CN111122879B - 新型冠状病毒重组抗原的包被液、预处理方法及应用和产品 - Google Patents

新型冠状病毒重组抗原的包被液、预处理方法及应用和产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了新型冠状病毒重组抗原的包被液、预处理方法及应用和产品。本发明提供的新型冠状病毒重组抗原的包被液，由PBS缓冲液、酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖、Proclin300和水组成，各组分相互协调配合作用能够有效提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性，有效提高新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度和特异性。此外，发明人通过利用DNA水解酶处理新型冠状病毒重组抗原，将新型冠状病毒重组抗原内的宿主DNA片段随机分解，生成寡核苷酸，消除DNA片段对后期抗原检测抗体的干扰，结果显著。

Description

新型冠状病毒重组抗原的包被液、预处理方法及应用和产品
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒重组抗原的包被液、预处理方法及应用和产品。
背景技术
2019 年 12月开始，出现了一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道传染病即新型冠状病毒肺炎（COVID-19）。
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）。已知感染人的冠状病毒有 6种，包括α属的 229E和NL63，β属的OC43 和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERSr-CoV）和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr-CoV）。此次出现的冠状病毒为一种属于β属的新型冠状病毒。冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径 50-200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。
目前新冠肺炎检测方式主要是针对病毒核酸的检测，但因为各种原因，如咽拭子采样手法、部位，样本前处理过程，核酸试剂检测下限等问题，并不是所有疑似的患者都能准确的检测出结果，存在一定概率的假阳性或假阴性。而且核酸检测对操作要求高，检测时间相当长。
CT也可为COVID-19的早期诊断及治疗提供重要依据，但胸部CT影像只是胸部X光（CT或胸片）的表现，这种阴影在各种肺病都可以出现，比如:病毒性肺炎、细菌性肺炎、支原体肺炎、肺部肿瘤、肺结核扩散期和矽肺都会出现，所以，只依据胸部CT影像作为诊断依据是有局限性的，同时CT 也容易产生交叉感染。
新型冠状病毒基因编码多个结构蛋白，例如N蛋白、E蛋白和S蛋白等。新型冠状病毒的上述抗原，可作为免疫原，在病毒感染人体后，刺激浆细胞产生特异性抗体，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗原检测抗体的存在，从而间接证明人体已感染新型冠状病毒。
抗体检测试剂均基于抗原与抗体特异性结合的免疫学原理，常用的方法学主要有胶体金法，免疫荧光层析法、酶联免疫法和化学发光法。抗体检测试剂的关键是获得高度灵敏且特异的天然抗原或重组抗原用于检测。鉴于天然抗原的高风险性，重组抗原成为检测新型冠状病毒抗体的首选。
现有检测新型冠状病毒抗体的检测试剂均直接使用重组抗原用于包被，为了提高检测的灵敏度和准确性，目前的研究方向主要为抗原表位的筛选，主要涉及基因工程、蛋白质工程等，但是这些研究热点的时间、人力和资源成本都很高。同时，为提升包被后的重组抗原在检测试剂中的稳定性，包被液的研究、选用至关重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种新型冠状病毒重组抗原的包被液。
本发明的第二目的在于提供一种预处理新型冠状病毒重组抗原的方法。
本发明的第三目的在于提供上述包被液或方法的应用。
本发明的第四目的在于提供一种新型冠状病毒抗体检测试剂卡。
本发明的第五目的在于提供一种非诊断目的检测新型冠状病毒抗体的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种新型冠状病毒重组抗原的包被液，该包被液由PBS缓冲液、酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖、Proclin300和水组成。
进一步地，所述PBS缓冲液浓度为0.01M~0.04M；
优选地，所述PBS缓冲液浓度为0.02M，所述酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.1~2%、0.05~0.2%、1~6%、2~8%以及0.01~0.03%；
优选地，所述PBS缓冲液浓度为0.01M或0.04M，所述酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.2~1%、0.07~0.14%、2~4%、3~6%以及0.015~0.026%；
优选地，所述酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.4~0.8%、0.09~0.12%、2.5~3.5%、4~5.5%以及0.018~0.023%；
优选地，所述酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.5%、0.1%、3%、5%以及0.02%。
进一步地，所述酸性氨基酸包括天冬氨酸和/或谷氨酸。
进一步地，所述新型冠状病毒重组抗原为DNA水解酶预处理的新型冠状病毒重组抗原；
优选地，所述DNA水解酶为Recombinant DNase I；
优选地，所述Recombinant DNase I与新型冠状病毒重组抗原的用量为0.5-2U：1mg。
一种预处理新型冠状病毒重组抗原的方法，所述方法包括利用DNA水解酶处理新型冠状病毒重组抗原的步骤。
进一步地，所述DNA水解酶为Recombinant DNase I；
优选地，所述Recombinant DNase I与新型冠状病毒重组抗原的用量为0.5-2U：1mg；
优选地，DNA水解酶处理的新型冠状病毒重组抗原为经蛋白纯化后的新型冠状病毒重组抗原。
上述包被液或方法在制备新型冠状病毒抗体检测产品中的应用。
进一步地，所述新型冠状病毒抗体检测产品用于化学发光法检测、ELISA检测或胶体金快速检测。
一种新型冠状病毒抗体检测试剂卡，由新型冠状病毒重组抗原包被膜分别与标记物结合垫、吸水纸、PVC板组装而成，所述新型冠状病毒重组抗原包被膜由上述包被液稀释所述新型冠状病毒重组抗原后包被于硝酸纤维素膜形成；
优选地，所述新型冠状病毒重组抗原为利用上述方法预处理后的新型冠状病毒重组抗原。
一种非诊断目的检测新型冠状病毒抗体的方法，所述方法利用上述检测试剂卡检测血液样本中的新型冠状病毒抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的新型冠状病毒重组抗原的包被液，由PBS缓冲液、酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖、Proclin300和水组成，各组分相互协调配合作用能够有效提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性，有效提高新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度和特异性。
经研究发现，新型冠状病毒重组抗原的核衣壳蛋白（N）由3个结构域构成，其中结构域1和2富含精氨酸和赖氨酸残基。本发明创造性地在包被液中添加带负电荷的酸性氨基酸，其能与N蛋白中带正电荷的碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸残基形成盐桥作用，从而提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性。包被液中添加的BSA为惰性蛋白，能够封闭新型冠状病毒重组抗原中的非特异性位点，从而提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的特异性。包被液中添加的甘露醇为共沉淀剂，能够增加蛋白疏水性有利于重组抗原在硝酸纤维素膜上的结合。
同时，发明人在研究工作中发现通过现有蛋白质表达技术表达出的抗原内会都含有大量的宿主DNA片段，而这些DNA片段会对后期抗原检测抗体产生干扰，这一干扰现象在新型冠状病毒中尤为严重，这使得新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度低，检测效果不理想。对此，发明人通过利用DNA水解酶处理新型冠状病毒重组抗原，将新型冠状病毒重组抗原内的宿主DNA片段随机分解，生成寡核苷酸，消除DNA片段对后期抗原检测抗体的干扰，结果显著，该操作显著提高了新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度，在一定程度上降低了新型冠状病毒抗体检测的成本，而且操作简便，为产品的研发提供了新的方向和选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例新型冠状病毒抗体试剂卡未预处理组测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号，纵坐标表示显色强度，◇表示样本、□表示对比例测试结果；
图2为本发明实施例新型冠状病毒抗体试剂卡的未预处理组和进行预处理组的测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号（序号1-30表示样本，序号31-40表示对比例），纵坐标表示显色强度，◇表示未预处理组、□表示预处理组测试结果；
图3为本发明实施例SARS病毒抗体试剂卡未进行预处理组测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号，纵坐标表示显色强度，◇表示样本、□表示对比例测试结果；
图4为本发明实施例SARS病毒抗体试剂卡的未预处理组和进行预处理组的测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号（序号1-30表示样本，序号31-40表示对比例），纵坐标表示显色强度，◇表示未预处理组、□表示预处理组测试结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种新型冠状病毒重组抗原的包被液，该包被液由PBS缓冲液、酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖、Proclin300和水组成。
本发明提供的新型冠状病毒重组抗原的包被液，由PBS缓冲液、酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖、Proclin300和水组成，各组分相互协调配合作用能够有效提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性，有效提高新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度和特异性。
经研究发现，新型冠状病毒重组抗原的核衣壳蛋白（N）由3个结构域构成，其中结构域1和2富含精氨酸和赖氨酸残基。本发明创造性地在包被液中添加带负电荷的酸性氨基酸（天冬氨酸和/或谷氨酸等），其能与N蛋白中带正电荷的碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸残基形成盐桥作用，从而提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性。包被液中添加的BSA为惰性蛋白，能够封闭新型冠状病毒重组抗原中的非特异性位点，从而提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的特异性。包被液中添加的甘露醇为共沉淀剂，能够增加蛋白疏水性有利于重组抗原在硝酸纤维素膜上的结合。
在优选的实施方式中，PBS缓冲液浓度为0.01M~0.04M。PBS缓冲液浓度可以但不限于为0.01 M、0.02 M、0.03 M或0.04 M。可以理解的是，“M”是指“mol/L”。
在更优选的实施方式中，PBS缓冲液浓度为0.02M，酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.1~2%、0.05~0.2%、1~6%、2~8%以及0.01~0.03%。酸性氨基酸的浓度可以但不限于为0.1%、0.2%、0.4%、0.5%、0.8%、1%、1.3%、1.5%、1.8%或2%；BSA的浓度可以但不限于为0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.12%、0.14%、0.16%或0.2%；甘露醇的浓度可以但不限于为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%或6%；海藻糖的浓度可以但不限于为2%、3%、4%、5%、6%、7%或8%；Proclin300的浓度可以但不限于为0.01%、0.015%、0.018%、0.02%、0.023%、0.026%、0.029%或0.03%。
在更优选的实施方式中，PBS缓冲液浓度为0.01M或0.04M，酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.2~1%、0.07~0.14%、2~4%、3~6%以及0.015~0.026%。
进一步优选地，酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.4~0.8%、0.09~0.12%、2.5~3.5%、4~5.5%以及0.018~0.023%。更优选地，酸性氨基酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.5%、0.1%、3%、5%以及0.02%。
在一些实施方式中，酸性氨基酸可以为天冬氨酸和/或谷氨酸等等。此外，新型冠状病毒重组抗原优选为DNA水解酶预处理的新型冠状病毒重组抗原，经NDA水解酶预处理后的新型冠状病毒重组抗原再利用上述的包被液进行包被，可以显著提高抗体检测的灵敏度和特异性。例如，DNA水解酶为Recombinant DNase I，Recombinant DNase I与新型冠状病毒重组抗原的用量为0.5-2U：1mg。
本发明还要保护一种预处理新型冠状病毒重组抗原的方法，该方法包括利用DNA水解酶处理新型冠状病毒重组抗原的步骤。
目前的新型冠状病毒抗体检测试剂均是直接将新型冠状病毒重组抗原用于包被，然后对抗体进行检测，其中，新型冠状病毒重组抗原一般都是通过宿主表达制备。发明人在研究工作中发现通过现有蛋白质表达技术表达出的抗原内都会含有大量的宿主DNA片段，而这些DNA片段会对后期抗原检测抗体产生干扰，这一干扰现象在新型冠状病毒中尤为严重，这使得新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度低，检测效果不理想。对此，发明人通过利用DNA水解酶处理新型冠状病毒重组抗原，将新型冠状病毒重组抗原内的宿主DNA片段随机分解，生成寡核苷酸，消除DNA片段对后期抗原检测抗体的干扰，结果显著，该操作显著提高了新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度，在一定程度上降低了新型冠状病毒抗体检测的成本，而且操作简便，为产品的研发提供了新的方向和选择。需要说明的是，DNA水解酶处理新型冠状病毒重组抗原的步骤位于新型冠状病毒重组抗原包被制备抗体检测试剂之前，即预处理后的新型冠状病毒重组抗原可直接用于抗体检测试剂的制备。
在优选的实施方式中，DNA水解酶为Recombinant DNase I；Recombinant DNase I与新型冠状病毒重组抗原的用量为0.5-2U：1mg，即每1mg的新型冠状病毒重组抗原用0.5-2U的DNA水解酶处理，进一步优选为每1mg抗原添加1U DNA水解酶处理。
DNA水解酶处理的新型冠状病毒重组抗原为经蛋白纯化后的新型冠状病毒重组抗原。新型冠状病毒重组抗原通过基因工程的手段在宿主中进行表达后需要通过蛋白纯化才能得到用于后期包被检测的新型冠状病毒重组抗原，而该经蛋白纯化后的新型冠状病毒重组抗原中还含有宿主DNA片段，此时利用DNA水解酶处理经蛋白纯化后的新型冠状病毒重组抗原可以降解DNA片段，消除干扰。
本发明还保护上述包被液或方法在制备新型冠状病毒抗体检测产品中的应用。可以理解的是，本发明得到的新型冠状病毒重组抗原可以应用于现有技术中检测新型冠状病毒抗体的常规手段中，例如化学发光法、ELISA或胶体金快速检测法等等，所以，新型冠状病毒抗体检测产品具体可以为新型冠状病毒抗体化学发光法检测试剂盒、新型冠状病毒抗体酶联免疫法检测试剂盒、新型冠状病毒抗体胶体金检测试剂盒等等。
本发明还保护一种新型冠状病毒抗体检测试剂卡，由新型冠状病毒重组抗原包被膜分别与标记物结合垫、吸水纸、PVC板组装而成，新型冠状病毒重组抗原包被膜由本发明提供的包被液稀释新型冠状病毒重组抗原后包被于硝酸纤维素膜形成。优选地，新型冠状病毒重组抗原为利用本发明提供的方法预处理后的新型冠状病毒重组抗原。
一种非诊断目的检测新型冠状病毒抗体的方法，该方法利用本发明提供检测试剂卡检测血液样本中的新型冠状病毒抗体。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
1）材料厂家：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠均购于广州化学试剂厂；海藻糖购于南京中诺生物工程有限责任公司；谷氨酸、BSA、甘露醇、Proclin300购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；预处理剂Recombinant DNase I购于Takara Bio；硝酸纤维素膜购于Sartorius，型号CN95；
设备厂家：喷金划膜仪来源于BioDot，型号XYZ3210；鼓风干燥箱来源于上海精宏实验设备有限公司，型号DHG-9053A；恒温孵育箱来源于上海精宏实验设备有限公司，型号GNP-9050。
2）重组抗原包被液配制
a PBS缓冲液配制：称取磷酸氢二钠0.145g、磷酸二氢钠0.012g、氯化钠0.85g溶于100ml的去离子水中，得到摩尔浓度为10mM PBS缓冲液；称取磷酸氢二钠0.29g、磷酸二氢钠0.024g、氯化钠0.85g溶于100ml的去离子水中，得到摩尔浓度为20mM PBS缓冲液；称取磷酸氢二钠0.58g、磷酸二氢钠0.048g、氯化钠0.85g溶于100ml的去离子水中，得到摩尔浓度为40mM PBS缓冲液。
b 包被液配制：分别取上述配制的10mM、20mM、40mM的PBS缓冲液各100ml，按表1中的物质量进行配制，搅拌至全部组份溶解，即得到包被液，共需配制出30份样本和10份对比例。
表1 包被液组份汇总表
物质 样本 PBS缓冲液（mM） 谷氨酸（g） BSA （g） 甘露醇（g） 海藻糖（g） Proclin300（ml）
样本1 10 0.05 0.03 0.5 1.5 0.005
样本2 10 0.1 0.05 1 2 0.01
样本3 10 0.2 0.07 2 3 0.015
样本4 10 0.4 0.09 2.5 4 0.018
样本5 10 0.5 0.1 3 5 0.02
样本6 10 0.8 0.12 3.5 5.5 0.023
样本7 10 1 0.14 4 6 0.026
样本8 10 1.5 0.16 5 7 0.029
样本9 10 2 0.2 6 8 0.03
样本10 10 2.5 0.22 7 8.5 0.033
样本11 20 0.05 0.03 0.5 1.5 0.005
样本12 20 0.1 0.05 1 2 0.01
样本13 20 0.2 0.07 2 3 0.015
样本14 20 0.4 0.09 2.5 4 0.018
样本15 20 0.5 0.1 3 5 0.02
样本16 20 0.8 0.12 3.5 5.5 0.023
样本17 20 1 0.14 4 6 0.026
样本18 20 1.5 0.16 5 7 0.029
样本19 20 2 0.2 6 8 0.03
样本20 20 2.5 0.22 7 8.5 0.033
样本21 40 0.05 0.03 0.5 1.5 0.005
样本22 40 0.1 0.05 1 2 0.01
样本23 40 0.2 0.07 2 3 0.015
样本24 40 0.4 0.09 2.5 4 0.018
样本25 40 0.5 0.1 3 5 0.02
样本26 40 0.8 0.12 3.5 5.5 0.023
样本27 40 1 0.14 4 6 0.026
样本28 40 1.5 0.16 5 7 0.029
样本29 40 2 0.2 6 8 0.03
样本30 40 2.5 0.22 7 8.5 0.033
对比例1 20 0 0.07 2 3 0.015
对比例2 20 0 0.1 3 5 0.02
对比例3 20 0 0.14 4 6 0.026
对比例4 20 0.2 0 2 3 0.015
对比例5 20 0.5 0 3 5 0.02
对比例6 20 1 0 4 6 0.026
对比例7 20 0.2 0.07 0 3 0.015
对比例8 20 0.5 0.1 0 5 0.02
对比例9 20 1 0.14 0 6 0.026
对比例10 20 0 0 0 5 0.02
稳定性研究
用上述配制好的包被液稀释新型冠状病毒重组抗原（来源于中国科学院武汉病毒研究所），稀释后的新型冠状病毒重组抗原终浓度均为1.0mg/ml。
1）新型冠状病毒重组抗原包被：将稀释后的新型冠状病毒重组抗原使用喷金划膜仪，包被于硝酸纤维素膜，划膜参数1.0μl/cm。包被完成后置于鼓风干燥箱中干燥，干燥温度37℃，干燥时间24小时，得到新型冠状病毒重组抗原包被膜。
2）试剂卡制作：使用上述新型冠状病毒重组抗原包被膜分别与标记物结合垫（含有胶体金标记的抗人IgM抗体）、吸水纸、PVC板组装成试剂卡。
3）试剂卡加速破坏：将上述试剂卡分别用铝箔袋装好并封袋。置于37℃恒温孵育箱中加速破坏，加速破坏时间20天。
4）加速破坏试剂卡测试：将上述加速破坏后的试剂卡用新型冠状病毒抗体质控品（企业自制）进行检测，质控品包括10例阳性样本（P1-P10）,10例阴性样本（N1-N10），测试结果如下表2：
表2 加速破坏后试剂卡测试结果汇总表
Figure 358314DEST_PATH_IMAGE001
从结果来看，经过37℃、20天的加速破坏后，采用样本1-30包被液进行包被的试剂卡无论是阳性样本还是阴性样本符合率均在70%以上，即在整体优于对比例1-10包被液进行包被的试剂卡的检测结果，表明本发明提供的新型冠状病毒重组抗原包被液能够提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性。
样本12-19包被液进行包被的试剂卡无论是阳性质控品还是阴性质控品符合率均在90%以上，表明在20mM的PBS缓冲液环境中，质量百分浓度分别为0.1~2%的谷氨酸、0.05~0.2%的BSA、1~6%的甘露醇、2~8%的海藻糖以及0.01~0.03%的Proclin300时，新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性表现优异。
样本4-6、13-19、24-26包被液进行包被的试剂卡无论是阳性质控品还是阴性质控品均符合，表明在10-40mM PBS缓冲液和质量百分浓度为0.4~0.8%谷氨酸、0.09~0.12%BSA、2.5~3.5%甘露醇、4~5.5%海藻糖以及0.018~0.023%Proclin300的情况下，新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性更优。
对比例1与样本13比较、对比例2与样本15比较、对比例3与样本17比较，对比例1-3的漏检次数明显高于样本13、15、17，表明谷氨酸能有效提高新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的稳定性。
灵敏度研究
用上述配制好的包被液稀释预处理后的新型冠状病毒重组抗原，稀释后的新型冠状病毒重组抗原终浓度均为1.0mg/ml。
预处理步骤：在新型冠状病毒重组抗原（来源于中国科学院武汉病毒研究所）中按照每毫克重组抗原添加1U 预处理剂Recombinant DNase I的比例加入预处理剂Recombinant DNase I，充分混匀后置于恒温孵育箱中反应1小时。
1）新型冠状病毒重组抗原包被：将稀释后的新型冠状病毒重组抗原使用喷金划膜仪，包被于硝酸纤维素膜，划膜参数1.0μl/cm。包被完成后置于鼓风干燥箱中干燥，干燥温度37℃，干燥时间24小时，得到新型冠状病毒重组抗原包被膜。
2）试剂卡制作：使用上述新型冠状病毒重组抗原包被膜分别与标记物结合垫（含有胶体金标记的抗人IgM抗体）、吸水纸、PVC板组装成试剂卡。
3）试剂卡测试：将上述试剂卡用新型冠状病毒抗体质控品（企业自制）进行检测，质控品包括10例阳性样本（P1-P10）,10例阴性样本（N1-N10），测试结果如下表3：
表3 试剂卡测试结果汇总表
Figure 138051DEST_PATH_IMAGE002
从结果来看，相对于未进行预处理的组（即表2所示结果）来说，采用本发明所述的预处理方法后，符合率明显提升，能够有效消除宿主DNA片段对新型冠状病毒重组抗原的干扰，提高新型冠状病毒抗体检测试剂的灵敏度。
样本12-19包被液进行包被的试剂卡无论是阳性质控品还是阴性质控品符合率均为100%，表明在20mM的PBS缓冲液环境中，质量百分浓度分别为0.1~2%的谷氨酸、0.05~0.2%的BSA、1~6%的甘露醇、2~8%的海藻糖以及0.01~0.03%的Proclin300时，进行本发明所述的预处理剂进行预处理后，新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的灵敏度进一步提高。
样本3-7包被液进行包被的试剂卡无论是阳性质控品还是阴性质控品符合率均为100%，表明在10mM的PBS缓冲液环境中，质量百分浓度分别为0.2~1%的谷氨酸、0.07~0.14%的BSA、2~4%的甘露醇、3~6%的海藻糖以及0.015~0.026%的Proclin300时，进行本发明所述的预处理剂进行预处理后，新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的灵敏度进一步提高。
样本23-27包被液进行包被的试剂卡无论是阳性质控品还是阴性质控品符合率均为100%，表明在40mM的PBS缓冲液环境中，质量百分浓度分别为0.2~1%的谷氨酸、0.07~0.14%的BSA、2~4%的甘露醇、3~6%的海藻糖以及0.015~0.026%的Proclin300时，进行本发明所述的预处理剂进行预处理后，新型冠状病毒重组抗原在检测试剂中的灵敏度进一步提高。
特异性研究
用上述配制好的包被液稀释预处理和未进行预处理SARS病毒（SARS-CoV）重组抗原，稀释后重组抗原终浓度均为1.0mg/ml。
预处理步骤：在SARS病毒重组抗原（来源于厦门慧嘉生物科技有限公司）中按照每毫克重组抗原添加1U 预处理剂Recombinant DNase I的比例加入预处理剂RecombinantDNase I，充分混匀后置于恒温孵育箱中反应1小时。
1）SARS病毒重组抗原包被：将稀释后的SARS病毒重组抗原使用喷金划膜仪，包被于硝酸纤维素膜，划膜参数1.0μl/cm。包被完成后置于鼓风干燥箱中干燥，干燥温度37℃，干燥时间24小时，得到SARS病毒重组抗原包被膜。
2）试剂卡制作：使用上述SARS病毒重组抗原包被膜分别与标记物结合垫（含有胶体金标记的抗人IgM抗体）、吸水纸、PVC板组装成试剂卡。
3）SARS病毒抗体试剂卡测试：将上述试剂卡用SARS病毒抗体质控品（企业自制）进行检测，并与标准比色卡（企业自制）对比，L1-L10表示显色强度由低到高，显色强度越高表示反应性越强，灵敏度越高，测试结果如图3、4所示。
4）新型冠状病毒抗体试剂卡测试：按上述稳定性研究和灵敏度研究中所述方法制作试剂卡（应当理解，不进行加速破坏），即制作出未预处理新型冠状病毒抗体试剂卡和预处理新型冠状病毒抗体试剂卡，将该两类试剂卡用新型冠状病毒抗体质控品（企业自制）进行检测，并与标准比色卡（企业自制）对比，测试结果如图1、2所示。
图1表示新型冠状病毒抗体试剂卡未预处理组测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号，纵坐标表示显色强度，◇表示样本、□表示对比例测试结果。
从图1来看，本发明提供的包被液相对于对比例包被液，对显色强度有明显的改善作用，本发明提供的不同浓度包被液之间也表现出对显色强度不同的改善作用，具体的，在样本3-6、12-19、24-27中，显色强度均达到7或以上，表明反应性强，灵敏度高。
图2表示新型冠状病毒抗体试剂卡的未预处理组和进行预处理组的测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号（序号1-30表示样本，序号31-40表示对比例），纵坐标表示显色强度，◇表示未预处理组、□表示预处理组测试结果。
从图2来看，本发明提供的预处理方法对新型冠状病毒抗体检测有明显的改善作用，即使是对比例所提供的包被液也能体现改善作用。
图3表示SARS病毒抗体试剂卡未进行预处理组测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号，纵坐标表示显色强度，◇表示样本、□表示对比例测试结果。
从图3来看，无论是本发明所述的包被液还是对比例所述包被液，抑或是不同浓度的包被液之间，对显色强度无明显作用，即本发明所述的包被液对SARS病毒抗体检测没有明显的改善作用，表明本发明所述的包被液对新型冠状病毒重组抗原具有特异性。
图4表示SARS病毒抗体试剂卡的未预处理组和进行预处理组的测试结果，图中横坐标表示样本/对比例编号（序号1-30表示样本，序号31-40表示对比例），纵坐标表示显色强度，◇表示未预处理组、□表示预处理组测试结果。
从图4来看，无论对SARS病毒重组抗原是否进行预处理，也无论采用的是本发明所述包被液或是对比例包被液，对SARS病毒抗体检测没有明显的改善作用，表明本发明所述的预处理对新型冠状病毒重组抗原具有特异性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (7)

1.一种新型冠状病毒重组抗原的包被液，其特征在于，该包被液由PBS缓冲液、谷氨酸、BSA、甘露醇、海藻糖、Proclin300和水组成，所述PBS缓冲液浓度为0.01M~0.04M，所述谷氨酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.4~0.8%、0.09~0.12%、2.5~3.5%、4~5.5%以及0.018~0.023%。
2.根据权利要求1所述的包被液，其特征在于，所述谷氨酸、BSA、甘露醇、海藻糖以及Proclin300的质量百分浓度分别为0.5%、0.1%、3%、5%以及0.02%。
3.根据权利要求1或2所述的包被液，其特征在于，所述新型冠状病毒重组抗原为DNA水解酶预处理的新型冠状病毒重组抗原；
所述DNA水解酶为Recombinant DNase I；
所述Recombinant DNase I与新型冠状病毒重组抗原的用量比为（0.5-2）U：1mg。
4.权利要求1-3任一项所述的包被液在制备新型冠状病毒抗体检测产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒抗体检测产品用于化学发光法检测、ELISA检测或胶体金快速检测。
6.一种新型冠状病毒抗体检测试剂卡，其特征在于，由新型冠状病毒重组抗原包被膜分别与标记物结合垫、吸水纸、PVC板组装而成，所述新型冠状病毒重组抗原包被膜由权利要求1-3任一项所述的包被液稀释所述新型冠状病毒重组抗原后包被于硝酸纤维素膜形成。
7.一种非诊断目的检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求6所述的检测试剂卡检测血液样本中的新型冠状病毒抗体。
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