JPH0371058A

JPH0371058A - アンジオゲニンの測定方法

Info

Publication number: JPH0371058A
Application number: JP20557489A
Authority: JP
Inventors: Kunitsugu Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-08-10
Filing date: 1989-08-10
Publication date: 1991-03-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、アンジオゲニンに特異的な抗体を利用した試
料中のアンジオゲニンの測定方法に関するものである。

（従来の技術）アンジオゲニンは、ヒト結腸がん細胞ＨＴ　−２９の無
血清培養上清からｆｌｉ−Ｍされたアミノ酸］２３残基
、分子量約１．４４００のタンパク質である（フェット
（Ｆｅｔｔ）ら；バイオケミストリー（Ｂｉ　ｏｃｈｅ
ｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）第２４巻、５４８０ページ、１９
８５年）。本物質は、生体組織中のいたる所において、
血管の増殖や新生を促進すると考えられているが、とり
わけ、腫瘍組織において、血管の新生や増殖を促し、ひ
いては、腫瘍の増殖を促進すると考えられている。

本物質の活性測定方法としては、ニワトリ胚の絨毛膜血
行を司る血管新生、又は、ウサギ角膜血管の伸長など、
実際の生体を用いて、血管の新生や増殖を顕微鏡下に観
察する方法が用いられてきた。これらの方法は生体を用
いるため特別な施設と設備が必要であり、操作も煩雑で
実施することが一般に困難である。”また、操作に時間
がかかり、生体間でのばらつきが大きく、測定感度も十
分ではない。

（発明が解決しようとする課題）本発明の目的は、アンジオゲニンに特異的な抗体を用い
ることによって従来の方法よりもより簡便な操作でかつ
安全に短時間に、くわえて高感度にアンジオゲニンを免
疫学的に測定する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段）本発明のアンジオゲニンの測定法は、アンジオゲニンに
特異的な抗体を用いる免疫学的測定法であり、以下その
詳細について説明する。

アンジオゲニンを特異的に認識する抗体としては、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらも用いる
ことができる。その製法としては、ポリクローナル抗体
は動物にアンジオゲニンを免疫し、その抗血清から得る
ことができる。またモノクローナル抗体は、それ自体公
知である方法（Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、２．５６，４９５．（１９７５））に準
じて得ることができる。この方法により、アンジオゲニ
ンを特異的に認識する複数種のモノクローナル抗体を得
た。それぞれの抗体の結合定数は、１０７〜ＩＯＩＩＭ
−１の範囲内であった。これらの中には、アンジオゲニ
ンの異なる抗原決定部位を認識する抗体も含まれていた
。

これらのポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を
使って、アンジオゲニンを定量的に測定できる競合法又
はサンドイツチ法による免疫学的測定方法が可能となっ
た。

競合法は通常行われているように、Ｃ：標識剤で標識されているアンジオゲニンを認識する
抗体及びＤ＝固定化されているアンジオゲニンを用いて、試料中のアンジオゲニンを測定すればよい。

サンドイツチ法も通常行われているように、アンジオゲ
ニンを認識する抗体で、Ａ：固定化されている第１抗体及びＢ：第１抗体とは異なる抗原部位を認識し、かつ標識剤
で標識されている第２抗体を用いて、試料中のアンジオゲニンを測定すればよい。

このとき、試料、固定化抗体、標識化抗体の添加順序に
は限定がなく、また、１ステツプ法。

２ステツプ法のどちらによっても測定することができる
。

本発明方法に用いられる抗体又はアンジオゲニンを固相
に固定化する方法は、公知の方法を採用でき、固相とし
ては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビ
ニル、ポリカーボネート。

セファロース粒子、ラテックス、アガロース、セルロー
ス、ポリメタアクリレートなどが使用される。また抗体
の標識化の方法とその検出方法もなんら限定されるもの
でなく、公知の方法により標識化および検出することが
できる。標識として酵素を用いる場合、標識物質として
は例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ
。

β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる。放射性物
質としては、３Ｈ，１２５Ｉ、または１３１１等が、蛍
光物質を使用する方法としては、例えば、フルオレスカ
ミン、フルオレッセンチオシアネート、テトラローダミ
ンイソチオシアネート等が常法によりモノクローナル抗
体に結合される。しかしながら、標識物質は上記物質に
何ら限定されるベきものではない。

１１１１１定に使用される試薬は、上記物質以外にも、
基質、溶解剤、緩衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の
試薬が用いられる。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のアンジオゲニン濃度は、１〜４００ｎｇ／ｍｌ
の範囲内で測定することができる。

（２）従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、か
つ感度よく多数の検体の測定が可能である。

（３）本発明のアンジオゲニンのｇ＋＋＋定法は、肚瘍
の診断、治療に応用できる。

（実施例）以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし本発
明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１モノクローナル抗体の製造法（Ａ）抗原感作動物細胞の調製Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（♀）をヒトアンジオゲニンで免疫
した。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュ
バントとヒトアンジオゲニン１００μｇ／匹とを乳化さ
せた試料土００μｍを投与することにより行った。２週
間後に追加免疫としてヒトアンジオゲニン１００μｇ／
匹をフロイントの不完全アジュバントと乳化させたちの
］、　Ｏ０μｍをマウス腹腔に投与した。１週間後最終
免疫としてヒト・アンジオゲニン１００μｇ／匹をリン
酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０，０１
％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解した
ちの１００μｌを腹腔内に投与した。３日後この処置マ
ウスの肺臓を無菌的に取出した。１−５％子牛脂児血〆
１９（以下１５％ＦＣ８と省略する）を含むダルベツコ
モディファイドイーグル培地（以下、ＤＭＥＭとする）
１０ｍｌを注射器で吸い取り２７ゲージの注射針をつけ
た。

肺臓を氷冷しておいたデイツシュに入れ、注射針で数か
新入をあけた。注射針を差し込み還流し肺臓細胞をデイ
ツシュに流出させた。流出液をナイロンメツシュで濾過
し遠心チューブに入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心
分離して上澄をすてた。細胞ペレット中の赤血球を０．
１５Ｍ塩化アンモニウム溶Ｍ（１，ｍＭエチレンジアミ
ン４酢酸−２ナトリウム塩を含むＯ，ＯＩＭ炭酸緩衝戒
、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し、さらに細胞ペレ
ットをＤＭＥＭで２回同様に遠心洗浄して牌細胞とした
。

（Ｂ）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としてはＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウス由来
の８−アサグアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１
４（以下Ｓ　Ｐ　２１０と省略する）を使用した。

細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ／ｍｌの８アザグ
アニン、１５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭで培養し、その後
細胞融合日まで１５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭを使用した
。細胞融合直前に、５Ｐ２１０は無菌的にＤＭＥＭで１
１０００ｒｐで１０分間遠心洗浄を２回繰り返し調製し
た。

（Ｃ）細胞融合上記（Ａ）項で調製した肺臓細胞と」二記（Ｂ）項で調
製した骨髄腫細胞を５；１の割合で混合遠心（１，００
Ｏｒｐｍ、１０分）し細胞ペレットを集めた。遠心チュ
ーブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうすく広げた
。その中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ（ＭＥＲ
Ｋ社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤＭＥ
Ｍ溶液０．５ｍｌを遠心チューブを回しながら少しずつ
滴下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混
合した後、３０秒に１−ｍｌの割合で遠心チューブを回
転しながら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１−０回
加えた。ツぎにＦｅ２を２ｍｌゆっくりと入れ、１１０
００ｒｐ、１０分間遠心した。細胞ペレットを１５％Ｆ
Ｃ８と１．　Ｘ　１．　Ｏ−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ
１０−７Ｍアミノプテリン。

１．６Ｘ１０−５Ｍチミジンを含むＤＭＥＭ　（以下Ｈ
ＡＴ培地と省略する）で２回遠心洗浄（１０００ｒｐｍ
、１．０分間）した。この培養液を９６ウエルプレート
（Ｆａ　１　ｃｏｎ＃３０４２）に５Ｘ１０５細胞個／
ウェルになるように２００μｌずつ分注した。３日日ご
とにＨＡＴ培地を１００μｌ／ウエル交換した。３週間
後からは、ｌＸｌ０−’Ｍヒポキサンチン、１．６Ｘ１
０−５Ｍチミジンと１５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭを培地
交換に用いた。

（Ｄ）ハイブリドーマの選択９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１０日
目前後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ヒ
トアンジオゲニン抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルイムノプレー１・平底（インターメッド社製
）に、ヒトアンジオゲニン２μｇ　／　ｍ　ｌを５０μ
ｍ／ウェル分注し、３７℃で１．５時間静置した。ウェ
ルに残っ・ている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツ
イーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ
−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｍを
各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブロッキング処
理した。

つぎに各ウェルに上記培養上清を１００μｌずっ分注し
３７℃で１．５時間静置した。これらのウェルをＰＢＳ
−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ラビ
ット抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）４０００倍
希釈を５０μｍ／ウェルずつ分注し、３７℃で１．５時
間静置した。ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、基質
溶液（１，２％　２，２−アジノジー（３−エチルベン
ズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩及び０゜０１％
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ５，１））を各ウェルに１００μｍ添加した
。３０分間室温で放置し、２００ｍＭシュウ酸溶液を１
００μｌを加えて酵素反応を停止させた。４１５ｎｍで
の吸光度を測定し、酵素活性が認められたウェルに抗ヒ
トアンジオゲニン抗体を産生ずるハイブリドーマが存在
することがわかった。以上のようにして、抗体価の強い
抗体産生ハイブリドーマを取得した。

（Ｅ）コンデショニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０、３
４Ｍサッカロース溶液を吸い取った。Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　
／　ｃマウス（♂）をを椎脱１２臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつけ
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、１１
０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ペレットに１５％ＦＣ８−ＤＭＥＭを加え攪拌し
プッシュに入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、０．２２μｍの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。

（Ｆ）クローニング抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０ｍ
１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し、
２００μｍ／ウェルずつ９６ウエルプレー）（Ｆａｌｃ
ｏｎ＃：３０４２）に分注した。培養１０日目前後から
細胞コロニーが認められるウェルについて、上記（Ｄ）
項に記載した固相酵素免疫測定法に準じて抗ヒトアンジ
オゲニン抗体産生ハイブリドーマを選択し、さらに再度
クローニングを繰り返し単一ハイブリドーマを樹立した
。最終的に２７クローンのハイブリドーマを確立した。

（Ｇ）抗ヒトアンジオゲニン抗体の精製Ｂａ１ｂ／ｃｖ
ウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を０．５ｍｌ
／匹投与した。２週間後上記（Ｆ）項で得られた抗ヒト
アンジオゲニン抗体産生バイプリドーマ株をマウス腹腔
内に各クローンについて２×１０６細胞個／匹移植した
。１０日目前後に生成した腹水を、１８ゲージの注射針
を腹腔に差し込み、１／２０量の０．　２Ｍ−ＥＤＴＡ
をいれた遠心チューブに滴下させた。

遠心チューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清
を集めた。採取した上滑を５０％硫酸アンモニウム沈殿
分画法にしたがって粗精製し、０．０５％アジ化ナトリ
ウムを含むＰＢＳ溶液に透析後、イオン交換クロマトグ
ラフィー及びゲル濾過をおこない精製した。メルカプト
エタノール還元下での１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動で１本の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドに
なったことで抗体の純度を確認した。

酵素標識法によるヒトアンジオゲニンの１１１１定（Ｈ
）抗ヒＩ・アンジオゲニン抗体の固定化未処理マイクロ
タイタープレー１−（９６ウエルφヌンクプレ−１・、
インターメッド社製）の各ウェルにＯ，１Ｍ炭酸すＩ・
リウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ／ｍｌの
マウス由来の抗ヒトアンジオゲニン抗体（上記（Ｇ）項
で得られたもの９名称ａとする１結合定数］　０”　Ｍ
−’）の溶酸２００μｍを加えて、４℃−夜インギュベ
トシた。次に、各ウェルの溶７夜を除去し、ＰＢＳ−Ｔ
で３回洗浄した後、０．１−％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ
−Ｔ溶液３００μｍを各ウェルに加えて、４℃でブロッ
キング処理しそのまま保存した。

（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製０１３Ｍ重炭酸すトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に溶解
したＨＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）に１％１−フルオロ−
２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．１．　
ｍ　１を加え、室温にて１時間反応させた。その溶７夜
に０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｍｌを添加し
３０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸すトリウムを０
．１６Ｍのエチレングリコール１．Ｏｍｌを加えて除去
した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
）で透析した。次に、マウス由来の抗ヒトアンジオゲニ
ン・モノクローナル抗体（上記（Ｇ）項で得られたもの
１名称すとする。結合定数１０９Ｍモノクローナル抗体
ａとは異なる抗原決定部位を認識するもの）５ｍｇを加
えて５〜６時間反応させた。水素化ホウ素すｌ・リウム
５ｍｇを添加して４°Ｃ中で一夜放置した。この後、未
反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するため、０．８
５％塩化すトリウムを含むユＯｍＭリン酸ナトリウム緩
衝戒（ｐＨ７，１，）に文・１して４℃で一夜攪拌しな
　５６がら透析した。上記反応物をＴ　Ｓ　Ｋ−ゲルＧ３００
０ＳＷ（東ソー株式会社製、商品名）を用いて高速液体
クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ標識抗体とした
。

（Ｊ）試料中のヒＩ・アンジオゲニンの定凰本実施例中
の（Ｈ’）で記述した方法で作製したマイクロタイター
プレー１〜を室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した
後、０−２５０　ｎ　ｇ　／　ｍｌのヒトアンジオゲニ
ンを含む標準試料を各ウェルにそれぞれ２０μｌ加えた
。つぎに本実施例（１）で得たＨＲＰ標識抗体をＰＢＳ
−Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに２００μｍずっ添加した
。そのまま室温で３時間インキュベートした後、溶液を
除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、１．２
％　２．２−アジノジー（３−エチルベンズチアゾリン
硫酸）−ジアンモニウム塩及び０．０１−％過酸化水素
（Ｈ２０□）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，１）から成る基質溶液を各ウェルに２００μｍ添加
し、室温で３０分間酵素反応させた後、２００ｍＭシュ
ウ酸溶液を１００μＩ加えて酵素反応を停止させた。上
記マイクロタイタープレー１・を各ウェルについて、波
長４１．５μｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動
マイクロタイタープレートリーダー（東ソー株式会社製
、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定し、表１の結果を得た
。表１−から明らかなように、試料中のヒトアンジオゲ
ニンは１〜４００ｎｇ／ｍｌの範囲で定量できることが
確認された。

表１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試料中のアンジオゲニンを測定する方法において
、アンジオゲニンを特異的に認識する抗体を用いること
を特徴とする試料中のアンジオゲニンの測定方法。
（２）アンジオゲニンを認識する抗体で、Ａ：固定化されている第１抗体及びＢ：第１抗体とは異なる抗原部位を認識し、かつ標識剤
で標識されている第２抗体を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
測定方法。
（３）Ｃ：標識剤で標識されているアンジオゲニンを認
識する抗体及びＤ：固定化されているアンジオゲニンを用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
測定方法。
（４）抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第１項〜第３項いずれかの項に記載の測定方法。
（５）抗体がポリクローナル抗体である特許請求の範囲
第１項〜第３項いずれかの項に記載の測定方法。