JPS59211863A - マクロライド系抗生物質の定量法およびマクロライド系抗生物質抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はマクロライド系抗生物質抗体の産生法およびそ
の定量法に関するものである。

従来のマクロライド系抗生物質の定量には検定するに十
分な量の培養が必要であシ、抗菌活性に基づくため代謝
物を含んだま＼測定している。また薄層クロマトグラフ
ィーおよび高速液体クロマトグラフィー抽出操作が必要
である。従来法では測定値が不正確になシ且つ操作が繁
雑でおる欠点がある。

一方体発明では、マクロライド抗生物質−蛋白質結合体
を用いて抗体を産生じ、またマクロライド抗生＊［−β
−ガラクトシダーゼ結合体の標識酵素を調整し、さらに
両者音用いる競争法（２抗体法）によってマクロライド
糸抗生物質を定量した。この方法により微小量の活性型
マクロライド抗生物質を簡便かつ正確に定量することが
できた。

本発明者らは研究した結果、１７位置にアルデヒド話金
有する１６員項マクロライド系抗生物質（以下Ｍという
）をキャリアープロティンと結合せしめ、これ金ヒト以
外の哺乳動物に免疫せしめ、次いでその血液を採取して
上記のＭに対するＭ抗体が極めて特異性を有する抗体で
かつ良好に産生されることを知った。

更に本発明者らは、産生されたＭ抗体と免疫反応を良好
に行ない得るＭの一素漂識本金得、Ｍを含■する波検液
中のＭ定量における上記のＭ抗体および非水・漂ａＭを
用いる定鉱法を確立叫た。本発明は上ｄｒ０２知見に基
ついて完成されたものである。

さらに本発明において、そのＭ抗体として不浴性担体に
固定化した固相本として用いる固相法による競争反応の
定１法を行なってもよく、また可溶・１生のままのＭ抗
体音用いてその反応後の分離においてＭ抗体に対する特
異的抗体を用いる２抗体法による競争反応の定徽法を行
なうこともできる。芒らにこの２抗体を不活性担体に固
定化せしめ固相体として用いることもできる。

本発明のＭ　Ｍ、　１４：および＃素標識Ｍ金辱るため
のＭは１７位置にアルデヒド基金有する１６員壊マクロ
ライド系抗生物質であれば種々のマクロライド糸抗生物
質例えば、９−ヒドロキシ糸１６員壌マクロライド抗生
物質または９−アシルオキシ系１６員世マクロライド抗
生物貞を下記一般式（Ｉ）にて示すが、これらは特に限
定するものではない。

７ また一般式ＣＩ）で表わされる塩基性１６員項マクロラ
イド抗生物質の構造式における置換基ａ、％　Ｒ２、Ｒ
，、Ｒ４のカポは以下に挙げるもので、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ
ｓはいずれも水素原子または低級アルカノイル基を示し
、′まだＲ４は低級アルカノイル基を示すが、何んらこ
ｎらに限定されるものではない。

上記の種々の１６負峯マクロライド抗生吻貢は、対象と
して好ましい化合７勿のｖｌｌ／Ｊ＼でめ９、これらの
マクロライド系抗生物質のほかに、１２−１３位にエポ
キシ基金有するマクロライド系抗生物質、例えばマリド
マイシンＩ　（ＹＬ−７０４Ｃｓ　　）、マリドマイシ
ン■（Ｙ　Ｌ　−７０４Ｃ４）　、マリドマイシン■（
ＹＬ−７０４０１）、マリドマイシンパ、マリドマイシ
ンｖ１マリドマイシン■や９−カルボニル基であるマク
ロライド系抗生物質、例エバカルボマイシンＡ１カルボ
マイシンＢ。

タイロシン、その池スピラマイシン１１スピラマイシン
■、スピラマイシンｍ１アセチルスヒラマイシン、ロサ
ミシン、アンゴラマイシンおよびそれらの代謝物などを
使用することができる。

本発明で匣用するに込するキャリアープロティンはアル
ブミン、ヘモシアニン、ｒ−グロブリン、サイログロブ
リンおよびポリアミノ酸などである。次に酵素標識Ｍを
得るに当つて用いられる酵素としては、酸化還元酵素、
加水分解酵系、私位酵素、リパーゼ、イソメラーゼ、リ
ガーゼが遍宜選択訣用されるもので、例えばラクテート
デヒドロゲナーゼ、マルトーデヒドロゲナーゼ、マルト
ースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ポスフェート
デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グル
メメイトデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ、ラクテートオキシダーゼ、マレ
イドオキシダーゼ、グルコースオキ７ダーゼ、アルコー
ルオギシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンアンオ午
シダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミ／オキシダーゼ
、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、ＮＡＤオキ／ダーゼ、α−アミラーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、リゾチーム、リパーゼ、アルカリホスノ
アターゼ、アミノベア°チターゼ、ヘキソキナーゼ、グ
リセロキナーゼ、ピルベートキナーゼなどが挙げられる
。さらにこれらの４素、キャリアーグコティン紛よヒＭ
　７ま、あらかじめ注意のスペーサーのノぴ人を用いて
もよく、例えばサクシンアルデヒド、グルタルアルデヒ
ド、アジボアルデヒドなどのジアルデヒド化合１勿；ω
−アミノ酪岐、ω−アミノクルタミン酸の酸クロライド
；サクシンイミドエステル、ｐ−、ニトロフェニルエス
テルなどの反応性、Ａ４体；マロン酸、コハク酸、グル
タル埴、アジピン＆ｉどのジカルボンばの反応性誘尋体
；ヘキ丈メチレンジアミン、デ刀メチレンジアミンなど
のジアミン化合９り、３−（２’−ピリジル−ジチオ）
プロピオン酸、３　　（２’　−ベンシナアゾリル−ジ
チオ）プロピオン酸などの反応性訪導体；Ｓ−アセチル
メルカプトサクシニックアンハイドライド、２−アミノ
エタンチオールなどのチオール化合物などのスペーサー
導入試薬の１４止１７ｃは２Ａ１以上’ｋ　７−７４い
て新たにアルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、チ
オール基などの官能基を尋人してもよい。次、いで、こ
のようなキャリアープロティン金柑いるキャリアーゾロ
ティア　−Ｍ　、ｉ；、：合体−！たは酵素金柑いる「
孝糸襟１鐵Ｍ金１好るに当っては、このＭおよびギヤリ
アープロティンまたｉｊ：酵素の有するアミノ承、アル
デヒド基、水ｒ投基、カルボキシル括、チオール基など
、さらに導入された官ＩＩヒ基に基ついて両者を結合し
得る架５而試桑を用いて得られる。また用いられる架橋
試薬としてはアミン基、水酸基、カルボキシル基、アル
デヒド基、チオール基などの盲目ヒ基と反応し寿る基ｆ
：２　個以上有する多官能性試薬であればよく、例えば
サクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジボアル
デヒドなどのジアルデヒド化合物；マロン酸、コハク酸
、グルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸または−
ｔの反応性誘導体；ヘキサメチレンジイソシアナート、
２，４−トルエンジイソシアナートなどのジイソシアナ
ート化合物；ヘギサメチレンジインチオシアナートなど
のジイソチオシアナート化合物；ヘキサメチレンジアミ
ン、デカメ、チレンジアミンなどのジアミン化合物；マ
レイミド安、す、’ａ′Ｉａ　、マレイミドフェニル酢
改などのマレイミドカルボン酸またはその反応性誘導体
：Ｎ、Ｎ’　−エチレンビスマレイミド、Ｎ、Ｎ’　−
ｏ　−フェニレンジマレイミドなどのシマレイミド化合
物；ビスジアゾベンジジン、ジエチルマロンイミデート
、ジメチルアジピンイミデート、Ｎ。

Ｎ′−ポリメチレンビスヨードアセトアミト、３−（２
’−ビリジルージチオ）プロピオン酸などのチオカルボ
ン殿化合物捷たはその反応性誘導体などが挙げられる。

これらの多官能性試薬は、ＪＴ］′ムるＭと酵素との１
１活合に関与するアミノ基、カルボキシル基、アルデヒ
ド基、水酸基、チオール基などの官能基を考慮して選択
使用すればよい。

さらにキャリアープロティン−Ｍ、結合体、酵素標識Ｍ
を製造するに当って例えばｐｎ　６〜８．５の緩衝液、
メタノール、エタノール、アセトン、ジオキサン、ジメ
チルスルホキサイド、ジメチルアセトアミド、テトラヒ
ドロフランなどの有機〃１媒、兼たはこれらの混合溶媒
甲ＯＣ〜４０ＣにてＭまたはそのスペーサ−ノ！Ｚ入試
桑誘１ｈ体と多官能１生試薬とを反応せしめる。この際
使用する割合としては、Ｍに対１−て多官能性ｉ試薬を
等モル比以上使用すればよく、Ｍ１分子当りに結合せし
めるキャリアープロティン−ｊ：た（・よＩｔ　＞４＜
分子辰に基いて決定すｒしはよい。次いでこの反応終了
後、必映に応じてう１１１製シフ、これにキャリアープ
ロティン丑たはｆ忰素を加え、喝に酵素標、ｊ〜Ｍを得
る場合には好１しくは酵素の安定ｐＨｆ：有する緩衝、
俟中にて反応・切し７めればよく、さらに使用されるキ
ャリアープロティン−Ｆたは酵素の愉としてはＭと等モ
ル比以上結合せしめるための１Ｉｉ−全ハｊいればよい
。次いでこのようにして倚られた生成物たるキャリアー
プロティンまたは酵素とＭとの結合体は、吸着クロマト
グラフィー、ゲルΔ」過などの精製手段によ＃）精装保
取ずればよい。

さらにＭ抗体ヲ得るに当って、よ先づ上記にのべた如く
キャリアープロティン−Δ４　、：、＃合１４−ｋ　＋
ｉ！喝鷲する。こ′ｎ′ｆ３：抗原としてヒト以外の哨
乳動物、例えばモルモット、ウサギ、ラット、マウス、
ヤギなどの抗体産生ト、ヒのりる動物を用い、通濱の方
法に従って免疫した麦、採血して抗血清を得、さらに抗
体を分離する。この除用いるＭは、高度に精製した単一
のものであることが望寸しい、−！だ抗体を／４）るに
当って、例えは前記のキャリアープロティン−Ｍ結合体
粉末０．１〜１〜全１〜食塩水０．１〜５７！に、容解
し、これに同量のコンプリート・７０インド・アジュバ
ントを加え、充分乳化した装用いる哺乳動物例えばウサ
ギ、マウスなどの皮下ｌたは皮内に注射し、１〜３週間
毎に数回注射して免疫せしめる。その後最終免疫の日よ
り一定力」間抜採血し、これ全放置し、凝固せしめて遠
心分離し、Ｍ抗体を含有する抗血ｆｆ！を得る。またこ
の場合に用いる動物としては抗体産生能のある動物であ
れば何れ音用いても、しく、多１６：の抗体を得るに・
′す大型動、勿をハＪいるのが好ましい。通常、・まウ
サギ、マウス、ヤギを用いるが何んら限定されるｔので
はない。さらにとｔらの動４勿から１替られたＭ抗体を
計有する抗血７ｙからＭ抗体をｆ、ｊ）るには、＋ｉ（
Ｊ常用いられる抗体の精製手段の方法ＶＣよって行なえ
るもので、例えば抗血清′ｆｆ：侃安分画し、次いでイ
オン交１ラサクロマトグラフ・ｒ−あるいはゲルｆ過に
よって箔製、採取すればよい。１らに高純度に、所製す
るにＶよＭ全固定化し２こ不溶性担体を基材として用い
るアフィニティークロマトグラフィーにて吸肩し、次い
で１谷出全行なって出ればよい。□さらにｒｌｌ　Ｊ、
ｙ＋、庫を得る別法としては、キャリ′γ−グロデイン
ーＭ結合体を抗原として免疫τＮせたヒト以外の噛Ａｍ
物の（ｊ♀細胞とミエローマｔｒＩＩＩ垢と音用いて融
合せしめ、この融合１Ｍ１ｌＩ胞からＭに対するモノク
ロナール抗体産生、１朋ｊ［ｉＩ令分ｉａ並し、この融
合、浦胞を用いるＭ−モノクロナール抗体を製造する方
法で、特に哺乳動物としてマウスに用いる方ｌ；とがよ
く利用さ、７シている〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）
亜、４９５−４９７貞（１９７５）、ネイチャーｊ　Ｎ
ａｔｕｒｅ　）　２７６．３９７−３９９頁（１９７８
）、セル（Ｃｅ１ｌ　）　１４．　９−２０］（１９４
８）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）１し、５５０−５
５２貝（１９７７）、ユウロ、ジャーナル、イムノオロ
ジー（Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｃ＋１．　、）　６５１１−５１９頁
（１９７（５）、ケミカルアンドエンジニアリングニュ
ース（Ｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｅｎｇ、　Ｎｅｗｓ、）　
Ｊａｎ、　１．、１９７９．１５−１７頁〕。り０えば
Ｂａ１ｂ／ｃ　　マウスを用いて、キャリアープロティ
ン−Ｍ結合体含有生理な塩水とコンプリート・フロイン
ト・アジュバントとの乳化液を皮下注射し、１〜３週間
唆複数回追加免疫を行ない、最１終免疫後３〜５日後に
マウスの牌ｊ臓ヲ摘出し、５量当な媒体中で牌Ｉ！（１
１砲の単−細胞化［７た懸濁液全調製する。次いでこの
牌ＭＪ胞３−１０純に対してマウス由来のミエローマ細
胞１量を用いて、３７℃、４０−５０％ポリエチレング
リコール（分子量１０００〜１５００）の存在下で過白
な培地レリえばＲＰ　Ｍ　Ｉ培地［Ｊ、Ａ、ＫＡ、。

１９９５１９真（１’Ｊ６’／　）、　Ｊ、　Ｎａｔ、
　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、。

３６４０５貞（１９６６）　、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　、
　６　、８９頁（１９７０）　）　　で融合せしめ、次
いで洗浄区分離し、クシ胎児皿清よ南ＲＰＭＩＪ４！１
池に加え、さらにこの細ノ抱憑濁液の微黛っつを炭ばガ
ス雰囲ヌζ中でヒポキサンチン、アミノグテリジケ抹取
し、その抗体１曲の商いＪ＠養細胞を選択し、さらに用
いたマウスＢａ１ｂ／ｃ　　の胸庫細胞全用いる限界布
拭法によシクローニングを行ない、Ｍ−モノクロナール
抗体産生細胞を分取する。さらにこの細胞を例えばウシ
胎児血清冴壱ＲＰＭＩ培地またはダルベツコＭＥＭ培地
（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　）　　
にて培養し、その上清全取得し、これを硫安分画、イオ
ン交侠クロマトグラフィーまたはゲル濾過によシ精製し
てＭ−モノクロナール抗体を得る。

また別法としてＭ−モノクロナール抗体産生細胞を、組
織適合動物または無胸腺ヌードマウスの体内でｌ腫瘍と
して生゛げせしめ、これから採取、精製することもでき
る。さらにこのＭ−モノクロナー抗体産生ａ胞は、ジメ
チルスルホキサイド筐たはグリセロールなどの凍結保護
剤を用いて血清含有増殖培地にて液体窒素にて凍結保存
できる。さらに、このよりなＭ抗体はそのま＼の可溶性
の状態で用いてもよく、または不溶性担体に固定化した
固体担体として用いることもできる。このような固体担
体としては、不溶性担体と上記の抗体とを前記の多官能
性試薬を用いて結合せしめたＭに対する免疫結合活性’
ｔ１Ｍ持しているものであればよい。用いられる不溶性
担体としては、用いる抗体または多官能性試薬の官能基
と反応し借る基を有していればよく、または必要に応じ
て上記の如くスペーサー導入試薬を用いて反応し得る基
を導入せしめたものであればよく、例えばアルプミ／、
またはゼラチンなどの蛋白質の不俗化したもの、アガロ
ース、セルロース、デキストリンｆｘ　ト（Ｄ多糖頓の
エピクロルヒドリン処理による不（６化したものあるい
は臭化シアン処理およびアミノ恭尋人のためのスペーサ
ー導入試薬処理して不俗化したものなどの不溶性半合成
向分子系相本、アクリロニトリル、アクリル改、アクリ
ル赦エステル、メタアクリル酸、メタアクリル咳ニスデ
ル、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノ
スチレン、クロルスチレン、スルホスチレン、マレイン
酸、フマルばなどの瓜合体または共重合体などの不舒・
１１合合成動子系担体、ケイ素およびアルミニウムなど
の無機化合物の水酸基にアミン基を尋人した年齢性無機
系担体が挙げられる。

これらの不溶性担体は通常少なくとも１過などの手段に
よシ容易に単離できる粒径のものがよく、１同えば住１
ｍ以上、好ましくｖｉｓｆｌｌＩ＋以上のものがよく、
ビーズ状のものが繁用される。またビーズ状の代夛に、
免役反応′ａの′ａ底部の形状と・１旧以したＵｍ形の
形大のものとして用いることができる。ざらに免疫反応
のｆｊ質、丙えはガシスおよび合成向分子刊料自不を不
溶性担体としてＡｚｕ用することもできる。次にこのよ
うな不溶性担体の反応し１替る屏に基いてＭ杭木を直裁
よたは多ば叱圧試楽　　。

を用いて粘合させるのであるが、粘合においてＱよ一２
Ｉｆｉ帛ｐＨ６−８，５の砂働漱、Ｍ機石媒またりよこ
れらのイ昆合＆本中、θ℃〜４０℃にて各々を反応せし
めればよい。−、ｆ　ｆｃ別のｔＩ！ＬＩ相体を製造す
る方法としては、用いる不溶性担体の多孔性のａ　１Ｍ
　院に利用して吸７に固定化させることもできる。さら
に、このＭ抗体に対する翁°異的抗体、すなわち、この
Ｍ抗体産生の；＋ｍ　ＩＬ動物のグロブリン分画を用い
て池棟類の喘乳勧物、特に大型咄乳動物に免疫せしめて
得られた第２抗体を用い、この第２抗体全不浴性担体に
同定化せしめ、次いでこれにこのＭ−抗′本を免疫的手
段にて示占合せしめることによるＭ抗体の活性全殆んど
失活せしめることのない回走化手段によって同相不ヲ１
４でもよい。さらにこのようにして所られた固相体は、
ｌ１７ｃ浄、保存すればよい。

さしＶこ−また上記の固相体を用いる・戊シに、Ｍ抗体
をｏｆ石性の兼まで用いる場合には、被俣故中のＭの定
量反応ＶこおけるＭ−Ｅたは酵素標識Ｍ　、！：　Ｍ抗
体との結合体と未反応物と全分離するのに、Ｍ抗体に対
する特異的抗体が用いらｊＬる。この特異的抗体は第２
抗体とも呼はれＣ−ずｌわちＭ抗体産生の補動動物のグ
ロブリン分画を抗原として用い、これを公知の免疫手段
に基いて池拙煩の１１Ｍ乳動物、奇に大型咄乳動物に皮
下、皮肉に注射せしめて免疫し、その血液から抗血清全
得、さらに公知の積装手段によシ抗体′ｆ：［；すれば
よく、この場合、通常の抗血清の状態で利用することが
簡便である。さらに、この抗体を上記の如く不活性ＪＵ
体（Ｍ抗体固定化の手段による不溶化）とし−Ｃ用いる
ことができる。

仄に本−Ａφノ全文施ｒ　、＝に当って、元づ】ｄの８
ｄ量を副疋しようとする仮凍我、丙えばＭゲ投与した患
者の尿または血（Ｈ，酵糸・品疏ＭおよびＭ抗体を免疫
反応媒体、調えばリン酸緩ＩＩＩＩｊ液−ま’ｔ’ｃｖ
よベロナール緩１１［Ｐに−Ｃ４〜５℃４：ｊ度にて、
Ｐタエないし７２時１．」ｊインキュベイトして競争反
応せしめ、仄いで兄疫請曾した部分、符にＵメ索襟識Ｍ
　−Ａｉ　ｉ）Ｅ体の結合部（以下Ｂという）と結合し
ていない未反応の遊離部分、荷に未反応の酵ぶ標識Ｍの
遊離部（以下Ｆという）とを分離するためにｎ−Ｆ；）
−を行なう。このＢ−Ｆ分離に当って用いるＭ抗体が固
相体でろる固相法の場合には競争反応後、１．！ｊ相体
と反応数層とｗ濾過などの手段にて分別し、洗浄後、固
相体またはｆ液のいずｉｔか一方の１．７：巣活比ｉｌ
ｉ金伸］定すれば工い。

−ｆ　ｆｃＢ　−Ｆ　ｆ）ｍＫ当って、用いる抗体が可
溶・１生のままで第２抗体を用いる２抗本法の場合には
競争反応後、第２抗本、さらに好−兼しくはその第２抗
体をよ有する抗血清、必要に応じて１４抗体作成に用い
ｆｃ補補動動物同一種類の動物の正１才血清をｈＩＪえ
て１〜１２時同イン・キュベイトし、とのｉ１３０００
　ｒｐｍ、１〇−３０分・一度地心分離して免疫反応に
よって結ＥｉＬ、況澱し！ｃ部分ＣＢ）と上清（Ｆ）と
を分別するかまたはこの上２抗俸全固定化して用いてこ
の１．８！Ｊ相倉分別し、抗浄仮沈澱、吻もしくは面相
ま７ζは土浦のいずれか一方の謔、・に活性１Ｉ１１を
しｊＪ定す、１′シばよい。

さしに上記の免疫反応の；１店合部である回相不↓・よ
ひｉｆ　ｄ　１グまたＶよ未反応物金言むｐ液および上
ｉ／７のいＪ“れか一方の酵素活姉匝を測定す才りばよ
い。

さらに上記の免疫反応の結合部で必る固相体♂よび沈滅
・吻または未反応物を冨む戸、夜および上ｎ’／　ｖ）
酵素活性の定量ンこ当っては、用いた酵素の注λに基づ
いて公知の：：重々の活性測定７人によって行なえばよ
い。列えば酵素とし−（ｉ１ｉ２化還元酵素、特に４便
化酵素を用いた一易合には、・・としつ酵素の基質と謬
仔識索と全利用して基質酸化物および過酸化水素、さら
に場合によシアンモニアまたは炭酸ガスを生成せしめる
酵素反応を行なわせ、その酵素反応によって消費される
成分、例えば酸素量および生成される成分例えば過酸化
水素、アンモニア、炭酸ガスの量を定量することによっ
て測定される。さらに酸素、過酸化水素、アンモニアお
よび炭酸ガスの量は酸素電極、過酸化水素電極、イオン
電極およびガス゛−極などの電極による電気化学的変化
量として測定すればよい。さらにまた過酸化水素量はペ
ルオキシダーゼおよびグアヤコール、４−アミノアンチ
ピリンとフェノール、４−アミノアンチピリンとジメチ
ルアニリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンとジメ
チルアニンなどの呈色試薬、ホモバニリン酸、ｐ−ヒド
ロキシフェニル酢酸などの螢光試料などの水素供与体を
用いて呈色または螢光せしめ、その量を常法に従って測
定してもよい。さらに酸化還元酵素でニコチン・アデニ
／、ジヌクレオチド（ホスフェート）［：ＮＡＤ（Ｐ）
：）または七の還元型を基質とするデヒドロゲナーゼを
用いて基質に作用させそのＮＡＤ（Ｐ）貰たは還元型Ｎ
Ａ　Ｄ　（Ｐ）　　の計を消費または生成せしめる反応
により、その還元型ＮＡＤ（ト）の量を波長３４０ｎｍ
　における吸光度として測定するか、テトラゾリウム塩
、ジアホラーゼによるホルマザン呈色のサイクリング反
応にて測定してもよい。さらにまた加水分解酵素の場合
には、加水分解酵素によって用いた基質から検出できる
）色色基を分解、遊離する合成基質を用いることが好ま
しく、例えば加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼの場
合には、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シドを基質としてその酵素反応によって遊離される〇−
ニトロフェニルの量を波長４２０　ｎｍに訃ける吸光度
として測定すればよい。

次に実施例を掲げて本発明を説明するが、これに限定さ
れるものではない。

実施例１ １）抗原の合成 １７位１飾にアルデヒド基を有する１６員項マクロイド
系抗生物質のアルデヒド基を酸化してカルボキシル基に
変換し、これに゛アミノ基ヲもつスペーサーとしてヘキ
ザメチレンジアミンを結合させてアミン基を導入し、こ
の末端アミノ基と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のアミノ
基を架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて架橋した
。

まず、リカマイシン（Ｒｉｃａｍｙｃｉｎ　、　ＴＩＶ
ｌＢ　−１９−Ｑ）２ｍモルを、アセトン１０−１０．
３Ｍスルファミン酸５ｍｌ、０．２Ｍ次亜塩素酸す）　
ＩＪウム５ゴの混合液に加え、室温で６０分間反応ぜし
めた。反応後、アセトンを溜去し、７係アンモニア水で
ｐｉ　９に調製した後、クロロホルム抽出し、さらにこ
れに値数マグネシウムを加えて脱水し、次いでクロロホ
ルムを溜去して粉末を得、これをシリカゲルがラムで備
装して１７位カルボキシル化ＴＭＳ−１９−Ｑを得た。

次いでこの１ｍモル全ジメチルホルムアミド１０７！に
加え、−１５℃に冷却下、トリエチルアミン１ｍモル、
クロル炭素エチル１．１　ｍモルを加えて５分間放置後
、ヘキザメテレンジアミン２ｍモル’ｃ　７ｊｌｌえ、
氷冷中で６０分間反応せしめた。

反応後、ヘキサノ２ｏｏ７ｙ’（ｉ＝加えて沈澱せしめ
、きらに沈澱物音エーテル抽出後、乾固し、セファデッ
クスＬＨ−２００カラムで精製（メ、タノールにて展開
）して１７位にアミン基全尋人した。仄いて化合物０．
２ｍモルを、小論のメタノール含；ｆ＠　１００　ｔｎ
　Ｍ　！Ｊン戚緩衝液（ｐＨｇ、　０　）　２０　ｔｒ
ｔに加えて溶解し、こｎにグルタルアルデヒド４０ｍモ
ル金加えて室温で４時間反応後、鎖編し、さらに水で洗
浄後沈澱物を回収し、これを少量のジオキサンに溶解せ
しめ、ＢＳＡｏ、００５ｍモル含有１００ｍ　Ｍリン葭
緩＠赦（ｐｕｓ、　ｏ　）　１　ｓ　１ｎｌｌｆ加え、
４℃で一度反応し、反応函透析してＢＳＡ−ＴＭＳ−１
９−Ｑの結合体を得た。

この反応様式を示せば次の如くである。

（ＴＭＳ−１９−Ｑ） 上記抗原はＴＭＳ−１９−Ｑ　：ＢＳＡ−１６：１の割
合で結合していた。

＋１）　　免疫方法 ウサギ（雄）の背部皮下にＴＭＳ−１９−Ｑｆｆｉとし
て１ｙｎｆの抗原をアジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ、
　）　　と共に乳濁化し、隔週で投与し、投与後１０日
で採血し、凝結、遠心分離により抗血清（Ｍ抗体）を得
た。

１１１）抗体価 ａ）酵素標識り吻の合成 上記の抗原の場合と同様にアミン基をもつスペーサーを
結合さぞ、得ら７した結合物（２５μモル）の末端アミ
ン基をβ−ガラクトシダーゼ（０，００２μモル）のチ
オール基（−８Ｈ基）を介して３−（２’−ベンゾチア
ゾール−ジチオ）プロピオンスクシンイミドエステル（
３０μモル）で架橋させた。標識率は９７チで、β−ガ
ラクトシダーゼとＴＭＳ−１９−Ｑとの結合率は１：２
．５であった。反応式で示せば次の如くである。

ＴＭＳ−１９−Ｑ−ＮＨ２（末端アミノ基）３−（２’
　−ベンゾチアゾイルジチオ）プロピオン酸すクシンイ
ミドエステ／Ｉ／（チオール基導入試薬） ［βＧａＡ　Ｓ）　Ｓ　ＣＨ，、・ＣＨ２Ｃ０ＮＩ（Ｃ
Ｈ２Ｃ０ＮＩ（−Ｔ以下、β−Ｇａｔ−ＴＭＳ　１９−
Ｑと略す）５℃で一夜放置 ３７℃で２時間放置 ム０００ｒｐｍで１５分間遠心分離 沈澱 １４−基質溶液　　　　　　　　　２００μｔ３７℃で
Ｘ分間反応 Ｆ反応停止液　　　　　　　　　２１箱波長４２０ｎｍ
における吸光度測定 抗体価は上記系でβ−ＧａＡ−ＴＭＳ−１９−Ｑの５０
チと結合することができる抗血清の希釈倍数とした。

”Ｂ：結合したβ−Ｇａ４乳域量 籠Ｔ：β−Ｇａｔ標’ａ’４を全瀘 ｃ）ＴＭＳ−１９Ｑの標準曲線 上記の試験系にＴＭＳ　−１９−Ｑを添〃口して標準曲
線を求めた。

以下上記と同様に行なった。

ＴＭＳ　−１９−Ｑの標準曲線は第１図に示した。反応
時間は９０分である。

ｄ）交左反応性 上記試Ｊ倹系にＴＭＳ−１９−Ｑの代シに裡々のロイコ
マイシン（ＬＭ）誘導体および分解産物を加え、交差反
応率を求めた。

交差反応率はＬ−ｏ、５とする場合の各化合Ｃ吻の用−
せからモル換算して求めた。なお、ＴＭＳ−１９−Ｑの
交差反応率ｆｔ１００チとした。

ＴＭＳ−１９−Ｑ−ＢＳＡ結合体を用いた抗体（煮４）
のＬＭｔＪｊ導体に対する交差性を第２表に示した。

第　　２　　表 ＴＭＳ−１９−Ｑ　（３”−ＰｒｏＡｓ）　　１００２
’−５ｕｃｃｉｎｙｌ　３”−ＰｒｏＡ５　　６４．４
ＬｌａＡ！　　　　　　　　　　　　　＜０．０１ＬＭ
Ａ、　　　　　　　　　　　　　（０，０１ＬＭＡ７＜
０．０１ ＬＭＵ　　　　　０．１０ ＬＭＶ　　　　　Ｏ，０８ ３，３”−ｄｉａｃｅｔｙｌ　Ａ１　　７．２イソＬ　
Ｍ　Ａｓ　　　　　　　　　　　　　　　＜　０．０１
９−ａｅｅｔｙｌＬＭＡ５　　　　　　　　　　（０，
０１９−ｐｒｏｐｙｌＬＭＡ５　　　＜０．０１Ｄｅｍ
ｙｃａｎｏａｙＬＬＭＡＨ１＜０．０１３−Ｐｒｏ−４
−Ｂｕ　Ｍｙｃａｒｏａｅ　　　Ｏ，０８Ｍｙｃａｒｏ
ｇｅ　　　　　　　　　　　　　＜０．ＱＩＭｙｃａｍ
ｉｎｏｓｅ　　　　（０，０１上記のように本発明の抗
体は非常に高い特異性分もち、ＴＭＳ−１９−Ｑの代謝
産物との商の交差性が１菫かであることより血中濃度測
尼に十分適用できる。

実施例 １）抗原の合成 ＴＭＳ−１９−Ｑの代シにミデカマイシン（Ｍｉｄｃｃ
ａｍｙｃｉｎ　）　（ＭＤＭ　）　　を用いて実施例と
同体にして下記の抗原全合成した。

０ＣＯＣＩ（２ｃＨｓ 上ｊｅ　抗Ｍ　Ｌ’Ｉ　Ｍ　Ｄ　Ｍ　：　Ｂ　Ｓ　Ａ−
ｂ、　５　：　１　（’）　ｍ１合で結合した。

１１）免疫方法 ウサギ（２＆）の背部皮下にＭ　Ｄ　Ｍ　７として１０
０μｔの抗原をアジュノ（ントと共に乳濁化し、隔週で
投与し、投与段１０日で採血し、抗血清を得た。

一畦−嫉淋蕩− −ａ−）＃嬬３動牙色文 実施例１と同様にして合成した。標識率７９．７　％ 旬−莢；友」 以下、実施例１と同様に行なった。

実施例 １）抗原の合成 ジョリーマイシン（Ｊｏｓａｍｙｃｉｎ　）　　（ＬＡ
Ｍｓ　）についてＴＭＳ−１９−Ｑと同様にして下記の
抗原をａ成した。

特開昭５９−２１１８６３（１１） 上記抗原はＬＭＡ、：　ＢＳＡ＝９．４　：　１の割合
で結合していン化。

−（０−づ４珠プｊ１ 実施例１と同、謝ｌ方法で行なった。

」１）抗体側− ａ）標識物の合成は実施例１と同様にして行なった。標
識率６５．９　ｇ６゜ ｂ）試験系 以下大施例１と同隊に行なった。

実施例４ Ｉ）抗原の合成 ロイ＝＋マイシンＡ　７　　（Ｌｅｕｃｏｍｙｃｉｎ　
Ａ７　）について実施例１と同、様にして下記の抗原を
合成した。

上記の抗原はＬＭＡ、：ＢＳＡ＝１　：３８の割合で粘
合していブこ１゜ −０−二制り方夫 実施例１と同様な方法で行なった。

ｌ１１）抗体価− 試験系 実施例５ １）抗原の合成 ロイコマイシンＶ　（Ｌｅｕｃｏｍｙｃｉｎ　Ｖ　）　
（ＬｉＶＩ’Ｖ）について実施例１と同様にして下記抗
原全合成した。。

上記抗原はＬＭＶ　：ＢＳＡ＝ｌ　：３０のＷＩＪ合で
結合していた。

肚−メ豊λ刃−浩一 実施例１０方法と同様に行なった。

却−碩鮫任 試験系

【図面の簡単な説明】

〆１、付図面第１図はリカマイシン（Ｔ　Ｍ　Ｓ　−１
Ｑ−ｑ）についての標１台曲線を示すグラフである。 図中０５軸は４２０　ｎｍの波長における吸光ｉ、ｊ＋
、イ黄弓ｑムはす力マイシンｂ’Ｊｇ（ｎｆ／ｍｌ　）
であ代理人三宅正夫 他２名 手続抽正書（自発） ｑ　　　　／６ 昭和ｊ、に年♀月訝日 肪許庁ｊ、’１’：　若杉４１大殿 】　中外の表示 昭和５：？年　　−Ｐ許願２第３５．りｊ２５」中外と
の関係　　′１′１１、′１−ｌコ１顧人１１１１月 氏　名（針・）１４趙゛［醸造法１−（会社５、　補正
命令の１１イ・１　　白　光（ｉ　油止によりｊＴ’ｆ
加する発明の数　　０７、補１１の創隊 １す］、＋１＋　、１・・つｌ”１．！Ｊ”＋！’Ｆｕ
ｌ’ｊ求Ｃ２つ呻：、＋１．ｌｌ及び１−発明の詳ｉ：
ｉｌｌな１１５胛」」（１）　　　　’Ａ　、寸１１’
Ｂ　　中　次の　ｆ甫Ｊｌ：９　７ＪＯｊ　　１）。 （、／）　　明細書Ｊす［特メト請求σ）　＊ｔｌ　：
１４（Ｊの項を別紙の＜’ｑ　＜訂正才ろ。 （２）　　明示田書シ美／６頁第り行の「−Ｐま（−い
。」を「望ましいが、必ずしもこ７ｔに限られろもので
汀ない。」と訂正する。 （３）　　同第７９′貞第７行り仁いし１ｌ−ｉ、ｌ記
７０行の「アミンノテリジン」す「アミノゾテリン」と
ＦｌＩヒする。 （≠）同第１り頁第１７行ない１７同第１ｇ行の［グル
ベソコＭＥＭ培地−１を「ダルペンコＭＥＭＪと訂正す
る。 （り）同第２θ貞第６行のｌ−Ｍ−モノクロナー抗体厘
生細胞」を「Ｍ−モノクロナール抗体産生細胞」と訂正
′１−ろ。 （ｇ＋　　同第２０頁第１／行ない１−同第７２行２よ
び同第１３行の「固体担体」をそれぞれ「固−相担体」
と訂正−「ろ。 （７）　　同第１／員下から第５行のＩ／■の抗原」・
ど「／＋η量の上記抗原−１と訂正′ｆろ。 Ｉ）　同第３２頁Ａ、１行ないし同第１／行θ〕「上記
り）抗原の場合・・・・・・／　：　、；！、５であっ
た。」？ζｌ＜　、り）　＋７・３　＜　ｐ、Ｊ正ｆお
）。 「上記の抗原のり貨合３１−同様にアミ７基？もつスペ
ーサー・を結ｔヤさせ、得られた７浩合吻（２３Ｍモル
、り０４ツメチルホルムアミド（θ　ｆ４Ｆ）　　せイ
１　リ　ン　酸緩衝ン仮　ン　の末−；Ｍ゛ア　ミ　、
７基、　３−　（、Ｊ　／　　−ペンゾチアゾイルーー
ノチオ）ゾロピオン酸スクシンイミドエステル（３０μ
七ル、す／酸緩衝欣）と反応せ［７めた後、これをカラ
へ債製（°セファｒツクスＬＨ２０を用いるゲルｒ過；
展開浴媒として７０％Ｄ　Ｍ　Ｆ含有リン酸緩ｉｇ閘用
）し、その反応生成−（β−がラクトシダーゼ１モル比
使用に刈してコ、タモル比使用）にβ−ガ°ラクトシダ
ーゼ（０，００２μモル、リン醪慌＠ＡＭ）をυ１］六
７て室Ｙ品下６０分間反応せしめてβ−ガラクトシ、ｐ
’−−ｔ：’標−！Ｔ、５４Ｓ−／？−ｑ／！／得に０
そθ）は識羊は７７％であった。」 （り）同第≠Ｏ頁の構造式を次の如く訂正１「ろ。 （／υ）同第≠２真下から第１Ｏ行の（−ｒ、ＭＡ７　
：ＢＳＡ＝／：３ｆ〕を［ＬｙＡ７：ＢＳＡ＝３ざ：／
］と訂正する。 （／／〕　　同第＋ｌＩ−貝第／行第７行Ｍｖ　：　Ｂ
ＳＡ＝／：３０」を「ＬＭＡ：ＩｔＳＡ＝３０：／」と
訂正する。 （■）図面中次の補正を加えろ。 （１）第１図における縦軸の１波＊ｌ／Ｌ７０　ｎｍＪ
を「波長ＩＡ　２０　ｎｍ　Ｊ　　と訂正す４）。 ’ｌ”ｒ　１７Ｆ　ＡＩ’ｔ　求ノ範ｎ（／ｌ／７位置
に゛アルデヒド基を有する／６員環マクロラ・ｆド系抗
生物質ケキャリアープロテインＫ　、帖付さ一オ、こイ
′うをヒト以外の哺乳動物に投龜感作−１ｉ７１．ｚめ
ろことを特徴とｆるマクロライド系抗生物質抗体の産生
法。 ｌ、２）　　上記キャリアープロティンはアルブミン、
ヘモシアニン、γ−グロブリン、サイログロブリンであ
る特許請求の範囲第１項記載の産生法。 （３）　　被検液とマクロライド系抗庄物質酵素標識物
となマクロワイド系抗生物質抗体に反応さぜ、仄いで酵
＃療繊マクロライド系抗生物負−マクロライド系抗生＠
負抗体結合体、未反応酵素標識マグロライ：パ系抗生物
員ンそｎぞれ分離し、その後分藩＋、　にい−ｉｊ”　
ｉｉ、か一方の酵素標識量を定；よ−「ろことを９守徴
とする仮検欣中のマクロライド系抗生物質の定寸法。 Ｖ）　マグロライド系抗生物１ｕ抗体が不清性徂体に両
足化さセ１こマクロライド系抗生物質抗体である特：′
ｆ　ｌ：ｊ’ｊ求Ｖ）ボＩΣ囲第３項記載の定は法。 （ｊ）　　マクロライド系抗生物質抗体が可溶性であり
、分離においてマクロライド系抗生物質抗体に対する特
異的抗体を用いろ特許請求の範囲記載の定量法。 φ）酵素がβ−ガラクトシダーゼである特許請求の範囲
第３項記載の定量法。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）１７位；野にアルデヒド基をＭする１６貝壇マク
   ロライド系抗生物５１　（１−千ヤリアープロディンに
   結合させ、これをヒト以外の哺乳動物に投与、感作せし
   めることを特徴と１−るマクロライド系抗生物質）Ｉ′
   Ｌ坏の産生？２．：。
2. （２）」二記キャリアープロティンはフ′ルフ゛ミン、
   −＼−〕ヨシアニン、γ−グロブリン、す１′ログＩＪ
   プリンでめる特許請求の範囲第１項記載の産生法。
3. （３）　　彼・険液とマノロライド系抗生物質酵素標識
   物とをマクロライド系抗生物質抗体に反応させ、次いで
   酵素標識マクロライド系抗ヰ・（７１質、マクロライド
   系抗生物質抗体結合体、米反応酵素標、シ１°ｉ：マク
   ロライド系抗生物質をぞｎぞれ分離Ｌ７、その後分離し
   たいずれか一方の酵素標識ｉを定量すること全符徴とす
   る被、、ｆｉＬ液中のマクロライド系抗生物質の定量法
   。
4. （４）　　マクロライド系抗生物質抗体が不溶性担体に
   固足化させたマクロライド系抗生物質抗体である特許請
   求の範囲第３項記載の定量法。
5. （５）　　マクロライド系抗生物質抗体が可溶性であシ
   、分離においてマクロライド系抗生物質抗体に対する特
   異的抗体を用いる特許請求の範囲第３頂記載の定は法。 （６ン　　酵ｇがβ−ガラクトシダーゼでめる特許請求
   の範囲第３項記載の定量法。