JP3400507B2 - 特異的結合パートナーと炭水化物含有蛋白質から構成される複合体の製造方法 - Google Patents
特異的結合パートナーと炭水化物含有蛋白質から構成される複合体の製造方法Info
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Description
【０００１】本発明は、特異的結合パートナーと炭水化
物含有蛋白質から構成される複合体（conjugate）の製
造方法、この方法で製造された複合体およびそれらの酵
素イムノアッセイにおける使用に関する。
物含有蛋白質から構成される複合体（conjugate）の製
造方法、この方法で製造された複合体およびそれらの酵
素イムノアッセイにおける使用に関する。
【０００２】Yalow ＆ Berson〔R．S．Yalow，S．A．Be
rson（1960） J．Clin．Invest．39，1157〜1175〕が最
初にラジオイムノアッセイを報告し、またEngvall ＆ P
erlmann〔E．Engvall，P．Perlmann（1971） Immunoche
mistry 8，871〜874〕ならびにvan Weemen ＆ Schuurs
〔B．K．van Weemen，A．H．W．M．Schuurs（1971） FE
BS-Letters 15，232〜236〕が最初に酵素イムノアッセ
イ（ＥＩＡ）を報告して以来、これらの技術は広範囲の
被検物質の測定に世界中で使用されている。
rson（1960） J．Clin．Invest．39，1157〜1175〕が最
初にラジオイムノアッセイを報告し、またEngvall ＆ P
erlmann〔E．Engvall，P．Perlmann（1971） Immunoche
mistry 8，871〜874〕ならびにvan Weemen ＆ Schuurs
〔B．K．van Weemen，A．H．W．M．Schuurs（1971） FE
BS-Letters 15，232〜236〕が最初に酵素イムノアッセ
イ（ＥＩＡ）を報告して以来、これらの技術は広範囲の
被検物質の測定に世界中で使用されている。
【０００３】免疫学的方法による検出は、一般的に著し
い特異性と感受性によって優れている。現在、これらの
技術は研究所において採用されているのみでなく、以前
からルーチンの診断および分析に導入されている。
い特異性と感受性によって優れている。現在、これらの
技術は研究所において採用されているのみでなく、以前
からルーチンの診断および分析に導入されている。
【０００４】低濃度で存在する被検物質の測定のための
酵素イムノアッセイにおいては、免疫学的結合パートナ
ー、例えば抗原、ハプテン、抗体または抗体の誘導体も
しくはフラグメントが共有結合により標識酵素とカップ
リングされて用いられている。免疫学的結合パートナー
と標識酵素の間のカップリングで得られる生成物は、一
般に複合体とよばれる。
酵素イムノアッセイにおいては、免疫学的結合パートナ
ー、例えば抗原、ハプテン、抗体または抗体の誘導体も
しくはフラグメントが共有結合により標識酵素とカップ
リングされて用いられている。免疫学的結合パートナー
と標識酵素の間のカップリングで得られる生成物は、一
般に複合体とよばれる。
【０００５】アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが酵素イムノ
アッセイの標識酵素としてしばしば使用され、基質とし
ては発色原、蛍光原または化学発光原化合物が用いられ
る。さらに他の種類の標識、例えば蛍光染料または化学
発光可能な分子も、本技術分野の熟練者にはよく知られ
ている通りである。
ダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが酵素イムノ
アッセイの標識酵素としてしばしば使用され、基質とし
ては発色原、蛍光原または化学発光原化合物が用いられ
る。さらに他の種類の標識、例えば蛍光染料または化学
発光可能な分子も、本技術分野の熟練者にはよく知られ
ている通りである。
【０００６】凹面形成体、例えば小チューブもしくは微
小滴定プレートの形態の凹部、ならびに凸面形成体、例
えば球体、マイクロ粒子（ラテックス粒子）、ロッドお
よび磁性粒子が固相として使用される。平面固相、例え
ばテストストリップも使用できる。ポリスチレンや他の
材料が、酵素イムノアッセイのための固相の材料として
しばしば用いられる。
小滴定プレートの形態の凹部、ならびに凸面形成体、例
えば球体、マイクロ粒子（ラテックス粒子）、ロッドお
よび磁性粒子が固相として使用される。平面固相、例え
ばテストストリップも使用できる。ポリスチレンや他の
材料が、酵素イムノアッセイのための固相の材料として
しばしば用いられる。
【０００７】酵素イムノアッセイの考えられる試験原
理、サンプル緩衝液、インキュベーション緩衝液および
洗浄緩衝液の組成、ならびに基質／発色原試薬は、本技
術分野の熟練者にはよく知られている。
理、サンプル緩衝液、インキュベーション緩衝液および
洗浄緩衝液の組成、ならびに基質／発色原試薬は、本技
術分野の熟練者にはよく知られている。
【０００８】標識酵素は、例えばグルタルアルデヒド法
〔一または二工程法、S．Avramｅas（1969） Immunoche
mistry 6，43〜52〕、過ヨウ素酸法〔P．K．Nakaneおよ
びA．Kawaoi（1974） J．Histochem．Cytochem． 22，1
084〜1901〕または異種二官能性複合方法〔F．Wold（19
72） Methods Enzymol． 25，623〜651〕を用いて免疫
学的結合パートナーにカップリングできる〔総説：E．I
shikawaら（1983） J．Immunoassey 4，209〜327〕。架
橋剤として標識酵素と免疫学的結合パートナーの架橋を
可能にする異種二官能性試薬の使用は、実質的により明
瞭に特性づけられた複合体の調製を可能にする。これに
関連して、異種二官能性複合法の場合の方が、グルタル
アルデヒドおよび過ヨウ素酸法に比べて免疫学的成分の
結合アフィニティーの損傷は少ないことが明らかにされ
ている〔E．Ishikawaら（1983） J．Immunoassey 4，20
9〜327〕。
〔一または二工程法、S．Avramｅas（1969） Immunoche
mistry 6，43〜52〕、過ヨウ素酸法〔P．K．Nakaneおよ
びA．Kawaoi（1974） J．Histochem．Cytochem． 22，1
084〜1901〕または異種二官能性複合方法〔F．Wold（19
72） Methods Enzymol． 25，623〜651〕を用いて免疫
学的結合パートナーにカップリングできる〔総説：E．I
shikawaら（1983） J．Immunoassey 4，209〜327〕。架
橋剤として標識酵素と免疫学的結合パートナーの架橋を
可能にする異種二官能性試薬の使用は、実質的により明
瞭に特性づけられた複合体の調製を可能にする。これに
関連して、異種二官能性複合法の場合の方が、グルタル
アルデヒドおよび過ヨウ素酸法に比べて免疫学的成分の
結合アフィニティーの損傷は少ないことが明らかにされ
ている〔E．Ishikawaら（1983） J．Immunoassey 4，20
9〜327〕。
【０００９】ラジオイムノアッセイおよび酵素イムノア
ッセイは、例えばＢ型肝炎感染の診断など次第に広範囲
に使用されるようになって、最近では、Ｂ型肝炎ウイル
ス感染の検出の感度および特異性はいずれも決定的に改
良することが可能になってきた。Ｂ型肝炎ウイルスに感
染後、ウイルス抗原およびそれらに相当する抗体が感染
患者の血清中に、ウイルスの複製および宿主の免疫系の
反応に関係する特定の順序で現れる。様々な診断的およ
び血清学的マーカー中、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）の
測定が感染血液または血漿の輸血用医薬品への移入を回
避するために、また鑑別診断のために最も重要である。
極微量のウイルスでも感染が起こることを想定しなけれ
ばならないので、HBsAg試験の検出限界には可能な最高
の要求がなされる。
ッセイは、例えばＢ型肝炎感染の診断など次第に広範囲
に使用されるようになって、最近では、Ｂ型肝炎ウイル
ス感染の検出の感度および特異性はいずれも決定的に改
良することが可能になってきた。Ｂ型肝炎ウイルスに感
染後、ウイルス抗原およびそれらに相当する抗体が感染
患者の血清中に、ウイルスの複製および宿主の免疫系の
反応に関係する特定の順序で現れる。様々な診断的およ
び血清学的マーカー中、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）の
測定が感染血液または血漿の輸血用医薬品への移入を回
避するために、また鑑別診断のために最も重要である。
極微量のウイルスでも感染が起こることを想定しなけれ
ばならないので、HBsAg試験の検出限界には可能な最高
の要求がなされる。
【００１０】酵素イムノアッセイは、本技術分野の熟練
者にはよく知られた様々な原理に従って構築することが
できる（例えば、サンドイッチ法、競合法、間接法
等）。サンドイッチ法は一般に、抗−HBs抗体でコーテ
ィングした固相を検討すべきサンプルとインキュベート
して、HBsAgを検出するために使用される。検討したサ
ンプル中にHBsAgが存在すると、それは固定化抗体に結
合する。標識抗体にカップリングする第二の抗体を用い
て三元複合体（サンドイッチ）が形成される。ついで、
非結合反応剤を数回の洗浄工程で分離する。
者にはよく知られた様々な原理に従って構築することが
できる（例えば、サンドイッチ法、競合法、間接法
等）。サンドイッチ法は一般に、抗−HBs抗体でコーテ
ィングした固相を検討すべきサンプルとインキュベート
して、HBsAgを検出するために使用される。検討したサ
ンプル中にHBsAgが存在すると、それは固定化抗体に結
合する。標識抗体にカップリングする第二の抗体を用い
て三元複合体（サンドイッチ）が形成される。ついで、
非結合反応剤を数回の洗浄工程で分離する。
【００１１】基質／発色原混合物を添加したのち、生成
しているサンドイッチ複合体の形成は、光度測定法によ
って検出される発色反応によって証明される。上述の原
理によるHBsAgの酵素イムノアッセイは市販品を用いて
実施することが可能で、また学術文献に詳細に記載され
ている。
しているサンドイッチ複合体の形成は、光度測定法によ
って検出される発色反応によって証明される。上述の原
理によるHBsAgの酵素イムノアッセイは市販品を用いて
実施することが可能で、また学術文献に詳細に記載され
ている。
【００１２】学術文献に記載され市販品を利用できる、
例えばHBsAgの検出のための酵素イムノアッセイは、高
い感度と特異性で傑出している。HBsAgの検出方法の優
れた感度にもかかわらず、ドナーは明らかにＢ型肝炎陽
性ではないのにそれでも偽陽性の結果を生じる血清のあ
ることが知られている（「問題血清」）。一般的に、偽
陽性サンプルと陽性サンプルは、そのHBsAg検出試験を
反復するか、または別種の確認試験を用いることによっ
て識別できる。しかしながら、これは使用者にさらに時
間と経費の浪費を強いるものである。したがって、偽陽
性結果の危険は実際の初期試験の段階から可能な限り低
くする努力が必要である。
例えばHBsAgの検出のための酵素イムノアッセイは、高
い感度と特異性で傑出している。HBsAgの検出方法の優
れた感度にもかかわらず、ドナーは明らかにＢ型肝炎陽
性ではないのにそれでも偽陽性の結果を生じる血清のあ
ることが知られている（「問題血清」）。一般的に、偽
陽性サンプルと陽性サンプルは、そのHBsAg検出試験を
反復するか、または別種の確認試験を用いることによっ
て識別できる。しかしながら、これは使用者にさらに時
間と経費の浪費を強いるものである。したがって、偽陽
性結果の危険は実際の初期試験の段階から可能な限り低
くする努力が必要である。
【００１３】EP0 209 155号には、標識酵素の過ヨウ素
酸酸化により「問題血清」についても同様に正しい結果
を生じる誘導体へ導くチロキシンの測定の酵素イムノア
ッセイが開示されている。この場合、競合原理により、
虚偽の、低い吸収値およびその結果、虚偽の、高い分析
値が測定される。特異性の改良は、免疫学的リガンドと
の複合前または後に、炭水化物残基を含有する標識酵素
を水性媒体中過ヨウ素酸またはそのアルカリ金属塩で処
理し、得られた酸化生成物を水素化ホウ素ナトリウムで
還元することによって達成される。この場合の実際のカ
ップリング反応は、標識酵素および免疫学的リガンドの
蛋白残基に作用する異種二官能性複合法を用いて行われ
る。
酸酸化により「問題血清」についても同様に正しい結果
を生じる誘導体へ導くチロキシンの測定の酵素イムノア
ッセイが開示されている。この場合、競合原理により、
虚偽の、低い吸収値およびその結果、虚偽の、高い分析
値が測定される。特異性の改良は、免疫学的リガンドと
の複合前または後に、炭水化物残基を含有する標識酵素
を水性媒体中過ヨウ素酸またはそのアルカリ金属塩で処
理し、得られた酸化生成物を水素化ホウ素ナトリウムで
還元することによって達成される。この場合の実際のカ
ップリング反応は、標識酵素および免疫学的リガンドの
蛋白残基に作用する異種二官能性複合法を用いて行われ
る。
【００１４】したがって本発明の目的は、特異性におけ
るこの欠点を除き、改良技術の助けによって、問題血清
の場合でも同様に正しい結果を生じる複合体を生成させ
ることにある。
るこの欠点を除き、改良技術の助けによって、問題血清
の場合でも同様に正しい結果を生じる複合体を生成させ
ることにある。
【００１５】驚くべきことに、本発明の複合技術を用い
た場合、特異性における欠点が消失するのみでなく、HB
sAg検出の感度も改良されることが明らかにされた。
た場合、特異性における欠点が消失するのみでなく、HB
sAg検出の感度も改良されることが明らかにされた。
【００１６】本発明は、したがって、特異的結合パート
ナーと炭水化物含有蛋白質から構成される複合体の製造
方法において、以下の工程 ａ） 炭水化物含有蛋白質を緩衝溶液中過ヨウ素酸また
は相当するアルカリ金属塩で酸化する工程、 ｂ） 酸化された蛋白質に、ジアミンとの反応および還
元安定化により、付加的なアミノ基を導入する工程、 ｃ） 工程ｂ）において導入されたアミノ基をイミノチ
オランと反応させて、これによりスルフヒドリル基を形
成する工程、ついで ｄ） 特異的結合パートナーと前記工程ａ）〜ｃ）によ
り活性化された蛋白質とを異種二官能性試薬を介してカ
ップリングする工程を包含する方法に関する。
ナーと炭水化物含有蛋白質から構成される複合体の製造
方法において、以下の工程 ａ） 炭水化物含有蛋白質を緩衝溶液中過ヨウ素酸また
は相当するアルカリ金属塩で酸化する工程、 ｂ） 酸化された蛋白質に、ジアミンとの反応および還
元安定化により、付加的なアミノ基を導入する工程、 ｃ） 工程ｂ）において導入されたアミノ基をイミノチ
オランと反応させて、これによりスルフヒドリル基を形
成する工程、ついで ｄ） 特異的結合パートナーと前記工程ａ）〜ｃ）によ
り活性化された蛋白質とを異種二官能性試薬を介してカ
ップリングする工程を包含する方法に関する。
【００１７】この場合上述の方法には、蛋白質の炭水化
物残基は４〜８０重量％であることが好ましい。
物残基は４〜８０重量％であることが好ましい。
【００１８】この場合、酸化はpH４〜８で行われること
が好ましい。
が好ましい。
【００１９】ジアミンとの反応および還元安定化はpH７
〜９.５において行われることが好ましい。
〜９.５において行われることが好ましい。
【００２０】炭水化物に富む蛋白質は酵素であることが
極めて好ましく、とくに西洋ワサビペルオキシダーゼで
あることが好ましい。
極めて好ましく、とくに西洋ワサビペルオキシダーゼで
あることが好ましい。
【００２１】この方法はまた、工程ｂ）の反応に式Ｈ2
Ｎ−(Ｘ)n−ＮＨ2のジアミンを使用することが好まし
い。この場合、Ｘは式−(ＣＨ2)−または−(ＣＨ2)n−
Ｏ−(ＣＨ2)n−の脂肪族結合単位であり、ｎは２〜１２
の数であることが好ましい。ジアミンとしてはジアミノ
ヘキサンを使用することが極めて好ましい。
Ｎ−(Ｘ)n−ＮＨ2のジアミンを使用することが好まし
い。この場合、Ｘは式−(ＣＨ2)−または−(ＣＨ2)n−
Ｏ−(ＣＨ2)n−の脂肪族結合単位であり、ｎは２〜１２
の数であることが好ましい。ジアミンとしてはジアミノ
ヘキサンを使用することが極めて好ましい。
【００２２】本発明はまた、本発明の方法によって製造
できる複合体に関する。
できる複合体に関する。
【００２３】本発明はさらに、このような複合体の免疫
学的検出過程、とくに酵素イムノアッセイ、好ましくは
一工程酵素イムノアッセイにおける使用に関する。
学的検出過程、とくに酵素イムノアッセイ、好ましくは
一工程酵素イムノアッセイにおける使用に関する。
【００２４】本発明の複合技術は、標識酵素と免疫学的
活性リガンドの間の実際のカップリングが標識の蛋白質
残基を介して起こるのではなく、酸化された炭水化物残
基とついで導入された標識酵素のアミノ基を介して起こ
る。
活性リガンドの間の実際のカップリングが標識の蛋白質
残基を介して起こるのではなく、酸化された炭水化物残
基とついで導入された標識酵素のアミノ基を介して起こ
る。
【００２５】HBsAgの検出の特異性および感度を改善す
るために、複合体の製造方法において、一方ではカップ
リング成分として、炭水化物−含有標識酵素例えば西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、グルコースオキシ
ダーゼ（ＧＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）お
よびフルクトシダーゼ（インベルターゼ）、ならびに他
方では、免疫学的活性結合パートナー例えばポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体およびそれらの誘導体お
よびフラグメント、さらには抗原およびハプテンを使用
する方法が発見された。
るために、複合体の製造方法において、一方ではカップ
リング成分として、炭水化物−含有標識酵素例えば西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、グルコースオキシ
ダーゼ（ＧＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）お
よびフルクトシダーゼ（インベルターゼ）、ならびに他
方では、免疫学的活性結合パートナー例えばポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体およびそれらの誘導体お
よびフラグメント、さらには抗原およびハプテンを使用
する方法が発見された。
【００２６】本発明の複合技術においては、標識酵素の
アミノ基がまず１−フルオロ−２,４−ジニトロベンゼ
ンで遮断され、標識酵素の炭水化物−含有側鎖を過ヨウ
素酸ナトリウムで酸化する。この場合、アミノ基を遮断
することは必ずしも必要ではなく、１−フルオロ−２,
４−ジニトロベンゼン以外の物質も使用できる。過ヨウ
素酸酸化の結果生成したアルデヒド基は、式Ｈ2Ｎ−
(Ｘ)n−ＮＨ2の添加ジアミンのアミノ基と反応して、シ
ッフの塩基の形成が起こり、これを水素化ホウ素ナトリ
ウムで処理して還元的に安定化することができる。
アミノ基がまず１−フルオロ−２,４−ジニトロベンゼ
ンで遮断され、標識酵素の炭水化物−含有側鎖を過ヨウ
素酸ナトリウムで酸化する。この場合、アミノ基を遮断
することは必ずしも必要ではなく、１−フルオロ−２,
４−ジニトロベンゼン以外の物質も使用できる。過ヨウ
素酸酸化の結果生成したアルデヒド基は、式Ｈ2Ｎ−
(Ｘ)n−ＮＨ2の添加ジアミンのアミノ基と反応して、シ
ッフの塩基の形成が起こり、これを水素化ホウ素ナトリ
ウムで処理して還元的に安定化することができる。
【００２７】この方法で導入されたアミノ基はイミノチ
オランと反応させ、それによって生成した遊離のスルフ
ヒドリル基をついで、架橋形成異種二官能性試薬（例え
ば、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド、Ｇ
ＭＢＳ）を介して、それぞれの免疫学的結合パートナー
の遊離アミノ基と反応させる。
オランと反応させ、それによって生成した遊離のスルフ
ヒドリル基をついで、架橋形成異種二官能性試薬（例え
ば、Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド、Ｇ
ＭＢＳ）を介して、それぞれの免疫学的結合パートナー
の遊離アミノ基と反応させる。
【００２８】これらの反応において、温度は炭化水素含
有標識酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素
活性を維持するための既知の条件に適合させるべきであ
ることは、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られ
た通りである。
有標識酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼの酵素
活性を維持するための既知の条件に適合させるべきであ
ることは、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られ
た通りである。
【００２９】これに関連して、酸化はpH４.０〜８.０で
行われるのが好ましく、とくに緩衝溶液中pH７.０にお
いて行われるのが好ましい。生成したシッフ塩基の還元
的安定化は好ましくはpH７.０〜９.５で行われ、とくに
pH８.５において行われるのが好ましい。
行われるのが好ましく、とくに緩衝溶液中pH７.０にお
いて行われるのが好ましい。生成したシッフ塩基の還元
的安定化は好ましくはpH７.０〜９.５で行われ、とくに
pH８.５において行われるのが好ましい。
【００３０】ＰＯＤは温度安定性がよいことから、上述
の反応は好ましくは０℃〜＋３７℃の温度で行うことが
できるが、室温での実施がとくに好ましい。
の反応は好ましくは０℃〜＋３７℃の温度で行うことが
できるが、室温での実施がとくに好ましい。
【００３１】以下の実施例は本発明を例示するものであ
り、いかなる意味においても本発明を限定するものでは
ない。これはとくに、ＰＯＤ以外の他の炭水化物含有標
識酵素、例えば本発明の範囲内において適当なことが明
らかなＧＯＤ、ＡＰおよびインベルターゼについていえ
ることである。
り、いかなる意味においても本発明を限定するものでは
ない。これはとくに、ＰＯＤ以外の他の炭水化物含有標
識酵素、例えば本発明の範囲内において適当なことが明
らかなＧＯＤ、ＡＰおよびインベルターゼについていえ
ることである。
【００３２】
ａ） 複合体Ｉの製造
抗体を異種二官能性試薬と反応させ〔Tanimoriら（198
3） J．Imm．Meth． 62，123〜131〕、ついで、ＳＨ−
活性化ペルオキシダーゼとインキュベートし〔Kingら、
Bio-chemistry 17，1499〜1506〕、続いてゲルクロマト
グラフィーによって精製する。
3） J．Imm．Meth． 62，123〜131〕、ついで、ＳＨ−
活性化ペルオキシダーゼとインキュベートし〔Kingら、
Bio-chemistry 17，1499〜1506〕、続いてゲルクロマト
グラフィーによって精製する。
【００３３】ｂ） 複合体IIの製造
標識酵素、ペルオキシダーゼを１−フルオロ−２,４−
ジニトロベンゼンと反応させ、ついで過ヨウ素酸塩で酸
化する。このようにして得られたアルデヒド基を抗体の
アミノ基とカップリングさせる。生成するシッフの塩基
を次に水素化ホウ素ナトリウムで還元する〔P．Tijseen
（1985） Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology， 223〜241〕。反応生成物をつい
で、遊離のペルオキシダーゼおよび遊離の抗体から、ゲ
ルクロマトグラフィーによって精製する。
ジニトロベンゼンと反応させ、ついで過ヨウ素酸塩で酸
化する。このようにして得られたアルデヒド基を抗体の
アミノ基とカップリングさせる。生成するシッフの塩基
を次に水素化ホウ素ナトリウムで還元する〔P．Tijseen
（1985） Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology， 223〜241〕。反応生成物をつい
で、遊離のペルオキシダーゼおよび遊離の抗体から、ゲ
ルクロマトグラフィーによって精製する。
【００３４】ｃ） 複合体IIIの製造
２０mgのペルオキシダーゼを２０mMのリン酸ナトリウム
緩衝液（pH７.０）に溶解し、０.４mlの１−フルオロ−
２,４−ジニトロベンゼン溶液（１０μlの１−フルオロ
−２,４−ジニトロベンゼン＋１.９３mlのエタノール）
を加える。混合物を室温で１時間インキュベートし、つ
いで０.６mlの０.２５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添
加し、インキュベーションを室温で遮光下にさらに３０
分継続する。
緩衝液（pH７.０）に溶解し、０.４mlの１−フルオロ−
２,４−ジニトロベンゼン溶液（１０μlの１−フルオロ
−２,４−ジニトロベンゼン＋１.９３mlのエタノール）
を加える。混合物を室温で１時間インキュベートし、つ
いで０.６mlの０.２５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添
加し、インキュベーションを室温で遮光下にさらに３０
分継続する。
【００３５】次に、過剰の試薬を予め２０mMのリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH７.０）で平衡化したカラムを用
い、ゲルクロマトグラフィーにより除去する。この方法
で予め活性化されたペルオキシダーゼの濃度は４０３nm
で測定する（ε＝２.２７５ｇ- 1・L・cm2）。
トリウム緩衝液（pH７.０）で平衡化したカラムを用
い、ゲルクロマトグラフィーにより除去する。この方法
で予め活性化されたペルオキシダーゼの濃度は４０３nm
で測定する（ε＝２.２７５ｇ- 1・L・cm2）。
【００３６】２.５mlのペルオキシダーゼ（７.５mg）を
７.０mlの０.２Ｍ炭酸水素ナトリウム／１５０mM NaCl
（pH８.５）で希釈し、ついで１.０mlのジアミノヘキサ
ン溶液（０.２Ｍ炭酸水素ナトリウム／１５０mM NaCl、
pH８.５中、５.８mg／ml）を加え、混合物を室温で遮光
下に２時間インキュベートする。続いて、この溶液に
０.９mlの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５mg／ml）を
加え、これを２時間開放容器中に放置する。反応混合物
に１.２mlの１Ｍエタノールアミン／HCl溶液（pH８.
０）を加え、これを一夜４℃でインキュベートする。翌
日ペルオキシダーゼ溶液を濃縮し、２５mM四ホウ酸ナト
リウム中に再緩衝化する。ペルオキシダーゼ濃度は１.
５〜２.０mg／mlとする。１Ｍイミノチオラン溶液（メ
タノールに溶解）８３μlを８mgのペルオキシダーゼ溶
液に加え、混合物を室温で２時間インキュベートし、つ
いで過剰の試薬を０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH
６.０）を用いゲルクロマトグラフィーにより除去し、
濃度を４０３nmで測定する。４mgの抗体（０.１Ｍホウ
酸リチウム緩衝液、pH８.０中、２mg／ml溶液）を７０
μlのＧＭＢＳ溶液（ジオキサン中３mg／ml）と混合
し、ついで室温で１時間インキュベートしたのち、０.
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH６.０）に再緩衝す
る。
７.０mlの０.２Ｍ炭酸水素ナトリウム／１５０mM NaCl
（pH８.５）で希釈し、ついで１.０mlのジアミノヘキサ
ン溶液（０.２Ｍ炭酸水素ナトリウム／１５０mM NaCl、
pH８.５中、５.８mg／ml）を加え、混合物を室温で遮光
下に２時間インキュベートする。続いて、この溶液に
０.９mlの水素化ホウ素ナトリウム溶液（５mg／ml）を
加え、これを２時間開放容器中に放置する。反応混合物
に１.２mlの１Ｍエタノールアミン／HCl溶液（pH８.
０）を加え、これを一夜４℃でインキュベートする。翌
日ペルオキシダーゼ溶液を濃縮し、２５mM四ホウ酸ナト
リウム中に再緩衝化する。ペルオキシダーゼ濃度は１.
５〜２.０mg／mlとする。１Ｍイミノチオラン溶液（メ
タノールに溶解）８３μlを８mgのペルオキシダーゼ溶
液に加え、混合物を室温で２時間インキュベートし、つ
いで過剰の試薬を０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH
６.０）を用いゲルクロマトグラフィーにより除去し、
濃度を４０３nmで測定する。４mgの抗体（０.１Ｍホウ
酸リチウム緩衝液、pH８.０中、２mg／ml溶液）を７０
μlのＧＭＢＳ溶液（ジオキサン中３mg／ml）と混合
し、ついで室温で１時間インキュベートしたのち、０.
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH６.０）に再緩衝す
る。
【００３７】活性化ペルオキシダーゼの溶液１.２ml
（４.３mg）を２.７mlの活性化抗体（３.２５mg）に加
え、ついで混合物を室温で２時間インキュベートしたの
ち、０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイミド溶液０.５mlで反応
を停止させる。
（４.３mg）を２.７mlの活性化抗体（３.２５mg）に加
え、ついで混合物を室温で２時間インキュベートしたの
ち、０.１Ｍ Ｎ−エチルマレイミド溶液０.５mlで反応
を停止させる。
【００３８】ｄ） HBsAg酵素イムノアッセイ
HBsAgを検出するための代表的な酵素イムノアッセイ、
たとえばEnzygnost HBsAgモノクローナルIIは一工程サ
ンドイッチ原理に基づくものである。検討サンプル（１
００μl）中に含まれるHBsAgは、ミクロタイタープレー
トのウエルに固定されたポリクローナル抗−HBs抗体、
およびモノクローナル、ペルオキシダーゼ−複合抗−HB
s抗体（抗−HBs／POD複合体）と、同時に反応する。イ
ンキュベーション時間は＋３７℃で９０分とする。吸引
および４回の洗浄により非結合反応原料を除去したの
ち、結合した複合体の量を１００μlの基質／発色原溶
液を加えて測定する（室温、３０分、遮光）。発色原、
テトラメチルベンチジン二塩酸塩の酵素的変換は１００
μlの０.５Ｎ硫酸の添加によって中断し、４５０nmにお
ける吸収を光度測定法により測定する。記録される吸収
はサンプル中に存在するHBsAgの濃度に比例する。
たとえばEnzygnost HBsAgモノクローナルIIは一工程サ
ンドイッチ原理に基づくものである。検討サンプル（１
００μl）中に含まれるHBsAgは、ミクロタイタープレー
トのウエルに固定されたポリクローナル抗−HBs抗体、
およびモノクローナル、ペルオキシダーゼ−複合抗−HB
s抗体（抗−HBs／POD複合体）と、同時に反応する。イ
ンキュベーション時間は＋３７℃で９０分とする。吸引
および４回の洗浄により非結合反応原料を除去したの
ち、結合した複合体の量を１００μlの基質／発色原溶
液を加えて測定する（室温、３０分、遮光）。発色原、
テトラメチルベンチジン二塩酸塩の酵素的変換は１００
μlの０.５Ｎ硫酸の添加によって中断し、４５０nmにお
ける吸収を光度測定法により測定する。記録される吸収
はサンプル中に存在するHBsAgの濃度に比例する。
【００３９】本発明の複合体を酵素イムノアッセイに使
用すると、HBsAgの検出感度の決定的な改良が達成され
るのみでなく、問題血清に偽陽性シグナルが起こること
もなくなることが明らかにされた。表１には、 ａ） 異種二官能性試薬法（＝複合体Ｉ） ｂ） 慣用のNakane法（＝複合体II） ｃ） 本発明の方法（＝複合体III） によって得られた複合体を用いたHBsAgの酵素免疫測定
法の結果を示す。
用すると、HBsAgの検出感度の決定的な改良が達成され
るのみでなく、問題血清に偽陽性シグナルが起こること
もなくなることが明らかにされた。表１には、 ａ） 異種二官能性試薬法（＝複合体Ｉ） ｂ） 慣用のNakane法（＝複合体II） ｃ） 本発明の方法（＝複合体III） によって得られた複合体を用いたHBsAgの酵素免疫測定
法の結果を示す。
【００４０】比較には、陰性対照およびPaul Ehrlich I
nstitute（Frankfurt，FRG）から入手した標準物質に対
して検量したHBsAgサンプルについて行った。
nstitute（Frankfurt，FRG）から入手した標準物質に対
して検量したHBsAgサンプルについて行った。
【００４１】直線回帰によって計算し、域値５０mEを考
慮した感度も示す。
慮した感度も示す。
【表１】
【００４２】表２には、
ａ） 異種二官能性試薬法（＝複合体Ｉ）
ｂ） 慣用のNakane法（＝複合体II）
ｃ） 本発明の方法（＝複合体III）
によって得られた複合体を用いたHBsAgの酵素免疫測定
法の結果を示す。
法の結果を示す。
【００４３】比較は、陰性対照、カットオフ値、３検体
の正常血清（ＮＳ１〜ＮＳ３）および１０検体の「問題
血清」（ＰＳ１〜ＰＳ１０）について行う。域値は５０
mEにセットし、カットオフ値は域値と陰性対照の和とし
て計算した。
の正常血清（ＮＳ１〜ＮＳ３）および１０検体の「問題
血清」（ＰＳ１〜ＰＳ１０）について行う。域値は５０
mEにセットし、カットオフ値は域値と陰性対照の和とし
て計算した。
【表２】
フロントページの続き
(72)発明者 ギユンター・ナウ
ドイツ連邦共和国デー−35043マルブル
ク．コルピングシユトラーセ４
(56)参考文献 特開 昭62−22065（ＪＰ，Ａ)
米国特許4587044（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/50 - 33/98
Claims (12)
- 【請求項１】 次の工程： ａ） 炭水化物含有蛋白質を緩衝溶液中過ヨウ素酸また
は相当するアルカリ金属塩で酸化する工程、 ｂ） 酸化された蛋白質に、ジアミンとの反応および還
元安定化により、付加的なアミノ基を導入する工程、 ｃ） 工程ｂ）において導入されたアミノ基をイミノチ
オランと反応させて、これによりスルフヒドリル基を形
成する工程、ついで ｄ） 特異的結合パートナーと前記工程ａ）〜ｃ）によ
り活性化された蛋白質とを異種二官能性試薬を介してカ
ップリングする工程を包含する特異的結合パートナーと
炭水化物含有蛋白質から構成される複合体を製造する方
法。 - 【請求項２】 蛋白質の炭水化物残基は４〜８０重量％
である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 酸化はpH４〜８で行われる請求項１記載
の方法。 - 【請求項４】 ジアミンとの反応および還元安定化はpH
７〜９.５において行われる請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 炭水化物に富む蛋白質は酵素である請求
項１記載の方法。 - 【請求項６】 酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであ
る請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 工程ｂ）の反応には式Ｈ2Ｎ−(Ｘ)n−Ｎ
Ｈ2〔ここでＸは式−(ＣＨ2)−または−(ＣＨ2)n−Ｏ−
(ＣＨ2)n−の脂肪族結合単位であり、ｎは２〜１２の数
である〕のジアミンを使用する請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 ジアミンとしてはジアミノヘキサンを使
用する請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方
法によって製造される複合体。 - 【請求項１０】 免疫学的検出過程における請求項９記
載の複合体からなる免疫学的検出試薬。 - 【請求項１１】 酵素イムノアッセイにおける請求項９
記載の複合体からなる免疫学的検出試薬。 - 【請求項１２】 酵素イムノアッセイは一工程酵素イム
ノアッセイである請求項１１記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4237479:0 | 1992-11-06 | ||
| DE4237479A DE4237479A1 (de) | 1992-11-06 | 1992-11-06 | Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus einem spezifischen Bindungspartner und einem kohlenhydrathaltigen Protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06201697A JPH06201697A (ja) | 1994-07-22 |
| JP3400507B2 true JP3400507B2 (ja) | 2003-04-28 |
Family
ID=6472249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27639093A Expired - Fee Related JP3400507B2 (ja) | 1992-11-06 | 1993-11-05 | 特異的結合パートナーと炭水化物含有蛋白質から構成される複合体の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5534414A (ja) |
| EP (1) | EP0601318B1 (ja) |
| JP (1) | JP3400507B2 (ja) |
| AT (1) | ATE216778T1 (ja) |
| AU (1) | AU682010B2 (ja) |
| CA (1) | CA2102547A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP3499568B2 (ja) * | 1995-01-23 | 2004-02-23 | ビオーラド・パストゥール | 免疫酵素的コンジュゲート、その製造方法およびその使用 |
| FR2734365B1 (fr) * | 1995-05-18 | 1999-04-09 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| EP0877938B2 (de) * | 1995-12-29 | 2004-04-21 | Biotez Berlin-Buch GmbH | Verfahren zur markierung von biomolekülen mit meerrettichperoxidase |
| AU2064201A (en) * | 1999-12-06 | 2001-06-12 | Eukarion, Inc. | Carbohydrate-aminated glycoproteins |
| US8481334B1 (en) * | 2001-11-06 | 2013-07-09 | Charm Sciences, Inc. | Method of attaching a ligand to a solid support |
| US6927135B2 (en) * | 2002-12-18 | 2005-08-09 | Micron Technology, Inc. | Methods of fabricating multiple sets of field effect transistors |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4587044A (en) * | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
| DE3525911A1 (de) * | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Konjugat fuer die enzymimmunobestimmung |
| US5248772A (en) * | 1992-01-29 | 1993-09-28 | Coulter Corporation | Formation of colloidal metal dispersions using aminodextrans as reductants and protective agents |
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- 1992-11-06 DE DE4237479A patent/DE4237479A1/de not_active Withdrawn
-
1993
- 1993-10-23 EP EP93117202A patent/EP0601318B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-23 DE DE59310280T patent/DE59310280D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-23 ES ES93117202T patent/ES2173879T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-23 AT AT93117202T patent/ATE216778T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-11-04 AU AU50454/93A patent/AU682010B2/en not_active Ceased
- 1993-11-05 JP JP27639093A patent/JP3400507B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-05 CA CA002102547A patent/CA2102547A1/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-03-30 US US08/414,058 patent/US5534414A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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| AU5045493A (en) | 1994-05-19 |
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| CA2102547A1 (en) | 1994-05-07 |
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