JP3499568B2 - 免疫酵素的コンジュゲート、その製造方法およびその使用 - Google Patents
免疫酵素的コンジュゲート、その製造方法およびその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫学的活性を有する物質および共重合体
形態のグリコシル化した標識用酵素からなる免疫酵素的
コンジュゲートに関する。本発明は、また、本発明のコ
ンジュゲートの製造方法および該コンジュゲートの診断
のための使用に関する。
形態のグリコシル化した標識用酵素からなる免疫酵素的
コンジュゲートに関する。本発明は、また、本発明のコ
ンジュゲートの製造方法および該コンジュゲートの診断
のための使用に関する。
種々のコンジュゲートおよび免疫酵素的コンジュゲー
トの製造方法は、従来技術により知られている。これら
の免疫酵素的コンジュゲートは、一般に、免疫学的活性
を有する物質およびグリコシル化されていてもよい標識
用酵素からなる。これらのコンジュゲートの製造方法
は、さまざまであり、特に、過ヨウ素酸塩カップリング
技術を用いる方法などがあり、これらの技術は、ホモ−
またはヘテロ−二官能性薬剤を用いるより高性能な方法
を引き起こした。これらの方法の目的は、診断結果の特
異性および／または感度を増大させることができるコン
ジュゲートを得るために、酵素の、免疫学的活性を有す
る物質へのカップリングを改良することである。
トの製造方法は、従来技術により知られている。これら
の免疫酵素的コンジュゲートは、一般に、免疫学的活性
を有する物質およびグリコシル化されていてもよい標識
用酵素からなる。これらのコンジュゲートの製造方法
は、さまざまであり、特に、過ヨウ素酸塩カップリング
技術を用いる方法などがあり、これらの技術は、ホモ−
またはヘテロ−二官能性薬剤を用いるより高性能な方法
を引き起こした。これらの方法の目的は、診断結果の特
異性および／または感度を増大させることができるコン
ジュゲートを得るために、酵素の、免疫学的活性を有す
る物質へのカップリングを改良することである。
ナカネ（Nakane）のカップリング方法［ザ・ジャーナ
ル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミス
トリー（The Journal of Histochemistry and Cytochem
istry）、第22巻、第12号、第1084−1091頁、1974］
は、酵素の炭水化物の過ヨウ素酸塩による酸化後の、遊
離アミン基を介するタンパクの直接カップリングを示
す。特許EP209,155には、免疫学的試薬を酵素のタンパ
ク部分にカップリングさせることができる方法が開示さ
れている。この方法によると、該酵素は、免疫学的試薬
とのカップリングの前または後に、過ヨウ素酸を用いて
酸化される。次いで、これにより得られた酸化生成物
は、ホウ水素化ナトリウムで還元される。カップリング
に関しては、これは、グルタルアルデヒド、またはスク
シンイミド誘導体などの慣用の試薬を用いて行われる。
この方法は、共重合工程を全く用いない。この方法によ
り得られるコンジュゲートは、いわゆる「問題の」血清
から生じる擬似陽性の結果を除去することができる。
ル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミス
トリー（The Journal of Histochemistry and Cytochem
istry）、第22巻、第12号、第1084−1091頁、1974］
は、酵素の炭水化物の過ヨウ素酸塩による酸化後の、遊
離アミン基を介するタンパクの直接カップリングを示
す。特許EP209,155には、免疫学的試薬を酵素のタンパ
ク部分にカップリングさせることができる方法が開示さ
れている。この方法によると、該酵素は、免疫学的試薬
とのカップリングの前または後に、過ヨウ素酸を用いて
酸化される。次いで、これにより得られた酸化生成物
は、ホウ水素化ナトリウムで還元される。カップリング
に関しては、これは、グルタルアルデヒド、またはスク
シンイミド誘導体などの慣用の試薬を用いて行われる。
この方法は、共重合工程を全く用いない。この方法によ
り得られるコンジュゲートは、いわゆる「問題の」血清
から生じる擬似陽性の結果を除去することができる。
同様に、特許出願EP601,318には、酵素の炭水化物の
酸化部分と事前に反応させたジアミン、次いで、ヘテロ
二官能性試薬（スクシンイミド誘導体）を介して免疫学
的試薬を酵素にカップリングさせるための方法が開示さ
れている。酵素−免疫学的試薬リンクが酵素の炭水化物
部分上で生じる非共重合コンジュゲートが得られる。実
質的に、このカップリング方法によると、タンパクに由
来する炭水化物基を用いて、該タンパクを抗体に直接移
植することができる。
酸化部分と事前に反応させたジアミン、次いで、ヘテロ
二官能性試薬（スクシンイミド誘導体）を介して免疫学
的試薬を酵素にカップリングさせるための方法が開示さ
れている。酵素−免疫学的試薬リンクが酵素の炭水化物
部分上で生じる非共重合コンジュゲートが得られる。実
質的に、このカップリング方法によると、タンパクに由
来する炭水化物基を用いて、該タンパクを抗体に直接移
植することができる。
さらに最近、特許出願EP560,912および特許US5,191,0
66には、抗体の免疫学的認識部位を保存することができ
る、タンパクの炭水化物部分を用いる免疫コンジュゲー
ト（抗体−アルカリホスファターゼ）の生成方法が開示
されている。
66には、抗体の免疫学的認識部位を保存することができ
る、タンパクの炭水化物部分を用いる免疫コンジュゲー
ト（抗体−アルカリホスファターゼ）の生成方法が開示
されている。
免疫酵素的コンジュゲートを共重合体の形態で得るこ
とができるいくつかの方法も知られている。
とができるいくつかの方法も知られている。
特許US4,693,969には、サンドイッチ型イムノアッセ
イ用試薬およびその製造方法が開示されている。重合形
態の免疫酵素的コンジュゲートを含有するイムノアッセ
イ用試薬は、ホルモンなどの生物試料中に低濃度で存在
する物質のアッセイの感度を増大させることができる。
この試薬は、第１段階で、カップリング剤（ｍ−マレイ
ミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
を用いてモノマー形態の抗体−酵素免疫コンジュゲート
を合成することによって得られる。第２段階では、該モ
ノマーは、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドと
の重合反応に付される。
イ用試薬およびその製造方法が開示されている。重合形
態の免疫酵素的コンジュゲートを含有するイムノアッセ
イ用試薬は、ホルモンなどの生物試料中に低濃度で存在
する物質のアッセイの感度を増大させることができる。
この試薬は、第１段階で、カップリング剤（ｍ−マレイ
ミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
を用いてモノマー形態の抗体−酵素免疫コンジュゲート
を合成することによって得られる。第２段階では、該モ
ノマーは、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドと
の重合反応に付される。
出願EP430,510には、カップリング剤を用いてお互い
に結合した「検出可能な」ユニットに基づくポリマーが
開示されている。これらの「検出可能な」ユニットは、
抗原活性を有するか、または、蛍光体系、化学発光体
系、発色体系、または酵素系の一部を形成する。「検出
可能な」ユニットは、1,4−ジ（アミノアルキル）ピペ
ラジン誘導体である親水性カップリング剤を用いてお互
いに結合される。これらのポリマーを得るために、「検
出可能な」ユニットは、２個のカルボキシル基またはカ
ルボキシル基およびアミノもしくはチオシアン酸エステ
ル基を含有するように化学的に修飾される。1,4−ジ
（アミノアルキル）ピペラジン誘導体との重合は、ペプ
チドのアミノ酸からの製造の化学、または、重合体合成
の化学のいずれかにおいて用いられる慣用方法（ペプチ
ドまたはジアルデヒドの縮合のための試薬の使用）を用
いて行われる。
に結合した「検出可能な」ユニットに基づくポリマーが
開示されている。これらの「検出可能な」ユニットは、
抗原活性を有するか、または、蛍光体系、化学発光体
系、発色体系、または酵素系の一部を形成する。「検出
可能な」ユニットは、1,4−ジ（アミノアルキル）ピペ
ラジン誘導体である親水性カップリング剤を用いてお互
いに結合される。これらのポリマーを得るために、「検
出可能な」ユニットは、２個のカルボキシル基またはカ
ルボキシル基およびアミノもしくはチオシアン酸エステ
ル基を含有するように化学的に修飾される。1,4−ジ
（アミノアルキル）ピペラジン誘導体との重合は、ペプ
チドのアミノ酸からの製造の化学、または、重合体合成
の化学のいずれかにおいて用いられる慣用方法（ペプチ
ドまたはジアルデヒドの縮合のための試薬の使用）を用
いて行われる。
出願EP175,560には、重合された酵素および抗体から
なるコンジュゲートを得るための方法が開示されてい
る。この方法によると、第１段階では、遊離チオールま
たはアミン基を介して酵素の少なくとも２個の分子の共
有結合によって、前重合した酵素が得られる。次いで、
この前重合した酵素は、共有結合によって抗体または抗
体フラグメントにカップリングされる。
なるコンジュゲートを得るための方法が開示されてい
る。この方法によると、第１段階では、遊離チオールま
たはアミン基を介して酵素の少なくとも２個の分子の共
有結合によって、前重合した酵素が得られる。次いで、
この前重合した酵素は、共有結合によって抗体または抗
体フラグメントにカップリングされる。
現今では、いくつかの病状について、非常に初期の段
階で抗原または特異性抗体の存在を検出することが必要
である。さらにまた、いくつかの抗原は、しばしば、検
出から遮蔽され、ほんの取るに足らない量の、抗原に対
して特異的な抗体が、感染に罹患している患者の血清中
に出現する。
階で抗原または特異性抗体の存在を検出することが必要
である。さらにまた、いくつかの抗原は、しばしば、検
出から遮蔽され、ほんの取るに足らない量の、抗原に対
して特異的な抗体が、感染に罹患している患者の血清中
に出現する。
従来技術の公知のコンジュゲートは、実質的な免疫学
的反応を誘発しない感染に罹患している患者の血清中に
存在する抗原または抗体の充分に感度の良い検出を可能
にしない。
的反応を誘発しない感染に罹患している患者の血清中に
存在する抗原または抗体の充分に感度の良い検出を可能
にしない。
本発明の意図は、本発明の免疫酵素的コンジュゲート
の使用によって感度不足というこの問題点の解決法を提
供することである。
の使用によって感度不足というこの問題点の解決法を提
供することである。
本発明の課題は、コンジュゲートが共重合体形態のグ
リコシル化された標識用酵素および免疫学的活性を有す
る物質からなる免疫酵素的コンジュゲート、ならびにイ
ムノアッセイにおけるこれらのコンジュゲートの使用で
ある。
リコシル化された標識用酵素および免疫学的活性を有す
る物質からなる免疫酵素的コンジュゲート、ならびにイ
ムノアッセイにおけるこれらのコンジュゲートの使用で
ある。
本発明は、また、本発明の共重合した免疫酵素コンジ
ュゲートの生成方法、ならびに、免疫学的測定のための
コンジュゲートの使用に関する。
ュゲートの生成方法、ならびに、免疫学的測定のための
コンジュゲートの使用に関する。
本発明は、本発明のコンジュゲートからなる診断用キ
ットにも関する。
ットにも関する。
酵素に関連する「炭水化物」または「グリコシル」な
る用語は、以下、酵素がタンパク部分に結合した１個以
上の炭水化物基を有することを意味するために用いられ
るであろう。
る用語は、以下、酵素がタンパク部分に結合した１個以
上の炭水化物基を有することを意味するために用いられ
るであろう。
本発明のコンジュゲートにより、従来技術のすでに知
られている免疫酵素的コンジュゲートを用いて得られる
ものよりも非常に感度の良い結果を得ることができる。
したがって、本発明は、診断の分野に、特に、ウイルス
起源を有する病状の診断のために有意な改良を与える。
というのは、後者は、感染の初期に、しばしば、検出す
るのが困難であり、従って、診断するのが困難であるか
らである。
られている免疫酵素的コンジュゲートを用いて得られる
ものよりも非常に感度の良い結果を得ることができる。
したがって、本発明は、診断の分野に、特に、ウイルス
起源を有する病状の診断のために有意な改良を与える。
というのは、後者は、感染の初期に、しばしば、検出す
るのが困難であり、従って、診断するのが困難であるか
らである。
本発明は、特に、
酵素共重合体を形成するように、標識用酵素の予め酸
化された炭水化物基を介してお互いに共重合した標識用
酵素の分子、および 共重合した標識用酵素の分子に酵素共重合体の遊離ア
ミン基を介してコンジュゲートした、免疫学的活性を有
する少なくとも１つの物質 からなる免疫酵素的コンジュゲートに関する。
化された炭水化物基を介してお互いに共重合した標識用
酵素の分子、および 共重合した標識用酵素の分子に酵素共重合体の遊離ア
ミン基を介してコンジュゲートした、免疫学的活性を有
する少なくとも１つの物質 からなる免疫酵素的コンジュゲートに関する。
本発明のコンジュゲートは、ホースラディッシュペル
オキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AL
P）、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよ
びフルクトースオキシダーゼなどの炭水化物部分を有す
る標識用酵素からなる。したがって、前記酵素からなる
共重合体、選択された酵素による共重合体からなるコン
ジュゲートは、本発明の方法によって得られる。
オキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AL
P）、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよ
びフルクトースオキシダーゼなどの炭水化物部分を有す
る標識用酵素からなる。したがって、前記酵素からなる
共重合体、選択された酵素による共重合体からなるコン
ジュゲートは、本発明の方法によって得られる。
本発明によると、酵素共重合体は、お互いに結合され
た、標識用酵素およびジアミンから、または、標識用酵
素および異なるヘテロ二官能性試薬から得られる。
た、標識用酵素およびジアミンから、または、標識用酵
素および異なるヘテロ二官能性試薬から得られる。
好都合な変形によると、本発明は、酵素共重合体が、
脂肪族ジアミン（直鎖状または分枝鎖状または環状の鎖
を有する）または芳香族ジアミン（ここで、該アミン
は、炭素原子２〜12個からなる）から選択されるジアミ
ンから得られるコンジュゲートに関する。好ましくは、
1,4−フェニレンジアミンが用いられる。
脂肪族ジアミン（直鎖状または分枝鎖状または環状の鎖
を有する）または芳香族ジアミン（ここで、該アミン
は、炭素原子２〜12個からなる）から選択されるジアミ
ンから得られるコンジュゲートに関する。好ましくは、
1,4−フェニレンジアミンが用いられる。
別の好都合な変形によると、本発明は、酵素共重合体
が、２−メルカプトエチルアミンまたは３−（２−ピリ
ジルジチオ）−プロピオンヒドラジド、および４−（マ
レイミドメチル）−１−シクロヘキサン−カルボヒドラ
ジドまたは４−（４−マレイミドフェニル）ブチロヒド
ラジドから各々選択される、お互いに結合された２種類
のヘテロ二官能性試薬を含有するコンジュゲートに関す
る。
が、２−メルカプトエチルアミンまたは３−（２−ピリ
ジルジチオ）−プロピオンヒドラジド、および４−（マ
レイミドメチル）−１−シクロヘキサン−カルボヒドラ
ジドまたは４−（４−マレイミドフェニル）ブチロヒド
ラジドから各々選択される、お互いに結合された２種類
のヘテロ二官能性試薬を含有するコンジュゲートに関す
る。
特に、本発明は、酵素共重合体が、1:1−10モル当
量、好ましくは、1:4−６モル当量の割合の酵素および
ジアミンまたはヘテロ二官能性試薬からなるコンジュゲ
ートに関する。
量、好ましくは、1:4−６モル当量の割合の酵素および
ジアミンまたはヘテロ二官能性試薬からなるコンジュゲ
ートに関する。
好ましくは、本発明は、酵素共重合体が酵素の分子ｎ
個（ここで、ｎは、３〜100の整数、好ましくは、５〜5
0の整数である）からなるコンジュゲートに関する。
個（ここで、ｎは、３〜100の整数、好ましくは、５〜5
0の整数である）からなるコンジュゲートに関する。
好都合な変形によると、本発明は、共重合した酵素が
ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼであるコンジュゲートに関する。
ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼであるコンジュゲートに関する。
本発明の免疫酵素的コンジュゲートは、酵素共重合体
が、酵素共重合体のアミン官能基と反応するホモ−また
はヘテロ二官能性試薬を介して免疫学的活性を有する少
なくとも１つの物質にカップリングされるコンジュゲー
トである。
が、酵素共重合体のアミン官能基と反応するホモ−また
はヘテロ二官能性試薬を介して免疫学的活性を有する少
なくとも１つの物質にカップリングされるコンジュゲー
トである。
特に、本発明は、酵素共重合体および免疫学的活性を
有する物質のモル比が10:1〜1:10（酵素ユニット／免疫
学的活性を有する物質のユニット）、好ましくは、3:1
〜1:3、さらに好ましくは、1:1であるコンジュゲートに
関する。
有する物質のモル比が10:1〜1:10（酵素ユニット／免疫
学的活性を有する物質のユニット）、好ましくは、3:1
〜1:3、さらに好ましくは、1:1であるコンジュゲートに
関する。
酵素共重合体にカップリングした免疫学的活性を有す
る物質は、天然もしくは組換えタンパク、モノ−もしく
はポリクローナル抗体、組換え体もしくはそうでないも
の、またはHIV（１または２）、HCVおよびHBVなどのウ
イルスから誘導されたペプチドようなペプチド、組換え
体もしくはそうではないものであってもよい。
る物質は、天然もしくは組換えタンパク、モノ−もしく
はポリクローナル抗体、組換え体もしくはそうでないも
の、またはHIV（１または２）、HCVおよびHBVなどのウ
イルスから誘導されたペプチドようなペプチド、組換え
体もしくはそうではないものであってもよい。
好ましい変形によると、本発明は、免疫学的活性を有
する物質がHIV1ペプチド、HIV2ペプチド、HCVペプチ
ド、組換えHCVタンパク、抗−HIV1抗体または抗−HBsAg
抗体であるコンジュゲートに関する。
する物質がHIV1ペプチド、HIV2ペプチド、HCVペプチ
ド、組換えHCVタンパク、抗−HIV1抗体または抗−HBsAg
抗体であるコンジュゲートに関する。
酵素共重合体の、免疫学的活性を有する物質とのカッ
プリング工程において用いられるホモ−またはヘテロ二
官能性カップリング剤は、例えば、スベリン酸ビス（ス
ルホスクシンイミジル）（BS3）、４−（マレイミドメ
チル）−１−シクロヘキサンカルボン酸スルホスクシン
イミジル（スルホ−SMCC）または３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（SPDP）であ
ってもよい。
プリング工程において用いられるホモ−またはヘテロ二
官能性カップリング剤は、例えば、スベリン酸ビス（ス
ルホスクシンイミジル）（BS3）、４−（マレイミドメ
チル）−１−シクロヘキサンカルボン酸スルホスクシン
イミジル（スルホ−SMCC）または３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（SPDP）であ
ってもよい。
本発明の課題は、
a.標識用酵素の分子が、予め酸化された炭水化物を介し
て共重合され、 b.次いで、酵素共重合体と免疫学的活性を有する少なく
とも１つの物質とをカップリングさせる ことを特徴とする本発明によるコンジュゲートの製造方
法でもある。
て共重合され、 b.次いで、酵素共重合体と免疫学的活性を有する少なく
とも１つの物質とをカップリングさせる ことを特徴とする本発明によるコンジュゲートの製造方
法でもある。
酵素炭水化物の酸化について、アルデヒド基を得るこ
とができる試薬が用いられる。例えば、過ヨウ素酸塩に
よる酸化、または、アルデヒド基を得ることができる他
の等価の酸化が用いられる。
とができる試薬が用いられる。例えば、過ヨウ素酸塩に
よる酸化、または、アルデヒド基を得ることができる他
の等価の酸化が用いられる。
第１の具体例では、本発明のコンジュゲートの製造方
法の共重合工程では、酵素の分子がジアミンと反応させ
られる。
法の共重合工程では、酵素の分子がジアミンと反応させ
られる。
第２の具体例では、本発明のコンジュゲートの製造方
法の共重合工程では、第１工程で、酵素の分子を２種類
のヘテロ二官能性試薬と別々に反応させ、次いで、第２
工程で、該反応生成物をお互いに反応させる。
法の共重合工程では、第１工程で、酵素の分子を２種類
のヘテロ二官能性試薬と別々に反応させ、次いで、第２
工程で、該反応生成物をお互いに反応させる。
好都合な変形によると、本発明は、ジアミンを用いる
場合、標識用酵素の分子の共重合後、共重合を停止させ
る効果を有するホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ
水素化ナトリウムなどの還元剤を用いて還元されること
を特徴とする、共重合した免疫酵素的コンジュゲートの
製造方法に関する。
場合、標識用酵素の分子の共重合後、共重合を停止させ
る効果を有するホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ
水素化ナトリウムなどの還元剤を用いて還元されること
を特徴とする、共重合した免疫酵素的コンジュゲートの
製造方法に関する。
別の好都合な変形によると、本発明は、異なるヘテロ
二官能性試薬を用いる場合、標識用酵素の分子の共重合
後、ヘテロ二官能性試薬の未反応遊離基をブロックする
薬剤を用いて還元されることを特徴とする、共重合した
免疫酵素的コンジュゲートの製造方法に関する。場合に
よっては、用いた試薬の両方の遊離基をブロックする薬
剤の両方を用いるか、または、用いた試薬の遊離基をブ
ロックする２つの薬剤のうちの一方を用いることが可能
である。
二官能性試薬を用いる場合、標識用酵素の分子の共重合
後、ヘテロ二官能性試薬の未反応遊離基をブロックする
薬剤を用いて還元されることを特徴とする、共重合した
免疫酵素的コンジュゲートの製造方法に関する。場合に
よっては、用いた試薬の両方の遊離基をブロックする薬
剤の両方を用いるか、または、用いた試薬の遊離基をブ
ロックする２つの薬剤のうちの一方を用いることが可能
である。
好ましくは、本発明は、酵素共重合体と免疫学的活性
を有する物質とのカップリング工程で、ホモ−またはヘ
テロ二官能性カップリング試薬の濃度が酵素共重合体の
濃度に対して過剰である、共重合した免疫酵素的コンジ
ュゲートの製造方法に関する。
を有する物質とのカップリング工程で、ホモ−またはヘ
テロ二官能性カップリング試薬の濃度が酵素共重合体の
濃度に対して過剰である、共重合した免疫酵素的コンジ
ュゲートの製造方法に関する。
本発明の製造方法を１つの工程で行う共重合について
以下に詳述する。
以下に詳述する。
コンジュゲートを製造するために選択した酵素を、共
重合反応前に、pH4〜８で、過ヨウ素酸塩などの炭水化
物基を酸化する試薬（酵素のモル当たり数100mol）で処
理する。次いで、酸化した酵素の溶液の透析によって、
過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。
重合反応前に、pH4〜８で、過ヨウ素酸塩などの炭水化
物基を酸化する試薬（酵素のモル当たり数100mol）で処
理する。次いで、酸化した酵素の溶液の透析によって、
過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。
次いで、pHが７〜9.5である媒質中、炭素原子１〜12
個からなる脂肪族（直鎖状、分枝鎖状もしくは環状）ま
たは芳香族ジアミン、好ましくは、1,4−フェニレンジ
アミンを1:1−10モル当量（酵素ユニット／ジアミンユ
ニット）、好ましくは、1:4−６モル当量の濃度で添加
する。
個からなる脂肪族（直鎖状、分枝鎖状もしくは環状）ま
たは芳香族ジアミン、好ましくは、1,4−フェニレンジ
アミンを1:1−10モル当量（酵素ユニット／ジアミンユ
ニット）、好ましくは、1:4−６モル当量の濃度で添加
する。
ゲル濾過クロマトグラフィー分析法によって該共重合
反応をモニターして、酵素モチーフｎ個（ここで、ｎ
は、３〜100の整数であり、好ましくは、５〜50の整数
である）からなる酵素共重合体を得る。
反応をモニターして、酵素モチーフｎ個（ここで、ｎ
は、３〜100の整数であり、好ましくは、５〜50の整数
である）からなる酵素共重合体を得る。
次いで、ホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素
化ナトリウムなどの共重合反応の間に反応しなかった酸
化された炭水化物を還元するための薬剤を過剰に添加す
ることによって、共重合反応を停止させる。
化ナトリウムなどの共重合反応の間に反応しなかった酸
化された炭水化物を還元するための薬剤を過剰に添加す
ることによって、共重合反応を停止させる。
次いで、ゲル濾過によって、これにより得られた酵素
共重合体を精製する。
共重合体を精製する。
次いで、pH6.5〜８で、酵素のモル当たり５〜50molの
割合でホモ−またはヘテロ二官能性試薬を添加すること
によって、酵素共重合体を活性化する。次いで、ゲル上
での脱塩により、活性化酵素共重合体を精製する。
割合でホモ−またはヘテロ二官能性試薬を添加すること
によって、酵素共重合体を活性化する。次いで、ゲル上
での脱塩により、活性化酵素共重合体を精製する。
次いで、活性化酵素共重合体と免疫学的活性を有する
物質とのコンジュゲーションを、約10:1〜1:10（酵素ユ
ニット／免疫学的活性を有する物質のユニット）、好ま
しくは、3:1〜1:3、さらに好ましくは、1:1のモル比を
用いて行う。この反応は、中性pHで行う。
物質とのコンジュゲーションを、約10:1〜1:10（酵素ユ
ニット／免疫学的活性を有する物質のユニット）、好ま
しくは、3:1〜1:3、さらに好ましくは、1:1のモル比を
用いて行う。この反応は、中性pHで行う。
本発明の製造方法を２つの工程で行う共重合について
以下に詳述する。
以下に詳述する。
コンジュゲートを製造するために選択した酵素を、共
重合反応前、pH4〜８で、過ヨウ素酸塩などの炭水化物
基を酸化するヘテロ二官能性試薬（酵素のモル当たり数
100mol）で処理する。次いで、酸化した酵素の溶液の分
析によって、過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。
重合反応前、pH4〜８で、過ヨウ素酸塩などの炭水化物
基を酸化するヘテロ二官能性試薬（酵素のモル当たり数
100mol）で処理する。次いで、酸化した酵素の溶液の分
析によって、過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。
酸化された酵素の溶液を５〜10mg/mlに調節し、二等
分する。
分する。
次いで、第１部分に２−メルカプトエチルアミンなど
のヘテロ二官能性試薬を、pH7〜9.5の媒質中、1:1−10
モル当量（酵素ユニット／ジアミンユニット）、好まし
くは、1:4−６モル当量の濃度で添加し、室温で１時間
反応させる。
のヘテロ二官能性試薬を、pH7〜9.5の媒質中、1:1−10
モル当量（酵素ユニット／ジアミンユニット）、好まし
くは、1:4−６モル当量の濃度で添加し、室温で１時間
反応させる。
第２部分に４−（マレイミドメチル）−１−シクロヘ
キサンカルボヒドラジドなどの試薬を前記のような濃度
で添加し、室温で１時間反応させる。
キサンカルボヒドラジドなどの試薬を前記のような濃度
で添加し、室温で１時間反応させる。
好ましい変形によると、前記工程について、以下のプ
ロトコールが行われる： pH5〜７で、第１部分に３−（２−ピリジルジチオ）
フロピオノヒドラジド（PDPH）などの試薬を約5mMの最
終濃度で添加する。該反応物を20℃で約１時間反応させ
る。
ロトコールが行われる： pH5〜７で、第１部分に３−（２−ピリジルジチオ）
フロピオノヒドラジド（PDPH）などの試薬を約5mMの最
終濃度で添加する。該反応物を20℃で約１時間反応させ
る。
pH5〜７で、第２部分に４−（４−マレイミドフェニ
ル）ブチロヒドラジド（MPBH）などの試薬を約1mMの最
終濃度で添加する。該反応物を20℃で約１時間反応させ
る。
ル）ブチロヒドラジド（MPBH）などの試薬を約1mMの最
終濃度で添加する。該反応物を20℃で約１時間反応させ
る。
酵素溶液の各々を濾過し、ゲル濾過によって精製す
る。
る。
PDPHで活性化されたフラクションをジチオトレイトー
ル（最終濃度10mM）で約10分間還元し、次いで、ゲル濾
過により再度精製する。
ル（最終濃度10mM）で約10分間還元し、次いで、ゲル濾
過により再度精製する。
還元後にPDPHで活性化された酵素フラクションを、MP
BHで活性化された酵素フラクションと混合する。pH6〜
８で約20℃で、２つの種類を共重合反応させる。
BHで活性化された酵素フラクションと混合する。pH6〜
８で約20℃で、２つの種類を共重合反応させる。
本発明の方法によると、正確な特徴が共重合体を形成
する酵素によって選択される分析用カラムを用いてゲル
濾過によって、共重合をモニターする。例えば、アルカ
リホスファターゼ（MW＝140,000）のためには、ファル
マシア・スーパーローズ（Pharmacia Superose ）6Pre
p Gradeゲルを充填したカラムを用い、ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ（MW＝44,000）のためには、スー
パーローズ（Superose ）12Prep Gradeゲルを充填した
カラムを用いる。
する酵素によって選択される分析用カラムを用いてゲル
濾過によって、共重合をモニターする。例えば、アルカ
リホスファターゼ（MW＝140,000）のためには、ファル
マシア・スーパーローズ（Pharmacia Superose ）6Pre
p Gradeゲルを充填したカラムを用い、ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ（MW＝44,000）のためには、スー
パーローズ（Superose ）12Prep Gradeゲルを充填した
カラムを用いる。
本発明の方法によると、共重合後、２−メルカプトエ
タノール（最終濃度1mM）およびＮ−エチルマレイミド
（最終濃度2mM）の連続添加によって、反応のブロッキ
ングを行う。反応しなかったカルボニル基を還元し、カ
ルボニル基とヒドラジドとの反応によって生じたヒドラ
ゾン基を安定化させるために、ホウ水素化ナトリウムま
たはシアノホウ水素化ナトリウムによる還元を行っても
よい。
タノール（最終濃度1mM）およびＮ−エチルマレイミド
（最終濃度2mM）の連続添加によって、反応のブロッキ
ングを行う。反応しなかったカルボニル基を還元し、カ
ルボニル基とヒドラジドとの反応によって生じたヒドラ
ゾン基を安定化させるために、ホウ水素化ナトリウムま
たはシアノホウ水素化ナトリウムによる還元を行っても
よい。
前記分析的モニターリングと同様の条件下、分取用カ
ラムでのゲル濾過によって、共重合された酵素の溶液を
精製する。ゲルから排除された種に相当するフラクショ
ンを回収する。これは、共重合した酵素の溶液を構成す
る。BCAアッセイ［ピアス（Pierce）］によってタンパ
ク濃度を測定する。
ラムでのゲル濾過によって、共重合された酵素の溶液を
精製する。ゲルから排除された種に相当するフラクショ
ンを回収する。これは、共重合した酵素の溶液を構成す
る。BCAアッセイ［ピアス（Pierce）］によってタンパ
ク濃度を測定する。
次いで、pH6.5〜８で、酵素のモル当たり５〜50molの
割合でホモ−またはヘテロ二官能性試薬を添加すること
によって、酵素共重合を行う。次いで、ゲル上での脱塩
によって、活性化された酵素共重合体を精製する。
割合でホモ−またはヘテロ二官能性試薬を添加すること
によって、酵素共重合を行う。次いで、ゲル上での脱塩
によって、活性化された酵素共重合体を精製する。
次いで、活性化された酵素共重合体と免疫学的活性を
有する物質とのコジュゲーションを、約10:1〜1:10（酵
素ユニット／免疫学的活性を有する物質のユニット）、
好ましくは、3:1〜1:3、さらに好ましくは、1:1のモル
比を用いて行う。この反応は、中性pHで行う。
有する物質とのコジュゲーションを、約10:1〜1:10（酵
素ユニット／免疫学的活性を有する物質のユニット）、
好ましくは、3:1〜1:3、さらに好ましくは、1:1のモル
比を用いて行う。この反応は、中性pHで行う。
得ようとするコンジュゲートの選択に依存して、共重
合反応前に、酵素の遊離アミン基をブロックしたり、し
なかったりする。
合反応前に、酵素の遊離アミン基をブロックしたり、し
なかったりする。
酵素分子の遊離アミン基をブロックしない限り、共重
合反応の間、例えば、1,4−フェニレンジアミンなどの
芳香族ジアミンまたはヘテロ二官能性試薬を用いること
が好ましいであろう。
合反応の間、例えば、1,4−フェニレンジアミンなどの
芳香族ジアミンまたはヘテロ二官能性試薬を用いること
が好ましいであろう。
酵素分子の遊離アミン基を共重合反応前にアミノ基に
ついての保護剤でブロックする限り、炭素原子２〜12個
からなる脂肪族ジアミン（直鎖状、分枝鎖状または環
状）もしくは芳香族アミンまたはヘテロ二官能性試薬を
用いて共重合反応を行ってもよい。
ついての保護剤でブロックする限り、炭素原子２〜12個
からなる脂肪族ジアミン（直鎖状、分枝鎖状または環
状）もしくは芳香族アミンまたはヘテロ二官能性試薬を
用いて共重合反応を行ってもよい。
次いで、共重合反応させてもよく、ホモ−またはヘテ
ロ二官能性試薬を介して免疫学的活性を有する物質と酵
素共重合体とをカップリングさせることが望ましい点に
依存して、アミン機能を保護する基を除去したり、しな
かったりする。
ロ二官能性試薬を介して免疫学的活性を有する物質と酵
素共重合体とをカップリングさせることが望ましい点に
依存して、アミン機能を保護する基を除去したり、しな
かったりする。
酵素共重合体と免疫学的活性を有する物質とのカップ
リングは、酵素共重合体のタンパク部分、または、ジア
ミン、または、一端を介して酸化された糖部分と予め反
応されており、他端を介してもしくは一度に両端では反
応しなかったヘテロ二官能性試薬で生じることができ
る。
リングは、酵素共重合体のタンパク部分、または、ジア
ミン、または、一端を介して酸化された糖部分と予め反
応されており、他端を介してもしくは一度に両端では反
応しなかったヘテロ二官能性試薬で生じることができ
る。
一工程共重合からなる本発明のコンジュゲートの製造
方法が免疫酵素的試験における感度の相当な増加を示す
コンジュゲートを得ることに加えて製造の好都合な変形
を可能にすることは、前記説明から明らかである。
方法が免疫酵素的試験における感度の相当な増加を示す
コンジュゲートを得ることに加えて製造の好都合な変形
を可能にすることは、前記説明から明らかである。
二工程共重合からなる本発明のコンジュゲートの製造
方法の利点が免疫学的活性を有する物質についてのカッ
プリング部位の選択範囲が大きいことであることも、前
記説明から明らかである。
方法の利点が免疫学的活性を有する物質についてのカッ
プリング部位の選択範囲が大きいことであることも、前
記説明から明らかである。
したがって、選択された酵素の共重合体および感染に
対して特異的な免疫学的活性を有する物質からなる好適
な免疫コンジュゲートは、診断が望まれる感染に従っ
て、本発明のコンジュゲートの製造方法の選択によって
得られる。本発明のコンジュゲートの製造方法の可能な
組合せ（１種類以上の共重合された酵素の共重合工程ま
たは用いられる免疫学的活性を有する１つ以上の物質の
カップリング工程のいずれに関しても）は、さまざまで
あり、賢明な選択によって、特異的かつ非常に感度の良
い検出結果を達成するコンジュゲートを得ることができ
るようになる。
対して特異的な免疫学的活性を有する物質からなる好適
な免疫コンジュゲートは、診断が望まれる感染に従っ
て、本発明のコンジュゲートの製造方法の選択によって
得られる。本発明のコンジュゲートの製造方法の可能な
組合せ（１種類以上の共重合された酵素の共重合工程ま
たは用いられる免疫学的活性を有する１つ以上の物質の
カップリング工程のいずれに関しても）は、さまざまで
あり、賢明な選択によって、特異的かつ非常に感度の良
い検出結果を達成するコンジュゲートを得ることができ
るようになる。
以下の実施例の記載において、限定されない場合、ク
ロマトグラフィー系のカラム［スーパーローズ（Supero
se ）12Prep GradeゲルおよびHR10×30およびXK16×70
カラム、ファルマシア（PHARMACIA）］は、洗浄され、
予め除気されたPBS緩衝液（50mM/pH＝7.4）を用いて平
衡化される。
ロマトグラフィー系のカラム［スーパーローズ（Supero
se ）12Prep GradeゲルおよびHR10×30およびXK16×70
カラム、ファルマシア（PHARMACIA）］は、洗浄され、
予め除気されたPBS緩衝液（50mM/pH＝7.4）を用いて平
衡化される。
実施例1:ペルオキシターゼ−HIV1ペプチドコンジュゲー
ト ａ−ペルオキシターゼの一工程共重合： 共重合を行うために、以下の緩衝液（Bfr）を調製す
る： − PBS Bfr（50mMリン酸ナトリウム、 0.15M NaCl/pH7.4） 2.0リットル − HEPES Bfr（0.36M/pH＝5.4） 0.1リットル − 酢酸ナトリウムBfr（0.01M/pH＝5.4） 酸化された
ペルオキシダーゼの容量の少なくとも1000倍 − 炭酸ナトリウムBfr（1M/pH＝9.0） ペルオキシダ
ーゼの容量の15％ 濃度および使用量の算出のために、280および403nmで
光学密度（OD）測定を行う；質量消衰係数（mass extin
ction coefficient）は、 ε280＝0.7ml.mg-1.cm-1 ε403＝1.93ml.mg-1.cm-1 である。
ト ａ−ペルオキシターゼの一工程共重合： 共重合を行うために、以下の緩衝液（Bfr）を調製す
る： − PBS Bfr（50mMリン酸ナトリウム、 0.15M NaCl/pH7.4） 2.0リットル − HEPES Bfr（0.36M/pH＝5.4） 0.1リットル − 酢酸ナトリウムBfr（0.01M/pH＝5.4） 酸化された
ペルオキシダーゼの容量の少なくとも1000倍 − 炭酸ナトリウムBfr（1M/pH＝9.0） ペルオキシダ
ーゼの容量の15％ 濃度および使用量の算出のために、280および403nmで
光学密度（OD）測定を行う；質量消衰係数（mass extin
ction coefficient）は、 ε280＝0.7ml.mg-1.cm-1 ε403＝1.93ml.mg-1.cm-1 である。
ペルオキシダーゼの分子量は、44,000Daである。
HEPES緩衝液中45mg/mlの理論的な濃度でペルオキシダ
ーゼ（100mg）を調製し、次いで、λ280および403nmでO
Dを測定することによってチェックする。濃度は、35mg/
mlから15％以内までである。次いで、過ヨウ素酸塩（HE
PES緩衝液中100mg/mlの濃度で、ペルオキシターゼの量
の1.5倍）を添加することによって酸化する。この酸化
は、約20℃で45分±10分間続き、一定に撹拌しつつ行わ
れる。
ーゼ（100mg）を調製し、次いで、λ280および403nmでO
Dを測定することによってチェックする。濃度は、35mg/
mlから15％以内までである。次いで、過ヨウ素酸塩（HE
PES緩衝液中100mg/mlの濃度で、ペルオキシターゼの量
の1.5倍）を添加することによって酸化する。この酸化
は、約20℃で45分±10分間続き、一定に撹拌しつつ行わ
れる。
次いで、分析を行う。該分析は、酸化されたペルオキ
シダーゼの量よりも非常に過剰である酢酸ナトリウム緩
衝液の３つの容量に相当する３つの工程において４℃で
行われる。全分析時間は、約24時間である。
シダーゼの量よりも非常に過剰である酢酸ナトリウム緩
衝液の３つの容量に相当する３つの工程において４℃で
行われる。全分析時間は、約24時間である。
炭酸ナトリウム緩衝液を添加することによって得られ
たアルカリ性媒質中、炭酸ナトリウム緩衝液中2mg/mlの
濃度の４モル当量の1,4−フェニレンジアミンの存在下
で共重合が生じる。この工程は、撹拌しつつ20℃で約12
時間生じる。
たアルカリ性媒質中、炭酸ナトリウム緩衝液中2mg/mlの
濃度の４モル当量の1,4−フェニレンジアミンの存在下
で共重合が生じる。この工程は、撹拌しつつ20℃で約12
時間生じる。
HR10×30分析用カラム中、スーパーローズ（Superose
）ゲル上に共重合されたペルオキシダーゼ25μｌを注
入することによって、共重合をモニターする。該プロフ
ィールは、ゲルから排除された分子種に相当する優位な
ピークからなる。別の２または３つピークが存在しても
よく、これらは、共重合の種々の状態に相当する。次い
で、該反応をブロックする。
）ゲル上に共重合されたペルオキシダーゼ25μｌを注
入することによって、共重合をモニターする。該プロフ
ィールは、ゲルから排除された分子種に相当する優位な
ピークからなる。別の２または３つピークが存在しても
よく、これらは、共重合の種々の状態に相当する。次い
で、該反応をブロックする。
共重合の間に反応しなかったペルオキシダーゼ分子の
酸化された基を還元することによって、共重合の停止を
行う。該停止は、水溶液中5mg/mlの濃度でホウ水素化ナ
トリウム（ペルオキシダーゼの５容量％）を添加するこ
とによって行われる。該混合物を30秒間撹拌し続け、次
いで、撹拌せずに室温で15〜20分間放置する。
酸化された基を還元することによって、共重合の停止を
行う。該停止は、水溶液中5mg/mlの濃度でホウ水素化ナ
トリウム（ペルオキシダーゼの５容量％）を添加するこ
とによって行われる。該混合物を30秒間撹拌し続け、次
いで、撹拌せずに室温で15〜20分間放置する。
同一条件下、同一の工程の２回目を繰り返す。
XK16×70分取用カラム中、スーパーローズ（Superose
）ゲル上で該共重合体を精製する。ペルオキシダーゼ
の最大注入量は、200mgであり、最大容量は、10mlであ
る。該カラムは、PBS緩衝液中で平衡化されるべきであ
る。精製のための流速は、120ml/時である。
）ゲル上で該共重合体を精製する。ペルオキシダーゼ
の最大注入量は、200mgであり、最大容量は、10mlであ
る。該カラムは、PBS緩衝液中で平衡化されるべきであ
る。精製のための流速は、120ml/時である。
ゲルによって排除されたかまたは最小に保持された分
子種に相当するフラクションを回収する。
子種に相当するフラクションを回収する。
ペルオキシダーゼ共重合体についての質量消衰係数
（ε）は、λ403nmで1.3ml.mg-1.cm-1である。
（ε）は、λ403nmで1.3ml.mg-1.cm-1である。
ｂ−カップリング：
以下の緩衝液を調製する：
− PBS Bfr（50mMリン酸ナトリウム、
0.15M NaCl/pH＝7.4） ２リットル
− MBU Bfr:−5mM2−モルホリノエタンスルホン酸（ME
S） 5mM −5mMホウ酸 −2M尿素 pH＝7.0 ２リットル 用いたペプチドは、HIV1単離BRUのgp41タンパクのフ
ラグメント（584−609）である。このペプチドは、公開
番号がEP220,273であるジェネティック・システムズ・
コーポレイション（Genetic Systems Corporation）欧
州特許に開示されているペプチド39に相当する。
S） 5mM −5mMホウ酸 −2M尿素 pH＝7.0 ２リットル 用いたペプチドは、HIV1単離BRUのgp41タンパクのフ
ラグメント（584−609）である。このペプチドは、公開
番号がEP220,273であるジェネティック・システムズ・
コーポレイション（Genetic Systems Corporation）欧
州特許に開示されているペプチド39に相当する。
活性化されるべき共重合体の量は、結合されるべきペ
プチドの量に依存する:HIV1ペプチド1mgについてペルオ
キシダーゼ10〜20mg。
プチドの量に依存する:HIV1ペプチド1mgについてペルオ
キシダーゼ10〜20mg。
一定に撹拌しつつ、20℃で45分間、PBS緩衝液中30mg/
mlの濃度で35モル当量のBS3でペルオキシダーゼ共重合
体を活性化する。
mlの濃度で35モル当量のBS3でペルオキシダーゼ共重合
体を活性化する。
MBU中で平衡化されたスーパーローズ（Superose ）
ゲル上で、活性化された酵素共重合体の脱塩を行う。そ
の機能は、未反応BS3から活性化されたペルオキシダー
ゼ共重合体を分離することである。
ゲル上で、活性化された酵素共重合体の脱塩を行う。そ
の機能は、未反応BS3から活性化されたペルオキシダー
ゼ共重合体を分離することである。
この脱塩により、ペルオキシダーゼ共重合体をエマー
ジェンスについて回収し、6mg/mlの濃度に調節した。
ジェンスについて回収し、6mg/mlの濃度に調節した。
活性化されたペルオキシダーゼ共重合体およびHIV1ペ
プチドのコンジュゲーションについて、モル比（ペプチ
ド／ペルオキシダーゼ）は、1:1である。該ペプチド
は、溶液中、5mg/mlの濃度である。活性化されたペルオ
キシダーゼ共重合体およびペプチドの正確な量を混合
し、20℃で２時間、絶えず撹拌し続けた。
プチドのコンジュゲーションについて、モル比（ペプチ
ド／ペルオキシダーゼ）は、1:1である。該ペプチド
は、溶液中、5mg/mlの濃度である。活性化されたペルオ
キシダーゼ共重合体およびペプチドの正確な量を混合
し、20℃で２時間、絶えず撹拌し続けた。
コンジュゲーションの２時間後、PBS緩衝液中で平衡
化されたスーパーローズ（Superose ）ゲル上で該混合
物を精製する。ペルオキシダーゼ共重合体/HIV1ペプチ
ド混合物をカラムに流速120mg/時で注入した。
化されたスーパーローズ（Superose ）ゲル上で該混合
物を精製する。ペルオキシダーゼ共重合体/HIV1ペプチ
ド混合物をカラムに流速120mg/時で注入した。
コンジュゲートに相当するフラクションを回収し、該
濃度を、λ403nmでODを測定する（ε＝1.3ml.mg-1.c
m-1）ことによって測定する。
濃度を、λ403nmでODを測定する（ε＝1.3ml.mg-1.c
m-1）ことによって測定する。
実施例2:アルカリホスファターゼ−HIV1ペプチドコンジ
ュゲート ａ−アルカリホスファターゼの一工程共重合 ペルオキシダーゼの代わりに精製したアルカリホスフ
ァターゼを用いる以外は、実施例１に記載されていると
同一の製造プロトコールを行う。アルカリホスファター
ゼの分子量は、140,000Daである。実施例２のコンジュ
ゲートを製造するために、3M NaCl、5mM MgCl2および0.
2mM ZnCl2を含有するトリエタノールアミン緩衝液（pH
＝7.6）中12mg/mlの濃度の酵素の溶液からアルカリホス
ファターゼの共重合を行う。
ュゲート ａ−アルカリホスファターゼの一工程共重合 ペルオキシダーゼの代わりに精製したアルカリホスフ
ァターゼを用いる以外は、実施例１に記載されていると
同一の製造プロトコールを行う。アルカリホスファター
ゼの分子量は、140,000Daである。実施例２のコンジュ
ゲートを製造するために、3M NaCl、5mM MgCl2および0.
2mM ZnCl2を含有するトリエタノールアミン緩衝液（pH
＝7.6）中12mg/mlの濃度の酵素の溶液からアルカリホス
ファターゼの共重合を行う。
アルカリホスファターゼのモル当量当たり400モル当
量の過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化を行う。
量の過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化を行う。
スーパーローズ（Superose）6PGゲル［ファルマシア
（Pharmacia）］上で、共重合のモニターリングを行
う。
（Pharmacia）］上で、共重合のモニターリングを行
う。
アルカリホスファターゼ共重合体についての質量消衰
係数（ε）は、非重合化ホスファターゼについての1.0m
l.mg-1.cm-1の代わりに、λ280nmで1.4ml.mg-1.cm-1で
ある。
係数（ε）は、非重合化ホスファターゼについての1.0m
l.mg-1.cm-1の代わりに、λ280nmで1.4ml.mg-1.cm-1で
ある。
ｂ−カップリング：
酵素共重合体を変えて、実施例１に記載の方法に従っ
て、ペプチドと重合されたアルカリホスファターゼとの
カップリングを行う。酵素ユニットのモル当たりペプチ
ド3molを用いて行ったカップリング反応後、MgCl2（1m
M）およびZnCl2（0.1mM）を含有する10mMトリス緩衝液
（pH8）中で平衡化されたスーパーローズ（Superos
e ）6PGゲル上でコンジュゲートを精製する。ゲルから
排除され、コンジュゲートに相当するフラクションを回
収する。280nmで光学密度を測定する（ε＝1.41ml.m
g-1.cm-1）ことによって、濃度を測定する。
て、ペプチドと重合されたアルカリホスファターゼとの
カップリングを行う。酵素ユニットのモル当たりペプチ
ド3molを用いて行ったカップリング反応後、MgCl2（1m
M）およびZnCl2（0.1mM）を含有する10mMトリス緩衝液
（pH8）中で平衡化されたスーパーローズ（Superos
e ）6PGゲル上でコンジュゲートを精製する。ゲルから
排除され、コンジュゲートに相当するフラクションを回
収する。280nmで光学密度を測定する（ε＝1.41ml.m
g-1.cm-1）ことによって、濃度を測定する。
調製したコンジュゲート（コンジュゲートＢ）の使用
および非重合化酵素を含有する従来技術によるコンジュ
ゲート（コンジュゲートＡ）との比較 従来技術に従って調製したコンジュゲートＡについて
は、用いる酵素は、重合されていない。ペプチドを酵素
にカップリングさせる方法は、この実施例に記載のカッ
プリング方法と同一である。
および非重合化酵素を含有する従来技術によるコンジュ
ゲート（コンジュゲートＡ）との比較 従来技術に従って調製したコンジュゲートＡについて
は、用いる酵素は、重合されていない。ペプチドを酵素
にカップリングさせる方法は、この実施例に記載のカッ
プリング方法と同一である。
アクセス（Access ）装置［サノフィ・ディアグノステ
ィクス・パストゥール（Sanofi Diagnostics Pasteu
r）］において行ったイムノアッセイの原理 HIV1ウイルスに対して行われた抗体の検出は、サンド
イッチ型化学発光性免疫酵素的技術の原理に基づいてい
る。該試験は、HIV1エンベロープ糖タンパクを含む精製
した抗原で被覆した固相の使用に基づいている。
ィクス・パストゥール（Sanofi Diagnostics Pasteu
r）］において行ったイムノアッセイの原理 HIV1ウイルスに対して行われた抗体の検出は、サンド
イッチ型化学発光性免疫酵素的技術の原理に基づいてい
る。該試験は、HIV1エンベロープ糖タンパクを含む精製
した抗原で被覆した固相の使用に基づいている。
固相は、希釈剤0.1ml中50μｇの割合で常磁性マイク
ロビーズ［エスタポア（Estapor ）、プロラボ（Prola
bo）、フランス］からなる。
ロビーズ［エスタポア（Estapor ）、プロラボ（Prola
bo）、フランス］からなる。
酵素について用いられる基質は、AMPPPD型のジオキセ
タン［トロピックス（Tropix）］または等価物である。
タン［トロピックス（Tropix）］または等価物である。
研究した血清は、
− 抗HIV1抗体について陽性の試料13個（BBI、NABI、
セロロジカルズ（Serologicals）、アメリカ合衆国から
入手された、希釈されたかまたはそうではない、セロコ
ンバージョン（seroconversion）試料）、 − 抗HIV1抗体について陰性の試料44個 からなっている。
セロロジカルズ（Serologicals）、アメリカ合衆国から
入手された、希釈されたかまたはそうではない、セロコ
ンバージョン（seroconversion）試料）、 − 抗HIV1抗体について陰性の試料44個 からなっている。
この実施例に記載されるコンジュゲートを使用するた
めに以下の工程を行う： Ａと記した一連のチューブおよびＢと記した一連のチ
ューブを調製する。
めに以下の工程を行う： Ａと記した一連のチューブおよびＢと記した一連のチ
ューブを調製する。
チューブ当たり以下のものを分配する：
− 感作マイクロビーズの懸濁液0.1ml
− 研究下の血清0.1ml。
37℃で20分間のインキュベーション、および洗浄（３
回）後、コンジュゲート0.26mlを添加する： − チューブA:コンジュゲートＡ − チューブB:コンジュゲートＢ。
回）後、コンジュゲート0.26mlを添加する： − チューブA:コンジュゲートＡ − チューブB:コンジュゲートＢ。
全てのチューブを37℃で20分間インキュベートし、洗
浄し（３回）、次いで、各チューブに基質0.2mlを添加
し、該混合物を37℃で５分間インキュベートし、アクセ
ス（Access ）光電子増倍管を用いてチューブＡおよび
Ｂの各々において、ALU（任意光単位（arbitrary light
units））で表される発光を測定する。
浄し（３回）、次いで、各チューブに基質0.2mlを添加
し、該混合物を37℃で５分間インキュベートし、アクセ
ス（Access ）光電子増倍管を用いてチューブＡおよび
Ｂの各々において、ALU（任意光単位（arbitrary light
units））で表される発光を測定する。
結果：
１−閾値の確立：
チューブＡの陰性試料全てにおける発光の平均値
（ALU）を算出し、標準偏差値（SD）10を加え、値Ａ
＋10 SDを得、これをチューブＡの閾値として用いる。
（ALU）を算出し、標準偏差値（SD）10を加え、値Ａ
＋10 SDを得、これをチューブＡの閾値として用いる。
チューブＢの陰性試料全てにおける発光の平均値
（ALU）を算出し、標準偏差値（SD）10を加え、値Ｂ
＋10 SD（ALUで表す）を得、これをチューブＢの閾値と
して用いる。
（ALU）を算出し、標準偏差値（SD）10を加え、値Ｂ
＋10 SD（ALUで表す）を得、これをチューブＢの閾値と
して用いる。
２−結果の解釈
試料は、発光の値がそれに相当する閾値よりも大きい
場合に陽性と宣言される。
場合に陽性と宣言される。
試料は、発光の値がそれに相当する閾値よりも小さい
場合に陰性と宣言される。
場合に陰性と宣言される。
下記第１表は、得られた値を示す。
本発明のコンジュゲート（Ｂ）により、コンジュゲー
トＡについてのALU反応と比較して非常に有意に増加し
たALU反応を得ることができることは、得られた結果か
ら非常に明確に明らかになる。さらに、従来技術のコン
ジュゲート（Ａ）を用いて陰性であることが判明した６
つの血清（No.514;Q4−1/40;Q6−1/100;Q6−1/200;241D
1/100;K5 1/10）は、本発明のコンジュゲート（Ｂ）を
用いると陽性になる。
トＡについてのALU反応と比較して非常に有意に増加し
たALU反応を得ることができることは、得られた結果か
ら非常に明確に明らかになる。さらに、従来技術のコン
ジュゲート（Ａ）を用いて陰性であることが判明した６
つの血清（No.514;Q4−1/40;Q6−1/100;Q6−1/200;241D
1/100;K5 1/10）は、本発明のコンジュゲート（Ｂ）を
用いると陽性になる。
したがって、これらのアッセイは、本発明により、改
良された感度を得ることができることを明確に示す。
良された感度を得ることができることを明確に示す。
実施例3:ペルオキシダーゼ−HIV1モノクローナル抗体コ
ンジュゲート HIV1ペプチドの代わりに、抗−HIV1モノクローナル抗
体、クローンHIV−p25−６（ATCC No.HB9409で寄託され
ている）を用いる以外は、実施例１に記載したと同一の
製造プロトコールを行う。
ンジュゲート HIV1ペプチドの代わりに、抗−HIV1モノクローナル抗
体、クローンHIV−p25−６（ATCC No.HB9409で寄託され
ている）を用いる以外は、実施例１に記載したと同一の
製造プロトコールを行う。
製造されたHIVコンジュゲート（コンジュゲートＢ）
の使用および従来技術によって製造されたコンジュゲー
ト（コンジュゲートＡ）との比較 試薬： − コンジュゲートB:この実施例で製造方法を前記した
共重合された免疫酵素的コンジュゲート。
の使用および従来技術によって製造されたコンジュゲー
ト（コンジュゲートＡ）との比較 試薬： − コンジュゲートB:この実施例で製造方法を前記した
共重合された免疫酵素的コンジュゲート。
− コンジュゲートA:ナカネ（Nakane）ら［ジャーナル
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（J.Histochem.Cytochem.）1974、22、第1084−109
1頁］の技術に従って製造した抗体HIV−ｐ−25−６−ペ
ルオキシダーゼコンジュゲート。
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（J.Histochem.Cytochem.）1974、22、第1084−109
1頁］の技術に従って製造した抗体HIV−ｐ−25−６−ペ
ルオキシダーゼコンジュゲート。
− 固相：モノクローナル抗体HIV−ｐ−25−２およびH
IV−ｐ−25−３で感作されたマイクロプレート。
IV−ｐ−25−３で感作されたマイクロプレート。
− 酵素基質:TMB（テトラメチルベンジジン）
試料：
− 陰性血清10個。
− HIVウイルス（V1〜V4）または組換えタンパク（RP1
およびRP2）の希釈物からなる陽性対照試料６個。
およびRP2）の希釈物からなる陽性対照試料６個。
− 血清ブランク１個：血清を含まないが、代わりに希
釈物0.2mlを含有するウエル。
釈物0.2mlを含有するウエル。
アッセイプロトコール：
当該技術の実行は、以下の工程に基づく：
研究下の各血清（3/4に希釈した試料0.2ml）をマイク
ロプレートのウエルに分配する。40℃で30分間のインキ
ュベートし、次いで、洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識コンジュゲート（0.2ml）を添加する。40℃で30分
間、さらにインキュベートし、さらに洗浄した後、室温
で30分間、基質（TMB）の存在下でインキュベートする
ことによって、複合体上に固定化された酵素の存在を視
覚化する。該反応をH2SO4で停止させた後、λ450/620nm
で分光光度計で測定する。
ロプレートのウエルに分配する。40℃で30分間のインキ
ュベートし、次いで、洗浄した後、ペルオキシダーゼ標
識コンジュゲート（0.2ml）を添加する。40℃で30分
間、さらにインキュベートし、さらに洗浄した後、室温
で30分間、基質（TMB）の存在下でインキュベートする
ことによって、複合体上に固定化された酵素の存在を視
覚化する。該反応をH2SO4で停止させた後、λ450/620nm
で分光光度計で測定する。
結果：
第２表は、２つのコンジュゲートＡおよびＢを用いて
得られた比較結果を示す。
得られた比較結果を示す。
第２表は、陰性血清について同一の平均にもかかわら
ず、陽性対照の光学密度が有意に増加しているので、感
度の増加がコンジュゲートＢの使用によって得られたこ
とを示す。
ず、陽性対照の光学密度が有意に増加しているので、感
度の増加がコンジュゲートＢの使用によって得られたこ
とを示す。
実施例4:アルカリホスファターゼ−HIV1ペプチドコンジ
ュゲート ａ−アルカリホスファターゼの二工程共重合 溶液中のアルカリホスファターゼ（3M NaCl、1mM MgC
l2および0.1mM ZnCl2を含有する30mMトリエタノールア
ミン緩衝液（pH7.6）中10〜20mg/ml）を過ヨウ素酸ナト
リウム（酵素のモル当たり300mol）で、20℃で45分間酸
化する。
ュゲート ａ−アルカリホスファターゼの二工程共重合 溶液中のアルカリホスファターゼ（3M NaCl、1mM MgC
l2および0.1mM ZnCl2を含有する30mMトリエタノールア
ミン緩衝液（pH7.6）中10〜20mg/ml）を過ヨウ素酸ナト
リウム（酵素のモル当たり300mol）で、20℃で45分間酸
化する。
次いで、1mM MgCl2を含有する10mM酢酸ナトリウム緩
衝液（pH5.5）に対して、酸化された酵素の溶液を透析
することによって、過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。
衝液（pH5.5）に対して、酸化された酵素の溶液を透析
することによって、過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。
透析後、酸化された酵素の溶液を二等分する。
第１部分に３−（２−ピリジルジチオ）プロピオノヒ
ドラジド（PDPH）を最終濃度4mMで添加し、アルカリホ
スファターゼ濃度を10mg/mlに調節する。該反応を20℃
で撹拌しつつ１時間続ける。
ドラジド（PDPH）を最終濃度4mMで添加し、アルカリホ
スファターゼ濃度を10mg/mlに調節する。該反応を20℃
で撹拌しつつ１時間続ける。
第２部分に４−（４−マレイミドフェニル）ブチロヒ
ドラジド（MPBH）を最終濃度1mMで添加し、アルカリホ
スファターゼ濃度を5mg/mlに調節する。該反応を20℃で
撹拌しつつ１時間続ける。
ドラジド（MPBH）を最終濃度1mMで添加し、アルカリホ
スファターゼ濃度を5mg/mlに調節する。該反応を20℃で
撹拌しつつ１時間続ける。
酵素溶液の各々を濾過し、150mM塩化ナトリウムを含
有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中、ゲル
濾過によって精製する。
有する50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中、ゲル
濾過によって精製する。
PDPHで活性化されたフラクションを、ジチオトレイト
ール（最終濃度10mM）で10分間還元し、次いで、ゲル濾
過によって再度精製する。
ール（最終濃度10mM）で10分間還元し、次いで、ゲル濾
過によって再度精製する。
還元後、PDPHで活性化された酵素フラクションを、MP
BHで活性化された酵素フラクションと混合する。２つの
種の共重合反応は、得られるのが望まれる共重合体のサ
イズに依存して、２〜15時間撹拌しつつ、20℃で行う。
BHで活性化された酵素フラクションと混合する。２つの
種の共重合反応は、得られるのが望まれる共重合体のサ
イズに依存して、２〜15時間撹拌しつつ、20℃で行う。
スーパーローズ（Superose ）6Prep Gradeゲル［フ
ァルマシア（Pharmacia）］を充填した分析用カラムで
のゲル濾過によって、共重合のモニターリングを行う。
ァルマシア（Pharmacia）］を充填した分析用カラムで
のゲル濾過によって、共重合のモニターリングを行う。
２−メルカプトエタノール（最終濃度1mM）およびＮ
−エチルマレイミド（最終濃度2mM）の連続添加によっ
て反応のブロッキングを行う。反応しなかったカルボニ
ル基を還元し、カルボニル基とヒドラジドとの反応によ
って生じたヒドラゾン基を安定化するために、ホウ水素
化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムによる
還元を行ってもよい。
−エチルマレイミド（最終濃度2mM）の連続添加によっ
て反応のブロッキングを行う。反応しなかったカルボニ
ル基を還元し、カルボニル基とヒドラジドとの反応によ
って生じたヒドラゾン基を安定化するために、ホウ水素
化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムによる
還元を行ってもよい。
前記の分析用モニターリングの条件と同様の条件下、
分取用カラムでのゲル濾過によって、重合された酵素の
溶液を精製する。ゲルから排除された種に相当するフラ
クションを回収する。このフラクションは、重合された
酵素の溶液を構成する。該タンパク濃度をBCAアッセイ
［ピアス（Pierce）］によって測定する。
分取用カラムでのゲル濾過によって、重合された酵素の
溶液を精製する。ゲルから排除された種に相当するフラ
クションを回収する。このフラクションは、重合された
酵素の溶液を構成する。該タンパク濃度をBCAアッセイ
［ピアス（Pierce）］によって測定する。
ｂ−カップリング：
実施例２の記載と同様のプロトコールを行う。
実施例5:ペルオキシダーゼ抗−HBsAG抗体コンジュゲー
ト このコンジュゲートを製造するために、実施例１（ａ
−ペルオキシダーゼの一工程共重合）に記載のペルオキ
シダーゼ共重合体を用いる。
ト このコンジュゲートを製造するために、実施例１（ａ
−ペルオキシダーゼの一工程共重合）に記載のペルオキ
シダーゼ共重合体を用いる。
カップリング：
ペルオキシダーゼ共重合体（5mg）を、水に30mg/mlの
濃度で溶解させた35モル当量の４−（マレイミドメチ
ル）−１−シクロヘキサンカルボン酸スルホスクシンイ
ミジル（スルホ−SMCC）で活性化する。20℃で30分間、
撹拌しつつ該反応を行う。
濃度で溶解させた35モル当量の４−（マレイミドメチ
ル）−１−シクロヘキサンカルボン酸スルホスクシンイ
ミジル（スルホ−SMCC）で活性化する。20℃で30分間、
撹拌しつつ該反応を行う。
PBS緩衝液中で平衡化したスーパーローズ（Superose
）ゲルで、活性化した酵素共重合体の脱塩を行う。そ
の機能は、活性化ペルオキシダーゼ共重合体を未反応ス
ルホ−SMCCから分離することである。
）ゲルで、活性化した酵素共重合体の脱塩を行う。そ
の機能は、活性化ペルオキシダーゼ共重合体を未反応ス
ルホ−SMCCから分離することである。
ペルオキシダーゼの活性化と同時に、以下の方法で、
モノクローナル抗体（クローン10−144）のチオール化
を行う。
モノクローナル抗体（クローン10−144）のチオール化
を行う。
− 濃度10mg/mlで無水エタノールに溶解させた８モル
当量の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ス
クシンイミジル（SPDP−ファルマシア（Pharmacia））
で濃度15mg/mlの抗体0.4mlを活性化する。該反応を撹拌
しつつ20℃で45分間続ける。PBS緩衝液中で平衡化させ
たPD−10型カラム（ファルマシア（Pharmacia））で、
活性化した抗体の脱塩を行う。その機能は、活性化され
た抗体を未反応SPDPから分離することである。回収した
抗体の溶液にDTT（ジチオトレイトール−ピアス（Pierc
e ））を添加して、10mMの最終濃度を達成する。該DTT
を５〜10分間反応させた後、前記と同様の方法でチオー
ル化した抗体の脱塩を行う。
当量の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ス
クシンイミジル（SPDP−ファルマシア（Pharmacia））
で濃度15mg/mlの抗体0.4mlを活性化する。該反応を撹拌
しつつ20℃で45分間続ける。PBS緩衝液中で平衡化させ
たPD−10型カラム（ファルマシア（Pharmacia））で、
活性化した抗体の脱塩を行う。その機能は、活性化され
た抗体を未反応SPDPから分離することである。回収した
抗体の溶液にDTT（ジチオトレイトール−ピアス（Pierc
e ））を添加して、10mMの最終濃度を達成する。該DTT
を５〜10分間反応させた後、前記と同様の方法でチオー
ル化した抗体の脱塩を行う。
ペルオキシダーゼおよび抗体のカップリングのため
に、前記で得た２つの溶液（チオール化した抗体3mgお
よび活性化ペルオキシダーゼ共重合体3mg、抗体の分子
当たり3.4酵素ユニットと等価）を撹拌しつつ20℃で２
時間混合する。
に、前記で得た２つの溶液（チオール化した抗体3mgお
よび活性化ペルオキシダーゼ共重合体3mg、抗体の分子
当たり3.4酵素ユニットと等価）を撹拌しつつ20℃で２
時間混合する。
β−メルカプトエタノール（最終濃度1mM）、次い
で、Ｎ−エチルマレイミド（最終濃度2mM）を15分間隔
てて連続的に添加することによって該反応をブロックす
る。
で、Ｎ−エチルマレイミド（最終濃度2mM）を15分間隔
てて連続的に添加することによって該反応をブロックす
る。
15分後、PBS中で平衡化したスーパーローズ（Superos
e）12PGゲルのカラムで該反応混合物を精製し、次い
で、PBSで溶離する。コンジュゲートに相当するフラク
ション（ゲルから排除された種）を回収し、タンパク・
アッセイ［BCAキット、ピアス（Pierce）］によって濃
度を測定する。
e）12PGゲルのカラムで該反応混合物を精製し、次い
で、PBSで溶離する。コンジュゲートに相当するフラク
ション（ゲルから排除された種）を回収し、タンパク・
アッセイ［BCAキット、ピアス（Pierce）］によって濃
度を測定する。
製造したコンジュゲート（コンジュゲートB:抗体10−
144−共重合化ペルオキシダーゼ）の使用およびHBs抗原
の検出における従来技術によって製造したコンジュゲー
ト（コンジュゲートA:抗体10−144−非共重合化ペルオ
キシダーゼ）との比較 行ったイムノアッセイの原理： 試薬： − コンジュゲートB:前記で製造。
144−共重合化ペルオキシダーゼ）の使用およびHBs抗原
の検出における従来技術によって製造したコンジュゲー
ト（コンジュゲートA:抗体10−144−非共重合化ペルオ
キシダーゼ）との比較 行ったイムノアッセイの原理： 試薬： − コンジュゲートB:前記で製造。
− コンジュゲートA:ナカネ（Nakane）ら［ジャーナル
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（J.Histochem.Cytochem.）1974、22、第1084−109
1頁］の技術に従って製造した抗体10−144−ペルオキシ
ダーゼコンジュゲート。
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リー（J.Histochem.Cytochem.）1974、22、第1084−109
1頁］の技術に従って製造した抗体10−144−ペルオキシ
ダーゼコンジュゲート。
− 固相:HBs Agモノリサ（Monolisa）キット［サノフ
ィ・ディアグノスティクス・パストゥール（Sanofi Dia
gnostics Pasteur）］で得られるようなモノクローナル
抗体112A26で感作したマイクロプレート。
ィ・ディアグノスティクス・パストゥール（Sanofi Dia
gnostics Pasteur）］で得られるようなモノクローナル
抗体112A26で感作したマイクロプレート。
− 酵素基質:TMB（テトラメチルベンジジン）
試料：
− 陰性血清194個。
− 陰性対照１個（マイクロプレート当たりいくつかの
ウエルにおいて試験した）。
ウエルにおいて試験した）。
− アッセイする試料（標準）:0.1、0.2、0.5、1.0、
3.0および5.0ng/ml。
3.0および5.0ng/ml。
アッセイプロトコール：
当該技術の実行は、以下の工程に基づく：
Ａと記した一連のマイクロプレートおよびＢと記した
一連のマイクロプレートを製造する。
一連のマイクロプレートを製造する。
ウエル当たり以下のものを分配する：
希釈剤50μ
コンジュゲート50μｌ
− ウエルA:コンジュゲートＡ
− ウエルB:コンジュゲートＢ
研究下の血清0.1ml。
40℃で１時間30分間インキュベートし、次いで、洗浄
した後、基質0.2mlを添加する。
した後、基質0.2mlを添加する。
全てのウエルを40℃で30分間インキュベートし、1.5N
H2SO40.1mlを添加し、次いで、ウエルＡおよびＢの各
々においてλ450/620nmでの光学密度（OD）を測定す
る。
H2SO40.1mlを添加し、次いで、ウエルＡおよびＢの各
々においてλ450/620nmでの光学密度（OD）を測定す
る。
結果：
略語DLで示した検出限界（または分析的感度）：
陰性対照で得た光学密度の平均を取ることによって各
マイクロプレートについて検出限界を測定し、次いで、
0.025光学密度ユニットを添加する。マイクロプレート
Ａにおいて、検出限界は、平均0.156ng/mlであった。し
たがって、従来技術のコンジュゲートを用いて、0.1ng/
ml標準を検出することはできなかった。マイクロプレー
トＢにおいて、検出限界は、平均0.046ng/mlであった。
したがって、本発明のコンジュゲートを用いて、0.1ng/
ml標準が完全によく検出されたことは、非常に明確であ
る。
マイクロプレートについて検出限界を測定し、次いで、
0.025光学密度ユニットを添加する。マイクロプレート
Ａにおいて、検出限界は、平均0.156ng/mlであった。し
たがって、従来技術のコンジュゲートを用いて、0.1ng/
ml標準を検出することはできなかった。マイクロプレー
トＢにおいて、検出限界は、平均0.046ng/mlであった。
したがって、本発明のコンジュゲートを用いて、0.1ng/
ml標準が完全によく検出されたことは、非常に明確であ
る。
マイクロプレートＡおよびマイクロプレートＢの両方
について、全ての陰性血清が実際に陰性であること、す
なわち、それらに相当する閾値以下であることが判明す
ることが明らかであろう。
について、全ての陰性血清が実際に陰性であること、す
なわち、それらに相当する閾値以下であることが判明す
ることが明らかであろう。
種々の結果を下記第３表に示す。
第３表の結果は、本発明のコンジュゲートが、擬似陽
性結果を生じずに、得られるべき感度を有意に増加させ
ることができたことを示す。
性結果を生じずに、得られるべき感度を有意に増加させ
ることができたことを示す。
実施例6:ペルオキシダーゼ−HCVペプチドコンジュゲー
トの酵素免疫アッセイ Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対して行われる抗体の検
出は、以下の実施例において、サンドイッチ型免疫酵素
的技術の原理に基づく。該試験は、HCVウイルス（キャ
プシド）の精製した抗原で感作した固相（マイクロプレ
ート）の使用に基づく。
トの酵素免疫アッセイ Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対して行われる抗体の検
出は、以下の実施例において、サンドイッチ型免疫酵素
的技術の原理に基づく。該試験は、HCVウイルス（キャ
プシド）の精製した抗原で感作した固相（マイクロプレ
ート）の使用に基づく。
試験の実行は、以下の反応工程に基づく：
研究下の各血清（3/4に希釈した試料0.1ml）をマクロ
プレートのウエル中に分配する。次いで、ペルオキシダ
ーゼ標識コンジュゲート（0.1ml）を添加する。40℃で3
0分間インキュベートし、次いで、洗浄した後、基質（T
MB）の存在下、30分間インキュベートすることによっ
て、複合体上の固定化された酵素の存在を視覚化する。
H2SO4で該反応を停止させた後、λ450/620nmで分光光度
計において測定する。各試料について、測定した光学密
度（OD）を算出した閾値のものと比較することによっ
て、抗−HCV抗体の存在または不在を測定する（この場
合、陰性の平均＋0.2）。
プレートのウエル中に分配する。次いで、ペルオキシダ
ーゼ標識コンジュゲート（0.1ml）を添加する。40℃で3
0分間インキュベートし、次いで、洗浄した後、基質（T
MB）の存在下、30分間インキュベートすることによっ
て、複合体上の固定化された酵素の存在を視覚化する。
H2SO4で該反応を停止させた後、λ450/620nmで分光光度
計において測定する。各試料について、測定した光学密
度（OD）を算出した閾値のものと比較することによっ
て、抗−HCV抗体の存在または不在を測定する（この場
合、陰性の平均＋0.2）。
第４表は、種々の条件下で製造した２つのコンジュゲ
ートＡおよびＢを用いて得られた比較結果を示す（HCV
ウイルスキャプシドタンパクの一部を模造するペプチド
のカップリング）。
ートＡおよびＢを用いて得られた比較結果を示す（HCV
ウイルスキャプシドタンパクの一部を模造するペプチド
のカップリング）。
製造したコンジュゲートＡおよびＢを以下に示す：
− コンジュゲートA:ペルオキシダーゼを処理せず、二
官能性試薬（PBS）を用いてペプチドをカップリングす
る。カップリング方法は、ペルオキシダーゼを用いる実
施例１に記載の方法である。
官能性試薬（PBS）を用いてペプチドをカップリングす
る。カップリング方法は、ペルオキシダーゼを用いる実
施例１に記載の方法である。
− コンジュゲートB:HIVペプチドの代わりにHCVペプチ
ドを用いて、実施例１に記載の方法に従って、コンジュ
ゲートを製造する。
ドを用いて、実施例１に記載の方法に従って、コンジュ
ゲートを製造する。
第４表は、全てのPHV−903−セロコンバージョン試料
［ボストン・バイオメディカ・インコーポレイテッド
（Boston Biomedica Inc.）からのパネル］について得
られた感度の増加を示す。公知の現行の試験によって検
出された最初の試料は、No.2〜No.6であるが、No.1では
ない。
［ボストン・バイオメディカ・インコーポレイテッド
（Boston Biomedica Inc.）からのパネル］について得
られた感度の増加を示す。公知の現行の試験によって検
出された最初の試料は、No.2〜No.6であるが、No.1では
ない。
これらの結果は、従前の結果を確認し、本発明の評価
を示す。
を示す。
実施例7:ペルオキシダーゼ−HIV1ペプチドコンジュゲー
トを用いる酵素免疫アッセイ HIVウイルスに対して行われる抗体の検出は、以下の
実施例において、サンドイッチ型免疫酵素的技術の原理
に基づく。該試験は、HIV1ウイルスエンベロープ糖タン
パクを含む精製した抗原で製造した固相の使用に基づ
く。
トを用いる酵素免疫アッセイ HIVウイルスに対して行われる抗体の検出は、以下の
実施例において、サンドイッチ型免疫酵素的技術の原理
に基づく。該試験は、HIV1ウイルスエンベロープ糖タン
パクを含む精製した抗原で製造した固相の使用に基づ
く。
マイクロプレートのウエルに研究下の血清（3/4に希
釈された試料0.1ml）を分配する。30分間インキュベー
トし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識コンジュゲー
トを添加する。遊離したままのコンジュゲートフラクシ
ョンを除去した後、基質の存在下、インキュベートする
ことによって、複合体上に固定化された酵素の存在を視
覚化する。該反応を停止させた後、450/620nmで分光光
度計で測定する。各試料について、測定した光学密度を
算出した閾値のものと比較することによって、抗HIV1抗
体の存在または不在を測定する（この場合、陰性の平均
＋0.1）。
釈された試料0.1ml）を分配する。30分間インキュベー
トし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識コンジュゲー
トを添加する。遊離したままのコンジュゲートフラクシ
ョンを除去した後、基質の存在下、インキュベートする
ことによって、複合体上に固定化された酵素の存在を視
覚化する。該反応を停止させた後、450/620nmで分光光
度計で測定する。各試料について、測定した光学密度を
算出した閾値のものと比較することによって、抗HIV1抗
体の存在または不在を測定する（この場合、陰性の平均
＋0.1）。
第４表は、種々の条件下で製造した５つのコンジュゲ
ートを用いて得られた比較結果を示す（HIV1ウイルスエ
ンベロープ糖タンパク／アミノ酸584−609単離BRUの免
疫優性（immunodominant）エピトープを模造するペプチ
ドと、ペルオキシダーゼとのカップリング）。
ートを用いて得られた比較結果を示す（HIV1ウイルスエ
ンベロープ糖タンパク／アミノ酸584−609単離BRUの免
疫優性（immunodominant）エピトープを模造するペプチ
ドと、ペルオキシダーゼとのカップリング）。
製造した種々のコンジュゲートを以下に示す：
− コンジュゲートA:ペルオキシダーゼを処理せず、二
官能性試薬を用いてペプチドをカップリングする（カッ
プリング方法は、実施例１に記載の方法である）。
官能性試薬を用いてペプチドをカップリングする（カッ
プリング方法は、実施例１に記載の方法である）。
− コンジュゲートB:以下の方法で変形したナカネら
［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サ
イトケミストリー（J.Histochem.Cytochem.）1974、2
2、第1084−1091頁］の方法に従って、ペプチドをペル
オキシダーゼとカップリングさせる。
［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サ
イトケミストリー（J.Histochem.Cytochem.）1974、2
2、第1084−1091頁］の方法に従って、ペプチドをペル
オキシダーゼとカップリングさせる。
ペルオキシダーゼ28mgを過ヨウ素酸ナトリウム19.7mg
で１時間30分酸化する。酸化したペルオキシダーゼ4mg
にペプチド1mgを３時間接触させる。このプロトコール
は、ナカネ法によるようなカップリングを変形しない。
で１時間30分酸化する。酸化したペルオキシダーゼ4mg
にペプチド1mgを３時間接触させる。このプロトコール
は、ナカネ法によるようなカップリングを変形しない。
− コンジュゲートC:番号EP601,318の下に公開された
特許出願に開示されている方法に従って、ペルオキシダ
ーゼを調製し、該出願の方法に従って二官能性試薬を用
いてペプチドにカップリングさせる。
特許出願に開示されている方法に従って、ペルオキシダ
ーゼを調製し、該出願の方法に従って二官能性試薬を用
いてペプチドにカップリングさせる。
− コンジュゲートD:二官能性共重合試薬として1,6−
ヘキサンジアミンを用いて、実施例１に記載の方法に従
って、コンジュゲートを製造する。
ヘキサンジアミンを用いて、実施例１に記載の方法に従
って、コンジュゲートを製造する。
− コンジュゲートE:実施例１に記載の方法に従って、
コンジュゲートを製造する。
コンジュゲートを製造する。
以下の表において示す結果は、前記プロトコールに従
って、前記コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを用
いて、酵素免疫アッセイを行って測定した光学密度値で
ある。
って、前記コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを用
いて、酵素免疫アッセイを行って測定した光学密度値で
ある。
用いた血清は、ボストン・バイオメディカ・インコー
ポレイテッド（Boston Biomedica Inc.）によって供給
されたパネルＫ、ＵおよびＱの試料ならびにHIV抗体の
検出について陰性の正常なドナー患者由来の血清31個で
ある。
ポレイテッド（Boston Biomedica Inc.）によって供給
されたパネルＫ、ＵおよびＱの試料ならびにHIV抗体の
検出について陰性の正常なドナー患者由来の血清31個で
ある。
表中で照合される試験の結果は、コンジュゲートＤお
よびＥのみにより、1/64に希釈された血清K2およびQ6の
両方の陽性反応を検出することができることを示す。
よびＥのみにより、1/64に希釈された血清K2およびQ6の
両方の陽性反応を検出することができることを示す。
したがって、本発明のコンジュゲートは、良好な検出
感度を従来技術の公知のコンジュゲートよりも得られる
ことができることが明らかである。かくして、HIV1ウイ
ルスに対して指向する抗体の検出は容易である。
感度を従来技術の公知のコンジュゲートよりも得られる
ことができることが明らかである。かくして、HIV1ウイ
ルスに対して指向する抗体の検出は容易である。
フロントページの続き
(72)発明者 ガデル，ステファヌ
フランス、エフ−91570ビェヴル、シュ
マン・ドゥ・ラ・パテュール（番地の表
示なし)
(72)発明者 ル・サジェ，カリヌ
フランス、エフ−78400シャトー、リ
ュ・ドゥ・ラ・ボワープワソニエール９
ア番
(56)参考文献 欧州特許出願公開175560（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
Claims (19)
- 【請求項１】酵素共重合体を形成するように、グリコシ
ル化された標識用酵素の酸化された炭水化物基を介して
お互いに共重合したグリコシル化された標識用酵素の分
子、および 共重合した標識用酵素の分子に酵素共重合体の遊離アミ
ン基を介してコンジュゲートした、免疫学的活性を有す
る少なくとも１つの物質 からなることを特徴とする、グリコシル化された標識用
酵素および免疫学的な活性を有する物質の免疫酵素的コ
ンジュゲート。 - 【請求項２】酵素共重合体が、お互いに結合された、標
識用酵素およびジアミンから、または、標識用酵素およ
び異なるヘテロ二官能性試薬から得られる請求項１記載
のコンジュゲート。 - 【請求項３】ジアミンが、直鎖状もしくは分枝鎖状また
は環状鎖を有する脂肪族ジアミンまたは芳香族ジアミン
である炭素原子２〜12個を含むジアミンから選択される
請求項２記載のコンジュゲート。 - 【請求項４】ジアミンが1,4−フェニレンジアミンであ
る請求項２記載のコンジュゲート。 - 【請求項５】異なるヘテロ二官能性試薬が、各々、２−
メルカプトエチルアミンまたは３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオノヒドラジド、および４−（マレイミドメ
チル）−１−シクロヘキサンカルボヒドラジドまたは４
−（４−マレイミドフェニル）ブチロヒドラジドから選
択される２つのヘテロ二官能性試薬である請求項２記載
のコンジュゲート。 - 【請求項６】酵素およびジアミンまたはヘテロ二官能性
試薬の割合が各々、1:1−10モル当量、好ましくは、1:4
−６モル当量である請求項２記載のコンジュゲート。 - 【請求項７】酵素共重合体が酵素の分子ｎ個（ここで、
ｎは、３〜100の整数、好ましくは、５〜50の整数であ
る）を含む請求項１記載のコンジュゲート。 - 【請求項８】共重合した酵素がホースラディッシュペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである請求
項１〜７記載のコンジュゲート。 - 【請求項９】酵素共重合体が、ホモ−またはヘテロ二官
能性試薬を介して、免疫学的活性を有する少なくとも１
つの物質に結合される請求項１記載のコンジュゲート。 - 【請求項１０】酵素共重合体および免疫学的活性を有す
る物質の個々のモル比が10:1〜1:10（酵素ユニット％免
疫学的活性を有する物質のユニット）、好ましくは、3:
1〜1:3、さらに好ましくは、1:1である請求項１および
９記載のコンジュゲート。 - 【請求項１１】免疫学的活性を有する物質がHIV1ペプチ
ド、HIV2ペプチド、HCVペプチドまたは抗−HIV1モノク
ローナル抗体または抗HBsAg抗体である請求項１、９お
よび10記載のコンジュゲート。 - 【請求項１２】a.グリコシル化された標識用酵素の分子
をその酸化された炭水化物を介して共重合させ、 b.次いで、該酵素共重合体を、免疫学的活性を有する少
なくとも１つの物質とカップリングさせること を特徴とする請求項１記載のコンジュゲートの製造方
法。 - 【請求項１３】共重合させるために、酵素の分子をジア
ミンと反応させる請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】共重合させるために、第１工程で、酵素
の分子を２種類のヘテロ二官能性試薬と別々に反応さ
せ、次いで、第２工程で、該反応生成物をお互いに反応
させる請求項12記載の方法。 - 【請求項１５】共重合後、ホウ水素化ナトリウムおよび
シアノホウ水素化ナトリウムから選択される還元剤を用
いて還元させる請求項12および13記載の方法。 - 【請求項１６】共重合後、ヘテロ二官能性試薬をブロッ
クする薬剤を用いて反応させる請求項12〜14記載の方
法。 - 【請求項１７】酵素共重合体と免疫学的活性を有する物
質とをカップリングさせる工程で、ホモ−またはヘテロ
二官能性試薬の濃度が、酵素共重合体の濃度に対して過
剰である請求項12記載の方法。 - 【請求項１８】免疫学的測定のための請求項１記載のコ
ンジュゲートの使用。 - 【請求項１９】請求項１記載の免疫酵素的コンジュゲー
トを含むことを特徴とする免疫学的測定用診断キット。
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|---|---|---|---|
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| FR95/00735 | 1995-01-23 | ||
| FR95/05939 | 1995-05-18 | ||
| FR9505939A FR2734365B1 (fr) | 1995-05-18 | 1995-05-18 | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| PCT/FR1996/000113 WO1996023226A1 (fr) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
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|---|---|
| JPH09511067A JPH09511067A (ja) | 1997-11-04 |
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| DE (1) | DE69610948T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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