JPH09511067A - 免疫酵素的コンジュゲート、その製造方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グリコシル化された標識用酵素共重合体および免疫学的活性を有する物質からなる免疫酵素的コンジュゲート。かかるコンジュゲートの製造方法、および診断キットにおける該コンジュゲートの使用も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫酵素的コンジュゲート、その製造方法およびその使用 本発明は、免疫学的活性を有する物質および共重合体形態のグリコシル化した 標識用酵素からなる免疫酵素的コンジュゲートに関する。本発明は、また、本発 明のコンジュゲートの製造方法および該コンジュゲートの診断のための使用に関 する。 種々のコンジュゲートおよび免疫酵素的コンジュゲートの製造方法は、従来技 術により知られている。これらの免疫酵素的コンジュゲートは、一般に、免疫学 的活性を有する物質およびグリコシル化されていてもよい標識用酵素からなる。 これらのコンジュゲートの製造方法は、さまざまであり、特に、過ヨウ素酸塩カ ップリング技術を用いる方法などがあり、これらの技術は、ホモ−またはヘテロ −二官能性薬剤を用いるより高性能な方法を引き起こした。これらの方法の目的 は、診断結果の特異性および／または感度を増大させることができるコンジュゲ ートを得るために、酵素の、免疫学的活性を有する物質へのカップリングを改良 することである。 ナカネ（Ｎakane）のカップリング方法［ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミ ストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｔhe Ｊournal of Ｈistochemistry a nd Ｃytochemistry）、第２２巻、第１２号、第１０８４−１０９１頁、１９７ ４］は、酵素の炭水化物の過ヨウ素酸塩による酸化後の、遊離アミン基を介する タンパクの直接カップリングを示す。特許ＥＰ ２０９,１５５には、免疫学的試 薬を酵素のタンパク部分にカップリングさせることができる方法が開示されてい る。この方法によると、該酵素は、免疫学的試薬とのカップリングの前または後 に、過ヨウ素酸を用いて酸化される。次いで、これにより得られた酸化生成物は 、ホウ水素化ナトリウムで還元される。カップリングに関しては、これは、グル タルアルデヒド、またはスクシンイミド誘導体などの慣用の試薬を用いて行われ る。この方法は、共重合工程を全く用いない。この方法により得られるコンジュ ゲー トは、いわゆる「問題の」血清から生じる擬似陽性の結果を除去することができ る。 同様に、特許出願ＥＰ ６０１,３１８には、酵素の炭水化物の酸化部分と事前 に反応させたジアミン、次いで、ヘテロ二官能性試薬（スクシンイミド誘導体） を介して免疫学的試薬を酵素にカップリングさせるための方法が開示されている 。酵素−免疫学的試薬リンクが酵素の炭水化物部分上で生じる非共重合コンジュ ゲートが得られる。実質的に、このカップリング方法によると、タンパクに由来 する炭水化物基を用いて、該タンパクを抗体に直接移植することができる。 さらに最近、特許出願ＥＰ ５６０,９１２および特許ＵＳ５,１９１,０６６に は、抗体の免疫学的認識部位を保存することができる、タンパクの炭水化物部分 を用いる免疫コンジュゲート（抗体−アルカリホスファターゼ）の生成方法が開 示されている。 免疫酵素的コンジュゲートを共重合体の形態で得ることができるいくつかの方 法も知られている。 特許ＵＳ ４,６９３，９６９には、サンドイッチ型イムノアッセイ用試薬およ びその製造方法が開示されている。重合形態の免疫酵素的コンジュゲートを含有 するイムノアッセイ用試薬は、ホルモンなどの生物試料中に低濃度で存在する物 質のアッセイの感度を増大させることができる。この試薬は、第１段階で、カッ プリング剤（ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル） を用いてモノマー形態の抗体−酵素免疫コンジュゲートを合成することによって 得られる。第２段階では、該モノマーは、グルタルアルデヒドまたはカルボジイ ミドとの重合反応に付される。 出願ＥＰ ４３０,５１０には、カップリング剤を用いてお互いに結合した「検 出可能な」ユニットに基づくポリマーが開示されている。これらの「検出可能な 」ユニットは、抗原活性を有するか、または、蛍光体系、化学発光体系、発色体 系、または酵素系の一部を形成する。「検出可能な」ユニットは、１,４−ジ(ア ミノアルキル)ピペラジン誘導体である親水性カップリング剤を用いてお互いに 結合される。これらのポリマーを得るために、「検出可能な」ユニットは、２個 のカ ルボキシル基またはカルボキシル基およびアミノもしくはチオシアン酸エステル 基を含有するように化学的に修飾される。１,４−ジ（アミノアルキル）ピペラ ジン誘導体との重合は、ペプチドのアミノ酸からの製造の化学、または、重合体 合成の化学のいずれかにおいて用いられる慣用方法（ペプチドまたはジアルデヒ ドの縮合のための試薬の使用）を用いて行われる。 出願ＥＰ １７５,５６０には、重合された酵素および抗体からなるコンジュゲ ートを得るための方法が開示されている。この方法によると、第１段階では、遊 離チオールまたはアミン基を介して酵素の少なくとも２個の分子の共有結合によ って、前重合した酵素が得られる。次いで、この前重合した酵素は、共有結合に よって抗体または抗体フラグメントにカップリングされる。 現今では、いくつかの病状について、非常に初期の段階で抗原または特異性抗 体の存在を検出することが必要である。さらにまた、いくつかの抗原は、しばし ば、検出から遮蔽され、ほんの取るに足らない量の、抗原に対して特異的な抗体 が、感染に罹患している患者の血清中に出現する。 従来技術の公知のコンジュゲートは、実質的な免疫学的反応を誘発しない感染 に罹患している患者の血清中に存在する抗原または抗体の充分に感度の良い検出 を可能にしない。 本発明の意図は、本発明の免疫酵素的コンジュゲートの使用によって感度不足 というこの問題点の解決法を提供することである。 本発明の課題は、コンジュゲートが共重合体形態のグリコシル化された標識用 酵素および免疫学的活性を有する物質からなる免疫酵素的コンジュゲート、なら びにイムノアッセイにおけるこれらのコンジュゲートの使用である。 本発明は、また、本発明の共重合した免疫酵素コンジュゲートの生成方法、な らびに、免疫学的測定のためのコンジュゲートの使用に関する。 本発明は、本発明のコンジュゲートからなる診断用キットにも関する。 酵素に関連する「炭水化物」または「グリコシル」なる用語は、以下、酵素が タンパク部分に結合した１個以上の炭水化物基を有することを意味するために用 いられるであろう。 本発明のコンジュゲートにより、従来技術のすでに知られている免疫酵素的コ ンジュゲートを用いて得られるものよりも非常に感度の良い結果を得ることがで きる。したがって、本発明は、診断の分野に、特に、ウイルス起源を有する病状 の診断のために有意な改良を与える。というのは、後者は、感染の初期に、しば しば、検出するのが困難であり、従って、診断するのが困難であるからである。 本発明は、特に、 酵素共重合体を形成するように、標識用酵素の予め酸化された炭水化物基を介 してお互いに共重合した標識用酵素の分子、および 共重合した標識用酵素の分子に酵素共重合体の遊離アミン基を介してコンジュ ゲートした、免疫学的活性を有する少なくとも１つの物質 からなる免疫酵素的コンジュゲートに関する。 本発明のコンジュゲートは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ） 、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダ ーゼおよびフルクトースオキシダーゼなどの炭水化物部分を有する標識用酵素か らなる。したがって、前記酵素からなる共重合体、選択された酵素による共重合 体からなるコンジュゲートは、本発明の方法によって得られる。 本発明によると、酵素共重合体は、お互いに結合された、標識用酵素およびジ アミンから、または、標識用酵素および異なるヘテロ二官能性試薬から得られる 。 好都合な変形によると、本発明は、酵素共重合体が、脂肪族ジアミン（直鎖状 または分枝鎖状または環状の鎖を有する）または芳香族ジアミン（ここで、該ア ミンは、炭素原子２〜１２個からなる）から選択されるジアミンから得られるコ ンジュゲートに関する。好ましくは、１,４−フェニレンジアミンが用いられる 。 別の好都合な変形によると、本発明は、酵素共重合体が、２−メルカプトエチ ルアミンまたは３−(２−ピリジルジチオ)−プロピオンヒドラジド、および４− (マレイミドメチル)−１−シクロヘキサン−カルボヒドラジドまたは４−(４− マレイミドフェニル)ブチロヒドラジドから各々選択される、お互いに結合され た２種類のヘテロ二官能性試薬を含有するコンジュゲートに関する。 特に、本発明は、酵素共重合体が、１：１−１０モル当量、好ましくは、１： ４−６モル当量の割合の酵素およびジアミンまたはヘテロ二官能性試薬からなる コンジュゲートに関する。 好ましくは、本発明は、酵素共重合体が酵素の分子ｎ個（ここで、ｎは、３〜 １００の整数、好ましくは、５〜５０の整数である）からなるコンジュゲートに 関する。 好都合な変形によると、本発明は、共重合した酵素がホースラディッシュペル オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼであるコンジュゲートに関する。 本発明の免疫酵素的コンジュゲートは、酵素共重合体が、酵素共重合体のアミ ン官能基と反応するホモ−またはヘテロ二官能性試薬を介して免疫学的活性を有 する少なくとも１つの物質にカップリングされるコンジュゲートである。 特に、本発明は、酵素共重合体および免疫学的活性を有する物質のモル比が１ ０：１〜１：１０（酵素ユニット／免疫学的活性を有する物質のユニット）、好 ましくは、３：１〜１：３、さらに好ましくは、１：１であるコンジュゲートに 関する。 酵素共重合体にカップリングした免疫学的活性を有する物質は、天然もしくは 組換えタンパク、モノ−もしくはポリクローナル抗体、組換え体もしくはそうで ないもの、またはＨＩＶ（１または２）、ＨＣＶおよびＨＢＶなどのウイルスか ら誘導されたペプチドようなペプチド、組換え体もしくはそうではないものであ ってもよい。 好ましい変形によると、本発明は、免疫学的活性を有する物質がＨＩＶ１ペプ チド、ＨＩＶ２ペプチド、ＨＣＶペプチド、組換えＨＣＶタンパク、抗−ＨＩＶ １抗体または抗−ＨＢsＡg抗体であるコンジュゲートに関する。 酵素共重合体の、免疫学的活性を有する物質とのカップリング工程において用 いられるホモ−またはヘテロ二官能性カップリング剤は、例えば、スベリン酸ビ ス(スルホスクシンイミジル)(ＢＳ³)、４−(マレイミドメチル)−１−シクロヘ キサンカルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）または３−(２ −ピリジルジチオ)プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）であっても よい。 本発明の課題は、 ａ．標識用酵素の分子が、予め酸化された炭水化物を介して共重合され、 ｂ．次いで、酵素共重合体と免疫学的活性を有する少なくとも１つの物質とを カップリングさせる ことを特徴とする本発明によるコンジュゲートの製造方法でもある。 酵素炭水化物の酸化について、アルデヒド基を得ることができる試薬が用いら れる。例えば、過ヨウ素酸塩による酸化、または、アルデヒド基を得ることがで きる他の等価の酸化が用いられる。 第１の具体例では、本発明のコンジュゲートの製造方法の共重合工程では、酵 素の分子がジアミンと反応させられる。 第２の具体例では、本発明のコンジュゲートの製造方法の共重合工程では、第 １工程で、酵素の分子を２種類のヘテロ二官能性試薬と別々に反応させ、次いで 、第２工程で、該反応生成物をお互いに反応させる。 好都合な変形によると、本発明は、ジアミンを用いる場合、標識用酵素の分子 の共重合後、共重合を停止させる効果を有するホウ水素化ナトリウムまたはシア ノホウ水素化ナトリウムなどの還元剤を用いて還元されることを特徴とする、共 重合した免疫酵素的コンジュゲートの製造方法に関する。 別の好都合な変形によると、本発明は、異なるヘテロ二官能性試薬を用いる場 合、標識用酵素の分子の共重合後、ヘテロ二官能性試薬の未反応遊離基をブロッ クする薬剤を用いて還元されることを特徴とする、共重合した免疫酵素的コンジ ュゲートの製造方法に関する。場合によっては、用いた試薬の両方の遊離基をブ ロックする薬剤の両方を用いるか、または、用いた試薬の遊離基をブロックする ２つの薬剤のうちの一方を用いることが可能である。 好ましくは、本発明は、酵素共重合体と免疫学的活性を有する物質とのカップ リング工程で、ホモ−またはヘテロ二官能性カップリング試薬の濃度が酵素共重 合体の濃度に対して過剰である、共重合した免疫酵素的コンジュゲートの製造方 法に関する。 本発明の製造方法を１つの工程で行う共重合について以下に詳述する。 コンジュゲートを製造するために選択した酵素を、共重合反応前に、pＨ４〜 ８で、過ヨウ素酸塩などの炭水化物基を酸化する試薬（酵素のモル当たり数１０ ０mol）で処理する。次いで、酸化した酵素の溶液の透析によって、過剰の過ヨ ウ素酸塩を除去する。 次いで、pＨが７〜９.５である媒質中、炭素原子１〜１２個からなる脂肪族（ 直鎖状、分枝鎖状もしくは環状）または芳香族ジアミン、好ましくは、１,４− フェニレンジアミンを１：１−１０モル当量（酵素ユニット／ジアミンユニット ）、好ましくは、１：４−６モル当量の濃度で添加する。 ゲル濾過クロマトグラフィー分析法によって該共重合反応をモニターして、酵 素モチーフｎ個（ここで、ｎは、３〜１００の整数であり、好ましくは、５〜５ ０の整数である）からなる酵素共重合体を得る。 次いで、ホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムなどの共重 合反応の間に反応しなかった酸化された炭水化物を還元するための薬剤を過剰に 添加することによって、共重合反応を停止させる。 次いで、ゲル濾過によって、これにより得られた酵素共重合体を精製する。 次いで、pＨ６.５〜８で、酵素のモル当たり５〜５０molの割合でホモ−また はヘテロ二官能性試薬を添加することによって、酵素共重合体を活性化する。次 いで、ゲル上での脱塩により、活性化酵素共重合体を精製する。 次いで、活性化酵素共重合体と免疫学的活性を有する物質とのコンジュゲーシ ョンを、約１０：１〜１：１０(酵素ユニット／免疫学的活性を有する物質のユ ニット)、好ましくは、３：１〜１：３、さらに好ましくは、１：１のモル比を 用いて行う。この反応は、中性pＨで行う。 本発明の製造方法を２つの工程で行う共重合について以下に詳述する。 コンジュゲートを製造するために選択した酵素を、共重合反応前、pＨ４〜８ で、過ヨウ素酸塩などの炭水化物基を酸化するヘテロ二官能性試薬（酵素のモル 当たり数１００mol）で処理する。次いで、酸化した酵素の溶液の分析によって 、過剰の過ヨウ素酸塩を除去する。 酸化された酵素の溶液を５〜１０mg／mlに調節し、二等分する。 次いで、第１部分に２−メルカプトエチルアミンなどのヘテロ二官能性試薬を 、pＨ７〜９.５の媒質中、１：１−１０モル当量(酵素ユニット／ジアミンユニ ット)、好ましくは、１：４−６モル当量の濃度で添加し、室温で１時間反応さ せる。 第２部分に４−（マレイミドメチル）−１−シクロヘキサンカルボヒドラジド などの試薬を前記のような濃度で添加し、室温で１時間反応させる。 好ましい変形によると、前記工程について、以下のプロトコールが行われる： pＨ５〜７で、第１部分に３−(２−ピリジルジチオ)フロピオノヒドラジド（ ＰＤＰＨ）などの試薬を約５mＭの最終濃度で添加する。該反応物を２０℃で約 １時間反応させる。 pＨ５〜７で、第２部分に４−(４−マレイミドフェニル)ブチロヒドラジド（ ＭＰＢＨ）などの試薬を約１mＭの最終濃度で添加する。該反応物を２０℃で約 １時間反応させる。 酵素溶液の各々を濾過し、ゲル濾過によって精製する。 ＰＤＰＨで活性化されたフラクションをジチオトレイトール（最終濃度１０m Ｍ）で約１０分間還元し、次いで、ゲル濾過により再度精製する。 還元後にＰＤＰＨで活性化された酵素フラクションを、ＭＰＢＨで活性化され た酵素フラクションと混合する。pＨ６〜８で約２０℃で、２つの種類を共重合 反応させる。 本発明の方法によると、正確な特徴が共重合体を形成する酵素によって選択さ れる分析用カラムを用いてゲル濾過によって、共重合をモニターする。例えば、 アルカリホスファターゼ（ＭＷ＝１４０,０００）のためには、ファルマシア・ ラムを用い、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＭＷ＝４４,０００）のた ムを用いる。 本発明の方法によると、共重合後、２−メルカプトエタノール（最終濃度１m Ｍ）およびＮ−エチルマレイミド（最終濃度２mＭ）の連続添加によって、反応 のブロッキングを行う。反応しなかったカルボニル基を還元し、カルボニル基と ヒドラジドとの反応によって生じたヒドラゾン基を安定化させるために、ホウ水 素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化ナトリウムによる還元を行ってもよい。 前記分析的モニターリングと同様の条件下、分取用カラムでのゲル濾過によっ て、共重合された酵素の溶液を精製する。ゲルから排除された種に相当するフラ クションを回収する。これは、共重合した酵素の溶液を構成する。ＢＣＡアッセ イ［ピアス(Ｐierce)］によってタンパク濃度を測定する。 次いで、pＨ６.５〜８で、酵素のモル当たり５〜５０molの割合でホモ−また はヘテロ二官能性試薬を添加することによって、酵素共重合を行う。次いで、ゲ ル上での脱塩によって、活性化された酵素共重合体を精製する。 次いで、活性化された酵素共重合体と免疫学的活性を有する物質とのコジュゲ ーションを、約１０：１〜１：１０(酵素ユニット／免疫学的活性を有する物質 のユニット)、好ましくは、３：１〜１：３、さらに好ましくは、１：１のモル 比を用いて行う。この反応は、中性pＨで行う。 得ようとするコンジュゲートの選択に依存して、共重合反応前に、酵素の遊離 アミン基をブロックしたり、しなかったりする。 酵素分子の遊離アミン基をブロックしない限り、共重合反応の間、例えば、１ ，４−フェニレンジアミンなどの芳香族ジアミンまたはヘテロ二官能性試薬を用 いることが好ましいであろう。 酵素分子の遊離アミン基を共重合反応前にアミノ基についての保護剤でブロッ クする限り、炭素原子２〜１２個からなる脂肪族ジアミン（直鎖状、分枝鎖状ま たは環状）もしくは芳香族アミンまたはヘテロ二官能性試薬を用いて共重合反応 を行ってもよい。 次いで、共重合反応させてもよく、ホモ−またはヘテロ二官能性試薬を介して 免疫学的活性を有する物質と酵素共重合体とをカップリングさせることが望まし い点に依存して、アミン機能を保護する基を除去したり、しなかったりする。 酵素共重合体と免疫学的活性を有する物質とのカップリングは、酵素共重合体 のタンパク部分、または、ジアミン、または、一端を介して酸化された糖部分と 予め反応されており、他端を介してもしくは一度に両端では反応しなかったヘテ ロ二官能性試薬で生じることができる。 一工程共重合からなる本発明のコンジュゲートの製造方法が免疫酵素的試験に おける感度の相当な増加を示すコンジュゲートを得ることに加えて製造の好都合 な変形を可能にすることは、前記説明から明らかである。 二工程共重合からなる本発明のコンジュゲートの製造方法の利点が免疫学的活 性を有する物質についてのカップリング部位の選択範囲が大きいことであること も、前記説明から明らかである。 したがって、選択された酵素の共重合体および感染に対して特異的な免疫学的 活性を有する物質からなる好適な免疫コンジュゲートは、診断が望まれる感染に 従って、本発明のコンジュゲートの製造方法の選択によって得られる。本発明の コンジュゲートの製造方法の可能な組合せ（１種類以上の共重合された酵素の共 重合工程または用いられる免疫学的活性を有する１つ以上の物質のカップリング 工程のいずれに関しても）は、さまざまであり、賢明な選択によって、特異的か つ非常に感度の良い検出結果を達成するコンジュゲートを得ることができるよう になる。 以下の実施例の記載において、限定されない場合、クロマトグラフィー系のカ ×３０およびＸＫ １６×７０カラム、ファルマシア(ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ)］は 、洗浄され、予め除気されたＰＢＳ緩衝液（５０mＭ／pＨ＝７.４）を用いて平 衡化される。 実施例１：ペルオキシターゼ−ＨＩＶ１ペプチドコンジュゲート ａ − ペルオキシターゼの一工程共重合： 共重合を行うために、以下の緩衝液（Ｂfr）を調製する： − ＰＢＳ Ｂfr（５０mＭリン酸ナトリウム、 ０.１５Ｍ ＮaＣl／pＨ７.４） ２.０リットル − ＨＥＰＥＳ Ｂfr（０.３６Ｍ／pＨ＝５.４） ０.１リットル − 酢酸ナトリウムＢfr（０.０１Ｍ／pＨ＝５.４） 酸化されたペルオキ シダーゼの容量の少 なくとも１０００倍 − 炭酸ナトリウムＢfr（１Ｍ／pＨ＝９.０） ペルオキシダーゼの 容量の１５％ 濃度および使用量の算出のために、２８０および４０３nmで光学密度（ＯＤ） 測定を行う；質量消衰係数（mass extinction coefficient）は、 ^ε２８０＝０.７ml.mg^-1.cm^{-1 ε}４０３＝１.９３ml.mg^-1.cm^-1 である。 ペルオキシターゼの分子量は、４４,０００ Ｄaである。 ＨＥＰＥＳ緩衝液中４５mg／mlの理論的な濃度でペルオキシダーゼ(１００mg) を調製し、次いで、λ２８０および４０３nmでＯＤを測定することによってチェ ックする。濃度は、３５mg／mlから１５％以内までである。次いで、過ヨウ素酸 塩（ＨＥＰＥＳ緩衝液中１００mg／mlの濃度で、ペルオキシターゼの量の１.５ 倍）を添加することによって酸化する。この酸化は、約２０℃で４５分±１０分 間続き、一定に撹拌しつつ行われる。 次いで、分析を行う。該分析は、酸化されたペルオキシダーゼの量よりも非常 に過剰である酢酸ナトリウム緩衝液の３つの容量に相当する３つの工程において ４℃で行われる。全分析時間は、約２４時間である。 炭酸ナトリウム緩衝液を添加することによって得られたアルカリ性媒質中、炭 酸ナトリウム緩衝液中２mg／mlの濃度の４モル当量の１,４−フェニレンジアミ ンの存在下で共重合が生じる。この工程は、撹拌しつつ２０℃で約１２時間生じ る。 重合されたペルオキシダーゼ２５μlを注入することによって、共重合をモニタ ーする。該プロフィールは、ゲルから排除された分子種に相当する優位なピーク からなる。別の２または３つピークが存在してもよく、これらは、共重合の種々 の状態に相当する。次いで、該反応をブロックする。 共重合の間に反応しなかったペルオキシダーゼ分子の酸化された基を還元する ことによって、共重合の停止を行う。該停止は、水溶液中５mg／mlの濃度でホウ 水素化ナトリウム（ペルオキシダーゼの５容量％）を添加することによって行わ れる。該混合物を３０秒間撹拌し続け、次いで、撹拌せずに室温で１５〜２０分 間放置する。 同一条件下、同一の工程の２回目を繰り返す。 共重合体を精製する。ペルオキシダーゼの最大注入量は、２００mgであり、最大 容量は、１０mlである。該カラムは、ＰＢＳ緩衝液中で平衡化されるべきである 。精製のための流速は、１２０ml／時である。 ゲルによって排除されたかまたは最小に保持された分子種に相当するフラクシ ョンを回収する。 ペルオキシダーゼ共重合体についての質量消衰係数（ε）は、λ４０３nmで１ .３ml.mg^-1.cm^-1である。 ｂ − カップリング： 以下の緩衝液を調製する： − ＰＢＳ Ｂfr（５０mＭリン酸ナトリウム、 ０.１５Ｍ ＮaＣl／pＨ＝７.４） ２リットル − ＭＢＵ Ｂfr： − ５mＭ 2-モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ） ５mＭ − ５mＭ ホウ酸 − ２Ｍ 尿素 pＨ＝７.０ ２リットル 用いたペプチドは、ＨＩＶ１単離ＢＲＵのgp ４１タンパクのフラグメント（ ５８４−６０９）である。このペプチドは、公開番号がＥＰ ２２０,２７３であ るジェネティック・システムズ・コーポレイション（Ｇenetic Ｓystems Ｃorpo ration）欧州特許に開示されているペプチド３９に相当する。 活性化されるべき共重合体の量は、結合されるべきペプチドの量に依存する： ＨＩＶ１ペプチド１mgについてペルオキシダーゼ１０〜２０mg。 一定に撹拌しつつ、２０℃で４５分間、ＰＢＳ緩衝液中３０mg／mlの濃度で３ ５モル当量のＢＳ³でペルオキシダーゼ共重合体を活性化する。 れた酵素共重合体の脱塩を行う。その機能は、未反応ＢＳ³から活性化されたペ ルオキシダーゼ共重合体を分離することである。 この脱塩により、ペルオキシダーゼ共重合体をエマージェンスについて回収し 、６mg／mlの濃度に調節した。 活性化されたペルオキシダーゼ共重合体およびＨＩＶ１ペプチドのコンジュゲ ーションについて、モル比（ペプチド／ペルオキシダーゼ）は、１：１である。 該ペプチドは、溶液中、５mg／mlの濃度である。活性化されたペルオキシダーゼ 共重合体およびペプチドの正確な量を混合し、２０℃で２時間、絶えず撹拌し続 けた。 コンジュゲーションの２時間後、ＰＢＳ緩衝液中で平衡化されたスーパーロー ＨＩＶ１ペプチド混合物をカラムに流速１２０mg／時で注入した。 コンジュゲートに相当するフラクションを回収し、該濃度を、λ４０３nmでＯ Ｄを測定する（ε＝１.３ml.mg^-1.cm^-1）ことによって測定する。 実施例２：アルカリホスファターゼ−ＨＩＶ１ペプチドコンジュゲート ａ − アルカリホスファターゼの一工程共重合 ペルオキシダーゼの代わりに精製したアルカリホスファターゼを用いる以外は 、実施例１に記載されていると同一の製造プロトコールを行う。アルカリホスフ ァターゼの分子量は、１４０,０００ Ｄaである。実施例２のコンジュゲートを 製造するために、３Ｍ ＮaＣl、５mＭ ＭgＣl₂および０.２mＭ ＺnＣl₂を含有す るトリエタノールアミン緩衝液（pＨ＝７.６）中１２mg／mlの濃度の酵素の溶液 からアルカリホスファターゼの共重合を行う。 アルカリホスファターゼのモル当量当たり４００モル当量の過ヨウ素酸ナトリ ウムを用いて酸化を行う。 スーパーローズ（Ｓuperose）６ ＰＧ ゲル［ファルマシア(Ｐharmacia)］上 で、共重合のモニターリングを行う。 アルカリホスファターゼ共重合体についての質量消衰係数（ε）は、非重合化 ホスファターゼについての１.０ml.mg^-1.cm^-1の代わりに、λ２８０nmで１.４ml .mg^-1.cm^-1である。 ｂ − カップリング： 酵素共重合体を変えて、実施例１に記載の方法に従って、ペプチドと重合され たアルカリホスファターゼとのカップリングを行う。酵素ユニットのモル当たり ペプチド３molを用いて行ったカップリング反応後、ＭgＣl₂（１mＭ）およびＺn Ｃl₂（０.１mＭ）を含有する１０mＭトリス緩衝液（pＨ８）中で平衡化され ゲルから排除され、コンジュゲートに相当するフラクションを回収する。２８０ nmで光学密度を測定する（ε＝１.４ml.mg^-1.cm^-1）ことによって、濃度を測定 する。 調製したコンジュゲート（コンジュゲートＢ）の使用および非重合化酵素を含 有する従来技術によるコンジュゲート（コンジュゲートＡ）との比較 従来技術に従って調製したコンジュゲートＡについては、用いる酵素は、重合 されていない。ペプチドを酵素にカップリングさせる方法は、この実施例に記載 のカップリング方法と同一である。 ル（Ｓanofi Ｄiagnostics Ｐasteur)］において行ったイムノアッセイの原理 ＨＩＶ１ウイルスに対して行われた抗体の検出は、サンドイッチ型化学発光性免 疫酵素的技術の原理に基づいている。該試験は、ＨＩＶ１エンベロープ糖タンパ クを含む精製した抗原で被覆した固相の使用に基づいている。 固相は、希釈剤０.１ml中５０μgの割合で常磁性マイクロビーズ［エスタポア 酵素について用いられる基質は、ＡＭＰＰＰＤ型のジオキセタン[トロピック ス（Ｔropix)]または等価物である。 研究した血清は、 − 抗ＨＩＶ１抗体について陽性の試料１３個(ＢＢＩ、ＮＡＢＩ、セロロジ カルズ(Ｓerologicals)、アメリカ合衆国から入手された、希釈されたかまたは そうではない、セロコンバージョン（seroconversion）試料)、 − 抗ＨＩＶ１抗体について陰性の試料４４個 からなっている。 この実施例に記載されるコンジュゲートを使用するために以下の工程を行う： Ａと記した一連のチューブおよびＢと記した一連のチューブを調製する。 チューブ当たり以下のものを分配する： − 感作マイクロビーズの懸濁液０.１ml − 研究下の血清０.１ml。 ３７℃で２０分間のインキュベーション、および洗浄（３回）後、コンジュゲ ート０.２６mlを添加する： − チューブＡ：コンジュゲートＡ − チューブＢ：コンジュゲートＢ。 全てのチューブを３７℃で２０分間インキュベートし、洗浄し（３回）、次い で、各チューブに基質０.２mlを添加し、該混合物を３７℃で５分間インキュベ 々において、ＡＬＵ(任意光単位(arbitrary light units))で表される発光を測 定する。 結果： １ − 閾値の確立： 値として用いる。 をチューブＢの閾値として用いる。 ２ − 結果の解釈 試料は、発光の値がそれに相当する閾値よりも大きい場合に陽性と宣言される 。 試料は、発光の値がそれに相当する閾値よりも小さい場合に陰性と宣言される 。 下記第１表は、得られた値を示す。 本発明のコンジュゲート（Ｂ）により、コンジュゲートＡについてのＡＬＵ反 応と比較して非常に有意に増加したＡＬＵ反応を得ることができることは、得ら れた結果から非常に明確に明らかになる。さらに、従来技術のコンジュゲート（ Ａ）を用いて陰性であることが判明した６つの血清（Ｎｏ．５１４；Ｑ４−１／ ４０；Ｑ６−１／１００；Ｑ６−１／２００；２４１Ｄ １／１００；Ｋ５ １／ １０）は、本発明のコンジュゲート（Ｂ）を用いると陽性になる。 したがって、これらのアッセイは、本発明により、改良された感度を得ること ができることを明確に示す。 実施例３：ペルオキシダーゼ−ＨＩＶ１モノクローナル抗体コンジュゲート ＨＩＶ１ペプチドの代わりに、抗−ＨＩＶ１モノクローナル抗体、クローンＨ ＩＶ−ｐ２５−６（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ９４０９で寄託されている）を用いる 以外は、実施例１に記載したと同一の製造プロトコールを行う。 製造されたＨＩＶコンジュゲート（コンジュゲートＢ）の使用および従来技術 によって製造されたコンジュゲート（コンジュゲートＡ）との比較 試薬： − コンジュゲートＢ：この実施例で製造方法を前記した共重合された免疫酵 素的コンジュゲート。 − コンジュゲートＡ：ナカネ（Ｎakane）ら［ジャーナル・オブ・ヒストケ ミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ.Ｈistochem.Ｃytochem.）１９７ ４、２２、第１０８４−１０９１頁］の技術に従って製造した抗体ＨＩＶ−ｐ− ２５−６−ペルオキシダーゼコンジュゲート。 − 固相：モノクローナル抗体ＨＩＶ−ｐ−２５−２およびＨＩＶ−ｐ−２５ −３で感作されたマイクロプレート。 − 酵素基質：ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン） 試料： − 陰性血清１０個。 − ＨＩＶウイルス（Ｖ１〜Ｖ４）または組換えタンパク（ＲＰ１よびＲＰ２ ）の希釈物からなる陽性対照試料６個。 − 血清ブランク１個：血清を含まないが、代わりに希釈物０.２mlを含有す るウエル。 アッセイプロトコール： 当該技術の実行は、以下の工程に基づく： 研究下の各血清（3/4に希釈した試料０.２ml）をマイクロプレートのウエルに 分配する。４０℃で３０分間のインキュベートし、次いで、洗浄した後、ペルオ キシダーゼ標識コンジュゲート（０.２ml）を添加する。４０℃で３０分間、さ らにインキュベートし、さらに洗浄した後、室温で３０分間、基質（ＴＭＢ）の 存在下でインキュベートすることによって、複合体上に固定化された酵素の存在 を視覚化する。該反応をＨ₂ＳＯ₄で停止させた後、λ４５０／６２０nmで分光光 度計で測定する。 結果： 第２表は、２つのコンジュゲートＡおよびＢを用いて得られた比較結果を示す 。 第２表は、陰性血清について同一の平均にもかかわらず、陽性対照の光学密度 が有意に増加しているので、感度の増加がコンジュゲートＢの使用によって得ら れたことを示す。 実施例４：アルカリホスファターゼ−ＨＩＶ１ペプチドコンジュゲート ａ − アルカリホスファターゼの二工程共重合 溶液中のアルカリホスファターゼ（３Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＭgＣl₂および０.１m Ｍ ＺnＣl₂を含有する３０mＭトリエタノールアミン緩衝液（pＨ７.６）中１０ 〜２０mg／ml）を過ヨウ素酸ナトリウム（酵素のモル当たり３００mol）で、２ ０℃で４５分間酸化する。 次いで、１mＭ ＭgＣl₂を含有する１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pＨ５.５） に対して、酸化された酵素の溶液を透析することによって、過剰の過ヨウ素酸塩 を除去する。 透析後、酸化された酵素の溶液を二等分する。 第１部分に３−（２−ピリジルジチオ）プロピオノヒドラジド（ＰＤＰＨ）を 最終濃度４mＭで添加し、アルカリホスファターゼ濃度を１０mg／mlに調節する 。該反応を２０℃で撹拌しつつ１時間続ける。 第２部分に４−（４−マレイミドフェニル）ブチロヒドラジド（ＭＰＢＨ）を 最終濃度１mＭで添加し、アルカリホスファターゼ濃度を５mg／mlに調節する。 該反応を２０℃で撹拌しつつ１時間続ける。 酵素溶液の各々を濾過し、１５０mＭ塩化ナトリウムを含有する５０mＭリン酸 ナトリウム緩衝液（pＨ７.４）中、ゲル濾過によって精製する。 ＰＤＰＨで活性化されたフラクションを、ジチオトレイトール（最終濃度１０ mＭ）で１０分間還元し、次いで、ゲル濾過によって再度精製する。 還元後、ＰＤＰＨで活性化された酵素フラクションを、ＭＰＢＨで活性化され た酵素フラクションと混合する。２つの種の共重合反応は、得られるのが望まれ る共重合体のサイズに依存して、２〜１５時間撹拌しつつ、２０℃で行う。 (Ｐharmacia)］を充填した分析用カラムでのゲル濾過によって、共重合のモニタ ーリングを行う。 ２−メルカプトエタノール（最終濃度１mＭ）およびＮ−エチルマレイミド（ 最終濃度２mＭ）の連続添加によって反応のブロッキングを行う。反応しなかっ たカルボニル基を還元し、カルボニル基とヒドラジドとの反応によって生じたヒ ドラゾン基を安定化するために、ホウ水素化ナトリウムまたはシアノホウ水素化 ナトリウムによる還元を行ってもよい。 前記の分析用モニターリングの条件と同様の条件下、分取用カラムでのゲル濾 過によって、重合された酵素の溶液を精製する。ゲルから排除された種に相当す るフラクションを回収する。このフラクションは、重合された酵素の溶液を構成 する。該タンパク濃度をＢＣＡアッセイ［ピアス(Ｐierce)］によって測定する 。 ｂ − カップリング： 実施例２の記載と同様のプロトコールを行う。 実施例５：ペルオキシダーゼー抗ＨＢsＡＧ抗体コンジュゲート このコンジュゲートを製造するために、実施例１（ａ − ペルオキシダーゼの 一工程共重合）に記載のペルオキシダーゼ共重合体を用いる。 カップリング： ペルオキシダーゼ共重合体（５mg）を、水に３０mg／mlの濃度で溶解させた３ ５モル当量の４−（マレイミドメチル）−１−シクロヘキサンカルボン酸スルホ スクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）で活性化する。２０℃で３０分間、撹拌 しつつ該反応を行う。 した酵素共重合体の脱塩を行う。その機能は、活性化ペルオキシダーゼ共重合体 を未反応スルホ−ＳＭＣＣから分離することである。 ペルオキシダーゼの活性化と同時に、以下の方法で、モノクローナル抗体（ク ローン１０−１４４）のチオール化を行う。 − 濃度１０mg／mlで無水エタノールに溶解させた８モル当量の３−(２−ピ リジルジチオ)プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ−ファルマシア(Ｐ harmacia)）で濃度１５mg／mlの抗体０.４mlを活性化する。該反応を撹拌しつつ ２０℃で４５分間続ける。ＰＢＳ緩衝液中で平衡化させたＰＤ−１０型カラム（ ファルマシア(Ｐharmacia)）で、活性化した抗体の脱塩を行う。その機能は、活 性化された抗体を未反応ＳＰＤＰから分離することである。回収した抗体 ０mＭの最終濃度を達成する。該ＤＴＴを５〜１０分間反応させた後、前記と同 様の方法でチオール化した抗体の脱塩を行う。 ペルオキシダーゼおよび抗体のカップリングのために、前記で得た２つの溶液 （チオール化した抗体３mgおよび活性化ペルオキシダーゼ共重合体３mg、抗体の 分子当たり３.４酵素ユニットと等価）を撹拌しつつ２０℃で２時間混合する。 β−メルカプトエタノール（最終濃度１mM）、次いで、Ｎ−エチルマレイミド （最終濃度２mM）を１５分間隔てて連続的に添加することによって該反応をブロ ックする。 １５分後、ＰＢＳ中で平衡化したスーパーローズ（Ｓuperose）１２ ＰＧゲル のカラムで該反応混合物を精製し、次いで、ＰＢＳで溶離する。コンジュゲート に相当するフラクション（ゲルから排除された種）を回収し、タンパク・アッセ イ［ＢＣＡキット、ピアス(Ｐierce)］によって濃度を測定する。 製造したコンジュゲート（コンジュゲートＢ：抗体１０−１４４−共重合化ペ ルオキシダーゼ）の使用およびＨＢｓ抗原の検出における従来技術によって製造 したコンジュゲート（コンジュゲートＡ：抗体１０−１４４−非共重合化ペルオ キシダーゼ）との比較 行ったイムノアッセイの原理： 試薬： − コンジュゲートＢ：前記で製造。 − コンジュゲートＡ：ナカネ（Ｎakane）ら［ジャーナル・オブ・ヒストケ ミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ.Histochem.Cytochem.）１９７４ 、２２、第１０８４−１０９１頁］の技術に従って製造した抗体１０−１４４− ペルオキシダーゼコンジュゲート。 − 固相：ＨＢs Ａgモノリサ（Ｍonolisa）キット［サノフィ・ディアグノス ティクス・パストゥール(Ｓanofi Diagnostics Pasteur)］で得られるようなモ ノクローナル抗体１１２ Ａ ２６で感作したマイクロプレート。 − 酵素基質：ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン） 試料： − 陰性血清１９４個。 − 陰性対照１個(マイクロプレート当たりいくつかのウエルにおいて試験し た)。 − アッセイする試料（標準）：０.１、０.２、０.５、１.０、３.０および ５.０ng／ml。 アッセイプロトコール： 当該技術の実行は、以下の工程に基づく： Ａと記した一連のマイクロプレートおよびＢと記した一連のマイクロプレート を製造する。 ウエル当たり以下のものを分配する： 希釈剤５０μ コンジュゲート５０μl − ウエルＡ：コンジュゲートＡ − ウエルＢ：コンジュゲートＢ 研究下の血清０.１ml。 ４０℃で１時間３０分間インキュベートし、次いで、洗浄した後、基質０.２m lを添加する。 全てのウエルを４０℃で３０分間インキュベー卜し、１．５Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄０.１ mlを添加し、次いで、ウエルＡおよびＢの各々においてλ４５０／６２０nmでの 光学密度（ＯＤ）を測定する。 結果： 略語ＤＬで示した検出限界（または分析的感度）： 陰性対照で得た光学密度の平均を取ることによって各マイクロプレートについ て検出限界を測定し、次いで、０.０２５光学密度ユニットを添加する。マイク ロプレートＡにおいて、検出限界は、平均０.１５６ng／mlであった。したがっ て、従来技術のコンジュゲートを用いて、０.１ng／ml標準を検出することはで きなかった。マイクロプレートＢにおいて、検出限界は、平均０.０４６ng／ml であった。したがって、本発明のコンジュゲートを用いて、０.１ng／ml標準が 完全によく検出されたことは、非常に明確である。 マイクロプレートＡおよびマイクロプレートＢの両方について、全ての陰性血 清が実際に陰性であること、すなわち、それらに相当する閾値以下であることが 判明することが明らかであろう。 種々の結果を下記第３表に示す。 第３表の結果は、本発明のコンジュゲートが、擬似陽性結果を生じずに、得ら れるべき感度を有意に増加させることができたことを示す。 実施例６：ペルオキシダーゼ−ＨＣＶペプチドコンジュゲートの酵素免疫アッ セイ Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対して行われる抗体の検出は、以下の実施例に おいて、サンドイッチ型免疫酵素的技術の原理に基づく。該試験は、ＨＣＶウイ ルス（キャプシド）の精製した抗原で感作した固相（マイクロプレート）の使用 に基づく。 試験の実行は、以下の反応工程に基づく： 研究下の各血清（3/4に希釈した試料０.１ml）をマイクロプレートのウエル中 に分配する。次いで、ペルオキシダーゼ標識コンジュゲート（０.１ml）を添加 する。４０℃で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄した後、基質（ＴＭＢ ）の存在下、３０分間インキュベートすることによって、複合体上の固定化され た酵素の存在を視覚化する。Ｈ₂ＳＯ₄で該反応を停止させた後、λ４５０／６２ ０nmで分光光度計において測定する。各試料について、測定した光学密度（ＯＤ ）を算出した閾値のものと比較することによって、抗−ＨＣＶ抗体の存在または 不 在を測定する（この場合、陰性の平均＋０.２）。 第４表は、種々の条件下で製造した２つのコンジュゲートＡおよびＢを用いて 得られた比較結果を示す（ＨＣＶウイルスキャプシドタンパクの一部を模造する ペプチドのカップリング。 製造したコンジュゲートＡおよびＢを以下に示す： − コンジュゲートＡ：ペルオキシダーゼを処理せず、二官能性試薬（ＰＢＳ ）を用いてペプチドをカップリングする。カップリング方法は、ペルオキシダー ゼを用いる実施例１に記載の方法である。 − コンジュゲートＢ：ＨＩＶペプチドの代わりにＨＣＶペプチドを用いて、 実施例１に記載の方法に従って、コンジュゲートを製造する。 第４表は、全てのＰＨＶ−９０３−セロコンバージョン試料［ボストン・バイ オメディカ・インコーポレイテッド （Ｂoston Ｂiomedica Ｉnc.）からのパネ ル］について得られた感度の増加を示す。公知の現行の試験によって検出された 最初の試料は、Ｎo.２〜Ｎo.６であるが、Ｎo.１ではない。 これらの結果は、従前の結果を確認し、本発明の評価を示す。 実施例７：ペルオキシダーゼ−ＨＩＶ１ペプチドコンジュゲートを用いる酵素 免疫アッセイ ＨＩＶウイルスに対して行われる抗体の検出は、以下の実施例において、サン ドイッチ型免疫酵素的技術の原理に基づく。該試験は、ＨＩＶ１ウイルスエンベ ロープ糖タンパクを含む精製した抗原で製造した固相の使用に基づく。 マイクロプレートのウエルに研究下の血清（3/4に希釈された試料０.１ml）を 分配する。３０分間インキュベートし、洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識コン ジュゲートを添加する。遊離したままのコンジュゲートフラクションを除去した 後、基質の存在下、インキュベートすることによって、複合体上に固定化された 酵素の存在を視覚化する。該反応を停止させた後、４５０／６２０nmで分光光度 計で測定する。各試料について、測定した光学密度を算出した閾値のものと比較 することによって、抗ＨＩＶ１抗体の存在または不在を測定する（この場合、陰 性の平均＋０.１）。 第４表は、種々の条件下で製造した５つのコンジュゲートを用いて得られた比 較結果を示す(ＨＩＶ１ウイルスエンベロープ糖タンパク／アミノ酸５８４−６ ０９単離ＢＲＵの免疫優性（immunodominant）エピトープを模造するペプチドと 、ペルオキシダーゼとのカップリング)。 製造した種々のコンジュゲートを以下に示す： − コンジュゲートＡ：ペルオキシダーゼを処理せず、二官能性試薬を用いて ペプチドをカップリングする（カップリング方法は、実施例１に記載の方法であ る）。 − コンジュゲートＢ：以下の方法で変形したナカネら［ジャーナル・オブ・ ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ.Ｈistochem.Ｃytochem. ）１９７４、２２、第１０８４−１０９１頁］の方法に従って、ペプチドをペル オキシダーゼとカップリングさせる。 ペルオキシダーゼ２８mgを過ヨウ素酸ナトリウム１９.７mgで１時間３０分酸 化する。酸化したペルオキシダーゼ４mgにペプチド１mgを３時間接触させる。こ のプロトコールは、ナカネ法によるようなカップリングを変形しない。 − コンジュゲートＣ：番号ＥＰ ６０１,３１８の下に公開された特許出願に 開示されている方法に従って、ペルオキシダーゼを調製し、該出願の方法に従っ て二官能性試薬を用いてペプチドにカップリングさせる。 − コンジュゲートＤ：二官能性共重合試薬として１,６−ヘキサンジアミン を用いて、実施例１に記載の方法に従って、コンジュゲートを製造する。 − コンジュゲートＥ：実施例１に記載の方法に従って、コンジュゲートを製 造する。 以下の表において示す結果は、前記プロトコールに従って、前記コンジュゲー トＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを用いて、酵素免疫アッセイを行って測定した光学密 度値である。 用いた血清は、ボストン・バイオメディカ・インコーポレイテッド（Ｂoston Ｂiomedica Ｉnc.）によって供給されたパネルＫ、ＵおよびＱの試料ならびにＨ ＩＶ抗体の検出について陰性の正常なドナー患者由来の血清３１個である。 表中で照合される試験の結果は、コンジュゲートＤおよびＥのみにより、１／ ６４に希釈された血清Ｋ２およびＱ６の両方の陽性反応を検出することができる ことを示す。 したがって、本発明のコンジュゲートは、良好な検出感度を従来技術の公知の コンジュゲートよりも得られることができることが明らかである。かくして、Ｈ ＩＶ１ウイルスに対して指向する抗体の検出は容易である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ガデル，ステファヌ フランス、エフ−91570ビエヴル、シュマ ン・ドゥ・ラ・パテュール（番地の表示な し) (72)発明者 ル・サジェ，カリヌ フランス、エフ−78400シャトー、リュ・ ドゥ・ラ・ボワ−プワソニエール９ア番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵素共重合体を形成するように、標識用酵素の予め酸化された炭水化物基 を介してお互いに共重合した標識用酵素の分子、および 共重合した標識用酵素の分子に酵素共重合体の遊離アミン基を介してコンジュ ゲートした、免疫学的活性を有する少なくとも１つの物質 からなることを特徴とする、グリコシル化された標識用酵素および免疫学的な活 性を有する物質の免疫酵素的コンジュゲート。 ２．酵素共重合体が、お互いに結合された、標識用酵素およびジアミンから、 または、標識用酵素および異なるヘテロ二官能性試薬から得られる請求項１記載 のコンジュゲート。 ３．ジアミンが、直鎖状もしくは分枝鎖状または環状鎖を有する脂肪族ジアミ ンまたは芳香族ジアミンである炭素原子２〜１２個からなるジアミンから選択さ れる請求項２記載のコンジュゲート。 ４．ジアミンが１,４−フェニレンジアミンである請求項２記載のコンジュゲ ート。 ５．異なるヘテロ二官能性試薬が、各々、２−メルカプトエチルアミンまたは ３−(２−ピリジルジチオ)プロピオノヒドラジド、および４−(マレイミドメチ ル)−１−シクロヘキサンカルボヒドラジドまたは４−(４−マレイミドフェニル )ブチロヒドラジドから選択される２つのヘテロ二官能性試薬である請求項２記 載のコンジュゲート。 ６．酵素およびジアミンまたはヘテロ二官能性試薬の割合が各々、１：１−１ ０モル当量、好ましくは、１：４−６モル当量である請求項２記載のコンジュゲ ート。 ７．酵素共重合体が酵素の分子ｎ個（ここで、ｎは、３〜１００の整数、好ま しくは、５〜５０の整数である）からなる請求項１記載のコンジュゲート。 ８．共重合した酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホ スファターゼである請求項１〜７記載のコンジュゲート。 ９．酵素共重合体が、ホモ−またはヘテロ二官能性試薬を介して、免疫学的活 性を有する少なくとも１つの物質に結合される請求項１記載のコンジュゲート。 １０．酵素共重合体および免疫学的活性を有する物質の個々のモル比が１０： １〜１：１０（酵素ユニット／免疫学的活性を有する物質のユニット）、好まし くは、３：１〜１：３、さらに好ましくは、１：１である請求項１および９記載 のコンジュゲート。 １１．免疫学的活性を有する物質がＨＩＶ１ペプチド、ＨＩＶ２ペプチド、Ｈ ＣＶペプチドまたは抗−ＨＩＶ１モノクローナル抗体または抗ＨＢsＡg抗体であ る請求項１、９および１０記載のコンジュゲート。 １２．ａ．予め酸化された炭水化物を介して標識用酵素の分子を共重合させ、 ｂ．次いで、該酵素共重合体を、免疫学的活性を有する少なくとも１つの物質 とカップリングさせること からなることを特徴とする請求項１記載のコンジュゲートの製造方法。 １３．共重合させるために、酵素の分子をジアミンと反応させる請求項１２記 載の方法。 １４．共重合させるために、第１工程で、酵素の分子を２種類のヘテロ二官能 性試薬と別々に反応させ、次いで、第２工程で、該反応生成物をお互いに反応さ せる請求項１２記載の方法。 １５．共重合後、ホウ水素化ナトリウムおよびシアノホウ水素化ナトリウムか ら選択される還元剤を用いて還元させる請求項１２および１３記載の方法。 １６．共重合後、ヘテロ二官能性試薬をブロックする薬剤を用いて反応させる 請求項１２〜１４記載の方法。 １７．酵素共重合体と免疫学的活性を有する物質とをカップリングさせる工程 で、ホモ−またはヘテロ二官能性試薬の濃度が、酵素共重合体の濃度に対して過 剰である請求項１２記載の方法。 １８．免疫学的測定のための請求項１記載のコンジュゲートの使用。 １９．請求項１記載の免疫酵素的コンジュゲートからなることを特徴とする免 疫学的測定用診断キット。