JPH0441307B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0441307B2 JPH0441307B2 JP58102394A JP10239483A JPH0441307B2 JP H0441307 B2 JPH0441307 B2 JP H0441307B2 JP 58102394 A JP58102394 A JP 58102394A JP 10239483 A JP10239483 A JP 10239483A JP H0441307 B2 JPH0441307 B2 JP H0441307B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tgf
- antibody
- growth factor
- transforming growth
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はトランスホーミンググロスフアクター
（Transforming Growth Factor；以下、TGFと
いう）の酵素免疫測定法に関する。 TGFは、ヒトおよびけつ歯動物のガン細胞で
つくられ、正常細胞に細胞形態学的に特異な変質
（形質転換および増殖）をさせるポリペプチドで
ある。ヒトおよび動物の正常細胞は、軟寒天培地
においてはコロニーを形成しないが、これに
TGFを加えるとコロニー形成能を有するように
なる。1979年ジ・ゼ・トダロら〔Proc.Natl.
Acad.Sci.、75、4001（1978）〕により、肉腫細胞
の培養上清から始めてTGFの存在が報告されて
以来、多数のTGFがヒトおよびけつ歯動物の培
養ガン細胞およびガン患者のガン組織からも発見
されている〔ロバーツ・エ・ビら；Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、77、3494（1980）〕。最近、デ
イ・アル・タージツクら〔JNCL、69、793
（1982）〕およびジ・ゼ・トダロら〔Cancer
Res.、43、403（1983）〕は、ガン患者の尿から分
子量約30000〜35000の高分子型TGFを抽出して
いるが詳しい物性は末だ明らかでない。 従つてまた、TGFと類似している種々のグロ
スフアクターを明瞭に識別する適切な手段がな
く、TGFを判定するに当つて、TGFの有する正
常細胞のコロニー形成能に基いて行なつていたに
すぎず、かつ煩雑な操作をも必要とするが、定量
性に欠けるものであつた。さらにTGFの体液、
例えば血液、尿などにおける存在、含有量、さら
にその消長などに関してあまり報告されていない
ものであつた。 本発明者らは、先に、高分子型のTGFは正常
人尿には存在せず、ガン患者尿のみ特異的に存在
すること、しかもこのものが正常細胞に対して前
述のような生物学的活性を有するもので極めて主
要な物質と考えて研究した結果、種々のガン患者
の尿を透析して無機イオンその他の低分子物質を
除去し、さらに必要に応じてゲル過した後、次
いで陽イオン交換体を用いてクロマトグラフイー
または／および吸着クロマトグラフイーを行な
い、極めて高純度に精製されたヒトTGFを得た
ものである（特願昭58−61102号明細書（特開昭
59−186994号）参照）。 さらに本発明者らは研究し続けた結果、この
TGFを用いてヒト以外の哺乳動物に注射して免
疫せしめ、その血液を採取してこのTGFに対す
るヒトTGF抗体が良好に得られることを知り、
さらに研究の結果、免疫させた哺乳動物の脾臓を
摘出し、その抗体産生能を有する単細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合せしめることによりTGFに対
するヒトTGF抗体としてのモノクロナール抗体
産生細胞を得、その培養物からヒトTGF抗体を
良好に得ることを完成した。さらに本発明者ら
は、得られたヒトTGF抗体を不溶性担体に固定
化せしめて固定化ヒトTGF抗体を得、またヒト
TGF抗体と酵素とを結合せしめて酵素標識ヒト
TGF抗体の結合体を得、TGFを含有する被検液
中のTGFの定量における、上述の固定化TGF抗
体および酵素標識TGF抗体を用いるサンドイツ
チ法による酵素免疫測定法（EIA）を確立した。 本発明は、上記の知見に基いて完成したもの
で、固定化TGF抗体と被検液とを反応せしめ、
次いで酵素標識TGF抗体を反応せしめた後、固
相と液相とを分離し、その分離したいずれか一方
の酵素標識の量を定量する方法において、該トラ
ンスホーミンググロスフアクターがニンヒドリン
反応陽性、SDS−電気泳動において単一であり、
酸および熱に対して安定で、トリプシンおよびジ
チオスレイトール処理により失活し、ゲル過に
より推定分子量28000〜35000を示す理化学的特性
を有するものであることを特徴とする被検液中の
TGFの酵素免疫測定法である。 まず本発明における固定化ヒトTGF抗体およ
び酵素標識ヒトTGF抗体に用いられるヒトTGF
抗体を得るためのヒトTGFは、例えば肺癌、絨
毛腫瘍、胃癌、咽頭癌、結脹癌、乳癌、黒色肉
腫、卵巣癌などのガン患者の尿を原料として精
製、回収することが簡便である。これらのガン患
者尿からのTGFの精製手段について例示すると、
集められたガン患者尿は、まず低分子の不純物を
除くため、水を透析外液として透析膜の分子量カ
ツト約10000以下の膜を用いて透析する。次いで
得られた透析内液は、必要に応じて、凍結、融解
を反復して不純物を析出させ、遠心分離や５ミク
ロン程度の細孔を有するフイルターを通して微細
な沈澱の粒子を除去してもよい。さらに必要に応
じて、透析内液は、バイオゲル（Biogel）ｐ−
60、ｐ−100（バイオラド社製）、セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−50（フアルマシア社製）などの
ゲル過剤にてゲル過してTGF活性を示す画
分を集めればよい。この際、TGF活性を示す画
分としては、推定分子量28000〜35000の位置に存
在し、後述する試験法によつて識別することがで
きる。次いで、前述の尿の透析内液またはゲル
過して集めた活性画分について、イオン交換クロ
マトグラフイーや分子篩膜例えば分子量10000〜
20000程度の限過膜による分子篩処理や吸着ク
ロマドグラフイーの少なくとも１以上の操作また
はこれらの操作を組み合せて精製されたTGF活
性画分が採取される。イオン交換クロマトグラフ
イーは、例えばCM−セフアデツクス
（Sephadex）（フアルマシア社製）、SP−セフア
デツクス（Sephadex）（フアルマシア社製）、
CM−52（ワツトマン社製）、バイオ・レツクス
（Bio−Rex）70｛バイオ・ラド社製）などの陽イ
オン交換体を基材としたカラムを用いて、上記の
TGF含有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次
濃度を上昇勾配させた中性塩、好ましくは塩化ナ
トリウムの水溶液を用いて傾斜溶出して、その
TGF活性画分を回収すればよい。次いで好まし
くは分子量10000〜20000程度の限外過膜を用い
て濃縮、脱塩を行なえばよい。さらに吸着クロマ
トグラフイーとしては、例えばシンクロパツク
（Synchropak）PRシリーズ（シンクローム社製）
の炭素数３〜20のアルキル基のような疏水性基で
修飾されたシリカゲルやMCI Gel CH20Pシリー
ズ（三菱化成工業社製）、アンバーライト
（Amberlite）XADシリーズ（アンバーライト社
製）のようなポリスチレン系ハイポーラス吸着樹
脂などの基材のカラムを用いて、上記のTGF含
有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次濃度を上
昇勾配させた親水性中性有機溶媒、例えばエタノ
ール、プロピルアルコールのような低級脂肪族ア
ルコールまたはアセトン、アセトニトリルのよう
な低級脂肪族ケトンなどの水溶液を用いて傾斜溶
出して、そのTGF活性画分を回収すればよい。
このようにして得られるTGF活性画分は、必要
に応じて凍結乾燥などの乾燥手段にて乾燥粉末と
して得てもよく、この乾燥粉末は白色で、ニンヒ
ドリン反応陽性、分子量28000〜35000（ゲル過
法）、SDS−電気泳動において単一であり、酸お
よび熱に対して安定で、トリプリンおよびジチオ
スレイトール処理により失活される理化学的性質
を有しており、極めて高度に精製されたヒト
TGFである。 またヒトTGF抗体を得るに当つては、上述の
ヒトTGFを抗源として、ヒト以外の哺乳動物、
例えばモルモツト、ウサギ、ラツト、マウスやヤ
ギなどの抗体産生能のある動物を用い、通常の方
法に従つて免疫した後採血して抗血清を得、さら
に抗体を分離する。この際抗源として用いる
TGFは、上述の如くまで高度に精製した単一の
蛋白標品であることが望ましい。必ずしもこれに
限定されるものではない。また抗体を得るに当つ
て、例えば上述のヒトTGF粉末0.1〜１mgを生理
食塩水0.1〜５mlに溶解し、これに同量のコンプ
リート・フロイント・アジユバント（Complee
Freund′s adjuvant）を加え、充分乳化した後用
いる哺乳動物、例えばウサギやマウスなどの皮
下、皮内に注射し、１〜３週間毎に数回注射して
免疫せしめる。その後、最終免疫の日より一定期
間後採血し、これを放置し、凝固せしめて遠心分
離し、ヒトTGF抗体を含有する抗血清を得る。
またこの場合に用いる動物としては抗体産生能の
ある動物であれば何れを用いてもよく、大量の抗
体を得るには大型動物を用いるのが好ましく、通
常はウサギ、マウスやヤギを用いるが、何んら限
定されるものではない。さらにこれらの動物から
得られたヒトTGF抗体を含有する抗血清からヒ
トTGF抗体を得るには、通常用いられる抗体の
精製手段の方法によつて行なえるもので、例えば
抗血清を硫安分画し、次いでイオン交換クロマト
グラフイーあるいはゲル過によつて精製、採取
すればよい。さらに高純度に精製するにはヒト
TGFを固定化した不溶性担体を基材として用い
るアフイニテイークロマトグラフイーにて吸着
し、次いで溶出を行なつて得ればよい。さらにヒ
トTGF抗体を得る別法としては、ヒトTGFを抗
原として免疫させたヒト以外の哺乳動物の脾細胞
とミエローマ細胞とを用いて融合せしめ、この融
合細胞からヒトTGFに対するモノクロナール抗
体産生細胞を分離し、この融合細胞を用いるヒト
TGFモノクロナール抗体を製造する方法で、特
に哺乳動物としてマウスを用いる方法がよく利用
されている〔Nature、256、495〜497（1975）、
Nature、276、397〜399（1978）、Cell、14、９〜
20（1978）、Nature、266、550〜552（1977）、Eur.
J.Immunol.、６、511〜519（1976）、Chemical
and Engineering News、Jan.1.1979、15〜17〕。
例えばBalb／Ｃマウスの皮下に、TGF含有生理
食塩水とコンプリート・フロイント・アジユバン
トの乳化液を注射し、１〜３週間後複数回追加免
疫を行ない、最終免疫の３〜５日後にマウスの脾
臓を摘出し、適当な媒体中で脾細胞の単一細胞化
した懸濁液を調製する。次いでこの脾細胞３〜10
量に対して、マウス由来のミエローマ細胞、例え
ばPS−Ｘ−63−Ag8−UI〕の１量を用いて、37
℃、40〜50％ポリエチレングリコール1000〜1500
の存在下適当な培地、例えばRPMI培地〔J.A.M.
A.、199、519（1967）、J.Nat.Cancer Inst.、36、
405（1966）、In Vitro、６、89（1970）〕で融合せ
しめ、次いで洗浄後分離し、ウシ胎児血清含有
RPMI培地に加え、さらにこの細胞懸濁液の微量
づつ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有するRPMI培地（HAT
培地）にて選択培養し、各培養液の上清を採取
し、その抗体価の高い培養細胞を選択し、さらに
用いたマウスBalb／ｃの胸腺細胞をフイダーセ
ルとして用いる限界希釈法法によりクローニング
を行ない、ヒトTGFモノクロナール抗体産生細
胞を分取する。さらにこの細胞を、ウシ胎児血清
含有RPMI培地やダルベツコ変法イーグル培地に
て培養し、その上清を取得し、これを硫安分画、
イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過やアフ
イニテイークロマトグラフイーを行なつて精製さ
れたヒトTGFモノクロナール抗体を得る。また
は、ヒトTGFモノクロナール抗体産生細胞を、
組織適合動物や無胸腺のヌードマウスの体内で腫
瘍として生育せしめ、これから採取、精製しても
よい。さらにこのヒトTGFモノクロナール抗体
産生細胞は、ジメチルスルホキサイドやグリセロ
ールなどの凍結保護剤を用いて血清含有増殖培地
にて液体窒素約−196℃で凍結保存すればよい。 さらにこのヒトTGF抗体またはヒトTGFモノ
クロナール抗体は、不活性担体に固体化した固定
化TGF抗体や標識である酵素との結合体として
の酵素標識TGF抗体として用いられる。まずこ
のような固定化TGF抗体に用いられる不溶性担
体としては、免疫反応器に対して自由に移動でき
る移動相不溶担体の場合と、免疫反応器例えば内
容量50〜500μ用のマイクロプレートの反応壁
面を不溶化担体とする連続相不溶性担体との場合
が挙げられる。また移動相不溶性担体としては、
通常少なくとも過などの手段により容易に単離
できる粒径のものがよく、例えば径１mm以上、好
ましくは５mm以上のものがよく、ビーズ状のもの
が繁用される。またビーズ状の代りに、免疫反応
器の底部の形状と相似した紡錘形や半円形の形状
のものとして用いてもよく、このような形状の不
溶性担体としては特開昭58−5657号公報に記載の
ものが例示される。さらにこのような不溶性担体
としては、例えばアルブミンやゼラチンなどの蛋
白質の不溶化したもの、アガロース、セルロース
やデキストリンなどの多糖類のエピクロルヒドリ
ン処理による不溶化したものや臭化シアン処理や
その他のアミノ基導入試薬、チオール基導入試薬
やカルボキシル基導入試薬にて処理し不溶化した
ものなどの不溶性半合成高分子系担体、アクリロ
ニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メ
タアクリル酸、メタアクリル酸エステル、ビニル
アルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノスチ
レン、クロルスチレン、スルホスチレン、マレイ
ン酸、フマル酸などの重合体または共重合体やそ
れらのハイポーラスなものなどの不溶性合成高分
子系担体やケイ素やアルミニウムなどの無機化合
物またはそのハイポーラス無機化合物の不溶性無
機系担体が挙げられる。また連続相不溶性担体と
しては、主に上記の不溶性合成高分子系担体や不
溶性無機系担体が挙げられる。次いでこれらの不
溶性担体を前記のTGF抗体を固定化せしめるに
当つては、不活性媒体、例えばリン酸緩衝液やベ
ロナール緩衝液などのPH６〜8.5の緩衝液などの
媒体中で不溶性担体のハイポーラス吸着能に基く
TGF抗体の吸着固体化を行なつてもよく、また
は不溶性担体の有する官能基またはそれに導入し
た官能基とTGF抗体の有する官能基またはそれ
に導入した官能基とに基いて、必要に応じて架橋
剤を用いて、共有結合せしめて固定化せしめても
よい。また官能基を導入する場合にはスペーサー
導入のための試薬がよく用いられ、例えばスクシ
ンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポアル
デヒドなどのジアルデヒド化合物、ｗ−アミノ酪
酸、ｗ−アミノグルタミン酸などのアミノ酸化合
物またはその酸クロライド、スクシンイミドエス
テル、ｐ−ニトロフエニルエステルなどの反応性
誘導体、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸などのジカルボン酸化合物またはその反応
性誘導体、ヘキサメチレンジアミン、デカメチレ
ンジアミンなどのジアミン化合物、３−（2′−ピ
リジル−ジチオ）プロピオン酸、３−（2′−ベン
ゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸などのチオ
カルボン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｓ−
アセチウメルカプトサクシニツク・アンハイドラ
イド、２−アミノエタンチオール、γ−アミノプ
ロピルエトキシシランなどの試薬の１種または２
種以上を用いてアルデヒド基、カルボキシル基、
アミノ基、チオール基などの官能基を導入しても
よい。さらにこのような不溶性担体およびTGF
抗体を用いて固定化TGF抗体の共有結合体を得
るに当つては、この不溶性担体、TGF抗体の有
するアミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオー
ル基などの官能基またはその反応性誘導体やさら
に導入された官能基またはその反応性誘導体に基
いて、必要に応じて両者を結合し得る架橋試薬を
用いて得られる。また架橋試薬としては、アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、チオール基などの
官能基と反応し得る基を二以上有する多官能性試
薬であればよく、例えばスクシンアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなどのジア
ルデヒド化合物、マロン酸、コハク酸、グルタル
酸、アジピン酸などのジカルボン酸またはその反
応性誘導体、ヘキサメチレンジイソシアナート、
２，４−トルエンジイソシアナートなどのジイソ
シアナート化合物、マレイミド安息香酸、マレイ
ミドフエニル酢酸などのマレイミドカルボン酸化
合物またはその反応性誘導体、Ｎ，N′−エチレ
ンビスマレイミド、Ｎ，N′−０−フエニレンジ
マレイミドなどのジマレイミド化合物、ビスジア
ゾベンジジン、ジエチルマロンイミデート、ジメ
チルアジピンイミデート、Ｎ，N′−ポリメチレ
ンビスヨードアセトアミドや３−（2′−ベンゾチ
アゾリン−ジチオ）プロピオン酸、３−（2′−ピ
リジル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｎ−〔２−
（2′−ピリジル−ジチオ）エチル〕−３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオンアミド、１
−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−２−（2′−
ピリジル−ジチオ）エタンなどのジチオ化合物な
どが挙げられ、これらの試薬は、用いる不溶性担
体とTGF抗体の結合に関与するアミノ基、カル
ボキシル基、アルデヒド基、水酸基、チオール基
などの官能基を考慮して選択使用すればよい。さ
らに不溶性担体にTGF抗体を共有結合して固定
化TGFを得るに当つては、例えばPH６〜8.5の緩
衝液メタノール、エタノール、アセトン、ジオキ
サン、ジメチルスルホキサイド、テトラヒドロフ
ランなどの有機溶媒またはこれらの混合溶媒を用
いて、０℃〜40℃にてTGF抗体と架橋試薬とを
反応せしめる。この際使用する割合としては
TGF抗体に対して架橋試薬等モル比以上使用す
ればよい。次いで反応後、必要に応じて精製し、
これと不溶性担体とを反応せしめればよい。また
不溶性担体とTGF抗体との使用割合としては特
に限定されるものではなく、測定すべき被検液中
のTGFの含有量に比べて過剰量のTGF抗体の量
を固定化したものあればよい。さらに別の固定化
手段としては、このTGF抗体に対する特異的抗
体、即ちこのTGF抗体産生の哺乳動物の免疫グ
ロブリン分画を用いて他種の哺乳動物、特に大型
動物に免疫せしめて得られたいわゆる第２抗体を
用い、第２抗体を不溶性担体に国定化せしめ、次
いでこれにこのTGF抗体を免疫的手段にて結合
せしめることによるTGF抗体の活性をほとんど
失活せしめることのない固定化手段によつて固定
化TGF抗体を得てもよい。 さらに酵素標識TGF抗体を得るに当つて、用
いられる酵素としては、酸化還元酵素、加水分解
酵素、転移酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガ
ーゼが適宜選択使用されるもので、例示すればラ
クテートデヒドロゲナーゼ、マレイトデヒドロゲ
ナーゼ、マルトースデヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、グルタメイトデヒドロゲ
ナーゼ、α−グリセロホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ、ラクテートオキシダーゼ、マレインオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキ
シダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペンオキシ
ダーゼ、カタラーゼ、NADオキシダーゼ、α−
アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチー
ム、リパーゼ、アルカリホスフアターゼ、アミノ
ペプチダーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロキナー
ゼ、ピルベートキナーゼなどが挙げられる。さら
にこれらの酵素は、あらかじめ任意のスベーサー
や官能基の導入を行なつてもよく、前記の不溶性
担体に官能基を導入する場合と同様の試薬、例え
ばジアルデヒド化合物、アミノ酸化合物またはそ
の反応性誘導体、ジカルボン酸化合物またはその
反応性誘導体、ジアミン化合物、チオカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体、その他Ｓ−アセ
チルメルカプトサクシニツク・アンハイドライ
ド、２−アミノエタンチオールなどの一種または
二種以上が用いられ、新たにアルデヒド基、カル
ボキシル基、アミノ基、チオール基などの官能基
をスペーサーを介して導入してもよい。また同様
に、酵素に導入する代りに、用いるTGF抗体に
上記の試薬を用いて官能基を導入してもよい。さ
らにこのような試薬を用いて官能基を導入するに
当つては、通常酵素やTGF抗体を失活せしめな
いPH６〜8.5の緩衝液、メタノール、エタノール、
アセトン、ジオキサン、ジメチルスルホキサイ
ド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン
などを有機溶媒、またはこれらの混合溶媒である
不活性媒体中、０〜40℃にて酵素またはTGF抗
体と試薬とを反応せしめ、必要に応じて精製す
る。さらにこのような酵素およびTGF抗体を用
いて酵素標識TGF抗体を得るに当つては、この
酵素、TGF抗体の有するアミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基、チオール基や、さらに導入された
官能基に基いて、両者を結合し得る架橋試薬を用
いて得られる。また用いられる架橋試薬として
は、前記の不溶性担体とTGF抗体とを結合せし
めるに際して用いられたものと同様の多官能性試
薬がよく用いられる。例えばジアルデヒド化合
物、ジカルボン酸化合物またはその反応性誘導
体、ジイソシアナート化合物、マレイミドカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、ジマレイミ
ド化合物、チオカルボン酸化合物またはその反応
性誘導体などが挙げられ、これらの多官能性試薬
は、用いる酵素とTGF抗体との結合に関与する
アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸
基、チオール基などの官能基を考慮して選択使用
すればよい。さらに酵素標識TGF抗体を製造す
るに当つて、例えば前記と同様の不活性媒体中、
０℃〜40℃にてTGF抗体と多官能性試薬を反応
せしめる。この際使用する割合としては、TGF
抗体に対して多官能性試薬を等モル比以上使用す
ればよい。次いでこの反応終了後、必要に応じて
精製し、これに酵素を加え、好ましくは酵素の安
定PHを有する緩衝液中にて反応せしめれはよく、
さらに使用される酵素量としてはTGF抗体と等
モル比以上を用いればよい。次いでこのようにし
て得られた酵素標識TGF抗体は、吸着クロマト
グラフイーやゲル過などの精製手段により精製
採取すればよい。 次いで本発明を実施するに当つて、まずTGF
の含有量を測定しようとする被検液、例えばヒト
の尿または血清の50μ〜１mlと被検液中のTGF
含有量に比べて過剰量のTGF抗体を固定化して
いる固定化TGF抗体とを免疫反応媒体、例えば
リン酸緩衝液やベロナール緩衝液50μ〜５ml中
にて４〜40℃、好ましくは37℃にて１〜５時間反
応せしめ、その後これに、被検液中のTGF含有
量に比べて過剰量のTGF抗体量を含む量の酵素
標識TGF抗体を加えて、好ましくは37℃、１〜
５時間反応せしめる。次いで固定化TGF抗体の
形成する固体化TGF抗体−被検液中TGF−酵素
標識TGF抗体の固相と、未反応の酵素標識TGF
抗体を含む液相とを分離し、さらに固相は必要に
応じて洗浄し、その後固相または液相のいずれか
一方、または両方の酵素活性値を測定する。特に
固定化TGF抗体の不溶性担体が、ビーズ状など
の移動相不溶性担体である場合には、この移動相
不溶性担体を過などの手段にて回収すればよ
く、またマイクロプレートなどの連続相不溶性担
体である場合には反応終了液を洗浄区別してマイ
クロプレートを回収すればよい。 さらに免疫反応後、固相または液相の酵素活性
を測定するのであるが、固相に免疫的に保持され
ている酵素標識TGF抗体における酵素または液
相に残存する酵素標識TGF抗体における酵素を
その酵素の性質に基く公知の種々の活性測定法に
よつて行なえばよい。例えば酵素として酸化還元
酵素、特に酸化酵素を用いた場合には、その酵素
の基質と溶存酵素とを利用する酵素の触媒反応を
行なわせしめて、基質酸化物および過酸化水素、
さらに場合によりアンモニアや炭素ガスを生成せ
しめ、その酵素反応によつて消費される成分、例
えば酸素の量や、生成される成分、例えば過酸化
水素、アンモニアや炭酸ガスの量を定量すること
によつて測定される。さらに酵素、過酸化水素、
アンモニアや炭素ガスの量は、酸素電極、過酸化
水素電極、イオン電極やガス電極などの電極によ
る電気化学的変化の量として定量すればよい。さ
らにまた過酸化水素の量はペルオキシダーゼおよ
びグアヤコール、４−アミノアンチピリンとフエ
ノール、４−アミノアンチピリンとジメチルアニ
リン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンとジ
メチルアニリンなどの過酸化水素呈色試薬やホモ
バニリン酸やｐ−ヒドロキシフエニル酢酸などの
螢光試薬を用いて呈色また螢光せしめて、その量
を常法に従つて定量してもよい。さらに酸化還元
酵素でニコチン・アデニン・ジヌクレオチドまた
はニコチン・アデニン・ジヌクレオチド〔NAD
（Ｐ）〕またはその還元型を基質とするデヒドロゲ
ナーゼを用いて、用いた基質に作用してNAD
（Ｐ）または還元型NAD（Ｐ）を消費または生成
せしめる反応により、その還元型NAD（Ｐ）の量
をその吸収波長である34nｍにて吸光度測定する
か、テトラゾリウム塩とジアホラーゼまたはメナ
ジンフエトサルフエートとによるホルマザン呈色
のサイクリング反応を行なわせて比色定量しても
よい。さらにまた加水分解酵素の場合には、加水
分解によつて用いる基質から検出できる低分子物
質を分解、遊離する合成基質を用いることが好ま
しく、例えば加水分解酵素がβ−ガラクトシダー
ゼの場合には、ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを基質とし、その酵素反応によ
つて低分子物質としてのｏ−ニトロフエニルを遊
離し、このｏ−ニトロフエニルの量を波長420n
ｍにおける吸光度として測定すればよい。さらに
遊離される低分子物質に応じて種々の定量手段が
採用できるもので、例えば低分子物質がアミノ酸
化合物やアミン化合物の場合にはアミノ酸オキシ
ダーゼやアミンオキシダーゼを用いて酸化反応に
おける前述の消費成分または生成成分の定量手段
にて測定でき、またフエノール化合物やアニリン
化合物が低分子物質の場合にはフエノールオキシ
ダーゼ、ラツカーゼなどを用いて呈色酸化反応せ
しめて比色定量することもできる。 このように、ヒトTGFを用いて得られる固定
化ヒトTGF抗体および酵素標識ヒトTGF抗体を
用いることにより、極めて正確かつ簡便に被検液
中のTGFの定量をなし得るもので、さらに固定
化ヒトTGF抗体の抗体が哺乳動物の血清から得
られた抗体またはモノクロナール抗体であり、か
つ酵素標識ヒトTGF抗体の抗体がモノクロナー
ル抗体である場合においては、前述の遂次反応の
みならず、これらの必要な試薬を同時に用いて反
応せしめる一段反応にてなし得るものである。さ
らにこれらの抗体は免疫グロブリンのままの使用
に限られず、これらの抗体をパパイン処理して得
られるそのＦ（ab′）2やさらにこれを還元処理して
得られるそのFab′や、抗体をペプシン処理して
得られるそのＦ（ab）2などのフラグメントをその
抗体の代りに用いてもよいものである。 以上の通り、本発明は被検液中のTGFの測定
における新規な定量法を提供するもので、ガンの
判定に有用に利用されるものであり、次いで本発
明の実施例および参考例を挙げて具体的に述べる
が、本発明は何んらこれによつて限定されるもの
ではない。 実施例 １ (1) ヒトTGF抗血清の作製 TGF（後述参考例１によつて製造したTGF）
0.5mgを生理食塩水0.5mlに溶解し、これに同量
のコンプリート・フロイント・アジユバントを
加え、充分に乳化混合した後、家ウサギの四肢
指の皮中、および背中の数ケ所に注射した。２
週間おきに同量の乳剤を６回皮下注射し、最終
の免疫より10日後にその全血を採血し、60分間
室温に放置し凝固せしめた後、3000rpmで10分
間遠心分離を行ないヒトTGF抗体（ポリクロ
ナール抗体）含有抗血清を得た。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の作製 TGF1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これに
同量のコンプリート・フロイント・アジユバン
トを加え、充分に乳化混合させた。乳化剤0.2
mlをBalb／ｃマウスの背中皮下数ケ所に注射
した。10日間隔に同様の方法で２回追加免疫を
行ない、さらに２週間後TGF100μｇを溶解さ
せた生理食塩水0.2mlを静脈内投与した。最終
免疫後３日目にマウスの脾臓を無菌的に取り出
し、単細胞化し、混入したが赤血球細胞は、
0.83％塩化アンモニウム液で融解させた。脾細
胞は、冷却したハンクス液で数回洗條後、別に
培養調製したマウスミエローマ細胞（P3−Ｘ
−63−Ag8−U1）と３対１の量比で混合した。
遠心分離を行ない得られた脾細胞とミエローマ
細胞のペレツトに予め37℃に加温した30％ポリ
エチレングリコール（シグマ社）含む
RPNM1640培地１mlを遠心管を回転させなが
ら約30秒かけてゆつくり加えた。室温で60秒間
放置後、1000rpmで４分間遠心分離を行ない、
上清をアスピレーターで除いた後、５mlの
RPMI培地を加え、室温で２分間放置後、再び
1000rpmで５分間遠心分離を行なつた。得られ
たペレツトをRPMI培地で洗條後、ペレツトに
34mlのHAT培地〔100μMヒポキサンチン、
0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン、10％
牛胎児血清（FCS）を含むRPMI1640倍地〕を
加え、細胞を懸濁させた。懸濁液100μを96
ウエルプレート（ムンク社）３枚に分注し、炭
酸ガス倍溶装置（95％空気、５％CO2；温度37
℃、湿度100％）で培養を開始した。その後、
１〜３日ごとに倍地の半分量をHAT倍地で交
換し、７〜14日後にハイブリドーマの生育して
きたウエルの培養上清を採取し、その抗体価を
β−ガラクトシダーゼ標識TGFを用いたEIA
法で測定し、抗体価の高いハイブリドーマを５
コ選択した。限界希釈法でクローニングを行な
い、得られた８コのハイブリドーマから最も高
い抗体価を示したNo.３のハイブリドーマをヒト
TGFモノクロナール抗体産生細胞として取得
した。No.３のハイブリドーマを10％FCSを含む
RPMI1640倍地で培養を行ない、得らえた2.5
×107コの細胞を、あらかじめプリスタン0.5ml
を１週間前に腹膣内注射したBalb／ｃマウス
腹膣内に投与し、腹水腫瘍を作らせ10日後に腹
水を採取し、同様な方法で腹水50mlを調製し、
ヒトTGFモノクロナール抗体液として使用し
た。 (3) 不溶性担体としてビーズを用いたサンドイツ
チEIAによるTGFの測定 (1) 抗体固定化ビーズの調製 (1)で得られた抗血清を常法に従い硫安分画
を行ないγ−グロブリン分画を回収し、次い
でTGFをセフアロース4Bに固定化したカラ
ムに、脱塩したヒトTGF抗体を含むγ−グ
ロブリン液を添加し、生理食塩水で充分洗滌
後、0.15M NaClを含有する0.1Mグリシン−
塩酸緩衝液（PH2.3）で抗体を溶出せしめ、
100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）に対して透析
を行ない、精製ヒトTGF抗体を得た。精製
抗体１mgを含有する100ｍＭリン酸緩衝液
（PH8.0）20mlに、ポリスチレンビーズ（積水
化学社製、粒径6.35mm）100粒を加え、５℃
で16時間、37℃で１時間反応させ、抗体をビ
ーズに固定化せしめた。ビーズは生理食塩水
で充分洗滌後、免疫反応用緩衝液（0.25％牛
血清アルブミン（BSA）、５ｍMEDTA、
0.1％アジ化ナトリウム、0.9％NaClを含有す
る10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4））に浸漬し、
５℃で保存し、固定化TGF抗体としての抗
体固定化ビーズを得た。 (2) β−ガラクトシダーゼーヒトTGFモノク
ロナール抗体結合物の製造 (2)で得られたヒトTGFモノクロナール抗
体を含有する腹水より、常法に従い硫安分
画、DEAT−セルロースクロマトグラフイ
ーを行ないTGFモノクロナール抗体を精製
した。精製抗体４mgを100ｍＭリン酸緩衝液
（PH8.0）1.8mlに溶解し、これに３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸スク
シンイミドエステル14.8μｇを含有するジメ
チルホルムアミド液200μ、および100ｍ
MEDTA水溶液20μを加えて５℃で１時間
反応せしめた。反応液をセフアデツクスＧ−
15（1.5×40cm）のカラムに添加し、50ｍＭ酢
酸緩衝液（PH5.0）で溶出を行ない、その素
通り画分を回収し、TGFモノクロナール抗
体のアミノ基に３−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）プロピオニル基を導入した誘導体
を得た。次いでこの誘導体1.5mgを含有する
100ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlにβ−ガ
ラクトシダーゼ（ベーリンガー社製）3.33mg
を含有する100ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
0.666mlを加え５℃で16時間反応せしめた。
反応液をセフアデツクスＧ−150（1.5×95cm）
のカラムに添加し、生理食塩水で溶出を行な
い、その素通り画分を回収して、β−カラク
トシダーゼーヒトTGFモノクロナール抗体
結合体を得た。 (3) TGFの測定 精製TGFを免疫反応用内衝液を用いて、
１mlあたり５、10、20、40、80、160、320mg
の各濃度に溶解したものを標準TGF液とし
た。反応用試験管（シオノギチユーブ）に、
免疫反応用緩衝液300μと各標準TGF100μ
を加え、これに抗体固体化ビーズを１粒加
え、37℃で３時間反応せしめた。次いで酵素
標識抗体液50μを加え、さらに37℃で２時
間反応せしめ、反応終了後生理食塩水２mlを
加え撹拌洗滌後、洗液をアスピレーターで吸
引除却した。この操作を２回くり返し行なつ
た後、β−ガラクトシダーゼ活性測定用基質
液（0.5％ｏ−ニトロフエニール−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド、0.1％BSA、0.1％アジ
化ナトリウム、３ｍＭ MgCl2、0.9％NaCl
を含有する10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.7）0.5
mlを加え、37℃で60分間反応せしめた。反応
停止液（100ｍＭグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（PH11.0））２mlを加え反応を停止
させた後、その呈色を波長420nｍにて測定
した。 結果は第１図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお被検液（血清、尿等）中のTGF量
を測定する場合は、標準TGF液の代りに、
被検液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない、定量曲線と対照することにより被検
液中のTGF濃度を求めることができる。 実施例 ２ (1) ヒトTGF抗血清の作製 実施例１に順じて行なつた。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の作製 実施例１に順じて行なつた。 (3) 不溶性担体としてマイクロプレート壁を用い
たサンドイツチEIAによるTGFの測定 (1) 抗体固定化マイクロプレートの調製 (1)で得られたヒトTGF抗体含有血清を常
法に従い硫安分画を行ないγ−グロブリン分
画を回収し、次いでTGFをセフアロース4B
に固定化したカラムに脱塩したヒトTGF抗
体を含むγ−グロブリン液を添加し、生理食
塩水で充分洗滌後、0.15M NaClを含有する
0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.3）で抗体
をカラムより溶出せしめ、100ｍＭリン酸緩
衝液に対して透析を行ない、精製ヒトTGF
抗体を得た。精製抗体１mgを１mlあたり5μ
ｇの濃度に溶解させた100ｍＭリン酸緩衝液
（PH8.0）を、96ウエルプレート（ムンク社、
EIA用）の１ウエルに150μづつ分注し、５
℃で16時間、37℃で１時間反応させ、抗体を
プレートに固定化せしめた。プレートは生理
食塩水で充分洗滌後、0.5％BSAを含有する
100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）を１ウエル
150μづづ加え37℃で２時間反応せしめた。
プレートは再び生理食塩水に洗滌後、免疫反
応用緩衝液を１ウエル150μづつ加え、５
℃で保存し、ヒトTGF抗体固定化プレート
として用いた。 (2) β−ガラクトシダーゼ−ヒトTGFモノク
ロナール抗体結合物の調製 実施例１に順じて行なつた。 (3) TGFの測定 精製TGFを免疫反応用緩衝液を用いて、
１mlあたり2.5、５、10、20、40、80、160mg
の各濃度に溶解したものを標準TGF液とし
た。ヒトTGF抗体固定化マイクロプレート
の１ウエルに各標準TGF液100μを加え37
℃で２時間反応せしめた。0.1％ツイーン20
を含む生理食塩水で各ウエルを３回洗滌した
後、β−ガラクトシダーゼ標識TGF液100μ
を各ウエルに加え37℃で２時間反応せしめ
た。再び0.1％ツイーン20を含む生理食塩水
で各ウエルを４回洗滌した後、β−ガラクト
シダーゼ活性測定用基質液（前述）150μ
を加え37℃で１時間反応せしめた。終了後、
500ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH11.0）を50μ加え、その呈色をコロナ２
波長マイクロプレート光度計（MTP−12）
を用い波長405nｍにて測定した。 結果は第２図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお被検液（血清、尿等）中のTGF量
を測定する場合は、標準TGF液の代りに、
被検液を免疫反応用緩衝液で５〜10倍に希釈
した液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない、定量曲線と対照することにより被検
液中のTGF濃度を求めることができる。 また以下にTGFの製造例を挙げるが、こ
れに限定されるものではなく、例えば特願昭
58−61102号明細書に記載の方法によつて
TGFを製造し、これを用いてもよい。 参考例 １ 肺癌患者尿1100mlを0.01Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対し分子量カツト10000の透析膜（三光純
薬社製）を用いて４℃で２昼夜透析を行なつた。
透析内液は12000ｇにて60分間遠心分離し、沈澱
を除く。SP−セフアデツクス（フアルマシヤ社
製）をカラム（4.5cm×33cm）に詰め、0.01Mリ
ン酸環境液（PH8.0）で平衡化した後、上記透析
内液を流下し、有効成分を吸着させた後、同緩衝
液で充分洗浄し、ついで同緩衝液中、塩化ナトリ
ウム0.01M〜1.5Mの傾斜溶出を行なつた。（流速
22.5ml／時、温度４℃、塩化ナトリウム傾斜濃度
緩衝液4.8使用）TGFは同緩衝液中、塩化ナト
リウム濃度0.6〜1.0Mの位置に溶出され、活性分
画62.0mlを得た。本活性分画は後記のTGF活性
試験法において、5μで正常細胞は変質されコ
ロニーを形成した。本活性分画全量をダイヤフロ
ー分子篩膜PM−10（アミコン、フアーイースト、
リミツテツド社製（日本））を用いて脱塩、濃縮
をくり返し、1.2mlとし、これにトリフロロ酢酸
を加えて0.05％トリフロロ酢酸溶液とした。 アルキル基（C18）を結合させたシリカゲルを
担体とするシンクロパツクRP−Ｐ（シンクローム
社製）をカラム（4.1mm×250mm）に詰め0.05％ト
リフロロ酢酸で平衡化し、このカラム１本に上記
TGF、トリフロ酢酸溶液の1/3を流し吸着後0.05
％トリフロロ酢酸水で洗浄した後、同液中０〜90
％アセトニトリルの傾斜溶出を行ないアセトニト
リル濃度55〜75％位置に溶出される活性分画をと
る。以上の操作を３回行ない前記の分子篩膜によ
る濃度調整液全量を処理しTGF活性分画7.9mlを
分取した。本分画を凍結乾燥後、再び3.0mlの生
理食塩水に溶解し、この溶液をTGF試験法にか
け0.4μで正常細胞は変質されコロニー形成能を
示した。
（Transforming Growth Factor；以下、TGFと
いう）の酵素免疫測定法に関する。 TGFは、ヒトおよびけつ歯動物のガン細胞で
つくられ、正常細胞に細胞形態学的に特異な変質
（形質転換および増殖）をさせるポリペプチドで
ある。ヒトおよび動物の正常細胞は、軟寒天培地
においてはコロニーを形成しないが、これに
TGFを加えるとコロニー形成能を有するように
なる。1979年ジ・ゼ・トダロら〔Proc.Natl.
Acad.Sci.、75、4001（1978）〕により、肉腫細胞
の培養上清から始めてTGFの存在が報告されて
以来、多数のTGFがヒトおよびけつ歯動物の培
養ガン細胞およびガン患者のガン組織からも発見
されている〔ロバーツ・エ・ビら；Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、77、3494（1980）〕。最近、デ
イ・アル・タージツクら〔JNCL、69、793
（1982）〕およびジ・ゼ・トダロら〔Cancer
Res.、43、403（1983）〕は、ガン患者の尿から分
子量約30000〜35000の高分子型TGFを抽出して
いるが詳しい物性は末だ明らかでない。 従つてまた、TGFと類似している種々のグロ
スフアクターを明瞭に識別する適切な手段がな
く、TGFを判定するに当つて、TGFの有する正
常細胞のコロニー形成能に基いて行なつていたに
すぎず、かつ煩雑な操作をも必要とするが、定量
性に欠けるものであつた。さらにTGFの体液、
例えば血液、尿などにおける存在、含有量、さら
にその消長などに関してあまり報告されていない
ものであつた。 本発明者らは、先に、高分子型のTGFは正常
人尿には存在せず、ガン患者尿のみ特異的に存在
すること、しかもこのものが正常細胞に対して前
述のような生物学的活性を有するもので極めて主
要な物質と考えて研究した結果、種々のガン患者
の尿を透析して無機イオンその他の低分子物質を
除去し、さらに必要に応じてゲル過した後、次
いで陽イオン交換体を用いてクロマトグラフイー
または／および吸着クロマトグラフイーを行な
い、極めて高純度に精製されたヒトTGFを得た
ものである（特願昭58−61102号明細書（特開昭
59−186994号）参照）。 さらに本発明者らは研究し続けた結果、この
TGFを用いてヒト以外の哺乳動物に注射して免
疫せしめ、その血液を採取してこのTGFに対す
るヒトTGF抗体が良好に得られることを知り、
さらに研究の結果、免疫させた哺乳動物の脾臓を
摘出し、その抗体産生能を有する単細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合せしめることによりTGFに対
するヒトTGF抗体としてのモノクロナール抗体
産生細胞を得、その培養物からヒトTGF抗体を
良好に得ることを完成した。さらに本発明者ら
は、得られたヒトTGF抗体を不溶性担体に固定
化せしめて固定化ヒトTGF抗体を得、またヒト
TGF抗体と酵素とを結合せしめて酵素標識ヒト
TGF抗体の結合体を得、TGFを含有する被検液
中のTGFの定量における、上述の固定化TGF抗
体および酵素標識TGF抗体を用いるサンドイツ
チ法による酵素免疫測定法（EIA）を確立した。 本発明は、上記の知見に基いて完成したもの
で、固定化TGF抗体と被検液とを反応せしめ、
次いで酵素標識TGF抗体を反応せしめた後、固
相と液相とを分離し、その分離したいずれか一方
の酵素標識の量を定量する方法において、該トラ
ンスホーミンググロスフアクターがニンヒドリン
反応陽性、SDS−電気泳動において単一であり、
酸および熱に対して安定で、トリプシンおよびジ
チオスレイトール処理により失活し、ゲル過に
より推定分子量28000〜35000を示す理化学的特性
を有するものであることを特徴とする被検液中の
TGFの酵素免疫測定法である。 まず本発明における固定化ヒトTGF抗体およ
び酵素標識ヒトTGF抗体に用いられるヒトTGF
抗体を得るためのヒトTGFは、例えば肺癌、絨
毛腫瘍、胃癌、咽頭癌、結脹癌、乳癌、黒色肉
腫、卵巣癌などのガン患者の尿を原料として精
製、回収することが簡便である。これらのガン患
者尿からのTGFの精製手段について例示すると、
集められたガン患者尿は、まず低分子の不純物を
除くため、水を透析外液として透析膜の分子量カ
ツト約10000以下の膜を用いて透析する。次いで
得られた透析内液は、必要に応じて、凍結、融解
を反復して不純物を析出させ、遠心分離や５ミク
ロン程度の細孔を有するフイルターを通して微細
な沈澱の粒子を除去してもよい。さらに必要に応
じて、透析内液は、バイオゲル（Biogel）ｐ−
60、ｐ−100（バイオラド社製）、セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−50（フアルマシア社製）などの
ゲル過剤にてゲル過してTGF活性を示す画
分を集めればよい。この際、TGF活性を示す画
分としては、推定分子量28000〜35000の位置に存
在し、後述する試験法によつて識別することがで
きる。次いで、前述の尿の透析内液またはゲル
過して集めた活性画分について、イオン交換クロ
マトグラフイーや分子篩膜例えば分子量10000〜
20000程度の限過膜による分子篩処理や吸着ク
ロマドグラフイーの少なくとも１以上の操作また
はこれらの操作を組み合せて精製されたTGF活
性画分が採取される。イオン交換クロマトグラフ
イーは、例えばCM−セフアデツクス
（Sephadex）（フアルマシア社製）、SP−セフア
デツクス（Sephadex）（フアルマシア社製）、
CM−52（ワツトマン社製）、バイオ・レツクス
（Bio−Rex）70｛バイオ・ラド社製）などの陽イ
オン交換体を基材としたカラムを用いて、上記の
TGF含有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次
濃度を上昇勾配させた中性塩、好ましくは塩化ナ
トリウムの水溶液を用いて傾斜溶出して、その
TGF活性画分を回収すればよい。次いで好まし
くは分子量10000〜20000程度の限外過膜を用い
て濃縮、脱塩を行なえばよい。さらに吸着クロマ
トグラフイーとしては、例えばシンクロパツク
（Synchropak）PRシリーズ（シンクローム社製）
の炭素数３〜20のアルキル基のような疏水性基で
修飾されたシリカゲルやMCI Gel CH20Pシリー
ズ（三菱化成工業社製）、アンバーライト
（Amberlite）XADシリーズ（アンバーライト社
製）のようなポリスチレン系ハイポーラス吸着樹
脂などの基材のカラムを用いて、上記のTGF含
有液を加えて吸着せしめる。次いで遂次濃度を上
昇勾配させた親水性中性有機溶媒、例えばエタノ
ール、プロピルアルコールのような低級脂肪族ア
ルコールまたはアセトン、アセトニトリルのよう
な低級脂肪族ケトンなどの水溶液を用いて傾斜溶
出して、そのTGF活性画分を回収すればよい。
このようにして得られるTGF活性画分は、必要
に応じて凍結乾燥などの乾燥手段にて乾燥粉末と
して得てもよく、この乾燥粉末は白色で、ニンヒ
ドリン反応陽性、分子量28000〜35000（ゲル過
法）、SDS−電気泳動において単一であり、酸お
よび熱に対して安定で、トリプリンおよびジチオ
スレイトール処理により失活される理化学的性質
を有しており、極めて高度に精製されたヒト
TGFである。 またヒトTGF抗体を得るに当つては、上述の
ヒトTGFを抗源として、ヒト以外の哺乳動物、
例えばモルモツト、ウサギ、ラツト、マウスやヤ
ギなどの抗体産生能のある動物を用い、通常の方
法に従つて免疫した後採血して抗血清を得、さら
に抗体を分離する。この際抗源として用いる
TGFは、上述の如くまで高度に精製した単一の
蛋白標品であることが望ましい。必ずしもこれに
限定されるものではない。また抗体を得るに当つ
て、例えば上述のヒトTGF粉末0.1〜１mgを生理
食塩水0.1〜５mlに溶解し、これに同量のコンプ
リート・フロイント・アジユバント（Complee
Freund′s adjuvant）を加え、充分乳化した後用
いる哺乳動物、例えばウサギやマウスなどの皮
下、皮内に注射し、１〜３週間毎に数回注射して
免疫せしめる。その後、最終免疫の日より一定期
間後採血し、これを放置し、凝固せしめて遠心分
離し、ヒトTGF抗体を含有する抗血清を得る。
またこの場合に用いる動物としては抗体産生能の
ある動物であれば何れを用いてもよく、大量の抗
体を得るには大型動物を用いるのが好ましく、通
常はウサギ、マウスやヤギを用いるが、何んら限
定されるものではない。さらにこれらの動物から
得られたヒトTGF抗体を含有する抗血清からヒ
トTGF抗体を得るには、通常用いられる抗体の
精製手段の方法によつて行なえるもので、例えば
抗血清を硫安分画し、次いでイオン交換クロマト
グラフイーあるいはゲル過によつて精製、採取
すればよい。さらに高純度に精製するにはヒト
TGFを固定化した不溶性担体を基材として用い
るアフイニテイークロマトグラフイーにて吸着
し、次いで溶出を行なつて得ればよい。さらにヒ
トTGF抗体を得る別法としては、ヒトTGFを抗
原として免疫させたヒト以外の哺乳動物の脾細胞
とミエローマ細胞とを用いて融合せしめ、この融
合細胞からヒトTGFに対するモノクロナール抗
体産生細胞を分離し、この融合細胞を用いるヒト
TGFモノクロナール抗体を製造する方法で、特
に哺乳動物としてマウスを用いる方法がよく利用
されている〔Nature、256、495〜497（1975）、
Nature、276、397〜399（1978）、Cell、14、９〜
20（1978）、Nature、266、550〜552（1977）、Eur.
J.Immunol.、６、511〜519（1976）、Chemical
and Engineering News、Jan.1.1979、15〜17〕。
例えばBalb／Ｃマウスの皮下に、TGF含有生理
食塩水とコンプリート・フロイント・アジユバン
トの乳化液を注射し、１〜３週間後複数回追加免
疫を行ない、最終免疫の３〜５日後にマウスの脾
臓を摘出し、適当な媒体中で脾細胞の単一細胞化
した懸濁液を調製する。次いでこの脾細胞３〜10
量に対して、マウス由来のミエローマ細胞、例え
ばPS−Ｘ−63−Ag8−UI〕の１量を用いて、37
℃、40〜50％ポリエチレングリコール1000〜1500
の存在下適当な培地、例えばRPMI培地〔J.A.M.
A.、199、519（1967）、J.Nat.Cancer Inst.、36、
405（1966）、In Vitro、６、89（1970）〕で融合せ
しめ、次いで洗浄後分離し、ウシ胎児血清含有
RPMI培地に加え、さらにこの細胞懸濁液の微量
づつ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有するRPMI培地（HAT
培地）にて選択培養し、各培養液の上清を採取
し、その抗体価の高い培養細胞を選択し、さらに
用いたマウスBalb／ｃの胸腺細胞をフイダーセ
ルとして用いる限界希釈法法によりクローニング
を行ない、ヒトTGFモノクロナール抗体産生細
胞を分取する。さらにこの細胞を、ウシ胎児血清
含有RPMI培地やダルベツコ変法イーグル培地に
て培養し、その上清を取得し、これを硫安分画、
イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過やアフ
イニテイークロマトグラフイーを行なつて精製さ
れたヒトTGFモノクロナール抗体を得る。また
は、ヒトTGFモノクロナール抗体産生細胞を、
組織適合動物や無胸腺のヌードマウスの体内で腫
瘍として生育せしめ、これから採取、精製しても
よい。さらにこのヒトTGFモノクロナール抗体
産生細胞は、ジメチルスルホキサイドやグリセロ
ールなどの凍結保護剤を用いて血清含有増殖培地
にて液体窒素約−196℃で凍結保存すればよい。 さらにこのヒトTGF抗体またはヒトTGFモノ
クロナール抗体は、不活性担体に固体化した固定
化TGF抗体や標識である酵素との結合体として
の酵素標識TGF抗体として用いられる。まずこ
のような固定化TGF抗体に用いられる不溶性担
体としては、免疫反応器に対して自由に移動でき
る移動相不溶担体の場合と、免疫反応器例えば内
容量50〜500μ用のマイクロプレートの反応壁
面を不溶化担体とする連続相不溶性担体との場合
が挙げられる。また移動相不溶性担体としては、
通常少なくとも過などの手段により容易に単離
できる粒径のものがよく、例えば径１mm以上、好
ましくは５mm以上のものがよく、ビーズ状のもの
が繁用される。またビーズ状の代りに、免疫反応
器の底部の形状と相似した紡錘形や半円形の形状
のものとして用いてもよく、このような形状の不
溶性担体としては特開昭58−5657号公報に記載の
ものが例示される。さらにこのような不溶性担体
としては、例えばアルブミンやゼラチンなどの蛋
白質の不溶化したもの、アガロース、セルロース
やデキストリンなどの多糖類のエピクロルヒドリ
ン処理による不溶化したものや臭化シアン処理や
その他のアミノ基導入試薬、チオール基導入試薬
やカルボキシル基導入試薬にて処理し不溶化した
ものなどの不溶性半合成高分子系担体、アクリロ
ニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メ
タアクリル酸、メタアクリル酸エステル、ビニル
アルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノスチ
レン、クロルスチレン、スルホスチレン、マレイ
ン酸、フマル酸などの重合体または共重合体やそ
れらのハイポーラスなものなどの不溶性合成高分
子系担体やケイ素やアルミニウムなどの無機化合
物またはそのハイポーラス無機化合物の不溶性無
機系担体が挙げられる。また連続相不溶性担体と
しては、主に上記の不溶性合成高分子系担体や不
溶性無機系担体が挙げられる。次いでこれらの不
溶性担体を前記のTGF抗体を固定化せしめるに
当つては、不活性媒体、例えばリン酸緩衝液やベ
ロナール緩衝液などのPH６〜8.5の緩衝液などの
媒体中で不溶性担体のハイポーラス吸着能に基く
TGF抗体の吸着固体化を行なつてもよく、また
は不溶性担体の有する官能基またはそれに導入し
た官能基とTGF抗体の有する官能基またはそれ
に導入した官能基とに基いて、必要に応じて架橋
剤を用いて、共有結合せしめて固定化せしめても
よい。また官能基を導入する場合にはスペーサー
導入のための試薬がよく用いられ、例えばスクシ
ンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポアル
デヒドなどのジアルデヒド化合物、ｗ−アミノ酪
酸、ｗ−アミノグルタミン酸などのアミノ酸化合
物またはその酸クロライド、スクシンイミドエス
テル、ｐ−ニトロフエニルエステルなどの反応性
誘導体、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸などのジカルボン酸化合物またはその反応
性誘導体、ヘキサメチレンジアミン、デカメチレ
ンジアミンなどのジアミン化合物、３−（2′−ピ
リジル−ジチオ）プロピオン酸、３−（2′−ベン
ゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸などのチオ
カルボン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｓ−
アセチウメルカプトサクシニツク・アンハイドラ
イド、２−アミノエタンチオール、γ−アミノプ
ロピルエトキシシランなどの試薬の１種または２
種以上を用いてアルデヒド基、カルボキシル基、
アミノ基、チオール基などの官能基を導入しても
よい。さらにこのような不溶性担体およびTGF
抗体を用いて固定化TGF抗体の共有結合体を得
るに当つては、この不溶性担体、TGF抗体の有
するアミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオー
ル基などの官能基またはその反応性誘導体やさら
に導入された官能基またはその反応性誘導体に基
いて、必要に応じて両者を結合し得る架橋試薬を
用いて得られる。また架橋試薬としては、アミノ
基、水酸基、カルボキシル基、チオール基などの
官能基と反応し得る基を二以上有する多官能性試
薬であればよく、例えばスクシンアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなどのジア
ルデヒド化合物、マロン酸、コハク酸、グルタル
酸、アジピン酸などのジカルボン酸またはその反
応性誘導体、ヘキサメチレンジイソシアナート、
２，４−トルエンジイソシアナートなどのジイソ
シアナート化合物、マレイミド安息香酸、マレイ
ミドフエニル酢酸などのマレイミドカルボン酸化
合物またはその反応性誘導体、Ｎ，N′−エチレ
ンビスマレイミド、Ｎ，N′−０−フエニレンジ
マレイミドなどのジマレイミド化合物、ビスジア
ゾベンジジン、ジエチルマロンイミデート、ジメ
チルアジピンイミデート、Ｎ，N′−ポリメチレ
ンビスヨードアセトアミドや３−（2′−ベンゾチ
アゾリン−ジチオ）プロピオン酸、３−（2′−ピ
リジル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｎ−〔２−
（2′−ピリジル−ジチオ）エチル〕−３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオンアミド、１
−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）−２−（2′−
ピリジル−ジチオ）エタンなどのジチオ化合物な
どが挙げられ、これらの試薬は、用いる不溶性担
体とTGF抗体の結合に関与するアミノ基、カル
ボキシル基、アルデヒド基、水酸基、チオール基
などの官能基を考慮して選択使用すればよい。さ
らに不溶性担体にTGF抗体を共有結合して固定
化TGFを得るに当つては、例えばPH６〜8.5の緩
衝液メタノール、エタノール、アセトン、ジオキ
サン、ジメチルスルホキサイド、テトラヒドロフ
ランなどの有機溶媒またはこれらの混合溶媒を用
いて、０℃〜40℃にてTGF抗体と架橋試薬とを
反応せしめる。この際使用する割合としては
TGF抗体に対して架橋試薬等モル比以上使用す
ればよい。次いで反応後、必要に応じて精製し、
これと不溶性担体とを反応せしめればよい。また
不溶性担体とTGF抗体との使用割合としては特
に限定されるものではなく、測定すべき被検液中
のTGFの含有量に比べて過剰量のTGF抗体の量
を固定化したものあればよい。さらに別の固定化
手段としては、このTGF抗体に対する特異的抗
体、即ちこのTGF抗体産生の哺乳動物の免疫グ
ロブリン分画を用いて他種の哺乳動物、特に大型
動物に免疫せしめて得られたいわゆる第２抗体を
用い、第２抗体を不溶性担体に国定化せしめ、次
いでこれにこのTGF抗体を免疫的手段にて結合
せしめることによるTGF抗体の活性をほとんど
失活せしめることのない固定化手段によつて固定
化TGF抗体を得てもよい。 さらに酵素標識TGF抗体を得るに当つて、用
いられる酵素としては、酸化還元酵素、加水分解
酵素、転移酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガ
ーゼが適宜選択使用されるもので、例示すればラ
クテートデヒドロゲナーゼ、マレイトデヒドロゲ
ナーゼ、マルトースデヒドロゲナーゼ、グルコー
ス−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、グルタメイトデヒドロゲ
ナーゼ、α−グリセロホスフエートデヒドロゲナ
ーゼ、ラクテートオキシダーゼ、マレインオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキ
シダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペンオキシ
ダーゼ、カタラーゼ、NADオキシダーゼ、α−
アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチー
ム、リパーゼ、アルカリホスフアターゼ、アミノ
ペプチダーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロキナー
ゼ、ピルベートキナーゼなどが挙げられる。さら
にこれらの酵素は、あらかじめ任意のスベーサー
や官能基の導入を行なつてもよく、前記の不溶性
担体に官能基を導入する場合と同様の試薬、例え
ばジアルデヒド化合物、アミノ酸化合物またはそ
の反応性誘導体、ジカルボン酸化合物またはその
反応性誘導体、ジアミン化合物、チオカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体、その他Ｓ−アセ
チルメルカプトサクシニツク・アンハイドライ
ド、２−アミノエタンチオールなどの一種または
二種以上が用いられ、新たにアルデヒド基、カル
ボキシル基、アミノ基、チオール基などの官能基
をスペーサーを介して導入してもよい。また同様
に、酵素に導入する代りに、用いるTGF抗体に
上記の試薬を用いて官能基を導入してもよい。さ
らにこのような試薬を用いて官能基を導入するに
当つては、通常酵素やTGF抗体を失活せしめな
いPH６〜8.5の緩衝液、メタノール、エタノール、
アセトン、ジオキサン、ジメチルスルホキサイ
ド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン
などを有機溶媒、またはこれらの混合溶媒である
不活性媒体中、０〜40℃にて酵素またはTGF抗
体と試薬とを反応せしめ、必要に応じて精製す
る。さらにこのような酵素およびTGF抗体を用
いて酵素標識TGF抗体を得るに当つては、この
酵素、TGF抗体の有するアミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基、チオール基や、さらに導入された
官能基に基いて、両者を結合し得る架橋試薬を用
いて得られる。また用いられる架橋試薬として
は、前記の不溶性担体とTGF抗体とを結合せし
めるに際して用いられたものと同様の多官能性試
薬がよく用いられる。例えばジアルデヒド化合
物、ジカルボン酸化合物またはその反応性誘導
体、ジイソシアナート化合物、マレイミドカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、ジマレイミ
ド化合物、チオカルボン酸化合物またはその反応
性誘導体などが挙げられ、これらの多官能性試薬
は、用いる酵素とTGF抗体との結合に関与する
アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸
基、チオール基などの官能基を考慮して選択使用
すればよい。さらに酵素標識TGF抗体を製造す
るに当つて、例えば前記と同様の不活性媒体中、
０℃〜40℃にてTGF抗体と多官能性試薬を反応
せしめる。この際使用する割合としては、TGF
抗体に対して多官能性試薬を等モル比以上使用す
ればよい。次いでこの反応終了後、必要に応じて
精製し、これに酵素を加え、好ましくは酵素の安
定PHを有する緩衝液中にて反応せしめれはよく、
さらに使用される酵素量としてはTGF抗体と等
モル比以上を用いればよい。次いでこのようにし
て得られた酵素標識TGF抗体は、吸着クロマト
グラフイーやゲル過などの精製手段により精製
採取すればよい。 次いで本発明を実施するに当つて、まずTGF
の含有量を測定しようとする被検液、例えばヒト
の尿または血清の50μ〜１mlと被検液中のTGF
含有量に比べて過剰量のTGF抗体を固定化して
いる固定化TGF抗体とを免疫反応媒体、例えば
リン酸緩衝液やベロナール緩衝液50μ〜５ml中
にて４〜40℃、好ましくは37℃にて１〜５時間反
応せしめ、その後これに、被検液中のTGF含有
量に比べて過剰量のTGF抗体量を含む量の酵素
標識TGF抗体を加えて、好ましくは37℃、１〜
５時間反応せしめる。次いで固定化TGF抗体の
形成する固体化TGF抗体−被検液中TGF−酵素
標識TGF抗体の固相と、未反応の酵素標識TGF
抗体を含む液相とを分離し、さらに固相は必要に
応じて洗浄し、その後固相または液相のいずれか
一方、または両方の酵素活性値を測定する。特に
固定化TGF抗体の不溶性担体が、ビーズ状など
の移動相不溶性担体である場合には、この移動相
不溶性担体を過などの手段にて回収すればよ
く、またマイクロプレートなどの連続相不溶性担
体である場合には反応終了液を洗浄区別してマイ
クロプレートを回収すればよい。 さらに免疫反応後、固相または液相の酵素活性
を測定するのであるが、固相に免疫的に保持され
ている酵素標識TGF抗体における酵素または液
相に残存する酵素標識TGF抗体における酵素を
その酵素の性質に基く公知の種々の活性測定法に
よつて行なえばよい。例えば酵素として酸化還元
酵素、特に酸化酵素を用いた場合には、その酵素
の基質と溶存酵素とを利用する酵素の触媒反応を
行なわせしめて、基質酸化物および過酸化水素、
さらに場合によりアンモニアや炭素ガスを生成せ
しめ、その酵素反応によつて消費される成分、例
えば酸素の量や、生成される成分、例えば過酸化
水素、アンモニアや炭酸ガスの量を定量すること
によつて測定される。さらに酵素、過酸化水素、
アンモニアや炭素ガスの量は、酸素電極、過酸化
水素電極、イオン電極やガス電極などの電極によ
る電気化学的変化の量として定量すればよい。さ
らにまた過酸化水素の量はペルオキシダーゼおよ
びグアヤコール、４−アミノアンチピリンとフエ
ノール、４−アミノアンチピリンとジメチルアニ
リン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンとジ
メチルアニリンなどの過酸化水素呈色試薬やホモ
バニリン酸やｐ−ヒドロキシフエニル酢酸などの
螢光試薬を用いて呈色また螢光せしめて、その量
を常法に従つて定量してもよい。さらに酸化還元
酵素でニコチン・アデニン・ジヌクレオチドまた
はニコチン・アデニン・ジヌクレオチド〔NAD
（Ｐ）〕またはその還元型を基質とするデヒドロゲ
ナーゼを用いて、用いた基質に作用してNAD
（Ｐ）または還元型NAD（Ｐ）を消費または生成
せしめる反応により、その還元型NAD（Ｐ）の量
をその吸収波長である34nｍにて吸光度測定する
か、テトラゾリウム塩とジアホラーゼまたはメナ
ジンフエトサルフエートとによるホルマザン呈色
のサイクリング反応を行なわせて比色定量しても
よい。さらにまた加水分解酵素の場合には、加水
分解によつて用いる基質から検出できる低分子物
質を分解、遊離する合成基質を用いることが好ま
しく、例えば加水分解酵素がβ−ガラクトシダー
ゼの場合には、ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを基質とし、その酵素反応によ
つて低分子物質としてのｏ−ニトロフエニルを遊
離し、このｏ−ニトロフエニルの量を波長420n
ｍにおける吸光度として測定すればよい。さらに
遊離される低分子物質に応じて種々の定量手段が
採用できるもので、例えば低分子物質がアミノ酸
化合物やアミン化合物の場合にはアミノ酸オキシ
ダーゼやアミンオキシダーゼを用いて酸化反応に
おける前述の消費成分または生成成分の定量手段
にて測定でき、またフエノール化合物やアニリン
化合物が低分子物質の場合にはフエノールオキシ
ダーゼ、ラツカーゼなどを用いて呈色酸化反応せ
しめて比色定量することもできる。 このように、ヒトTGFを用いて得られる固定
化ヒトTGF抗体および酵素標識ヒトTGF抗体を
用いることにより、極めて正確かつ簡便に被検液
中のTGFの定量をなし得るもので、さらに固定
化ヒトTGF抗体の抗体が哺乳動物の血清から得
られた抗体またはモノクロナール抗体であり、か
つ酵素標識ヒトTGF抗体の抗体がモノクロナー
ル抗体である場合においては、前述の遂次反応の
みならず、これらの必要な試薬を同時に用いて反
応せしめる一段反応にてなし得るものである。さ
らにこれらの抗体は免疫グロブリンのままの使用
に限られず、これらの抗体をパパイン処理して得
られるそのＦ（ab′）2やさらにこれを還元処理して
得られるそのFab′や、抗体をペプシン処理して
得られるそのＦ（ab）2などのフラグメントをその
抗体の代りに用いてもよいものである。 以上の通り、本発明は被検液中のTGFの測定
における新規な定量法を提供するもので、ガンの
判定に有用に利用されるものであり、次いで本発
明の実施例および参考例を挙げて具体的に述べる
が、本発明は何んらこれによつて限定されるもの
ではない。 実施例 １ (1) ヒトTGF抗血清の作製 TGF（後述参考例１によつて製造したTGF）
0.5mgを生理食塩水0.5mlに溶解し、これに同量
のコンプリート・フロイント・アジユバントを
加え、充分に乳化混合した後、家ウサギの四肢
指の皮中、および背中の数ケ所に注射した。２
週間おきに同量の乳剤を６回皮下注射し、最終
の免疫より10日後にその全血を採血し、60分間
室温に放置し凝固せしめた後、3000rpmで10分
間遠心分離を行ないヒトTGF抗体（ポリクロ
ナール抗体）含有抗血清を得た。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の作製 TGF1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これに
同量のコンプリート・フロイント・アジユバン
トを加え、充分に乳化混合させた。乳化剤0.2
mlをBalb／ｃマウスの背中皮下数ケ所に注射
した。10日間隔に同様の方法で２回追加免疫を
行ない、さらに２週間後TGF100μｇを溶解さ
せた生理食塩水0.2mlを静脈内投与した。最終
免疫後３日目にマウスの脾臓を無菌的に取り出
し、単細胞化し、混入したが赤血球細胞は、
0.83％塩化アンモニウム液で融解させた。脾細
胞は、冷却したハンクス液で数回洗條後、別に
培養調製したマウスミエローマ細胞（P3−Ｘ
−63−Ag8−U1）と３対１の量比で混合した。
遠心分離を行ない得られた脾細胞とミエローマ
細胞のペレツトに予め37℃に加温した30％ポリ
エチレングリコール（シグマ社）含む
RPNM1640培地１mlを遠心管を回転させなが
ら約30秒かけてゆつくり加えた。室温で60秒間
放置後、1000rpmで４分間遠心分離を行ない、
上清をアスピレーターで除いた後、５mlの
RPMI培地を加え、室温で２分間放置後、再び
1000rpmで５分間遠心分離を行なつた。得られ
たペレツトをRPMI培地で洗條後、ペレツトに
34mlのHAT培地〔100μMヒポキサンチン、
0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン、10％
牛胎児血清（FCS）を含むRPMI1640倍地〕を
加え、細胞を懸濁させた。懸濁液100μを96
ウエルプレート（ムンク社）３枚に分注し、炭
酸ガス倍溶装置（95％空気、５％CO2；温度37
℃、湿度100％）で培養を開始した。その後、
１〜３日ごとに倍地の半分量をHAT倍地で交
換し、７〜14日後にハイブリドーマの生育して
きたウエルの培養上清を採取し、その抗体価を
β−ガラクトシダーゼ標識TGFを用いたEIA
法で測定し、抗体価の高いハイブリドーマを５
コ選択した。限界希釈法でクローニングを行な
い、得られた８コのハイブリドーマから最も高
い抗体価を示したNo.３のハイブリドーマをヒト
TGFモノクロナール抗体産生細胞として取得
した。No.３のハイブリドーマを10％FCSを含む
RPMI1640倍地で培養を行ない、得らえた2.5
×107コの細胞を、あらかじめプリスタン0.5ml
を１週間前に腹膣内注射したBalb／ｃマウス
腹膣内に投与し、腹水腫瘍を作らせ10日後に腹
水を採取し、同様な方法で腹水50mlを調製し、
ヒトTGFモノクロナール抗体液として使用し
た。 (3) 不溶性担体としてビーズを用いたサンドイツ
チEIAによるTGFの測定 (1) 抗体固定化ビーズの調製 (1)で得られた抗血清を常法に従い硫安分画
を行ないγ−グロブリン分画を回収し、次い
でTGFをセフアロース4Bに固定化したカラ
ムに、脱塩したヒトTGF抗体を含むγ−グ
ロブリン液を添加し、生理食塩水で充分洗滌
後、0.15M NaClを含有する0.1Mグリシン−
塩酸緩衝液（PH2.3）で抗体を溶出せしめ、
100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）に対して透析
を行ない、精製ヒトTGF抗体を得た。精製
抗体１mgを含有する100ｍＭリン酸緩衝液
（PH8.0）20mlに、ポリスチレンビーズ（積水
化学社製、粒径6.35mm）100粒を加え、５℃
で16時間、37℃で１時間反応させ、抗体をビ
ーズに固定化せしめた。ビーズは生理食塩水
で充分洗滌後、免疫反応用緩衝液（0.25％牛
血清アルブミン（BSA）、５ｍMEDTA、
0.1％アジ化ナトリウム、0.9％NaClを含有す
る10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4））に浸漬し、
５℃で保存し、固定化TGF抗体としての抗
体固定化ビーズを得た。 (2) β−ガラクトシダーゼーヒトTGFモノク
ロナール抗体結合物の製造 (2)で得られたヒトTGFモノクロナール抗
体を含有する腹水より、常法に従い硫安分
画、DEAT−セルロースクロマトグラフイ
ーを行ないTGFモノクロナール抗体を精製
した。精製抗体４mgを100ｍＭリン酸緩衝液
（PH8.0）1.8mlに溶解し、これに３−（2′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸スク
シンイミドエステル14.8μｇを含有するジメ
チルホルムアミド液200μ、および100ｍ
MEDTA水溶液20μを加えて５℃で１時間
反応せしめた。反応液をセフアデツクスＧ−
15（1.5×40cm）のカラムに添加し、50ｍＭ酢
酸緩衝液（PH5.0）で溶出を行ない、その素
通り画分を回収し、TGFモノクロナール抗
体のアミノ基に３−（2′−ベンゾチアゾリル
−ジチオ）プロピオニル基を導入した誘導体
を得た。次いでこの誘導体1.5mgを含有する
100ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）２mlにβ−ガ
ラクトシダーゼ（ベーリンガー社製）3.33mg
を含有する100ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）
0.666mlを加え５℃で16時間反応せしめた。
反応液をセフアデツクスＧ−150（1.5×95cm）
のカラムに添加し、生理食塩水で溶出を行な
い、その素通り画分を回収して、β−カラク
トシダーゼーヒトTGFモノクロナール抗体
結合体を得た。 (3) TGFの測定 精製TGFを免疫反応用内衝液を用いて、
１mlあたり５、10、20、40、80、160、320mg
の各濃度に溶解したものを標準TGF液とし
た。反応用試験管（シオノギチユーブ）に、
免疫反応用緩衝液300μと各標準TGF100μ
を加え、これに抗体固体化ビーズを１粒加
え、37℃で３時間反応せしめた。次いで酵素
標識抗体液50μを加え、さらに37℃で２時
間反応せしめ、反応終了後生理食塩水２mlを
加え撹拌洗滌後、洗液をアスピレーターで吸
引除却した。この操作を２回くり返し行なつ
た後、β−ガラクトシダーゼ活性測定用基質
液（0.5％ｏ−ニトロフエニール−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド、0.1％BSA、0.1％アジ
化ナトリウム、３ｍＭ MgCl2、0.9％NaCl
を含有する10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.7）0.5
mlを加え、37℃で60分間反応せしめた。反応
停止液（100ｍＭグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（PH11.0））２mlを加え反応を停止
させた後、その呈色を波長420nｍにて測定
した。 結果は第１図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお被検液（血清、尿等）中のTGF量
を測定する場合は、標準TGF液の代りに、
被検液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない、定量曲線と対照することにより被検
液中のTGF濃度を求めることができる。 実施例 ２ (1) ヒトTGF抗血清の作製 実施例１に順じて行なつた。 (2) ヒトTGFモノクロナール抗体の作製 実施例１に順じて行なつた。 (3) 不溶性担体としてマイクロプレート壁を用い
たサンドイツチEIAによるTGFの測定 (1) 抗体固定化マイクロプレートの調製 (1)で得られたヒトTGF抗体含有血清を常
法に従い硫安分画を行ないγ−グロブリン分
画を回収し、次いでTGFをセフアロース4B
に固定化したカラムに脱塩したヒトTGF抗
体を含むγ−グロブリン液を添加し、生理食
塩水で充分洗滌後、0.15M NaClを含有する
0.1Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.3）で抗体
をカラムより溶出せしめ、100ｍＭリン酸緩
衝液に対して透析を行ない、精製ヒトTGF
抗体を得た。精製抗体１mgを１mlあたり5μ
ｇの濃度に溶解させた100ｍＭリン酸緩衝液
（PH8.0）を、96ウエルプレート（ムンク社、
EIA用）の１ウエルに150μづつ分注し、５
℃で16時間、37℃で１時間反応させ、抗体を
プレートに固定化せしめた。プレートは生理
食塩水で充分洗滌後、0.5％BSAを含有する
100ｍＭリン酸緩衝液（PH8.0）を１ウエル
150μづづ加え37℃で２時間反応せしめた。
プレートは再び生理食塩水に洗滌後、免疫反
応用緩衝液を１ウエル150μづつ加え、５
℃で保存し、ヒトTGF抗体固定化プレート
として用いた。 (2) β−ガラクトシダーゼ−ヒトTGFモノク
ロナール抗体結合物の調製 実施例１に順じて行なつた。 (3) TGFの測定 精製TGFを免疫反応用緩衝液を用いて、
１mlあたり2.5、５、10、20、40、80、160mg
の各濃度に溶解したものを標準TGF液とし
た。ヒトTGF抗体固定化マイクロプレート
の１ウエルに各標準TGF液100μを加え37
℃で２時間反応せしめた。0.1％ツイーン20
を含む生理食塩水で各ウエルを３回洗滌した
後、β−ガラクトシダーゼ標識TGF液100μ
を各ウエルに加え37℃で２時間反応せしめ
た。再び0.1％ツイーン20を含む生理食塩水
で各ウエルを４回洗滌した後、β−ガラクト
シダーゼ活性測定用基質液（前述）150μ
を加え37℃で１時間反応せしめた。終了後、
500ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH11.0）を50μ加え、その呈色をコロナ２
波長マイクロプレート光度計（MTP−12）
を用い波長405nｍにて測定した。 結果は第２図に示す通りであり、本測定系
はきわめて良好な定量曲線を示すものであつ
た。なお被検液（血清、尿等）中のTGF量
を測定する場合は、標準TGF液の代りに、
被検液を免疫反応用緩衝液で５〜10倍に希釈
した液100μを加え、前記と同様の操作を
行ない、定量曲線と対照することにより被検
液中のTGF濃度を求めることができる。 また以下にTGFの製造例を挙げるが、こ
れに限定されるものではなく、例えば特願昭
58−61102号明細書に記載の方法によつて
TGFを製造し、これを用いてもよい。 参考例 １ 肺癌患者尿1100mlを0.01Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対し分子量カツト10000の透析膜（三光純
薬社製）を用いて４℃で２昼夜透析を行なつた。
透析内液は12000ｇにて60分間遠心分離し、沈澱
を除く。SP−セフアデツクス（フアルマシヤ社
製）をカラム（4.5cm×33cm）に詰め、0.01Mリ
ン酸環境液（PH8.0）で平衡化した後、上記透析
内液を流下し、有効成分を吸着させた後、同緩衝
液で充分洗浄し、ついで同緩衝液中、塩化ナトリ
ウム0.01M〜1.5Mの傾斜溶出を行なつた。（流速
22.5ml／時、温度４℃、塩化ナトリウム傾斜濃度
緩衝液4.8使用）TGFは同緩衝液中、塩化ナト
リウム濃度0.6〜1.0Mの位置に溶出され、活性分
画62.0mlを得た。本活性分画は後記のTGF活性
試験法において、5μで正常細胞は変質されコ
ロニーを形成した。本活性分画全量をダイヤフロ
ー分子篩膜PM−10（アミコン、フアーイースト、
リミツテツド社製（日本））を用いて脱塩、濃縮
をくり返し、1.2mlとし、これにトリフロロ酢酸
を加えて0.05％トリフロロ酢酸溶液とした。 アルキル基（C18）を結合させたシリカゲルを
担体とするシンクロパツクRP−Ｐ（シンクローム
社製）をカラム（4.1mm×250mm）に詰め0.05％ト
リフロロ酢酸で平衡化し、このカラム１本に上記
TGF、トリフロ酢酸溶液の1/3を流し吸着後0.05
％トリフロロ酢酸水で洗浄した後、同液中０〜90
％アセトニトリルの傾斜溶出を行ないアセトニト
リル濃度55〜75％位置に溶出される活性分画をと
る。以上の操作を３回行ない前記の分子篩膜によ
る濃度調整液全量を処理しTGF活性分画7.9mlを
分取した。本分画を凍結乾燥後、再び3.0mlの生
理食塩水に溶解し、この溶液をTGF試験法にか
け0.4μで正常細胞は変質されコロニー形成能を
示した。
【表】
TGF活性試験法
（TGFの軟寒天培地培養試験法）
材 料
(1) NRK−細胞（株49F）
(2) ５％牛胎児血清および１％非不可欠アミノ酸
添加ダルベツコ変法イーグル培地 (3) 精製寒天（Difco社製Noble Special Agar） (4) 直径60mmのペトリ皿操作 0.5％寒天含有の(1)の培地をペトリ皿一枚に５
mlづつ注加して下層培地とする。この上にNRK
細胞１×103個／mlを含む0.3％寒天含有培地をペ
トリ皿一枚に２mlづつ層積し上層培地とし、この
上0.5mlの生理食塩水に溶解した資料を加え、炭
酸ガスインキユベーター中に37℃で培養する、14
日後に培養器から取り出し、40倍のケンビ鏡でペ
トリ皿上の２mm2視野を10ケ所を無作為にえらび、
細胞数10個以上よりなるコロニーの数をかぞえて
その総数を成績とする。
添加ダルベツコ変法イーグル培地 (3) 精製寒天（Difco社製Noble Special Agar） (4) 直径60mmのペトリ皿操作 0.5％寒天含有の(1)の培地をペトリ皿一枚に５
mlづつ注加して下層培地とする。この上にNRK
細胞１×103個／mlを含む0.3％寒天含有培地をペ
トリ皿一枚に２mlづつ層積し上層培地とし、この
上0.5mlの生理食塩水に溶解した資料を加え、炭
酸ガスインキユベーター中に37℃で培養する、14
日後に培養器から取り出し、40倍のケンビ鏡でペ
トリ皿上の２mm2視野を10ケ所を無作為にえらび、
細胞数10個以上よりなるコロニーの数をかぞえて
その総数を成績とする。
第１図は実施例１における不溶性担体としてビ
ーズを用いたサンドイツチEIAによるTGFの定
量曲線を示し、第２図は実施例２における不溶性
担体としてマイクロプレート壁を用いたサンドイ
ツチEIAによるTGFの定量曲線を示す。
ーズを用いたサンドイツチEIAによるTGFの定
量曲線を示し、第２図は実施例２における不溶性
担体としてマイクロプレート壁を用いたサンドイ
ツチEIAによるTGFの定量曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 固定化トランスホーミンググロスフアクター
抗体と被検液とを反応せしめ、次いで酵素標識ト
ランスホーミンググロスフアクター抗体を反応せ
しめた後、固相と液相とを分離し、その分離した
いずれか一方の酵素標識の量を定量する方法にお
いて、該トランスホーミンググロスフアクターが
ニンヒドリン反応陽性、SDS−電気泳動において
単一であり、酸および熱に対して安定で、トリプ
シン及びジチオスレイトール処理により失活し、
ゲル過により推定分子量28000〜35000を示す理
化学的特性を有するものであることを特徴とする
被検液中のトランスホーミンググロスフアクター
の酵素免疫測定法。 ２ トランスホーミンググロスフアクターが、ヒ
トトランスホーミンググロスフアクターである特
許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ 固定化トランスホーミンググロスフアクター
抗体が、移動相不溶化担体に結合したトランスホ
ーミンググロスフアクター抗体である特許請求の
範囲第１項記載の測定法。 ４ 固定化トランスホーミンググロスフアクター
抗体が、連続相不溶化担体に結合したトランスホ
ーミンググロスフアクター抗体である特許請求の
範囲第１項記載の測定法。 ５ トランスホーミンググロスフアクター抗体
が、モノクロナール抗体である特許請求の範囲第
１項記載の測定法。 ６ 酵素が、酸化還元酵素である特許請求の範囲
第１項記載の測定法。 ７ 酵素が、加水分解酵素である特許請求の範囲
第１項記載の測定法。 ８ 加水分解酵素が、β−ガラクトシダーゼであ
る特許請求の範囲第７項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58102394A JPS59226864A (ja) | 1983-06-07 | 1983-06-07 | トランスホ−ミンググロスファクタ−の酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58102394A JPS59226864A (ja) | 1983-06-07 | 1983-06-07 | トランスホ−ミンググロスファクタ−の酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59226864A JPS59226864A (ja) | 1984-12-20 |
| JPH0441307B2 true JPH0441307B2 (ja) | 1992-07-07 |
Family
ID=14326227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58102394A Granted JPS59226864A (ja) | 1983-06-07 | 1983-06-07 | トランスホ−ミンググロスファクタ−の酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59226864A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02126157A (ja) * | 1988-11-04 | 1990-05-15 | Tosoh Corp | ヒトトランスフォーミンググロースファクターβの免疫学的測定方法 |
| CN1355882A (zh) * | 1999-04-09 | 2002-06-26 | 韩美药品工业株式会社 | 定量转化生长因子－β1的方法以及通过使用该方法检测癌症的方法 |
| KR100378746B1 (ko) * | 1999-04-09 | 2003-04-07 | 한미약품공업 주식회사 | 체액내 활성 세포증식억제인자-베타1의 정량 방법 및 이를이용한 암 검사 방법 |
-
1983
- 1983-06-07 JP JP58102394A patent/JPS59226864A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59226864A (ja) | 1984-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0511011B1 (en) | Novel antibodies and methods for their use | |
| JP2758394B2 (ja) | ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナール抗体 | |
| JPS59157569A (ja) | 異なる区分又は下位区分の単一クロ−ン抗体を用いる二部位免疫検定法及びその試験キツト | |
| US5643731A (en) | Use of pairs of leucine zipper peptides in immunoassay methods | |
| EP0311383B1 (en) | Monoclonal antibody to methamphetamine, preparation of the same, assay method and assay kit of methamphetamine | |
| FI83669C (fi) | Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas. | |
| JPH0441307B2 (ja) | ||
| JPH08217800A (ja) | 免疫学的測定法によるヒトプロマトリックスメタロプロテアーゼ７の定量 | |
| JPWO1992011384A1 (ja) | 抗ヒトプラスミン−α↓２−プラスミンインヒビター複合体抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| JPH0827286B2 (ja) | ヒト胎盤由来酸性グルタチオンｓ−トランスフェラ−ゼの測定方法及び試薬キット | |
| JPS59216058A (ja) | トランスホ−ミンググロスフアクタ−の定量法 | |
| JP3888695B2 (ja) | ヒトｌｅｃｔ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット | |
| JPH02221300A (ja) | イムノアフィニティーマトリックス | |
| Bose-Bierne et al. | Production and characterization of four monoclonal antibodies against porcine pancreatic colipase | |
| JP3174492B2 (ja) | ウサギｍｍｐ−３に対するモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 | |
| JPH0977799A (ja) | ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−ｍｉｆ）に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ | |
| JPH03183483A (ja) | ポリペプチド、組換ｄｎａ、微生物、ポリペプチドの製法、群特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体の製法、及びエンテロウイルス感染の群特異的免疫学的検出法 | |
| JPH07268000A (ja) | 免疫吸着体とその製造法 | |
| JPS6018764A (ja) | トランスホ−ミンググロスフアクタ−の免疫測定法 | |
| JPH03127997A (ja) | ヒト１ｇＥ結合因子に特異的なモノクローン抗体、それを産生するハイブリドーマおよびその用途 | |
| WO2000009739A1 (en) | Monoclonal antibody against canine trypsin | |
| WO1989002078A1 (fr) | Procede de diagnostic de rhumatismes articulaires chroniques | |
| JPH02283293A (ja) | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体 | |
| JPS62104591A (ja) | モノクロ−ナル抗体のスクリ−ニング法 | |
| JPH0376423B2 (ja) |