JPH03127997A - ヒト１ｇＥ結合因子に特異的なモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、ヒトＩｇＥ結合因子に特異的なモノクローン
抗体（以下、モノクローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗体と称する
ことがある）、とくに、組換えＤＮＡ操作により動物細
胞に発現させたヒトＩｇＥ結合因子に特異的なモノクロ
ーン抗体、ならびにこれを産生ずるハイブリドーマおよ
びその用途に関する。

本発明のモノクローン抗ＩｇＥ−ＢＦ抗体は、小児アト
ピー性皮膚炎等の重篤なアレルギー性疾患や自己免疫疾
患の診断および治療において有用である。

［従来の技術］ ヒトＩｇＥはアレルギー反応を担う免疫グロブリンであ
り、高ＩｇＥ血症として小児アトピー性皮膚炎などの重
篤なアレルギー性疾患、自己免疫疾患などが知られてい
る。ヒトＩｇＥ結合因子（以下、これをＩｇＥ−ＢＰと
略することがある）に特異的なモノクローン抗体はこれ
らの疾患の診断および治療に有用である。ＩｇＥ−ＢＰ
はリンパ球のＰｃレセプター（以下、これをＦｃｅＲと
略記する）と構造上の共通性を有する可能性が示唆され
ている［代謝臨時増刊号「免疫°８６」、第２３巻、第
５５−６９頁（１９８６年）参照］ことから、ＦｃｅＲ
に特異的なモノクローン抗体の製造に関して種々試みら
れている。例えば、特開昭６３−２５８４９４号公報に
はＦｃｅＲを細胞膜表面上に発現しているヒトＢ細胞株
ＲＰＭＩ８８６６でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫後、脾細
胞をマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕｌと細胞融合して得
られたハイブリドーマよりＦｃ５Ｒに特異的なモノクロ
ーン抗体１−７（γ、ｂ型）、３−５（γ１型）および
８−３０（μ型）を得たことが報告されている。ジャー
ナル・オフ・イムノロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ
Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第１３８（９）巻、第２９７
０〜２９７８頁（１９８７年）には、上記と同様にＲＰ
Ｍ１８８６６細胞で免疫して、ＦｃｅＲに特異的でＩｇ
Ｅの結合を阻害するモノクローン抗体Ｍａｂ２５（Ｉｇ
Ｇｌ型）を得たことが報告されてＬする。

特開昭６０−２５５７３４号公報およびジャーナル・才
プ・イムノロジー、第１３７（４）巻、第１２５８−１
２６３頁（１９８６年）にはヒトＢ細胞株ＲＰＭＩ１７
８８で免疫して、ＦｃｅＲに特異的なモノクローン抗体
Ｈ１０７（ＩｇＧｔｂ型）を得たことが報告されている
。

ＦｃｅＲに特異的なモノクローン抗体を用いて、サンプ
ル中のＩ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐを検出することができる。例
えば、特開昭６１−２８９１００号公報には、ハイブリ
ドーマセルライン２０８．２５Ａ。

４．３／１３５．２０８．２５Ｄ、２．１／１７６およ
び２０８．２５Ｄ、２／９４により分泌されるＦｃｅＲ
に対するモノクローン抗体を用いて試験サンプル中のＩ
ｇＥ−ＢＰを検出する酵素イムノアッセイ（以下、これ
をＥＬ　Ｉ　ＳＡと略記する）について報告されている
（ただし、測定結果は開示されていない）。メディカル
・イムノロジー（ＭｅｄｉｃａｌＩ　ｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ）、第１５（４）、第４０１〜４１０頁（１９８８年
）には、２種のＦｃｅＲに特異的なモノクローン抗体を
用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりリュウマチ患者
と活動期の全身性エリテマトーデス患者の血清中のＩｇ
Ｅ−ＢＰを測定したことが報告されている。

［発明が解決しようとする課題］ アレルギー性疾患や自己免疫疾患の診断や治療を有効に
行なうためには、ＩｇＥ結合因子に特異的なモノクロー
ン抗体を得る必要がある。

特開昭６３−１９８９８８号公報によれば、ＩｇＥ結合
因子はＦｃεＲの３２１個のアミノ酸のうちＮ末端例か
ら１４９個のアミノ酸を削除した残り１７２個のアミノ
酸から成る。

従来、ヒトＢ細胞で免疫して得られた抗体は、ＦｃεＲ
に特異性を有するが、その約１／２のアミノ酸の長さを
持つＩｇＥ結合因子に対して特異的であることは確認さ
れていない。ＩｇＥ結合因子には存在しないＦｃεＲの
アミノ酸配列（１〜１４９番）に対する抗体は診断およ
び治療の特異性の点で問題がある。

しかして、本発明の目的は、アレルギー性疾患や自己免
疫疾患の診断および治療に有用なｒｇＥ結合因子に特異
的なモノクローン抗体を効率よく得ることにある。本発
明の他の目的は、かかるモノクローン抗ｔ　ｇＥ　−Ｂ
　Ｐ抗体を産生ずるハイブリドーマを提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、該モノクローン抗１　
ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体を用いたヒトＩｇＥ結合因子の検出
用試薬を提供することにある。本発明のさらに池の目的
は、該モノクローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗体を用いたヒト［
ｇＥ結合因子の吸着剤を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討した結
果、組換えＤＮＡ操作により動物細胞に発現させた下記
式で示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＥ結合因子
で免疫された動物細胞と、新形成細胞との細胞融合によ
って得られるハイブリドーマ細胞株が所望のモノクロー
ン抗１ｇＥＢＰ抗体を産生ずることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

Ｍｅｔ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　ＶａｌＳｅ
ｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｃｙ
ｓ　　ＡｓｎＴｈｒ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　
　Ｌｙｓ　　Ｔｒｐ　　１ｉｅＡｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｇ
ｉｎ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｔｙｒｙｒ Ｇｉｎ Ａｌａ １ｎ Ｐｒ。

ｈｒ Ｇｌｙ ｓｎ Ｐｈｅ ｉｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ ｓｐ Ｖａｌ Ｃｙｓ １ｙ Ｐｒ。

ｓｐ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ １ｅ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｃｙｓ ｈｒ Ｓｅｒ ｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ ｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ ｉｓ Ｔｒｐ ｓｐ Ｔｒｐ ｓｐ Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ｍｅｔ ｓｎ Ｃｙｓ ５ｐ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ ｉｓ ｓｐ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｌａ １ｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ ｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ ｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒ。

Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ ｉｅ ｓｐ Ｓｅｒ １ｙ Ｃｙｓ ｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒ。

Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒ。

Ｐｒ。

ｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ ｉｓ Ｐｈｅ ｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ｓｎ ｈｒ ｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｍｅｔ ｓｐ ｈｒ Ｃｙｓ ｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｒｐ ｈｒ Ｇｌｕ ｔｙ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｈ４ｓ　　
Ｓｅｒ上記モノクローン抗１ｇＥ−ＢＰ抗体、すなわち
、Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｆ　（可溶性ＦｃεＲ）に特異的な
モノクローン抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞法の取
得は、まずｒ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐをコードする下記式で示
される塩基配列を含むＤＮＡを適当なベクターに組み込
み、動物細胞に該ベクターによりＤＮＡを導入し、動物
細胞に発現されたＴｇＥ−ＢＦを得、ＩｇＥ−ＢＦで動
物を免疫して得られた抗体産生細胞を新形成細胞と融合
させることによって行なわれる。

ＡＴＣ 丁ＣＣＡＧＣＧＧＣ ＡＣＣＴＧＣＣＣＴ ＡＡＴ　　ＴＴＣＣＡＡ ＴＡＣＴＴＣＧＧＣ ＣＡＧ　　ＴＧＧ　　ＧＴＣ ＧＣＣＴＧＴ　　ＧＡＣ ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＣ ＣＣＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＧ ＧＡＧ　　ＴＴＧ　　ＣＡＧ ＴＴＴ　　ＧＴＧ　　ＴＧＣ ＧＡＡ　　　ＡＡＧ　　　ＴＧＧ ＣＧＧ　　ＡＡＧ　　ＴＧＣ ＡＡＧ　　ＧＧＣＡＣＣ ＣＡＣＧＣＣＣＧＧ ＧＡＣＡＴＧ　　ＧＡＡ ＡＧＣＡＴＣＣＡＣ ＣＡＧ　　ＧＡＣＴＴＣ ＡＣＣＡＡＧ　　ＣＡＴ　　ＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣ
ＧＧＣＴＣＣＴＧＧ　　ＡＴＴ　　ＧＧＣＣＴＴ　　Ｃ
ＧＧＡＡＣＴＴＧ　　ＧＡＣＣＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧ
Ａ　　ＧＡＧＴＴＴ　　ＡＴＣＴＧＧ　　ＧＴＧ　　Ｇ
ＡＴ　　ＧＧＧ　　ＡＧＣＣＡＴ　　Ｃ１ＴＧ　　ＧＡ
ＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴ　　ＣＣＡ　　ＧＧ
Ｇ　　ＧＡＧ　　ＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＧＧ　　ＡＧＣ
ＣＡＧ　　ＧＧＣＧＡＧ　　ＧＡＣＴＧＣＧＴＧ　　Ａ
ＴＧ　　ＡＴＧ　　ＣＧＧ　　ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＣＧ
ＣＴＧＧ　　ＡＡＣＧＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＣ
ＧＴ　　ＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＧＣＧＣＣＴＧＧＧＴ
Ｇ　　ＴＧＣＧＡＣＣＧＧ　　ＣＴＧ　　ＧＣＣＡＣＡ
ＴＧＣＡＣＧ　　ＣＣＧ　　ＣＣＡ　　ＧＣＣＡＧＣＧ
ＡＡＧＧＴ　　ＴＣＣＧＣＧ　　ＧＡＧ　　ＴＣＣＡＴ
Ｇ　　ＧＧＡＣＣＴ　　ＧＡＴ　　ＴＣＡ　　ＡＧＡ　
　ＣＣＡ　　ＧＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧ　
　ＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴ　　ＧＣＣＣＣＴ　　ＣＴ
ＣＣＡＣＴＣＴＩｇＥ−ＢＦの発現は、ＩｇＥ−ＢＦ’
をコードする上記式で示される塩基配列を含むＤＮＡフ
ラグメント、例えば、ＳＶ４０初期プロモーターとＩｇ
Ｅ　−Ｂ　ＦのｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメント（両
端にＥｃｏＲｒサイトを有する）［プロシーデインゲス
・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエン
ス・オフ・ザ・ユナイテッド・ステープ・才ブ・アメリ
カ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉ
ｏ−ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　
ｏｆ　ｔｈｅ　ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　ｏｒ　Ａｍ
ｅｒｉｃａ）、第８４巻、第８１９頁（１９８７年）コ
を、プラスミドベクター（例えばプラスミドｐＳ　Ｖ　
２　ｎｅｏ、　［ジャーナル・オフ・モレキュラー・ア
ンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ’　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１巻、第３２７頁］のＥｃｏ
ＲＩ切断サイトに組み込み、得られた発現ベクターを用
いて、常法により、例えばエレクトロボーレイジョンに
より、動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞を形質転換させ
、ついで該形質転換体を常法により培養することにより
ＩｇＥ−ＢＦを発現させる。この培養液から、常法によ
り、例えば限外濾過濃縮、イオン交換クロマトグラフィ
、ゲル濾過、逆相ＨＰＬＣによって精製して所望のＩ　
ｇＥ　−Ｂ　Ｐを単離する。

Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐによる動物の免疫は、ＩｇＥ−ＢＦ
の生理食塩水などの塩類溶液をフロイントの完全アジュ
バントや水酸化アルミニウムなどのアジュバントととも
に混合し、動物の腹腔、皮下などに２回以上投与するこ
とにより行なわれる。最終投与より３日後に動物の膵臓
、リンパ節などから抗体産生細胞が取得される。

免疫する動物としては、細胞融合を行なう抗体産生細胞
と新形成細胞は同種の動物に由来するものを用いるのが
好ましいことから、人手容易な新形成細胞が多数知られ
ているネズミ属、なかでも、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い
ることが好ましい。

新形成細胞としては、融合効率および得られたハイブリ
ドーマのクローニング効率、安定性、増殖性および抗体
産生能の高さ等より、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のミエロ
ーマ細胞株で、かつ、ヒボキサンチン・アミノプテリン
・チミジン感受性を有しているものが好ましい。このよ
うな細胞法の中で、Ｐ　ｓＮ　Ｓ　Ｉ　／　ｌ　　Ａｇ
４　１株［ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ＋８］が特に好ましい
。

抗体産生細胞と新形成細胞の融合は、常法により、融合
剤の存在下に緩衝液中で行なわれる。融合剤としてはポ
リエチレングリコール、センダイウィルス等が用いられ
る。

上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択は、
ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有
する培地（以下、これをＨＡ　Ｔ培地と略記する）中で
融合操作後の細胞を培養することにより行なわれる。Ｈ
ＡＴ培地は、ＲＰＭｌ−１６４０培地などの動物細胞用
培地に牛胎児血清を約１０〜１５％添加し、さらにヒボ
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを通常それ
ぞれ１ｘｌＯ−’Ｍ、４ｘｌＯ−７Ｍ％！、６ｘｌＯ−
’Ｍ添加することにより調製される。ＨＡＴ培地での培
養は、ＣＯ，を５〜８％含む空気中、３７℃で１〜４週
間静置させて行なう。（ｇＥ　−Ｂ　Ｐに対して特異的
なモノクローン抗体を産生ずるハイブリドーマの選別は
、ハイブリドーマ培養上清中のモノクローン抗１ｇＥ−
ＢＰ抗体価をＥＬＩＳＡや放射性免疫測定法（以下、こ
れをＲＩＡ法と略記する）で測定して行なうことができ
る。このようにして得られるハイブリドーマを限界希釈
法によりクローニングして永続的にモノクローン抗Ｉ　
ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体を産生ずるハイブリドーマを得るこ
とができる。

このようにして得られたハイブリドーマ細胞株を適当な
動物細胞用培地で培養することにより、培養上清中にモ
ノクローン抗１ｇＥ−ＢＦ抗体を産生させることができ
る。また、別法として、該ハイブリドーマを、融合に使
用した新形成細胞と同種の動物の体内に移植して動物の
体内でモノクローン抗１　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体を産生さ
せることもできる。

このようにして得られたモノクローン抗体は、ハイブリ
ドーマの培養上清や移植した動物の腹水、血清等の体液
から硫酸アンモニウムによる塩析、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の操作
によって分離精製される。

前記のようにして得られた精製または未精製のモノクロ
ーン抗ＩｇＥ−ＢＦ抗体を含有する検出用試薬をＥＬＩ
ＳＡ法、ＲｔＡ法、蛍光免疫測定法、血球凝集反応法な
どの抗原・抗体反応を利用して抗原を検出する方法にお
いて使用することにより、血清などの試料中に存在する
ＩｇＥ−ＢＦを定性的または定量的に検出することがで
きる。

Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐの検出用試薬はモノクローン抗Ｉｇ
Ｅ−ＢＰ抗体から調製される標識抗体または抗体固定化
担体からなる。標識抗体としては、放射性標識抗体、ビ
オチン標識抗体、蛍光標識抗体および酵素標識抗体が挙
げられる。放射性標識抗体、ビオチン標識抗体および蛍
光標識抗体は標識可能な基、すなわち、放射性原子を有
する基、ビオチン基または蛍光を発する基と抗体のアミ
ノ酸残基と反応するための官能基を有する試薬を、モノ
クローン抗１ｇＥ−ＢＰ抗体と該官能基を介して結合さ
せることにより調製される。このような試薬としては、
ポルトンハンター試薬［アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｓ＋）社製；放射性標識抗体の調製に用いられるコ、ス
ルホスフシミジル　６−（ビオチンアミド）ヘキサノエ
ート（ビオチン標識抗体の調製に用いられる）およびフ
ルオレセイン　５−イソチオシアネート（蛍光標識抗体
の調製に用いられる）が挙げられる。酵素標識抗体は二
官能性架橋剤を用いてその一方の官能基と酵素を、他方
の官能基とモノクローン抗ＥｇＥ−ＢＦ’抗体をそれぞ
れ結合させることにより調製される。調製法としては、
モノクローンＩ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体のアミノ基と担体
のアミノ基とをグルタルアルデヒドで架橋するグルタル
アルデヒド法、過ヨウ素ナトリウムを用いるナカネ法、
Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミ
ドなどのマレイミド化試薬を用いるマレイミド法、ビオ
チン化抗体とアビジン化酵素を用いるアビジン・ビオチ
ン法などが採用される。用いられる酵素としては、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、ウシ小腸アルカリ性ホスファ
ターゼ、ナタマメウレアーゼなどが挙げられる。抗体固
定化担体は、担体にモノクローン抗１ｇＥＢＦ抗体また
は前述の標識抗体を吸着または化学結合により固定化す
ることにより得られる。担体としては、ラテックス粒子
、ビーズ、マイクロプレートなどの形状を有するポリス
チレン、ガラスなどが用いられる。

また、本発明のモノクローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体
は、血清中のＩ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐを吸着除去するために
も用いられる。かかる目的にはＩ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ吸着
剤を用い、血清を処理することにより達成される。

ＩｇＥ−ＢＰの吸着剤は、モノクローン抗１ｇＥ−ＢＦ
抗体を不溶性の担体に固定化することにより得られる。

モノクローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体を固定化する際
に使用される担体としては、体液に不溶性であり、一般
に抗体を固定化する際に用いられるような担体が挙げら
れるが、抗体との間で共有結合を形成させるために利用
し得るアミノ基、カルボキシル基などの反応性の官能基
を有し、かつ親水性の表面を有するものが好ましい。担
体は粒子状、繊維状、シート状、中空糸状などの任意の
形状であることができる。かかる担体としては、例えば
、セルロファインＧＣＬ−２００００（チッソ昧式会社
製）などのセルロース系担体、トリスアクリルＧＦ２０
００［Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ＧＦ２０００＋スウェーデ
ン国ファルマシア・エル・ケー・ビー・バイオテクノロ
ジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）社製コなどのポリアクリルアミド系担体
、ＴＳＫｇｅｌ）ヨバールＨＷ−７５Ｃ（東ソー株式会
社製）などのポリビニルアルコール系担体、ＣＮＢｒ−
セファ０−スＣＬ　　４　Ｂ［ＣＮＢｒ−５ｅｐｈａ　
−ｒｏｓｅＣＬ４Ｂ・スウェーデン国ファルマシア・エ
ル・ケー・ビー・バイオテクノロジー社製］などのアガ
ロース系担体などの有機質担体および多孔性ガラスなど
の無機質担体が挙げられる。

また担体として、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒド
ロキシエチルメタクリレートなどの親水性のアクリレー
ト系もしくはメタクリレート系の単量体をアクリル酸、
メタクリル酸、アミノエチルアクリレートなどのアミノ
アルキルアクリレートまたはアミノエチルメタクリレー
トなどのアミノアルキルメタクリレートと共重合させて
得られる共重合体を多孔性ガラスなどの基材の表面に被
覆して得られる担体（特公昭６１−５９１７５号公報参
照）を使用することもできる。

モノクローン抗１　ｇＥ　−Ｂ　Ｆ抗体の担体への固定
化は一般に抗体を担体に固定化する場合に採用される方
法に従って行なわれる。その固定化方法としては、例え
ば、モノクローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗体のアミノ基と担体
のアミノ基とをグルタルアルデヒドで架橋する方法、担
体のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと
反応させることによってスクシンイミドオキシカルボニ
ル基に変換し、これにモノクローン抗１ｇＥ−ＢＰ抗体
のアミノ基を反応させる方法などが挙げられる。

し実施例コ 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明ｌよこれらの実施例によって何ら限定されるもので（
；ない。

親國剋 ＩｇＥ−ＢＦの発現： 両端にＥｃｏＲＩ切断サイトを有し、かつＳＶ４０初期
プロモーターとＰｃεＲの７９ベースから１５２３ベー
スのｃＤＮＡ（特開昭６３−１９８９８８号公報参照）
を含むＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＳ　Ｖ　２　
ｎｅｏのＥｃｏＲＩ切断サイトに組み込んだ。このベク
ター２０μ９をエレクトロポレーション（１００Ｖ、　
３０　μｓｅｃ、パルス２回）でＣＨＯ細胞株（Ｉ　Ｘ
　１０”個）に感染させ、ネオマイシン（０、６ｘ９／
　＊（１）入り培地（１０％ＦＣＳ　　ＰＲＭＩ）によ
り培養することにより、ＩｇＥ−ＢＰを発現するＣＨＯ
細胞株を得た。

ＣＨＯ細胞法の培養上清を限外濾過濃縮、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相ＨＰＬＣに順次付す
ることにより、２５にダルトンの分子量を有する分画を
得た。この分画のＩｇＥ−ＢＰ生理活性をヨーロピアン
・ジャーナル・オフ・イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉ　ｍｍｕｎ。

１ｏｇｙ）、第１８巻、第９２９〜９３５頁（１９８８
年）に記載の方法により確認した。

実施例１ モノクローン抗１ｇＥ−ＢＰ抗体の調製：（１）抗体産
土細、ａの取得 上記調製例において得られたｒｇＥ−ＢＦ’をｌｘｙ／
ｘ（ｌの濃度で含有するリン酸緩衝液（以下、これをＰ
ＢＳと略記する）を調製し、次いで、これを濾過滅菌し
た。これと等容積のフロイントの完全アジュバントと混
合し、得られたエマルジョンの０　、５　ｘＱをＢ　Ａ
　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注入することによっ
て、該マウスを免疫した。３週間後、上記の滅菌したｔ
ｇＥ−ＢＦ’をｔｏ／ｍ（の濃度で含有するＰＢＳｉｓ
液を、塩化ナトリウム水溶液に水酸化アルミニウムを懸
濁させたもの（水酸化アルミニウム含有率：約１．２％
；塩化ナトリウム濃度：０．１５モル１０と等容積の割
合で混合し、得られた混合物の０　、５　ｚＱを上記の
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注入すること
によって、該マウスを追加免疫した。追加免疫の３日後
に、免疫されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスから膵臓
を摘出し、これをステンレスメツシュ上で粉砕し、メツ
シュを通過した粉砕物中の赤血球を塩化アンモニウムお
よび２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−ブロ
パンジオール（トリス）をそれぞれ０．１４４モル／Ｑ
および０．０１７モル／１２の濃度で含む水溶液（ｐＨ
ニア、２５）に溶血させることによって除去した。赤血
球を除去した脾細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて
３回遠心洗浄した。

（２）細胞融合 上記（１）において得られた脾細胞の５．５Ｘ１０８個
とＰａ　　ＮＳＩ／Ｉ　　Ａｇ４　１法の２．８×１０
’個とを、平均分子ｆｆ１１５００のポリエチレングリ
コール１ｇとＲＰＭＩ−１６４０培地１ｘ（１との混合
液の１ｘＩ２と混合して、３７℃の温度で２分間撹拌し
た。得られた混合物にＲＰＭＩ　−１６４０培地９ｚ（
ｌを撹拌下に徐々に加えたのち、この混合物を遠心分離
することにより、細胞混合物を沈澱物として得た。ＨＡ
Ｔ培地に細胞混合物をｌＸｌ０’個／ｘ（ｌの濃度とな
るように加えた。このようにして得られた細胞を含有す
る培地をポリスチレン製のマイクロウェルプレート［デ
ンマーク国ヌンク（Ｎ　ｕｎｃ）社製、９６ウ工ルマイ
クロウエルプレートフタツキ×９個コの８３０ウエル中
に０　、１　ｘＱ／ウェルずつ分注し、二酸化炭素を７
％含む空気中において３７℃の温度で静置培養した。

培養開始より１０〜２０日後に１２６ウエルにおいてハ
イブリドーマの増殖が認められた。

（３）ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＥ−ＢＰに特異的な抗体
を産生ずるハイブリドーマの選別上記調製例で得られた
ＩｇＥ−ＢＦを０．０１ｊＩ９／Ｉ（２含有するＰＢＳ
溶液をポリ塩化ビニル製のマイクロウェルプレート［米
国ベクトンーディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂ
　ｅｃｔｏｎ　−Ｄ　１ｃｋｉｎ−ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ）社製、ファルコン（Ｆ　ａｌｃｏｎ）　
３９１２．９６穴プレートコのウェルに５０μＱ／ウエ
ルずつ分注し、４℃の温度で一晩静置することによりＩ
ｇＥ−ＢＰをプレートに吸着させた。

各ウェルから溶液を除去したのち、牛脂児血清を５容量
％含有するＰＢＳ溶液を３００Ｊｔ（２／ウエルずつ分
注し、３７℃の温度で２時間静置することにより、Ｉｇ
Ｅ−ＢＰが吸着していない固相表面のブロッキングを行
なった。牛脂児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で各
ウェルを洗浄したのち、上記（２）においてハイブリド
ーマの増殖が認められた培地の上滑を５０μＱ／ウエル
ずっ各ウェルに分注し、３７°Ｃの温度で１時間静置し
、次いで牛脂児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で各
ウェルを洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
したマウス免疫グロブリンに対する抗体［イギリス国ア
マジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アンチマウス■ｇ
１ペルオキシダーゼリンクド、スピーシーズスペシフィ
ック・ホール・アンチボディ（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅｌ
ｇｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−１ｉｎｋｅｄｑＳｐｅｃｉ
ｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｗｈｏｌｅ　Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ）］を牛脂児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液に約
２μ９／ＩＩＱの濃度で溶解し、この溶液を５０μＱ／
ウエルずつ各ウェルに分注し、３７℃の温度で１時間静
置した。各ウェルをＰＢＳで洗浄したのち、２゜２°−
アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）を１ミリモル／Ｑ含有し、かつ過酸化水素を０
．００４５重量％含有するトリス緩衝溶液（ｐＨニア、
４）を１００μｍ２／ウエルずつ各ウェルに分注し、室
温下で１５分間振盪することによって発色操作を行なっ
た。各ウェル中の溶液について波長４０９ｎｍと５０１
ｎｍにおける吸光度を測定した。

上記の吸光度測定の結果、上記（２）でハイブリドーマ
の増殖が認められた１２６ウエル中の培地のうちの２ウ
エル中の培地の上清に由来する溶液について、４Ｑ９ｎ
ｍと５Ｑ１ｎｍにおける吸光度の差が大きく、この２ウ
エル中のハイブリドーマがＩｇＥ−ＢＦに特異的な抗体
を産生していると判断した。

（４）ハイブリドーマのクローニング 上記（３）で得られたＩｇＥ−ＢＰに特異的な抗体を産
生ずるハイブリドーマについて限界希釈法によりクロー
ニングを行なった。すなわち、このハイブリドーマを５
０個／ｘＱ、　　１０個／ｌｅおよび５個／１１２の濃
度となるように牛脂児血清を約１３容量％含有するＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で希釈し、これらの５０個／１１２
，１０個／Ｉ（２および５（１１／ｘ１２の濃度の希釈
液をそれぞれポリスチレン製のマイクロウェルプレート
［デンマーク国ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、９６ウエルマ
イクロウエルプレートフタツキ］の４０ウエル、３２ウ
エルおよび２４ウエルに０　、１　ｘ（１／ウエルずつ
分注し、二酸化炭素を７％含有する空気中において３７
°Ｃの温度で静置培養した。培養開始より２〜４週間後
にコロニーが出現した各ウェルの培養上清について、上
記（３）におけると同様なＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によりＩ　
ｇＥ　−ＢＦに対する抗体価を測定し、Ｉ　ｇＥ　−Ｂ
　Ｆに特異的な抗体の産生能が高い２細胞株を取得した
。これらをＥ７０株（微工研菌寄第１１０１２号）およ
びＥ７１味（微工研菌寄第１１０１３号）と命名した。

（５）抗体のサブクラスの決定 上記（４）で得られた２細胞株が産生ずるモノクローン
抗体のサブクラスをＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により決定した。

すなわち、２細胞法の培養上清をそれぞれマウス免疫グ
ロブリン用検定キット［米国ザイメット（７，ｙａ＋ｅ
ｄ）社製、ＭｏｎｏＡｂ　−Ｉ　Ｄ　Ｅ　Ｉ　Ａキラ）
（ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ　　ＥＩＡ　　Ｋｉｔ）］を用い
て検定した結果、Ｅ７０株が産生ずるモノクローン抗体
はＩｇＧ＋（に）サブクラスに、２７１１２が産生ずる
モノクローン抗体はＩｇＧ２ａ（に）サブクラスにそれ
ぞれ属すると判定した。

（６）モノクローン抗体の精製 上記（５）で得られた２細胞株をそれぞれ濃度が５ＸＩ
Ｏ’個／ｆｆ（！となるように牛脂児血清を約１３容量
％含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中に！！濁し、二酸
化炭素を７％含有する空気中において３７℃の温度で培
養した。培地中の細胞の濃度がｌＸｌ０″個／Ｎ＆以上
となった時点で培養族を遠心分離することに上り上清を
得た。マウスｒｇＧに対するヤギ抗血清［イスラエル国
バイオーイエダ（Ｂ　ｉｏ　−Ｙ　ｅｄａ）社製、アン
チ−マウスＩｇＧ（Ｈ＋ＬＸＡｎｔｉ　Ｍｏｕｓｅ　Ｉ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ））］を硫酸アンモニウムで塩析すること
によってマウスＩｇＧに対する抗体を得、このマウスＩ
ｇＧに対する抗体をアガロース系担体（スウェーデン国
ファルマシア社製、ＣＮＢｒ−セファロースＣＬ　　４
Ｂ）に固定化してマウスＩｇＧ用吸着体を得た。このマ
ウスＩｇＧ用吸着体を用いて前記の２細胞法の培養上清
のうちの３００ｘＱずつをアフィニティクロマトグラフ
ィに付した。マウスＩｇＧ用吸着体におけるモノクロー
ン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗体をグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ：
２．５）で溶出させることによって、該モノクローン抗
ＩｇＥ−ＢＰ抗体をそれぞれ約５ｘｇ得た。

実施例２ ビチオン標識モノクローン抗体の作成：Ｅ７０株または
Ｅ７１株によって産生され、上記方法によって精製され
たモノクローン抗ＩｇＥ−ＢＦ抗体の約２朽ずつをそれ
ぞれ０．１ミリモル／Ｑの濃度の炭酸水素ナトリウム水
溶液の２ｘＱに溶解し、この溶液にスルホスクシンイミ
ジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート［米国ピア
ス・ケミカル（ＰＩＥＲＣＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ）社製
、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩ
Ｎ）］を１１９／Ｍ（ｌの濃度で含有するジメチルホル
ムアミド溶液２００μＱを加え、混合液を室温で４時間
静置した。得られた各混合液を４℃の温度でＰＢＳに対
して透析することにより、ビチオンで標識したモノクロ
ーン抗１ｇＥ−ＢＦ抗体を含有するＰＢＳ溶液をそれぞ
れ得た。

実施例３ モノクローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法
によるＩｇＥ−ＢＰの検出： Ｅ７０株またはＥ７１株によって産生され、実施例１−
（６）の方法によって精製されたモノクローン抗１　ｇ
Ｅ　−Ｂ　Ｐ抗体を０　、０５　ｘ９／ｘＱの濃度で含
有するＰＢＳ溶液をポリスチレン製のマイクロウェルプ
レート（米国ベクトンーディッキンソン・アンド・カン
パニー社製、ファルコン３９１５．９６穴プレート）の
ウェルに５０μＱ／ウエルずつ分注し、４℃の温度で一
晩静置することによってモノクローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗
体をプレートに吸着させた。各ウェルから溶液を除去し
たのち、牛脂児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液を３
００μ（！／ウェルずつ分注し、３７℃の温度で２時間
静置することによって、モノクローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗
体が吸着していない固相表面のブロッキングを行ない、
次いで各ウェルを牛脂児血清を５容量％含有するＰＢｓ
ｓ液で洗浄した。

次に、ＩｇＥ−ＢＦを含む試料を５０μＱずつ各ウェル
に注ぎ、３７℃で２時間静置し、次いで各ウェルを牛胎
児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。

実施例２で得られノニビチオンで標識したモノクローン
抗１　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体を含有するＰＢＳ溶肢を用い
て、該ビチオンで標識したモノクローン抗Ｉ　ｇＥ　−
Ｂ　Ｐ抗体および牛胎児血清をそれぞれ２μ’ｉ／Ｒ（
ｌおよび５容量％の濃度で含有するＰＢＳ溶液を調製し
、得られたＰＢＳ溶液を５０μＱ／ウエルずつ各ウェル
に分注し、３７℃の温度で１時間静置し、次いで各ウェ
ルを牛胎児血清を５容量％含有するＰＢＳ溶岐で洗浄し
た。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したストレプト
アビジン［米国ビー・アール・エル（ＢＲＬ）社製、ス
トレプトアビジン−ホースラデイツシュ・ペルオキシダ
ーゼ・コンジュゲート（Ｓ　ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−
ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ）］を牛脂児血清を５容量％含有する
ＰＢＳ溶肢で約５００倍に希釈し、この希釈溶液を各ウ
ェルに５０μｍ２／ウエルずつ加えたのち、３７℃の温
度で１時間静置した。

各ウェルをＰＢＳで洗浄したのち、２．２’−７ジノー
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
をｌミリモル／１２含有し、かつ過酸化水素を０．００
４５重量％含有するトリス緩衝溶液（ｐＨニア、４）を
！００μＱ／ウェルずっ各ウェルに分注し、室温下で１
５分間振盪することによって発色操作を行った。

各ウェルの波長４０９ｎｍと５０１ｎｍの吸光度を測定
し、両波長における吸光度の差を求めた。既知濃度のｆ
ｇＥ−ＢＰを試料として加えて得られた検量線の一例を
第１図と第２図に示す。

実施例４ ＩｇＥ−ＢＰの吸着剤の作成−Ｉ： 臭化シアンで活性化されたアガロース粒子（スウェーデ
ン国ファルマシア社製、ＣＮＢｒ−セファロースＣＬ４
Ｂ）の１９（乾燥重量）を塩化ナトリウムおよび炭酸水
素ナトリウムをそれぞれ０．５モル／Ｑおよび０．１モ
ル／ｅの濃度で含有する水溶液（ｐＨ：８．３）で洗浄
し、得られた懸濁物を吸引濾過した。得られたゲルを実
施例１−（６）におけると同様な方法で得られたＥ７０
株によって産生されたモノクローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　
Ｐ抗体を７ｊＩ９含有し、かつ塩化ナトリウムおよび炭
酸水素ナトリウムをそれぞれ０．５モル／Ｑおよび０．
１モル／１２ノ濃度で含有する水溶液（ｐＨ：８，３）
の１０ｏ２に加え、得られた混合物を４℃の温度で一晩
撹拌した。撹拌終了後、混合物を吸引濾過した。濾液に
ついて波長２８Ｏｒ＋ａ＋における吸光度を測定したが
、モノクローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｆ抗体に基づく吸収
は認められなかった。得られたゲルをグリシンを１モル
／ｇ含有するＰＢＳ溶液の１０ｗｒｌ中に加え、この混
合物を４℃の温度で一晩撹拌した。得られた混合物をＰ
ＢＳ溶液で洗浄し、吸引濾過すること１こよって、モノ
クローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体の７ｍｇが固定化さ
れたアガロース粒子のゲルを約３．５ｇ得た。

実施例５ Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐの吸着剤の作成−■：５０容量％の
ジオキサン水溶液の１５ｘＣにエピクロルヒドリン２．
５　ｘＱを加えて撹拌した。得られた溶液を、セルロー
ス粒子（チッソ株式会社製、セルロファインＧＣＬ−２
０００Ｃ）を含水させて得られたゲルの１０９および２
規定の水酸化ナトリウム水溶液６　、５　ｘ（ｌと混合
し、混合物を４０℃の温度で２時間撹拌した。得られた
混合物を水洗し、吸引濾過した。得られたゲルのうちの
８゜３ｇを２５〜２８重量％のアンモニア水溶液１６゜
８Ｊ１１２と混合し、この混合物を４０℃の温度で２゜
５時間撹拌した。得られた混合物を水およびジオキサン
で順次洗浄し、吸引濾過することによって、ジオキサン
を含有するゲルを得た。このゲルの７゜５３９を、無水
コハク酸１．６ｇとジオキサン２４ｚ（ｌとからなる溶
液と混合し、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた混
合物をジオキサンで洗浄し、吸引濾過した。得られたゲ
ルの７．４５９をＮ−ヒドロキシコハク酸イミド０．３
５８９、ジシクロへキシルカルボジイミド０．７７１９
およびジオキサン２９．８ｚ１２と混合し、混合物を室
温下で−晩撹拌した。得られた混合物をジオキサンおよ
び１０ミリモル／ｇのリン酸塩緩衝液（ｐＨニア、４）
で順次洗浄し、次いで吸引濾過した。得られたゲルのう
ちの３．５ｇを、実施例１−（６）におけると同様な方
法によって得られたＥ７１株によって産生されたモノク
ローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ抗体の７１９およびｌＯミ
リモル／１２のリン酸塩緩衝液（ｐＨニア、４）１５村
と混合し、混合物を４℃の温度で一晩撹拌した。得られ
た混合物を吸引濾過した。濾液について波長２８０ｎｍ
における吸光度を測定したが、モノクローン抗１　ｇＢ
　−Ｂ　Ｆ抗体に基づく吸収は認められなかった。得ら
れたゲルをＰＢＳで洗浄し、吸引濾過することによって
、モノクローン抗ｒｇＥ−ＢＦ抗体の７１１９が固定化
されたセルロース粒子のゲルを約３．５９得た。

実施例６ ＩｇＥ−ＢＰの吸着実験 ＩｇＥ−ＢＰを約１０１９７１（ｌの濃度になるように
加えたヒト血清１ｘ（ｌに実施例４および実施例５で得
られたＩ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ吸着剤を５０ｇ＋９づつ加え
、３７℃で３時間インキュベートした。遠心して得られ
た上清中のＩ　ｇＥ　−Ｂ　Ｆの濃度を実施例３と同様
のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により測定した。

比較のために実施例４およびと実施例５においてモノク
ローン抗ＩｇＥ−ＢＰ抗体の代わりにマウスＩｇＧを固
定化した吸着剤についても同様の吸着実験を行なった。

結果をまとめて第１表に示す。

第１表 上清中の 固定化担体　　担体　　ＩｇＥ−ＢＰの濃度（ｎｙ／ｘ
（２） 実施例４ Ｅ７０株より 産生された 抗体 アガロース ＜０．５ 実施例５ Ｅ７１株より 産生された 抗体 セルロース 〈０，５ 比較例　　マウスＩｇＧ　　アガロース　ｌＯ〃　　　
　　〃　　　セルロース　　９［発明の効果］ 本発明によれば、新規なハイブリドーマ細胞株を用いる
ことにより、Ｉ　ｇＥ　−Ｂ　Ｐ　（可溶性ＦｃεＲ）
に特異的な新規なモノクローン抗体か効率的に製造され
る。該モノクローン抗体はＩ　ｇＥ　−ＢＦの検出用試
薬およびＩｇＥ−ＢＰ除去用吸着剤において利用される
。このＩｇＥ−ＢＰ除去用吸着剤を使用することにより
、ＩｇＥ−ＢＰを血清中より除去することが可能である
。

【図面の簡単な説明】

第１図は固相化抗体としてＥ７０株産生モノクローン抗
ＩｇＥ−ＢＰ抗体を用い、ビオチン標識抗体としてビオ
チン標識のＥ７１株産生モノクローン抗Ｉ　ｇＥ　−Ｂ
　Ｐ抗体を用いた場合の検量線の一例を示す。 第２図は固相化抗体としてＥ７１株産生モノクローン抗
ＩｇＥ−ＢＰ抗体を用い、ビオチン標識抗体としてビオ
チン標識のＥ７０株産生モノクローン抗１ｇＥ−ＢＰ抗
体を用いた場合の検量線の一例を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＩｇＥ結合因子に特異的なモノクローン抗体。 ２、該ヒトＩｇＥ結合因子が下記式で示されるアミノ酸
   配列を有し、組換えＤＮＡ操作により動物細胞に発現さ
   せたヒトＩｇＥ結合因子である請求項第１項に記載のモ
   ノクローン抗体。 【遺伝子配列があります】 ３、該モノクローン抗体が、ヒトＩｇＥ結合因子で免疫
   されたＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞とＰ＿３−ＮＳＩ／１
   −Ａｇ−１法の細胞融合により形成されたハイブリドー
   マより生成され、マウスＩｇＧ１型である請求項第１項
   に記載のモノクローン抗体。 ４、該モノクローン抗体が、ヒトＩｇＥ結合因子で免疫
   されたＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞とＰ＿３−ＮＳＩ／１
   −Ａｇ−１法の細胞融合により形成されたハイブリドー
   マより生成され、マウスＩｇＧ２ａ型である請求項第１
   項に記載のモノクローン抗体。 ５、請求項第１項ないし第４項のいずれか１つに記載の
   モノクローン抗体を産生するハイブリドーマ。 ６、請求項第１項ないし第４項のいずれか１つに記載の
   モノクローン抗体を使用するヒトＩｇＥ結合因子の検出
   用試薬。 ７、請求項第１項ないし第４項のいずれか１つに記載の
   モノクローン抗体を不溶性の担体に固定化してなるヒト
   ＩｇＥ結合因子の吸着剤。