CN111662379A - 抗新型冠状病毒的抗体、制备方法和应用 - Google Patents
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
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Abstract
本发明公开了抗新型冠状病毒的抗体、制备方法和应用。本发明还涉及编码抗体的核酸分子。本发明还涉及使用这些抗体进行诊断和治疗的方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及抗新型冠状病毒的抗体、制备方法和应用。
背景技术
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与 SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV) 相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。Spike蛋白(刺突蛋白)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，决定了病毒的宿主范围和特异性，是宿主中和抗体的重要位点以及疫苗设计的关键靶点。
由于特异性治疗药物及有效疫苗尚未研发成功，目前已有恢复期病人血浆用于治疗重症患者的尝试，且具有明显的效果。由于血浆及血浆制品成分复杂，且可能具有潜在的危险因素。病毒的中和性抗体，特别是全人源单克隆的在病毒诊断及治疗方面显得尤为重要。单克隆抗体能够识别病毒的单一抗原表位，有些具有中和作用的单克隆抗体能够通过结合在病毒特异性位点，例如受体结合部位，蛋白酶切位点，膜融合部位的附件，从而感染病毒生命周期中的粘附宿主细胞，利用膜融合及表面蛋白水解等机制而起到中和作用。其中从恢复期病人体内获得的全人源单克隆抗体更具有成药潜能。首先因为恢复期患者体内的免疫系统经过充分的免疫应答，B细胞经过充分的体细胞高频突变，使抗体亲和力得到最大程度的成熟。其次因为人体免疫系统全人源抗体不产生免疫应答，人源抗体成药更具安全性。因此，高亲和力和高中和活性的人源抗体对新型冠状病毒疫情控制和重症患者治疗方面都具有重大的应用价值。
发明内容
本发明提供了抗体或其抗原结合片段，它们能特异地结合新型冠状病毒S蛋白。这些抗体是人源单克隆杭体。
根据本发明的一个方面，本发明提供了能与新型冠状病毒S蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO.1-3所示的序列的CDR区的重链可变区。
在本发明的具体实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含含有SEQ ID NO.5-7所示的序列的CDR区的轻链可变区。
在本发明的具体实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA 或IgD分子，在一种优选的实施方案中，这种人源抗体是IgG。可能是IgG1、IgG2、 IgG3、或IgG4亚型。这种抗体或其抗原结合片段可以从Fab片段、F(ab’)2片段、 Fv片段、单链抗体或嵌合抗体衍生而来。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以作为融合蛋白的一部分。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了包含前面所述的抗体或其抗原结合片段编码序列的多核苷酸分子，特别是提供了编码重链和轻链可变区、编码重链和轻链CDR1到CDR3连续的氨基酸序列以及编码单独CDRs的核苷酸序列。
所述核酸分子包括SEQ ID NO.9和10所示的序列。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含前面所述的多核苷酸分子。
进一步，所述表达载体还包含与前面所述的多核苷酸分子可操作性连接的表达控制序列。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其被前面所述的多核苷酸分子或前面所述的表达载体所转化。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物可以是经过标记的或衍生的前面所述的抗体或其抗原结合片段。在一种实施方案中，这种抗体或其抗原结合片段是经过放射性标记物、酶标记物、毒素、磁性物质或药物偶联物的标记。在另一种实施方案中，这种抗体或其抗原结合片段经过衍生以提高其一种或多种特性，比如半衰期、生物利用度或活性。在一种优选的实施方案中，这种抗体或其抗原结合片段用聚乙二醇，至少1个甲基或乙基或至少一个糖链衍生。在另一种优选的实施方案中，经过标记或衍生的抗体或其抗原结合片段被用于诊断或治疗方法。
所述组合物可以是药物组合物，药物组合物包含抗体及一种或多种运载体、赋形剂和/或稀释剂。可以将药物组合物配制用于特定用途，例如用于兽医用途或人类的药物用途。
对于治疗性用途，药物组合物可作为包括药学上可接受的运载体的无菌、药物组合物的一部分来提供。此组合物可呈任何合适的形式(视向例如人类受试者的受试者(即，患者)施用其的所需方法而定)。药物组合物可利用各种途径来向受试者施用，这些途径诸如，经口、经皮、皮下、鼻内、经静脉内、肌内、瘤内、鞘内、表面或局部。在任何给定情况下的最合适施用途径将视特定抗体、受试者、及疾病的性质与严重程度以及受试者的生理条件而定。通常，药物组合物应经静脉内或皮下施用。
药物组合物可宜以每剂量含有预定量的本文所描述的抗体的单位剂量形式存在。包括于单位剂量中的抗体的数量将视所治疗的疾病以及如本领域中所熟知的其他因素而定。此类单位剂量可呈含有适合于单次施用的一定量的抗体的冻干干粉形式，或呈液体形式。干燥粉单位剂型可以与注射器、适量的稀释剂和/或其他可用于给予的组分包装在试剂盒中。呈液态形式的单位剂量可宜呈预填有适合于单次施用的一定量的抗体的注射器形式来提供。
药物组合物还可呈含有适合于多次施用的一定量的抗体的块体形式来提供。
可通过使具有所需纯度的抗体与任选地选用的本领域中通常采用的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(以上所有在均本文中均被称为“运载体”)，即，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、离子等张剂、非离子清洁剂、抗氧化剂及其他混杂添加剂混合来制备用于储存为冻干配制品或水溶液的药物组合物。参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第16版(Osol编辑，1980)。这样的添加剂在所用的剂量和浓度下应对接受者无毒。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围内。其可在广泛多种浓度下存在，但应通常以介于约2mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于与本披露一起使用的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者及其盐，如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液 (例如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如，葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如，乳酸- 乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钾混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸盐缓冲液 (例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用富马酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液及三甲胺盐，诸如，2-氨基-2-羟甲基-丙-1，3-二醇(即，Tris、 THAM或三(羟甲基)氨基甲烷)。
可添加有时被称为“稳定剂”的等张剂以确保本发明的液体组合物的等张性，且这些等张剂包括多羟基糖醇、例如三元醇或更高糖醇，诸如，丙三醇、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其就功能而言范围从膨胀剂到溶解治疗剂或者有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上面列举的)；氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)、有机糖或糖醇(如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇)、甘油等，包括环多醇(如肌醇)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如，尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，具有10 个残基或更少残基的肽)；亲水性聚合物，诸如，聚乙烯吡咯啶酮单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖，诸如，乳糖、麦芽糖、蔗糖及海藻糖；及三糖，诸如，棉子糖；以及多糖如右旋糖酐。稳定剂可以介于每重量的抗体0.5重量％至10重量％范围内的量存在。
可添加非离子表面活性剂或清洁剂(还称为“润湿剂”)以帮助溶解糖蛋白以及保护糖蛋白免于搅拌诱发的聚集，其还准许配制品暴露于剪切应力表面而不导致蛋白质的变性。合适非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(poloxamer)(184、188等)及普洛尼克(pluronic)多元醇。非离子表面活性剂可以约 0.05mg/mL至约1.0mg/mL的范围存在。
适合于经由静脉内输注施用的水性组合物的具体例示性实施例包含 10mg/mL的抗体，15mM组氨酸缓冲液，pH 6.0，8.0％(w/v)蔗糖及0.05％(w/v) 聚山梨醇酯80。组合物可呈冻干粉末形式，该冻干粉末在用2.0mL无菌水或其他适合于注射或输注的溶液(例如，0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、乳酸化林格氏溶液等)复水后，提供上文水性组合物。组合物或其他实施例的组合物还可呈预填有一定量的适合于单次施用抗体的组合物的注射器或其他适合于注射和/或输注的器件形式。
本发明的抗体可单独施用(单药疗法)或辅助其他疗法，或与其他可以治疗新型冠状病毒感染导致的疾病的药物一起施用。无论是作为单药疗法施用或辅助其他疗法或药物，抑或与其他疗法或药物一起施用，施用一定量的的抗体。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了包含前面所述的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
进一步，所述试剂盒还包含显色剂。试剂盒中还有诊断方法的说明书。该试剂盒可利用包含的前面所述的抗体或其抗原结合片段以检测生物样品中的新型冠状病毒。
检测方法包括常规的免疫实验，包括(不限于)ELISA、RIA、FACS、免疫组化、Westernblot或免疫沉淀等。本发明的抗体或其抗原结合片段可用于检测新型冠状病毒S蛋白。
本发明提供了一种检测生物样品中新型冠状病毒S蛋白的方法，包括用本发明的前面所述的抗体或其抗原结合片段与生物样品接触，检测抗体与S蛋白的结合，以确定样品中的新型冠状病毒是否存在。在一种实施方案中，抗体直接用某种可检测的标记物标记。在另一种实施方案中，抗S蛋白的抗体(第一抗体)不标记，而第二抗体或其他可结合抗S蛋白抗体的分子被标记。本领域的专业人员都知道，选择的第二抗体应能特异性结合第一抗体的种属和类别。例如，如果抗S 蛋白的抗体是一种人源IgG，那么第二抗体可以是抗人IgG抗体。能结合抗体的其他分子包括(不限于)蛋白A和蛋白G。
合适的抗体或第二抗体标记物在上文已做了描述，包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性物质等。合适的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶等；合适的辅基复合物包括链亲和素/生物素和卵清亲和素/生物素等；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白等；发光材料有发光氨；合适的放射性物质包括125I、131I、35S或3H等。
在另一种实施方案中，生物样品中的新型冠状病毒S蛋白可以通过竞争免疫试验来检测，即使用以可测物质标记的S蛋白标准品和未标记的抗S蛋白的抗体进行试验。在这项试验中，生物样品、标记的S蛋白标准品和抗S蛋白抗体混合在一起，测定与未标记的抗体结合的标记的S蛋白标准品的量。生物样品中的S蛋白的量与抗S蛋白抗体结合的标记的S蛋白标准品的量成反比。
本发明还提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，包括用永生性细胞株、人工合成、重组表达或噬菌体展示技术等方法来制备。在具体实施方案中，本发明的方法包括培养前面所述的宿主细胞的步骤。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
(1)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒检测产品或诊断产品中的应用；
(2)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(3)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗新型冠状病毒感染导致的疾病的药物中的应用；
(4)前面所述的组合物在制备新型冠状病毒的检测产品或诊断产品中的应用；
(5)前面所述的组合物在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(6)前面所述的组合物在制备预防或治疗新型冠状病毒感染导致的疾病的药物中的应用；
所述检测产品或诊断产品包括前面所述的试剂盒。
利用本发明的检测产品或诊断产品实现检测功能或诊断功能的方法同前面所述。
定义与一般技术
除在这里特别定义的以外，本发明中使用的科学和技术术语其含义与本领域普通技术人员通常所理解的一致。此外，除非上下文需要，本发明中使用的单数名词包括复数含义，复数名词包含单数含义。通常来说，这里描述的细胞组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学的相关术语是本领域中众所周知和常用的。本发明使用的方法和技术除非特别说明基本上是按照本领域中众所周知的常规方法进行的，这些方法在各种普通或专门的参考书籍中都有描述，如Sambrook et al.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2d ed.， Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates(1992)； Harlow and Lane Antibodies： ALaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.(1990)等。酶促反应和纯化技术按制造商说明书操作，有的是本领域的常规方法，有的在这里做了描述。这里使用的与分析化学、有机合成化学和药物化学相关的名词或实验操作程序都是本领域众所周知的和常用的。化学合成、化学分析、药物制剂、处方、运输和对病人的治疗均采用标准技术。
除非特别说明下列名词术语均为下述含义：
术语“免疫球蛋白”是一种四聚体分子。自然界存在的免疫球蛋白四聚体是由两个相同多肽链对组合物的，每个多肽链对有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的氨基端部分包含一个约100-110左右氨基酸的可变区，主要负责识别抗原。每条链的羧基端部分是恒定区主要负责发挥功能效应。人类的轻链分为κ链和λ链两类；重链被分为μ、δ、γ、α、ε五类，对应抗体的亚类分别为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。轻重链的可变区和恒定区均由一个约12个左右氨基酸的“J”区连接，重链还包括一个约10个左右氨基酸的“J”区。参考文献见： See generally，FundamentalImmunology Ch.7(Paul，W.，ed.，2nded.Raven Press， N.Y.(1989))。每个轻/重链对的可变区形成抗体的结合位点，因此完整的免疫球蛋白分子有两个结合位点。
免疫球蛋白链具有基本相同的结构：在相对保守的骨架区(FR)间有三个高度可变的区域，也叫互补决定区(CDRs)。两条链的CDRs被骨架区排成一列，使它们能够结合特异的表位。无论轻链或重链从N端到C端的功能区依次为FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个功能区所含氨基酸的划分与下列文献一致：Kabat， Sequences ofProteins ofImmunological Interest(National Institutes ofHlealth， Bethesda，Md.(1987and1991))；Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)； Chothia et al.Nature 342：878-88(1989)。
术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或者其抗原结合片段，该片段能和完整抗体竞争特异的结合位点。抗原结合片段可以由完整抗体通过重组蛋白质技术、酶解反应或化学切割等方法而获得。抗原结合片段主要包括：Fab、Fab′、 F(ab′)2、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双价抗体(diabodies)以及至少包括某种免疫球蛋白一部分而具有抗原结合特性的多肽。 Fab是一种单价片段，由VL、VH、CL、CHI几个结构域组合物；F(ab′)2是一种二价片段，由两个Fab片段通过位于铰链区的二硫键连接而成；Fd片段由VH和 CHI组合物；Fv由抗体的VL和VH组合物；dAb片段(Wardet al.，Nature 341：544-546，1989)由一个VH结构域构成。单链抗体(scFv)是由VL和VH区通过合成的接头相连为一条蛋白链而形成的一种单价的抗体分子(Bird et al.，Science 242：423- 426，1988；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。双价抗体(diabodies)是双价双特异性的抗体，它的VH和VL区位于一条多肽链，但是二者间的接头太短使同条链的两个结构域无法配对，因此迫使其与另一条链对应结构域配对而形成两个抗原结合位点(Holliger，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 6444-6448，1993；Poljak，R.J.，etal.，Structure 2：1121-1123，1994)。一个或多个CDR可以用共价或非共价的形式插入某个分子形成免疫粘附素。免疫粘附素可以是将CDR插入一条大的多肽链，也可以用共价或非共价的形式将CDR与另一条多肽链相连。CDR使免疫粘附素能特异性的结合感兴趣的特定抗原。
抗体可以有一个或不止一个结合位点。如果结合位点不止一个，那么它们可以相同也可以不同。比如自然界存在的免疫球蛋白有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段仅有一个结合位点，而“双特异性”或“双功能性”抗体有两个不同的结合位点。双特异性抗体可用多种方法获得，如杂交瘤细胞融合或不同Fab′片段结合。参考文献见：Songsivilai&Lachmann Clin/.Exp.Immunol.79：315- 321(19190)；Kostlny et al.J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
抗体或免疫球蛋白分子片段或类似物可用本领域的常规技术按本说明书的介绍进行制备。优选的片段或类似物的氨基端或羧基端位于功能结构域附近。通过与公共或私有数据库中核苷酸和/或氨基酸数据的比较可以确定抗体的结构和功能结构域。优选的方法是用计算机比较方法来鉴别序列基序或预测在其他已知结构和/或功能的蛋白质中出现过的构象结构域。已有方法可以确定蛋白序列是否折叠成已知的三维结构(Bowie etal.Science 253：164(1991))。
优选的氨基酸置换可以：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物时的结合亲合力，(4)改变结合亲和性，和(5) 给予或改变这些类似物的其他物理化学或功能特性。类似物可以包含与自然界存在的蛋白序列不同的各种突变。比如，可在自然界存在的蛋白序列中(特别是在发生分子间接触的结构域以外的部分)进行单个或多个氨基酸置换(特别是保守氨基酸的置换)。保守氨基酸的置换不应该改变亲本序列的结构特性(比如取代的氨基酸不应该打断亲本序列的螺旋结构，或改变亲本序列的其他特定二级结构)。一些已知的蛋白二级和四级结构的例子参见Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introductionto Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；Thornton et at.Nature354：105(1991)。
本说明书使用的二十种基本氨基酸及其缩写均采用常规格式，参考文献见Immunology-A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub andD.R.Gren，Eds.， SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))。二十种基本氨基酸的立体异构体 (如D-氨基酸)，非自然界氨基酸如α，α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸，以及其他非传统氨基酸也可以在本发明的多肽中使用。非传统氨基酸的例子有： 4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基色氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、 O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、 s-N-甲基精氨酸，以及其他类似氨基酸和亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。这里采用的多肽表示方法左边是氨基末端，右边是羧基末端，与常规标准用法一致。
术语“多核苷酸”这里指至少10个碱基长的核苷酸聚合物，核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，也可以是核苷酸的修饰形式。多核苷酸包括DNA的单链或双链形式。
术语“可操作地连接”序列包括与目的基因连在一起的表达控制序列，也包括反式作用的或与目的基因间隔有一段距离的表达控制序列。“表达控制序列”这里指能够影响与其相连的编码序列的表达或加工的多聚核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录启始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪切和PolyA信号；能稳定细胞质mRNA的序列；能增强翻译效率的序列(如Kozak 序列)；能增强蛋白稳定性的序列；在需要时能增强蛋白分泌性的序列。自然界中不同的宿主的这些控制序列不同；在原核生物，这些序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物，这些序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”至少包括所有表达和加工必需的成分，也包括对表达和加工有用的其他成分，比如引导序列和融合序列。
术语“载体”这里指能运输与其相连的其他核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，它是环形双链DNA，其他DNA片段可以插入其中。另一类载体是病毒载体，其他DNA片段可以插入病毒基因组。某些载体可以在其进入的宿主细胞中自动复制(如包含细菌复制原点的细菌载体和游离的哺乳动物载体)。有些载体(如非游离的哺乳动物载体)可以在进入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可以指导其所连基因的表达。这样的载体在这里称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。在重组DNA技术上使用的表达载体一般为质粒的形式。本说明书中“质粒”和“载体”交替使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明包括了其他形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有同样的功能。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)这里指被转进重组表达载体的细胞。需要指出这个术语不仅指特定的原始细胞，还包括其后代细胞。因为突变或环境因素的作用，后代细胞可能出现某些改变，从而与亲本细胞不完全相同，但是仍包括在这里使用的术语“宿主细胞”的范围之内。
术语“患者”包括人及动物患病者。
整个说明书和权利要求书中，词语“包括″或相关词如“包含”或“含有”等理解为含所述数字或数字组，但不排除其他数字或数字组。
附图说明
图1显示利用间接ELISA检测本发明的抗体与重组S-ECD特异性结合的结果图；
图2显示利用间接ELISA检测本发明的抗体与重组S-RBD特异性结合的结果图；
图3显示利用免疫沉淀检测本发明的抗体与S-RBD与S-ECD结合的蛋白电泳图；
图4显示利用SPR实验检测本发明的抗体与S-RBD与S-ECD亲和力的结果图，其中，A：FC05；B：FC08；C：FC11；
图5显示利用体外中和实验检测本发明的抗体的中和活性的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1抗体筛选
一、噬菌体文库构建
1、采集COVID-19患者恢复期外周血，从外周血中分离单个核细胞(PBMC)
采集5位COVID-19确诊患者出院前外周血各20ml。使用GE的Ficoll-Paque PLUS，经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的单个核细胞(PBMC)。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
使用QIAGEN的RNeasy Mini Kit提取PBMC细胞RNA，然后使用罗氏公司的第一链合成试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche， Cat No.：04896866001)将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH(EX Taq，Takara,Cat No.:DRR001A)
(1)扩增VK&VL体系如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 1 |
| EX Buffer(10x) | 5 |
| dNTPs(10mM each) | 4 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.3 |
| dH<sub>2</sub>O | 35.7 |
(2)扩增重链Fd段体系如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
| 溶液或组分 | 体积(μL) |
| cDNA | 2 |
| EX Buffer(10x) | 10 |
| dNTPs(10mM each) | 8 |
| P1(10μM) | 2 |
| P2(10μM) | 2 |
| EX Taq 1U/μl | 0.6 |
| dH<sub>2</sub>O | 75.4 |
(3)反应程序如表3所示。
表3反应程序
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H 载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到抗体文库。
6、抗体库的包装
(1)从-80℃冰箱取出抗体库，冰上融化后取1ml加入10ml A+(20μg/ml) 2YT培养基中，37℃200rpm摇1小时；
(2)加100ml A+(100μg/ml)，T+(20μg/ml)2YT培养基，200rpm摇1小时；
(3)加1012pfu的VCSM13辅助噬菌体，37℃静置20min，200rpm摇2小时；
(4)加终浓度70μg/ml卡那30℃200rpm摇过夜；
(5)次日6000rpm离心20min，倒出上清，加入4％PEG8000(4g)和3％NaCl(3g)，混匀，置于冰上30min以上；
(6)分装于50ml离心管中9000rpm离心25min，弃去上清，控干，沉淀用 1ml PBS重悬即为包装文库。
二、噬菌体文库筛选
1、将重组SARS-CoV-2刺突蛋白胞外区(extra cellular domain of spikeprotein， S-ECD，购自南京巴傲得生物科技有限公司，货号NCP0030P)包被于免疫管中，按50μg/管包被3管，于4℃放置过夜，次日用2％脱脂牛奶封闭免疫管1h。
2、向免疫管中加1.75ml含2％脱脂牛奶的PBS和250μl噬菌体文库，37℃摇1h，再37℃静置1h。
3、倒去噬菌体文库，用PBST洗20次，每次摇5min。
4、用1ml pH＝2.2的Gly-HCl洗脱免疫管，室温静置5min，再37℃摇5min，然后吸至1.5ml EP管中，加入57μl 2M Tris中和至pH＝7。
5、将洗脱液转移至一个新的50ml离心管中，立即加入10ml OD＝1的新鲜 XL1-Blue，混匀后37℃孵育30min，加入10ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml)。
6、取10μl菌液用来测洗脱库容量，剩下20ml培养基倒入500ml三角瓶， 230rpm摇1h。
7、加入130ml 2YT(Amp 100ug/ml，Tet 20μg/ml)，230rpm摇1h。
8、加入MOI＝20的辅助噬菌体，37℃静置孵育30min。
9、3000g 10min离心，重悬沉淀至150ml 2YT(Amp 100μg/ml，Tet 20μg/ml) 中，37℃，230rpm摇2h。
10、加入110μl 70mg/ml卡那霉素，30℃230rpm过夜。次日再加1/5体积的PEG-NaCl(40ml)，混匀后冰浴至少1h，然后10000g 4℃离心20min，沉淀重悬于2-3ml PBS中，瞬时离心去除杂菌，过0.45μm滤器后用于下一轮筛选。
11、重复上述筛选步骤3次，以达到对噬菌体文库富集筛选的目的。
12、第三轮富集完以后，挑选2*96个克隆。经IPTG诱导后，次日进行ELISA 检测。
三、ELISA检测2*96个克隆的结合特异性
1、分别包被2块抗人Fab抗体(1:3000)、2块S-ECD蛋白(2μg/ml)，于 4℃包被过夜。
2、次日用3％脱脂牛奶封闭1h，然后加入50μl诱导上清和50μl脱脂牛奶， 37℃孵育1h，PBST洗涤。
3、4块板均加入HRP标记的抗人Fab抗体(1:3000)，37℃孵育1h，PBST 洗涤后，TMB显色。
经筛选获得159株能与S-ECD蛋白结合的噬菌体抗体片段，抗体片段为人源的Fab段，包括轻链全长及重链的Fd段。将159个单菌落扩增后送测序，获得轻重链齐全的合格序列。
实施例2间接ELISA检测抗体与S-RBD及S-ECD的结合特异性
从筛选获得的159株抗体中选定3株人源抗体，构建成IgG形式人源全分子抗体(三株抗体分别命名为FC05、FC08、FC11)，并在293F细胞中表达，用 Protein A纯化后备用。
FC11抗体序列如下所示：
重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO.1所示、重链可变区CDR2的序列如SEQ IDNO.2所示、重链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区的CDR1序列如SEQ IDNO.5所示、轻链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO.6所示、轻链可变区的CDR3序列如SEQ IDNO.7所示。重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
将重组SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合区(Recepor binding domain of spikeprotein，S-RBD，购自南京巴傲得生物科技有限公司，货号NCP0029P)及重组 S-ECD用PBS按1μg/ml浓度包被ELISA板，将所有抗体浓度稀释到1mg/ml，然后从1:2500开始倍比稀释8个稀释度，使用病人血清作为阳性对照，用健康成人血清作为阴性对照，从1:100开始稀释8个梯度。标本稀释以后，于37℃孵育30min，然后PBST洗3次，加入HRP标记的抗人Fc(1:5000)，37℃孵育30min 后PBST洗3次，用TMB显色，终止后读取OD450吸光度值。在同等条件下重复3批，每孔吸光度值取平均数后用GraphPad软件分析。
与重组S-ECD的间接ELISA结果如图1所示，FC05、FC08和FC11均能与重组S-ECD特异性结合。以1mg/mL为起始浓度，将cutoff值定义为
抗体滴度可分别达到1:320000，1:320000和1:40000，说明该3株抗体均能与S- ECD特异性结合。
与重组S-RBD的间接ELISA结果如图2所示，只有FC08和FC11与S-RBD 结合活性比较高，其中FC08抗体与S-RBD明显强于FC11，FC05与S-RBD蛋白不结合。
此结果说明，FC05，FC08和FC11均能识别S-ECD，其中FC08和FC11识别的S-ECD中的RBD区，而FC05则结合在RBD以外的区域。
实施例3抗体与S-RBD及S-ECD的免疫沉淀实验
前期用Western Blot检测3株抗体与S-RBD及S-ECD的结合特异性，发现该3株抗体均不与经SDS-PAGE后的S-RBD及S-ECD反应，预示三株抗体均为构象表位。因此，采用免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)方法检测抗体与目的蛋白的结合特异性，方法如下：
将FC05，FC08和FC11三株抗体与20μL Protein A beads室温结合2min，然后用20mM磷酸钠洗去未结合的抗体。再将20μg的靶抗原(S-RBD和S-ECD) 加入抗体与Protein A凝胶混合物中，室温结合2min。用20mM磷酸钠洗去未结合抗原，用30μl Gly-HCl缓冲液(pH3.0)洗脱抗原抗体复合物，加1uL 1M Tris (pH 9.0)中和体系至中性，洗脱物加入SDS-PAGE Loading Buffer煮沸10min 后进行SDS-PAGE分析。
IP结果如图3所示，FC05能结合ECD，在Line 1中可见约140kDa大小的ECD蛋白条带，以及抗体的重链(58kDa)及轻链(28kDa)，而在Line 2中只有抗体的两条带，没有RBD蛋白条带。FC08和FC11根据前期ELISA结果，认为即能和RBD结合又能和ECD结合，Line 3，5显示此两株抗体均能结合ECD，Line 4，6为结合RBD泳道，由于RBD分子量大小与抗体轻链大小相似均在 28kDa左右，在Lin4，6道可见抗体轻链与RBD重叠后的弥散条带。注：图中 M：蛋白marker；1，3，5为3株抗体与ECD蛋白结合的泳道；2，4，6为3株抗体与RBD蛋白结合的泳道。
实施例4 SPR测定抗体与S-ECD的亲和力
亲和力测定由Biacore 8K工作站完成，首先使用NHS/EDC方法将标有链霉素的重组S-ECD蛋白固定于CM5芯片上并使响应值(Response units，RUs)达到600左右。系列稀释的抗体由125nM～7.8nM依次进样；带有HIS tag的ACE2 蛋白进样浓度依次为500nM～31.25nM。在竞争实验中，首先将第一个样品以20 μl/min流经芯片120s，然后将第二个样品以同样的速度和时间注入芯片中，收集响应信号，并用BIAevaluation(版本4.1)软件全局拟合曲线来获得结合亲和力。
SPR结果如图4所示，SPR结果表明，FC05和FC08和FC11抗体均能高效结合S-ECD蛋白，其亲和力分别为0.1nM，0.8nM和0.5nM。FC08和FC11能够高亲和力结合病毒的RBD区，可以通过影响病毒与受体的结合而发挥中和作用。FC05不与RBD结合，但是与ECD的亲和力可以达到0.1nM。
实施例5抗体中和活性鉴定
1、病毒来源
病毒来源于SARS-CoV-2江苏分离株，GISAID号：EPI_ISL_411953，毒株名：BetaCoV/JS03/human/2020
2、稀释抗体
5份血清从1:10开始稀释(100μl血清+900μlPBS)；
3株抗体从1:80开始稀释(15μl抗体+1185μlPBS)
3、准备细胞
将Vero E6细胞以1*104/孔传至96孔板中，37℃5％CO2放置过夜，次日细胞长至单层后即可使用。
4、准备病毒和抗体混合物
1)取一96孔板，在A1-H1孔加100μl抗体(或血清)，其他孔均加50μl PBS，然后用排枪从左至右倍比稀释，每个抗体做4个复孔。
2)将病毒稀释至100TCID/50μl的浓度，向所有孔中加入50μl病毒液(即加入100TCID50的病毒)，37℃孵育1小时。
3)将96孔板中Vero E6细胞换液，每孔加入病毒抗体复合物100μl，放37℃ 5％CO2培养箱中，持续观察细胞病变直至5天(120h)后。
4)每次需做100TCID 50，10TCID50，1TCID50，0.1TCID50病毒对照孔，同时需做一个阳性血清对照，一次正常细胞对照。
5、结果
表4显示本发明的抗体或患者血清的中和滴度信息。
表4抗体中和滴度信息
统计结果见表5和图5。
表5抗体的IC50值
三株单克隆抗体的IC50值在142-818ng/mL之间，其中FC05中和活性最高，可达142ng/mL。将三种抗体互相组合形成鸡尾酒制剂后，表现出了更强的协同效应。其中两株RBD区的抗体(FC08和FC11)混合后IC50为102ng/mL，比单独的单抗平均值高5.6倍，具有一定的协同效应。如将S-ECD区的FC05和S-RBD区的两株抗体混合后，中和效果出现了协同效应。FC05，FC11组合的IC50值为19ng/mL， FC05与FC08组合的IC50值为4ng/mL，三株抗体混合后的IC50值为9ng/mL。从结果中可以发现，非RBD区的抗体FC05的中和活性高于2株RBD区抗体，RBD区中和抗体与另外一株非RBD区抗体组合成鸡尾酒以后，混合物的中和效果可以提高约100倍。此揭示SARS-CoV-2病毒的中和位点除了RBD区以外，还有其他更加重要的中和位点。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）
<120> 抗新型冠状病毒的抗体、制备方法和应用
<150> 2020103888320
<151> 2020-05-09
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Glu
1 5
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Lys Ala Met Phe Leu Gly Asp Ser Ser Gly Leu Thr Gly Leu Asp
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Met Phe Leu Gly Asp Ser Ser Gly Leu Thr Gly Leu Asp
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 6
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ala Ser
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaggtgcagc tgttggagtc ggggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt caccttcagt tactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcacgg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa tgaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagccatg 300
tttctgggcg atagtagtgg tttaacgggc ctcgatatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacattgagc tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cactttatta ctgtcagcag cgtggcaact ggcctcccac tttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
Claims (10)
1.与新型冠状病毒S蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO.1-3所示的序列的CDR区的重链可变区。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，重链可变区包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含含有SEQ ID NO.5-7所示的序列的CDR区的轻链可变区。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，轻链可变区包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
5.一种多核苷酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述多核苷酸分子包括SEQ ID NO.9和10所示的序列。
6.一种表达载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸分子以及与其可操作性连接的表达控制序列。
7.一种宿主细胞，其被权利要求5所述的多核苷酸分子或权利要求6所述的表达载体所转化。
8.一种制备特异性结合新型冠状病毒S蛋白的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括培养权利要求7所述的宿主细胞的步骤。
9.一种组合物或试剂盒，其含有权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
(1)权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备新型冠状病毒检测产品或诊断产品中的应用；
(2)权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(3)权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的疾病的药物中的应用；
(4)权利要求9所述的组合物在制备新型冠状病毒检测产品或诊断产品中的应用；
(5)权利要求9所述的组合物在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用；
(6)权利要求9所述的组合物在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的疾病的药物中的应用。
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