CN108414736B - 一种利用化学发光增强子修饰的抗体检测目标物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种将化学发光底物的增强子修饰到抗体上，实现对目标物的浓度等进行检测的方法。所述方法包括：将对化学发光信号有增强作用的化合物标记到抗体1上，将化学发光的催化物质如辣根过氧化氢酶、碱性磷酸酶等标记到另一个抗体2上；而鲁米诺、过氧化物等发光底物溶于溶液中，当溶液中存在被测目标物时，抗体1和抗体2与被测物结合，利用催化物质与增强子的空间靠近来增强化学发光效果。本发明是一种均相、不需分离纯化等步骤的检验方法。

Description

一种利用化学发光增强子修饰的抗体检测目标物的方法

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，尤其是涉及一种利用化学发光增强子修饰的抗体检测目标物的方法。

背景技术

免疫法是当前体外诊断试剂领域重要的检测手段。主要检测对象是多种多样的蛋白质(抗原)，主要利用了两种抗体与抗原形成“三明治”结构，实现检测目的。目前绝大多数的免疫方法都是利用固相载体(例如96孔板，模条，磁珠，芯片等)来固定一种抗体，而另一种抗体一般标记有示踪物质(如酶，荧光分子，有色分子等)。通过与被测抗原形成夹心结构后，再清洗掉没有结合到固相载体的抗原和抗体。对剩余的示踪物质进行定量测定，从而实现了对被测抗原的定量过程。

但该方法存在一个问题，就是由于固相载体的存在，使产品的生产成本较高，其中高质量的磁珠成本经常达到试剂总成本的一半以上。而且固相载体的清洗，分离对自动化的仪器要求比较高，所以目前几乎所有的自动化免疫仪器都相当庞大和复杂，使免疫测定的成本一直居高不下。

酶促化学发光中有一个很重要的现象，就是存在一些对化学发光有显著增强效果的化合物，被称之为“增强子”。当增强子存在时，化学发光的信号值会实现几千几万倍的提升。一直以来，增强子都是作为发光底物的一个成分来使用的。即先将抗体固定在固相载体上，并且另外制备用酶来标记的抗体；检测时将两种抗体混合并加入待测抗原，形成抗体包被固相载体-抗原-酶标记抗体的夹心结构，然后洗涤除去未结合的抗原和酶标记抗体，加入增强剂和发光底物，使其发光，通过检测光信号来计算抗原浓度。这种方法存在一定缺陷：第一是如上所述的固相载体的存在提高了仪器复杂性，第二是仍然需要洗涤过程，使检测过程非常复杂。

申请号为CN201010616899.1的专利申请文件公开了一种非分离式测定方法，将增强子标记在抗体1上，发光底物标记在抗体2上，而酶溶解在溶液中。这种方法虽然也不需要洗涤步骤，但是也有明显的缺陷，第一是发光底物的量非常少，发光很快就结束了，对于仪器的信号接收很不利，发射光子数总量少，所以灵敏度偏低；第二是与经典成熟的酶标记技术不同，将发光底物有效地标记到抗体上有较高的技术难度，造成本方法难度较大，成本偏高。而且该方法适用的发光底物十分特殊，合成难度很大，不利于本方法的推广和应用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种利用化学发光增强子修饰的抗体与酶标抗体结合检测目标物的方法。本发明将酶促化学发光的增强子和酶各自修饰到一抗和二抗上，实现了崭新的均相免疫分析手段。

本发明的技术方案如下：

一种利用发光增强子修饰的抗体检测目标物的方法，包括以下部分：

与目标物有结合能力的抗体1，其中抗体1上标记了增强子；

与目标物有结合能力的抗体2，其中抗体2上标记了酶；

抗体1、抗体2的溶液在使用时与发光底物溶液混合，用于目标物的检测；通过测定化学发光信号的高低来测定目标物的浓度。

所述的目标物包括且不限于蛋白质、激素、DNA、RNA、小分子化合物。

所述的抗体1及抗体2是对目标物有结合能力的蛋白质，抗体1与抗体2可以相同也可以不相同。

所述的增强子为对化学发光信号有增强作用的化合物。

所述的增强子包括且不限于以下化合物：吩噁嗪类化合物、对碘苯酚类化合物，杂环类化合物，羧酸类化合物，硼酸类化合物。

所述的酶为能催化化学发光反应、产生光信号的酶。

所述的酶包括且不限于以下种类的酶：过氧化氢酶，辣根过氧化氢酶，碱性磷酸酶。

所述发光底物为环状酰肼。

所述发光底物包括且不限于：鲁米诺、氨基苯二酰一肼、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼、7一二甲基氨基萘-1,2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼。

本发明可测的项目包括但不限于：甲状腺激素：T3、T4、hTSH、FT4、FT3、抗TPO、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。生殖激素：β-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黄体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。肾上腺/垂体激素：皮质醇、尿皮质醇、人生长激素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。贫血因子：维生素B12、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋白等。肿瘤标记物：AFP、CEA、PSA、游离PSA、CAl9-9、CAl25、CAl5-3等。感染性疾病：衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原体抗原确认、弓形体IgG抗体、弓形体IgM抗体、风疹病毒IgG抗体、风疹病毒IgM抗体、巨细胞病毒IgG抗体、巨细胞病毒IgM抗体等。糖尿病：胰岛素、C肽等。心血管系统：肌酸激酶MB同工酶、地高辛、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白-I等。病毒标记物：HIVl/2Ab、HBsAg、HBsAg确认、HBsAb、HCVAb、HAV IgM、HAVAb、HBcAb、HBclgM、HBeAg、HBeAb等。骨代谢：骨胶原酶、脱氧吡啶啉等。过敏性疾病：总IgE、特异性IgE等。治疗药物监测：茶碱、地高辛、环孢素、巴比妥等。

所述的目标物包括且不限于蛋白质、激素、DNA、RNA、小分子化合物。目标物可以来自于血液、血浆、血清、尿液、精液、唾液、细胞培养物、组织提取液等等。还可以来自于其他类型的样品，如各种溶剂、海水、工业用水样品、食用样品和环境样品，如土壤、水、植物材料、真核生物、细菌、质粒、病毒、真菌、以及源于原核生物的细胞。

所述的抗体1及抗体2是对目标物有结合能力的蛋白质，抗体1与抗体2可以相同也可以不相同。抗体1上标记增强子的方法主要有：NHS活化酯法和EDC耦合法等方法。抗体2上标记酶的方法主要包括：高碘酸钠法，戊二醛法，桥接法，NHS活化酯法等方法。

所述的增强子为对化学发光信号有增强作用的化合物。包括且不限于以下化合物：吩噁嗪类化合物、对碘苯酚类化合物，杂环类化合物，羧酸类化合物，硼酸类化合物。

所述的酶为能催化化学发光反应、产生光信号的酶。包括且不限于以下种类的酶：过氧化氢酶，辣根过氧化氢酶，碱性磷酸酶。

增强化学发光技术的工作原理是，通过使用氧化剂，使发光物体在辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的催化氧化作用下，呈现活跃状态，以在激发状态向着基态转化的过程中出现发光。

辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP/ALP)是增强化学发光酶免疫分析常用的两种标记体系，它们有各自的发光底物。HRP可催化氧化发光的底物种类很多，适合的底物包括鲁米诺及结构相近的分子。

本发明有益的技术效果在于：

本发明将增强子分子通过化学键偶联到抗体上，将具有示踪效果的酶分子偶联到二抗分子上；而溶液中含有除增强子之外的发光底物的全部成分。当测试溶液配好后，加入被测样本，如果被测样本中含有待测抗原，抗原抗体结合时，一抗和二抗在空间上的接近，使增强子在近距离发挥增强化学发光的效果，从而使形成了抗原抗体的夹心结构产生强烈的化学发光。根据信号强弱，就可以推算出被测抗原的浓度。若溶液中不含待测抗原，或者抗原浓度极低，则标记了增强子的一抗和标记了酶的二抗空间上各自远离，无法共同发挥作用来产生明显的化学发光现象。

本发明的优点在于：第一，不需要使用任何固相载体，是一种“均相”免疫化学发光体系；第二，不需要洗涤、分离纯化的步骤，大大简化了检测步骤的复杂性；第三，本发明的发光底物量很充分，可以提供长时间的发光；四，本发明的酶耦合在抗体上，可以反复使用、反复催化发光；五、本发明在测试过程中，酶和增强子是直接耦合的，形成了靶向效应，排除了外界杂质的干扰，灵敏度大大提高。

与申请号为CN201010616899.1的专利申请文件相比，本发明针对其缺陷，做出实质性的改进。不再将发光底物标记到抗体2上，而是将酶标记到抗体2上，一方面酶是廉价易得的，另一方面标记方法成熟可靠。而且本方法可以选择多种多样的化学发光底物(而前述专利只能选择有限的几个发光底物)，本方法具有更加广泛的推广和应用前景。

综合以上所述，本发明工艺简单，成本低，测试灵敏度高，测试结果准确，适用于各种自动化检测仪器，是化学发光免疫法的重大改进。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行具体描述。本发明的具体实现方法如下：

(1)制备偶联了增强子的抗体1(一抗)

(2)制备酶标抗体2(二抗)

(3)将上述两种抗体以及部分化学发光底物配成溶液，形成试剂盒。

(4)检测试剂盒的使用，主要是将被测样本与上述溶液混合，待充分孵育后，加入化学发光底物的另一成分，产生化学发光信号。测定该信号获得抗原浓度信息。

不同的化学发光体系的具体制备方法和操作方法有所不同。

实施例：

以吩噁嗪类化合物为增强子，以HRP酶为示踪分子的AFP(甲胎蛋白)检测试剂盒的制备如下例所示

实施例1吩噁嗪活化酯的制备

将吩噁嗪-10-基-乙酸0.27g(1mMol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.17g(1.5mMol)，双环己基碳酰亚胺(DCC)0.31g(1.5mMol)混合。加入2ml的无水DMSO。震荡溶解后，室温反应36小时。获得吩噁嗪的活化酯。本活化酯可以冷冻后长期使用。

实施例2AFP一抗上标记吩噁嗪

将实施例1中制备的活化酯1.3微升加入到AFP一抗的溶液中(含有10mg鼠源单克隆抗体)。活化酯与抗体的摩尔比为10:1。两者室温反应6小时后进行三次透析(生理盐水中进行)。获得吩噁嗪标记的抗体溶液，用生理盐水稀释到100ug/ml的浓度待用。

实施例3试剂盒的组成

R1试剂：含有2ug/ml的AFP一抗(吩噁嗪标记)，含有2ug/ml的AFP二抗(HRP酶标记)，含有0.1％浓度的鲁米诺，介质为0.1M PBS pH＝7.4。

R2试剂：含有0.1％的双氧水。

化学发光检测仪器：安图公司产LUMO化学发光免疫分析仪

实施例4试剂盒使用具体操作

向96孔化学发光微孔板中加入50ul R1试剂和50ul的待测血清(对照实验用生理盐水)。37℃下孵育15分钟后加入50ul的R2试剂。立即测定化学发光的强度RLU值。根据RLU值的高低计算出待测血清中AFP的浓度值。使用罗氏诊断的AFP检测试剂盒作为参比试剂得到的结果如下表1所示：

表1

检测结果显示，用本方法开发的AFP检测试剂盒，与罗氏对照试剂的相关性(R平方)达到0.98以上。检测限达到0.1ng/mL以下。由表1的结果可以看到，本发明提供的新型AFP检测试剂盒可以获得与罗氏诊断试剂盒十分相近的检测结果。而本发明的方法简单，不需要复杂仪器，可大幅度提升检测效率，压缩检测成本。是一种很有广阔应用前景的均相免疫化学发光技术。

Claims (7)

1.一种利用发光增强子修饰的抗体检测目标物的方法，其特征在于包括以下部分：

与目标物有结合能力的抗体1，其中抗体1上标记了增强子；

与目标物有结合能力的抗体2，其中抗体2上标记了酶；

抗体1、抗体2的溶液在使用时与发光底物溶液混合，用于目标物的检测；通过测定化学发光信号的高低来测定目标物的浓度；

所述的增强子为对化学发光信号有增强作用的化合物；

所述的增强子包括且不限于以下化合物：吩噁嗪类化合物、对碘苯酚类化合物，杂环类化合物，羧酸类化合物，硼酸类化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的目标物包括且不限于蛋白质、激素、DNA、RNA、小分子化合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的抗体1及抗体2是对目标物有结合能力的蛋白质，抗体1与抗体2可以相同也可以不相同。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶为能催化化学发光反应、产生光信号的酶。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述的酶包括且不限于以下种类的酶：过氧化氢酶，辣根过氧化氢酶，碱性磷酸酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发光底物为环状酰肼。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：所述发光底物包括且不限于：鲁米诺、氨基苯二酰一肼、异氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基异氨基苯二酰一肼、氨基己基乙基异氨基苯二酰一肼、7一二甲基氨基萘-1, 2-二羧酸酰肼、环取代的氨基邻苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1, 2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羟基-邻苯二甲酰肼、6-羟基邻苯二甲酰肼。