CN101160413B

CN101160413B - 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN101160413B
Application number: CN2005800476286A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏
Original assignee: Shenzhen Feipeng Biological Co ltd
Current assignee: Fapon Biotech Inc
Priority date: 2005-02-02
Filing date: 2005-05-10
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2025-05-10
Also published as: US7658930B2; US20090029348A1; CN101287989B; JP2008529015A; CN101160413A; WO2006081718A1; EP1845378A4; CN101287989A; US20080193955A1; EP1845378A1; WO2006081701A1

Abstract

本发明提供一种双抗原夹心法检测HCV抗体的试剂盒，该试剂盒以“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-酶标记物-可识别信号”形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步结合反应，该试剂盒的特征在于所述第二抗原稀释液和酶标记物稀释液分为两个容器包装，在检测过程中二者分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育。本发明解决了双抗原夹心法检测HCV抗体试剂盒中酶标记物对第二抗原活性的影响以及第二抗原可能存在的错配二硫键问题，在提高了第二抗原的活性的同时避免了酶活性的丧失，因此提供了灵敏度、特异性均有较大提高的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒。

Description

一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体来说，本发明涉及HCV抗体检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的严重肝脏疾病。全世界现有1.7亿的HCV感染者，我国的感染人数超过了4000万，在HCV感染者中约有50-85％会发展成慢性肝炎，约10-15％会发展为肝硬化。丙型肝炎病毒给人类健康带来极大的危害，给社会经济造成极大的负担。

自1989年Choo等成功克隆HCV基因以来，HCV的诊断检测技术已取得了巨大进展。目前检测丙型肝炎主要有三个途径：用PCR检测HCVRNA；用单克隆抗体检测HCV抗原；用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白印染法等检测HCV抗体。

ELISA检测HCV抗体的试剂已经发展了三代，第一代ELISA-1试剂盒于1990年由英国Ortho诊断公司开发，抗原是利用美国Chiron公司提供的HCV NS4基因重组抗原C100-3，但是其敏感性及特异性不理想。之后第二代ELISA-2取代了ELISA-1，ELISA-2试剂盒由英国Ortho诊断公司和美国Abbott诊断公司分别开发，使用抗原包括CORE、NS3和NS4抗原，其敏感性和特异性有所改善，在慢性丙肝病人中用ELISA-2检测，其阳性率为92-95％。由于采用CORE及NS3抗原使HCV血清阳转的平均窗口期由16周缩短为10周。第三代ELISA-3试剂盒由英国Ortho诊断公司、美国Abbott诊断公司、法国Sanofi诊断公司率先开发生产，使用抗原包含CORE、NS3、NS4和NS5抗原。采用ELISA-3检测献血员及高危人群的HCV，其敏感性均有增加，约为97％，HCV血清阳转的平均窗口期缩短至7-8周。

由于ELISA在诊断上具有易于自动化、使用方便、重复性好、成本低并且有利于实验数据的分析整理和保存，所以目前国际上筛查HCV抗体的商品化试剂主要是利用间接法开发的第二代或第三代ELISA试剂盒。虽然ELISA试剂已经经过了三代改进，但仍有不足之处，主要体现为漏检、假阳性、不确定结果仍较多。这主要是由于间接法试剂在方法学上存在的缺陷引起的，具体表现如下：

1.特异性差：由于间接法采用了非特异性识别的第二抗体(以下简称二抗)标记，这种非特异性的识别导致其较低的特异性；

2.灵敏度低：由于特异性差，试剂盒中包被抗原、标记二抗的使用浓度被迫降低，待测样品量减少，样品稀释倍数增加又进一步导致了灵敏度的降低；

3.窗口期长：一般使用的二抗为抗IgG抗体，只能检测抗体中的IgG组分，对其它类型抗体尤其是早期出现的IgM抗体无法检出，致使灵敏度低并且延长了窗口期。

目前，丙型肝炎的输血后感染占输血后肝炎病例的70％，而在丙型肝炎感染者中更有80-90％是属于输血后感染。这在很大程度上是由于现有间接法试剂的上述缺陷造成的，因此需要开发出高灵敏度、高特异性的HCV抗体诊断试剂。

双抗原夹心法是利用标记抗原代替间接法中的标记二抗，从方法学上解决了间接法的上述缺陷。但是，在双抗原夹心方法广泛应用于抗体检测的今天，之所以筛查HCV抗体的试剂盒仍没有采用较为先进的双抗原夹心法，主要是因为：

1.HCV蛋白抗原经酶标记后的活性损失问题

目前抗原标记主要将标记物如辣根过氧化物酶(HRP)直接标记到抗原上，但这种方法在HCV抗原的标记过程中遇到了问题。首先，由于HCV的主要抗原表位区段NS3抗原是对构象依赖性较强的抗原，当被分子量较大的“柔性”标记物如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记后，其构象变化较大，且活性表位不易暴露，标记后NS3抗原的活性大为降低；其次，HCV的另一主要抗原表位区段CORE的主要活性区富含赖氨酸，这些赖氨酸对 CORE的活性至关重要，而赖氨酸侧链上的游离氨基又往往是标记反应(如NaIO₄氧化法标记HRP)的主要靶基团，所以标记后CORE抗原的活性大大降低，最终使试剂盒的灵敏度还不如间接法，存在着严重漏检。即便是HCV抗原的间接标记，按照传统办法将第二抗原与酶标记物预先混合形成酶复合物时，分子量较大的酶标记物对构象依赖性的HCV第二抗原的活性也会造成较大的影响。

2.高本底问题

CORE区抗原有很强的体内或体外的同源及异源结合能力(Matsumoto，M.等，Virology，218：P43-51，1996；Kunkel，M.等，Virology，294：P239-245，2002；Majeau，N.等，Journal of General Virology，85：P971-981，2004)，在双抗原夹心法中标记抗原(第二抗原)利用此种结合能力与包被抗原(第一抗原)同源结合造成试剂盒的高本底。

3.重组HCV第二抗原由于可能存在的错配二硫键引起抗原构象改变

HCV的主要抗原表位区段NS3抗原含有多个半胱氨酸残基(仅a.a.1196-1473就有7个Cys)，当重组表达时，此蛋白可能形成错配的二硫键，从而改变天然的构象，导致NS3抗原活性降低，CORE抗原表位也因为暴露不充分而引起活性降低。

美国专利US6096319、US6270960、US6306579提到使用重组NS3抗原利用双抗原夹心法原理检测HCV抗体的方法，并提出使用巯基试剂来提高NS3抗原的活性，其实施例中使用的是将标记物钌金属复合物直接标记第二抗原后作为标记抗原的电化学检测方法。但是这三个专利提到的夹心法均为仅利用NS3抗原进行的，没有研究巯基试剂的加入对CORE抗原活性的影响。而且没有提到以酶为标记物的酶联免疫HCV双抗原夹心检测方法，因此没有涉及到当使用巯基试剂来提高HCV抗原活性的同时也使酶活性丧失(如天然辣根过氧化物酶有四个二硫键，分别由11-91，44-49，97-301，177-209位半胱氨酸形成)这一问题以及针对这一问题的解决方案。

美国专利US6630298介绍的方法中第二抗原与酶标抗第二抗原外源蛋白SOD抗体以复合物的形式一步加入参加反应，其缺点在于：1、HCV抗原与分子量很大的酶标抗体结合导致其构象受到一定的破坏并且表位不易暴露，造成第二抗原活性降低，使检测的敏感性降低；2、没有提及用于提高HCV抗原活性的方法。

公开号为CN 1548958A的专利申请介绍的也是HCV双抗原夹心法。该专利申请没有公开所使用的HCV抗原的具体区段，也没有提及在反应系统中加入还原试剂用于提高HCV抗原活性的方法。

李保昌等，中国实验血液学杂志，12(3)：P359-362，2004介绍的方法虽然研究了生物素化HCV抗原，但该文章仅停留在抗原水平的研究上，没有提出对双抗原夹心法HCV抗体诊断试剂在开发中会遇到的上述难题的具体解决办法。

美国专利US6613530的HCV双抗原桥式夹心法也没有提到用于提高HCV抗原活性的方法。

为了解决HCV蛋白经酶标记后的活性损失问题和高本底问题，2005年2月2日申请的PCT/CN2005/00149的专利申请公开了HCV重组蛋白的间接标记方法，并以之制成了较现有间接ELISA试剂盒有较大改善的夹心法试剂盒。

本发明解决了目前双抗原夹心法试剂盒存在的技术问题，尤其是将第二抗原与酶标记物作为试剂盒的两个独立成分分别包装，并且在检测时分两步加入反应系统并分别进行孵育的分步检测步骤，不仅解决了在不分步的情况下当第二抗原稀释液和酶标记物稀释液放入同一容器或者分别包装的两种溶液在检测时预先混合时，酶标记物与第二抗原结合后对第二抗原构象的影响，造成的第二抗原活性降低的问题；而且可以在第二抗原稀释液中加入还原试剂，在提高第二抗原活性的同时避免了还原试剂对酶活性的破坏，进一步提高试剂盒的灵敏度。

发明的目的

本发明的目的在于提高HCV抗原尤其是第二抗原的活性，结合生物素-亲和素放大系统，提供灵敏度、特异性均较目前试剂有较大提高的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒。

发明概述

本发明提供一种检测HCV抗体的试剂盒，该试剂盒以“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-酶标记物-可识别信号”形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步的结合反应，该试剂盒包括样品稀释液、第二抗原稀释液、酶标记物稀释液，所述第二抗原稀释液和酶标记物稀释液分别采用独立包装。

在本发明实施方案中，所述第二抗原稀释液中含有还原试剂。

在本发明实施方案中，所述还原试剂包括但不限于β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

在本发明实施方案中，当检测流程中待测样品和第二抗原同时加入反应系统中并一起进行孵育时，样品稀释液和第二抗原稀释液可以是同一溶液，即包装于一个容器中的第二抗原稀释液，其中第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.01-50‰，优选为0.05-20‰，更优选为1-10‰，最优选为5‰。

在本发明实施方案中，待测样品和第二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，其中第二抗原稀释液的β-巯基乙醇浓度为0.01-50‰，优选为0.05-30‰，更优选为0.2-20‰，更优选为0.5-10‰，更优选为0.5-5‰，最优选为1‰。

在本发明实施方案中，所述样品稀释液中含有可以还原二硫键的还原试剂，包括但不限于β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

在本发明实施方案中，待测样品和第二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，使用的样品稀释液的β-巯基乙醇浓度为0.01-50‰，优选为0.1-20‰，更优选为0.5-10‰，最优选为5‰。

在本发明实施方案中，所述试剂盒包括预包被酶标板、第二抗原、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照、阳性对照、盖板膜、自封袋及说明书和包装盒。

在本发明实施方案中，所述第二抗原为HCV蛋白与标签的结合物，标签包括肽类标签或非肽类标签。

在本发明实施方案中，所述肽类标签为含有His Tag、T7 Tag、S Tag、Flag Tag、HA Tag或HCV肽片段的肽或蛋白。

在本发明实施方案中，所述非肽类标签为化合物、半抗原、维生素、类固醇、染料、激素、抗生素、核酸或者为它们与肽或蛋白的组合物。

在本发明实施方案中，所述化合物为二硝基苯酚或溴脱氧尿苷；维生素为生物素或其衍生物；类固醇为地高辛；染料为吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯或荧光素。

在本发明实施方案中，所述标签为生物素。

本发明还提供一种用本发明所述试剂盒检测HCV抗体的方法，该方法以“支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-酶标记物-可识别信号”形式完成检测，包括以下检测步骤：

A.第一抗原捕获抗体：加入待测样品后孵育，预包被酶标板上的第一抗原捕获样品中的HCV抗体；

B.抗体捕获第二抗原：加入第二抗原溶液后孵育，HCV抗体捕获第二抗原；

C.检测：利用标签通过一步或几步孵育引入酶标记物进行检测；

其中B步骤在还原条件下进行，步骤A和B可以合并，即待测样品和第二抗原可同时加入反应系统中一起进行孵育，其特征为在检测流程中所述第二抗原与酶标记物分两步依次加入反应系统并分别进行孵育。

附图简述

图1为间接法ELISA检测HCV抗体原理示意图。

图2为一步夹心法ELISA检测HCV抗体原理示意图。

图3为两步夹心法ELISA检测HCV抗体原理示意图。

图4为三步夹心法ELISA检测HCV抗体原理示意图。

图5为表达载体质粒P2的质粒图谱。

图6为第一抗原表达质粒P2-HCVAg1的质粒图谱。

图7为第二抗原表达质粒P2-X-Y的质粒图谱。

定义

本发明中使用的术语除非另有说明，否则具有以下含义。

本发明中使用的术语“还原试剂”为蛋白质二硫键的还原试剂，即可以将蛋白质内部或之间由两个半胱氨酸侧链巯基形成的二硫键还原为游离巯基的试剂，包括但不限于β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

本发明中使用的术语“第一抗原”为包被抗原。

本发明中使用的术语“第二抗原”是HCV蛋白与标签的结合物，第二抗原可以为一个或几个，其各自的标签满足本发明限定条件。

本发明中使用的术语“一步法”指试剂盒完成支持物-第一抗原结合后，同时加入待测样品及第二抗原，一起进行孵育后洗板，再加入酶标记物；以此检测流程开发的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒简称一步法试剂盒。

本发明中使用的术语“两步法”指试剂盒完成支持物-第一抗原-待测HCV抗体结合并洗板后，再加入第二抗原和酶标记物或其复合物进行孵育；以此检测流程开发的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒简称两步法试剂盒。

本发明中使用的术语“三步法”指试剂盒完成支持物-第一抗原-待测HCV抗体结合并洗板后，加入第二抗原溶液进行孵育后洗板，再加入酶标记物；以此检测流程开发的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒简称三步法试剂盒。

本发明中使用的术语“生物素或其衍生物”为生物素或其功能性衍生物，包括但不限于D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素、脱硫生物素等，其共同特征为含有可与亲合素结合的咪唑酮环或其功能类似结构。

本发明中使用的术语“肽”和“蛋白”具有本领域技术人员所理解的一般含义，而且可以互换使用。

本发明中使用的术语“CORE”和“NS3”分别指HCV核心蛋白和非结构蛋白3。其中前者指HCV全基因编码蛋白的a.a.1-191(a.a.为氨基酸的简写，本发明中a.a.A-B表示HCV全基因编码蛋白的第A个氨基酸到第B个氨基酸的区段，其中B＞A)区段，后者指HCV全基因编码蛋白的a.a.1027-1657区段。

本发明中使用的术语“生物素接受蛋白”(Biotin Acceptor Protein)为生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl-carrier protein，BCCP)家族或其功能区段、SEQ ID NO.3多肽或其功能类似物(详见Peter，J.S.等，Biotechnology，11：1138-1143，1993)，本发明选择的生物素接受蛋白可以为上述肽或蛋白的一个、几个或几个的组合。

本发明使用术语“标签”为与HCV蛋白连接的并且可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的物质，包括肽类标签和非肽类标签。

所述肽类标签为肽或蛋白质，包括包含有His Tag、T7 Tag、S Tag、FlagTag、HA Tag(有多种肽可以选择，详见Abcam公司epitope tags章节的产品介绍http://www.abcam.com)或第一抗原中所没有的且其结合能力不至于引起高本底的HCV肽片段等所有存在或可制备出相应结合配偶体的肽或蛋白，其主要特征为“可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的”核心物质为肽或蛋白。所述His Tag指6个连续组氨酸，即6×His。

所述肽类标签为外源蛋白时，其分子量小于30KD，优选小于20KD，进一步优选小于15KD，再进一步优选小于10KD，更进一步优选小于5KD。

所述肽类外源蛋白标签位于HCV蛋白的N端时，分子量小于5KD；位于HCV蛋白的C端时，分子量小于20KD。

所述非肽类标签为化合物(如二硝基苯酚、溴脱氧尿苷)、半抗原、维生素(如生物素或其衍生物)、类固醇(如地高辛)、染料(如吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯、荧光素、Oregon Green、Lucifer yellow、Alexa Fluor、CascadeBlue)、激素、抗生素、核酸等(有多种非肽类物质可以选择，详见Invitrogen公司分子探针的产品介绍http://www.probes.com)所有存在或可制备出相应结合配偶体的非肽类物质。其主要特征为“可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的”核心物质为非肽或蛋白类物质。

标签可以是一个、几个或几个的组合，可以在HCV抗原的N端、C端、两端或内部。

标签应尽可能小，以减少对HCV抗原活性的损伤。

本发明中使用的术语“结合配偶体”为可以和标签相互结合的配体或受体，当选用非肽类标签时，其结合配偶体为该标签的特异性受体或抗体，如选用生物素或其衍生物或它们与肽或蛋白的结合物为标签时，其结合配偶体为亲和素、链霉亲和素、中性链亲和素、它们的类似物、抗生物素或其衍生物抗体；当选用肽类标签时，其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中使用的术语“柔性”和“刚性”主要指物质的结构易变性，如HRP等大分子蛋白质与HCV抗原交联时，其会与HCV抗原“纠缠”在一起致使后者结构改变进而影响其活性，此类物质即为“柔性”物质；相反，如聚苯乙烯、胶体金等与HCV抗原交联时，双方并不会“纠缠”在一起，这时HCV抗原的构象变化不大，此类物质即为“刚性”物质。

本发明中使用的术语“表达宿主”包括原核、真核表达系统宿主，包括但不限于细菌，例如大肠杆菌、枯草杆菌等；酵母例如甲醇酵母、酿酒酵母等；真核细胞例如昆虫细胞、哺乳动物细胞等；病毒；组织、器官或生物活体反应器等。

本发明中使用的术语“支持物”包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、硅化物等材料制备的酶标板、小球、微粒子、玻片、芯片、塑料、薄膜等。

本发明中使用的术语“待检测样品”为所有可被HCV感染的物种的体液，包括但不限于全血、血清、血浆、分泌物、尿液、唾液、脑脊液、淋巴液、组织液，粪便浸出液，细胞培养液或细胞、组织、器官匀浆液等。

本发明试剂盒主要优势

1.第二抗原稀释液中加入还原试剂而且检测流程中第二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中并分别进行孵育的优势：

A.若第二抗原与酶标记物同时或预先混合后加入反应系统中一起进行孵育，则分子量较大的酶标记物与第二抗原特异性结合后会使第二抗原的表位暴露不充分，而且会对HCV抗原的构象破坏较大，使第二抗原的活性大大降低，将第二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中并分别进行孵育可避免这一现象；

B.若第二抗原与酶标记物同时或预先混合后加入反应系统中一起进行孵育，如果在其稀释液中不加入还原试剂则HCV抗原活性较低；如果加入还原试剂又会破坏酶的活性，因为多数酶含有天然二硫键，所以若加入还原试剂将破坏天然二硫键进而影响酶的结构，使酶失活。本发明检测流程中第二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中分别进行孵育并在第二抗原稀释液中加入巯基试剂解决了这一矛盾。

2.在样品稀释液中加入还原试剂的优势：

A.使待测样品中的抗体与HCV抗原在还原条件下进行反应，保证HCV抗原的高活性；

B.在检测流程为待测样品和第二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，样品稀释液中若不加入还原试剂，则IgM抗体将以五聚体的形式被第一抗原捕获，而当第二抗原加入后，为了提高第二抗原的活性又必须在其稀释液中加入还原试剂，这样靠二硫键相互结合的IgM抗体的五聚体被打开，使一部分第二抗原与游离的IgM抗体单体结合而无法参加检测反应，不利于IgM抗体的检测进而不利于窗口期的缩短。在样品稀释液中加入还原试剂解决了上述问题。

反应系统各种缓冲液中加入还原试剂的浓度

还原试剂的加入可以打开HCV抗原内部的错配二硫键，提高HCV抗原的活性。因此，本发明反应系统的各种缓冲液中除酶稀释液外均加入一定浓度的还原试剂。所说的还原试剂可以为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠等所有可以还原二硫键的试剂。

其中β-巯基乙醇在各种缓冲液中的浓度范围为：

1.包被液中β-巯基乙醇的浓度范围为0.5-5‰，优选1‰。

2.封闭液中β-巯基乙醇的浓度范围为0.5-5‰，优选1‰。

3.一步法样品稀释液与第二抗原稀释液为同一稀释液时，其中β-巯基乙醇的浓度为0.01-50‰，优选为0.05-20‰，更优选为1-10‰，最优选为5‰。

4.三步法样品稀释液中β-巯基乙醇的浓度为0.01-50‰，优选为0.1-20‰，更优选为0.5-10‰，最优选为5‰。

5.三步法第二抗原稀释液中β-巯基乙醇的浓度为0.01-50‰，优选为0.05-30‰，更优选为0.2-20‰，更优选为0.5-10‰，更优选为0.5-5‰，最优选为1‰。

本领域普通技术人员按现有常规技术或本发明的精神，可以选择其它还原试剂及其浓度。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。

实施例1 第一抗原的制备

本发明参考罗文新等，生物工程学报，16(5)：P578-581，2000，得到改造载体pTO-T7，合成引物扩增其NdeI和BamHI之间的基因序列，上游引物带有NdeI和BamHI位点，下游引物带有BamHI和EcoRI位点。片段回收后(本发明所使用的分子生物学提取和回收试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司)经NdeI/EcoRI(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司)酶切后克隆到同样酶切处理的pTO-T7载体上。阳性克隆经BamHI单酶切后回收载体再自身连接，即除去了pTO-T7载体上NdeI和BamHI之间的T7Tag基因，得到的载体命名为P1。

由于载体P1的T7启动子的上游有一个BglII位点，不利于本发明的克隆。因此合成引物扩增载体P1的BglII和XbaI之间的基因片段，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有XbaI位点。片段经BamHI/XbaI酶切后克隆到BglII/XbaI酶切后的载体P1上，得到的阳性克隆即为BglII位点被封闭的表达质粒P2，也就是本发明所使用的克隆载体，在实施本发明的过程中P1和P2并不是必需表达载体，其上游的增强子在本发明中也不起实质作用，构建此载体只是为了克隆方便，其它许多表达载体如pET-24a(+)(美国Novagen公司，货号69749-3)均可用于实施本发明。

PCR扩增a.a.1201-1465基因(SEQ ID NO.2中第1-795位核苷酸)，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。PCR扩增a.a.2-59基因(SEQ ID NO.1中第4-177位核苷酸)，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。通过BamHI/EcoRI酶切将片段a.a.1201-1465基因克隆到同样酶切处理的表达载体P2上得到P2-G。将该克隆载体BglII/EcoRI酶切后插入经BamHI/EcoRI酶切的片段a.a.2-59基因，得到的阳性克隆为P2-G-CORE(a.a.2-59)，也即本发明第一抗原的表达质粒，命名为P2-HCVAg1，含有该质粒的菌株(Escherichia coli ER2566/P2-HCVAg1)已经于2005年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编430072)，保藏号为：CCTCC M205009，其表达抗原命名为HCVAg1。

将P2-HCVAg1转化大肠杆菌ER2566(美国New England Biolabs公司)，涂布于含100ug/ml卡那霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号KE170)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度卡那霉素的500ml LB培养基37℃振荡培养至OD₆₀₀1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG(生工，货号IB0168)进行诱导，诱导条件为：37℃，200rpm，4小时。4℃5000rpm离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)重悬，超声破碎，4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体，用含2％TritonX-100(生工货号T0694)的溶液I(20mM Tirs-HCl，pH8.5，5mM EDTA，100mM NaCl)重悬，4℃12000rpm离心20分钟收集包涵体，用溶液I配制的4M尿素溶解后对100倍体积的PB缓冲液(pH7.0，20mM)透析，换液3次，4℃ 12000rpm离心20分钟去除沉淀后制成粗抗原，用同一PB缓冲液平衡Sephacryl S-200凝胶柱(美国Amersham Biosciences公司)后将上述粗抗原过柱，收集并合并含目的蛋白的溶液，再过CM琼脂糖离子交换柱(美国Amersham Biosciences公司)，HCV抗原可被吸附，用PBS缓冲液(pH7.0，20mM PB，50mM NaCl)洗涤以去除未被吸附的杂蛋白，再以PBS缓冲液(pH7.0，20mM PB，500mM NaCl)洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，4℃或-20℃保存备用。

除了HCVAg1外，2005年2月2日申请号为PCT/CN2005/00149专利申请中的第一抗原也均可作为本发明中的第一抗原使用。

实施例2第二抗原以及酶标记物的制备

1生物素化第二抗原的制备

PCR扩增编码HCV抗原a.a.1-28(SEQ ID NO.1中第1-84位核苷酸)基因，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。PCR扩增编码生物素接受蛋白的基因片段L(SEQID NO.3)，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有BglII和EcoRI位点且两位点间含有终止密码TAA。

通过BamHI/EcoRI酶切将片段a.a.1-28基因克隆到BglII/EcoRI酶切处理的表达载体P2-G上，得到的阳性克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)命名为P2-HCVAg2，其表达抗原命名为HCVAg2。通过BamHI/EcoRI酶切将基因L克隆到BglII/EcoRI酶切处理的表达载体P2-G-CORE(a.a.1-28)上，得到的阳性克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-L命名为P2-X。

提取大肠杆菌ER2566总基因组，以其作为模板对大肠杆菌K12生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶BirA基因(SEQ ID NO.4)Y进行PCR扩增。扩增引物如下：

引物1：5′-CCC GAA TTC ATG AAG GAT AAC ACC GTG CC-3′

引物2：5′-GGG AAG CTT TTA TTT TTC GGC ACT ACG CAG GGATAT TTC ACC-3′

其上游引物带有EcoRI位点，下游引物带有HindIII位点且含有终止密码TAA。扩增出的基因片段Y经EcoRI/HindIII酶切后克隆到同样酶切处理的质粒载体P2-X中，得到的阳性克隆命名为P2-X-Y，也即本发明优选第二抗原的表达质粒，含有该质粒的菌株(Escherichia coli ER2566/P2-X-Y)已经于2005年1月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编430072)，保藏号为：CCTCC M205010。基因X和Y之间有一个终止密码TAA，因此在P2-X-Y中，基因X和Y组成了在同一表达调控元件作用下的双顺反子。

将P2-X-Y转化大肠杆菌ER2566，涂布于含100ug/ml卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度卡那霉素且含终浓度20uM D-生物素(美国Sigma-Aldrich公司，货号B-4501)的500ml LB培养基37℃振荡培养至OD₆₀₀1.0左右，用终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，诱导条件为：37℃，200rpm，4小时。离心收集菌体，每升菌液的菌体用10ml裂解缓冲液重悬，超声破碎，4℃12000rpm离心20分钟的上清经10％-30％饱和硫酸铵沉淀，用PB缓冲液(100mM，pH7.0)复溶，4℃12000rpm离心10分钟除去不溶物后，再经过含SoftLink Soft Release Avidin树脂的亲和素层析柱纯化(纯化过程详见美国Promega公司，货号V2012说明书)，以含有5mM D-生物素的PB缓冲液(100mM，pH7.0)洗脱即得纯化的生物素化抗原，然后对100倍体积的PB缓冲液透析以去除游离生物素，换液3次，离心上清测定蛋白浓度，4℃或-20℃保存备用。表达纯化得到的抗原为HCVAg。

在本生物素化方法中，我们又进一步尝试了在X的终止密码和Y的起始密码之间加入SD序列(具体方法为基因工程现有常规技术，详细可参考Tsao，K.L.等，Gene，169；P59-64，1996)，使基因Y编码蛋白的表达量增加，可以在一定程度上提高生物素化效率进而提高本发明试剂盒的灵敏度。

除了HCVAg外，2005年2月2日申请号为PCT/CN2005/00149专利申请中的生物素化第二抗原均可作为本发明中的第二抗原使用。

2带有肽类标签的第二抗原的制备

PCR扩增编码HCV抗原a.a.1-28(SEQ ID NO.1中第1-84位核苷酸)基因，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点和终止密码TAA，并且在终止密码的上游带有His Tag。通过BamHI/EcoRI酶切将片段a.a.1-28基因克隆到BglII/EcoRI酶切处理的表达载体P2-G上，得到的阳性克隆P2-G-CORE(a.a.1-28)-His表达的目的蛋白即为带有肽类标签的第二抗原。另外，2005年2月2日申请号为PCT/CN2005/00149专利申请中的带有肽类标签的第二抗原均可作为本发明中的第二抗原使用。

下面将以生物素化第二抗原为例进行说明。

3酶标记物的制备

生物素的结合配偶体即链霉亲和素的酶标记方法为NaIO₄氧化法。称取10mgHRP溶解于1ml超纯水中，再缓慢滴加1ml超纯水新鲜配制的5mg/ml NaIO₄(生工，货号ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌40分钟后加入20％乙二醇(生工，货号E0582)溶液0.05ml，室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入事先对100mM，pH9.51碳酸盐缓冲液透析2小时，2.5mg/ml的链霉亲和素(生工，货号SE497)溶液1ml，4℃避光对100mM，pH9.51碳酸盐缓冲液透析过夜。次日，向混合物中滴加0.1ml新鲜配制的4mg/ml NaBH₄(生工，货号ST1268)溶液，混匀，4℃静置2小时。将上述液装入透析袋中，对PBS缓冲液(150mM，pH7.4)透析，4℃过夜。加入酶保护剂及终浓度50％的甘油混匀后-20℃避光保存备用。

实施例3还原试剂浓度的选择

以HCVAg1和HCVAg分别作为包被抗原，在包被液中加入不同浓度的β-巯基乙醇进行间接法检测(结果见表1)，我们在封闭液中加入不同浓度的β-巯基乙醇也得到了类似结果，结果显示还原试剂在一定的程度上提高HCV抗原的活性，表明重组HCV抗原存在着错配二硫键，而还原试剂的处理使错配二硫键能够重新打开，让HCV抗原恢复原来的构象。β-巯基乙醇在包被液和封闭液中的最适浓度范围是0.5-5‰，优选1‰。

表1包被液中β-巯基乙醇对HCV间接法试剂盒灵敏度的影响

注：Cut Off值＝0.200

将HRP稀释一定的比例，在其中加入不同浓度的还原试剂后直接加入底物显色，结果是随着还原试剂浓度的增加HRP的活性逐渐降低直至消失，该结果表明还原试剂对HRP的活性有破坏作用，也说明HRP内部的四个二硫键对维持其活性至关重要。

综合上述结果，一方面还原试剂可在很大程度上提高HCV抗原的活性，另一方面它又对HRP的活性有破坏作用。当第二抗原与酶标记物一起加入反应系统中时，为了使以此方法进行检测的试剂盒达到最佳检测效果，就必须摸索出还原试剂合适的使用浓度。

我们在第二抗原与酶标记物的稀释液中加入一定浓度的β-巯基乙醇，并进行试剂盒灵敏度的检测(数据见表2)，由此得出β-巯基乙醇的最佳浓度为0.075‰，此时灵敏度达到最高。

表2两步法第二抗原的稀释液中β-巯基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响

注：Cut Off值＝0.150

本发明同样也在一步法和三步法试剂盒的第二抗原稀释液中加入β-巯基乙醇，研究不同浓度的巯基乙醇对灵敏度的影响。表3和表4的结果均表明加入巯基乙醇后，一步法的阳性血清OD平均值/Co从7.24提高到了16.54，而三步法也从从7.35提高到了17.26，不同浓度的巯基乙醇均有作用，试剂盒的灵敏度得到较大改善。本结果进一步验证了巯基试剂可以打开重组HCV抗原的错配二硫键，让HCV抗原恢复原来的构象，在一定的程度上提高HCV抗原的活性。由表3结果我们确定了一步法第二抗原稀释液中β-巯基乙醇的浓度为0.01-50‰，优选为0.05-20‰，更优选为1-10‰，最优选为5‰。由表4结果我们确定三步法第二抗原稀释液中β-巯基乙醇的浓度为0.01-50‰，优选为0.05-30‰，更优选为0.2-20‰，更优选为0.5-10‰，更优选为0.5-5‰，最优选为1‰。

表3一步法第二抗原稀释液中β-巯基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响

注：Cut Off值＝0.150

表4三步法第二抗原稀释液中β-巯基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响

注：样品稀释液中已加入5‰β-巯基乙醇

Cut Off值＝0.150

我们尝试在三步法试剂盒第二抗原稀释液中加入1‰β-巯基乙醇的同时，在其样品稀释液中也加入β-巯基乙醇，见表5。由表中结果我们可以确定三步法样品稀释液中β-巯基乙醇的浓度为0.01-50‰，优选为0.1-20‰，更优选为0.5-10‰，最优选为5‰。

表5三步法样品稀释液中β-巯基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响

注：Cut Off值＝0.150

我们又进一步对针对CORE区抗原的抗体进行了如上述三步法同样的样品稀释液和第二抗原稀释液中β-巯基乙醇浓度的摸索，也得到了与上述结果类似的结论，其中针对CORE区抗原的抗体主要是利用CORE区抗原制备亲和柱，纯化不同患者血清中HCV抗体中针对CORE抗原的多抗。这说明β-巯基乙醇的加入除了能打开NS3抗原的错配二硫键，提高NS3抗原的活性外，还能够提高CORE区抗原的活性，推测是与打开NS3抗原错配二硫键的同时使CORE区抗原的表位暴露更加充分有关。

另外，我们也尝试了利用二硫苏糖醇代替β-巯基乙醇作为巯基试剂，但在稳定性考核实验中发现其如许多报道所提到的一样稳定性相对较差，并且其还原二硫键的能力在本试剂盒中与β-巯基乙醇相当，并不像有些报道所提到的远远好于β-巯基乙醇。

实施例4本发明试剂盒的生产及检测流程

1.生物素化HCV抗原作为第二抗原的试剂盒

将HCV包被抗原以一定比例用碳酸盐缓冲液(50mM，pH9.51，含1‰β-巯基乙醇(生工，货号M0482))稀释，100ul/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)，4℃包被24小时，次日用PBST(10mM PB，150mMNaCl，0.05％Tween-20，pH7.4)洗涤液洗板二次，拍干。120ul/孔加入含30％新生牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，8％蔗糖，5‰酪蛋白(美国Sigma-Aldrich公司，货号C-8645)，1‰β-巯基乙醇，150mM NaCl的pH7.4，10mM PB封闭液，37℃封闭2小时，甩掉孔内液体，拍干。置室温20-25 ℃、湿度55％-65％、有通风设备的房间内风干后封装于加有干燥剂的铝膜袋中。

检测时可分一步、两步和三步三种方法进行，方法如下：

1.1一步法

在包被酶标板中先加入50ul含5‰β-巯基乙醇，0.5‰TritonX-100，20％新生牛血清，5‰酪蛋白，150mM NaCl及以一定比例稀释生物素化HCV第二抗原(临用前稀释)的pH7.4的20mM PB缓冲液，再50ul/孔加入待测样品、阴性(正常人阴性血清)、阳性(HCV抗体阳性血清)对照，37℃温育90分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。

用含1‰酪蛋白，20％新生牛血清及以一定比例稀释链霉亲和素酶标记物(临用前稀释)的pH7.4的20mM PB缓冲液，100ul/孔加入反应板，37℃温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。

加入含0.5‰过氧化氢尿素(生工，货号UB1753)、4.76‰三水合乙酸钠、0.9‰冰醋酸的显色剂A及含0.32‰ TMB(生工，货号TB0514)、5mM柠檬酸、0.5mMEDTA-2Na、5％甲醇、2‰二甲基甲酰氨的显色剂B各50ul，37℃避光显色30分钟。每孔加50ul，含2M硫酸的终止液终止反应，酶标仪450nm波长(参考波长630nm)空白孔校零后读取OD值，Cutoff Value计算：COV＝阴性对照平均OD值×2.0(阴性对照OD值低于0.075作0.075计算，高于0.075按实际OD值计算)，待测样品OD值≥COV为阳性，待测样品OD值＜COV为阴性。

1.2两步法

将一定稀释比例的HCV生物素化抗原加入(临用前加入)含0.5‰TritonX-100，20％新生牛血清，5‰酪蛋白，150mM NaCl及以一定比例稀释链霉亲合素酶标记物的pH7.4，20mM PB的酶稀释液中制成酶预备液。

在包被酶标板中先50ul/孔加入含5‰ β-巯基乙醇，0.5‰ TritonX-100，20％新生牛血清，5‰酪蛋白，150mM NaCl，pH7.4，20mM PB的样品稀释液，再加入50ul待测样品、阴性(正常人阴性血清)、阳性(HCV抗体阳性血清)对照，37℃温育60分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。

临用前往上述酶预备液中加入β-巯基乙醇至终浓度为0.075‰制成酶工作液，100ul/孔加入包被酶标孔中，37℃温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。显色及结果判定同前述1.1中的一步法。

1.3三步法：

在包被板中先加入标本稀释液(含5‰ β-巯基乙醇，1‰ TritonX-100，20％新生牛血清，pH7.4的20mM PB)50ul，再加入50ul待测样品、阴性、阳性对照，37℃温育60分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。

100ul/孔加入含1‰ β-巯基乙醇，1‰ TritonX-100，20％新生牛血清，150mM NaCl及以一定比例稀释的生物素化HCV抗原(临用前稀释)的pH7.4的20mM PB缓冲液，37℃温育30分钟后用PBST洗涤液洗板五次，拍干。

用含1‰酪蛋白，20％新生牛血清及以一定比例稀释链霉亲和素酶标记物的pH7.4的20mM PB缓冲液，100ul/孔加入反应板，37℃温育30分钟；用PBST洗涤液洗板五次，拍干。

显色及结果判定同前述1.1中的一步法。

上述生物素化HCV抗原及链霉亲和素酶标记物的稀释比例应根据实际情况具体摸索以达到最佳效果，反应物稀释比例及各步反应时间也可以根据需要在实际生产中进行调整以便在保证检测效果的同时缩短检测时间提高工作效率，这种摸索和调整为本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法，在此不再详述。

2.使用不同检测流程的试剂盒的比较

为了比较上述3种检测方式，我们以HCVAg1为第一抗原，以HCVAg为第二抗原，分别采用上述3种夹心方法检测12份丙型肝炎阳性血清(包括2份前滞血清)和10份阴性血清。结果如表6显示，当第二抗原和酶标记物一起加入时，试剂盒灵敏度较低，已经接近间接法检测时的灵敏度，无法体现出夹心法的优势。这表明：虽然我们已经确定了β-巯基乙醇的最佳浓度为0.075‰，但在这浓度下，β-巯基乙醇对HRP的活性影响还是存在的。我们又作了在三种方法的反应步骤中均不加β-巯基乙醇的实验，发现两步法灵敏度明显偏低，这说明酶标记物与第二抗原预先混合后第二抗原活性有较大损失。因此，本发明试剂盒的检测流程优选三步法和一步法。但由于一步法存在前滞效应(HOOK效应，如对前滞血清SP1和SP2的反应)，本发明试剂盒更优选三步法。本发明下面所提到的夹心法HCV抗体检测试剂盒如无特殊说明均指三步法。

表6采用不同检测流程时试剂盒灵敏度的比较

注：表中的数值为反应的OD值；

SP表示抗体滴度极高的阳性血清(即前滞血清)，

P表示阳性血清，N表示阴性血清，^*表示OD值大于3.0。

实施例5本发明试剂盒的性能评价

(一)、灵敏度

为了将生物素化HCV蛋白作为第二抗原的夹心法试剂盒与现有商品化间接ELISA试剂盒的灵敏度进行比较，我们以本发明的试剂盒对两份正常人阴性血清稀释的100份HCV阳性血清进行检测，对照选用英科新创(厦门)科技有限公司HCV间接法诊断试剂(简称新创间接法)及Abbott公司Murex Anti-HCV 4.0。结果如表7，表明本发明的试剂盒和商品化间接ELISA试剂盒对各稀释度血清反应的灵敏度差异均具有统计意义(P＜0.05)。由此可见，本发明试剂较现有间接法试剂的灵敏度有较大的提高。

表7 本发明试剂盒与现有商品化间接ELISA试剂盒的灵敏度比较

注：表中的数值表示各试剂对100份HCV阳性血清的检出数

(二)、特异性

本发明采用了三步特异性识别，所以较只有一步特异性识别的间接法试剂有了极大改善。我们用本发明试剂盒和英科新创(厦门)科技有限公司的HCV间接法试剂分别检测了3000份临床阴性血清，本试剂假阳性率为0.067％，而该间接法为0.67％，我们又进一步将后者的20份假阳性经Murex Anti-HCV 4.0间接ELISA试剂盒检测，仍有12份检测为阳性，其假阳性率最低为0.4％。

(三)、可疑血清

我们经过筛选，得到如下12份本室间接法试剂判定为阳性，HCVRIBA确证试剂(新加坡Genelabs公司，货号11130-018)检测为可疑，PCR检测(瑞士ROCHE公司COBAS Ampliscreen^TM HCV 2.0)为阴性，其提供者在临床上不具有任何肝炎症状的可疑血清(数据见表8)，除C5之外的11份血夹心法为阴性，用夹心法所使用的第一抗原和第二抗原包被的间接法检测均为阳性，RIBA结果除C4和C6外的9份血为NS4单独阳性，但本夹心法使用的两抗原均无NS4区段，综上所述，可推知这9份血应为本室间接法试剂的假阳性。C4和C6在夹心法试剂、Murex试剂和PCR检测中均为阴性，结合临床也基本可推断为本室间接法试剂的假阳性。C5虽然其在夹心法检测中为阳性，但夹心法反应OD值明显低于间接法，推测其应为间接与夹心的共同假阳性。同理可推导除C4、C6外的其它10份应为Murex Anti-HCV 4.0试剂盒的假阳性。综上所述，本发明试剂盒对可疑血清判定的准确性较现有商品化试剂和本室内部的间接法试剂均有较大提高。

表8本发明试剂盒检测可疑血清(均为阴性)情况

注：+表示阳性，-表示阴性

(四)、重复性

对阴、阳性待测样品各240份，采用不同时不同批次不同操作者进行多次检测，考查本发明试剂盒判定结果的重复性，结果显示本发明试剂盒对阴、阳性判定结果的重复性为100％。这表明本方法检测结果的再现性好，结果判定可靠。

(五)、稳定性

将整套试剂(包括包被酶标板、样品稀释液、第二抗原、第二抗原稀释液、链霉亲和素酶标记物、酶稀释液、阴性对照、阳性对照、显色剂A和B、终止液)37℃考核72小时，取出后与同时4℃存放的试剂在同一条件下检测相同的阴、阳性质控血清，其结果见表9。实验表明，两条件下标本测得OD值无明显差异，说明本发明试剂盒稳定性较好。

表9 本试剂盒稳定性实验结果

(六)、精密性

在同一反应板上对同一份已知阳性标本，多次平行做大于等于10孔重复检测，得到各孔的检测OD值，计算其CV值均低于15％，说明本试剂盒精密性较好。

序列表

<110>崔鹏

<120>一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及检测方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>177

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)

<220>

<223>丙型肝炎病毒全基因编码蛋白第1-59个氨基酸的编码序列

<400>1

ATGAGCACGA ACCCTAAACC TCAAAGAAAA ACCAAACGTA ACACCAACCG CCGCCCACAG 60

GACGTCAAGT TCCCGGGCGG TGGTCAGATC GTTGGTGGAG TTTACCTGTT GCCGCGCAGG 120

GGCCCCAGGT TGGGTGTGCG CGCGACTAGG AAGACTTCCG AGCGGTCACA ACCTCGT 177

<210>2

<211>795

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)

<220>

<223>丙型肝炎病毒全基因编码蛋白第1201-1465个氨基酸的编码序列

<400>2

CTAGAAACTA CCACGCGGTC TCCGGTTTTC ACAGACAACT CATCCCCCCC GGCCGTACCG 60

CAGACATTCC AAGTGGCCCA TCTACACGCT CCTACTGGCA GCGGCAAGAG CACTAAAGTG 120

CCGGCTGCAT ATGCGGCCCA AGGGTACAAG GTGCTCGTCC TGAACCCGTC CGTTGCCGCC 180

ACCTTAGGTT TTGGGGCGTA TATGTCTAAG GCACATGGTA TCGACCCTAG CGTCAGGACC 240

GGGGTAAGGA CCATCACCAC GGGTAGCCCC ATCACGTACT CCACCTATGG CAAGTTCCTT 300

GCTGATGGTG GTTGCTCTGG GGGTGCCTAT GACATTATAA TATGTGATGA GTGCCATTCA 360

ACTGACTCGA CTACTATCTT GGGCATCGGC ACGGTCCTGG ACCAAGCGGA GACGGCTGGA 420

GCGCGGCTTG TCGTGCTCGC CACCGCTACG CCTCCGGGAT CGGTCACCGT GCCACATCCC 480

AACATCCAGG AGGTGGCCCT GTCCAATACT GGAGAGATCC CCTTCTATGG TAAAGCCATC 540

CCCATCGAGG CCATCAGGGG GGGAAGGCAT CTCATTTTCT GCCACTCCAA GAAGAAGTGT 600

GACGAGCTCG CTGCAAAGCT ATCATCCCTC GGACTCAACG CTGTGGCGTA CTACCGGGGT 660

CTTGATGTGT CCGTCATACC ATCTAGCGGA GACGTCGTTG TCGTGGCAAC AGACGCTCTA 720

ATGACGGGCT TTACCGGCGA CTTTGACTCA GTGATCGACT GTAACACGTG CGTCACCCAG 780

ACAGTCGATT TCAGC 795

<210>3

<211>69

<212>DNA

<213>人工合成序列

<220>

<223>生物素接受蛋白的编码序列

<400>3

ATGGCTGGTG GTTTAAACGA CATCTTTGAA GCTCAGAAAA TCGAATGGCA TGAAGACACC 60

GGTGGCTCT 69

<210>4

<211>966

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223>大肠杆菌生物素-乙酰辅酶A羧化酶合成酶BirA的编码序列

<400>4

ATGAAGGATA ACACCGTGCC ACTGAAATTG ATTGCCCTGT TAGCGAACGG TGAATTTCAC 60

TCTGGCGAGC AGTTGGGTGA AACGCTGGGA ATGAGCCGGG CGGCTATTAA TAAACACATT 120

CAGACACTGC GTGACTGGGG CGTTGATGTC TTTACCGTTC CGGGTAAAGG ATACAGCCTG 180

CCTGAGCCTA TCCAGTTACT TAATGCTAAA CAGATATTGG GTCAGCTGGA TGGCGGTAGT 240

GTAGCCGTGC TGCCAGTGAT TGACTCCACG AATCAGTACC TTCTTGATCG TATCGGAGAG 300

CTTAAATCGG GCGATGCTTG CATTGCAGAA TACCAGCAGG CTGGCCGTGG TCGCCGGGGT 360

CGGAAATGGT TTTCGCCTTT TGGCGCAAAC TTATATTTGT CGATGTTCTG GCGTCTGGAA 420

CAAGGCCCGG CGGCGGCGAT TGGTTTAAGT CTGGTTATCG GTATCGTGAT GGCGGAAGTA 480

TTACGCAAGC TGGGTGCAGA TAAAGTTCGT GTTAAATGGC CTAATGACCT CTATCTGCAG 540

GATCGCAAGC TGGCAGGCAT TCTGGTGGAG CTGACTGGCA AAACTGGCGA TGCGGCGCAA 600

ATAGTCATTG GAGCCGGGAT CAACATGGCA ATGCGCCGTG TTGAAGAGAG TGTCGTTAAT 660

CAGGGGTGGA TCACGCTGCA GGAAGCGGGG ATCAATCTCG ATCGTAATAC GTTGGCGGCC 720

ATGCTAATAC GTGAATTACG TGCTGCGTTG GAACTCTTCG AACAAGAAGG ATTGGCACCT 780

TATCTGTCGC GCTGGGAAAA GCTGGATAAT TTTATTAATC GCCCAGTGAA ACTTATCATT 840

GGTGATAAAG AAATATTTGG CATTTCACGC GGAATAGACA AACAGGGGGC TTTATTACTT 900

GAGCAGGATG GAATAATAAA ACCCTGGATG GGCGGTGAAA TATCCCTGCG TAGTGCAGAA 960

AAATAA 966

Claims

1.一种检测HCV抗体的试剂盒，该试剂盒以支持物-第一抗原-待测HCV抗体-第二抗原-酶标记物-可识别信号的形式完成检测，其中第二抗原与酶标记物之间进行一步或多步的结合反应，该试剂盒包括样品稀释液、第二抗原稀释液、酶标记物稀释液，其特征在于所述第二抗原稀释液和酶标记物稀释液分别采用独立包装，其中第二抗原稀释液中含有还原试剂，检测流程中第二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中并分别进行孵育，其中所述第二抗原为HCV蛋白与标签的结合物，所述标签为生物素或其衍生物。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述还原试剂为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

3.权利要求2的试剂盒，其中所述还原试剂为β-巯基乙醇。

4.权利要求3的试剂盒，其中检测过程中待测样品和第二抗原同时加入反应系统中并一起进行孵育时，样品稀释液和第二抗原稀释液是同一溶液，即包装于一个容器中的第二抗原稀释液，其中第二抗原稀释液的β-巯基乙醇浓度为0.01-50‰。

5.权利要求3的试剂盒，其中第二抗原稀释液的β-巯基乙醇浓度为0.05-20‰。

6.权利要求3的试剂盒，其中第二抗原稀释液的β-巯基乙醇浓度为1-10‰。

7.权利要求3的试剂盒，其中第二抗原稀释液的β-巯基乙醇浓度为5‰。

8.权利要求3的试剂盒，其中待测样品和第二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.01-50‰。

9.权利要求8的试剂盒，其中第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.05-30‰。

10.权利要求8的试剂盒，其中第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.2-20‰。

11.权利要求8的试剂盒，其中第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.5-10‰。

12.权利要求8的试剂盒，其中第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.5-5‰。

13.权利要求8的试剂盒，其中第二抗原稀释液中的β-巯基乙醇浓度为1‰。

14.权利要求1-3和8-13任一项的试剂盒，其中所述样品稀释液中含有还原试剂。

15.权利要求14的试剂盒，其中所述还原试剂为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

16.权利要求15的试剂盒，其中所述还原试剂为β-巯基乙醇。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述样品稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.01-50‰。

18.权利要求17的试剂盒，其中所述样品稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.1-20‰。

19.权利要求17的试剂盒，其中所述样品稀释液中的β-巯基乙醇浓度为0.5-10‰。

20.权利要求17的试剂盒，其中所述样品稀释液中的β-巯基乙醇浓度为5‰。

21.权利要求1的试剂盒，所述试剂盒包括预包被酶标板、第二抗原、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照、阳性对照、盖板膜、自封袋及说明书和包装盒。

22.权利要求1-21任一项的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于检测HCV抗体。