JPH02126157A - ヒトトランスフォーミンググロースファクターβの免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトトランスフォーミンググロースファクタ
ーβ（Ｔｒａｎｓｒｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａ
ｃｔｏｒ　　β。

以下　Ｔ　Ｇ　Ｆ　　βとする）を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を使用し、た試料中のヒトＴＧＦβの
測定方法に関するものである。

ヒトＴＧＦ　　βは、１１２個のアミノ酸残基で（！〜
成されるポリペプチドの２量体で、分子量２３０００〜
２５０００の蛋白質であり、ガン細胞、肝龜細胞、（共
推芽細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血青内皮細胞など多種の細
胞増殖に関して負の制御因子として機能している。また
ヒトＴＧＦ　　βは、血管形成を誘導１７結合組織を増
殖させ、またコラゲーンの生産を増強し骨形成を促す作
用もある（１ンｏｂｅｒＬｓ、Ａ、Ｂ、ｃｔ　ａｌ、、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ。

８：Ｌ４１６７−４１７１．１９８０）。さらに近年ヒ
ｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ　　βは、細胞増殖に依ａしないで動脈
硬化症を引き起こす原因物質の可能性も考えられている
（星宏良実験医学、Ｇ、０．７３−７４，１９８８）。

一方、癌患者尿中にβタイプのヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆか多量
に１ノ１．泄されているとの報告もある（　Ｎ１５ｈｆ
＋ｕｒａ、Ｒ，ａｔ　ａｌ、、ｊｐｎ、Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ？ｃｓ（Ｇａｎｎ）、７７．５６０−
５６７．１９８６）　ｏ従って尿中あるいは血ｉ（ｋ中
に遊離したヒトＴＧＦ　　βを測定することにより、癌
等の病理診断へ適用できる可能性かある。

（従来の技術） ヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ　　βの測定法としては、ヒトＴＧＦ
の有するＮ　ＲＫ　４９細胞、ＡＫＲ−２Ｂ細胞及びＢ
ａ１ｂ／ｃ３Ｔ３細胞のコロニー形成能に基づいて行う
方法が知られている（　Ａｓ５ｏｔａｎ、Ｉ？、に、ｅ
ｔａｌ、、ＮａＬｕｒｅ、３０９，８０４−８０６．ｔ
９８４；Ｍａｓｓａｑｕｅ、Ｊ、ｅｔａｌ、　　Ｊ、ｌ
３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２Ｇ０．４５５１−４５５４．１
９８５；ＶｏｎＺｏｅｌｃｎ、ｌＥ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２Ｇ１．５００３−５０
０９．１９８Ｇ；Ｍｏｒｌｔａ、Ｈ，ｃｔ　ａｌ、、Ｇ
ａｎｎ、７５，４０３−４０９゜１９８４）。

（発明が解決しようとする課題） 従来知られたヒトＴＧＦのコロニー形成能に基づく測定
方法においては、繁雑な操作を必要とし定量性に欠ける
問題がある。

本発明者らは従来技術の課題を解決し、操作性が簡便で
測定感度の高いヒ）ＴＧＦ　　βの測定方法を提供する
ことを目的とするものである。

（課題を解決するための手段及び作用）本発明者らは上
記課題について鋭意検討したところ、モノクローナル抗
体を使用することでこれら課題を解決することを見出し
、本発明を完成させた。

即ち本発明は、ヒトＴＧＦ　　βを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体で、 ・固相に固定化されたモノクローナル抗体（１）・ｊ票
＋ｌｉされたまたは標識されていないモノクローナル抗
体（ＩＩ） 及び標識されていないモノクローナル抗体（ＩＩ）を使
用した場合には、モノクローナル抗体（ＩＩ）を持５°
（的に認識する標識された抗体を試料と反応させ、固相
又は液相の標識を直接的または間接的に検出することを
特徴とする試料中のヒトＴＧＦβの測定方法にある。ま
た本発明は、ヒトＴＧＦβを特異的に認識し、固…に固
定化されたモノクローナル抗体（１）、標識されたヒト
ＴＧＦ　　β及び試料とを反応させ、固相又は液相の標
識を直接的または間接的に検出することを特徴とする試
ｔ−１中のヒトＴＧＦ　　βの′Ａ−１定方法にある。

本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、それ自体公知である方法（Ｇ、Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒ＆
Ｃ，Ｍｉ　ｌ　ｓ　ｔ　ｅ　ｉ　ｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、２５６，４９５．（１９７５））に準じ
て作製することができる。

以りの方法により、ヒトＴＧＦ　　βを特異的に認識す
る複数種のモノクローナル抗体を得ることができた。そ
れぞれの抗体は、］］０−７〜０−１１という結合定数
の高いものが得られた。

従ってこれらのモノクローナル抗体を使って、ヒトＴＧ
Ｆ　　βをサンドイツチ法。競争法などにより定量的に
免疫学的に４（す定することが可能となった。

例えばサンドイツチ法の場合は、抗体及び試ｔ３１の添
加順序には特に限定はなく、又、固相と液相との分離回
数にも制限はない。即ち、試料、モノクローナル抗体（
１）、（ＴＩ）を順次反応させても、同時に反応させて
もよい。モノクローナル抗体（ＩＩ）は、標識されてい
てもいなくてもよい。

標識されている場合は、反応後、その標識を同相又は液
相において検出すればよい。標識されていない場合は、
モノクローナル抗体（ＩＩ）を特異的に認識する抗体を
添加し、その標識を検出すればよい。このときの抗体は
、例えば抗１ｇＧ抗体なと′かあけ゛られる。まｔ二、
ヒトＴＧＦ　　βは２皿ｆ本Ｉ、Ｘ１．５をとっている
ため、モノクローナル抗体（ｉ）、（ＩＩ）は同じ抗原
決定部泣を認識するものであってもよいか、異なるもの
の方が好ましい。

また競争法の場合、固相に固定化されたモノクローナル
抗体（１）に々・■し、標識されたヒトＴＧＦ　βと試
料とを同時に反応開始させる必要がある。そのため、も
し標識されたヒトＴＧＦ　　βと試ｉｌｌとを同時に添
加できない場へは、先に加えたものか反応しない工夫を
するべきである。例えば、一方を加えた時点で凍結乾燥
すればよい。

本を明方法に用いられる抗体を固相に固定化する方法は
、公知の方法を採用でき、同相としては例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネ
ー１＝　、セファ０一ス粒子。

ラテックス、アガロース、セルロース、ポリメタアクリ
レートなどが使用される。また抗体の標識化の方法とそ
の検出方法もなんら限定されるものでなく、公知の方法
により標識化および検出することができる。標識として
直接的に検出されるものとしては、たとえば放射性物質
、蛍光物質などがあげられ、間接的に検出されるものと
しては、例えば酵素などがあげられる。酵素として具体
的には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ３
　β−グルクロニダーゼなどがあげられ、３　　　１２
５　　　１３１　Ｉ 放射性物質と１７では、　Ｈ，Ｉ。

、−か、蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン
、フルオレッセンチオシアネート、テトラロダミンイソ
チオシアネ−１・等があけげられ、常法によりモノクロ
ーナル抗体に結合される。

競争法で用いられる標識されたヒトＴＧＦ　　βのＪｊ
Ｉｊ方法も、公知の方法に１．たがって化学的にＱ、１
７６させればよく、標識物質として例えば上記で説明し
たものが使用できる。しかしながら、標識物′はは」二
足物質に何ら限定されるべきものではな（１゜ 測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、）λ質、
溶解剤、緩衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の試薬が
用いられる。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のヒトＴＧＦ　β濃度は、０．１〜３２　（１ｎ
　ｇ　／　ｍ　ｌの範囲内で′Ａ１１ｌ定することがで
き、（２）従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に
、かつ感度よく多数の検体の測定が可能である。

（実鞭例） 以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし、本発
明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ （八）抗原感作動物細）１３の調製 Ｂａ１ｂ／ａマウス（♀）をヒＩ−Ｔ　Ｇ　Ｆ　　βで
免疫した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全ア
ジュバントとヒトＴＧＦ　　β１００μｇ／匹とを乳化
させた試料１００μｌを投与した。２週間後に追加免疫
と１．てヒトＴＧＦ　　β１００μｇ／匹をフロイント
の不完全アジュバントと乳化させたちの１００ｕ　ｌを
マウス腹腔に投与した。

１週間後最終免疫としてヒトＴＧＦ　　β１００Ｂ　ｇ
　／匹をリン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣＩ
含イ’ｊ’０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下
ＰＢＳ）に溶解したもの１００μｍを腹腔内に投しノシ
た。３日後この処置マウスの牌；１・ａを無菌的に取出
した。１５％子牛脂児血清（以上１’５９．；ＦＣ８と
省略する）を含むＤＭＥＭＩＯｍ　ｌを注射器で吸い取
り２７ゲージの注射針をつけた。肺臓を氷冷しておいた
デイツシュに入れ、ｌ＋　！１・ｊ針で故か所穴をあけ
た。注射針を差し込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流
出させた。流出液をナイロンメツシュで濾過し遠心チュ
ーブに入れ、１１０００ｒｐで〕Ｏ分間遠心分離して上
澄をすてた。細胞ペレット中の赤血球を０．１５Ｍ塩化
アンモニウム溶ｉ＆（１ｍＭエチレンジアミン４酢酸−
２ナトリウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）を含む０．
０１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し
、さらに細胞ベレットをＤＭＥＭで２回同様に遠心洗浄
して肝細胞とｌ−た。

（１ミ）骨髄腫細胞の調製 ・；゛ｊ髄肺肝細胞してはＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　Ｃマウ
ス由来の８−アザグアニン耐性株として、Ｓ　Ｐ　２１
０Ａｇ１．４（以下５Ｐ２１０と省略する）を使用した
。細胞融合を行う１週間前まで２０　Ｂ　ｇ　／　ｍ　
１の８−アーザグアニン、１５％ＦＣ３を含むＤＭＥＭ
で培養し、その後細胞融合日まで１５％ＦＣＳを含むＤ
ＭＥＭを使用した。細胞融合直前に、Ｓ　Ｐ　２１０は
無菌的にＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで１１００Ｏｒｐで１０分間遠
心洗浄を２回繰り返ｌ−調製（７た。

（Ｃ）細胞融合 」二足（Ａ）で調整した１１Ａ！臓細胞と上記（Ｂ）項
で調製ｌまた骨髄腫細胞を５：１の割合で混合遠心（１
０００ｒｐｍ、１０分）し細胞ベレットを集めた。遠心
チューブを軽くたたいて細胞ベレットを壁面にうずく広
げた。その中に３７℃に暖めておいた５　０９６　Ｐ　
Ｅ　Ｇ　（Ｍ　Ｅ　ＲＫ社製ポリエチレングリコール４
０００）を含むＤＭＥＭ溶液０．５ｍｌを遠心チューブ
を回１２ながら少しずつ滴下した。］−９分ゆっくりと
遠心チューブを回転させ混合した後、３０秒に１ｍｌの
割合で遠心チューブを回転しながら３７℃に加湿してお
いたＤＭＥＭを１０回加えた。つぎにＦｅ２を２ｍｌゆ
っくりと入れ、１．０００　ｒ　ｐ　ｍ　、　　１０分
間遠心した。細胞ペレットを１５９６ＦＣ３とｌＸｌ０
　　　Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０　　　Ｍアミノプテ
リン。

１．６Ｘ１０　　　Ｍチミジンを含むＤＭＥＭ　（以下
ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心洗浄（１０００ｒｐ
ｍ、１０分間）した。この培程液を０６ｗｅｌｌ　　ｐ
ｌａｔｅ　（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４２）に５×１０５細
胞個／ウェルになるように２００μｌずつ分注した。３
０目ごとにＨＡ　Ｔ培地を１００７ｚｌ／ウエル交換し
た。３週間後からは、１．Ｘ１０　　　Ｍヒポキサンチ
ン。

１６Ｘ１０Ｍチミジンと１５９６　Ｆ　ＣＳを含むＤＭ
ＥＭ　（以下ＨＴ培地と省略する）を培地交換に用いた
。

（１））ハイブリドーマの選択 ９６ウエルブレー１・に細１泡コロニーが認められる１
０日［］前後から固＋１１酵素免疫／ＩＩＩ定法を行い
、培養上清に抗ヒトＴＧＦ　β抗体が存在するかどうか
調べた〇 ９６ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、ヒトＴＧＦ　　β２　μｇ　／　ｍ　１を５０μｌ
／ウエル分注し、３７℃で１．５時間静置した。ウェル
に残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイー
ン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ
）で３回洗浄した後、０、＋９．’；ウシ血清アルブミ
ン（以下ＢＳＡ）を溶解１７たＰＢＳ−Ｔ溶液３００μ
ｌを各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブロッキン
グ処理した。

つぎに各ウェルに上記培養」ニ清を１００μｌずつ分注
し３７℃で１．５時間静置した。これらのウェルをＰＢ
Ｓ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ラ
ビット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）４０００
倍希釈を５０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃で１．５
時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、基
質溶液（１，２９５２，２−アジノジ−（３−エチルベ
ンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）
及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含ｒｉ　ｔ　
ル０　、　　Ｉ　Ｍ　’ｙ　エン酸緩１ｉｆｔ（ｐＨ５
，１））を呂ウェルに１００μｍ添加した。３０分間室
温で放置し、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｍを加
えて酵素反応を停市させた。４１５ｎ口１での吸光度を
測定し、酵素活性が認められたウェルに抗ヒトＴＧＦ　
　β抗体を産生ずるハイブリドーマが存在することがわ
かった。以上のようにして、抗体１１ｉの強い抗体産生
／％イブリドーマを取ｊ１、Ｉした。

（＋７）コンデンヨニングメデウムの調整２６ゲージの
＋４−、射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておい
た０、３４Ｍザッカロース溶液を吸い取った。Ｂ　ａ　
ｌ　ｂ　／　ｃマウス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に
腹腔内に上記溶液を注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をっけ
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。水冷
しておいた遠心チュー・ブに上記回収液を流し込み、１
０００　ｒ　ｐ　ｍで５分間遠心分離した。遠心後上清
を廃棄し、細胞ベレットに１５背δＦＣ３−ＤＭＥＭを
加え攪拌しプッシュに入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃
度＋　９５９ｏ湿度で−晩培ｉ＄シた。培養」１消を集
め、０．２２１１ｍのメンブレンフ、イルターで濾過し
、これをコンデショニングメデウムとした。

（Ｉご）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０ｍ
１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに１個になるように上記培を液中に調製し、
２００μｌ／ウエルずつ０６ウエルプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ＃　’３０４２　）に分注した。培徨１０日目前後
から！（Ｉｔ　Ｉｌｌ　ｍ口二一が認められるウェルに
ついて、上記（１））に記載した固用酵索免疫ａｌｌｌ
定法に僧じて抗ヒ１−　Ｔ　Ｇ　Ｆ　　β抗体産生ハイ
ブリドーマを選択し、さらに１１１度クローニングを繰
り返し単一ハイブリド−マを樹立した。

（Ｇ）抗ヒｌ−’ｒ　Ｇ　Ｆ　　β抗体の精製Ｂａ１ｂ
／ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリスタン（２
，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を０．
５ｍｌ／匹投与した。２週間後上記（Ｐ）で？１すられ
た抗ヒトＴＧＦ　β抗体産件ハイブリドーマ株をマウス
腹腔内に各クローンについて２×１０６細胞個／匹移植
した。１０１１１］前後に生成した腹水を、１８ゲージ
の注射針を腹腔に差し込み、１／２０量の０．２Ｍ−Ｅ
ＤＴＡをいれた遠心チューブに滴下させた。遠心チュー
ブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を集めた。

採取した上清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にし
たがって粗精製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含む
ＰＢＳ溶液に透析後、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過をおこない精製した。メルカプトエタノール還
元下での１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で
１本の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになったことて
抗体の純度を確認した。

（１］〉抗ヒトＴＧＦ　　β抗体の固定化未処理マイク
ロタイタープレート（９６ウエル・ヌンクプレート、イ
ンターメッド社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ　／　ｍ　ｌ
のマウス由来の抗ヒ）ＴＧＦ　　β抗体（名称Ａとする
、結合定数１０　　）の溶液２００μｌを加えて、４℃
−夜インキユベートした。次に、各ウェルの溶液を除去
し、リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣＩ　Ｄ
　Ｍ　Ｏｌｏ　１９ｏ　リン酸Ｍ　ｄ＋ｒ　ｉ＆、ｐＨ
７，２：以下ＰＢＳ）に０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅ
ｎ）−２０を含んだ溶液（以下Ｐ　Ｂ　５−Ｔ）で３回
洗浄した後、Ｏｌ】９６ウシ血清アルブミン（以下ＢＳ
Ａ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｍを各ウェルに
加えて、４°Ｃでブロッキング処理しそのまま保存した
。

（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製 ０．３Ｍ！ｒ！炭酸ナトＩＪ　ウムＷＴｈｊ液（ｐＨ８
，１）に溶解したＨ　ＲＰ溶液（５ｍ　ｇ　／　ｍ　１
　）に１％１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンの
エタノール溶ｌｉ＆０．１０１１を加え、室温にて１時
間反応させた。その溶液に０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリ
ウム１．Ｏｍｌを添加し３０分反応させた。未反応の過
ヨウ素酸ナトリウムを０．１６Ｍのエチレングリコール
１．Ｏｍｌを加えて除去した後、０．０１Ｍ４ｉシ酸す
トリウム緩衝液（ｐＨ９，５）て透析した。次に、マウ
ス由来抗ヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ　　β・モノクローナル抗体
（モノクローナル抗体Ａとは異なる抗原部位を認識する
もの、結゛合定数１０　　”　Ｏ）５ｍｇを加えて５〜
６時間反応サセす。水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添
加して４°Ｃ中で一夜放置した。この後、未反応の水素
化ホウ素すｌ・リウムを除去するため、０．８５％塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，１）に対して４℃で一夜攪拌しながら透１１ｒ　
ｌ、た。上記反応物をＴ　Ｓ　Ｋ−ゲルＧ−３０００Ｓ
Ｗ（東ソー株式会社製、商品名）を用いて高速液体クロ
マトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ標識抗体とした。

（Ｊ）試１１中のヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ　　βの定量本実施
例中の（１１）で記述した方法で作製したマイクロタイ
タープレートを室温にもどし、ＰＢＳ＝Ｔ溶液で洗浄し
た後、ヒトＴＧＦ　βを含む標亭試料を各ウェルにそれ
ぞれ２０μｌ加えた。っぎに本実施例（１）で得たＨＲ
Ｐ標識抗体をＰＢＳ−Ｔ溶１ｔＪｉ、で希釈し、各ウェ
ルに２００１！１ずつ嵩加した。そのまま室温で３時間
インキュベートした後、溶−液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液
で３回洗浄した。それに、１．２％　２，２−アジノジ
ー（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウ
ム塩及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する
０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基質溶
液を各ウェルに２００μｌ添加し、室温で３０分間酵素
反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶ｄｋを１００μｍ
加えて酵素反応を停止させた。上記マイクロタイタープ
レートの各ウェルについて、波長４１５％ｍ、対照波長
４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイタープレート
リーダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）
で７１！ｌＩ定した。結果を表１に示す。表から明らか
なように、試料中のヒトＴＧＦ　　βは０．３２３〜３
２０　ｎ　ｇ　／　ｍ　＋の範囲で定量できることが確
認された。

表

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトトランスフォーミンググロースファクターβ
   を特異的に認識するモノクローナル抗体で、・固相に固
   定化されたモノクローナル抗体（ I ）・標識されたま
   たは標識されていないモノクローナル抗体（II） 及び標識されていないモノクローナル抗体（II）を使用
   した場合には、モノクローナル抗体（II）を特異的に認
   識する標識された抗体を試料と反応させ、固相又は液相
   の標識を直接的または間接的に検出することを特徴とす
   る試料中のヒトトランスフォーミンググロースファクタ
   ーβの測定方法。
2. （２）ヒトトランスフォーミンググロースファクターβ
   を特異的に認識し、固相に固定化されたモノクローナル
   抗体（ I ）、標識されたヒトトランスフォーミンググ
   ロースファクターβ及び試料とを反応させ、固相又は液
   相の標識を直接的または間接的に検出することを特徴と
   する試料中のヒトトランスフォーミンググロースファク
   ターβの測定方法。
3. （３）モノクローナル抗体が、ヒトトランスフォーミン
   ググロースファクターβに対して１０＾−＾７〜１０＾
   −＾１＾１の結合定数を有するものである請求項（１）
   または（２）に記載の方法。