JPH0376423B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマクロライド系抗生物質の定量法およ
びこの定量法に好適に使用され、新規な生産法に
よつて得られるマクロライド系抗生物質の抗体に
関するものである。 従来のマクロライド系抗生物質の定量には検定
するに十分な量の培養が必要であり、抗菌活性に
基づくため代謝物を含んだまゝ測定している。ま
た薄層クロマトグラフイーおよび高速液体クロマ
トグラフイー抽出操作が必要である。従来法では
測定値が不正確になり且つ操作が繁雑である欠点
がある。 一方本発明では、マクロライド抗生物質−蛋白
質結合体を用いて抗体を産生し、またマクロライ
ド抗生物質−β−ガラクトシダーゼ結合体の標識
酵素を調製し、さらに両者を用いる競争法（２抗
体法）によつてマクロライド系抗生物質を定量し
た。この方法により微小量の活性型マクロライド
抗生物質を簡便かつ正確に定量することができ
た。 本発明者らは研究した結果、17位置にアルデヒ
ド基を有す16員環マクロライド系抗生物質（以下
Ｍという）の第17位置にキヤリアープロラインを
結合せしめ、これをヒト以外の哺乳動物に免疫せ
しめ、次いでその血液を採取して上記のＭに対す
るＭ抗体が極めて特異性を有する抗体でかつ効率
よく産生されることを知つた。 更に本発明者らは、産生されたＭ抗体と免疫反
応を良好に行ない得るＭの酵素標識体を得、Ｍを
含有する被検液中のＭ定量における上記のＭ抗体
および酵素標識Ｍを用いる定量法を確立した。本
発明は上記知見に基づいて完成されたものであ
る。 さらに本発明において、そのＭ抗体として不溶
性担体に固定化した固相体として用いる固相法に
よる競争反応の定量法を行なつてもよく、また可
溶性のままのＭ抗体を用いてその反応後の分離に
おいてＭ抗体に対する特異的抗体を用いる２抗体
法による競争反応の定量法を行なうこともでき
る。さらにこの２抗体を不活性担体に固定化せし
め固相体として用いることもできる。 本発明のＭ抗体および酵素標識Ｍを得るための
Ｍは17位置にアルデヒド基を有する16員環マクロ
ライド系抗生物質であれば種々のマクロライド系
抗生物質例えば、９−ヒドロキシ系16員環マクロ
ライド抗生物質または９−アシルオキシ系16員環
マクロライド抗生物質を下記一般式〔〕にて示
すが、これらは特に限定するものではない。 また一般式〔〕で表わされる塩基性16員環マ
クロライド抗生物質の構造式における置換基R₁、
R₂、R₃、R₄の例示は以下に挙げるもので、R₁、
R₂、R₃はいずれも水素原子または低級アルカノ
イル基を示し、またR₄は低級アルカノイル基を
示すが、何んらこれらに限定されるものではな
い。 【表】 【表】 【表】 上記の種々の16員環マクロライド抗生物質は、
対象として好ましい化合物の例示であり、これら
のマクロライド系抗生物質のほかに、12−13位に
エポキシ基を有するマクロライド系抗生物質、例
えばマリドマイシン（YL−704C₃）、マリドマ
イシン（YL−704C₄）、マリドマイシン
（YL−704C₁）、マリドマイシン、マリドマイ
シン、マリドマイシンや９−カルボニル基て
あるマクロライド系抗生物質、例えばカルボマイ
シンＡ、カルボマイシンＢ、タイロシン、その他
スピラマイシン、スピラマイシン、スピラマ
イシン、アセチルスピラマイシン、ロサミシ
ン、アンゴラマイシンおよびそれらの代謝物など
を使用することができる。 本発明で使用するに適するキヤリアープロテイ
ンはアルブミン、ヘモシアニン、γ−グロブリ
ン、サイログロブリンおよびポリアミノ酸などで
ある。次に酵素標識Ｍを得るに当つて用いられる
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、転
位酵素、リパーゼ、イソメラーゼ、リガーゼが適
宜選択使用されるもので、例えばラクテートデヒ
ドロゲナーゼ、マレイトデヒドロゲナーゼ、マル
トースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホス
フエートデヒドロゲナゼー、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ、グルタメイトデヒドロゲナーゼ、α−
グリセロールホスフエートデヒドロゲナーゼ、ラ
クテートオキシダーゼ、マレイトオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダー
ゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダー
ゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、カタラーゼ、NADオキシダーゼ、α−アミ
ラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、リ
パーゼ、アルカリホスフアターゼ、アミノペプチ
ターゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロキナーゼ、ピ
ルベートキナーゼなどが挙げられる。さらにこれ
らの酵素、キヤリアープロテインおよびＭは、あ
らかじめ任意のスペーサーの導入を用いてもよ
く、例えばサクシンアルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、アジポアルデヒドなどのジアルデヒド化合
物；ω−アミノ酪酸、ω−アミノグルタミン酸の
酸クロライド；サクシンイミドエステル、ｐ−ニ
トロフエニルエステルなどの反応性誘導体；マロ
ン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などの
ジカルボン酸の反応性誘導体；ヘキサメチレンジ
アミン、デカメチレンジアミンなどのジアミン化
合物、３−（2′−ピリジル−ジチオ）プロピオン
酸、３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロ
ピオン酸などの反応性誘導体；Ｓ−アセチルメル
カプトサクシニツクアンハイドライド、２−アミ
ノエタンチオールなどのチオール化合物などのス
ペーサー導入試薬の１種または２種以上を用いて
新たにアルデヒド基、カルポキシル基、アミノ
基、チオール基などの官能基を導入してもよい。
次いで、このようなキヤリアープロテインを用い
るキヤリアープロテイン−Ｍ結合体または酵素を
用いる酵素標識Ｍを得るに当つては、このＭおよ
びキヤリアープロテインまたは酵素の有するアミ
ノ基、アルデヒド基、水酸基、カルボキシル基、
チオール基など、さらに導入された官能基に基づ
いて両者を結合し得る架橋試薬を用いて得られ
る。また用いられる架橋試薬としてはアミノ基、
水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、チオー
ル基などの官能基と反応し得る基を２個以上有す
る多官能性試薬であればよく、例えばサクシンア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポアルデヒ
ドなどのジアルデヒド化合物；マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸
またはその反応性誘導体；ヘキサメチレンジイソ
シアナート、２，４−トルエンジイソシアナート
などのジイソシアナート化合物；ヘキサメチレン
ジイソチオシアナートなどのジイソチオシアナー
ト化合物；ヘキサメチレンジアミン、デカメチレ
ンジアミンなどのジアミン化合物；マレイミド安
息香酸、マレイミドフエニル酢酸などのマレイミ
ドカルボン酸またはその反応性誘導体；Ｎ，
N′−エチレンビスマレイミド、Ｎ，N′−ｏ−フ
エニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合
物；ビスジアゾベンジジン、ジエチルマロンイミ
デート、ジメチルアジピンイミデート、Ｎ，
N′−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、３
−（2′−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸などの
チオカルボン酸化合物またはその反応性誘導体な
どが挙げられる。これらの多官能性試薬は、用い
るＭと酵素との結合に関与するアミノ基、カルボ
キシル基、アルデヒド基、水酸基、チオール基な
どの官能基を考慮して選択使用すればよい。 さらにキヤリアープロテイン−Ｍ結合体、酵素
標識Ｍを製造するに当つて例えばPH６〜8.5の緩
衝液、メタノール、エタノール、アセトン、ジオ
キサン、ジメチルスルホキサイド、ジメチルアセ
トアミド、テトラヒドロフランなどの有機溶媒、
またはこれらの混合溶媒中０℃〜40℃にてＭまた
はそのスペーサー導入試薬誘導体と多官能性試薬
とを反応せしめる。この際使用する割合として
は、Ｍに対して多官能性試薬を等モル比以上使用
すればよく、M1分子当りに結合せしめるキヤリ
アープロテインまたは酵素分子量に基いて決定す
ればよい。次いでこの反応終了後、必要に応じて
精製し、これにキヤリアープロテインまたは酵素
を加え、特に酵素標識Ｍを得る場合には好ましく
は酵素の安定PHを有する緩衝液中にて反応せしめ
ればよく、さらに使用されるキヤリアープロテイ
ンまたは酵素の量としてはＭと等モル比以上結合
せしめるための量を用いればよい。次いでこのよ
うにして得られた生成物たるキヤリアープロテイ
ンまたは酵素とＭとの結合体は、吸着クロマトグ
ラフイー、ゲル過などの精製手段により精製採
取すればよい。 さらにＭ抗体を得るに当つては先づ上記にのべ
た如くキヤリアープロテイン−Ｍ結合体を調整す
る。これを抗原としてヒト以外の哺乳動物、例え
ばモルモツト、ウサギ、ラツト、マウス、ヤギな
どの抗体産生能のある動物を用い、通常の方法に
従つて免疫した後、採血して抗血清を得、さらに
抗体を分離する。この際用いるＭは、高度に精製
した単一のものであることが望ましいが、必ずし
もこれに限られるものではない。また抗体を得る
に当つて、例えば前記のキヤリアープロテイン−
Ｍ結合体粉末0.1〜１mgを生理食塩水0.1〜５mlに
溶解し、これに同量のコンプリート・フロイン
ト・アジユバンドを加え、充分乳化した後用いる
哺乳動物例えばウサギ、マウスなどの皮下または
皮内に注射し、１〜３週間毎に数回注射して免疫
せしめる。その後最終免疫の日より一定期間後採
血し、これを放置し、凝固せしめて遠心分離し、
Ｍ抗体を含有する抗血清を得る。またこの場合に
用いる動物としては抗体産生能のある動物であれ
ば何れを用いてもよく、多量の抗体を得るには大
型動物を用いるのが好ましい。通常はウサギ、マ
ウス、ヤギを用いるが何んら限定されるものでは
ない。さらにこれらの動物から得られたＭ抗体を
含有する抗血清からＭ抗体を得るには、通常用い
られる抗体の精製手段の方法によつて行なえるも
ので、例えば抗血清を硫安分画し、次いでイオン
交換クロマトグラフイーあるいはゲル過によつ
て精製、採取すればよい。さらに高純度に精製す
るにはＭを固定化した不溶性担体を基材として用
いるアフイニテイークロマトグラフイーにて吸着
し、次いで溶出を行なつて得ればよい。 さらにＭ抗体を得る別法としては、キヤリアー
プロテイン−Ｍ結合体を抗原として免疫させたヒ
ト以外の哺乳動物の脾細胞とミエローマ細胞とを
用いて融合せしめ、この融合細胞からＭに対する
モノクロナール抗体産生細胞を分離し、この融合
細胞を用いるＭ−モノクロナール抗体を製造する
方法で、特に哺乳動物としてマウスを用いる方法
がよく利用されている〔ネイチヤー（Nature）
256、495−497頁（1975）、ネイチヤー（Nature）
276、379−399頁（1978）、セル（Cell）14、９−
20頁（1978）、ネイチヤー（Nature）266、550−
552頁（1977）、ユウロ、ジヤーナル、イムノオロ
ジー（Eur.J Immunol.、）６ 511−519頁
（1976）、ケミカルアンドエンジニアリングニユー
ス（Chem.and Eng.News、）Jan.1.1979、15−17
頁〕。例えばBalb／ｃマウスを用いて、キヤリア
ープロテイン−Ｍ結合体含有生理食塩水とコンプ
リート・フロイント・アジユバンドとの乳化液を
皮下注射し、１〜３週間後複数回追加免疫を行な
い、最終免疫後３〜５日後にマウスの脾臓を摘出
し、適当な媒体中で脾細胞の単一細胞化した懸濁
液を調製する。次いでこの脾細胞３−10量に対し
てマウス由来のミエローマ細胞１量を用いて、37
℃、40−50％ポリエチレングリコール（分子量
1000〜1500）の存在下で適当な培地例えばRPMI
培地〔J.A.M.A.、199 519頁（1967）、J.Nat.
Cancer Inst.、36 405頁（1966）、In Vitro、
６、89頁（1970）〕で融合せしめ、次いで洗浄後
分離し、ウシ胎児血清含有RPMI培地に加え、さ
らにこの細胞懸濁液の微量づつを炭酸ガス雰囲気
中でヒポキサンチン、アミノプリテリン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有するRPMI培地（HAT
媒地）にて選択培養し、各培養液の上清を採取
し、その抗体価の高い培養細胞を選択し、さらに
用いたマウスBalb／ｃの胸線細胞を用いる限界
希釈法によりクローニングを行ない、Ｍ−モノク
ロナール抗体産生細胞を分取する。さらにこの細
胞を例えばウシ胎児血清含有RPMI培地またはダ
ルベツコMEM（Modified Egle Medium）にて
培養し、その上清を取得し、これを硫安分画、イ
オン交換クロマトグラフイーまたはゲル過によ
り精製してＭ−モノクロナール抗体を得る。また
別法としてＭ−モノクロナール抗体産生細胞を、
組織適合動物または無胸腺ヌードマウスの体内で
腫瘍として生育せしめ、これから採取、精製する
こともできる。さらにこのＭ−モノクロナール抗
体産生細胞は、ジメチルスルホキサイドまたはグ
リセロールなどの凍結保護剤を用いて血清含有増
殖培地にて液体窒素にて凍結保存できる。さら
に、このようなＭ抗体はそのまゝの可溶性の状態
で用いてもよく、または不溶性担体に固体化した
固相担体として用いることもできる。このような
固相担体としては、不溶性担体と上記の抗体とを
前記の多官能性試薬を用いて結合せしめたＭに対
する免疫結合活性を保持しているものであればよ
い。用いられる不溶性担体としては、用いる抗体
または多官能性試薬の官能基と反応し得る基を有
していればよく、または必要に応じて上記の如く
スペーサー導入試薬を用いて反応し得る基を導入
せしめたものであればよく、例えばアルブミン、
またはゼラチンなどの蛋白質の不溶化しもの、ア
ガロール、セルロース、デキストリンなどの多糖
類のエピクロルヒドリン処理による不溶化したも
のあるいは臭化シアン処理およびアミノ基導入の
ためのスペーサー導入試薬処理して不溶化したも
のなどの不溶性半合成高分子系担体、アクリロニ
トリル、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタ
アクリル酸、メタアクリル酸エステル、ビニルア
ルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノスチレ
ン、クロルスチレン、スルホスチレン、マレイン
酸、フマル酸などの重合体または共重合体などの
不溶性合成高分子系担体、ケイ素およびアルミニ
ウムなどの無機化合物の水酸基にアミノ基を導入
した不溶性無機系担体が挙げられる。これらの不
溶性担体は通常少なくとも過などの手段により
容易に単離できる粒径のものがよく、例えば径１
mm以上、好ましくは５mm以上のものがよく、ビー
ズ状のものが繁用される。またビーズ状の代り
に、免疫反応管の管底部の形状と相似した紡錘形
の形状のものとして用いることができる。さらに
免疫反応の材質、例えばガラスおよび合成高分子
材料自体を不溶性担体として利用することもでき
る。次にこのような不溶性担体の反応し得る基に
基にてＭ抗体を直接または多官能性試薬を用いて
結合せさせるのであるが、結合においては、通常
PH６−8.5の緩衝液、有機溶媒またはこれらの混
合媒体中、０℃〜40℃にて各々を反応せしめれば
よい。また別の固相体を製造する方法としては、
用いる不溶性担体の多孔性の吸着能を利用して吸
着固定化させることもできる。さらに、このＭ抗
体に対する特異的抗体、すなわち、このＭ抗体産
生の哺乳動物のグロブリン分画を用いて他種類の
哺乳動物、特に大型哺乳動物に免疫せしめて得ら
れた第２抗体を用い、この第２抗体を不溶性担体
に固定化せしめ、次いでこれにこのＭ−抗体を免
疫的手段にて結合せしめることによるＭ抗体の活
性を殆んど失活せしめることのない固定化手段に
よつて固相体を得てもよい。さらにこのようにし
て得られ固相体は、洗浄、保存すればよい。 さらにまた上記の固相体を用いる代りに、Ｍ抗
体を可溶性のままで用いる場合には、被検液中の
Ｍの定量反応におけるＭまたは酵素標識ＭとＭ抗
体との結合体と未反応物とを分離するので、Ｍ抗
体に対する特異的抗体が用いられる。この特異的
抗体は第２抗体とも呼ばれ、すなわちＭ抗体産生
の哺乳動物のグロブリン分画を抗原として用い、
これを公知の免疫手段に基いて他種類の哺乳動
物、特に大型哺乳動物に皮下、皮内に注射せしめ
て免疫し、その血液から抗血清を得、さらに公知
の精製手段により抗体を得ればよく、この場合、
通常の抗血清の状態で利用することが簡便であ
る。さらに、この抗体を上記の如く不活性担体
（Ｍ抗体固定化の手段による不溶化）として用い
ることができる。 次に本発明の定量法を実施するに当つて、先づ
Ｍの含有量を測定しようとする被検液、例えばＭ
を投与した患者の尿または血清、酵素標識Ｍおよ
びＭ抗体を免疫反応媒体、例えばリン酸緩衝液ま
たはベロナール緩衝液中にて４〜５℃程度にて約
１ないし72時間インキユベイトして競争反応せし
め、次いで免疫結合した部分、特に酵素標識Ｍ−
Ｍ抗体の結合部（以下Ｂという）と結合していな
い未反応の遊離部分、特に未反応の酵素標識Ｍの
遊離部（以下Ｆという）とを分離するためにＢ−
Ｆ分離を行なう。このＢ−Ｆ分離に当つて用いる
Ｍ抗体が固相体である固相法の場合には競争反応
後、固相体と反応液層とを過などの手段にて分
別し、洗浄後、固相体または液のいるぜか一方
の酵素活性値を測定すればよい。またＢ−Ｆ分離
に当つて、用いる抗体が可溶性のままで第２抗体
を用いる２抗体法の場合には競争反応後、第２抗
体、さらに好ましくはその第２抗体を含有する抗
血清、必要に応じてＭ抗体作成に用いた哺乳動物
と同一種類の動物の正常血清を加えて１〜12時間
インキユベイトし、その後3000rpm、10−30分程
度遠心分離して免疫反応によつて結合し、沈澱し
た部分(B)と上清(F)とを分別するかまたはこの第２
抗体を固定化して用いてこの固相を分別し、洗浄
後沈澱物もしくは固相または上清のいずれか一方
の酵素活性値を測定すればよい。 さらに上記の免疫反応の結合部である固相体お
よび沈澱物または未反応物を含む液および上清
のいずれか一方の酵素活性値を測定すればよい。 さらに上記の免疫反応の結合部である固相体お
よび沈澱物または未反応物を含む液および上清
の酵素活性の定量に当つては、用いた酵素の性質
に基づいて公知の種々の活性測定法によつて行な
えばよい。例えば酵素として酸化還元酵素、特に
酸化酵素を用いた場合には、その酵素の基質と溶
存酵素とを利用して基質酸化物および過酸化水
素、さらに場合によりアンモニアまたは炭酸ガス
を生成せしめる酵素反応を行なわせ、その酵素反
応によつて消費される成分、例えば酸素量および
生成される成分例えば過酸化水素、アンモニア、
炭酸ガスの量を定量することによつて測定され
る。さらに酸素、過酸化水素、アンモニアおよび
炭酸ガスの量は酸素電極、過酸化水素電極、イオ
ン電極およびガス電極などの電極による電気化学
的変化量として測定すればよい。さらにまた過酸
化水素量はペルオキシダーゼおよびグアヤコー
ル、４−アミノアンチピリンとフエノール、４−
アミノアンチピリンとジメチルアニリン、３−メ
チル−２−ペンゾチアゾリンとジメチルアニンな
どの呈色試薬、ホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシ
フエニル酢酸などの螢光試料などの水素供与体を
用いて呈色または螢光せしめ、その量を常法に従
つて測定してもよい。さらに酸化還元酵素でニコ
チン・アデニン、ジヌクレオチド（ホスフエー
ト）〔NAD（Ｐ）〕またはその還元型を基質とする
デヒドロゲナーゼを用いて基質に作用させその
NAD（Ｐ）または還元型NAD（Ｐ）の量を消費ま
たは生成せしめる反応により、その還元型NAD
（Ｐ）の量を波長340nｍにおける吸光度として測
定するか、テトラゾリウム塩、ジアホラーゼによ
るホルマザン呈色のサイクリング反応にて測定し
てもよい。さらにまた加水分解酵素の場合には、
加水分解酵素によつて用いた基質から検出できる
発色基を分解、遊離する合成基質を用いることが
好ましく、例えば加水分解酵素がβ−ガラクトシ
ダーゼの場合には、Ｏ−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドを基質としてその酵素反応
によつて遊離されるＯ−ニトロフエニルの量を波
長420nｍにおける吸光度として測定すればよい。 次に実施例を掲げて本発明を説明するが、これ
に限定されるものではない。 実施例 １ () 抗原の合成 17位置にアルデヒド基を有する16員環マクロ
イド系抗生物質の該アルデヒド基を酸化してカ
ルボキシル基に変換し、これにアミノ基をもつ
スペーサーとしてヘキサメチレンジアミンを結
合させてアミノ基を導入し、この末端アミノ基
と牛血清アルブミン（BSA）のアミノ基を架
橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて架橋し
た。 まず、リカマイシン（Ricamycin、TMS−
19−Ｑ）２ｍモルを、アセトン10ml、0.3Mス
ルフアミン酸５ml、0.2M次亜塩素酸ナトリウ
ム５mlの混合液に加え、室温で60分間反応せし
めた。反応後、アセトンを溜去し、７％アンモ
ニア水でPH９に調製した後、クロロホルム抽出
し、さらにこれに硫酸マグネシウムを加えて脱
水し、次いでクロロホルムを溜去して粉末を
得、これをシリカゲルカラムで精製して17位カ
ルボキシル化TMS−19−Ｑを得た。次いでこ
の１ｍモルをジメチルホルムアミド10mlに加
え、−15℃に冷却下、トリエチルアミン１ｍモ
ル、クロル炭素エチル1.1ｍモルを加えて５分
間放置後、ヘキサメチレンジアミン２ｍモルを
加え、氷冷中で60分間反応せしめた。反応後、
ヘキサン200mlを加えて沈澱せしめ、さらに沈
澱物をエーテル抽出後、乾固し、セフアデツク
スLH−20のカラムで精製（メタノールにて展
開）して17位にアミノ基を導入した。次いで化
合物0.2ｍモルを、少量のメタノール含有100ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH8.0）20mlに加えて溶解し、
これにグルタルアルデヒド40ｍモルを加えて室
温で４時間反応後、濃縮し、さらに水で洗浄後
沈澱物を回収し、これを少量のジオキサンに溶
解せしめ、BSA0.005ｍモル含有100ｍＭリン酸
緩衝液（PH8.0）15mlを加え、４℃で一度反応
し、反応後透析してBSA−TMS−19−Ｑの結
合体を得た。 この反応様式を示せば次の如くである。 上記抗原はTMS−19−Ｑ：BSA＝16：１の
割合で結合していた。 () 免疫方法 ウサギ（雄）の背部皮下にTMS−19−Ｑ量
として１mg量の上記抗原をアジユバント
（Adjuvant）と共に乳濁化し、隔週で投与し、
投与後10日で採血し、凝結、遠心分離により抗
血清（Ｍ抗体）を得た。 () 抗体価 (a) 酵素標識物の合成 上記の抗原の場合と同様にアミノ基をもつ
スペーサーを結合させ、得られた結合物
（25Mモル、90％ジメチルホルムアミド
（DMF）含有リン酸緩衝液）の末端アミノ基
を３−（2′−ベンゾチアゾール−ジチオ）プ
ロピオン酸スクシンイミドエステル（30μモ
ル、リン酸緩衝液）と反応せしめた後、これ
をカラム精製（セフアデツクスLH20を用い
るゲル過；展開溶媒として90％DMF含有
リン酸緩衝液使用）し、その反応生成物（β
−ガラクトシダーゼ１モル比使用に対して
2.5モル比使用）にβ−ガラクトシダーゼ
（0.002μモル、リン酸緩衝液）を加えて室温
下60分間反応せしめてβ−ガラクトシダーゼ
標識TMS−19−Ｑを得た。その標識率は97
％であつた。反応式で示せば次の如くであ
る。 （以下、β−Gal−TMS−19−Ｑと略す） (b) 試験系 【表】 抗体価は上記系でβ−Gal−TMS−19−
Ｑの50％と結合することができる抗血清の希
釈倍数とした。 【表】 (c) TMS−19−Ｑの標準曲線 上記の試験系にTMS−19−Ｑを添加して
標準曲線を求めた。 【表】 ↓
以下上記と同様に行なつた。 TMS−19−Ｑの標準曲線は第１図に示し
た。反応時間は90分である。 (d) 交差反応性 上記試験系にTMS−19−Ｑに代りに種々
のロイコマイシン（LM）誘導体および分解
産物を加え、交差反応率を求めた。交差反応
率はＢ／Ｔ＝0.5とする場合の各化合物の用量か らモル換算して求めた。なお、TMS−19−
Ｑの交差反応率を100％とした。 TMS−19−Ｑ−BSA結合体を用いた抗体
（No.４）のLM誘導体に対する交差性を第２
表に示した。 【表】 【表】 上記のように本発明の抗体は非常に高い特異
性をもち、TMS−19−Ｑの代謝産物との間
の交差性が僅かであることより血中濃度測定
に十分適用できる。 実施例 ２ () 抗原の合成 TMS−19−Ｑの代りにミデカマイシン
（Midecamycin）（MDM）を用いて実施例と
同様にして下記の抗原を合成した。 上記抗原はMDM：BSA＝6.5：１の割合で
結合した。 () 免疫方法 ウサギ（雄）の背部皮下にMDM量として
100μｇの抗原をアジユバンドと共に乳濁化し、
隔週で投与し、投与後10日で採血し、抗血清を
得た。 () 抗体価 (a) 標識物の合成 実施例１と同様にして合成した。標識率
79.7％ (b) 試験系 【表】 ↓
以下、実施例１と同様に行なつた。 【表】 実験例 ３ () 抗原の合成 ジヨサマイシン（Josamycin）（LAM₃）に
ついてTMS−19−Ｑと同様にして下記の抗原
を合成した。 上記抗原はLMA₃：BSA＝9.4：１の割合で
結合していた。 () 免疫方法 実施例１と同様な方法で行なつた。 () 抗体価 (a) 標識物の合成は実施例１と同様にして行な
つた。標識率65.9％。 (b) 試験系 【表】 ↓
以下実施例１と同様に行なつた。 【表】 実施例 ４ () 抗原の合成 ロイコマイシンA₇（Leucomycin A₇）につ
いて実施例１と同様にして下記の抗原を合成し
た。 上記の抗原はLMA₇：BSA＝38：１ の割合で結合していた。 () 免疫方法 実施例１と同様な方法で行なつた。 () 抗体価 試験系 【表】 ↓
以下実施例１と同様に行なつた。 【表】 実施例 ５ () 抗原の合成 ロイコマイシンＶ（Leucomycin Ｖ）
（LMV）について実施例１と同様にして下記抗
原を合成した。 上記抗原はLMV：BSA＝30：１の割合で結
合していた。 () 免疫方法 実施例１の方法と同様に行なつた。 () 抗体価 試験系 【表】 ↓
以下実施例１と同様に行なつた。 【表】 比較例 リカマイシンの2′位にサクシニル基を導入し、
ついでこの末端カルボキシル基に実施例１と同様
にしてBSAを結合させて結合体Ｓを得た。 このＳ結合体について実施例１（Ｌ−１〜４）
と同様にして抗体価（S1〜３）を求めた。結果
を次表に示す。 【表】

【図面の簡単な説明】

添付図面第１図はリカマイシン（TMS−19−
Ｑ）についての標準曲線を示すグラフである。 図中縦軸は420nｍの波長における吸光度、横
軸はリカマイシン濃度（ｎｇ／ml）である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 被検液とマクロライド系抗生物質酵素標識物
   とを、17位置にアルデヒド基を有する16員環マク
   ロライド系抗生物質の17位置にキヤリア−プロテ
   インを結合させた結合体を使用して得られたマク
   ロライド系抗生物質抗体に反応させ、次いで酵素
   標識マクロライド系抗生物質−マクロライド系抗
   生物質抗体結合体、未反応酵素標識マクロライド
   系抗生物質をそれぞれ分離し、その後分離したい
   ずれか一方の酵素標識量を定量することを特徴と
   する被検液中のマクロライド系抗生物質の定量
   法。 ２ マクロライド系抗生物質抗体が不溶性担体に
   固定化させたマクロライド系抗生物質抗体である
   特許請求の範囲第１項記載の定量法。 ３ マクロライド系抗生物質抗体が可溶性であ
   り、分離においてマクロライド系抗生物質抗体に
   対する特異的抗体を用いる特許請求の範囲第１項
   記載の定量法。 ４ 酵素がβ−ガラクトシダーゼである特許請求
   の範囲第１項記載の定量法。 ５ 17位置にアルデヒド基を有する16員環マクロ
   ライド系抗生物質の17位置にキヤリア−プロテイ
   ンを結合させた結合体をヒト以外の哺乳動物に投
   与、感作せしめて得られたことを特徴とするマク
   ロライド系抗生物質抗体。 ６ キヤリア−プロテインがアルブミン、ヘモシ
   アニン、γ−グロブリンまたはサイログロブリン
   である特許請求の範囲第５項記載のマクロライド
   系抗生物質抗体。