DE69610948T2

DE69610948T2 - Immunoenzymatisches konjugat, herstellungsverfahren dafür und verwendungen

Info

Publication number: DE69610948T2
Application number: DE69610948T
Authority: DE
Inventors: Gilles Cognet; Christophe Cucurou; Stephane Gadelle; Carine Le Sager
Original assignee: Pasteur Sanofi Diagnostics SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1996-01-23
Publication date: 2001-06-07
Anticipated expiration: 2016-01-24
Also published as: IL116863A0; AU4626096A; PT752102E; ATE197645T1; EP0752102B1; AU707172B2; DK0752102T3; EP0752102A1; WO1996023226A1; GR3035226T3; JP3499568B2; JPH09511067A; DE69610948D1; CA2184636A1; ES2153090T3; US6027874A; CA2184636C; IL116863A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunoenzymatisches Konjugat, welches aus Substanz(en) mit immunologischer Wirkung und glykosyliertem (glykosylierten) Markierungsenzym(en) in Form eines Copolymeren gebildet ist. Die Erfindung betrifft weiterhin das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats und die Verwendung des Konjugats für die Diagnostik.
Aus dem Stand der Technik sind verschiedene immunoenzymatische Konjugate und Verfahren zur Herstellung von immunoenzymatischen Konjugaten bekannt. Diese immunoenzymatischen Konjugate bestehen im allgemeinen aus einer Substanz mit immunologischer Wirkung und einem Markierungsenzym, welches glykosyliert sein kann. Die Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate sind unterschiedlich und es stehen insbesondere Verfahren zur Verfügung, wie jene, die die Methoden der Periodatkupplung ausnützen, welche zu Methoden perfektioniert worden sind, die homo- oder heterobifunktionelle Mittel einsetzen. Diese Verfahren zielen darauf ab, die Kupplung des Enzyms mit der Substanz mit immunologischer Wirkung zu verbessern, zum Erhalt von Konjugaten, welche es ermöglichen, die Spezifizität und/oder die Empfindlichkeit der Diagnoseergebnisse zu steigern.
Das Kupplungsverfahren von Nakane (The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Bd. 22. Nr. 12 (1974), S. 1084-1091) beschreibt nach der Oxidation der Kohlenhydrate des Enzyms mit Periodat die direkte Kupplung des Proteins über seine freien Aminfunktionen. Die Europäische Patentschrift 209155 beschreibt ein Verfahren, welches die Kupplung des immunologischen Reagens auf den Proteinteil des Enzyms ermöglicht. Nach diesem Verfahren wird das Enzym vor oder nach seiner Kupplung mit dem immunologischen Reagens einer Oxidation mit Periodsäure unterworfen. Das in dieser Weise erhaltene Oxidationsprodukt wird anschließend mit Natriumborhydrid reduziert. Was die Kupplung betrifft, so wird diese mit Hilfe von klassischen Reagenzien bewirkt, wie Glutaraldehyd oder Succinimidderivaten. Dieses Verfahren wendet keinerlei Copolymerisationsstufe an. Die mit Hilfe dieses Verfahrens erhaltenen Konjugate ermöglichen die Beseitigung von falsch-positiven Ergebnissen, die bei "Problemseren" auftreten.
In gleicher Weise beschreibt die Europäische Patentanmeldung EP 601318 ein Verfahren zur Kupplung des immunologischen Reagens an das Enzym über ein Diamin und dann mit Hilfe eines heterobifunktionellen Reagens (Succinimidderivat), wobei das Diamin zuvor mit dem oxidierten Teil des Enzym-Kohlenhydrats umgesetzt worden ist. Man erhält in dieser Weise ein nicht copolymerisiertes Konjugat, dessen Bindung zwischen dem Enzym und dem immunologischen Reagens sich am Kohlenhydratteil des Enzyms findet. In der Tat werden bei diesem Kupplungsverfahren von dem Protein getragene Kohlenhydratgruppen eingesetzt, um direkt das Protein auf den Antikörper aufzupfropfen.
In jüngerer Zeit wurde in der Europäischen Patentanmeldung EP 560912 und dem US-Patent 5,191,066 ein Verfahren zur Herstellung von Immunokonjugaten (Antikörper-alkalische Phosphatase) beschrieben, bei dem der Kohlenhydratteil der Proteine verwendet wird, was es ermöglicht, die immunologische Erkennungsstelle des Antikörpers freizuhalten.
Weiterhin sind Verfahren bekannt, welche die Herstellung von immunoenzymatischen Konjugaten in Form von Copolymeren ermöglichen.
Das US-Patent 4,693,969 beschreibt ein Reagens für Immunoassays des Sandwich-Typs und das Verfahren zu seiner Herstellung. Das Reagens für Immunoassays, welches ein immunoenzymatisches Konjugat in polymerisierter Form trägt, ermöglicht die Steigerung der Empfindlichkeit der Bestimmung der in geringen Konzentrationen vorhandenen Substanzen in biologischen Proben, wie Hormonen. Dieses Reagens erhält man dadurch, daß man in einer ersten Stufe mit Hilfe eines Kupplungsmittels (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) Antikörper/Enzym-Immunokonjugate in Form von Monomeren synthetisiert. In einer zweiten Stufe werden die Monomeren einer Polymerisationsreaktion mit Glutaraldehyd oder Carbodiimid unterworfen.
Die Europäische Patentanmeldung EP 430510 beschreibt ein Polymeres auf der Grundlage von "nachweisbaren" Einheiten, welche untereinander mit Hilfe eines Kupplungsmittels verbunden sind. Die "nachweisbaren" Einheiten haben entweder eine antigene Wirkung oder sind Teil eines fluoreszierenden, chemolumineszierenden, chromogenen oder enzymatischen Systems. Die "nachweisbaren" Einheiten sind über ein hydrophiles Kupplungsmittel, bei dem es sich um ein 1,4-Di-(aminoalkyl)-piperazinderivat handelt, miteinander verknüpft. Zur Herstellung dieser Polymeren werden die "nachweisbaren" Einheiten chemisch in der Weise modifiziert, daß sie entweder zwei Carboxylgruppen tragen oder eine Carboxylgruppe und eine Amino- oder Thiocyanatgruppe. Die Polymerisation mit den 1,4-Di-(amino alkyl)-piperazinderivaten erfolgt durch Anwendung klassischer Methoden, die entweder in der Chemie der Peptidherstellung ausgehend von Aminosäuren oder in der Chemie der Polymersynthese (Verwendung von Reagenzien der Kondensation von Peptiden oder Dialdehyden) angewandt werden.
Die Europäische Patentanmeldung EP 175560 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, welches aus einem polymerisierten Enzym und einem Antikörper gebildet ist. Nach diesem Verfahren erhält man in einer ersten Stufe durch kovalente Kupplung von mindestens zwei Enzymmolekülen über ihre Thiolfunktionen oder freien Aminfunktionen ein vorpolymerisiertes Enzym. Dieses vorpolymerisierte Enzym wird anschließend über kovalente Bindungen mit einem Antikörper oder einem Antikörperfragment gekuppelt.
Derzeit ist es für bestimmte pathologische Zustände erforderlich, sehr frühzeitig die Anwesenheit eines spezifischen Antigens oder Antikörpers nachzuweisen. Weiterhin sind bestimmte Antigene gelegentlich für den Nachweis maskiert und in dem Serum des Patienten, der von einer solchen Infektion befallen ist, erscheinen nur winzige Mengen von für das Antigen spezifischen Antikörpern.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Konjugate ermöglichen daher nicht einen ausreichend empfindlichen Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, die in dem Serum von Patienten vorhanden sind, welche an einer Infektion erkrankt sind, die keine starke immunologische Reaktion auslöst.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, eine Lösung dieses Problems der mangelnden Empfindlichkeit durch die Verwendung der erfindungsgemäßen immunoenzymatischen Konjugate zu schaffen.
Gegenstand der Erfindung sind daher immunoenzymatische Konjugate, welche Konjugate aus glykosylierten Markierungsenzymen in Copolymer-Form und Substanzen mit immunologischer Wirkung gebildet sind, und die Verwendung dieser Konjugate bei einer immunologischen Bestimmung.
Die Erfindung betrifft weiterhin das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen copolymerisierten immunoenzymatischen Konjugate sowie die Verwendung dieser Konjugate für die immunologische Bestimmung.
Die Erfindung betrifft weiterhin Diagnosekits, welche die erfindungsgemäßen Konjugate umfassen.
Die Begriffe "Kohlenhydrat" oder "glykosyliert", wie sie im Hinblick auf Enzyme angewandt werden, besitzen im folgenden die Bedeutung, daß das Enzym eine oder mehrere Kohlehydratgruppen aufweist, die an seinen Proteinteil gebunden ist.
Die erfindungsgemäßen Konjugate ermöglichen wesentlich empfindlichere Ergebnisse als man sie mit den bereits aus dem Stand der Technik immunoenzymatischen Konjugaten erzielen kann. Die Erfindung führt somit zu einer signifikanten Verbesserung im Bereich der Diagnostik und insbesondere der Diagnose von pathologischen Zuständen mit viralem Ursprung, da diese letzteren häufig zu Beginn der Infektion nur schwierig nachzuweisen und damit zu diagnostizieren sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere immunoenzymatische Konjugate, die gebildet sind aus:
- Markierungsenzymmolekülen, die über zuvor oxidierte Kohlenhydratgruppen miteinander copolymerisiert worden sind unter Bildung eines Enzym-Copolymers, und
- mindestens einer mit den Markierungsmolekülen konjugierten Substanz mit immunologischer Wirkung, die über die freien Aminfunktionen des Enzym- Copolymers copolymerisiert sind.
Die erfindungsgemäßen Konjugate sind somit aus Markierungsenzymen gebildet, welche einen Kohlehydratteil besitzen, wie Meerrettich-Peroxidase (POD), alkalische Phosphatase (PAL), Galactosidase, Glucose-Oxidase und Fructose-Oxidase. Man erhält in dieser Weise mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens Konjugate, die aus Copolymeren gebildet sind, die aus den genannten Enzymen aufgebaut sind, die Copoylmere des ausgewählten Enzyms darstellen.
Erfindungsgemäß erhält man das Enzym-Copolymer ausgehend von dem Markierungsenzym und Diamin(en) oder dem Markierungsenzym und verschiedenen untereinander verbundenen heterobifunktionellen Reagenzien.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen Enzym-Copolymer erhalten worden ist ausgehend von einem Diamin ausgewählt aus aliphatischen Diaminen (mit gerader oder verzweigter oder cyclischer Kette) oder aromatischen Diaminen, welche Amine 2 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen. Vorzugsweise verwendet man Phenylen-1,4-diamin.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen Enzym-Copolymer zwei verschiedene, miteinander verbundene heterobifunktionelle Reagenzien enthält, welche ausgewählt sind aus 2-Mercaptoethylamin oder 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionyl-hydrazid bzw. 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyl-hydrazid oder 4-(4-N-Maleimido-phenyl)-butyryl-hydrazid.
In besonders bevorzugter Weise betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen Enzym-Copolymer die Enzyme und Diamine bzw. heterobifunktionellen Reagenzien in Verhältnissen enthält, die 1/l-10 Moläquivalenten, vorzugsweise 1/4-6 Moläquivalenten entsprechen.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen Enzym-Copolymer n Enzymmoleküle enthält, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 100, vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 5 und 50 bedeutet.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen copolymerisiertes Enzym Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase ist.
Das erfindungsgemäße immunoenzymatische Konjugat ist ein Konjugat, dessen Enzym-Copolymer über ein homo- oder heterobifunktionelles Reagens, welches mit einer Aminfunktion des Enzym-Copolymers reagiert, an mindestens eine Substanz mit immunologischer Aktivität gekuppelt ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen Molverhältnis se des Enzym-Copolymers oder Copolymers von Enzymen und der (den) Substanz(en) mit immunologischer Aktivität 10/ 1 bis 1/10 (enzymatische Einheit/Einheit der Substanz mit immunologischer Aktivität), vorzugsweise 3/1 bis 1/3, und noch bevorzugter 1/1, betragen.
Die mit den Enzym-Copolymeren gekuppelten Substanzen mit immunologischer Aktivität können natürliche oder rekombinante Proteine, mono- oder polyklonale, rekombinante oder nicht-rekombinante Antikörper, rekombinante oder nicht-rekombinante Peptide sein, wie Peptide, die von Viren abgeleitet sind, wie die Viren VIH (HIV) (1 oder 2), VHC (HCV) und VHB (HBV).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Konjugat, dessen Substanz mit immunologischer Aktivität ein Peptid VIH1 (HIV1- Peptid), ein Peptid VHC (HCV-Peptid), ein rekombinantes Protein VHC (HCV-Peptid), ein Anti-VIH1-Antikörper (Anti-HIVI-Antikörper) oder ein Anti-AgHBs-Antikörper ist.
Die in der Stufe der Kupplug des Enzym-Copolymers mit der Substanz mit immunologischer Aktivität verwendeten homo- oder heterobifunktionellen Kupplungsreagenzien können beispielsweise Bis(sulfosuccinimidyl)-suberat (Bs³), Sulfosuccinimidyl-4-(n-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) oder N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) sein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man:
a. die Markierungsenzymmoleküle über ihre zuvor oxidierten Kohlenhydrate copolymerisiert und
b. dann die Kupplung des Enzym-Copolymers mit mindestens einer Substanz mit immunologischer Aktivität bewirkt.
Zur Oxidation des Enzym-Kohlenhydrats verwendet man Reagenzien, welche die Bildung von Aldehydgruppen ermöglichen. Man führt beispielsweise eine Oxidation mit Periodat oder irgendeine andere äquivalente Oxidation durch, welche die Bildung von Aldehydgruppen ermöglicht.
Gemäß einer ersten Ausführungsform setzt man in der Stufe der Copolymerisation des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate die Enzymmoleküle mit einem Diamin um.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform setzt man in der Stufe der Copolymerisation des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate in einer ersten Stufe die Enzymmoleküle getrennt mit verschiedenen heterobifunktionellen Reagenzien um und bewirkt dann in einer zweiten Stufe die Reaktion der Reaktionsprodukte miteinander.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines copolymerisierten immunoenzymatischen Konjugats, gemäß dem nach der Copolymerisation der Markierungsenzymmoleküle man dann, wenn man ein Amin verwendet, eine Reduktion mit einem Reduktionsmittel, wie Natriumborhydrid oder Natriumcyanborhydrid, durchführt, um in dieser Weise die Copolymerisation zu unterbrechen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines copolymerisierten immunoenzymatischen Konjugats, bei dem man nach der Copolymerisation der Markierungsenzyme dann, wenn man verschiedene heterobifunktionelle Reagenzien verwendet, man eine Reaktion mit Mitteln zum Blockieren der freien Funktionen der nicht umgesetzten heterobifunktionellen Reagenzien durchführt. Man kann, je nachdem, entweder die beiden Mittel, die die freien Funktionen der beiden verwendeten Reagenzien blockieren, oder eines der beiden Mittel, die die freien Funktionen der verwendeten Reagenzien blockieren, einsetzen.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines copolymerisierten immunoenzymatischen Konjugats, bei dem man in der Stufe der Kupplung des Enzym-Copolymers mit den Substanzen mit immunologischer Aktivität die Konzentration des Reagens der homo- oder heterobifunktionellen Kupplung im Überschuß im Vergleich zu der Konzentration des Enzym-Copolymers anwenden.
Das erfindungsgemäße Verfahren sei im folgenden genauer erläutert für eine Copolymerisation, die in einer Stufe durchgeführt wird:
Das für die Herstellung des Konjugats ausgewählte Enzym wird vor der Copolymerisationsreaktion mit einem Oxidationsmittel für die Kohlenhydratgruppen, wie Periodat (mehrere hundert Mol pro Mol Enzym) bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8 behandelt. Man entfernt anschließend das überschüssige Periodat durch Dialyse der Lösung des oxidierten Enzyms.
Anschließend gibt man ein aliphatisches (lineares, verzeigtes oder cyclisches) oder aromatisches Diamin, welches 2 bis 12 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise Phenylen-1,4-diamin, in einer Konzentration von 1/l-10 Moläquivalenten (enzymatische Einheit / Diaminelnhelt), vorzugsweise 1 /4-6 Moläquivalente, in einem Medium mit einem pH-Wert zwischen 7 und 9,5 zu.
Man überwacht die Copolymerisationsreaktion durch gelfiltrations-chromatographische Analyse in der Weise, daß man Enzym-Copolymere erhält, welche n Enzymreste enthalten, wobei n eine ganze Zahl von 3 bis 100 und vorzugsweise eine ganze Zahl von 5 bis 50 darstellt.
Anschließend unterbricht man die Copolymerisationsreaktion durch Zugabe eines Überschusses eines Reduktionsmittels für die während der Copolymerisationsreaktion nicht umgesetzten oxidierten Kohlenhydrate, wie beispielsweise Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid.
Dann reinigt man das in dieser Weise erhaltene Enzym-Copolymer durch Gelfiltration.
Anschließend aktiviert man das Enzym-Copolymer durch Zugabe eines homo- oder heterobifunktionellen Reagens in Verhältnissen von 5-50 Mol pro Mol Enzym bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8. Anschließend reinigt man die aktivierten Enzym-Copolymere durch Salzentfernung über einem Gel.
Man bewirkt anschließend die Konjugation des aktivierten Enzym-Copolymers mit der Substanz mit immunologischer Aktivität unter Anwendung von molaren Verhältnissen von etwa 10/ 1 bis 1/10 (enzymatische Einheit/Einheit der Substanz mit immunologischer Aktivität), vorzugsweise 3/1 bis 1/3 und noch bevorzugter 1/1, wobei diese Reaktion bei neutralem pH-Wert durchgeführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren sei im folgenden näher im Hinblick auf eine in zwei Stufen durchgeführte Copolymerisation erläutert:
Das für die Herstellung des Konjugats verwendete Enzym wird vor der Copolymerisationsreaktion mit einem heterobifunktionellen Oxidationsreagens für die Kohlenhydratgruppen, wie Periodat (mehrere huntert Mol / Mol Enzym) bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8 behandelt. Anschließend entfernt man das überschüssige Periodat durch Dialyse der Lösung des oxidierten Enzyms. Die Lösung des oxidierten Enzyms wird auf 5-10 mg/ml eingestellt und in 2 gleich große Teile aufgeteilt.
Dann gibt man zu dem ersten Teil ein heterobifunktionelles Reagens, wie 2-Mercaptoethylamin in einer Konzentration von 1/1-10 Moläquivalenten (enzymatische Einheit/Diamineinheit), vorzugsweise 1/4-6 Moläquivalenten, in einem Medium, dessen pH-Wert zwischen 7 und 9,5 liegt, und man bewirkt die Reaktion während einer Stunde bei Raumtemperatur.
Man gibt zu dem zweiten Teil ein Reagens, wie 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyl-hydrazid in einer Konzentration, wie sie oben definiert worden ist, und setzt während einer Stunde bei Raumtemperatur um.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bewirkt man die oben genannte Stufe gemäß dem folgenden Reaktionsschema:
- Man gibt zu dem ersten Teil ein Reagens, wie 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionyl-hydrazid (PDPH) bis zu einer Endkonzentration von etwa 5 mM bei einem pH- Wert von 5-7 und läßt die Reagenzien während etwa einer Stunde bei 20ºC reagieren.
- Man gibt zu dem zweiten Teil ein Reagens, wie 4-(4-N-Maleimido-phenyl)- butyryl-hydrazid (MPBH) bis zu einer Endkonzentration von etwa 1 mM, bei einem pH-Wert von 5-7. Man läßt die Reaktionsteilnehmer während etwa 1 Stunde bei 20ºC reagieren.
Jede der Enzymlösungen wird filtriert und durch Gelfiltration gereinigt. Die mit PDPH aktivierte Fraktion wird mit Dithiolthreit (Endkonzentration 20 mM) während etwa 10 Minuten reduziert und dann erneut durch Gelfiltration gereinigt.
Die mit PDPH aktivierte Enzymfraktion wird nach der Reduktion mit der mit MPBH aktivierten Enzymfraktion vermischt und man bewirkt die Copolymerisationsreaktion der beiden Materialien bei 20ºC und einem pH-Wert zwischen 6 und 8.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Überwachung der Copolymerisation durch Gelfiltration mit Hilfe einer analytischen Säule, deren genaue Eigenschaften in Abhängigkeit von dem das Copolymer bildenden Enzym ausgewählt werden. Man verwendet beispielsweise eine Säule, die mit dem Gel Pharmacia Superose® 6 Prep Grad für alkalische Phosphatase (MG = 140.000) oder dem Gel Superose® 12 Prep Grad für Meerrettich-Peroxidase (MG = 44.000) gefüllt ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unterbricht man am Ende der Copolymerisation die Reaktion durch sukzessive Zugabe von 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 1 mM) und von N-Ethylmaleimid (Endkonzentration 2 mM). Man kann eine Reduktion mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanborhydrid durchführen, um die Carbonylfunktionen zu reduzieren, die gegebenenfalls nicht umgesetzt worden sind und zur Stabilisierung der Hydrazon-Funktionen, die durch Reaktion der Carbonylfunktionen mit Hydraziden gebildet worden sind. Die Lösung des polymerisierten Enzyms wird durch Gelfiltration über eine präparative Säule unter ähnlichen Bedingungen wie zur oben beschriebenen analytischen Überwachung gereinigt. Die Fraktion, die den von dem Gel ausgeschlossenen Bestandteilen entspricht, wird gewonnen und bildet die Lösung des polymerisierten Enzyms. Man bestimmt die Proteinkonzentration durch BCA-Bestimmung (Pierce).
Anschließend aktiviert man das Enzym-Copolymer durch Zugabe eines homo- oder heterobifunktionellen Reagens in Verhältnissen von 5-50 Mol/Mol Enzym bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8. Anschließend reinigt man die aktivierten Enzym-Copolymere durch Entsalzen über einem Gel.
Man bewirkt anschließend die Konjugierung des aktivierten Enzym-Copolymers mit der Substanz mit immunologischer Aktivität unter Anwendung von Molverhältnissen von etwa 10/1 bis 1/10 (enzymatische Einheit/Einheit der Substanz mit immunologischer Aktivität), vorzugsweise von 3/1 bis 1/3 und noch bevorzugter von 1/1, wobei diese Reaktion bei einem neutralen pH-Wert durchgeführt wird.
In Abhängigkeit von der Auswahl des herzustellenden Konjugats werden die freien Aminfunktionen der Enzyme gegebenenfalls vor der Copolymerisationsreaktion blockiert.
Wenn man die freien Aminfunktionen der Enzymmoleküle nicht blockiert, verwendet man vorzugsweise im Verlaufe der Polymerisationsreaktion ein aromatisches Diamin, wie beispielsweise Phenylen-1,4-diamin, oder heterobifunktionelle Reagenzien.
Wenn man die freien Aminfunktionen der Enzymmoleküle vor der Copolymerisationsreaktion mit einem Mittel zum Schutz von Aminfunktionen blockiert, kann die Copolymerisationsreaktion mit einem aliphatischen (linearen, verzweigten oder cyclischen) Diamin oder einem aromatischen Amin mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen oder heterobifunktionellen Reagenzien durchgeführt werden.
Man kann dann die Copolymerisationsreaktion durchführen und in Abhängigkeit von der Stelle, an der die Kupplung der Substanz mit immunologischer Aktivität über das homo- oder heterobifunktionelle Reagens an dem Enzym-Copolymer reagieren kann, gegebenenfalls die Schutzgruppe der Aminfunktionen entfernen.
Die Kupplung des Enzym-Copolymers mit der Substanz mit immunologischer Aktivität kann entweder über den Proteinteil des Enzym-Copolymers oder über die Diamine oder heterobifunktionellen Reagenzien, die zuvor mit einem ihrer Enden mit den oxidierten Zuckerresten umgesetzt worden sind und nicht mit dem anderen Ende reagiert haben, oder über beide Varianten gleichzeitig erfolgen.
Es ergibt sich aus der obigen Beschreibung, daß das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate, welches eine Copolymerisation in einer Stufe umfaßt, neben der Herstellung von Konjugaten, die eine erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit bei immunoenzymatischen Tests zeigen, interessante Herstellungsvarianten erlauben.
Es ergibt sich weiterhin aus der obigen Beschreibung, daß der Vorteil des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate, welches eine Copolymerisation in zwei Stufen umfaßt, in einer größeren Breite der Auswahl der Kupplungsstellen für die Substanz mit immunologischer Aktivität zu sehen ist.
Man kann daher durch die Auswahl des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate in Abhängigkeit von der zu diagnostizierenden Infektion geeignete Immuno-Konjugate herstellen, die aus dem ausgewählten Enzym- Copolymer und der Substanz mit der für die Infektion spezifischen immunologischen Aktivität bestehen. Die möglichen Kombinationen des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate (ob dies nun die Stufe der Copolymerisation in einem oder mehreren verschiedenen copolymerisierten Enzymen oder die Stufe der Kupplung einer oder mehrerer verwendeten Substanzen mit immunologischer Aktivität umfaßt) sind vielfältig und ermöglichen durch gezielte Auswahl die Herstellung von Konjugaten, welche spezifische und ultraempfindliche Nachweisergebnisse ermöglichen.
Bei der Beschreibung der nachfolgenden Beispiele, die die Erfindung nicht einschränken sollen, werden die Säulen des Chromatographiesystems (Gel Superpose® 12 Prep Grad und Säulen HR 10 · 30 und XK 16-70, PHARMACIA) mit dem zuvor entgasten PBS-Puffer (50 mM / pH = 7,4) gespült und äquilibriert.

Beispiel 1: PEROXIDASE-PEPTID VIH1-KONJUGAT

a - Copolymerisation der Peroxidase in einer Stufe:

Zur Durchführung der Copolymerisation bereitet man die folgenden Puffer:
- PBS-Puffer (Natriumphosphat 50 mM, NaCl 0,15 M / pH = 7,4) 2,0 l
- HEPES-Puffer (0,36 M 1 pH = 5,4) 0,1 l
- Natriumacetat-Puffer (0,01 m / pH = 5,4) mindestens das 1000-fache Volumen der oxidierten Peroxidase
- Natriumcarbonat-Puffer (1 M / pH = 9,0) 15% des Volumens der Peroxidase
Zur Berechnung der Konzentrationen und Mengen führt man die Bestimmung der optischen Dichte (O. D.) bei 280 und 403 nm durch, wobei die Massenextinktionskoeffizienten die folgenden sind:
e280 = 0,7 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹
s403 = 1,93 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹
Das Molekulargewicht der Peroxidase beträgt 44.000 Da.
Man präpariert die Peroxidase (100 mg) zu einer theoretischen Konzentration von 45 mg/ml in dem HEPES-Puffer und überprüft dann durch eine Messung der O. D. bei · 280 und 403 nm. Die Konzentration muß 35 mg/ml auf etwa 15% betragen. Sie wird anschließend durch Zugabe von Periodat (des 1,5-fachen der Peroxidasemenge bei einer Konzentration von 100 mg/ml in dem HEPES-Puffer) oxidiert. Diese Oxidation dauert 45 Minuten plus oder minus 10 Minuten bei etwa 20ºC und sie wird unter ständigem Rühren durchgeführt.
Anschließend bewirkt man eine Dialyse bei 4ºC in drei Stufen, welche drei Volumen des Natriumacetat-Puffers entsprechen, die deutlich größer sind als das Volumen der oxidierten Peroxidase. Die Gesamtdauer der Dialyse muß etwa 24 Stunden betragen.
Die Copolymerisation erfolgt in einem alkalischen Medium, welches man durch Zugabe des Natriumcarbonat-Puffers in Gegenwart von 4 Moläquivalenten Phenylen-1,4-diamin in einer Konzentration von 2 mg/ml in dem Natriumcarbonat-Puffer erhalten hat. Diese Stufe erfolgt bei 20ºC unter Rühren und dauert etwa 12 Stunden.
Die Überprüfung der Copolymerisation erfolgt durch Injektion von 25 ul der copolymerisierten Peroxidase auf das Superose®-Gel in einer Analysensäule HR 10 · 30. Das Profil muß einen Hauptpeak umfassen, der den Molekülbestandteilen entspricht, die von dem Gel ausgeschlossen werden. Es können zwei oder drei weitere Peaks vorhanden sein, die unterschiedlichen Copolymerisationszuständen entsprechen. Dann unterbricht man die Reaktion.
Das Stoppen der Copolymerisation erfolgt durch Reduktion der oxidierten Funktionen der Peroxidasemoleküle, die nicht während der Copolymerisation reagiert haben. Die Unterbrechung erfolgt durch Zugabe von Natriumborhydrid (5% des Peroxidase-Volumens) in einer Konzentration von 5 mg/ml in wäßriger Lösung. Die Mischung wird während 30 Sekunden gerührt und dann während 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rühren stehen gelassen.
Man wiederholt die gleiche Stufe unter den gleichen Bedingungen ein zweites Mal.
Man reinigt die Copolymeren über dem Superose®-Gel in einer präparativen Säule XK 16 · 70. Die maximal injizlerbare Peroxidase-Menge beträgt 200 mg bei einem Maximalvolumen von 10 ml. Die Säule muß mit dem PBS-Puffer äquilibriert worden sein. Der Durchsatz während der Reinigung beträgt 120 ml/Stunde.
Man sammelt die Fr aktion, die den ausgeschlossenen Molekülbestandteilen entspricht oder die von dem Gel zurückgehalten wird.
Der spezifische Extinktionskoeffizient (s) des Peroxidase-Copolymers beträgt 1,3 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹ bei λ · 403 nm.

b - Kupplung

Man bereitet die folgenden Puffer:
- PBS-Puffer (Natriumphosphat 50 mM, NaCl 0,15 M / pH = 7,4 2 l
- M. B. U.-Puffer: - 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES) 5 mM
- Borsäure 5 mM
- Harnstoff 2 M
pH = 7, 0 2 l
Das verwendete Peptid ist das Fragment (584-609) des Proteins gp 41 des Isolats BRU VIH&sub1;. Dieses Peptid entspricht dem Peptid 39, das in dem Europäischen Patent, Veröffentlichungsnummer EP-220 273 der Genetic Systems Corporation offenbart ist.
Die Menge des zu aktivierenden Copolymers hängt ab von der Menge des zu kuppelnden Peptids: 10 bis 20 mg Peroxidase pro 1 mg des Peptids VIH 1. Man aktiviert das Peroxidase-Copolymer mit 35 Moläquivalenten BS3 in einer Konzentration von 30 mg/ml in dem PBS-Puffer während 45 Minuten bei 20ºC unter ständigem Rühren.
Das Entsalzen des aktivierten Enzym-Copolymers erfolgt auf dem Superose®-Gel, welches mit M. B. U. äquilibriert worden ist, und dient dazu, das mit B53 aktivierte nicht umgesetzte Peroxidase-Copolymer abzutrennen.
Das Peroxidase-Copolymer wird nach dieser Entsalzung gewonnen und auf eine Konzentration von 6 mg/ml eingestellt.
Bei der Konjugation des aktivierten Peroxidase-Copolymers mit dem Peptid VIH 1 beträgt das Molverhältnis (Peptid/Peroxidase) 1/l. Man setzt das Peptid in Lösung in einer Konzentration von 5 mg/ml ein. Man vermischt die richtigen Mengen der aktivierten Peroxidase-Copolymeren und der Peptide und hält unter ständigem Rühren während 2 Stunden bei 20ºC.
Nach einer Konjugatlonsreaktion während zwei Stunden wird die Mischung über dem Superose~Qel gereinigt, welches mit dem PBS-Puffer äquilibriert worden ist. Die Peroxidase-Copolymer - Peptid VIH1-Mischung wird in einer Menge von 120 ml/Stunde auf die Säule aufgebracht.
Die Fraktion, die dem Konjugat entspricht, wird gewonnen und ihre Konzentration wird durch Bestimmung der O. D. bei · 403 nm (r = 1,3 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹) bestimmt.

Beispiel 2: KONJUGAT AUS ALKALISCHER PHOSPHATASE UND PEPTID VIH1

a- Copolymerisation der alkalischen Phosphatase in einer Stufe:

Man wendet das gleiche Herstellungsverfahren an, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet jedoch anstelle von Peroxidase gereinigte alkalische Phosphatase. Das Molekulargewicht der alkalischen Phosphatase beträgt 140.000 Da. Zur Herstellung des Konjugats des Beispiels 2 erfolgt die Polymerisation der alkalischen Phosphatase ausgehend von einer Enzymlösung mit einer Konzentration von 12 mg/ml in einem Triethanolamin-Puffer (pH = 7,6), der 3 M NaCl. 5 mM MgCl&sub2; und 0,2 mM ZnCl&sub2; enthält.
Man bewirkt die Oxidation mit 400 Moläquivalenten Natriumperiodat pro Moläquivalent alkalischer Phosphatase.
Man überwacht die Copolymerisatlon auf dem Gel Superose 6 Pg (Pharmacia).
Der Massenextinktionskoeffizient (s) für das Copolymer der alkalischen Phosphatase beträgt 1,4 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹ bei · 280 nm anstelle von 1,0 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹ für die nicht polymerisierte Phosphatase.

b- Kupplung

Die Kupplung des Peptids mit der polymerisierten alkalischen Phosphatase erfolgt unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode unter Austausch des Enzym-Copolymers. Nach der Kupplungsreaktion, die unter Verwendung von 3 Mol des Peptids pro Mol enzyrnatischer Einheit durchgeführt wird, reinigt man das Konjugat über dem Gel Superose® 6 PG, welches mit einem 10 mM TRIS-Puffer mit einem pH-Wert von 8, der MgCl&sub2; (1 mM) und ZnCl&sub2; (0,1 mM) enthält, äquilibriert worden ist. Die von dem Gel ausgeschlossene Fraktion, die dem Konjugat entspricht, wird gewonnen. Man bestimmt die Konzentration durch Messung der optischen Dichte bei 280 nm (s = 1,4 ml·mg&supmin;¹·cm&supmin;¹).

ANWENDUNG DES HERGESTELLTEN KONJUGATS (KONJUGAT B) UND VERGLEICH MIT EINEM KONJUGAT DES STANDES DER TECHNIK (KONJUGAT A) MIT NICHT-POLYMERISIERTEM ENZYM

Bei dem nach dem Stand der Technik hergestellten Konjugat A ist das verwendete Enzym nicht polymerisiert worden. Die Methode der Kupplung des Peptids mit dem Enzym ist identisch mit der in diesem Beispiel beschriebenen Kupplungsmethode.

Prinzip des Immunoassays, der in der Vorrichtung Accessm (Sanofi Diagnostics Pasteur) durchgeführt wird

Der Nachweis der gegen das Virus VIH 1 gerichteten Antikörper basiert auf dem Prinzip der immunoenzymatischen Chemolumineszenz-Technik vom Sandwich-Typ. Der Test umfaßt auf der Anwendung einer festen Phase, die mit den gereinigten Antigenen bedeckt ist, darunter das Hüll-Glykoprotein VIH 1. Die feste Phase wird aus paramagnetischen Mikrokügelchen (Estaporº, Prolabo, Frankreich) in einer Menge von 50 ug in 0,1 ml des Verdünnungsmittels gebildet.
Das verwendete Enzymsubstrat ist ein Dioxethan des Typs AMPPD (Tropix) oder ein äquivalentes Material.
Die untersuchten Sera umfassen:
- 13 Proben positiv bezüglich Anti-VIH1-Antikörpern (gegebenenfalls verdünnte Serumumwandlungs-Proben, erhalten von BBI, NABI, Serologicals, USA),
- 44 Proben negativ bezüglich der Anti-VIH1-Antikörper.
Für den Einsatz des in diesem Beispiel beschriebenen Konjugats bewirkt man die folgenden Stufen:
Man bereitet eine Reihe von Röhrchen, die mit A etikettiert sind und eine Reihe von Röhrchen, die mit B etikettiert sind.
Man verteilt pro Röhrchen:
- 0,1 ml der Suspension der sensibilisierten Mikrokügelchen,
- 0,1 ml des zu untersuchenden Serums.
Nach der Inkubation während 20 Minuten bei 37ºC und dem (dreifachen) Waschen gibt man 0,26 ml des Konjugats zu:
- Röhrchen A: Konjugat A
- Röhrchen B: Konjugat B
Man inkubiert sämtliche Röhrchen während 20 Minuten bei 37ºC, wäscht (dreifach), setzt dann jedem Röhrchen 0,2 ml des Substrats zu, inkubiert während 5 Minuten bei 37ºC und mißt dann in jedem der Röhrchen A und B mit Hilfe eines Photomultipliers (Access®) das emittierte Licht, ausgedrückt in UAL (Unites Arbitraires de Lumiere, willkürliche Lichteinheiten).

Ergebnisse:

1-Ermittlung der Schwellenwerte:

Man berechnet den Mittelwert des emittierten Lichts (UAL) in sämtlichen negativen Proben der Röhrchen A und setzt 10 Standardabweichungen (Ecart- Typ, ET) zu und erhält den Wert xA + 10 ET, den man als Schwellenwert für die Röhrchen A verwendet.
Man berechnet den Mittelwert x des emittierten Lichts (UAL) für sämtliche negativen Proben der Röhrchen B und setzt 10 Standardabweichungen (ET) zu und erhält den Wert xB + 10 ET (ausgedrückt in UAL), welches man als Schwellenwert für die Röhrchen B verwendet.

2-Interpretation der Ergebnisse:

Eine Probe wird als positiv erklärt, deren Wert für das emittierte Licht größer ist als der ihr entsprechende Schwellenwert.
Eine Probe wir d als negativ erklärt, deren Wert des emittierten Lichts unterhalb des ihr entsprechenden Schwellenwerts liegt.
Die nachfolgende Tabelle I verdeutlicht die erhaltenen Werte: TABELLE I
*VS = Schwellenwert
Es ergibt sich deutlich aus den obigen Ergebnissen, daß das erfindungsgemäße Konjugat (B) es ermöglicht, UAL-Antworten zu erzielen, die signifikant erhöht sind im Vergleich zu jenen, die mit dem Konjugat A erhalten worden sind. Andererseits ist zu beobachten, daß sechs Sera (Nr. 514; Q4-1 /40; Q6-1/100; Q6-1 /200; 241 D 1/100; K5 1/10) mit dem Konjugat des Standes der Technik (A) als negativ angesehen werden, die mit dem erfindungsgemäßen Konjugat (B) positiv werden.
Diese Untersuchungen zeigen somit deutlich, daß die Erfindung eine Verbesserung der Sensibilität ermöglicht.

Beispiel 4: KONJUGAT AUS ALKALISCHER PHOSPHATASE UND PEPTID VIH1

a- Copolymerisation der alkalischen Phosphatase in zwei Stufen:

Man oxidiert die alkalische Phosphatase in Lösung (10 - 20 mg/mL in einem Triethanolamin-Puffer 30 mM, pH 7,6, der 3 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2; und 0,1 mM ZnCl&sub2; enthält) mit Natriumperiodat (300 Mol/Mol Enzym) während 45 Minuten bei 20ºC.
Anschließend entfernt man das überschüssige Periodat durch Dialyse der Lösung des oxidierten Enzyms gegen einen 10 mM Natriumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5, der 1 mM MgCl&sub2; enthält.
Nach der Dialyse teilt man die Lösung des oxidierten Enzyms in 2 gleiche Teile auf.
Man gibt zu dem ersten Teil 3-(2-Pyridyl-dithio)-propionyl-hydrazid (PDPH) bis zu einer Endkonzentration von 4 mM, wobei die Konzentration der alkalischen Phosphatase auf 10 mg/ml eingestellt wird. Die Reaktion wird während 1 Stunde unter Rühren bei 20ºC durchgeführt.
Man gibt zu dem zweiten Teil 4-(4-N-Maleimido-phenyl)-butyryl-hydrazid (MPBH) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu, wobei die Konzentration der alkalischen Phosphatase auf 5 mg/ml eingestellt wird. Die Reaktion wird während 1 Stunde bei 20ºC unter Rühren durchgeführt.
Jede der Enzymlösungen wird filtriert und durch Filtration über ein Gel mit einem 50 mM Natriumphosphat-Puffer mit einem pH von 7,4, der 150 mM Natriumchlorid enthält, gereinigt.
Die mit PDPH aktivierte Fraktion wird mit Dithiotreit (Endkonzentration 10 mM) während 10 Minuten reduziert und dann erneut durch Filtration über das Gel gereinigt.
Die mit PDPH aktivierte Enzymfraktion wird nach der Reduktion mit der mit MPBH aktivierten Enzymfraktion vermischt. Man bewirkt die Copolymerisationsreaktion dieser beiden Materialien bei 20ºC unter Rühren während 2 bis 15 Stunden in Abhängigkeit von der Größe der zu erhaltenden Copolymeren.
Die Überwachung der Copolymerisation erfolgt durch Gelfiltration über eine mit dem Gel Superose® 6 Prep Grad (Pharmacia) beschickten analytischen Säule.
Man bewirkt die Blockierung der Reaktionen durch sukzessive Zugaben von 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 1 mM) und von N-Ethylmaleimfd (Endkonzentration 2 mM). Man kann eine Reduktion mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanborhydrid durchführen zur Reduktion der gegebenenfalls nicht umgesetzten Carbonylfunktionen zur Stabilisierung der durch die Reaktion der Carbonylfunktionen mit den Hydraziden gebildeten Hydrazonfunktionen.
Man reinigt die Lösung des polymerisierten Enzyms durch Gelfiltration über einer präparativen Säule unter ähnlichen Bedingungen wie denen der obigen analytischen Überwachung. Man gewinnt die Fraktion, die den von dem Gel ausgeschlossenen Bestandteilen entspricht, und erhält eine Lösung des polymerisierten Enzyms. Die Proteinkonzentration wird durch PCA-Bestimmung (Pferce) bestimmt.

b- Kupplung:

Man wendet die gleiche Methode an, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist.

Beispiel 6: IMMUNOENZYMASSAY DES KONJUGATS PEROXIDASE-PEPTID VHC (oder HCV)

Der Nachweis der gegen das Hepatitisvirus C (HCV oder VHC) gerichteten Antikörper beruht auf dem nachfolgenden Beispiel auf dem Prinzip der immunoenzymatischen Technik des Sandwich-Typs. Der Test beruht auf der Anwendung einer festen Phase (Mikroplättchen), die mit einem gereinigten Antigen des HCV- Virus (Capside) sensibilisiert worden ist.
Die Durchführung des Tests beruht auf den nachfolgenden Reaktionsstufen.
Jedes zu untersuchende Serum (0,1 ml einer auf 3/4 verdünnten Probe) wird in ein Näpfchen der Mikroplatte eingebracht. Dann wird das mit Peroxidase markierte Konjugat (0,1 ml) zugegeben. Nach der Inkubation während 30 Minuten bei 40ºC und dem Waschen wird die Anwesenheit des auf den Komplexen immobilisierten Enzyms durch Inkubation in Gegenwart des Substrats (TMB) während 30 Minuten entwickelt. Nach Beendigung der Reaktion mit H&sub2;SO&sub4; erfolgt die Messung mit einem Spektrophotometer bei · 450/620 nm. Man bestimmt die Anwesenheit oder Abwesenheit der Anti-VHC-Antikörper durch Vergleich der optischen Dichte (O. D.) einer jeden aufgezeichneten Probe mit jener des berechneten Schwellenwerts (in diesem Fall der Mittelwert der negativen + 0,2).
Die Tabelle IV verdeutlicht die mit Hilfe der beiden Konjugate A und B erhaltenen Vergleichsergebnisse, die unter verschiedenen Bedingungen hergestellt worden sind (Kupplung eines Peptids, das einen Teil des Capsid-Proteins des Virus VHC nachahmt).
Die hergestellten Konjugate und B werden im folgenden beschrieben:
- Konjugat A: Die Peroxidase ist unbehandelt und das Peptid wird mit Hilfe eines bifunktionellen Reagens (PBS) gekuppelt. Die Kupplungsmethode ist die in Beispiel 1 unter Verwendung von Peroxidase beschriebene.
- Konjugat B: Das Konjugat wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt durch Ersatz des Peptids VIH durch das Peptid VHC. TABELLE IV
Die Tabelle IV verdeutlicht die Steigerung der Empfindlichkeit, die an sämtlichen Proben der Serumkonversion PHV-903- (Panel von Boston Biomedica Inc.) erhalten worden ist. Die erste Entnahme, die mit bekannten herkömmlichen Tests nachgewiesen worden ist, liegt zwischen Nr. 2 und Nr. 6, ist jedoch niemals die Nr. I.
Diese Ergebnisse bestätigen die obigen Ergebnisse und verdeutlichen das Interesse der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 7: IMMUNOENZYMASSAY UNTER EINSATZ EINES PEROXIDASE- PEPTID VIH1-KONJUGATS

Der Nachweis der gegen das Virus VIH gerichteten Antikörper beruht in dem nachfolgenden Beispiel auf dem Prinzip der immunoenzymatischen Technik des Sandwich-Typs. Der Test benutzt die Anwendung einer festen Phase, die mit gereinigten Antigenen hergestellt worden ist, darunter das Hüll-Glykoprotein des Virus VIH1.
Die zu untersuchenden Sera (0,1 ml einer im Verhältnis 3/4 verdünnten Probe) werden in Näpfchen der Mikroplatte verteilt. Nach der Inkubation während 30 Minuten wird das mit Peroxidase markierte Konjugat nach dem Waschen zugegeben. Die Anwesenheit des auf den Komplexen Immobilisierten Enzyms wird durch Inkubation in Gegenwart des Substrats nach der Entfernung der Fraktion des frei gebliebenen Konjugats entwickelt. Nach Beendigung der Reaktion erfolgt die Ablesen mit einem Spektrophotometer bei 450/620 nm. Man bestimmt die Anwesenheit oder Abwesenheit der Anti-VIH1-Antikörper durch Vergleich der für jede Probe aufgezeichneten optischen Dichte mit jener des berechneten Schwellenwerts (in diesem Fall Mittelwert der negativen Proben + 0,1).
Die Tabelle IV verdeutlicht die Vergleichsergebnisse, die mit Hilfe von fünf Konjugaten erhalten worden sind, die unter unterschiedlichen Bedingungen hergestellt worden sind (Kupplung eines Peptids, das das immunodominierende Epitop des Hüll-Glykoproteins des Virus VIH1 nachahmt / Aminosäuren 584-609, BRU-Isolat mit Peroxidase).
Die verschiedenen hergestellten Konjugate werden im folgenden beschrieben:
- Konjugat A: Die Peroxidase ist unbehandelt und das Peptid wird mit Hilfe eines bifunktionellen Reagens gekuppelt (die Methode der Kupplung ist diejenige des Beispiels 1).
- Konjugat B: Das Peptid wird mit Peroxidase gekuppelt nach der Methode von Nakane et al. (J. Histochem. Cytochem. 22 (1972), 1084-1091), die wie folgt modifiziert worden ist:
Man oxidiert 28 mg Peroxidase mit 19, 7 mg Natriumperiodat während 1 Stunde und 30 Minuten. Dann bringt man 1 mg des Peptids mit 4 mg oxidierter Peroxidase während 3 Stunden in Kontakt. Diese Methode modifiziert die Kupplung nicht, die nach der Methode von Nakane angewandt wird.
- Konjugat C: Die Peroxidase wird nach der in der unter der Nummer EP 601318 veröffentlichten Patentanmeldung hergestellt und wird mit Hilfe eines bifunktionellen Reagens nach der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahrensweise mit dem Peptid gekuppelt.
- Koniugat D: Man bereitet das Konjugat nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode unter Verwendung von Hexandiamin-1,6 als bifunktionelles Reagens für die Copolymerisation.
- Koniugat E: Das Konjugat wird mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt.
Die in den folgenden Tabellen angegebenen Ergebnisse entsprechen den Werten der optischen Dichte, die bei der Durchführung von immunoenzymatischen Assays abgelesen worden sind, die nach dem beschriebenen Protokoll durchgeführt worden sind unter Verwendung der oben beschriebenen Konjugate A, B, C, D und E.
Die verwendeten Sera sind Proben der Panels K, U und Q, die von der Boston Biomedica Inc. geliefert worden sind, sowie 31 Sera von normalen Spenderpatienten, die negativ sind bei dem Nachweis der VIH-Antikörper.
Die in den Tabellen zusammengefaßten Testergebnisse zeigen, daß lediglich die Konjugate D und E es ermöglichen, gleichzeitig die im Verhältnis 1/64 verdünnten Sera K2 und Q6 positiv nachzuweisen.
Es erscheint somit, daß die erfindungsgemäßen Konjugate eine bessere Nachweissensibilität ermöglichen als jene, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. So wird der Nachweis der gegen die Proteine des Virus VIH1 gerichteten Antikörper früher möglich.

Claims

1. Immunoenzymatisches Konjugat aus glykosylierten Markierungsenzymen und Substanzen mit immunologischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß es gebildet ist aus

- Markierungsenzymmolekülen, die über zuvor oxidierte Kohlenhydratgruppen copolymerisiert sind unter Bildung eines Enzym-Copolymers und

- mindestens einer mit den Markierungsenzymmolekülen konjugierten Substanz mit immunologischer Wirkung, die über die freien Aminfunktionen des Enzym-Copolymers copolymerisiert ist.

2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Copolymer erhalten worden ist ausgehend von dem Markierungsenzym und Diamin(en) oder dem Markierungsenzym und verschiedenen heterobifunktionellen Reagenzien, die untereinander verbunden sind.

3. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diammn ausgewählt ist aus aliphatischen Diaminen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen mit gerader oder verzweigter oder cyclisierter Kette oder aromatischen Diaminen.

4. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Diamin Phenylen-1,4-diamin ist.

5. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen heterobifunktionellen Reagenzien zwei heterobifunktionelle Reagenzien sind, die ausgewählt sind aus 2-Mercaptoethylamin oder 3-(2-Pyridyldithio)-propionylhydrazid bzw. 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyl-hydrazid oder 4-(4- N-Maleimidophenyl)-butyryl-hydrazid.

6. Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verhältnisse von Enzym und Diamin oder heterobifunktionellen Reagenzien 1/l-10 Moläquivalente, vorzugsweise 1/4-6 Moläquivalente betragen.

7. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Copolymer n Enzymmoleküle umfaßt, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 100, vorzugsweise eine ganze Zahl von 5 bis 50, bedeutet.

8. Konjugat nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das copolymerisierte Enzym Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase ist.

9. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Copolymer über ein homo- oder heterobifunktionelles Reagens an mindestens eine Substanz mit immunologischer Aktivität gekuppelt ist.

10. Konjugat nach den Ansprüchen 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Molverhältnisse des Enzym-Copolymers bzw. der Substanz mit immunologischer Aktivität 10/1 bis 1/10 (enzymatische Einheit/Einheit der Substanz mit immunologischer Aktivität), vorzugsweise 3/1 bis 1/3, und noch bevorzugter 1/1 betragen.

11. Konjugat nach den Ansprüchen 1, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit immunologischer Aktivität ein Peptid VIH1, ein Peptid VIH2, ein Peptid VHG oder ein monoklonaler Anti-VIH1-Antikörper oder ein Anti-AgHBs- Antikörper ist.

12. Verfahren zur Herstellung des Konjugats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a. die Markierungsenzymmoleküle über ihre zuvor oxidierten Kohlenhydrate copolymerisiert,

b. dann die Kupplung des Enzym-Copolymers mit mindestens einer Substanz mit immunologischer Aktivität bewirkt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung der Copolymerisation die Enzym-Moleküle mit einem Diamin umsetzt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung der Copolymerisation getrennt in einer ersten Stufe die Enzym-Moleküle mit zwei verschiedenen heterobifunktionellen Reagenzien umsetzt und dann in einer zweiten Stufe die Reaktionsprodukte miteinander umsetzt.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Copolymerisation eine Reduktion mit einem Reduktionsmittel ausgewählt aus Natriumborhydrid und Natriumcyanoborhydrid durchführt.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Copolymerisation eine Reaktion mit Mitteln durchführt, welche die heterobifunktionellen Reagenzien blockieren.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe der Kupplung des Enzym-Copolymers mit der oder den Substanz(en) mit immunologischer Aktivität die Konzentration des homo- oder heterobifunktionellen Reagens überschüssig ist im Vergleich zu der Konzentration des Enzym-Copolymers.

18. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 für immunologische Bestimmungen.

19. Diagnose-Kit für immunologische Bestimmungen, dadurch gekennzeichnet, daß er ein immunoenzymatisches Konjugat nach Anspruch 1 umfaßt.