CN114805570A - 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗人ace2单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗人ACE2的单克隆抗体及其应用。该抗体能够特异性结合人ACE2蛋白，阻断SARS‑CoV‑2RBD与人ACE2受体结合，抑制SARS‑CoV‑2感染宿主。

Description

一种抗人ACE2单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种高活性的抗人ACE2单克隆抗体，能够用于预防及治疗病毒感染及其应用。
背景技术
冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。新型冠状病毒(SARS-CoV-2，其引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。在这些冠状病毒中，SARS-CoV、SARS-CoV-2和HCoV-NL63都是以血管紧张素转化酶2(ACE2)作为受体，完成感染宿主细胞的生物学过程，感染人源宿主细胞和人。
目前还没有针对SARS-CoV和SARS-CoV-2等冠状病毒的特效药物上市。
治疗性抗体药物不但在肿瘤和自身免疫疾病方面占有重要地位，在传染性疾病的治疗中也同样有效。目前已经上市的治疗和预防病毒感染的药物有预防小儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染的帕利珠单抗(Synagis)，治疗HIV感染的艾巴利珠单抗(Trogarzo)，以及用于狂犬病毒暴露后预防的Rabishield。同时还有针对众多病毒的单克隆抗体处于临床研究的不同阶段(https：//clinicaltrials.gov/)。
病毒要感染细胞，首先需要通过囊膜蛋白结合宿主的受体。抗体，尤其是阻断抗体，通过结合到受体蛋白上，阻断病毒与细胞受体的结合，从而阻断病毒感染，达到阻断病毒入侵宿主细胞的过程，实现预防及治疗效果。
基于已经发表的多项研究结果，发现HCoV-NL63、SARS-CoV和SARS-CoV-2三种冠状病毒都是利用其表面主要的糖基化刺突蛋白(S)与宿主细胞表面受体ACE2结合；进一步分析研究结果，发现上述病毒均是通过S区的RBD，结合受体人ACE2介导感染的过程。因此靶向人ACE2受体的并且阻断RBD与人ACE2结合的抗体，可能成为抑制病毒感染的有效抗体。
发明内容
本发明的目的是针对人ACE2受体，利用杂交瘤技术筛选能够阻断病毒S蛋白与受体结合的鼠源抗体，利用基因工程技术将具有保护效果的鼠源抗体人源化，最终获得高阻断活性的人源化抗体，用于预防及治疗多种利用人ACE2作为受体的冠状病毒感染。
为了获得具有保护效果的人源化抗体，本发明首先以人ACE2作为抗原，通过免疫BALB/c小鼠结合杂交瘤技术，获得能够分泌鼠源抗体的融合细胞；通过体外筛选，筛选到可以特异性结合人ACE2蛋白的杂交瘤单克隆细胞株；利用5’RACE技术分离抗体可变区编码序列，并进行鼠源抗体人源化改造，最终与抗体恒定区连接后形成重组人鼠嵌合抗体和人源化抗体表达质粒；将上述质粒经哺乳动物细胞体外表达系统表达、纯化后，制备人源化抗体蛋白，后续进行一系列的功能检测，包括：与人ACE2蛋白的结合能力、阻断SARS-CoV-2RBD与人ACE2结合的效果、抑制SARS-CoV-2感染宿主细胞的效果等，获得了能够有效阻断SARS-CoV-2等冠状病毒感染的人源化单克隆抗体，命名为h11B11。
具体地，本发明通过以下方面实现。
本发明的一个方面在于提供一种能够与人ACE2分子特异结合的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，优选地所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含如SEQ IDNO：3所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：4所示的重链CDR2和如SEQ ID NO：5所示的重链CDR3；以及如SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3。
在本发明的实施方案中，所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：1所示的重链可变区和SEQ ID NO：2所示的轻链可变区；或包含SEQ ID NO：9所示的重链可变区和SEQ ID NO：10所示的轻链可变区。
在本发明的实施方案中，所述抗人ACE2抗体包含SEQ ID NO：11所示的重链和SEQID NO：12所示的轻链。
在本发明的实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体和包含CDR的肽，所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段阻断人ACE2与SARS-CoV-2RBD的结合。
在一些实施方式中，所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段为鼠源或人源化的抗人ACE2单克隆抗体。优选地，所述人源化的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含人Fc区，更优选为人IgG4的Fc区。
本发明的一个方面涉及多肽，其包含SEQ ID NO：9所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：10所示的多肽。
本发明的一个方面涉及多肽，其包含SEQ ID NO：10所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：9所示的多肽。
本发明的一个方面涉及多肽，其包含SEQ ID NO：1所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：2所示的多肽。
本发明的一个方面涉及多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：1所示的多肽。
本发明的一个方面在于提供编码上述所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段或上述多肽的分离的多核苷酸。
在本发明的一个方面，涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：9所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：10所示的多肽。优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：15表示。
在本发明一个方面，涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：10所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：9所示的多肽。优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：16表示。
在本发明的一个方面，涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：1所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：2所示的多肽。优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：13表示。
在本发明的一个方面，涉及分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：1所示的多肽。优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：14表示。
本发明的一个方面在于提供包含所述多核苷酸的表达载体。
本发明的一个方面在于提供包含上述表达载体的宿主细胞。
本发明的一个方面在于提供制备所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：1)培养所述宿主细胞；2)从所述宿主细胞或培养基中回收多肽。
本发明的一个方面在于提供一种含有所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段的组合物或缀合物，优选地，所述缀合物进一步包含直接或通过合适长度的间隔物与多肽缀合的另外的分子，例如放射性同位素或放射性核素、毒素或细胞毒性基团，标记基团(标记的多肽)，如荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒等。
本发明的一个方面在于提供所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段在制备用于预防及治疗病毒感染的药物中的用途，优选所述药物用于治疗冠状病毒感染。
多研究结果显示，多种冠状病毒，尤其是HCoV-NL63、SARS-CoV和SARS-CoV-2，都是利用其表面主要的糖基化刺突蛋白(S)与宿主细胞表面受体ACE2结合；进一步分析发现，这些病毒均是通过S区的RBD区结合人ACE2受体介导感染。因此靶向人ACE2受体的抗体，并且是阻断RBD与人ACE2结合的抗体，可能成为抑制病毒感染的有效抗体。
本发明基于上述原理，发现的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段通过与人ACE2分子特异结合，阻断人ACE2与SARS-CoV-2RBD、的结合，从而使利用ACE2作为受体的冠状病毒失去入侵宿主的能力，达到预防及治疗病毒感染的效果。
本申请中，抗人ACE2抗体包括与人ACE2特异性结合的抗体或衍生物，也包括与原来的抗体显示实质上相同的抗原特异性的抗原结合片段。
定义
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽另外在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式为含有最小限度的来源于非人类免疫球蛋白序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分为人免疫球蛋白，其中受体抗体的高变区残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种高变区的残基置换，非人类物种例如有小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体或供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如人ACE2的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明还提供含有本发明抗人ACE2抗体或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使抗体或其抗原结合片段与可药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的医药组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物结合的抗体。
附图说明
图1是表示hACE2胞外区蛋白SDS-PAGE纯度检测结果的图。
图2是表示11B11杂交瘤细胞上清抑制SARS-CoV-2假病毒感染HEK293T-ACE2细胞的图。
图3是表示人源化11B11抗体蛋白SDS-PAGE纯度检测结果的图。
图4是表示人源化11B11抗体能够阻断人ACE2与SARS-CoV-2RBD的结合的图。
图5是表示人源化11B11抗体与人ACE2亲和力测定的图。
图6是表示人源化11B11抗体能够抑制SARS-CoV-2活病毒感染VeroE6细胞的图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1.人ACE2靶点阻断抗体筛选、人源化构建及制备
1.hACE2-ecto重组表达质粒的构建
以GenBank提供的序列为模板(NM_001371415.1)，全基因合成人ACE2胞外区(hACE2-ecto)全长编码DNA序列并且在3’端添加6HIS标签序列，通过5’端EcoRI和3’端XhoI酶切位点克隆入表达载体pCAGGS(ADDGENE公司)，建立人ACE2胞外全长蛋白的重组真核表达质粒，即hACE2-ecto重组质粒DNA。
2.hACE2-ecto重组蛋白的表达与纯化
(1)转染HEK293T(ATCC：CRL-11268)细胞：HEK293T细胞以1：3传至培养皿中继续培养；取7.5mL DMEM(GIBCO)培养基至50mL管中，加入300μL聚醚酰亚胺(PEI)(POLYCIENCE)混匀；加入40μg hACE2-ecto重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30min；分别取515μL至各培养皿中进行转染，然后置于37℃5％CO2培养箱中培养。转染6h后，更换无血清DMEM培养基。
(2)收获上清：转染72h后，收集细胞培养上清，4℃离心，过滤。
(3)HisTrap亲和层析柱纯化：将上清以1mL/min的速度，流过HisTrap亲和层析柱；完成后，用5个柱体积的20mM Tris-HCl、150mM NaCl pH8.0平衡液冲洗层析柱；用5个柱体积的20mM Tris-HCl、150mM NaCl、0-500mM咪唑pH8.0洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱峰。纯化后的hACE2-ecto蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定；电泳条带大小约为85kDa，与预期分子量大小相符，纯度大于95％，可以用于后续实验(图1)。
3.抗hACE2单克隆抗体杂交瘤制备与初步筛选
将上述纯化的hACE2-ecto重组蛋白(以下简称为hACE2抗原)用于BALB/C小鼠免疫。具体方法如下：
(1)动物免疫：经过纯化的hACE2抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/C小鼠(购自维通利华)，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
(2)细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1∶5-1∶10混合，滴加37℃的50％PEG(pH8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃5％CO2恒温培养箱中进行培养。
(3)筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的hACE2重组蛋白进行ELISA测试，用pH7.4磷酸盐缓冲液4℃过夜包被每孔100ng hACE2重组蛋白，弃去包被液后用含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液洗ELISA板5次，每孔加入细胞克隆培养上清100μL，室温孵育1h，弃去上清后用含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液洗ELISA板5次，每孔加入1：3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(中杉金桥)100μL，室温孵育1h；弃去二抗后，用含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液洗ELISA板5次，每孔加入50μL ELISA显色液(天根)显色15min，每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，酶标仪读取OD450数值。标记阳性细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD450值较高的单克隆进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全为阳性。挑取值高的单克隆株作为小鼠抗hACE2单克隆抗体杂交瘤，进行后续筛选。
4.具有阻断假病毒感染能力的杂交瘤细胞株筛选
(1)SARS-CoV-2假病毒包装：在转染前一天，将HEK293T细胞分盘，37℃ 5％CO2培养20h，细胞密度达到70％左右，即可进行转染。用pLVX-Luc2-puro(海吉浩格)、psPAX2(ADDGENE)和SARS-CoV-2Spike(海吉浩格)质粒转染HEK293T，包装假病毒；48h收集假病毒上清，1000rpm离心5min，过0.45μm滤膜备用。
(2)假病毒感染抑制检测：在转染前一天，将HEK293T-hACE2细胞分至96孔板，每孔1×105个细胞，37℃ 5％CO2培养20h；将收集的假病毒上清，按每孔100μL感染细胞，同时加100μL小鼠抗hACE2单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清，37℃ 5％CO2培养36h；从每个孔中吸去200μL上清，加50μL细胞裂解液(Promega)，室温摇床裂解15min，从每孔吸出20μL细胞裂解液加100μL荧光素酶底物(Promega)，置于化学发光检测仪读取发光值。
(3)筛选结果：与空白对照上清相比，5株杂交瘤上清均有一定程度的抑制SARS-CoV-2假病毒感染HEK293T-hACE2细胞的能力，其中被命名为11B11单克隆杂交瘤细胞株的上清的抑制能力非常显著(图2)，可以作为候选细胞株进行后续的检测。
5.11B11抗体可变区序列获取及鼠源抗体人源化
利用5’RACE的方法从11B11单克隆杂交瘤细胞中获取11B11抗体编码区序列主要方法如下：
(1)将前期筛选出的11B11单克隆杂交瘤细胞扩增培养，Trizol法提取总RNA；利用SMARTer RACE 5′Kit(TAKARA)合成cDNA第一链；得到产物进一步扩增后，获得鼠源抗体可变区编码片段并进行测序(VH的编码序列为SEQ ID NO：13，VL的编码序列为SEQ ID NO：14)。
(2)鼠源11B11抗体人源化主要过程如下：将11B11抗体轻、重链V区序列(SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2)提交到IMGT在线服务器，选择人源物种后，将V区完整编码序列与人源抗体基因座进行序列比对，确定序列同源性最高的人源抗体基因座。将11B11抗体的重链HCDR区(HCDR1：SEQ ID NO：3、HCDR2：SEQ ID NO：4、HCDR3：SEQ ID NO：5)和轻链的LCDR区(LCDR1：SEQ ID NO：6、LCDR2：SEQ ID NO7、LCDR3：SEQ ID NO：8)与同源性最高的人源抗体基因座的重链FR区和轻链的FR区重新组合，形成人源化的重、轻链V区序列(SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10，其编码序列分别为SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)，并与人IgG4的Fc(SEQ IDNO：19)进行融合，形成人源化抗体序列(重链为SEQ ID NO：11、轻链为SEQ ID NO：12)。
(3)人源化11B11(h11B11)抗体编码序列通过全基因合成方式(金斯瑞)获得，在重链和轻链的5’端添加信号肽及EcoRI酶切位点、3’端添加终止密码子和XhoI酶切位点，通过酶切将人源化抗体编码区序列克隆入pCAGGS表达载体(ADDGENE公司)，利用构建编码如SEQID NO：11所示的重链的多肽(编码其的多核苷酸为SEQ ID NO：17)和编码如SEQ ID NO：12所示的轻链的多肽(编码其的多核苷酸为SEQ ID NO：18)的多核苷酸的pCAGGS表达载体用于表达的h11B11抗体的表达和制备。
6.h11B11抗体制备
利用上一步制备的h11B11表达质粒转染HEK293T细胞，表达h11B11抗体主要步骤如下：
(1)在转染前一天将细胞分盘，37℃5％CO2培养20h，细胞密度达到70％上即可进行转染。
(2)以10cm培养皿转染贴壁HEK293T细胞为例：转染所需的质粒的量为20μg/盘(轻链∶重链＝1∶1，质量比)，稀释到100μL/盘的HBS液中，混匀后静置；以PEI(μL)∶质粒质量(μg)＝1∶4的比例确定PEI(1mg/mL)的用量，稀释到100μL/盘的DMEM培养基液中，混匀后静置。上述两溶液分别单独静置混合5min，之后将二者混合继续静置20min，最后加入到要转染的细胞培养液中。
(3)转染4-6h后，给转染的细胞换液，先用2-3mL的PBS润洗两遍后再换成新鲜的无血清的DMEM培养基(按1∶1000加入了青链霉素)，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
(4)将上述转染后的细胞培养液，在培养3天后收取上清。上清进过离心、过滤后，去除杂质，进行亲和纯化：将Protein A(5mL)HP亲和柱(GE公司)连接于AKTA Purifier(GE公司)上，在机器上操作下面的过程：先用水将柱中的20％乙醇冲出，再用20mM Na3PO4，pH7.0的缓冲液平衡层析柱，待仪器上显示电导为4.5％后，将上述样品流加到Protein A层析柱中，流速1mL/min；再用20mM Na3PO4，pH 7.0的缓冲液平衡层析柱，待UV平稳后，在随后的收集管中加入1M的Tris pH9.0约0.8mL(收集体积为3.2mL)，然后在程序上改成100％的0.1M Gly pH3.0洗脱抗体；收集洗脱的样品，凝胶电泳鉴定。根据还原电泳图可见人源化抗体的重链条带约50kDa、轻链条带约为25kDa(图3)，与抗体理论大小相符，纯度大于95％，可以用于后续实验。将抗体蛋白浓缩换至PBS中，直接使用或保存于-80℃冰箱。
实施例2.h11B11抗体阻断功能分析
在本实施例中，通过在hACE2全长(SEQ ID NO：20)5’端HindIII和3’端BamHI的酶切位点克隆到pEGFP-N1载体(CLONTECH公司)，获得带有GFP标签的hACE2质粒(hACE2-GFP-p)，并转染HEK293T(ATCC)细胞，获得表达hACE2全长的HEK293T细胞。
(1)转染前1天按照0.5-2×105细胞每孔接种于24孔培养板，并加入500μL不含抗生素的DMEM完全培养基(GIBCO公司)，以保证转染时细胞汇合达70～80％。1μg hACE2-GFP-p质粒稀释于50μL不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。将2μLPEI(4mg/mL)稀释于50μL不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。5min后，将50μLPEI稀释液滴加到50μL DNA稀释液中，轻轻混匀，室温孵育20min。将100μL PEI/DNA复合物滴加到每孔中并轻轻摇动使其与新鲜的培养基均匀混合。将细胞放入培养箱孵育4～6h后，更换含血清培养液。将细胞放置在37℃5％CO2继续孵育24h后，通过流式细胞分析仪(BD CALIBUR)检测GFP表达水平，评价hACE2全长在HEK293T细胞的表达水平。
(2)将10μgh11B11抗体和含2×105个hACE2全长表达HEK293T细胞溶液混合至总体积0.5mL，置冰上孵育30min，设置无关同型IgG(Biolegend)抗体为阴性对照，之后PBS清洗两次；加入SARS-CoV-2 RBD蛋白(义翘神州)置冰上孵育30min，之后PBS清洗两次；加入1∶100稀释的APC标记的抗HIS二抗(Biolegend)，孵育30min后用PBS缓冲液清洗两次，最终用300μL PBS溶液重悬后，进行流式细胞术检测。
(3)结果表明：在加入无关抗体的情况下，SARS-CoV-2 RBD蛋白能够显著结合到hACE2全长表达的HEK293T细胞上，而加入h11B11抗体后能够完全阻断SARS-CoV-2 RBD与hACE2的结合(图4)。
实施例3.h11B11抗体与hACE2亲和力分析
本实施例中，通过表面等离子共振技术(SPR)对h11B11抗体与hACE2进行亲和力鉴定。
将hACE2-ecto蛋白和h1lB11抗体浓缩换至SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl、150mMNaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)。将h11B11抗体蛋白稀释到2μg/mL捕获到到Protein A芯片(GE公司)上，之后将梯度稀释的hACE2-ecto蛋白依次流过Protein A芯片各通道，利用BIAevaluation软件(GE公司)分析结合动力学参数，并计算亲和力常数(KD)。结果表明，h11B11抗体与hACE2-ecto的亲和力为1.69×10-9M(图5)，说明该抗体可以以高亲和力结合人ACE2蛋白。
实施例4.h11B11抗体抑制SARS-CoV-2活病毒感染的活性检测
用DMEM完全培养基(Gibco)将Vero E6(ATCC：CRL-1586)细胞按照5×104cells/孔铺96孔板，37℃5％CO224h。将实施例1得到的纯化的h11B11抗体从5μg/mL开始2倍倍比稀释至第10个梯度；将不同浓度抗体与Vero E6混合后在37℃混孵育1h，然后每孔加入100TCID50SARS-CoV-2病毒混匀，继续培养72h。显微镜下观察细胞病变情况，利用生物统计学软件拟合计算半数抑制浓度(IC50)。
通过数据分析，h11B11抗体能够以高活性抑制SARS-CoV-2活病毒感染靶细胞，IC50为0.63μg/mL(图6)。
以上实施例说明，h11B11抗体能够作为高活性的阻断抗体，抑制SARA-CoV-2感染宿主细胞。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (19)

1.与人ACE2分子特异性结合的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区中的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区中的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，优选地所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：3所示的重链CDR1、如SEQ ID NO：4所示的重链CDR2和如SEQ ID NO：5所示的重链CDR3；以及如SEQ ID NO：6所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO：7所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO：8所示的轻链CDR3。
2.权利要求1所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：1所示的重链可变区和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区；或包含如SEQ ID NO：9所示的重链可变区和如SEQ ID NO：10所示的轻链可变区。
3.权利要求1或2所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗人ACE2抗体包含如SEQ ID NO：11所示的重链和如SEQ ID NO：12所示的轻链。
4.权利要求1或2所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体和包含权利要求1所述的CDR的肽，所述抗原结合片段能够阻断ACE2与SARS-CoV-2RBD的结合。
5.权利要求1-4中任一项所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段为鼠源或人源化的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，优选地，所述人源化的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段包含人Fc区，更优选为人IgG4的Fc区，优选地所述抗人ACE2抗体为鼠源或人源化的抗人ACE2单克隆抗体。
6.多肽，其包含SEQ ID NO：9所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：10所示的多肽。
7.多肽，其包含SEQ ID NO：10所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：9所示的多肽。
8.多肽，其包含SEQ ID NO：1所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：2所示的多肽。
9.多肽，其包含SEQ ID NO：2所示的序列，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：1所示的多肽。
10.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：9所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：10所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：15表示。
12.分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：10所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：9所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：16表示。
13.分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：1所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：2所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：13表示。
14.分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2所述的多肽，其中所述多肽是特异性结合人ACE2的抗体的一部分，并且所述抗体还包含SEQ ID NO：1所示的多肽，优选地，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：14表示。
15.表达载体，其包含权利要求10-14中任一项所述的分离的多核苷酸。
16.宿主细胞，其包含权利要求15所述的表达载体。
17.制备抗人ACE2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：1)培养权利要求16所述的宿主细胞；2)从所述宿主细胞或培养基中回收抗人ACE2抗体。
18.一种组合物或缀合物，其含有权利要求1-5中任一项所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段，优选地，所述缀合物进一步包含直接或通过间隔物与所述抗人ACE2抗体或其抗原结合片段缀合的另外的分子，优选所述另外的分子选自放射性同位素或放射性核素、毒素或细胞毒性基团，标记基团(例如标记的多肽)，如荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒。
19.权利要求1-5任一项所述的抗人ACE2抗体或其抗原结合片段在制备用于预防及治疗病毒感染的药物中的用途，优选所述病毒感染为以ACE2作为受体的冠状病毒感染。
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