JPH02219593A

JPH02219593A - モノクローナル抗体、それからなる阻害剤及びそれを用いた測定方法

Info

Publication number: JPH02219593A
Application number: JP1098823A
Authority: JP
Inventors: Satoru Onaka; 悟大仲; Kazuhide Yoshikawa; 和秀吉川; Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1989-04-20
Publication date: 1990-09-03
Anticipated expiration: 2014-11-02
Also published as: JP2969647B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は神経成長因子（ＩＩｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ、以下ＮＧＦとする）β
サブユニットを特異的に認識するモノクローナル抗体、
それから成る阻害剤及びそれを用いた測定方法に関する
ものである。

（従来の技術）ＮＣＦは、胎生期の知覚神経節および交感神経節神経細
胞の分化と成長を促進する作用を持つ、−群のポリペプ
チドである。神経組織以外の組織で産生され、神経組織
に作用するものと考えられ、特に交感神経節神経細胞で
は、成長後もその機能維持に必須の因子である。

ＮＧＦは、α、β、γの３８ｉの異なるサブユニットか
らなる分子ｆｆ１１４００００のホルモン様タンパク質
である。αサブユニットの役割は未だ明確にされておら
ず、γサブユニットはアルギニン特異的ペプチダーゼ活
性を持つセリンプロテアーゼである。βサブユニットは
単独でＮＧＦ活性を発現し、１１８個のアミノ酸残基か
らなる分子量１４０００のペプチド鎖が２分子非共有結
合した２Ｑ体構造をとっており、分子量は約２８０００
である。

動物実験では、筋ジストロフイー症マウス（ｄ　ｙ／ｄ
　ｙ）の願下リンパ腺中のＮＧＦ活性および後肢筋肉中
ＮＧＦ様免疫交叉活性レベルが、発症していないマウス
に比較して有意に減少していることが報告されている。

一方、ＮＧＦに応答し分化する株細胞系としては、１９
７６年、ラット褐色細胞Ｊｌｉｌ（ｐｈ−ｅｏｃｈｒｏ
ｍｏｃｙｔｏｍａ）よりＰＣＩ２細胞が単離されクロー
ンとして樹立された。ＰＣｌ、２細胞はＮＧＦに応答し
、形態的には、長い神経線維を伸ばし、種々の神経細胞
としての機能を高めることが次第に明らかになってきて
おり、この細胞系が、ＮＧＦなどによる分化に伴なう形
質発現の分子機構を明らかにできる絶好の系と考えられ
ている。また、この細胞系は、分化した交感神経細胞の
性質を明らかにする良い系ともなっており、また、神経
分泌細胞のモデルとしても良く用いられている。

（発明が解決しようとする課ｍ＞ＮＧＦの測定法としてはバイオアッセイ法（内分泌実験
講座、ホルモン測定法（上’）　　２６６−２８０頁　
１９８２年）、ポリクローナル抗体を用いた放射免疫測
定法（ジャーナル　オブ　ニューロケミストリー　第１
８巻　２３５５−２３６２頁）、酵素免疫測定法（プロ
シーヂングス　オブ　ナシヨナル　アカデミ−オブ　サ
イエンスＵＳＡ　　第７５巻　４０４２−４０４６頁１
９７８年）が知られている。

従来知られているバイオアッセイ法は、生物活性を指標
としているため最も信頼性のある方法であるが、神経節
の採取などにある程度の習熟を必要とし、様々な神経繊
維伸長パター゛ンがあられれ評価が困難であり、また感
度はせいぜいｌｏｇ／ｍ１程度と比較的低いという問題
がある。

放射免疫測定法、酵素免疫測定法においても、使用する
抗体が必ずしも均一な性質を有していないことから測定
精度に問題がある。

また増殖因子の研究において、その活性阻害剤を用いる
ことは、研究の進歩と深い関わりがある。

しかし、ＮＧＦには生理的条件下で、ＮＧＦの作用のみ
を阻害する適当な阻害剤が知られておらず、この事がＮ
ＧＦ研究の進歩を妨げている。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明者らは従
来技術の問題点を解決するべく、操作が簡単で測定精度
の高いＮＧＦの測定方法及びＮＧＦの阻害剤について鋭
意検討したところ、モノクローナル抗体を使用すること
でこれらの問題点を解決できることを見出だ１、本発明
を完成させた。

すなわち本発明は、 ■　神経成長因子βサブユニットを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体 ■　神経成長因子βサブユニットを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体で、・固相に固定化されたモノクローナル抗体（Ｉ）・標識
されたまたは標識されていないモノクロ−ナル抗体（Ｉ
Ｉ）及び標識されていないモノクローナル抗体（Ｉｆ）を使
用した場合には、モノクローナル抗体（１）若しくは（
Ｉｆ）の結果生じる免疫反応生成物またはモノクローナ
ル抗体（Ｉｆ）を特異的に認識する標識された抗体を試
料と反応させ、固相又は液相の標識を直接的又は間接的
に検出することを特徴とする、試料中の神経成長因子β
サブユニットおよび／又は神経成長因子のｉｌＮ定方法
■　神経成長因子βサブユニットを特異的に認識し、固
相に固定化されたモノクローナル抗体・標識された神経
成長因子及び／又は神経成長因子βサブユニット・試料とを反応させ、固相又は液相の標識を直接的または間接
的に検出することを特徴とする、試料中の神経成長因子
βサブユニットおよび／又は神経成長因子の測定方法 ■　請求項（１）に記載の抗体から成る神経成長因子β
サブユニット及び／又は神経成長因子に対する阻害剤である。以下、その詳細について説明する。

本発明において、ＮＧＦβサブユニットを特異的に認識
するモノクローナル抗体は、それ自体公知である方法（
ジー、ケーラーとシー　ミルシニタイン、ネーチャー、
第２５６巻、４９５頁。

１９７５年）に準じて得ることができる。この方法によ
り、ＮＧＦβサブユニットを特異的に認識する複数種の
モノクローナル抗体を得ることができた。それぞれの抗
体の親和定数は、１０−７〜１０−１１Ｍの範囲内であ
った。またこれらの抗体は、ＮＧＦβサブユニットの異
なる抗原決定部位を認識するものであった。

従ってこれらのモノクローナル抗体を使って、ＮＧＦβ
サブユニットをサンドイッチ法、競争法などにより、定
量的に免疫学的に測定することが可能となり、βサブユ
ニットを定量できることはもちろん、それを通してＮＧ
Ｆを定量的に測定することが可能となった。

例えばサンドイツチ法の場合は、抗体及び試料の添加順
序には特に限定はなく、また、同相と液相との分離回数
にも制限はない。モノクローナル抗体（ＩＩ）は、標識
されていてもいなくてもよい。

標識されている場合は、反応後、その標識を固相又は液
相において検出すればよい。標識されていない場合は、
モノクローナル抗体（１）若しくは（ＩＩ）の結果生じ
る免疫反応生成物又はモノクローナル抗体（ＩＩ）を特
異的に認識する標識化抗体を添加し、その標識を検出す
ればよい。このときの抗体は、例えば抗ＩＧ抗体などが
あげられる。

また、ＮＧＦβサブユニットは２量体構造をとりている
ため、モノクローナル抗体（１）、（ＩＩ）は同じ抗原
決定部位を認識するものであってもよいが、異なるもの
の方が好ましい。

また競争法の場合は、固相に固定化されたモノクローナ
ル抗体（Ｉ）に対し、標識されたＮＧＦ及び／又はＮＧ
Ｂβサブユニットと試料とを同時に反応開始させる必要
がある。そのため、もし標識されたＮＧＦ及び／又はＮ
ＧＢβサブ、ユニットと試料とを同時に添加できない場
合は、先に加えたものが反応しない工夫をするべきであ
る。例えば、一方を加えた時点で凍結乾燥すればよい。

本発明方法に用いられるモノクローナル抗体（１）は固
相に固定化されているが、固相に固定化する方法は公知
の方法を採用することができる。

固相としては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒子、
ラテックス、アガロース、セルロース、ポリメタアクリ
レートなどが使用される。

また本発明で用いられる標識化抗体の作製方法とその検
出方法もなんら限定されるものではなく、公知の方法に
より標識化および検出することができる。標識としては
、直接的に検出されるものとしては、例えば放射性物質
、蛍光物質などがあげられ、間接的に検出されるものと
しては、例えば酵素などがあげられる。酵素として具体
的には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、
β−グルクロニダーゼなどがあげられ、放射性物質とし
ては、３，１２５Ｉ、または１３１１等が、蛍光物質と
しては、例えば、フルオレスカミン、フルオレラセンチ
オシアネート、テトラローダミンイソチオシアネート（
ＴＲＩＴＣ）等があげられ、常法によりモノクローナル
抗体に結合される。

競争法で用いられる標識されたＮＧＦの調製方法も、公
知の方法に従って化学的に結合させれば良く、標識物質
としては例えば上記で説明したものが使用できる。しか
しながら、標識物質は上記物質に何ら限定されるべきも
のではない。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤９反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。

また本発明のモノクローナル抗体から成る阻害剤を使っ
て神経クローン細胞や、神経節細胞の神経成長因子に応
答した神経線維形成を阻害させることが可能となった。

この阻害剤は抗ＮＧＦβサブユニットモノクローナル抗
体から成ればよく、生物学的、薬学的に許容される物質
を含んでもよい。

このときに用いられる神経クローン細胞や神経節細胞と
しては、ＮＧＦに応答して神経線維を形成するものであ
れば特に限定はしないが、例えば前述のＰＣ１２細胞系
が良く用いられる。

−例をあげればＰＣＩ２細胞に対するＮＧＦによる分化
誘導作用を観察する際には、まず細胞を１〜２．５Ｘ１
０　　　ｃ　ｅ　１１　ｓ／ｃｍ　　　にまき、ＮＧＦ
存在下に１夜以上培養することにより行うことができる
。このとき、抗ＮＧＦβサブユニットモノクローナル抗
体から成る阻害剤を用いることにより、神経線維形成の
阻害が観察できる。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように本発明によれば、■抗Ｎ
ＧＦβサブユニットモノクローナル抗体が得られる。

■試料中のＮＧＦ濃度は、０．１〜２００ｎｇ／ｍｌの
範囲内で測定することができ、 ■従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、かつ感
度よく多数の検体の測定が可能である。

■本発明のモノクローナル抗体から成る阻害剤を用いて
神経クローン細胞や、神経節細胞の神経成長因子に応答
した神経線維形成を阻害させることが可能となり、神経
生理学的分野の研究において、該モノクローナル抗体が
果たす役割は非常に重要であると考えられる。

（実施例）以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし本発明
は、これら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１モノクローナル抗体の作成（Ａ）抗原感作動物細胞の調製Ｂａ１ｂ／ｃｖウス（♀）をヒトＮＧＦβサブユニット
で免疫した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全
アジュバントとヒトＮＧＦβサブユニット（特願昭６３
−３５０４２記載の方法で得た大腸菌由来の組換えヒト
ＮＧＦβサブユニット）１００μｇ／匹とを乳化させた
試料１００μｌを投与した。２週間後に追加免疫として
ヒトＮＧＦβサブユニット１００μｇ／匹をフロイント
の不完全アジュバントと乳化させたちの１００μｍをマ
ウス腹腔に投与した。１週間後最終免疫としてヒトＮＧ
Ｆβサブユニット１００μｇ／匹をリン酸緩衝化生理食
塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リン酸緩衝液
、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解したちの１００μｌ
を腹腔内に投与した。３日後この処置マウスの肺臓を無
菌的に取出した。１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣ
８と省略する）を含むＤＭＥＭｌｏｍ　ｌを注射器で吸
い取り２７ゲージの注射針をつけた。肺臓を水冷してお
いたデイツシュに入れ、注射針で数か新入をあけた。注
射針を差し込み還流し膵臓細胞をデイツシュに流出させ
た。流出液をナイロンメツシュで濾過し遠心チューブに
入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離して上澄をす
てた°。細胞ペレット中の赤血球を０．１５Ｍ塩化アン
モニウム溶液（１ｍＭエチレンジアミン４酢酸−２ナト
リウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）を含む０．０１Ｍ
炭酸緩衝液、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し、さら
に細胞ペレットをＤＭＥＭで２回同様に遠心洗浄して牌
細胞とした。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としてはＢａ１ｂ／ｃマウス由来の８−アザ
グアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（以下
Ｓ　Ｐ　２１０と省略する）を使用°した。細胞融合を
行う１週間前まで２０ｕｇ／ｍｌの８−アザグアニン、
１５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭで培養し、その後細胞融合
臼まで１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭを使用した。細胞勘
合直前に、Ｓ　Ｐ　２１０は無菌的にＤＭＥＭで１１０
００ｒｐで１０分間遠心洗浄を２回繰り返し調製した。

（Ｃ）細胞融合上記（Ａ）項で調製した肺臓細胞と上記（Ｉ３）項で調
製した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０００
ｒｐｍ、１０分）し細胞ペレットを集めた。遠心チュー
ブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広げた。

その中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ　（ＭＥＲ
Ｋ社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤＭＥ
Ｍ溶液０．５ｍｌを遠心チューブを回しながら少しずつ
滴下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混
合した後、３０秒に１ｍｌの割合で遠心チューブを回転
しながら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１０回加え
た。つぎにＦｅ２を２ｍｌゆっくりと入れ、１１０００
ｒｐ、１０分間遠心した。細胞ペレットを１５％ＦＣＳ
とｌＸｌ０　　　Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０　　　Ｍ
アミノプテリン、１．６Ｘ１０　　　Ｍチミジンを含む
ＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心洗
浄（１０００ｒｐｍ、１０分間）した。この培養液を９
６ウエルプレート（Ｆａ　１ｃｏｎ＃３０４２）に５×
１０５細胞個／ウェルになるように２００μｌずつ分注
した。３日目ごとにＨＡＴ培地を１００μｌ／ウエル交
換した。３週間後からは、ＩＸＩＯＭヒボキサンチン、
１．６Ｘ１０　　　Ｍチミジンと１５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭ（
以下ＨＴ培地と省略する）を培地交換に用いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１００
日目後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒ
トＮＧＦβサブユニット抗体が存在するかどうか調べた
。

９６ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、ヒトＮＧＦβサブユニット２μｇ／ｍｌを５０ｕ　
１／ウェル分注し、３７℃で１．５時間静置した。ウェ
ルに残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０，０４％ツイ
ーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−
Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（
以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３ｏｏμｍを各
ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブロッキング処理
した。つぎに各ウェルに上記培養上清を１００μｍずつ
分注し３７℃で１．５時間静置した。これらのウェルを
ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識ラビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）４０
００倍希釈を５０μｌ／ウエルずっ分注し、３７℃で１
．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち
、基質溶液（１，２％　２．２−アジノジー（３−エチ
ルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴ
Ｓ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ。）を含有する
０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，１）を各ウェルに１
００μｌ添加した。

３０分間室温で放置し、２００ｍＭシュウ酸溶液１００
μｌを加えて酵素反応を停止させた。

４１５ｎｍでの吸光度を測定し、酵素活性が認められた
ウェルに抗ヒトＮＧＦβサブユニット抗体を産生ずるハ
イブリドーマが存在することがわかる。以上のようにし
て、抗体価の強い抗体産生ハイブリドーマを取得した。

（ＩＥ）コンデショニングメディウムの調製２６ゲージ
の注射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０
、３４Ｍサッカロース溶液を吸い取った。Ｂａ１ｂ／ｃ
マウス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶
液を注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつけ
水冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、１１
０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ペレットに１５％ＦＣＳ−ＤＭＥＭを加え攪拌し
デッシニに入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、０．２２μｍの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。

（Ｆ）クローニング抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０ｍ
１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し、
２００μｍ／ウェルずつ９６ウエルプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ＃３０４２）に分注した。培養１０日目前後から細
胞コロニーが認められるウェルについて、上記（Ｄ）項
に記載した固相酵素免疫測定法をに準じて抗ヒトＮＧＦ
βサブユニット抗体産生ハイブリドーマを選択し、さら
に再度クローニングを繰り返し単一ハイブリドーマを樹
立した。最終的に２７クローンのハイブリドーマを確立
した。

（Ｇ）抗ヒトＮＧＦβサブユニット抗体の精製Ｂａ１ｂ
／ｃ？ウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリスタン（２
，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を０．
５ｍｌ／匹投与した。２週間後上記（Ｆ）項で得られた
抗ヒトＮＧＦβサブユニット抗体産土ハイブリドーマ株
をマウス腹腔内に各クローンについて２×１０６細胞個
／匹移植した。１０日目前後に生成した腹水を、１８ゲ
ージの注射針を腹腔に差し込み、１／２０ｍの０．２Ｍ
−ＥＤＴＡをいれた遠心チューブに滴下させた。遠心チ
ューブを４００Ｏｒ　ｐｍで１０分間遠心し、上清を集
めた。採取した上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画
法にしたがって粗精製し、０．０５％アジ化ナトリウム
を含むＰＢＳ溶液に透析後、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過をおこない精製した。メルカプトエタノ
ール還元下での１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動で１本の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになった
ことで抗体の純度を確認した。

以上の方法により、ヒトＮＧＦβサブユニットを特異的
に認識する複数種のモノクローナル抗体を得た。それぞ
れの抗体の結合定数は１ｏ−７〜１０　　　Ｍの範囲内
であった。

実施例２免疫測定法（Ａ）抗ヒトＮＧＦβサブユニット抗体の固定化未処理
マイクロタイタープレート（９６ウエルφヌンクプレー
ト、インターメッド社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝１ｆＣ（ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ／
ｍｌのマウス由来の抗ヒトＮＧＦβサブユニットモノク
ローナル抗体（実施例１で作製したちの；名称Ａとする
）の溶液２００μ！を加えて、４℃で一夜インキエベー
トした。次に、各ウェルの溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで
３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ
溶液３００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブロッキン
グ処理しそのまま保存した。

（Ｂ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標詭
抗体の調製０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に溶解
したＨＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍ　ｌ）ｌ：１％１−フルオ
ロ−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．１
ｍｌを加え、室温にて１時間反応させた。その溶液に０
．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｍｌを添加し３０
分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０．１
６Ｍのエチレングリコール１．Ｏｍｌを加えて除去した
後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で
透析した。次に、マウス由来抗ヒトＮＧＦβサブユニッ
ト・モノクローナル抗体（実施例１で作製したもの、名
称Ｂとする；モノクローナル抗体Ａとは異なる抗原部位
を認識するもの）５ｍｇを加えて５〜６時間反応させた
。水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４℃で一夜
放置した。この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを
除去するため、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍリン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，１）に対して４℃
で一夜攪拌しながら透析した。上記反応物をＴＳＫゲル
Ｇ−３０００ＳＷ　（東ソー■製、商品名）を用いて高
速液体クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ標識抗体
とした。

（Ｃ）試料中のＮＧＦの定量本実施例中の（Ａ）で記述した方法で作製したマイクロ
タイタープレートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗
浄した後、ヒトＮＧＦを含む標準試料を各ウェルにそれ
ぞれ２０μｌ加えた。

つぎに本実施例（Ｂ）で得たＨＲＰ標識抗体をＰＢＳ−
Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに２００μｌずつ添加した。

そのまま室温で３時間インキュベートした後、溶液を除
去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、１．２％
　２．２゛−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン
硫酸）−ジアンモニウム塩及び０．０１％過酸化水素（
Ｈ２０２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４
，１）から成る基質溶液を各ウェルに２００μｍ添加し
、室温で３０分間酵素反応させた後、２００ｍＭシュウ
酸溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。

上記マイクロタイタープレートの各ウェルについて、波
長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダー（東ソー■製、ＭＰＲ
−Ａ４、商品名）で測定した。結果を表１に示す。表１
から明らかなように、試料中のＮＧＦは０．１〜２００
ｎｇ／ｍｌの範囲で定量できることが確認された。

表１実施例３抗ヒトＮＧＦβサブユニットモノクローナル抗体による
阻害試験（ａ）ＰＣＩ２細胞の培養（前培養）ＰＣ１２細胞をプライマリアデイツシュ（ベクトン、デ
ィッキンソン社製）に、１ｏ４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃
度でまき、３７℃、９５％ａｉｒ、５％ＣＯ２の雰囲気
下で１日培養した。培地は、５％準胎児牛血清、５％馬
血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ　　ＭｏｄｉｆｉｅｄＭｉ
ｎｉｍｕｍ　　ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ　　を
使用した。（５％ＰＦＣＳ。

５％ＨＳＳＤＭＥＭと略す）（実験区１）実験区１として、ｍｏｕｓｅ　　２．５ＳＮＧＦ　（Ｓ
　ｉ　ｇｍａ社製）を４０ｎｇ／ｍｌの濃ｆｆｌ’５％
ＰＦｃｓ、５９６Ｈ３，ＤＭＥＭに溶解し、前培養培地
と交換し３日間培養した。

（実験区２）実験区２として、ｍｏｕｓｅ　　２．５８ＮＧＦ　（Ｓ
　ｉ　ｇｍａ社製）とヒト神経成長因子βサブユニット
を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体ｃｌｏｎｅ　　
Ｆ３Ｆ９　（実施例１で調製した°もの）とをそれぞれ
４０ｎｇ／ｍｌの濃度で５％ＰＦＣ８，５％Ｈ８，ＤＭ
ＥＭに溶解し、前培養培地と交換し３日間培養した。

（実験区３）実験区３として、大腸菌由来ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ｈｕｍａｎ　　ＮＧＦβ５
ｕｂｕｎｉｔを２０μｇ／ｍｌの濃度で５％ＰＦＣＳ、
５％Ｈ８，ＤＭＥＭに溶解し、前培養培地と交換し３日
間培養した。

（実験区４）実験区４として、大腸菌由来ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ｈｕｍａｎ　　ＮＧＦβ５
ｕｂｕｎｉｔと抗ヒトＮＧＦβサブユニットモノクロー
ナル抗体ｃｌｏｎｅ　　Ｆ３Ｆ９をそれぞれ２０　ｕ　
ｇ　／　ｍ　ｌの濃度で５％ＰＦＣＳ。

５％ＨＳ、ＤＭＥＭに溶解し、前培養培地と交換し３日
間培養した。

（対照区）対照区としてＮＧＦ及びモノクローナル抗体無添加の５
％ＰＦＣＳ、５％ＨＳ、ＤＭＥＭを前培養培地と交換し
３日間培養した。

（結果）実験区１〜４及び対照区における神経線維の伸長を観察
し、その結果をそれぞれ第１〜５図に示した。

図からも明らかなように実験区１と実験区３では、神経
線維の伸長が観察された。しかし、実験区２と実験区４
では、神経線維の伸長は観察されず、対照区と同様の形
態を示し、ヒト神経成長因子βサブユニットを特異的に
認識するモノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ　　Ｆ３Ｆ９が
、ｍｏｕｓｅ　　２．５８　　ＮＧＦとｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ｈｕｍａｎ　　ＮＧＦβ　
５ｕｂｕｎｔｔのＰＣ１２細胞に対する神経線維伸長作
用を阻害することが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は、それぞれ実施例３の実験区１〜４及び対
照区における神経線維の伸長の程度を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）神経成長因子βサブユニットを特異的に認識する
モノクローナル抗体。
（２）神経成長因子βサブユニットを特異的に認識する
モノクローナル抗体で、・固相に固定化されたモノクローナル抗体（ I ）・標
識されたまたは標識されていないモノクローナル抗体（
II）及び標識されていないモノクローナル抗体（II）を使用
した場合には、モノクローナル抗体（ I ）若しくは（
II）の結果生じる免疫反応生成物またはモノクローナル
抗体（II）を特異的に認識する標識された抗体を試料と
反応させ、固相又は液相の標識を直接的又は間接的に検
出することを特徴とする、試料中の神経成長因子βサブ
ユニットおよび／又は神経成長因子の測定方法。
（３）神経成長因子βサブユニットを特異的に認識し、
固相に固定化されたモノクローナル抗体（ I ）・標識された神経成長因子及び／又は神経成長因子βサ
ブユニット・試料とを反応させ、固相又は液相の標識を直接的または間接
的に検出することを特徴とする、試料中の神経成長βサ
ブユニットおよび／又は神経成長因子の測定方法。
（４）モノクローナル抗体が、神経成長因子βサブユニ
ットに対して１０＾−＾７〜１０＾−＾１＾１Ｍの親和
定数を有するものである請求項（２）または（３）に記
載の方法。
（５）請求項（１）に記載の抗体から成る神経成長因子
βサブユニット及び／又は神経成長因子に対する阻害剤
。