CN113189330A

CN113189330A - 一种检测冠状病毒的蛋白芯片及其制备方法和检测试剂盒

Info

Publication number: CN113189330A
Application number: CN202110380180.0A
Authority: CN
Inventors: 黄若磐; 方建民; 罗树红; 朱思为; 谢社火; 易玉华
Original assignee: Guangzhou Hanpu Chuangzhan Medical Science Examination Laboratory Co ltd; Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Hanpu Chuangzhan Medical Science Examination Laboratory Co ltd; Reboo Guangzhou Biotechnology Co ltd; Raybiotech Inc
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-07-30

Abstract

本发明公开了一种检测冠状病毒的蛋白芯片，包括载体和芯片抗原，所述芯片抗原为冠状病毒Spike蛋白中不同区域的多肽片段，所述多肽片段排列在所述载体上形成蛋白质微阵列芯片。本发明还公开一种检测冠状病毒的蛋白芯片的制备方法以及冠状病毒检测试剂盒。本发明通过将Spike蛋白不同区域的多肽片段固定在载体上实现了一次测定中高通量筛选多个靶标，可用于检测多种冠状病毒。

Description

一种检测冠状病毒的蛋白芯片及其制备方法和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测冠状病毒的蛋白芯片及其制备方法和检测试剂盒。

背景技术

进入21世纪以来，冠状病毒引起的传染性疾病不断出现。如2003年严重急性呼吸综合征冠状病毒(severeacuterespiratorysyndrome-coronavirus， SARS-CoV)引起的非典型性肺炎和2012年中东呼吸综合征冠状病毒 (MiddleEastrespiratorysyndrome-coronavirus，MERS-CoV)引起的中东呼吸综合征，分别造成约10％和36％的病死率。

冠状病毒家族属于病毒目、冠状病毒科。该家族可进一步细分为α、β、 γ和δ4个属。SARS-CoV-2属于β属，其基因组序列与SARS-CoV有79.5％的相似性，与MERS-CoV有40％的相似性，与蝙蝠SARS样冠状病毒 (bat-SL-CoVZC45)有超过85％的相似性[9-10]。在进化上，形成了与SARS-CoV 和MERS-CoV不同的另外一个分枝。SARS-CoV-2病毒颗粒的直径在50～200nm。它的遗传物质为连续线型单链RNA，基因组全长29891个核苷酸，编码9860 个氨基酸(aa)，GC含量为38％。基因组的5′和3′端各有一个不翻译区，3′端有 PolyA“尾”，内部包含10个基因：开放阅读框1ab(ORF1ab)基因(编码7096aa 的多聚蛋白)、棘突蛋白基因(编码1273aa的棘突蛋白)、ORF3a基因、包膜蛋白基因(编码75aa的包膜蛋白)、膜糖蛋白基因(编码222aa的膜糖蛋白)、ORF6 基因、ORF7a基因、ORF8基因、核衣壳蛋白基因(编码419aa的核衣壳蛋白) 及ORF10基因。

棘突蛋白由S1和S2亚基组成。S1亚基含有信号肽、N末端结构域和受体结合结构域(RBD)，负责介导病毒与宿主细胞膜结合；S2亚基包含融合肽、胞质结构域和跨膜结构域，负责病毒与宿主细胞膜融合。SARS-CoV-2棘突蛋白与 SARS-CoV棘突蛋白的氨基酸序列相似度为76.47％，且二者RBD的3D结构相同，因此，SARS-CoV-2棘突蛋白与人Ⅱ型肺泡细胞表面的血管紧张素转换酶2 分子也具有很强的亲和性，二者的结合很可能是介导SARS-CoV-2进入人体细胞的关键所在。包膜蛋白和膜糖蛋白均参与病毒的装配。核衣壳蛋白包裹并保护病毒的遗传物质。

由于RT-PCR诊断的假阴性缺点，病毒基因二代测序的费用贵、耗时长、检测门槛相对较高等问题，如能够在不同时期对患者体内抗体进行检测可以有效缓解面临的临床患者诊断困境。目前已经有重庆(重庆医科大学黄爱龙教授科研团队)、浙江等地多家科研单位成功开发出针对SARS-CoV-2的IgM、IgG的试剂盒，目前抗体检查的方法有化学发光法和胶体金方法两种。化学发光法灵敏度高，容易检测出低值的抗体量，假阳性偏高；胶体金法的Cut-Off值略高，检测灵敏度降低，容易出现假阴性结果，最好两种方法互为补充。由于抗体检测是血清学的检测，对于有肝病、类风湿关节炎、SLE等免疫性疾病的患者会引起假性非特异性反应，出现部分假阳性结果。

SARS-CoV-2的棘突蛋白与核衣壳蛋白均是理想的免疫学检测靶标。考虑到棘突蛋白RBD与其他SARS相关冠状病毒该结构域同源性较低，以及orf3b很可能编码新型短蛋白，棘突蛋白RBD和orf3b编码的新型短蛋白有望成为 SARS-CoV-2的特异性检测靶标。一方面，可以针对这些蛋白设计合成多肽、免疫动物、纯化出相应抗体，制备成抗原检测试剂，用于检测咽拭子、下呼吸道标本中的SARS-CoV-2抗原。另一方面，可以克隆这些蛋白的基因并构建原核或真核表达载体，纯化出相应蛋白，制备抗体检测试剂，用于检测全血、血清或血浆标本中针对SARS-CoV-2的IgM/IgG抗体。其中IgM抗体的检测对 SARS-CoV-2感染者的筛查具有重要意义。部分SARS-CoV-2感染者并无明显临床症状，但他们是病毒的危险传播者。如果对高危人群进行大面积的血液IgM 检测，筛查出并无发热等症状的IgM阳性个体，再结合核酸检测，就可尽早排查、确诊，有力控制病毒的传播。

新冠病毒表面蛋白SpikeProteinRBD蛋白，包含wild-type和mutant。研究证明RBD会和人类的ACE2结合，进而感染细胞。透过序列多型性分析，RBD 具有高度多变性。在1609SARS-CoV2病毒株中，32个病毒株有RBD的突变。 V367F突变来自于法国和中国香港，V483A和G476S突变来自于美国。而研究发现这些突变可能会增加RBD和人类ACE2的亲和力，从而增加检测的难度。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测冠状病毒的蛋白芯片，通过将Spike蛋白不同区域的多肽片段固定在载体上实现一次测定中高通量筛选多个靶标，可用于检测多种冠状病毒。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测冠状病毒的蛋白芯片，包括载体和芯片抗原，所述芯片抗原为冠状病毒Spike蛋白中不同区域的多肽片段，所述多肽片段排列在所述载体上形成蛋白质微阵列芯片。

作为进一步优选的方案，本发明所述的多肽片段能与人免疫球蛋白特异性结合。

作为进一步优选的方案，本发明所述的不同区域的多肽片段的序列选自表1 中所列的序列。

作为进一步优选的方案，本发明所述的多肽片段在载体上的排列方式为表2 中每列排列方式中的一种或多种。

作为进一步优选的方案，本发明所述的冠状病毒新冠病毒SARS-CoV-2、 SARS病毒、MERS病毒中的一种。

本发明还提供了一种蛋白芯片的制备方法，该制备方法包括

芯片抗原包被并排列在载体上：将冠状病毒Spike蛋白中不同区域的多肽片段用包被液包被排列在载体上形成蛋白质微阵列芯片；

干燥：将蛋白质微阵列芯片置于真空干燥箱中干燥；

装框：取出干燥后的芯片，装框；

封袋：将装好框架的芯片于铝箔袋中，同时在框架的背面置有干燥剂，最后进行真空封袋。

本发明还提供了一种冠状病毒检测试剂盒，包含本发明所述的检测冠状病毒的蛋白芯片。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒还至少包含生物素抗人IgG、生物素抗人IgA、生物素抗人IgM、生物素抗人IgD、生物素抗人lgE中的一种二抗。优选的，所述试剂盒还包含Cys链亲和素、包被液、封闭液、洗涤液。

作为进一步优选的方案，本发明所述的包被液由以下组分组成：

BSA 0.2-0.4wt％、

甘露醇 1-2.5wt％、

海藻糖 5-10wt％、

甘氨酸 0.3-0.5wt％、

Pro-clin300 0.1-1wt％、

0.01M PBS 75-80wt％、

所述包被液的pH值调至7.2-9.6；

0.01M PBS补充至100wt％。

作为进一步优选的方案，本发明所述的封闭液由以下组分组成：

0.01M PBS添加至1200mL。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的蛋白芯片每个阵列仅需不超过2μL的原始血清样品，具有样品消耗低的优点。

2.本发明所述的检测试剂盒具有高灵敏度，生物素-链霉亲和素对和荧光检测均可实现可用于测量血清IgG或IgM的最灵敏测定。

3.本发明所述的试剂盒具有高效率和准确性的特点，在一次测定中高通量筛选多个靶标，每个蛋白芯片可同时测试多达16个样品，并包含内部阳性对照以在蛋白芯片之间进行标准化，从而使每次测定之间的差异最小化。

4.本发明所述的检测试剂盒可以实现4个数量级范围的动态检测，具有可以在阵列之间标准化的高精度数据。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为感染后期血清样本(Later stage samples)以生物素抗人IgA孵育的荧光检测信号图；

图2为感染早期的血清样本(Early stage samples)以生物素抗人IgA孵育的荧光检测信号图；

图3为阴性血清样本(Negative samples)以生物素抗人IgA孵育的荧光检测信号图；

图4为Spss统计的图1-图3中三组间有差异的多肽片段；

图5为感染后期血清样本(Later stage samples)以生物素抗人IgG孵育的荧光检测信号图；

图6为感染早期的血清样本(Early stage samples)以生物素抗人IgG孵育的荧光检测信号图；

图7为阴性血清样本(Negative samples)以生物素抗人IgG孵育的荧光检测信号图；

图8为Spss统计的图5-图7中三组间有差异的多肽片段

图9为感染后期血清样本(Later stage samples)以生物素抗人IgM孵育的荧光检测信号图；

图10为感染早期的血清样本(Early stage samples)以生物素抗人IgM孵育的荧光检测信号图；

图11为阴性血清样本(Negative samples)以生物素抗人IgM孵育的荧光检测信号图；

图12为Spss统计的图9-图11中三组间有差异的多肽片段。

图13为不同配及pH的包被液包被后的蛋白芯片的荧光信号图。

具体实施方式

在本发明中，除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。 “……一种或多种”是指从所列组合中选取其中的一种或多种。

本发明所述的检测冠状病毒的蛋白芯片，包括载体和芯片抗原，所述芯片抗原为冠状病毒Spike蛋白中不同区域的多肽片段，所述多肽片段排列在所述载体上形成蛋白质微阵列芯片。具体的，所述的多肽片段能人免疫球蛋白特异性结合，包括与人IgG、IgA、IgM、IgD、lgE抗体的特异性结合。具体表现为在荧光染料存在时，IgG、IgA、IgM、IgD、lgE抗体会与这些多肽片段中的特异性肽表位结合产生荧光信号。本发明中所提及的蛋白质微阵列芯片是在同一芯片上进行大量蛋白质或多肽信息的平行分析，能够在尽量小的空间范围内，以尽量少的试剂的使用和加快检测的速度。

作为进一步优选的方案，本发明所述的不同区域的多肽片段的序列选自下列表1中所列的序列。

表1：多肽片段的序列

作为进一步优选的方案，本发明所述的多肽片段在载体上的排列方式为下表2中每列排列方式中的一种或多种。

表2：肽段在载体上的排列方式

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Biotin-BSA(1)

Human IgG

Biotin-BSA(2)

WUSP-10

WUSP-1

WUSP-11

WUSP-2

WUSA-1

WUSP-3

WUSA-2

WUSP-4

WUSA-3

WUSP-5

PBS

WUSP-6

S1,RBD

WUSP-7

S2

WUSP-8

N protein

WUSP-9

PBS

MERS-1

MERS-5

MERS-2

MERS-6

MERS-3

SARS-1

MERS-4

Biotin-BSA(1)

Human IgG

Biotin-BSA(2)

注释：表格中Biotin-BSA(1)和Biotin-BSA(2)中的(1)、(2)表示重复次数。

作为一种优选的方案，本发明所述的检测冠状病毒的蛋白芯片可以是检测新冠病毒SARS-CoV-2的蛋白芯片，其中芯片抗原为SARS-CoV-2Spike蛋白上不同区域的多肽片段，这些多肽片段能与人IgG或IgM特异性结合。具体的，这些多肽片段可以来自但不限于上述表1中的多肽片段。

本发明所述的检测冠状病毒的蛋白芯片也可以为检测SARS病毒的蛋白芯片，其中芯片抗原为SARS病毒Spike蛋白上不同区域的多肽片段，这些多肽片段能与人IgG或IgM特异性结合，具体的，这些多肽片段可以来自但不限于上述表1中的多肽片段。

本发明所述的检测冠状病毒的蛋白芯片还可以为检测MERS病毒的蛋白芯片，其中芯片抗原为MERS病毒Spike蛋白上不同区域的多肽片段，这些多肽片段能与人IgG或IgM特异性结合，具体的，这些多肽片段可以来自但不限于上述表1中的多肽片段。

本发明还提供了一种检测冠状病毒的蛋白芯片的制备方法，该制备方法包括

干燥：将蛋白质微阵列芯片置于真空干燥箱中干燥；

装框：取出干燥后的芯片，装框；

在上述制备方法中，进一步的，所述干燥步骤在真空度为-0.09pa，温度＜ 30℃，湿度＜30％的干燥箱中进行，干燥时间为5-6小时。

在上述制备方法中，进一步的，装框时的温度＜30℃，湿度＜30％。封袋时在温度＜30℃，湿度＜30％条件下进行。

进一步的，本发明所述的蛋白芯片制备完成后在2-8℃保存一个月后转-20 ±5℃保存，待用。

作为进一步优选的方案，本发明所述的试剂盒至少还包含生物素抗人IgG、生物素抗人IgA、生物素抗人IgM、生物素抗人IgD、生物素抗人lgE中的一种二抗。优选的，所述试剂盒还包含Cys链亲和素、包被液、封闭液、洗涤液。

由于多肽或蛋白质在不同包被环境中所带电荷不同，可影响抗原的包被量，而且在不同包被环境中蛋白质或多肽抗原的折叠状态不同，抗原表位的暴露程度也不一样，这也可影响抗原的反应活性，因此，试剂盒的难度在于将多种多肽片包被于芯片中同时保持其较高的结合活性，经过研究发现，在本发明中采用由以下组分和pH值的包被液能够保持多肽片段的结合活性：

BSA 0.2-0.4wt％

甘露醇 1-2.5wt％

海藻糖 5-10wt％

甘氨酸 0.3-0.5wt％

Pro-clin300 0.1-1wt％

0.01M PBS 75-80％

所述包被液的pH值调至7.2-9.6；

0.01M PBS补充至100wt％。

进一步的，优选的，但所采用的述包被液以下组分组成时候，被包被的多肽片段具有较高的结合活性：

BSA 0.4g，

甘露醇 2.5g，

海藻糖 10g，

甘氨酸 0.3g，

Pro-clin300 0.1mL，

0.01M PBS80mL，

包被液的pH值被调至为9.0；

0.01M PBS添加至100mL。

PBS作为缓冲溶液，起到溶解保护试剂的作用，在本发明中，主要用于调节包被液的pH值。本发明中，为了控制包被液的pH值，保持被包被多肽片段的活性，优选的上述包被液中所采用的0.01M PBS由以下组分组成：

氯化钾 0.1-0.3g

氯化钠 5-10g

磷酸二氢钾 0.1-0.5g

磷酸氢二钠 1.0-1.5g

工艺用水 750-850mL

pH调至7.2-7.6

工艺用水量添加至1000mL。

作为进一步优选的方案，所述0.01M PBS由以下组分组成

氯化钾 0.2g，

氯化钠 8g，

磷酸二氢钾 0.2g，

磷酸氢二钠 1.15g，

工艺用水 800mL，

pH调至7.2-7.6；

工艺用水量添加至1000mL。

pH值调至7.2-7.6，

0.01M PBS添加至1200mL。

进一步的，本发明所述的试剂盒所采用的包被稀释液、冻干稀释液、浓缩洗液以及显色稀释液等配液的组成如下表3所示。

表3：配液组成

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的配液、试剂以及检测方法等除了本发明特殊限定外，均为现有技术。

实施例1

一种检测新冠病毒(SARS-CoV-2)的蛋白芯片，所述芯片抗原为SARS-CoV-2Spike蛋白上不同区域的多肽片段，所述多肽片段能与人IgG或IgM 特异性结合并选自上述表1中的多肽片段序列，所述多肽片段在载玻片上的排列方式如上述表2所示，所述蛋白芯片通过以下方法制备而成：

芯片抗原包被并排列在载体上：将冠SARS-CoV-2Spike蛋白上中能与人 IgG或IgM特异性结合的多肽片段用包被液包被排列在载体上形成蛋白质微阵列芯片；所述包被液为BSA：0.4g，甘露醇：2.5g，海藻糖：10g，甘氨酸：0.3g， Pro-clin300：0.1g，0.01M PBS：80g，包被液的pH值被调至为9.0；0.01M PBS 添加至100g；

干燥：将蛋白质微阵列芯片置于真空度为-0.09pa、温度＜30℃、湿度＜30％的真空干燥箱中干燥5-6小时；

装框：取出干燥后的芯片，在温度＜30℃、湿度＜30％的条件下进行装框；

封袋：将装好框架的芯片于铝箔袋中，同时在框架的背面置有干燥剂，最后在温度＜30℃，湿度＜30％条件下进行真空封袋。

实施例2

检测SARS病毒的蛋白芯片，其中芯片抗原为SARS病毒Spike蛋白上不同区域的多肽片段，这些多肽片段能与人IgG或IgM特异性结合，所述多肽片段在载玻片上的排列方式如上述表2所示，所述蛋白芯片制备方法与实施例1相同；其中区别在于，该实施例中，所述包被液为BSA：0.2g，甘露醇：1g，海藻糖：5g，甘氨酸：0.5g，Pro-clin300：0.1g，0.01M PBS：80g，包被液的pH 值被调至为9.0；0.01M PBS添加至100g。

实施例3

检测MERS病毒的蛋白芯片，其中芯片抗原为MERS病毒Spike蛋白上不同区域的多肽片段，这些多肽片段能与人IgG或IgM特异性结合，所述多肽片段在载玻片上的排列方式如上述表2所示，所述蛋白芯片制备方法及条件与实施例1相同。

实施例4

一种新冠病毒(SARS-CoV-2)的检测试剂盒，采用上述实施例1的蛋白芯片，还包括1000×生物素化的抗人IgG 1.5μL，1000×生物素化的抗人IgM1.5μL、 1500×Cys链亲和素1mL，封闭液，20×洗涤液；所述配液如上述表3所示，封闭液的组成为封闭液由以下组分组成：酪蛋白20g，蔗糖250g，Pro-clin300 1.2mL，0.01M PBS960mL，pH值调至7.5，0.01MPBS添加至1200mL。

实施例5-实施例6

实施例5采用上述实施例2的蛋白芯片，其他条件与上述实施例4相同；实施例6采用上述实施例3的蛋白芯片，其他条件与上述实施例4相同。

应用实施例1

采用上述实施例实施4的检测试剂盒，对血清样本进行检测，样本中包括 16例感染后期血清样本(Later stage samples)、30例感染早期的血清样本(Early stagesamples)、29例阴性血清样本(Negative samples)；步骤如下

1)取出包被好抗原的蛋白芯片平衡至室温，载玻片中每个孔中添加100μL 的封闭缓冲液，并在室温下孵育1小时，然后将100μL稀释的血清样品加入每个孔中，轻轻摇动或摇动孵育1小时；设置对照；

2)用150μL洗涤缓冲液洗涤2次，每次振摇在室温下洗涤5分钟；

3)生物素结合的抗人IgA、IgG、IgM孵育加入每个孔中，轻轻摇动或摇动孵育1小时，三种抗体的稀释倍数参见表4；

4)洗涤后，加入荧光燃料Cy3标记的链霉亲和素孵育；

5)荧光检测并读数，荧光信号与结合抗体的数量成正比，由于每个斑点代表已知的独特肽，因此可以确定抗体结合的特异性表位。

表4：三种自身抗体稀释倍数

组号	抗体	血清稀释倍数	生物素标记抗体稀释倍数	Cys链亲和素稀释倍数
					1	IgA	1:50	抗IgA 1:500	1:3000
2	IgG	1:200	抗IgG 1:1000	1:3000
					3	IgM	1:200	抗IgM 1:1000	1:3000

上述应用实施例中，对检测结果的分析方法如下：

通过考虑这些阵列上阳性对照斑点的信号强度差异，原始数据归一化用于比较阵列(即不同样品)之间的数据。阳性对照是在阵列上的生物素化蛋白；每个斑点的信号量取决于与生物素化蛋白结合的Cy3-链霉亲和素量的比值；由于报告物的数量成比例地影响阵列上每个斑点的信号强度，因此阵列之间阳性对照(生物素-BSA)信号的差异将准确反映斑点之间的差异。

为了标准化，将一个阵列定义为“参考阵列(r)”，将其他“样本阵列”的信号标准化到该阵列。归一化值的计算如下：

·Pr：参考阵列上所有生物素-BSA斑点的平均信号值(r)；

·Ps：样品阵列上所有生物素-BSA斑点的平均信号值；

·Xs：样品阵列上特定斑点(X)的信号值；

·nXs：标准化的Xs值。

通过比较阵列图像之间和阵列图像之间每个目标的信号强度，可以确定样品或组之间每种分析物表达水平的相对差异。样品或组之间单个分析物信号强度的任何≥1.5倍增加或≤0.65倍减少，只要两组信号均远高于背景，就可以认为是表达上可测量的显着差异。

上述应用实施例中，在该应用实施例中，按照表4中的条件每组都分别对16例感染后期血清样本(Later stage samples)、30例感染早期的血清样本(Early stagesamples)、29例阴性血清样本(Negative samples)按照上述步骤进行荧光检测，检测结果参见图1-图12。多肽片段跟真核及原核N protein有很高的相关性：N protein信号高，多肽才会有信号。

图1-图3为以生物素抗人IgA孵育感染后期血清、感染早期血清以及阴性血清三组样本的荧光信号图，图1的结果显示：检测的16个感染后期血清样本中，有5例发现多肽片段有信号；真核表达S1 RBD,N protein没信号，其余15 个样本真核表达蛋白都有信号。图2的结果显示：检测的30例感染后期血清样本中，有16例发现肉眼可见的多肽片段有信号。图3的结果显示：29个阴性血清样本背景信号值都在正常范围。

通过Spss统计以生物素抗人IgA孵育三组血清样本(感染后期、感染早期以及阴性血清)间有差异的肽段，结果如图4所示，图4的结果显示：WUSP-3、 WUSP-5肽段的效果最为明显。

图5-图7为以生物素抗人IgG孵育感染后期血清、感染早期血清以及阴性血清三组样本的荧光信号图，图5的结果显示：检测的16个感染后期血清样本中，有14例发现多肽片段有信号，有1例未发现多肽信号，还有1例背景高；而真核表达S1 RBD,N protein全部样本都有信号。图6的结果显示：检测的30 例感染后期血清样本中，有21例发现肉眼可见的多肽片段有信号,有些有信号的样本没有展示出来。图7的结果显示：29个阴性血清样本背景信号值都在正常范围。

通过Spss统计以生物素抗人IgG孵育三组血清样本(感染后期、感染早期以及阴性血清)间有差异的肽段，结果如图8所示，图8的结果显示：WUSP-2、 WUSP-4、WUSP-5肽段的效果最为明显。

图9-图为以生物素抗人IgM孵育感染后期血清、感染早期血清以及阴性血清三组样本的荧光信号图，图9的结果显示：检测的16个感染后期血清样本中，有5例发现多肽片段有信号,有3例背景较高；而真核表达S1 RBD,N protein全部样本都有信号。图10的结果显示：检测的30例感染后期血清样本中，有17 例发现肉眼可见的多肽片段有信号,有些有信号的样本没有展示出来。图11的结果显示：29个阴性血清样本中大部分的背景信号值都在正常范围，有几个背景较高。

通过Spss统计以生物素抗人IgG孵育三组血清样本(感染后期、感染早期以及阴性血清)间有差异的肽段，结果如图12所示，图12的结果显示：只有 WUSP-4肽段结果比较明显。

对比实施例1

为了验证在本发明中，包被液对多肽活性的影响，在该对比实施例中对不同配及pH的包被液包被后的蛋白芯片的荧光信号进行对比，多肽片段的排列方式按照上述表2中的排列方式，分别包括实验组和对比组1、对比组2，包被液的配比参见表5。结果参见图13。

表5：包被液的配比

配方名称	实验组	对比组1	对比组2
				BSA	0.4g	0.4g	0.4g
甘露醇	2.5g	2.5g	2.5g
				海藻糖	10g	10g	3g
甘氨酸	0.3g	0	0.3g
				Pro-clin300	0.1ml	0.1ml	0.1ml
0.01M PBS	80ml	80ml	80ml
				PH	9	9	7.2

图13的结果显示：在碱性环境下，抗原多肽的包被效果最佳，海藻糖的浓度越高包被效果越好，并且，从荧光图上可以看出实验组的大部分肽段都显示出荧光信号，多肽片段保持良好的活性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种检测冠状病毒的蛋白芯片，包括载体和芯片抗原，其特征在于，所述芯片抗原为冠状病毒Spike蛋白中不同区域的多肽片段，所述多肽片段排列在所述载体上形成蛋白质微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述多肽片段能与人免疫球蛋白特异性结合。

3.根据权利要求2所述的蛋白芯片，其特征在于，所述不同区域的多肽片段的序列选自表1中所列的序列。

4.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述多肽片段在载体上的排列方式为表2中每列排列方式中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述冠状病毒为新冠病毒SARS-CoV-2、SARS病毒、MERS病毒中的一种。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的蛋白芯片的制备方法，其特征在于，包括

干燥：将蛋白质微阵列芯片置于真空干燥箱中干燥；

装框：取出干燥后的芯片，装框；

7.一种冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-5任一项所述的检测冠状病毒的蛋白芯片。

8.根据权利要求6所述的冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，还包含生物素抗人IgG、生物素抗人IgA、生物素抗人IgM、生物素抗人IgD、生物素抗人lgE中至少一种二抗以及Cys链亲和素、包被液、封闭液以及洗涤液。

9.根据权利要求7所述的冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述包被液由以下组分组成：

所述包被液的pH值调至7.2-9.6；

0.01M PBS补充至100wt％。

10.根据权利要求7所述的冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液由以下组分组成：