CN114685652B - 针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人广谱交叉中和抗体及其应用 - Google Patents

针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人广谱交叉中和抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了针对冠状病毒SARS‑CoV‑2和SARS‑CoV的广谱交叉中和抗体及其应用。具体地本发明公开了多株靶向新冠病毒冠状病毒SARS‑CoV‑2和SARS‑CoV的RBD蛋白的全人单克隆抗体、编码抗体和抗体片段的核酸序列及其制备方法。体外实验证实本发明的抗体均能有效的抑制SARS‑CoV‑2和SARS‑CoV假病毒和以及SARS‑CoV‑2真病毒感染宿主细胞，且通过不同机制发挥中和作用，从而有效地预防及控制冠状病毒感染，并减少耐药的发生。

Description

针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人广谱交叉中和抗体及其 应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地涉及抗SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱交叉中和抗体及其应用。
背景技术
单克隆抗体临床干预在预防和治疗病毒感染方面非常有效，临床上已成功用于预防呼吸道合胞病毒的感染。大量临床前及早期临床数据表明单克隆抗体能有效预防和治疗多种病毒引起的感染。因此，开发预防及治疗性中和抗体，对抗击新型冠状病毒疫情具有重要价值。
冠状病毒表面刺突蛋白是诱导中和抗体的重要抗原，中和抗体通过阻断S蛋白与受体的结合或抑制病毒与宿主细胞膜的融合发挥中和作用。S蛋白由S1和S2两个功能域组成。其中S1负责结合宿主细胞上的特定受体以促进病毒感染，在不同冠状病毒之间序列高度可变。根据氨基酸比对研究，SARS-CoV与SARS-CoV-2共有的S蛋白序列同源性为76％，而RBDs的同源性为73.5％，低于全长S蛋白的同源性，然而，大多数变异存在于RBM(receptorbinding motif)区域内，其共享特性仅为47.8％。因此，RBD中RBM外保守核心结构的同一性为84％，在SARS-CoV与SARS-CoV-2相对保守，意味着RBD 核心结构域极有可能诱导出SARS-CoV和SARS-CoV-2广谱交叉抗体。
目前，国内外有多家实验室从新冠病毒康复患者中陆续分离到靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的全人单克隆抗体，这些抗体大多靶向RBD突变频率最高的RBM区域，通过阻断RBD与宿主受体血管紧张素转化酶2(ACE2)的相互作用，从而抑制病毒感染宿主细胞。然而在疫苗以及新药加速研发的同时，新冠病毒在人群中的传播流行还面临随时可能会出现导致发病机理，致病力或传播能力改变的突变。近期，多篇文献报道SARS-CoV-2 在世界各地已经发生突变，某些突变尤其是RBM上的关键氨基酸位点的突变导致早期分离的中和抗体无效。靶向RBD的中和抗体耐药位点的出现限制了其使用范围。目前，靶向新型冠状病毒RBD的核心区域的广谱交叉抗体报道较少，并缺少系统性的研究。
因此，本领域亟待寻找冠状病毒广谱性中和抗体以及靶向新的保守性表位的抗体。
发明内容
本发明目的是提供了一种能够预防及控制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的全人单克隆抗体。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
(i)分别如SEQ ID NO.:15-21所示的CDR1，
(ii)分别如SEQ ID NO.:22-28所示的CDR2，和
(iii)分别如SEQ ID NO.:29-35所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的RBD结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区分别具有SEQ ID NO.:1-12所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
(i)分别如SEQ ID NO.:36-42所示的CDR1’，
(ii)氨基酸序列为KAS、GNS、DVF、WAS、DAS、或AAS的CDR2’，和
(iii)分别如SEQ ID NO.:43-49所示的CDR3’。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的RBD结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区分别具有SEQ ID NO.:13-24所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的抗体，较佳地为特异性抗SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的RBD蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体、或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:1所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:2所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:3所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:10所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:4所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:11所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:5所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:12所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:6所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:13所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:7所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:14所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:15所示的CDR1，如SEQ ID NO.:22所示的CDR2和如SEQ ID NO.:29；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:36 所示的CDR1’，氨基酸序列为KAS的CDR2’和如SEQ ID NO.:43所示的CDR3’。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:16所示的CDR1，如SEQ ID NO.:23所示的CDR2和如SEQ ID NO.:30；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:37所示的CDR1’，氨基酸序列为GNS的CDR2’和如SEQ ID NO.:44所示的CDR3’。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:17所示的CDR1，如SEQ ID NO.:24所示的CDR2和如SEQ ID NO.:31；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:38所示的CDR1’，氨基酸序列为DVF的CDR2’和如SEQ ID NO.:45所示的CDR3’。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:18所示的CDR1，如SEQ ID NO.:25所示的CDR2和如SEQ ID NO.:32；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:35所示的CDR1’，氨基酸序列为WAF的CDR2’和如SEQ ID NO.:46所示的CDR3’。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的RBD蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv段为特异性结合于SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的受体结合区域，并且所述scFv 具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明的第九方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD) 或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或其组合，所述活性成分用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
在另一优选例中，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV。
在另一优选例中，所述药剂用于治疗或预防冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV感染。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防和/或治疗冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV感染。
本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白；
(3)如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.:50-56和/或SEQ ID NO.:57-63 所示的序列。
本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
本发明的第十五方面，提供了一种检测样品中冠状病毒SARS-CoV-2和/或 SARS-CoV的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV。
在另一优选例中，所述检测为非治疗非诊断目的。
本发明还提供了一种检测样品中SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的RBD蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在 SARS-CoV-2和/或SARS-CoV RBD蛋白。
在另一优选例中，所述检测为非治疗非诊断目的。
本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的免疫偶联物。
本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检测板。
本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。
本发明的第十九方面，提供了一种治疗新型冠状病毒感染的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了ELISA验证7株抗体与SARS-CoV-2和SARS-CoV的结合活性。
图2显示了ELISA验证7株抗体阻断RBD与ACE2的能力。
图3显示了假病毒实验验证7株抗体对SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒的中和活性。
图4显示了RBD特异性抗体对SARS-CoV-2真病毒的微中和活性。
图5显示了OCTET RED 96仪器检测7个抗体对RBD的亲和力。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地研发了一种针对冠状病毒 SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人源广谱交叉中和抗体的制备方法和多株编码抗体和抗体片段的核酸及氨基酸序列。体外实验证实这类抗体均能有效的抑制SARS-CoV-2和 SARS-CoV假病毒和以及SARS-CoV-2真病毒感染宿主细胞，且通过不同机制发挥中和作用。并且本发明的多株抗体靶向SARS-CoV-2和SARS-CoV RBD的保守区域，突变频率相对较低，可应对因为冠状病毒突变较快形成的耐药问题。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99 和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的针对冠状病毒RBD蛋白的单克隆抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％, 97％,98％,99％,100％。
冠状病毒（Coronavirus, CoV）
冠状病毒在系统分类上属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。冠状病毒属的病毒是具囊膜（envelope）、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒直径约80～120nm，基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。其仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。
2019新型冠状病毒（SARS-CoV-2），2020年1月12日，世界卫生组织正式将其命名为2019-nCoV，引发新型冠状病毒感染COVID-19。而冠状病毒SARS-CoV引发重症急性呼吸综合征。
本发明的多株全人单克隆抗体靶向的是冠状病毒的受体结合区域的相对保守的核心区域，因此可以广谱性的结合及中和SARS-CoV-2和SARS-CoV。
本发明的多株全人单克隆抗体靶向的是冠状病毒的受体结合区域的相对保守的核心区域，因此可以广谱性的结合及中和SARS-CoV-2和SARS-CoV。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗SARS-CoV-2和SARS-CoV 的RBD蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗 SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL 结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白的单克隆抗体。术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion, CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括如下表A所示的三个互补决定区CDR：
表A
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:1-7所示。
在另一优选例中，所述重链可变区的核酸编码序列分别如SEQ ID NO.:50 (28-26K)、51(25-F7)、52(25-D9)、53(25-E8)、54(28-9K)、55(25-F4)、 56(25-C10)所示。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下表B的互补决定区CDR：
表B
VL CDR1’ CDR2’ CDR3’
28-26K QSISSW(SEQ ID NO.:36) KAS HQYNSNSPYT(SEQ ID NO.:43)
25-F7 SSNIGAGYG(SEQ ID NO.:37) GNS QSYDSSLSGWV(SEQ ID NO.:44)
25-D9 QGISNS(SEQ ID NO.:38) DVF QQYYSTPYT(SEQ ID NO.:45)
25-E8 QSVLYSSNNKNY(SEQ ID NO.:39) WAS QQYYSTLYT(SEQ ID NO.:46)
28-9K QSVSTY(SEQ ID NO.:40) DAS QQRSNFR(SEQ ID NO.:47)
25-F4 SQSISSYL(SEQ ID NO.:41) AAS QQSYSTHLRT(SEQ ID NO.:48)
25-C10 SQSISSY(SEQ ID NO.:42) AAS QQSYSTSLYT(SEQ ID NO.:49)
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.:8-14所示。
在另一优选例中，所述轻链可变区的核酸编码序列分别如SEQ ID NO.:57 (28-26K)、58(25-F7)、59(25-D9)、60(25-E8)、61(28-9K)、62(25-F4)、 63(25-C10)所示。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
本发明抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定，可以特异性的结合SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白，能够阻止SARS-CoV-2或 SARS-CoV侵染易感细胞。利用此抗体可变区基因或互补决定区(CDR)基因，可在利用原核和真核细胞的任何表达系统中改造和生产不同形式的基因工程抗体。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ IDNO.:1-7所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:8-14所示的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、 IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了 FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与 6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约60个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表C进行氨基酸替换而产生。
表C
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:50-63所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:50-63所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如 50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:1-7和/或SEQ ID NO.:8-14所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293 细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可偶联的治疗剂包括但不限于：胰岛素、IL-2、干扰素、降钙素、GHRH肽、肠肽类似物、白蛋白、抗体片段、细胞因子、和激素。
此外还可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2. 生物毒素；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体； 7.纳米磁粒；8.前药激活酶；9.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为 5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合冠状病毒SARS-2-CoV和SARS-CoV的 RBD蛋白分子，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1 微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点
(1)本发明的全人单克隆抗体能够能广谱性的结合及中和SARS-CoV-2和 SARS-CoV。
(2)本发明的全人单克隆抗体靶向的是SARS-CoV-2和SARS-CoV的受体结合区域(RBD)的相对保守的核心区域(该区域突变频率较低)，并通过不同的机制发挥中和作用。
(3)本发明分离到的不同的抗体可以组成鸡尾酒疗法，增强抗病毒效果并能解决因为病毒不断突变而形成的耐药问题。
(4)本发明是全人单克隆抗体，不含鼠源部分，对人体来说具有更低的免疫原性和更高的安全性，可以避免人抗鼠等其它物种来源的抗体介导免疫排斥反应。
(5)本发明的全人单克隆抗体可应用于SARS-2-CoV和SARS-CoV感染相关疾病的预防和治疗，以及作为临床诊断的工具。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例或测试例中未注明具体条件的实验，通常按常规条件进行，或按照原料/商品制造商建议的条件；未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
以下说明本发明能够中和冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD蛋白的全人单克隆抗体制备以及抗体特性分析过程。
实施例1单细胞RT-PCR法获得抗体基因以及抗体表达
1.1外周血单核细胞(PBMC)的获得
从健康的志愿者体内抽取外周血，采用常规Ficoll-Paque(厂家为(CEDARLANE)公司)密度梯度离心，得到107以上个外周血单核细胞(PBMC)。
Ficoll分离方法：
(1)收集血液，于50ml离心管(预含4％柠檬酸钠1ml)，收集全血20ml，颠倒混匀 8-10次。(即使柠檬酸钠终浓度为0.4％)；
(2)加等体积RPMI1640(含柠檬酸钠)，混匀；
(3)用15ml透明离心管，铺3ml淋巴细胞分离液，在其上小心加6ml血样。形成分离界面(或4ml分离液加8ml血样)；
(4)室温离心800g，20min(2000rpm，20min)；
(5)小心吸取界面层细胞，转移至新管；
(6)加RPMI1640(含柠檬酸钠)，稀释减小液体密度。离心，800g/2000rpm，10min。去上清；
(7)RPMI1640洗细胞2-3次，备用
1.2新冠病毒特异性记忆B细胞的获得
使用FITC-CD19/APC-IgG/BV421和PE–RSV F蛋白为标志物，BD HorizonTMFixableViability Stain 780去掉死细胞，经流式细胞仪获得特异性B细胞至96孔 RT-PCR板，每孔一个细胞，获得SARS-CoV-2RBD蛋白特异性记忆B细胞。
(1)RBD蛋白由哺乳动物细胞CHO表达系统表达；参考Invitrogen ExpiCHO-STMExpression System手册；RBD蛋白序列参考nCoV-SH01(GenBank:MT121215.1)，在上海捷瑞公司进行全基因合成。在上海捷瑞公司进行全基因合成，构建到invitrogen pcDNA3.1的表达载体上；
(2)RBD蛋白进行生物素(Biotin)标记：No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin(购自PIERCE，参考PIERCE公司EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素标记Protocol)10mM 试剂；另两个标志物FITC-CD19和APC-IgG均购自BD Bioscience公司；SA Streptavidin PE和streptavidin BV 421(购自BD公司)用来检测生物素标记的SARS-CoV-2RBD蛋白；
(3)分选细胞的标记：PBMC细胞分组，实验组+对照组，按细胞数加入标志物，避光染色，进行标记，用PBS重悬后，使用40μm BD falcon滤膜过滤；
(4)特异性B细胞的分选：使用BD FACS Influx筛选，根据前向角和侧向角从PBMC中筛选到淋巴细胞，然后通过不同对照组的调节补偿，获得SARS-CoV-2RBD蛋白的特异性记忆B细胞，将其分选到96孔板中进行RT-PCR(反转录PCR)，每孔一个细胞，板置于干冰上。
1.3抗体基因获得及载体构建
将获得的单个记忆B细胞通过RT-PCR获得cDNA,然后通过nested-PCR获得抗体基因可变区，跑琼脂糖核酸凝胶，将重轻链可以配对的胶块回收并测序。通过 IgBLAST网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)检索获得抗体基因序列。接下来通过AgeI及SalI酶切位点，AgeI及BsiwI酶切位点，AgeI及XhoI酶切位点将抗体基因分别连接到相应的IgH，Igκ和Igλ表达载体上。全人抗体表达载体IgH， Igκ和Igλ(分别表达抗体heavy链、kappa链、lambda链)由Patrick Wilson实验室馈赠，载体序列见NCBI GenBank:FJ475055、FJ475056和FJ517647。
1.4抗体表达和纯化
瞬时转染CHO细胞，进行全人抗体表达。转染前一天(第-1天)，分种 ExpiCHO-STM细胞，最终密度为3×106–4×106个活细胞/mL，使细胞过夜生长。次日(第0天)，测定活细胞密度和存活率百分比。细胞密度应达到约7×106–10×106个活细胞/mL。存活率应为95–99％，方可继续转染。将细胞稀释至最终密度为6×106个活细胞/mL。使用预冷的试剂(4℃)配制Expi FectamineTMCHO/质粒DNA复合物。室温孵育Expi FectamineTMCHO/质粒DNA复合物1–5分钟，然后将溶液慢慢转移至CHO细胞培养瓶中，在添加过程中轻轻晃动培养瓶。将细胞置于轨道摇床上 (37℃培养箱含8％CO2的湿化空气条件下)培养。培养7-11天，待细胞死亡一半时即可收上清，开始纯化抗体。
使用Protein G Agarose 4FF填料(购自GE)纯化抗体。首先将收集的CHO细胞悬液4000rpm,4℃离心30min，将收集的上清再用0.45um filter过滤，待纯化。取重力型离心柱，加入Protein G Agarose 4FF填料，使用3倍柱体积的20％乙醇稳定填料，之后用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子，然后上样品，再用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子，最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱子，向洗脱下来的抗体溶液中加入中和buffer使洗脱下来的样品pH达7.5左右。将抗体溶液在5L 1×PBS中透析 3次，即可将抗体浓缩保存至-80℃。
实验结果：
单细胞RT-PCR和Nested-PCR法获得匹配抗体重轻链可变区基因。琼脂糖割胶回收并进行测序。将测序结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast及 http://www.imgt.org/进行比对，获得抗体胚系基因信息和抗体重轻链基因高可变区信息，并进行表达载体构建及后续表达纯化。最后，通过该技术，成功获得多株可广谱性中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人单克隆抗体。
本发明的全人抗体重链可变区氨基酸序列如下，其中使用下划线标注的依次为重链氨基酸CDR1，CDR2，CDR3序列。
28-26K重链可变区氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSITSNSVYMYYAASVKGRFTISRDNARNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVLSPVDYDFWSGPDAFDFWGQGTMVTVSSAS(SEQ ID NO.:1)；
25-F7重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFTTYGITWVRQAPGQGLEWMGWISTYNNKTNYPQNLQGRVTMTTDTSTSTAYLELRSLRSGDTAVYYCARDGDSAYFDRSGYYGSSRDNWFDPWGQGTLVTVSSAS(SEQ IDNO.:2)；
25-D9重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYTGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAGTYDSNLLDPWGQGTLVT VSSAS(SEQ ID NO.:3)；
25-E8重链可变区氨基酸序列：
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDRTPYYDFWSGWGSFDYWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO.:4)；
28-9K重链可变区氨基酸序列：
QVQLVQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSDKYYADSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLGPDDTAVYYCAKRMAGYASRWYPLDYWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO.:5)；
25-F4重链可变区氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLSCTVSGGSISSGADYWSWIRQHPGKGLEWIGNIDNSGSTYYNPSLKSRVSISVDTSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRANHMGYNWFDPWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO.:6)；
25-C10重链可变区氨基酸序列：
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQATGKGLEWVSIIGTAGDTYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARAGYKYGLYSYFDYWGQGTLVTVSSAS(SEQ ID NO.:7)。
本发明的全人抗体轻链可变区氨基酸序列如下，其中使用下划线标注的依次为轻链氨基酸CDR1’，CDR2’和CDR3’序列。
28-26K轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLES GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCHQYNSNSPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.:8)；
25-F7轻链可变区氨基酸序列:
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYGVHWYQHLPGTAPKLLIYGNSN RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO.:9)；
25-D9轻链可变区氨基酸序列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLLYDVFRFES GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPDDFATYYCQQYYSTPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.: 10)；
25-E8轻链可变区氨基酸序列:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTLYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.:11)；
28-9K轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNFRFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.: 12)；
25-F4轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTHLRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.:13)；
25-C10轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCQQSYSTSLYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.: 14)。
实施例2抗体特性分析
实验方法：
(1)ELISA检测抗体结合抗原的活性
使用ELISA检测表达的抗体是否识别RBD蛋白。包被RBD蛋白ELISA板， 0.5μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。次日PBST洗板3次。2％BSA封闭,每孔200 μL，37℃,2h。再次PBST洗板3次。RBD特异性抗体测试6个浓度，3倍梯度稀释，2复孔，起始测试浓度为30μg/ml。上样，每孔100μL，37℃，2h。PBST洗板3次。Goat Anti-Human IgG(Fc specific)-Peroxidaseantibody(sigma)，1:5000稀释，每孔100μL，37℃，1h。PBST洗板3次。加底物TMB 100μL/孔显色，若颜色较浅可37℃避光反应15min。加入2M H2SO4终止反应，每孔50μL。测定 OD450，并进行数据处理。
(2)受体阻断实验
包被5ug/ml的hACE2蛋白过夜；PBST洗板3次，2％BSA buffer封闭2h；不同梯度稀释的抗体与150ng/ml的生物素化的SARS-CoV-2RBD蛋白孵育2h，不加抗体作为对照；加入预包被hACE2的微孔板中，孵育2h,PBST洗版三次，SA-HRP 40稀释孵育30min；TMB底物显色，检测OD450读值。阳性对照组不加block抗体，但是加第二个检测抗体。
(3)BLI亲和力检测
本实验在生化细胞研究所的分子平台使用OCTET RED 96仪器完成。首先将 AHCsensor放到有PBS的96孔黑板中浸泡至少10min，加样不同RBD抗体，浓度为20ug/ml；抗原设置浓度梯度，2倍梯度稀释，200nM-100nM-50nM-25nM-12.5nM-6.25nM；将抗体抗原及再生buffer及PBS buffer加到另一块黑板中，置于仪器上；设定程序，开始运行，程序为：baseline 120s→loading Ab→300s-baseline→ 240s-association→900s-disassociation→900s-regenaration→5s-baseline→5s-regenaration→5s-baseline→5s-regenaration→5s-baseline→5s；软件分析数据，计算抗原抗体亲和力KD值。
(4)假病毒中和实验
全长SARS-2-CoV S蛋白质粒和pNL4-3的质粒共转染HEK293T细胞于10cm培养皿中，6小时换液，48小时后收集上清液，使用完全培养基稀释。将抗体梯度稀释，并与等体积的病毒混合，37℃下培养1h。将抗体和病毒混合物转移到稳定表达的人ACE2的HEK293T细胞中。37℃下培养48小时。去掉上清，向细胞中加入裂解缓冲液，充分裂解。检测荧光素酶活性(Promega)。通过比较实验组的荧光素酶值与仅病毒对照组的荧光素酶值来计算中和效率。计算公式如下：
抑制活性百分比(％)＝(病毒对照平均值-测试孔读值)/(病毒对照平均值- 细胞对照平均值)×100；
IC50值通过Prism软件计算。
(5)真病毒微中和实验
接种细胞：取处于对数生长期的Vero-E6细胞，接种到96孔板中，每孔100μl，每孔细胞4×104个。
中和实验：供试品稀释：如表1所示，第1列(B-G行)加入10μg/ml预稀释样品60μl，加入病毒稀释液60μl后抗体终浓度为5μg/ml)，其余孔加入依次3倍稀释的样品60μl。第1行为细胞对照(Cell Control,CC)加入无血清培养基120μl，第8行为病毒对照(VirusControl,VC)加入无血清培养基60μl。
表1. 96孔板加样方法
病毒稀释：病毒储存液滴度为2.5×105TCID50/ml，取病毒储存液200μl，加入25ml无血清培养基，充分混匀，将病毒稀释至100TCID50/50μl。
滴加病毒：垂直悬滴病毒(细胞对照除外)至96孔板内，加样体积60μl/孔，最终病毒-抗体混合液120μl。
中和：将加好样的细胞培养板在震荡器上混匀，置于37℃培养箱，中和1小时。中和结束后，吸去接种有细胞的培养板上清液，随后将病毒-血清混合液吸取100 μl/孔加入其中，放入37℃CO2培养箱中培养1小时，进行感染。病毒感染结束后，吸去培养板上清液，空斑形成实验样品加入含有1％的甲基纤维素的维持培养基 (DMEM培养基含有2％FBS)，放入37℃CO2培养箱中培72-96小时。用倒置显微镜于4天时观察并记录结果，弃去上清，空斑形成实验样品经甲醛固定后，结晶紫染色空斑计数分析。对于测试100&抑制率，用倒置显微镜于2天时观察CPE并记录结果。
实验结果：
2.1ELISA验证分离抗体对冠病毒RBD的结合活性
为了研究RBD特异性的抗体是否交叉结合SARS-2-CoV和SARS-CoV RBD区域，我们用ELISA的方法验证重组表达抗体对SARS-CoV-2蛋白RBD的结合活性。结果如图1所示，有7株抗体对SARS-CoV-2和SARS-CoV RBD蛋白有较高的结合活性，CR3022 是已知报道的SARS-2-CoV和SARS-CoV交叉结合抗体。
2.2RBD特异性的抗体有效阻断RBD与受体ACE2的结合
为了进一步确认RBD特异性的抗体是否有效阻断RBD与受体ACE2的结合，在96微孔板上包被ACE2-FC重组蛋白，将不同梯度稀释的抗体与生物素化的RBD 蛋白孵育后加入到预包被的ACE2-FC的微孔板上。用HRP偶联的链霉亲和素进行检测。如图2所示，28-26K，25-F7以及25-D9抗体均能有效地抑制SARS-CoV-2以及 SARS-CoV RBD与ACE2的结合，并呈现剂量依赖效应。而且其他四株抗体不能阻断RBD与ACE2的结合。
2.3假病毒实验确认RBD特异性抗体中和活性
为了进一步确认7株RBD特异性抗体的功能，包装了SARS-CoV-2和SARS-CoV 的假病毒，在稳转人ACE2的293T细胞上进行SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒中和实验，实验表明，7株抗体以不同能力中和SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒，对 SARS-CoV-2假病毒半数有效抑制浓度IC50在0.007-5.4μg/ml之间，对SARS-CoV 假病毒半数有效抑制浓度IC50在0.3-25μg/ml之间(图3)。
2.4真病毒实验验证RBD特异性抗体的中和活性
为了进一步确认28-26K，25-F7等抗体对SARS-CoV-2真病毒中和活性，在 BSL-3实验室进行SARS-CoV-2真病毒中和活性检测。结果表明，检测的6株抗体可以有效抑制SARS-CoV-2真病毒，IC50在0.3-31μg/ml之间(图4)。
2.5OCTET RED 96仪器检测RBD特异性抗体对RBD蛋白的亲和力
为了研究28-26K，25-F7等抗体对RBD的亲和力，我们使用OCTET RED 96仪器检测7个抗体对RBD的亲和力。结果显示7株抗体对SARS-CoV-2RBD呈现较高的亲和力，在10-9-10- 10M之间，而7株抗体对SARS-CoV RBD蛋白的亲和力在10-8-10-9M 之间(图5)。
本发明人利用单细胞RT-PCR技术从新冠感染的康复志愿者的外周血PBMC中分离到7株SARS-CoV-2和SARS-CoV交叉结合抗体，这些抗体经过了体细胞高频突变的过程，对于新冠的RBD蛋白具有较高的亲和力。体外实验证实验证实这7株抗体均能有效的抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒和以及SARS-CoV-2真病毒感染宿主细胞。此外。这些抗体的中和机制不同，其中28-26K，25-F7以及25-D9三株抗体可以有效阻断 SARS-CoV-2RBD和SARS-CoVRBD与ACE2的结合。其他四株抗体通过可能通过其他机制发挥中和作用。这7株抗体极有可能靶向SARS-CoV-2和SARS-CoV RBD的保守区域，突变频率相对较低，应对因为SARS-CoV-2突变较快形成的耐药问题，对预防和治疗SARS-CoV-2具有潜在的应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
<120> 针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的全人广谱交叉中和抗体及其应用
<130> P2020-2621
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Thr Ser Asn Ser Val Tyr Met Tyr Tyr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Ser Pro Val Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro Asp
100 105 110
Ala Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Asn Lys Thr Asn Tyr Pro Gln Asn Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Ser Ala Tyr Phe Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly
100 105 110
Ser Ser Arg Asp Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser
130
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Thr Tyr Asp Ser Asn Leu Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Trp Gly Ser
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Met Ala Gly Tyr Ala Ser Arg Trp Tyr Pro Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Ile Asp Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Arg Ala Asn His Met Gly Tyr Asn Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Tyr Lys Tyr Gly Leu Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Ser Asn Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Asp Val Phe Arg Phe Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Phe Arg Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr His Leu
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Ser Leu
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Gly
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Ile Thr Ser Asn Ser Val Tyr Met
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Ile Ser Thr Tyr
1
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Thr
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asp Lys
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Ile Asp Asn Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr
1 5
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Ala Arg Val Leu Ser Pro Val Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro Asp
1 5 10 15
Ala Phe Asp Phe
20
<210> 30
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Ala Arg Asp Gly Asp Ser Ala Tyr Phe Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Ser Arg Asp Asn Trp Phe Asp Pro
20 25
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Ala Gly Thr Tyr Asp Ser Asn Leu Leu Asp Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Ala Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Trp Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asp Tyr
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
Ala Lys Arg Met Ala Gly Tyr Ala Ser Arg Trp Tyr Pro Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Ala Arg Asp Arg Ala Asn His Met Gly Tyr Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
Ala Arg Ala Gly Tyr Lys Tyr Gly Leu Tyr Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
Gln Gly Ile Ser Asn Ser
1 5
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
Gln Ser Val Ser Thr Tyr
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
His Gln Tyr Asn Ser Asn Ser Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val
1 5 10
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 46
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 47
Gln Gln Arg Ser Asn Phe Arg
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 48
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr His Leu Arg Thr
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Ser Leu Tyr Thr
1 5 10
<210> 50
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatacca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attactagta atagtgttta catgtactac 180
gcagcctcag tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaggaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtactc 300
tcacccgtcg attacgattt ttggagtggt cctgatgctt ttgatttctg gggccaaggg 360
acaatggtca ccgtctcttc a 381
<210> 51
<211> 402
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 51
caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgagggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc acctacggta tcacctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaataataa gacaaactat 180
ccacagaacc tccagggcag agtcaccatg accacggaca catccacgag cacagcctac 240
ttggagctga ggagcctgcg atctggcgac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300
gattcagctt actttgatag aagtggttat tatggctctt ccagggacaa ctggttcgac 360
ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcct cc 402
<210> 52
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 52
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccggggaagg gactggagtg gattggatat atctattata ctgggagcac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgaggt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggg aacttacgat 300
tccaacctgc tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 53
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcga 300
accccgtatt acgatttttg gagtggttgg ggctcctttg actactgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 54
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 54
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccgac ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcaga agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatttg atggaagtga taaatactat 180
gcagactcct tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctggg acctgacgac acggctgtgt attactgtgc gaaaagaatg 300
gccggctatg ccagcagatg gtaccctctt gattactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 55
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 55
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
agctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtgctg actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggaacatcg acaacagtgg gagcacctac 180
tataacccgt ccctcaagag tcgagtttcc atatcagtag acacgtctag gaaccagttc 240
tccctgaagt tgagctctgt gacagccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
agggcgaatc acatgggata caactggttc gacccctggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 56
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120
acaggaaaag gtctggagtg ggtctcaatt attggtactg ctggtgacac atactatcca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agctggatac 300
aagtatggtt tatattccta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 57
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatttataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaccag tataatagta attccccgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggagat caaa 324
<210> 58
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg gtgtacactg gtaccagcat 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 59
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gctctatgat gtattcagat tcgaaagtgg ggtcccatcc 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacggat tacactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgtcaacag tattatagta ccccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 60
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
ttgtacactt ttggccaggg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 61
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc acctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact tccgtttcgg cggagggacc 300
aaggtggaaa tcaaa 315
<210> 62
<211> 315
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc acctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact tccgtttcgg cggagggacc 300
aaggtggaaa tcaaa 315
<210> 63
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactc ctgtcaacag agttacagta cctccttgta cacttttggc 300
caggggacca aggtggaaat caaa 324

Claims (13)

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体选自下组：
(1)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:15所示的CDR1，如SEQ ID NO.:22所示的CDR2和如SEQ ID NO.:29所示的CDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO.:36所示的CDR1’，氨基酸序列为KAS的CDR2’和如SEQ ID NO.:43所示的CDR3’；
(2)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:16所示的CDR1，如SEQ ID NO.:23所示的CDR2和如SEQ ID NO.:30所示的CDR3；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:37所示的CDR1’，氨基酸序列为GNS的CDR2’和如SEQ ID NO.:44所示的CDR3’；
(3)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:17所示的CDR1，如SEQ ID NO.:24所示的CDR2和如SEQ ID NO.:31所示的CDR3；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:38所示的CDR1’，氨基酸序列为DVF的CDR2’和如SEQ ID NO.:45所示的CDR3’；
(4)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:18所示的CDR1，如SEQ ID NO.:25所示的CDR2和如SEQ ID NO.:32所示的CDR3；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:39所示的CDR1’，氨基酸序列为WAS的CDR2’和如SEQ ID NO.:46所示的CDR3’；
(5)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:19所示的CDR1，如SEQ ID NO.:26所示的CDR2和如SEQ ID NO.:33所示的CDR3；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:40所示的CDR1’，氨基酸序列为DAS的CDR2’和如SEQ ID NO.:47所示的CDR3’；
(6)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:20所示的CDR1，如SEQ ID NO.:27所示的CDR2和如SEQ ID NO.:34所示的CDR3；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:41所示的CDR1’，氨基酸序列为AAS的CDR2’和如SEQ ID NO.:48所示的CDR3’；或
(7)所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.:21所示的CDR1，如SEQ ID NO.:28所示的CDR2和如SEQ ID NO.:35所示的CDR3；以及轻链可变区包含如SEQ ID NO.:42所示的CDR1’，氨基酸序列为AAS的CDR2’和如SEQ ID NO.:49所示的CDR3’；
且所述的抗体为特异性抗SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的抗体。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:1所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示；
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:2所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:9所示；
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:3所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:10所示；
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:4所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:11所示；
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:5所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:12所示；
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:6所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:13所示；或
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.:7所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:14所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为为特异性抗SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的RBD蛋白的抗体。
4.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为全人源广谱交叉中和抗体。
5.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1-4任一项所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
6.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分包含如权利要求1-4任一项所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
7.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1-4任一项所述的抗体、如权利要求5所述的重组蛋白、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药剂用于治疗或预防冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV感染。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述试剂、检测板或试剂盒用于检测冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1-4任一项所述的抗体、如权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求6所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于预防和/或治疗冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV感染。
12.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1-4任一项所述的抗体；或
(2)如权利要求5所述的重组蛋白。
13.一种非诊断和非治疗性体外检测样品中冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与权利要求1-4任一项所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在冠状病毒SARS-CoV-2和/或SARS-CoV。
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