CN114137203A - 抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法。该方法包括以下步骤：(1)采用4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯对碱性磷酸酶室温下进行活化，得到活化的碱性磷酸酶；(2)采用3‑(2‑吡啶二巯基)丙酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白室温下反应，加入还原剂还原，得到含游离巯基的抗原蛋白；(3)将所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应，加入N‑乙基马来酰亚胺反应，再加入乙醇胺反应，得到抗原与碱性磷酸酶结合物。本发明方法制备的抗原与碱性磷酸酶结合物发光值高、热稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域，特别是涉及抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法。
背景技术
在免疫诊断分析领域中，酶标记物是指利用具有促发光性能的酶类对抗原或抗体进行标记，配合适当的反应体系产生光信号的一种试剂，其质量的好坏直接影响免疫诊断试剂研发的成功与否，因此又被称为免疫分析中的关键试剂。而酶标记物的质量(如发光值与稳定性等)与酶活性、抗原/抗体质量和标记方法密切相关。
就碱性磷酸酶而言，常用的标记方法主要包括同双功能团交联法、碳二亚胺法和异双功能团交联法。其中，同双功能团交联法主要指戊二醛交联法，该方法反应步骤简单，操作方便，但往往偶连率较低，所得酶标记物的活性较低；碳二亚胺法利用碳二亚胺类物质对蛋白质的羧基进行改造，容易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物；而异双功能团交联法通过使用不同的交联剂，分别对抗原/抗体和碱性磷酸酶进行不同基团改造，偶连率高，相对而言更普适于抗原-酶结合物制备中。
在化学发光免疫诊断分析中，本发明的发明人在研究中发现，使用双抗原夹心法检测抗体如：例如乙肝表面抗体(HBsAb)等病毒抗体，常需要将病毒抗原与碱性磷酸酶标记结合，而传统酶标记方法如戊二醛交联法的结果通常并不理想，酶标记物的质量(如发光值与稳定性等)较差。而直接采用异双功能团交联法发现发光值和热稳定性也都不理想。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种发光值高、热稳定性好的抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法。
实现上述目的的技术方案包括以下：
一种抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(即：SMCC)对碱性磷酸酶室温下进行活化，得到活化的碱性磷酸酶；
(2)采用3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(即：SPDP)与抗原蛋白室温下反应，加入还原剂还原，得到含游离巯基的抗原蛋白；
(3)将所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应，加入N-乙基马来酰亚胺反应，再加入乙醇胺反应，得到抗原与碱性磷酸酶结合物；
步骤(3)中，所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比为1：(0.8-4)；所述含游离巯基的抗原蛋白与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1：(5-20)，所述N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1：(1-5)；所述加入N-乙基马来酰亚胺反应的反应时间为(15-38)min，所述加入乙醇胺反应的反应时间为(15-38)min。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述加入N-乙基马来酰亚胺反应的反应时间为(30-38)min。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述加入乙醇胺反应的反应时间为(30-38)min。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比为1：(0.8-1.2)。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应的反应时间为(30-125)min。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应的反应时间为(115-125)min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和碱性磷酸酶的摩尔比为(5-22)：1，优选为(18-22)：1。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白反应的反应时间为(30-125)min，优选为(115-125)min。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白的摩尔比为(4-20)：1，优选为(4-6)：1。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述活化的时间为(30-120)min。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述加入还原剂还原的时间为(20-120)min，优选为(20-40)min。
在其中一些实施例中，所述抗原蛋白为乙肝表面抗原。
在其中一些实施例中，步骤(1)的反应在缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液为PBS、HEPES和CBS中的至少一种；所述缓冲溶液的pH为7.0-9.0。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述还原剂为二硫苏糖醇。
本发明的另一目的是提供一种上述的制备方法制备的抗原与碱性磷酸酶结合物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种特别适合制备高化学发光值、高热稳定性的抗原与碱性磷酸酶结合物的方法，尤其是特别适合制备高化学发光值、高热稳定性的乙肝表面抗原与碱性磷酸酶结合物的方法。
本发明的发明人在研究中发现，SMCC制备而成活化的碱性磷酸酶和SPDP制备而成含游离巯基的抗原蛋白进行反应后，在反应产物中先加入N-乙基马来酰亚胺封闭反应，再加入乙醇胺进行封闭反应，并结合合适的原料配比和封闭时间(15-38)min，可以有效提高产物蛋白-酶结合物的发光值和热稳定性，特别是严格控制N-乙基马来酰亚胺和乙醇胺为(30-38)min的封闭时间，结合其他步骤，可以显著地提高发光值和热稳定性。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本实施方式提供一种抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯对碱性磷酸酶室温下进行活化，得到活化的碱性磷酸酶；
(2)采用3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白室温下反应，加入还原剂还原，得到含游离巯基的抗原蛋白；
(3)将所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应，加入N-乙基马来酰亚胺反应，再加入乙醇胺反应，得到抗原与碱性磷酸酶结合物；
步骤(3)中，所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比为1：(0.8-4)；所述含游离巯基的抗原蛋白与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1：(5-20)，所述N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1：(1-5)；所述加入N-乙基马来酰亚胺反应的反应时间为(15-38)min，所述加入乙醇胺反应的反应时间为(15-38)min。
步骤(1)中，碱性磷酸酶与SMCC(即：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)的反应式如下：
步骤(2)中，抗原蛋白与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应式如下：
步骤(3)中，所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白的反应式为：
在其中一些实施方式中，所述加入N-乙基马来酰亚胺反应的反应时间可以为15-20min，21-30min，30-38min。优选所述加入乙醇胺反应的反应时间为(30-38)min，进一步优选为33-38min。
在其中一些实施方式中，所述加入乙醇胺反应的反应时间可以为15-20min，21-30min，30-38min。优选所述加入乙醇胺反应的反应时间为(30-38)min，进一步优选为33-38min。
在其中一些实施方式中，步骤(3)中，所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比可以为1：(0.8-1.5)，1：(1.6-3)，1：(3.1-4)；具体可以为1:0.8，1:0.9，1：1，1:1.1，1:1.2，1:1.3，1：1.4，1:2，1:3，1:4。优选所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比为1：(0.8-1.2)。
在其中一些实施方式中，步骤(3)中，所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应的反应时间为(30-125)min，还可以为30-60min，60-90min，90-125min。优选所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应的反应时间为(115-125)min。
在其中一些实施方式中，步骤(1)中，所述4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和碱性磷酸酶的摩尔比为(5-22):1。可以为(5-10)：1，(10-15)：1，(15-22)：1。具体可以为5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1，11:1，12:1，13:1，14:1，15:1，16:1，17:1，18:1，19:1，20:1，21:1，22:1。优选为(18-22)：1。
在其中一些实施方式中，步骤(2)中，所述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白反应的反应时间为(30-125)min，还可以为30-60min，60-90min，90-125min。优选为(115-125)min。
在其中一些实施方式中，步骤(2)中，所述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白的摩尔比为(4-20)：1。可以为(4-10)：1，(10-15)：1，(15-20)：1。具体可以为4:1，5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1，11:1，12:1，13:1，14:1，15:1，16:1，17:1，18:1，19:1，20:1。优选为(4-6)：1。
在其中一些实施方式中，步骤(1)所述活化的时间为(30-120)min。还可以为30-60min，60-90min，90-120min。
在其中一些实施方式中，步骤(2)所述加入还原剂还原的时间为(20-120)min。还可以为20-60min，60-90min，90-120min。优选为(20-40)min。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
碱性磷酸酶：购自BBI Solution(货号：ALPI10G)
HBsAg抗原：购自北京博尔迈生物技术有限公司(货号：8930)
实施例1：乙肝表面抗原(HBsAg)与碱性磷酸酶结合物的制备
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。其中，碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。其中，HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应35min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:1.5。
实施例2：乙肝表面抗原(HBsAg)与碱性磷酸酶结合物的制备
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应60min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化。碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:10。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应60min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化。HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:10，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:2混匀，室温反应60min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应15min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应15min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:2。
实施例3：乙肝表面抗原(HBsAg)与碱性磷酸酶结合物的制备
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化。碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化。HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应20min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应20min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:1.5。
实施例4：乙肝表面抗原(HBsAg)与碱性磷酸酶结合物的制备
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的PBS缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化。碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:5。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的PBS缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化。HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:20，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:2混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应35min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:20，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:2。
对比例1戊二醛工艺：
采用传统工艺(戊二醛工艺)制备乙肝表面抗原(HBsAg)与碱性磷酸酶结合物：
分别取100μg HBsAg抗原和200μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度均为5mg/mL；加入10μL 1.25％戊二醛溶液中，室温下反应过夜，纯化后得到酶标记物。
对比例2：乙肝表面抗原(HBsAg)与碱性磷酸酶结合物的制备
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与乙醇胺的摩尔比为1:15。
对比例3
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10。
对比例4：
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应180min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。其中，碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:30。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。其中，HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应35min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:1.5。
对比例5：
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。其中，碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应180min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。其中，HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:30，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应35min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:1.5。
对比例6：
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。其中，碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。其中，HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:8混匀，室温反应180min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应35min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应35min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:1.5。
对比例7：
1、碱性磷酸酶的活化及纯化
取100μg碱性磷酸酶，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SMCC(N-马来酰亚胺基甲基)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶。其中，碱性磷酸酶与SMCC的摩尔比为1:20。
2、HBsAg抗原的活化、还原及纯化
取100μg HBsAg抗原，将溶剂置换为pH7.0的HEPES缓冲液，浓度为5mg/mL；按比例加入SPDP(羟基琥珀酰亚胺酯)溶液(用DMF溶解为10mg/mL)，混匀后室温下反应120min，加入一定量DTT(二硫苏糖醇)溶液(用pH为4.0的乙酸缓冲液溶解为20mg/mL)，混匀后室温下反应30min进行还原，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到含游离巯基的HBsAg抗原。其中，HBsAg抗原与SPDP的摩尔比为1:5，DTT与HBsAg抗原的摩尔比为300:1。
3、活化HBsAg抗原与活化碱性磷酸酶的偶连及封闭
将含游离巯基的HBsAg抗原与含马来酰亚胺基的碱性磷酸酶按质量比1:1混匀，室温反应120min，按比例加入N-乙基马来酰亚胺，混匀后室温下反应50min，按比例加入乙醇胺，混匀后室温下反应50min，反应终止后用脱盐柱进行脱盐纯化，得到纯化后的酶标记物，加入适量缓冲溶液和等体积甘油保存在-20℃。含游离巯基的HBsAg抗原与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1:10，N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1:1.5。
检测过程：将样本在全自动化学发光免疫分析仪上进行，将样本与包被着HBsAg抗原的磁珠、HBsAg抗原-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵育、清洗等步骤，形成双抗原夹心免疫复合物，随后将化学发光底物液添加到反应管中，发光底物经碱性磷酸酶水解后产生光信号，经仪器检测得到发光值。
实施例与传统方法(戊二醛工艺)及对比例所得HBsAg抗原酶标记物的化学发光值及信噪比对比如表1所示；37℃热稳定性对比如表2所示：
表1.各实施例及对比例工艺制备得到的HBsAg抗原酶标记物的发光值对比结果
表2.五种工艺制备得到的HBsAg抗原酶标记物的37℃(加速7天)热稳定性对比结果
以上结果表明，采用本发明方法制备得到的HBsAg抗原酶标记物发光值、灵敏度及热稳定性均为最优。其中，未采用本发明方法制备得到的HBsAg抗原酶标记物会存在灵敏度低或热稳定性较差的问题。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)室温下，采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯对碱性磷酸酶进行活化，得到活化的碱性磷酸酶；
(2)室温下，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白反应，再加入还原剂还原，得到含游离巯基的抗原蛋白；
(3)室温下，将步骤(1)所述活化的碱性磷酸酶和步骤(2)所述含游离巯基的抗原蛋白反应，然后加入N-乙基马来酰亚胺反应，再加入乙醇胺反应，得到抗原与碱性磷酸酶结合物；
步骤(3)中，所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比为1：(0.8-4)；所述含游离巯基的抗原蛋白与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比为1：(5-20)，所述N-乙基马来酰亚胺与乙醇胺的摩尔比为1：(1-5)；所述加入N-乙基马来酰亚胺反应的反应时间为(15-38)min，所述加入乙醇胺反应的反应时间为(15-38)min。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述加入N-乙基马来酰亚胺反应的反应时间为(30-38)min；所述加入乙醇胺反应的反应时间为(30-38)min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述含游离巯基的抗原蛋白与所述活化的碱性磷酸酶的质量比为1：(0.8-1.2)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述活化的碱性磷酸酶和所述含游离巯基的抗原蛋白在室温下反应的反应时间为(30-125)min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和碱性磷酸酶的摩尔比为(5-22):1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白反应的反应时间为(30-125)min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与抗原蛋白的摩尔比为(4-20)：1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述活化的时间为(30-120)min；和/或，步骤(2)所述加入还原剂还原的时间为(20-120)min。
9.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述抗原蛋白为乙肝表面抗原；和/或，步骤(2)所述还原剂为二硫苏糖醇。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制备的抗原与碱性磷酸酶结合物。
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Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4698420A (en) * | 1985-02-25 | 1987-10-06 | Xoma Corporation | Antibody hybrid molecules and process for their preparation |
| US5403716A (en) * | 1991-01-10 | 1995-04-04 | Teijin Limited | Method for measurement of tissue factor in high sensitivity and measurement kit therefor |
| US6027874A (en) * | 1995-01-23 | 2000-02-22 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Immunoenzymatic conjugate, method for its productions, applications thereof |
| US6156495A (en) * | 1994-02-14 | 2000-12-05 | Abbott Laboratories | Hepatitis GB virus recombinant proteins and uses thereof |
| CN1532286A (zh) * | 1999-08-19 | 2004-09-29 | 协和梅迪克斯株式会社 | 检测或确定hcv核心抗原的方法及其中应用的用于检测或确定的试剂 |
| WO2005019819A1 (en) * | 2003-08-20 | 2005-03-03 | Biosite, Inc. | Methods and compositions for measuring biologically active natriuretic peptides and for improving their therapeutic potential |
| US20050089943A1 (en) * | 2003-10-23 | 2005-04-28 | Kang Cai | Rapid method of determining clearance of prion protein |
| CN1934127A (zh) * | 2003-12-17 | 2007-03-21 | 艾兰制药公司 | Αβ免疫原性肽载体－偶联物及其生产方法 |
| CA3160831A1 (en) * | 2007-07-16 | 2009-01-22 | Genentech, Inc. | Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
| CN103063845A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-04-24 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 一种乙型肝炎病毒表面抗体的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| CN103163294A (zh) * | 2013-03-21 | 2013-06-19 | 厦门市波生生物技术有限公司 | 乙肝5项化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
| US20200209226A1 (en) * | 2017-01-20 | 2020-07-02 | Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co. | Labeled complex, preparation method thereof, kit containing the same, application of kit and detection system comprising kit |
| CN112067826A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-11 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用 |
| CN112269025A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-01-26 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种白介素-6化学发光测定试剂盒及其制备方法 |
| CN112462075A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-03-09 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种碱性磷酸酶标记amh抗体结合物及其制备方法和应用 |
| CN113311174A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-27 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种肌红蛋白抗体-酶标记物及其制备与应用 |
-
2021
- 2021-10-21 CN CN202111229485.8A patent/CN114137203A/zh active Pending
Patent Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4698420A (en) * | 1985-02-25 | 1987-10-06 | Xoma Corporation | Antibody hybrid molecules and process for their preparation |
| US5403716A (en) * | 1991-01-10 | 1995-04-04 | Teijin Limited | Method for measurement of tissue factor in high sensitivity and measurement kit therefor |
| US6156495A (en) * | 1994-02-14 | 2000-12-05 | Abbott Laboratories | Hepatitis GB virus recombinant proteins and uses thereof |
| US6027874A (en) * | 1995-01-23 | 2000-02-22 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Immunoenzymatic conjugate, method for its productions, applications thereof |
| CN1532286A (zh) * | 1999-08-19 | 2004-09-29 | 协和梅迪克斯株式会社 | 检测或确定hcv核心抗原的方法及其中应用的用于检测或确定的试剂 |
| WO2005019819A1 (en) * | 2003-08-20 | 2005-03-03 | Biosite, Inc. | Methods and compositions for measuring biologically active natriuretic peptides and for improving their therapeutic potential |
| US20050089943A1 (en) * | 2003-10-23 | 2005-04-28 | Kang Cai | Rapid method of determining clearance of prion protein |
| CN1934127A (zh) * | 2003-12-17 | 2007-03-21 | 艾兰制药公司 | Αβ免疫原性肽载体－偶联物及其生产方法 |
| CA3160831A1 (en) * | 2007-07-16 | 2009-01-22 | Genentech, Inc. | Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
| CN103063845A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-04-24 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 一种乙型肝炎病毒表面抗体的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法 |
| CN103163294A (zh) * | 2013-03-21 | 2013-06-19 | 厦门市波生生物技术有限公司 | 乙肝5项化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
| US20200209226A1 (en) * | 2017-01-20 | 2020-07-02 | Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co. | Labeled complex, preparation method thereof, kit containing the same, application of kit and detection system comprising kit |
| CN112067826A (zh) * | 2020-09-15 | 2020-12-11 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用 |
| CN112269025A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-01-26 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种白介素-6化学发光测定试剂盒及其制备方法 |
| CN112462075A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-03-09 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种碱性磷酸酶标记amh抗体结合物及其制备方法和应用 |
| CN113311174A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-27 | 宁波瑞源生物科技有限公司 | 一种肌红蛋白抗体-酶标记物及其制备与应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李爱华;唐涛;张惠媛;汪琦;田杰生;李颖;: "细菌磁小体的修饰及其在病原物检测中的应用", 生物物理学报, no. 08 * |
| 王力波;赵武;马玲;吴健敏;: "自体红细胞凝集试验及其在动物传染病诊断中的应用", 中国兽医学报, no. 07 * |
| 赵宜为,杨朝辉,杜正军,王秉瑞: "抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)避孕疫苗的研制", 中国生物制品学杂志, no. 02 * |
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