細
胞の分化と成長を促進する作用を持つ、一群のポリペプ
チドである。神経組織以外の組織で産生され、神経組織
に作用するものと考えられ、特に交感神経節神経細胞で
は、成長後もその機能維持に必須の因子である。

NGFは、α，β，γの３種の異なるサブユニットから
なる分子量140000のホルモン様タンパク質である。αサ
ブユニットの役割は未だ明確にされておらず、γサブユ
ニットはアルギニン特異的ペプチダーゼ活性を持つセリ
ンプロテアーゼである。βサブユニットは単独でNGF活
性を発現し、118個のアミノ酸残基からなる分子量14000
のペプチド鎖が２分子非共有結合した２量体構造をとっ
ており、分子量は約28000である。

動物実験では、筋ジストロフィー症マウス（dy/dy）
の顎下リンパ腺中のNGF活性および後肢筋肉中NGF様免疫
交叉活性レベルが、発症していないマウスに比較して有
意に減少していることが報告されている。

一方、NGFに応答し分化する株細胞系としては、1976
年、ラット褐色細胞腫（ph−eochromocytoma）よりPC12
細胞が単離されクローンとして樹立された。PC12細胞は
NGFに応答し、形態的には、長い神経線維を伸ばし、種
々の神経細胞としての機能を高めることが次第に明らか
になってきており、この細胞系が、NGFなどによる分化
に伴なう形質発現の分子機構を明らかにできる絶好の系
と考えられている。また、この細胞系は、分化した交感
神経細胞の性質を明らかにする良い系ともなっており、
また、神経分泌細胞のモデルとしても良く用いられてい
る。

（発明が解決しようとする課題） NGFの測定法としてはバイオアッセイ法（内分泌実験
講座，ホルモン測定法（上） 266−280頁 1982年），
ポリクローナル抗体を用いた放射免疫測定法（ジャーナ
ルオブニューロケミストリー第18巻 2355−2362
頁），酵素免疫測定法（プロシーヂングスオブナシ
ョナルアカデミーオブサイエンスUSA 第75巻 4
042−4046頁1978年）が知られている。

従来知られているバイオアッセイ法は、生物活性を指
標としているため最も信頼性のある方法であるが、神経
節の採取などにある程度の習熟を必要とし、様々な神経
繊維伸長パターンがあらわれ評価が困難であり、また感
度はせいぜい1ng/ml程度と比較的低いという問題があ
る。

放射免疫測定法，酵素免疫測定法においても、使用す
る抗体が必ずしも均一な性質を有していないことから測
定精度に問題がある。

また増殖因子の研究において、その活性阻害剤を用い
ることは、研究の進歩と深い関わりがある。しかし、NG
Fには生理的条件下で、NGFの作用のみを阻害する適当な
阻害剤が知られておらず、この事がNGF研究の進歩を妨
げている。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明者らは従来技術の問題点を解決するべく、操作
が簡単で測定精度の高いNGFの測定方法及びNGFの阻害剤
について鋭意検討したところ、モノクローナル抗体を使
用することでこれらの問題点を解決できることを見出だ
し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的に認識する
モノクローナル抗体ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的に認識する
モノクローナル抗体で、・固相に固定化されたモノクローナル抗体（Ｉ）・標識されたまたは標識されていないモノクローナル抗
体（II）及び標識されていないモノクローナル抗体（II）を使用
した場合には、モノクローナル抗体（Ｉ）若しくは（I
I）の結果生じる免疫反応生成物またはモノクローナル
抗体（II）を特異的に認識する標識された抗体を試料と
反応させ、固相又は液相の標識を直接的又は間接的に検
出することを特徴とする、試料中のヒト神経成長因子β
サブユニットおよび／又はヒト神経成長因子の測定方法ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的に認識し、
固相に固定化されたモノクローナル抗体（Ｉ）・標識されたヒト神経成長因子及び／又はヒト神経成長
因子βサブユニット・試料とを反応させ、固相又は液相の標識を直接的または間接
的に検出することを特徴とする、試料中のヒト神経成長
因子βサブユニットおよび／又はヒト神経成長因子の測
定方法ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的に認識する
モノクローナル抗体から成る、ヒト神経成長因子βサブ
ユニット及び／又はヒト神経成長因子に対する阻害剤である。以下、その詳細について説明する。

本発明において、ヒトNGFβサブユニットを特異的に
認識するモノクローナル抗体は、それ自体公知である方
法（ジー．ケーラーとジー．ミルシュタイン，ネーチャ
ー，第256巻,495頁,1975年）に準じて得ることができ
る。この方法により、ヒトNGFβサブユニットを特異的
に認識する複数種のモノクローナル抗体を得ることがで
きた。それぞれの抗体の親和定数は、10^-7〜10^-11Mの範
囲内であった。またこれらの抗体は、ヒトNGFβサブユ
ニットの異なる抗原決定部位を認識するものであった。

従ってこれらのモノクローナル抗体を使って、ヒトNG
Fβサブユニットをサンドイッチ法，競争法などによ
り、定量的に免疫学的に測定することが可能となり、β
サブユニットを定量できることはもちろん、それを通し
てヒトNGFを定量的に測定することが可能となった。

例えばサンドイッチ法の場合は、抗体及び試料の添加
順序には特に限定はなく、また、固相と液相との分離回
数にも制限はない。モノクローナル抗体（II）は、標識
されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、
反応後、その標識を固相又は液相において検出すればよ
い。標識されていない場合は、モノクローナル抗体
（Ｉ）若しくは（II）の結果生じる免疫反応生成物又は
モノクローナル抗体（II）を特異的に認識する標識化抗
体を添加し、その標識を検出すればよい。このときの抗
体は、例えば抗I_gG抗体などがあげられる。また、ヒトN
GFβサブユニットは２量体構造をとっているため、モノ
クローナル抗体（Ｉ），（II）は同じ抗原決定部位を認
識するものであってもよいが、異なるものの方が好まし
い。

また競争法の場合は、固相に固定化されたモノクロー
ナル抗体（Ｉ）に対し、標識されたヒトNGF及び／又は
ヒトNGFβサブユニットと試料とを同時に反応開始させ
る必要がある。そのため、もし標識されたヒトNGF及び
／又はヒトNGFβサブユニットと試料とを同時に添加で
きない場合は、先に加えたものが反応しない工夫をする
べきである。例えば、一方を加えた時点で凍結乾燥すれ
ばよい。

本発明方法に用いられるモノクローナル抗体（Ｉ）は
固相に固定化されているが、固相に固定化する方法は公
知の方法を採用することができる。固相としては例え
ば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リカーボネート、セファロース粒子、ラテックス、アガ
ロース、セルロース、ポリメタアクリレートなどが使用
される。

また本発明で用いられる標識化抗体の作製方法とその
検出方法もなんら限定されるものではなく、公知の方法
により標識化および検出することができる。標識として
は、直接的に検出されるものとしては、例えば放射性物
質，蛍光物質などがあげられ、間接的に検出されるもの
としては、例えば酵素などがあげられる。酵素として具
体的には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラー
ゼ、β−グルクロニダーゼなどがあげられ、放射性物質
としては、³H,¹²⁵I,または¹³¹I等が、蛍光物質として
は、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンチオシ
アネート、テトラローダミンイソチオシアネート（TRIT
C）等があげられ、常法によりモノクローナル抗体に結
合される。

競争法で用いられる標識されたヒトNGFの調製方法
も、公知の方法に従って化学的に結合させれば良く、標
識物質としては例えば上記で説明したものが使用でき
る。しかしながら、標識物質は上記物質に何ら限定され
るべきものではない。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質，
溶解剤，緩衝剤，洗浄剤，反応停止剤等の公知の試薬が
用いられる。

また本発明のモノクローナル抗体から成る阻害剤を使
って神経クローン細胞や、神経節細胞の神経成長因子に
応答した神経線維形成を阻害させることが可能となっ
た。この阻害剤は抗ヒトNGFβサブユニットモノクロー
ナル抗体から成ればよく、生物学的，薬学的に許容され
る物質を含んでもよい。

このときに用いられる神経クローン細胞や神経節細胞
としては、ヒトNGFに応答して神経線維を形成するもの
であれば特に限定はしないが、例えば前述のPC12細胞系
が良く用いられる。

一例をあげればPC12細胞に対するヒトNGFによる分化
誘導作用を観察する際には、まず細胞を１〜2.5×10⁴ce
lls/cm²にまき、ヒトNGF存在下に１夜以上培養すること
により行うことができる。このとき、抗ヒトNGFβサブ
ユニットモノクローナル抗体から成る阻害剤を用いるこ
とにより、神経線維形成の阻害が観察できる。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように本発明によれば、抗ヒトNGFβサブユニットモノクローナル抗体が得ら
れる。

試料中のヒトNGF濃度は、0.1〜200ng/mlの範囲内で測
定することができ、従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、かつ感
度よく多数の検体の測定が可能である。

本発明のモノクローナル抗体から成る阻害剤を用いて
神経クローン細胞や、神経節細胞の神経成長因子に応答
した神経線維形成を阻害させることが可能となり、神経
生理学的分野の研究において、該モノクローナル抗体が
果たす役割は非常に重要であると考えられる。

（実施例）以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし本発
明は、これら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１モノクローナル抗体の作成（Ａ）抗原感作動物細胞の調製 Balb/cマウス（♀）をヒトNGFβサブユニットで免疫
した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュ
バントとヒトNGFβサブユニット（特願昭63−35042記載
の方法で得た大腸菌由来の組換えヒトNGFβサブユニッ
ト）100μg/匹とを乳化させた試料100μｌを投与した。
２週間後に追加免疫としてヒトNGFβサブユニット100μ
g/匹をフロイントの不完全アジュバントと乳化させたも
の100μｌをマウス腹腔に投与した。１週間後最終免疫
としてヒトNGFβサブユニット100μg/匹をリン酸緩衝化
生理食塩水（0.85％NaCl含有0.01％リン酸緩衝液、pH7.
2:以下PBS）に溶解したもの100μｌを腹腔内に投与し
た。３日後この処置マウスの脾臓を無菌的に取出した。
15％子牛胎児血清（以下15％FCSと省略する）を含むDME
M10mlを注射器で吸い取り27ゲージの注射針をつけた。
脾臓を氷冷しておいたデイッシュに入れ、注射針で数か
所穴をあけた。注射針を差し込み還流し脾臓細胞をデイ
ッシュに流出させた。流出液をナイロンメッシュで濾過
し遠心チューブに入れ、1000rpmで10分間遠心分離して
上澄をすてた。細胞ペレット中の赤血球を0.15M塩化ア
ンモニウム溶液（1mMエチレンジアミン４酢酸−２ナト
リウム塩（以下EDTAと省略する）を含む0.01M炭酸緩衝
液、pH7.2）で溶血させ遠心分離し、さらに細胞ペレッ
トをDMEMで２回同様に遠心洗浄して脾細胞とした。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としてはBalb/cマウス由来の８−アザグア
ニン耐性株として、SP2/0−Ag14（以下SP2/0と省略す
る）を使用した。細胞融合を行う１週間前まで20μg/ml
の８−アザグアニン,15％FCSを含むDMEMで培養し、その
後細胞融合日まで15％FCSを含むDMEMを使用した。細胞
融合直前に、SP2/0は無菌的にDMEMで1000rpmで10分間遠
心洗浄を２回繰り返し調製した。

（Ｃ）細胞融合上記（Ａ）項で調製した脾臓細胞と上記（Ｂ）項で調
製した骨髄腫細胞を5:1の割合で混合遠心（1000rpm,10
分）し細胞ペレットを集めた。遠心チューブを軽くたた
いて細胞ペレットを壁面にうすく広げた。その中に37℃
に暖めておいた50％PEG（MERK社製ポリエチレングリコ
ール4000）を含むDMEM溶液0.5mlを遠心チューブを回し
ながら少しずつ滴下した。１分間ゆっくりと遠心チュー
ブを回転させ混合した後、30秒に1mlの割合で遠心チュ
ーブを回転しながら37℃に加温しておいたDMEMを10回加
えた。つぎにFCSを2mlゆっくりと入れ、1000rpm,10分間
遠心した。細胞ペレットを15％FCSと１×10^-4Mヒポキサ
ンチン、４×10^-7Mアミノプテリン、1.6×10^-5Mチミジ
ンを含むDMEM（以下HAT培地と省略する）で２回遠心洗
浄（1000rpm,10分間）した。この培養液を96ウエルプレ
ート（Falcon♯3042）に５×10⁵細胞個／ウエルになる
ように200μｌずつ分注した。３日目ごとにHAT培地を10
0μl/ウエル交換した。３週間後からは、１×10^-4Mヒポ
キサンチン,1.6×10^-5Mチミジンと15％FCSを含むDMEM
（以下HT培地と省略する）を培地交換に用いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択 96ウエルプレートに細胞コロニーが認められる10日目
前後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒト
NGFβサブユニット抗体が存在するかどうか調べた。

96ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、ヒトNGFβサブユニット２μg/mlを50μl/ウエル分
注し、37℃で1.5時間静置した。ウエルに残っている溶
液を除去し、PBSに0.04％ツイーン（tween）−20を含ん
だ溶液（以下PBS−Ｔ）で３回洗浄した後、0.1％ウシ血
清アルブミン（以下BSA）を溶解したPBS−Ｔ溶液300μ
ｌを各ウエルに加えて、37℃で1.5時間ブロッキング処
理した。つぎに各ウエルに上記培養上清を100μｌずつ
分注し37℃で1.5時間静置した。これらのウエルをPBS−
Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ラビッ
ト抗マウスIgG抗体（ジャクソン社製）4000倍希釈を50
μl/ウエルずつ分注し、37℃で1.5時間静置した。PBS−
Ｔ溶液で３回洗浄したのち、基質溶液（1.2％ 2,2−ア
ジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアン
モニウム塩（ABTS）及び0.01％過酸化水素（H₂O₂）を含
有する0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.1）を各ウエルに100μ
ｌ添加した。30分間室温で放置し、200mMシュウ酸溶液1
00μｌを加えて酵素反応を停止させた。415nmでの吸光
度を測定し、酵素活性が認められたウエルに抗ヒトNGF
βサブユニット抗体を産生するハイブリドーマが存在す
ることがわかる。以上のようにして、抗体価の強い抗体
産生ハイブリドーマを取得した。

（Ｅ）コンデショニングメディウムの調製 26ゲージの注射針をつけた注射器に10mlの冷蔵してお
いた0.34Mサッカロース溶液を吸い取った。Balb/cマウ
ス（♂）を脊椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を
注入した。注入後５分以内に左側腹部に18ゲージの注射
針をつけて氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収
した。氷冷しておいた遠心チューブに上記回収液を流し
込み、1000rpmで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃
棄し、細胞ペレットに15％FCS−DMEMを加え攪拌しデッ
シュに入れた。37℃,5％炭酸ガス濃度,95％湿度で一晩
培養した。培養上清を集め、0.22μｍのメンブレンフィ
ルターで濾過し、これをコンデショニングメデウムとし
た。

（Ｆ）クローニング抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法
を用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製した
コンデショニングメデウムを1ml含むHAT培地20mlを用意
した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞を各ウエ
ルに１個になるように上記培養液中に調整し、200μl/
ウエルずつ96ウエルプレート（Falcon♯3042）に分注し
た。培養10日目前後から細胞コロニーが認められるウエ
ルについて、上記（Ｄ）項に記載した固相酵素免疫測定
法をに準じて抗ヒトNGFβサブユニット抗体産生ハイブ
リドーマを選択し、さらに再度クローニングを繰り返し
単一ハイブリドーマを樹立した。最終的に27クローンの
ハイブリドーマを確立した。

（Ｇ）抗ヒトNGFβサブユニット抗体の精製 Balb/cマウス（♂）６〜10週令の腹腔にプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を0.5ml/匹
投与した。２週間後上記（Ｆ）項で得られた抗ヒトNGF
βサブユニット抗体産生ハイブリドーマ株をマウス腹腔
内に各クローンについて２×10⁶細胞個／匹移植した。1
0日目前後に生成した腹水を、18ゲージの注射針を腹腔
に差し込み、1/20量の0.2M・EDTAをいれた遠心チューブ
に滴下させた。遠心チューブを4000rpmで10分間遠心
し、上清を集めた。採取した上清を50％硫酸アンモニウ
ム沈殿分画法にしたがって粗精製し、0.05％アジ化ナト
リウムを含むPBS溶液に透析後、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過をおこない精製した。メルカプトエ
タノール還元下での12％SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動で１本の重鎖と１本の軽鎖の２本のバンドになった
ことで抗体の純度を確認した。

以上の方法により、ヒトNGFβサブユニットを特異的
に認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。それぞ
れの抗体の結合定数は10^-7〜10^-11Mの範囲内であった。

実施例２免疫測定法（Ａ）抗ヒトNGFβサブユニット抗体の固定化未処理マイクロタイタープレート（96ウエル・ヌンク
プレート、インターメッド社製）の各ウエルに0.1M炭酸
ナトリウム緩衝液（pH9.6）に溶解した３μg/mlのマウ
ス由来の抗ヒトNGFβサブユニットモノクローナル抗体
（実施例１で作製したもの；名称Ａとする）の溶液200
μｌを加えて、４℃で一夜インキュベートした。次に、
各ウエルの溶液を除去し、PBS−Ｔで３回洗浄した後、
0.1％BSAを溶解したPBS−Ｔ溶液300μｌを各ウエルに加
えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。

（Ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下HRP）標識抗
体の調製 0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.1）に溶解したHRP
溶液（5mg/ml）に１％１−フルオロ−2,4−ジニトロ
ベンゼンのエタノール溶液0.1mlを加え、室温にて１時
間反応させた。その溶液に0.06M過ヨウ素酸ナトリウム
1.0mlを添加し30分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナ
トリウムを0.16Mのエチレングリコール1.0mlを加えて除
去した後、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）で透析
した。次に、マウス由来抗ヒトNGFβサブユニット・モ
ノクローナル抗体（実施例１で作製したもの、名称Ｂと
する；モノクローナル抗体Ａとは異なる抗原部位を認識
するもの）5mgを加えて５〜６時間反応させた。水素化
ホウ素ナトリウム5mgを添加して４℃で一夜放置した。
この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するた
め、0.85％塩化ナトリウムを含む10mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.1）に対して４℃で一夜攪拌しながら透析
した。上記反応物をTSKゲルＧ−3000SW（東ソー（株）
製、商品名）を用いて高速液体クロマトグラフィーにて
精製し、HRP標識抗体とした。

（Ｃ）試料中のNGFの定量本実施例中の（Ａ）で記述した方法で作製したマイク
ロタイタープレートを室温にもどし、PBS−Ｔ溶液で洗
浄した後、ヒトNGFを含む標準試料を各ウエルにそれぞ
れ20μｌ加えた。つぎに本実施例（Ｂ）で得たHRP標識
抗体をPBS−Ｔ溶液で希釈し、各ウエルに200μｌずつ添
加した。そのまま室温で３時間インキュベートした後、
溶液を除去しPBS−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、1.2
％ 2,2′−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン
硫酸）−ジアンモニウム塩及び0.01％過酸化水素（H
₂O₂）を含有する0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.1）から成る
基質溶液を各ウエルに200μｌ添加し、室温で30分間酵
素反応させた後、200mMシュウ酸溶液を100μｌ加えて酵
素反応を停止させた。

上記マイクロタイタープレートの各ウエルについて、
波長415nm、対照波長492nmの吸光強度を自動マイクロタ
イタープレートリーダー（東ソー（株）製、MPR−A4、
商品名）で測定した。結果を表１に示す。表１から明ら
かなように、試料中のNGFは0.1〜200ng/mlの範囲で定量
できることが確認された。

実施例３抗ヒトNGFβサブユニットモノクローナル抗体による阻
害試験（ａ）PC12細胞の培養（前培養） PC12細胞をプライマリアディッシュ（ベクトン、ディ
ッキンソン社製）に、10⁴cells/cm²の濃度でまき、37
℃、95％air,5％CO₂の雰囲気下で１日培養した。培地
は、５％準胎児生血清、５％馬血清を含むDulbecco Mo
dified Minimum Essential Mediumを使用した。（５
％PFCS、５％HS、DMEMと略す）（実験区１）実験区１として、mouse 2.5S NGF（Sigma社製）を4
0ng/mlの濃度で５％PFCS、５％HS、DMEMに溶解し、前培
養培地と交換し３日間培養した。

（実験区２）実験区２として、mouse 2.5S NGF（Sigma社製）と
ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体clone F3F9（実施例１で調製したも
の）とをそれぞれ40ng/mlの濃度で５％PFCS、５％HS、D
MEMに溶解し、前培養培地と交換し３日間培養した。

（実験区３）実験区３として、大腸菌由来recombinant human NG
Fβsubunitを20μg/mlの濃度で５％PFCS、５％HS、DMEM
に溶解し、前培養培地と交換し３日間培養した。

（実験区４）実験区４として、大腸菌由来recombinant human NG
Fβsubunitと抗ヒトNGFβサブユニットモノクローナル
抗体clone F3F9をそれぞれ20μg/mlの濃度で５％PFC
S、５％HS、DMEMに溶解し、前培養培地と交換し３日間
培養した。

（対照区）対照区としてNGF及びモノクローナル抗体無添加の５
％PFCS、５％HS、DMEMを前培養培地と交換し３日間培養
した。

（結果）実験区１〜４及び対照区における神経線維の伸長を観
察し、その結果をそれぞれ第１〜５図に示した。

図からも明らかなように実験区１と実験区３では、神
経線維の伸長が観察された。しかし、実験区２と実験区
４では、神経線維の伸長は観察されず、対照区と同様の
形態を示し、ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的
に認識するモノクローナル抗体clone F3F9が、mouse
2.5S NGFとrecombinant human NGFβ subunitのPC1
2細胞に対する神経線維伸長作用を阻害することが確認
された。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は、それぞれ実施例３の実験区１〜４及び対
照区における神経線維の伸長の程度を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．, Ｖｏｌ．34，Ｎｏ．11（1986）ｐ．4724 −4730 ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．78，Ｎｏ. ７（1981）ｐ．4611−4615 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳＷＰＩ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的
に認識し、かつヒト神経成長因子βサブユニット及び／
又はヒト神経成長因子の作用を阻害しうることを特徴と
するモノクローナル抗体。
【請求項２】ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的
に認識するモノクローナル抗体で、・固相に固定化されたモノクローナル抗体（Ｉ）・標識されたまたは標識されていないモノクローナル抗
体（II）、及び・標識されていないモノクローナル抗体（II）を使用し
た場合には、モノクローナル抗体（Ｉ）若しくは（II）
の結果生じる免疫反応生成物またはモノクローナル抗体
（II）を特異的に認識する標識された抗体を試料と反応
させ、このときモノクローナル抗体（Ｉ）又は（II）の
少なくとも一方に請求項１に記載のモノクローナル抗体
を用い、次いで固相又は液相の標識を直接的又は間接的
に検出することを特徴とする、試料中のヒト神経成長因
子βサブユニットおよび／又はヒト神経成長因子の測定
方法。
【請求項３】・固相に固定化された、請求項１に記載の
モノクローナル抗体（Ｉ）・標識されたヒト神経成長因子及び／又はヒト神経成長
因子βサブユニット・試料とを反応させ、固相又は液相の標識を直接的または間接
的に検出することを特徴とする、試料中のヒト神経成長
因子βサブユニットおよび／又はヒト神経成長因子の測
定方法。
【請求項４】モノクローナル抗体が、ヒト神経成長因子
βサブユニットに対して10^-7−10^-11Mの親和定数を有す
るものである請求項（２）または（３）に記載の方法。
【請求項５】請求項（１）に記載の抗体から成るヒト神
経成長因子βサブユニット及び／又はヒト神経成長因子
に対する阻害剤。