CN111474340A - 一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明创造提供了一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用，采用高碘酸钠氧化法将2019‑nCoV抗原与酶进行偶联得到。本发明创造所述的试剂盒与现有核酸检测试剂盒相比具有操作简便，速度快，成本低，对实验室要求低等特点。

Description

一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试 剂盒与应用

技术领域

本发明创造属于免疫分析医学领域，尤其是涉及一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用。

背景技术

冠状病毒属于单股正链RNA病毒，既往已知感染人的冠状病毒有6种，即HCoV-229E、HCoV-OC43、SARSr-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERSr-CoV。新型冠状病毒（2019-nCoV）属于第7种。

新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型冠状病毒。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况中存在经气溶胶传播的可能。患者初始症状多为发热，乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。

目前临床实验室的检测方法主要依靠核酸检测，但核酸检测要在有条件和资质的实验室进行，存在检测时间长、样本采集要求高、步骤多、场地和设备要求高等不足，难以大规模开展。双抗体（原）夹心法，通常是结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。目前还没有应用上述双抗体（原）夹心法来检测新型冠状病毒的试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在提出一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用，避免了核酸检测试剂假阴性、操作繁琐等缺点，且解决了通量低，对检测环境和人员要求较高，成本高的缺陷。实现了大范围推广，流行病学调查，提升核酸检测的准确率，实现疑似病例鉴定和密切接触人群的普筛，结合核酸检测，降低漏检和错检率、多种检测试剂盒满足不同级别医院对新型冠状病毒的灵敏、快速和高通量检测需求。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种酶标记的2019-nCoV抗原，采用高碘酸钠氧化法将2019-nCoV抗原与酶进行偶联得到，所述的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，所述2019-nCoV抗原为氨基酸序列为SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4所示的4种合成多肽或包括氨基酸序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的4种合成多肽的氨基酸序列的重组抗原，具体如表1所示。

表1 多肽的氨基酸序列

2019-nCoV抗原中的2019-nCoV重组抗原可以为SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：10所示的4种合成多肽的氨基酸序列的重组抗原，具体如表2所示。

表2 重组抗原的氨基酸系列信息

制备上述酶标记的2019-nCoV抗原的方法，包括如下步骤：

A、酶活化；

a1、配制5-10mg/mL酶溶液；

a2、配制10-20mg/mL过碘酸钠溶液；

a3、将上述a1和a2配制溶液按体积比1：（1-3）混匀，室温避光反应0.5-2h；

a4、配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤a3配制溶液以1:（1-2）的体积混合，常温避光反应0.5-2h，活化即完成；

B、酶标记2019-nCoV 抗原：

b1、将2019-nCoV抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，省略该步骤；

b2、当2019-nCoV抗原为重组抗原时，将透析后的2019-nCoV抗原与步骤A活化的酶按摩尔比1:（2-4）进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；

当2019-nCoV抗原为合成多肽时，将合成多肽与步骤A活化的酶按摩尔比1:（1-3）进行混合，避光37℃反应8-12h。

b3、配置浓度为2-5mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mg酶加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；

b4、将上述步骤b3完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

步骤C：用酶稀释液将步骤B制得的酶活化标记2019-nCoV抗原稀释至工作浓度0.01-0.5μg/mL，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2-8℃。

一种试剂盒，该试剂盒包括上述酶标记的2019-nCoV抗原，还包括2019-nCoV抗原包被的固相载体，所述2019-nCoV抗原为4种合成多肽时，4种多肽的质量比为（0.5-2）：（0.5-2）：（0.5-2）：（0.5-2）。

进一步的，所述固相载体为微孔板，所述包被2019-nCoV抗原的微孔板的制备方法包括如下步骤：

将2019-nCoV抗原用0.02-0.1M 磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到96 孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2-4小时；弃去孔内液体，用pH7.4 PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.2-1％ BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃。

优选地，所述固相载体为磁性颗粒，所述包被2019-nCoV抗原的磁性颗粒的制备方法包括如下步骤：

取100mL 0.05-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，加入50-100mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌0.5-2h，之后加入10-40mg的2019-nCoV抗原，然后加入EDC，其浓度为5-10mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.01-0.05M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01-0.05M PBS定溶至1L即可。

优选地，所述试剂盒中还包括稀释液，当酶为碱性磷酸酶时，所述稀释液包括如下组分：1-5g /LTris、10-20g /LNaCl、1-5g/L CaseinNa、1-5mL/L吐温20、1-5mL/LProClin^TM300，2-10mL/L硫酸庆大霉素；用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

优选地，当酶为辣根过氧化酶时，所述稀释液包括如下组分：4-10g/LTris、1-5g/LCaCl₂，1-10g/mLBSA，10-30g /mLNaCl，1-5g /mLCaseinNa，体积百分比0.5-5%的吐温20，体积百分比1-5%的 ProClin^TM300，体积百分比0.5-5%的硫酸庆大霉素；用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

优选地，所述试剂盒还包括化学发光液，当酶为碱性磷酸酶时，所述化学发光液的制备方法包括如下步骤：

1）量取600-900mL的纯化水；

2）向步骤1）中分别添加0.1-1gAMPPD、0.01-0.1g Na₂SO₃、1-10gSDS、2-15gTris，搅拌至完全溶解；

3）向步骤2）中分别添加0.02-0.1mLTween-20和0.5-2mL Proclin^TM300，定容至1L。

4）调节pH至9.0±0.5，储存于2~8℃。

优选地，所述试剂盒还包括浓缩洗液，所述浓缩洗液由包括50-100g/L的磷酸氢二钠、5-10g/L的磷酸二氢钠、100-300g/L的NaCl、5-20mL/L的Tween-20和体积百分比2%的Proclin300混合而得。

当酶为辣根过氧化酶时，所述化学发光液包括化学发光液A和化学发光液B，所述化学发光液A为0.5-1.5g/L的鲁米诺、0.05-0.2g/L的对碘酚和缓冲液混合而得，所述缓冲液为pH8.5-10的2-10mmol/L Tris-HCl，避光保存；所述化学发光液B为0.5-1g/L的过氧化脲，用工艺用水配制而得。

本发明还包括所述试剂盒在检测新型冠状病毒的应用。

本发明采用双抗原夹心法检测人血清中的新型冠状病毒抗体。

磁微粒试剂盒检验原理是将新型冠状病毒抗原（合成多肽或重组抗原）标记的磁性颗粒和样本加入到反应管中，若样本中含有新型冠状病毒抗体，则与以上试剂中的合成多肽或重组抗原形成复合物，结合到磁性颗粒上，洗掉游离成分。将碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的合成多肽或重组抗原加入反应管中，与上述复合物结合，并形成碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的合成多肽或重组抗原-抗体-合成多肽或重组抗原-磁性颗粒复合物，洗掉游离成分。加入化学发光底物液，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化相应底物液发光，测定各样本管的发光值（RLU）。样本的发光值与其中的新型冠状病毒抗体浓度呈正相关，从而检测人血清中的新型冠状病毒抗体。

化学发光检测试剂盒检验原理是将样本加入到新型冠状病毒抗原（重组抗原或合成多肽）包被的微孔板中，若样本中含有新型冠状病毒抗体，则与以上试剂中的合成多肽或重组抗原形成复合物，结合到包被板上，洗掉游离成分。将碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记新型冠状病毒抗原加入反应孔中，其与上述复合物结合，并形成碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记新型冠状病毒合成多肽或重组抗原-抗体-新型冠状病毒合成多肽或重组抗原复合物，洗掉游离成分。加入化学发光底物液，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化相对应的化学发光底物发光，测定各样本的发光值（RLU）。样本的发光值与其中的新型冠状病毒抗体浓度呈正相关，从而检测人血清中的新型冠状病毒抗体。

相对于现有技术，本发明创造所述的用于新型冠状病毒检测的抗原、制备方法及试剂盒与应用具有表3所示的优势。

表3 本发明创造的用于新型冠状病毒检测的试剂盒的优势

。

附图说明

图1为化学发光检测试剂盒（碱性磷酸酶）的ROC曲线分析图；

图2为磁微粒试剂盒（碱性磷酸酶）的ROC曲线分析图；

图3为化学发光检测试剂盒（辣根过氧化酶）的ROC曲线分析图；

图4为磁微粒化学发光检测试剂盒（辣根过氧化酶）的ROC曲线分析图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明创造。

实施例1：化学发光检测试剂盒的制备

具体步骤如下：

（1）包被有2019-nCoV抗原的包被板的制备：

操作步骤：

1）将2019-nCoV抗原用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2-4小时；

2）弃去孔内液体，用pH7.4 PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.5％ BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，4℃封闭16-24小时；

3）弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；

4）装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃。

（2）稀释液的配制：

操作步骤：

在1L工艺用水中，加入2.4g Tris、17.56g NaCl，搅拌至完全溶解；再加入1.5gCaseinNa搅拌至完全溶解；再加入1.1mL的吐温20（Tween-20），混合均匀；再加入2.1mLProClin^TM300，5mL硫酸庆大霉素搅拌30分钟；用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

（3）碱性磷酸酶标记抗原的制备：

操作步骤：

A、碱性磷酸酶活化；

a1、配置10mg/mL碱性磷酸酶溶液；

a2、配置12 .8mg/mL过碘酸钠溶液；

a3、将上述a1和a2配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；

a4、配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液a3以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存；

B、碱性磷酸酶标记2019-nCoV抗原：

b1、将2019-nCoV抗原与活化的ALP按质量比1:1进行混合，避光37℃反应8-12h；

b2、配置浓度为2mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgAlP加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

b3、将上述步骤3）完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

步骤C：用酶稀释液将步骤B制得的碱性磷酸酶活化标记2019-nCoV抗原稀释至工作浓度0.01-0.5μg/mL，并加入10%酶稳定剂，储存于2-8℃。

本实施例中使用的2019-nCoV抗原为4种合成多肽按相同质量比混合；4种合成多肽的氨基酸序列如表1所示。

（4）20倍浓缩洗液的配制：

操作步骤：

20倍浓缩洗液由包括58g/L的磷酸氢二钠、5.92g/L的磷酸二氢钠、180g/L的NaCl、10mL/L的Tween-20和2%的Proclin300混合而得；

（5）化学发光液的配制：

1）量取900mL的纯化水；

2）向步骤1）中分别添加0.25gAMPPD、0.05g Na₂SO₃、5gSDS(十二烷基硫酸钠)、6gTris，搅拌至完全溶解；

3）向步骤2）中分别添加0.05mLTween-20和1mL Proclin^TM300，定容至1L。

4）调节pH至9.0，储存于2~8℃。

实施例2：化学发光检测试剂盒的检测方法

检测使用的仪器是：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I ；产品注册号-津械注准20182400046；

检测步骤为：

1.样本处理：取1mL生理盐水，加入20μL样本，用漩涡混匀仪混匀5秒，静置15分钟后开始实验。

2.根据实验需要取出适量的包被板条。加入50μL 处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。

3.揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。

4.加入50μL 碱性磷酸酶标记的新型冠状病毒重组抗原或合成多肽。

5.用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。

6.揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。

7.每孔加入化学发光底物液200μL。

8.室温（18~25℃）暗置5秒后测定相对发光强度，每孔读数时间1秒。

在软件支持下将各孔位按实验需要定义。

实施例3：磁微粒化学发光检测试剂盒的制备

具体步骤如下：

（1）包被有2019-nCoV抗原的磁微粒的制备：

操作步骤：

取100mL 0.1M羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液，加入80mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌40min，之后加入20mg的2019-nCoV抗原，然后加入EDC，其浓度为8mg/mL，2-8℃反应1h后，用0 .01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可。

（2）稀释液的配制：

操作步骤：

在1L工艺用水中，加入2.4g Tris、17.56g NaCl，搅拌至完全溶解；再加入1.5gCaseinNa搅拌至完全溶解；再加入1.1mL的吐温20（Tween-20），混合均匀；再加入2.1mLProClin^TM300，5mL硫酸庆大霉素搅拌30分钟；用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

（3）碱性磷酸酶标记抗原的制备：

操作步骤：

A、碱性磷酸酶活化；

a1、配置10mg/mL碱性磷酸酶溶液；

a2、配置12 .8mg/mL过碘酸钠溶液；

a3、将上述a1和a2配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；

a4、配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液a3以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存；

B、碱性磷酸酶标记2019-nCoV抗原：

b1、将2019-nCoV抗原与活化的ALP按按摩尔比1:1进行混合，避光37℃反应8-12h；

b2、配置浓度为2mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgAlP加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

b3、将上述步骤3）完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

步骤C：用酶稀释液将步骤B制得的碱性磷酸酶活化标记2019-nCoV抗原稀释至工作浓度0.01-0.5μg/mL，储存于2-8℃。

本实施例中使用的2019-nCoV抗原为为4种多肽按相同质量比混合；4种多肽的氨基酸序列如表1所示。

（4）20倍浓缩洗液的配制：

操作步骤：

20倍浓缩洗液由包括58g/L的磷酸氢二钠、5.92g/L的磷酸二氢钠、180g/L的NaCl、10mL/L的Tween-20和2%的Proclin300混合而得；

（5）化学发光液的配制：

1）量取900mL的纯化水；

2）向步骤1）中分别添加0.25gAMPPD、0.05g Na₂SO₃、5gSDS(十二烷基硫酸钠)、6gTris，搅拌至完全溶解；

3）向步骤2）中分别添加0.05mLTween-20和1mL Proclin^TM300，定容至1L。

4）调节pH至9.0±0.5，储存于2~8℃。

操作步骤：

实施例4：磁微粒试剂盒的检测方法

检测使用的仪器是：化学发光法免疫分析仪Axceed260，产品注册号-津械注准20182400046。

检测步骤为：

1、样本处理：取1mL样本稀释液，加入20mL样本，用漩涡混匀仪混匀5秒，静置15分钟后开始实验。

2、根据实验需要取出适量的反应管。设置阴性、阳性对照各2管。每管先加入50mL新型冠状病毒重组抗原或合成多肽标记的磁性颗粒、75μL处理后样本或阴性、阳性对照，在37℃下反应20分钟。

3、磁分离清洗。

4、每管加入75µL碱性磷酸酶标记的新型冠状病毒重组抗原或合成多肽。在37℃下反应15分钟。

5、磁分离清洗。

6、每管加入化学发光底物液200mL，避光检测，反应5秒读数。

实施例5：化学发光检测试剂盒检测效果评价

材料与仪器：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I ；产品注册号-津械注准20182400046。

该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取1189例病例，其中确诊病例192例，排除病例997例。试验结果显示，该产品临床灵敏度 94.8 %、特异度为98%。

该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：

1.稳定性

1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密性检测结果均应符合设计要求。

1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。

1.3试验结果如表4所示，具体数据如表5所示。

表4 稳定性实验结果

表5 具体检测数据

2、精密度

2.1设计要求

2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求

2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；

2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；

2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。

2.1.2批间精密性：检测参考品中精密度阳性质控品，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。

2.2试验方法

2.2.1批内精密性：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据阳性质控品测定结果（S/CO）的平均值（ ）与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。

变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）

2.2.2批间精密性：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。

2.3精密度参考品测定结果如表6所示。

表6精密度测定结果

3.灵敏度与特异性

表7 排除2019-nCoV感染的部分检测结果

表8 感染2019-nCoV感染的部分检测结果

根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如表9所示，ROC曲线分析图如图1所示。

表9 曲线下的面积

a.在非参数假设下；

b.原假设：实面积＝0.5。

判定阳性依据就是数据里S/CO值，大于1,；其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定本发明试剂盒的cutoff值，在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度和特异性的表现，筛选出最优的cutoff值，通过筛选，cutoff值为83002。

ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.975，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。

实施例6 磁微粒化学发光试剂盒检测效果评价

材料与仪器：化学发光法免疫分析仪Axceed260，产品注册号-津械注准20182400046。

该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取1189例病例，其中确诊病例192例，排除病例997例。试验结果显示，该产品临床灵敏度96.4%、特异度为98.2%。

该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：

1.稳定性

1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。

1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。

1.3试验结果如表10所示，具体检测数据如表11所示。

表10 稳定性试验结果

表11 稳定性检测数据

2.精密度

2.1设计要求

2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求

2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；

2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；

2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。

2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。

2.2试验方法

2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值（ ）与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。

变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）

2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。

2.3精密度参考品测定结果见表12。

表12 精密度测定结果

3.灵敏度与特异性

表13 排除2019-nCoV感染的部分检测结果

表14 感染2019-nCoV感染的部分检测结果

根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如表15所示，ROC曲线分析图如图2所示。

表15 曲线下的面积

a.在非参数假设下；

b.零假设：实面积＝0.5。

判定阳性依据就是数据里S/CO值，大于1；其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定本发明试剂盒的cutoff值，在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度和特异性的表现，筛选出最优的cutoff值，通过筛选，cutoff值为90000。

ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.976，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。

实施例7：化学发光检测试剂盒的制备

具体步骤如下：

（1）包被有2019-nCoV 抗原的包被板的制备：

操作步骤：

1）将2019-nCoV抗原用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2-4小时；

2）弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；

3）弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；

4）装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2-8℃；

（2）稀释液的配制：

操作步骤：

1）在1L工艺用水中，加入6.05 Tris、1g CaCl₂，搅拌至完全溶解；

2）再加入1.5gBSA搅拌至完全溶解；2.4g Tris、17.56g NaCl，搅拌至完全溶解；

3）再加入1.5g CaseinNa搅拌至完全溶解；

4）再加入1.1mL的吐温20，混合均匀；

5）再加入2.1mL ProClinTM300，5mL硫酸庆大霉素搅拌30分钟；

6）用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.2范围内的要求；

（3）辣根过氧化物酶标记抗原的制备：

操作步骤：

A、辣根过氧化物酶活化：

a1、配制10mg/mL辣根过氧化物酶溶液；

a2、配制12.8mg/mL过碘酸钠溶液；

a3、将步骤a1和步骤a2配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；

a4、配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤a3配制溶液以1:1的体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存，保存时间不超过3个月；

B、辣根过氧化物酶标记2019-nCoV抗原：

b2、将2019-nCoV抗原与活化的辣根过氧化物酶按摩尔比1:1进行混合，避光37℃反应8-12h；

b3、配置浓度为2mg/mL的 NaBH₄水溶液，按1mg辣根过氧化物酶加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；

b4、将上述步骤b3完成的标记液用0.01M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

C、用酶稀释液将步骤B制得的辣根过氧化物酶标记2019-nCoV抗原稀释至工作浓度0.01-0.5μg/mL，并加入10%酶稳定剂，储存于2-8℃。

本实施例中使用的2019-nCoV抗原为4种多肽按相同质量比混合；4种多肽的氨基酸序列如表1所示。

（4）20倍浓缩洗液的配制：

操作步骤：

20倍浓缩洗液由包括58g/L的磷酸氢二钠、5.92g/L的磷酸二氢钠、180g/L的NaCl、10mL/L的Tween-20和2%的Proclin300混合而得；

（5）化学发光液A和化学发光液B的配制：

化学发光液A为0.7g/L的鲁米诺、0.08g/L的对碘酚和缓冲液混合而得，所述缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；

化学发光液B为0.675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制而得；A液和B液在使用前5min混合。

实施例8：化学发光检测试剂盒的检测方法

检测使用的仪器是：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I ；产品注册号-津械注准20182400046；

检测步骤为：

1、样本处理：取1mL生理盐水，加入20μL样本，用漩涡混匀仪混匀5秒，静置15分钟后开始实验。

2、根据实验需要取出适量的包被板条。加入50μL 处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。

3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。

4、加入50μL辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒重组抗原或合成多肽。

5、用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。

6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。

7、发光液A与发光液B等体积混合，现用现配，每孔加入混合发光液100μL。

8、室温（18~25℃）暗置5秒后测定相对发光强度，每孔读数时间1秒。

在软件支持下将各孔位按实验需要定义。

实施例9：磁微粒化学发光检测试剂盒的制备

具体步骤如下：

（1）包被有2019-nCoV抗原的磁性颗粒的制备：

取100mL 0.1M羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液，加入80mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌40min，之后加入20mg的2019-nCoV重组抗原，然后加入EDC，其浓度为8mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可。

（2）试剂稀释液的配制：

操作步骤：

1）在1L工艺用水中，加入6.05g Tris、1g CaCl₂，搅拌至完全溶解；

2）再加入1.5gBSA搅拌至完全溶解；2.4gTris、17.56gNaCl，搅拌至完全溶解；

3）再加入1.5g CaseinNa搅拌至完全溶解；

4）再加入1.1mL的吐温20（Tween-20），混合均匀；

5）再加入2.1mL ProClinTM300，5mL硫酸庆大霉素搅拌30分钟。

6）用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

（3）辣根过氧化物酶标记抗原的制备：

操作步骤：

1）辣根过氧化物酶活化：

a1、配制10mg/mL辣根过氧化物酶溶液；

a2、配制12.8mg/mL过碘酸钠溶液；

a3、将步骤a1和步骤a2配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；

a4、配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤a3配制溶液以1:1的体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存，保存时间不超过3个月；

2）辣根过氧化物酶标记2019-nCoV抗原：

b1、将2019-nCoV抗原与活化的辣根过氧化物酶按质量比1:1进行混合，避光37℃反应8-12h；

b2、配置浓度为2mg/mL的 NaBH₄水溶液，按1mg辣根过氧化物酶加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；

b3、将上述步骤b3完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

3）用酶稀释液将步骤B制得的辣根过氧化物酶标记2019-nCoV抗原稀释至工作浓度0.01-0.5μg/mL，储存于2-8℃；

本实施例中使用的2019-nCoV抗原为4种多肽按相同质量比混合；4种多肽的氨基酸序列下表1所示。

（4）20倍浓缩洗液的配制：

操作步骤：

20倍浓缩洗液包括58g/L 磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和2% Proclin300

（5）化学发光液A和化学发光液B的配制：

化学发光液A为0.7g/L的鲁米诺、0.08g/L的对碘酚和缓冲液混合而得，所述缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；

化学发光液B为0.675g/L的过氧化脲，用工艺用水配制而得。

化学发光液A液和化学发光液B液在使用前5min混合。

实施例9：磁微粒化学发光检测试剂盒的检测方法

检测使用的仪器是：化学发光法免疫分析仪Axceed260（产品注册号-津械注准20182400046；）。

检测步骤为：

1、样本处理：取1mL样本稀释液，加入20mL样本，用漩涡混匀仪混匀5秒，静置15分钟后开始实验。

2、根据实验需要取出适量的反应管。设置阴性、阳性对照各2管。每管先加入50mL新型冠状病毒重组抗原或合成多肽标记的磁性颗粒、75μL处理后样本或阴性、阳性对照，在37℃下反应20分钟。

3、磁分离清洗。

4、每管加入75µL辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒重组抗原或合成多肽。在37℃下反应15分钟。

5、磁分离清洗。

6、每管加入化学发光法液A、化学发光底物液B各100mL，避光检测，反应30秒读数。

实施例11：化学发光检测试剂盒检测效果评价

材料与仪器：化学发光法免疫分析仪PETECK96-I，产品注册号-津械注准20182400046。

该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取1189例病例，其中确诊病例192例，排除病例997例。试验结果显示，该产品临床灵敏度 95.3 %、特异度为 97.9 %。

该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：

1.稳定性

1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。

1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。

1.3试验结果如表16所示，具体数据如表17所示。

表16 稳定性实验结果

表17 具体检测数据

2.精密度

2.1设计要求

2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求

2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；

2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；

2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。

2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。

2.2试验方法

2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值（ ）与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。

变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）

2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。

2.3精密度参考品测定结果如表18所示。

表18 精密度测定结果

3.灵敏度与特异性

表19 排除2019-nCoV感染的部分检测结果

表20 感染2019-nCoV感染的部分检测结果

根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如表21所示，ROC曲线分析图如图3所示。

表21.曲线下的面积

a.在非参数假设下；

b.零假设：实面积＝0.5。

判定阳性依据就是数据里S/CO值，大于1,；其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定本发明试剂盒的cutoff值，在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度和特异性的表现，筛选出最优的cutoff值，通过筛选，cutoff值为101442.5。

ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.975，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。

实施例12 磁微粒化学发光试剂盒检测效果评价

材料与仪器：化学发光法免疫分析仪Axceed260，产品注册号-津械注准20182400046。

该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取1189例病例，其中确诊病例192例，排除病例997例。试验结果显示，该产品临床灵敏度95.8 %、特异度为 98.2 %。

该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：

1.稳定性

1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。

1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测参考品。

1.3试验结果如表22所示，具体检测数据如表23所示。

表22 稳定性试验结果

表23 稳定性检测数据

2.精密度

2.1设计要求

2.1.1批内精密度：检测参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求

2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100%（n=20）；

2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90%（n=20）；

2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100%，且CV≤10%（n=20）。

2.1.2批间精密度：检测参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100%，且CV≤15%。

2.2试验方法

2.2.1批内精密度：检测精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果（S/CO）的平均值（ ）与标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.1要求。

变异系数（CV%）＝SD/平均值×100%…………公式（2）

2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差（SD），根据公式（2）计算变异系数（CV），结果应符合2.1.2要求。

2.3精密度参考品测定结果见表24。

表24 精密度测定结果

3.灵敏度与特异性

表25 排除2019-nCoV感染的部分检测结果

表26 感染2019-nCoV感染的部分检测结果

根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如表27所示，ROC曲线分析图如图4所示。

表27 曲线下的面积

a.在非参数假设下；

b.零假设：实面积＝0.5。

判定阳性依据就是数据里S/CO值，大于1；其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定本发明试剂盒的cutoff值，在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度和特异性的表现，筛选出最优的cutoff值，通过筛选，cutoff值为109065.5。

ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.997，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司

重庆医科大学

<120>一种用于新型冠状病毒检测的酶标记的抗原、制备方法及试剂盒与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Gly Pro Val Pro Leu Ala Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr Ser

1 5 10 15

Leu His Thr Pro Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly

20 25

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

20 25 30

Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

35 40 45

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro

1 5 10 15

Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser

20 25

<210> 4

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln

20 25 30

Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr

35 40

<210> 5

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly

195 200

<210> 6

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg

1 5 10 15

Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro

20 25 30

Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu

35 40 45

Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln

50 55 60

Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser

65 70 75 80

Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr

85 90 95

Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly

100 105 110

Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln

115 120 125

Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg

130 135 140

Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Ala

145 150 155 160

Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile

165 170 175

Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu

180 185 190

Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro

195 200 205

Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp

210 215 220

Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp

225 230 235 240

Ser Thr Gln Ala

<210> 7

<211> 325

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser

325

<210> 8

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn

1 5 10 15

Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

20 25 30

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser

35 40 45

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

50 55 60

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

65 70 75 80

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala

85 90 95

Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

100 105 110

Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

115 120 125

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

130 135 140

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

145 150 155 160

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser

165 170 175

Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln

180 185 190

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg

195 200 205

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys

210 215 220

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

225 230 235 240

Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys

245 250 255

Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr

260 265 270

Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro

275 280 285

Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser

290 295 300

Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro

305 310 315 320

Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser

325 330 335

Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala

340 345 350

Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly

355 360 365

Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg

370 375 380

Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr

385 390 395

<210> 9

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser

1 5 10 15

Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu

20 25 30

Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys

35 40 45

Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe

50 55 60

Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp

65 70 75 80

Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr

85 90 95

Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro

100 105 110

Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe

115 120 125

Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp

130 135 140

Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe

145 150 155 160

Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala

165 170 175

Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr

180 185 190

Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala

195 200 205

Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn

210 215 220

Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln

225 230 235 240

Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

245 250 255

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser

260 265 270

Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg

275 280 285

Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly

290 295 300

Arg

305

<210> 10

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

1 5 10 15

Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu

20 25 30

Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser

35 40 45

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val

50 55 60

Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

85 90 95

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg

100 105 110

Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser

115 120 125

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln

130 135 140

Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala

145 150 155 160

His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe

165 170 175

Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn

180 185 190

Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn

195 200 205

Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu

210 215 220

Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly

225 230 235 240

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

245 250 255

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

260 265 270

Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr

275 280 285

Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

290 295

Claims (11)

1.一种酶标记的2019-nCoV抗原，其特征在于：采用高碘酸钠氧化法将2019-nCoV抗原与酶进行偶联得到，所述的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，所述2019-nCoV抗原包括氨基酸序列为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4所示的4种合成多肽，所述2019-nCoV抗原中的4种合成多肽的质量比为1：1：1：1。

2.一种制备权利要求1所述的酶标记的2019-nCoV抗原的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤A、酶活化；

a1、配制5-10mg/mL酶溶液；

a2、配制10-20mg/mL过碘酸钠溶液；

a3、将上述a1和a2配制溶液按体积比1：（1-3）混匀，室温避光反应0.5-2h；

a4、配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤a3配制溶液以1：（1-2）的体积混合，常温避光反应0.5-2h，活化即完成；

步骤B、酶标记2019-nCoV 抗原：

b1、将2019-nCoV抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h，当2019-nCoV抗原为合成多肽时，省略该步骤；

b2、将透析后的2019-nCoV抗原与步骤A活化的酶按质量比1:（2-4）进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；

当2019-nCoV抗原为合成多肽时，将合成多肽与步骤A活化的酶按摩尔比1:（1-3）进行混合，避光37℃反应8-12h；

b3、配置浓度为2-5mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mg酶加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；

b4、将上述步骤b3完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存；

步骤C：用酶稀释液将步骤B制得的酶活化标记2019-nCoV抗原稀释至工作浓度0.01-0.5μg/mL，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2-8℃。

3.一种新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1所述的酶标记的2019-nCoV抗原，还包括2019-nCoV抗原包被的固相载体；新型冠状病毒抗原为4种合成多肽时，4种合成多肽的质量比为（0.5-2）：（0.5-2）：（0.5-2）：（0.5-2）。

4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述固相载体为微孔板，所述包被2019-nCoV抗原的微孔板的制备方法包括如下步骤：

将2019-nCoV重组抗原用0.02-0.1M 磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2-4小时；弃去孔内液体，用pH7.4 PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.2-1％ BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2~8℃。

5.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述固相载体为磁性颗粒，所述包被2019-nCoV抗原的磁性颗粒的制备方法包括如下步骤：

取100mL 0.05-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，加入50-100mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌0.5-2h，之后加入10-40mg的2019-nCoV抗原，然后加入EDC，其浓度为5-10mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.01-0.05M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01-0.05M PBS定溶至1L即可。

6.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括稀释液，当酶为碱性磷酸酶时，所述稀释液包括如下组分：1-5g /LTris、10-20g /LNaCl、1-5g/L CaseinNa、1-5mL/L吐温20、1-5mL/L ProClin^TM300，2-10mL/L硫酸庆大霉素；用pH计测定其pH值，用6M HCl 或2M NaOH 调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

7.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括稀释液，当酶为辣根过氧化酶时，所述稀释液包括如下组分：4-10g/LTris、1-5g/LCaCl₂，1-10g/mLBSA，10-30g /mLNaCl，1-5g /mLCaseinNa，体积百分比0.5-5%的吐温20，体积百分比1-5%的 ProClin^TM300，体积百分比0.5-5%的硫酸庆大霉素；用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。

8.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括化学发光液，当酶为碱性磷酸酶时，所述化学发光液的制备方法包括如下步骤：

1）量取600-900mL的纯化水；

2）向步骤1）中分别添加0.1-1gAMPPD、0.01-0.1g Na₂SO₃、1-10gSDS、2-15gTris，搅拌至完全溶解；

3）向步骤2）中分别添加0.02-0.1mLTween-20和0.5-2mL Proclin^TM300，定容至1L；

4）调节pH至9.0±0.5，储存于2~8℃。

9.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括化学发光液，当酶为辣根过氧化酶时，所述化学发光液包括化学发光液A和化学发光液B，所述化学发光液A为0.5-1.5g/L的鲁米诺、0.05-0.2g/L的对碘酚和缓冲液混合而得，所述缓冲液为pH8.5-10的2-10mmol/L Tris-HCl，避光保存；所述化学发光液B为0.5-1g/L的过氧化脲，用工艺用水配制而得。

10.根据权利要求3所述的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括浓缩洗液，所述浓缩洗液由包括50-100g/L的磷酸氢二钠、5-10g/L的磷酸二氢钠、100-300g/L的NaCl、5-20mL/L的Tween-20和体积百分比1-5%的Proclin300混合而得。

11.权利要求3-10任一所述的试剂盒在检测新型冠状病毒的应用。

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