CN101160413A

CN101160413A - 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN101160413A
Application number: CNA2005800476286A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏
Original assignee: Individual
Current assignee: Fapon Biotech Inc
Priority date: 2005-02-02
Filing date: 2005-05-10
Publication date: 2008-04-09
Anticipated expiration: 2025-05-10
Also published as: US20090029348A1; US7658930B2; JP2008529015A; CN101160413B; CN101287989B; EP1845378A4; WO2006081718A1; CN101287989A; WO2006081701A1; US20080193955A1; EP1845378A1

Abstract

本发明提供一种双抗原夹心法检测HCV抗体的试剂盒，该试剂盒以“支持物－第一抗原－待测HCV抗体－第二抗原－酶标记物－可识别信号”形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步结合反应，该试剂盒的特征在于所述第二抗原稀释液和酶标记物稀释液分为两个容器包装，在检测过程中二者分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育。本发明解决了双抗原夹心法检测HCV抗体试剂盒中酶标记物对第二抗原活性的影响以及第二抗原可能存在的错配二硫键问题，在提高了第二抗原的活性的同时避免了酶活性的丧失，因此提供了灵敏度、特异性均有较大提高的双抗原夹心法HCV抗体检测试剂盒。

Description

一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及检测方法技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体来说，本发明涉及 HCV抗体检测试剂盒及其检测方法。背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒 (HCV)引起的严重肝脏疾病。全世界现有 1.7亿的 HCV感染者，我国的感染人数超过了 4000万，在 HCV感染者中约有 50-85%会发展成慢性肝炎，约 10-15%会发展为肝硬化。丙型肝炎病毒给人类健康带来极大的危害，给社会经济造成极大的负担。

自 1989年 Choo等成功克隆 HCV基因以来， HCV的诊断检测技术已取得了巨大进展。目前检测丙型肝炎主要有三个途径：用 PCR检测 HCV RNA; 用单克隆抗体检测 HCV抗原；用酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、蛋白印染法等检测 HCV抗体。

ELISA检测 HCV抗体的试剂已经发展了三代，笫一代 ELISA-1试剂盒于 1990年由英国 Ortho 诊断公司开发，抗原是利用美国 Chiron公司提供的 HCV NS4基因重组抗原 C100-3, 但是其敏感性及特异性不理想。之后笫二代 ELISA-2取代了 ELISA-1 , ELISA-2试剂盒由英国 Ortho诊断公司和美国 Abbott诊断公司分别开发，使用抗原包括 CORE、 NS3和 NS4 抗原，其敏感性和特异性有所改善，在慢性丙肝病人中用 ELISA-2检测，其阳性率为 92-95%。由于采用 CORE及 NS³抗原使 HCV血清阳转的平均窗口期由 16周缩短为 10周。笫三代 ELISA-3试剂盒由英国 Ortho诊断公司、美国 Abbott诊断公司、法国 Sanofi诊断公司率先开发生产，使用抗原包含 CORE、 NS3、 NS4和 NS5抗原。采用 ELISA-3检测献血员及高危人群的 HCV, 其敏感性均有增加，约为 9⁷%, HCV 血清阳转的平均窗口期缩短至 7-8周。

ι_οο3 由于 ELISA在诊断上具有易于自动化、使用方便、重复性好、成本低并且有利于实验数据的分析整理和保存，所以目前国际上筛查 HCV抗体的商品化试剂主要是利用间接法开发的笫二代或笫三代 ELISA试剂盒。虽然 ELISA试剂已经经过了三代改进，但仍有不足之处，主要体现为漏检、假阳性、不确定结果仍较多。这主要是由于间接法试剂在方法学上存在的缺陷引起的，具体表现如下：

1. 特异性差：由于间接法采用了非特异性识别的笫二抗体 (以下简称二抗)标记，这种非特异性的识别导致其较低的特异性；

2. 灵敏度低：由于特异性差，试剂盒中包被抗原、标记二抗的使用浓度被迫降低，待测样品量减少，样品稀释倍数增加又进一步导致了灵敏度的降低；

3. 窗口期长：一般使用的二抗为抗 IgG抗体，只能检测抗体中的 IgG 组分，对其它类型抗体尤其是早期出现的 IgM抗体无法检出，致使灵敏度低并且延长了窗口期。

目前，丙型肝炎的输血后感染占输血后肝炎病例的 70%, 而在丙型肝炎感染者中更有 80-90%是属于输血后感染。这在很大程度上是由于现有间接法试剂的上述缺陷造成的，因此需要开发出高灵敏度、高特异性的 HCV 抗体诊断试剂。

双抗原夹心法是利用标记抗原代替间接法中的标记二抗，从方法学上解决了间接法的上述缺陷。但是，在双抗原夹心方法广泛应用于抗体检测的今天，之所以筛查 HCV 抗体的试剂盒仍没有采用较为先进的双抗原夹心法，主要是因为：

1. HCV蛋白抗原经酶标记后的活性损失问题

目前抗原标记主要将标记物如辣根过氧化物酶 (HRP)直接标记到抗原上，但这种方法在 HCV抗原的标记过程中遇到了问题。首先，由于 HCV 的主要抗原表位区段 NS3抗原是对构象依赖性较强的抗原，当被分子量较大的 "柔性" 标记物如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记后，其构象变化较大，且活性表位不易暴露，标记后 NS3抗原的活性大为降低；其次， HCV 的另一主要抗原表位区段 CORE的主要活性区富含赖氨酸，这些赖氨酸对 CORE 的活性至关重要，而赖氨酸侧链上的游离氨基又往往是标记反应 (如

NaI0₄氧化法标记 HRP)的主要靶基团，所以标记后 CORE抗原的活性大大争低，最终使试剂盒的灵敏度还不如间接法，存在着严重漏检。即便是 HCV 抗原的间接标记，按照传统办法将第二抗原与酶标记物预先混合形成酶复合物时，分子量较大的酶标记物对构象依赖性的 HCV 笫二抗原的活性也会造成较大的影响。

2. 高本底问题

CORE 区抗原有很强的体内或体外的同源及异源结合能力 (Matsumoto, M.等， Virology, 218:P43-51,1996; Kunkel, M.等， Virology, 294: P239-245, 2002; Majeau, Ν·等， Journal of General Virology, 85: P971-981， 2004), 在双抗原夹心法中标记抗原 (笫二抗原）利用此种结合能力与包被抗原 (笫一抗原）同源结合造成试剂盒的高本底。

3. 重组 HCV笫二抗原由于可能存在的错配二硫键引起抗原构象改变 HCV的主要抗原表位区段 NS3抗原含有多个半胱氨酸残基 (仅 a.a.1196-

1473就有 7个 Cys)，当重组表达时，此蛋白可能形成错配的二硫键，从而改变天然的构象，导致 NS3抗原活性降低， CORE抗原表位也因为暴露不充分而引起活性降低。

美国专利 US6096319、 US6270960, US6306579提到使用重组 NS3抗原利用双抗原夹心法原理检测 HCV抗体的方法，并提出使用巯基试剂来提高 NS3抗原的活性 , 其实施例中使用的是将标记物钌金属复合物直接标记笫二抗原后作为标记抗原的电化学检测方法。但是这三个专利提到的夹心法均为仅利用 NS3抗原进行的，没有研究巯基试剂的加入对 CORE抗原活性的影响。而且没有提到以酶为标记物的酶联免疫 HCV双抗原夹心检测方法，因此没有涉及到当使用巯基试剂来提高 HCV抗原活性的同时也使酶活性丧失 (如天然辣 ~过氧化物酶有四个二充键，分别由 11-91， 44-49, 97-301 , 177-209位半胱氨酸形成)这一问题以及针对这一问题的解决方案。

美国专利 US6630298介绍的方法中笫二抗原与酶标抗笫二抗原外源蛋白 SOD抗体以复合物的形式一步加入参加反应，其缺点在于： 1、 HCV抗原与分子量很大的酶标抗体结合导致其构象受到一定的破坏并且表位不易暴露，造成笫二抗原活性降低，使检测的敏感性降低； 2、没有提及用于提高 HCV抗原活性的方法。

公开号为 CN 1548958A的专利申请介绍的也是 HCV双抗原夹心法。该专利申请没有公开所使用的 HCV抗原的具体区段，也没有提及在反应系统中加入还原试剂用于提高 HCV抗原活性的方法。

李保昌等，中国实验血液学杂志， 12(³)： P359-362, 2004介绍的方法虽然研究了生物素化 HCV抗原，但该文章仅停留在抗原水平的研究上，没有提出对双抗原夹心法 HCV抗体诊断试剂在开发中会遇到的上述难题的具体解决办法。

美国专利 US6613530的 HCV双抗原桥式夹心法也没有提到用于提高 HCV抗原活性的方法。

为了解决 HCV蛋白经酶标记后的活性损失问题和高本底问题， 2005 年 2月 2日申请的 PCT/CN2005/00149的专利申请公开了 HCV重组蛋白的间接标记方法，并以之制成了较现有间接 ELISA试剂盒有较大改善的夹心法试剂盒。

本发明解决了目前双抗原夹心法试剂盒存在的技术问题，尤其是将第二抗原与酶标记物作为试剂盒的两个独立成分分别包装，并且在检测时分两步加入反应系统并分别进行孵育的分步检测步骤，不仅解决了在不分步的情况下当笫二抗原稀释液和酶标记物稀释液放入同一容器或者分别包装的两种溶液在检测时预先混合时，酶标记物与笫二抗原结合后对笫二抗原构象的影响，造成的笫二抗原活性降低的问题；而且可以在第二抗原稀释液中加入还原试剂，在提高笫二抗原活性的同时避免了还原试剂对酶活性的破坏，进一步提高试剂盒的灵敏度。发明的目的

本发明的目的在于提高 HCV抗原尤其是笫二抗原的活性，结合生物素 -亲和素放大系统，提供灵敏度、特异性均较目前试剂有较大提高的双抗原夹心法 HCV抗体检测试剂盒。发明概述

本发明提供一种检测 HCV 抗体的试剂盒，该试剂盒以 "支持物 -笫一抗原 -待测 HCV抗体-笫二抗原 -酶标记物-可识别信号" 形式完成检测，其中第二抗原与标记物之间进行一步或多步的结合反应，该试剂盒包括样品稀释液、笫二抗原稀释液、酶标记物稀幹液，所述笫二抗原稀释液和酶标记物稀释液分别采用独立包装。

在本发明实施方案中，所述笫二抗原稀释液中含有还原试剂。

在本发明实施方案中，所述还原试剂包括但不限于 β -巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

在本发明实施方案中，当检测流程中待测样品和第二抗原同时加入反应系统中并一起进行孵育时，样品稀释液和笫二抗原稀译液可以是同一溶液，即包装于一个容器中的笫二抗原稀释液，其中笫二抗原稀释液中的 β - 巯基乙醇浓度为 0.01-50%。，优选为 0.05-20%。，更优选为 1-10%。，最优选为 5%₀。

在本发明实施方案中，待测样品和笫二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，其中笫二抗原稀释液的 β -巯基乙醇浓度为 0.01-50 %, 优选为 0.05-30% , 更优选为 0.2-20% , 更优选为 0.5-10%。，更优选为 0.5-5% , 最优选为 1 % ₀

在本发明实施方案中，所述样品稀释液中含有可以还原二硫键的还原试剂，包括但不限于 β -巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺曱酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

在本发明实施方案中，待测样品和笫二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，使用的样品稀释液的 β -巯基乙醇浓度为 0.01-⁵0%₀ , 优选为 0.1-20%。，更优选为 0.5-10%。，最优选为 5°/₀₀。 5

6 在本发明实施方案中，所述试剂盒包括预包被酶标板、笫二抗原、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照、阳性对照、盖板膜、自封袋及说明书和包装盒。

在本发明实施方案中，所述笫二抗原为 HCV蛋白与标签的结合物，标签包括肽类标签或非肽类标签。

在本发明实施方案中，所述肽类标签为含有 His Tag、 T7 Tag、 S Tag, Flag Tag, HA Tag或 HCV肽片段的肽或蛋白。

在本发明实施方案中，所述非肽类标签为化合物、半抗原、维生素、类固醇、染料、激素、抗生素、核酸或者为它们与肽或蛋白的组合物。

在本发明实施方案中，所述化合物为二硝基苯酚或溴脱氧尿苷；维生素为生物素或其衍生物；类固醇为地高辛；染料为吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯或荧光素。

在本发明实施方案中，所述标签为生物素。

本发明还提供一种用本发明所述试剂盒检测 HCV抗体的方法，该方法以 "支持物-第一抗原 -待测 HCV抗体-第二抗原 -酶标记物-可识别信号" 形式完成检测，包括以下检测步骤：

A. 笫一抗原捕获抗体：加入待测样品后孵育，预包被酶标板上的第一抗原捕获样品中的 HCV抗体；

B. 抗体捕获笫二抗原：加入笫二抗原溶液后孵育， HCV抗体捕获笫二抗原；

C. 检测：利用标签通过一步或几步孵育引入酶标记物进行检测；其中 B步骤在还原条件下进行，步驟 A和 B可以合并，即待测样品和笫二抗原可同时加入反应系统中一起进行孵育，其特征为在检测流程中所述笫二抗原与酶标记物分两步依次加入反应系统并分别进行孵育。附图筒述

图 1为间接法 ELISA检测 HCV抗体原理示意图。

图 2为一步夹心法 ELISA检测 HCV抗体原理示意图。图 3为两步夹心法 ELISA检测 HCV抗体原理示意图。

图 4为三步夹心法 ELISA检测 HCV抗体原理示意图。

图 5为表达载体质粒 P2的质粒图谱。

图 6为笫一抗原表达质粒 P2-HCVAgl的质粒图谱。

图 7为笫二抗原表达质粒 P2-X-Y的^粒图奄。定义

本发明中使用的术语除非另有说明 , 否则具有以下含义。

本发明中使用的术语 "还原试剂" 为蛋白质二硫键的还原试剂，即可以将蛋白质内部或之间由两个半胱氨酸侧链巯基形成的二硫键还原为游离巯基的试剂，包括但不限于 β -巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

本发明中使用的术语 "笫一抗原" 为包被抗原。

本发明中使用的术语 "笫二抗原" 是 HCV蛋白与标签的结合物，笫二抗原可以为一个或几个，其各自的标签满足本发明限定条件。

本发明中使用的术语 "一步法" 指试剂盒完成支持物-笫一抗原结合后，同时加入待测样品及第二抗原，一起进行孵育后洗板，再加入酶标记物；以此检测流程开发的双抗原夹心法 HCV 抗体检测试剂盒简称一步法试剂盒。

本发明中使用的术语 "两步法" 指试剂盒完成支持物-笫一抗原 -待测 HCV抗体结合并洗板后，再加入笫二抗原和酶标记物或其复合物进行孵育；以此检测流程开发的双抗原夹心法 HCV 抗体检测试剂盒简称两步法试剂盒。

本发明中使用的术语 "三步法" 指试剂盒完成支持物-笫一抗原 -待测 HCV抗体结合并洗板后，加入笫二抗原溶液进行孵育后洗板，再加入酶标记物；以此检测流程开发的双抗原夹心法 HCV 抗体检测试剂盒简称三步法试剂盒。本发明中使用的术语 "生物素或其衍生物" 为生物素或其功能性衍生物，包括但不限于 1 生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素、脱硫生物素等，其共同特征为含有可与亲合素结合的咪唑酮环或其功能类似结构。

本发明中使用的术语 "肽" 和 "蛋白" 具有本领域技术人员所理解的一般含义，而且可以互换使用。

本发明中使用的术语 "CORE" 和 "NS3" 分别指 HCV核心蛋白和非结构蛋白 3。其中前者指 HCV全基因编码蛋白的 a.a.l-191(a.a.为氨基酸的简写，本发明中 a.a.A-B表示 HCV全基因编码蛋白的笫 A个基酸到笫 B 个氨基酸的区段,其中 B>A)区段，后者指 HCV全基因编码蛋白的 a.a.1027- 1657区段。

本发明中使用的术语 "生物素接受蛋白" （Biotin Acceptor Protein)为生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl-carrier protein, BCCP)家族或其功能区段、 SEQ ID N0.3 多肽或其功能类似物（详见 Peter, J.S.等， Biotechnology,ll:1138-1143,1993), 本发明选择的生物素接受蛋白可以为上述肽或蛋白的一个、几个或几个的组合。

本发明使用术语 "标签" 为与 HCV蛋白连接的并且可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的物质，包括肽类标签和非肽类标签。

所述肽类标签为肽或蛋白质，包括包含有 His Tag、 T7 Tag、 S Tag, Flag Tag, HA Tag (有多种肽可以选择，详见 Abeam公司 epitope tags章节的产品介绍 http://www.abcam.com)或笫一抗原中所没有的且其结合能力不至于引起高本底的 HCV肽片段等所有存在或可制备出相应结合配偶体的肽或蛋白，其主要特征为 "可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的" 核心物质为肽或蛋白。所述 His Tag指 6个连续组氨酸，即 6xHis。

所述肽类标签为外源蛋白时，其分子量小于 30KD, 优选小于 20KD, 进一步优选小于 1⁵KD,再进一步优选小于 10KD,更进一步优选小于 5KD。

所述肽类外源蛋白标签位于 HCV蛋白的 N端时，分子量小于 5KD; 位于 HCV蛋白的 C端时，分子量小于 20KD。所述非肽类标签为化合物 (如二硝基苯酚、溴脱氧尿苷)、半抗原、维生素 (如生物素或其衍生物)、类固醇 (如地高辛)、染料 (如吖啶酯、罗丹明、丹石黄醜氯、荧光素、 Oregon Green、 Lucifer yellow、 Alexa Fluor、 Cascade Blue), 激素、抗生素、核酸等 (有多种非肽类物质可以选择，详见 Invitrogen 公司分子探针的产品介绍 http：〃 www.probes.com) 所有存在或可制备出相应结合配偶体的非肽类物^。其主要特征为 "可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过程的" 核心物质为非肽或蛋白类物质。

标签可以是一个、几个或几个的组合, 可以在 HCV抗原的 N端、 C 端、两端或内部。

标签应尽可能小，以减少对 HCV抗原活性的损伤。

本发明中使用的术语 "结合配偶体" 为可以和标签相互结合的配体或受体，当选用非肽类标签时，其结合配偶体为该标签的特异性受体或抗体，如选用生物素或其衍生物或它们与肽或蛋白的结合物为标签时，其结合配偶体为亲和素、链霉亲和素、中性链亲和素、它们的类似物、抗生物素或其衍生物抗体；当选用肽类标签时，其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中使用的术语 "柔性" 和 "刚性" 主要指物廣的结构易变性，如 HRP等大分子蛋白 ^与 HCV抗原交联时，其会与 HCV抗原 "纠缠" 在一起致使后者结构改变进而影响其活性，此类物质即为 "柔性" 物质；相反，如聚苯乙烯、胶体金等与 HCV抗原交联时，双方并不会 "纠缠" 在一起，这时 HCV抗原的构象变化不大，此类物质即为 "刚性" 物质。

本发明中使用的术语 "表达宿主" 包括原核、真核表达系统宿主，包括但不限于细菌，例如大肠杆菌、枯草杆菌等；酵母例如甲醇酵母、酿酒酵母等；真核细胞例如昆虫细胞、哺乳动物细胞等；病毒；组织、器官或生物活体反应器等。

本发明中使用的术语 "支持物" 包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤維素、醋酸纤维素、硅化物等材料制备的酶标板、小球、微粒子、玻片、芯片、塑料、薄膜等。本发明中使用的术语 "待检测样品" 为所有可被 HCV感染的物种的体液，包括但不限于全血、血清、血浆、分泌物、尿液、唾液、脑脊液、淋巴液、组织液，粪便浸出液，细胞培养液或细胞、组织、器官匀浆液等。本发明试剂盒主要优势

1. 第二抗原稀释液中加入还原试剂而且检测流程中笫二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中并分别进行孵育的优势：

A. 若笫二抗原与酶标记物同时或预先混合后加入反应系统中一起进行孵育，则分子量较大的酶标记物与笫二抗原特异性结合后会使笫二抗原的表位暴露不充分，而且会对 HCV抗原的构象破坏较大，使笫二抗原的活性大大降低，将笫二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中并分别进行孵育可避免这一现象；

B. 若笫二抗原与酶标记物同时或预先混合后加入反应系统中一起进行孵育，如果在其稀释液中不加入还原试剂则 HCV抗原活性较低；如果加入还原试剂又会破坏酶的活性，因为多数酶含有天然二硫键，所以若加入还原试剂将破坏天然二硫键进而影响酶的结构，使酶失活。本发明检测流程中笫二抗原与酶标记物分两步加入反应系统中分别进行孵育并在笫二抗原稀释液中加入巯基试剂解决了这一矛盾。

2. 在样品稀释液中加入还原试剂的优势：

A. 使待测样品中的抗体与 HCV抗原在还原条件下进行反应，保证 HCV抗原的高活性；

B. 在检测流程为待测样品和笫二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，样品稀释液中若不加入还原试剂，则 IgM 抗体将以五聚体的形式被笫一抗原捕获，而当笫二抗原加入后，为了提高笫二抗原的活性又必须在其稀释液中加入还原试剂，这样靠二硫键相互结合的 IgM抗体的五聚体被打开，使一部分笫二抗原与游离的 IgM抗体单体结合而无法参加检测反应，不利于 IgM抗体的检测进而不利于窗口期的缩短。在样品稀释液中加入还原试剂解决了上述问题。反应系统各种緩冲液中加入还原试剂的浓度

还原试剂的加入可以打开 HCV抗原内部的错配二硫键，提高 HCV 抗原的活性。因此，本发明反应系统的各种緩冲液中除酶稀释液外均加入一定浓度的还原试剂。所说的还原试剂可以为 β -巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺曱酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠等所有可以还原二硫键的试剂。

其中 β -巯基乙醇在各种緩冲液中的浓度范围为：

1. 包被液中 β -巯基乙醇的浓度范围为 0.5-5%。，优选 1%₀。

2. 封闭液中 β -巯基乙醇的浓度范围为 0.5-5%。，优选 1%。。

3. 一步法样品稀释液与第二抗原稀释液为同一稀释液时，其中 β -巯基乙醇的浓度为 0.01-50%。，优选为 0.05-20%。，更优选为 1-10%。，最优选为 5。/₀。。

4. 三步法样品稀释液中 β -巯基乙醇的浓度为 0.01-⁵0%D ,优选为 0.1-²0 %o, 更优选为 0.5-10%。，最优选为 5%₀。

5. 三步法笫二抗原稀释液中 β -巯基乙醇的浓度为 0·01_⁵0%。，优选为 0.05-30%, 更优选为 0.2-20% , 更优选为 0.5-10% ,■更优选为 0.5-5% , 最优选为 1 %。。

本领域普通技术人员按现有常规技术或本发明的精神，可以选择其它还原试剂及其浓度。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。实施例 1 第一抗原的制备

本发明参考罗文新等，生物工程学报， 16(5)： P578-581 , 2000, 得到改造载体 pTO-T7 , 合成引物扩增其 Ndel和 BamHI之间的基因序列，上游引物带有 Ndel和 BamHI位点，下游引物带有 BamHI和 EcoRI位点。片段工程有限公司）经 NdeI/Eco I(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司）酶切后克隆到同样酶切处理的 pTO-T7 载体上。阳性克隆经 BamHI单酶切后回收载体再自身连接，即除去了 pTO-T7载体上 Ndel和 BamHI之间的 T7 Tag基因，得到的载体命名为 P1。

由于载体 P1 的 T7启动子的上游有一个 Bglll位点，不利于本发明的克隆。因此合成引物扩增载体 P1 的 Bglll和 Xbal之间的基因片段，其上游引物带有 BamHI位点，下游引物带有 Xbal位点。片段经 BamHI/Xbal 酶切后克隆到 Bglll/Xbal酶切后的载体 P1上，得到的阳性克隆即为 Bglll 位点被封闭的表达廣粒 P2, 也就是本发明所使用的克隆载体，在实施本发明的过程中 P1和 P2并不是必需表达载体，其上游的增强子在本发明中也不起实质作用，构建此载体只是为了克隆方便，其它许多表达载体如 pET- 24a(+) (美国 Novagen公司，货号 69749-3)均可用于实施本发明。

PCR扩增 a.a.1201-1465基因（SEQ ID N0.2中笫 1-795位核苷酸)，其上游引物带有 BamHI位点，下游引物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。 PCR扩增 a.a.2-59基因 (SEQ JD NO.l中笫 4-177位核苷酸)，其上游引物带有 BamHI位点，下游引物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。通过 BamHI/EcoRI酶切将片段 a.a.1201-1465 基因克隆到同样酶切处理的表达载体 P2 上得到 P2-G。将该克隆载体 Bglll/EcoRI酶切后插入经 BamHI/EcoRI酶切的片段 a.a.2-59基因，得到的阳性克隆为 P2-G-CORE(a.a.2-59) , 也即本发明笫一抗原的表达廣粒，命名为 P2-HCVAgl , 含有该质粒的 KEscherichia coli ER2566/P2-HCVAgl) 已经于 2005年 1月 21 日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编 4³0072)，保藏号为： CCTCC M 205009, 其表达抗原命名为 HCVAgl。

将 P2-HCVAgl 转化大肠杆菌 ER2566(美国 New England Biolabs公司），涂布于含 100ug/ml卡那霉素 (上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号 KE170)的 LB平板上， 37°C过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度卡那霉素的 500ml LB培养基 ³⁷°C振荡培养至 OD₆。。 1.0左右，用终浓度为 0.5mM的 IPTG (生工，货号 IB0168)进行诱导，诱导条件为： 37 。C , 200rpm, 4小时。 4°C 5000rpm 离心 20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用 10ml裂解緩冲液 (50mM Tirs-HCl， pH8.0, ImM EDTA, lOOmM NaCl) 重悬，超声破碎， 4°C 12000rpm 离心 ²0分钟收集包涵体，用含 2% Triton X-100(生工货号 T0694)的溶液 I(20mM Tirs-HCl, pH8.5, 5mM EDTA, lOOmM NaCl)重悬， 4°C 12000rpm 离心 20分钟收集包涵体，用溶液 I配制的 4M尿素溶解后对 100倍体积的 PB緩冲液 (pH7.0， 20mM)透析，换液 3 次， 4°C 12000rpm 离心 20分钟去除沉淀后制成粗抗原，用同一 PB緩冲液平衡 Sephacryl S-200凝胶柱 (美国 Amersham Biosciences公司)后将上述粗抗原过柱，收集并合并含目的蛋白的溶液，再过 CM琼脂糖离子交换柱 (美国 Amersham Biosciences公司）， HCV抗原可被吸附，用 PBS緩冲液 (pH7.0, 20mM PB, 50mM NaCl)洗涤以去除未被吸附的杂蛋白，再以 PBS 緩冲液 (pH7.0, 20mM PB, 500mM NaCl)洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度， 4 °。或-20°。保存备用。

除了 HCVAgl夕卜， 2005年 2月 2 日申请号为 PCT/CN2005/00149专利申请中的笫一抗原也均可作为本发明中的笫一抗原使用。实施例 1 第二抗原以及酶标记物的制备

1 生物素化第二抗原的制备

PCR扩增编码 HCV抗原 a.a.l-28(SEQ ID N0.1中笫 1-84位核苷酸)基因，其上游引物带有 BamHI位点，下游引物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。PCR扩增编码生物素接受蛋白的基因片段 L(SEQ ID N0.3), 其上游引物带有 BamHI位点，下游引物带有 Bgffl和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。

通过 BamHI/EcoRI酶切将片段 a.a.1-28基因克隆到 Bglll/EcoRI酶切处理的表达载体 P2-G上，得到的阳性克隆 P2-G-CORE(a.a.l-28)命名为 P2- HCVAg2, 其表达抗原命名为 HCVAg2。通过 BamHI/EcoRI酶切将基因 L 克隆到 Bglll/EcoRI酶切处理的表达载体 P2-G-CORE(a.a. l-28)上，得到的阳性克隆 P2-G-CORE(a.a.l-28)-L命名为 P2-X。

提取大肠杆菌 ER2566总基因组，以其作为模板对大肠杆菌 K12生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶 BirA基因（SEQ ID N0.4)Y进行 PCR扩增。扩增引物如下：

引物 1： 5'-CCC GAA TTC ATG AAG GAT AAC ACC GTG CC-3' 引物 2： 5'-GGG AAG CTT TTA TTT TTC GGC ACT ACG CAG GGA

TAT TTC ACC-3'

其上游引物带有 EcoRI位点，下游引物带有 Hindlll位点且含有终止密码 TAA。扩增出的基因片段 Y经 EcoRI /Hindlll酶切后克隆到同样酶切处理的质粒载体 P2-X 中，得到的阳性克隆命名为 P2-X-Y, 也即本发明优选笫二抗原的表达质粒，含有该质粒的菌株 coli ER2566/P2-X- Y)已经于 2005年 1月 21 日保藏于中国典型培养物保藏中心 (中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编 430072) , 保藏号为： CCTCC Μ 205010。基因 X和 Υ之间有一个终止密码 ΤΑΑ, 因此在 Ρ2-Χ-Υ中，基因 X和 Υ组成了在同一表达调控元件作用下的双顺反子。

将 Ρ2-Χ-Υ转化大肠杆菌 ER2566 , 涂布于含 100ug/ml卡那霉素的 LB 平板上， 37 °C过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度卡那霉素且含终浓度 20uM D-生物素 (美国 Sigma-Aldrich公司,货号 B-4501)的 500ml LB培养基 37 °C振荡培养至 OD₆。。 1.0左右，用终浓度为 0.⁵mM的 IPTG进行诱导，诱导条件为： 200rpm, 4小时。离心收集菌体，每升菌液的菌体用 10ml 裂解緩冲液重悬，超声破碎， 4°C 12000rpm 离心 20分钟的上清经 10%_³0% 饱和硫酸铵沉淀，用 PB緩冲液 (lOOmM, pH7.0)复溶， 4 °C 12000rpm 离心 10分钟除去不溶物后，再经过含 SoftLink Soft Release Avidin树脂的亲和素层析柱纯化 (纯化过程详见美国 Promega公司，货号 V2012说明书），以含有 5mM D-生物素的 PB緩冲液 (lOOmM, pH7.0)洗脱即得纯化的生物素化抗原，然后对 100倍体积的 PB緩冲液透析以去除游离生物素，换液 3 次，离心上清测定蛋白浓度， 4°C或 -20°C保存备用。表达纯化得到的抗原为 HCVAg。

在本生物素化方法中，我们又进一步尝试了在 X的终止密码和 Y的起始密码之间加入 SD序列 (具体方法为基因工程现有常规技术，详细可参考 Tsao,K丄.等， Gene,169;P59-64,1996)，使基因 Y编码蛋白的表达量增加，可以在一定程度上提高生物素化效率进而提高本发明试剂盒的灵敏度。

除了 HCVAg外， 2005年 2月 2日申请号为 PCT/CN2005/00149专利申请中的生物素化笫二抗原均可作为本发明中的笫二抗原使用。

2 带有肽类标签的第二抗原的制备

PCR扩增编码 HCV抗原 a.a.l-28(SEQ ID NO.l中笫 1-84位核苷酸)基因，其上游引物带有 BamHI位点，下游引物带有 EcoRI位点和终止密码 TAA, 并且在终止密码的上游带有 His Tag。通过 BamHI/EcoRI酶切将片段 a.a.1-28基因克隆到 Bglll/EcoRI酶切处理的表达载体 P2-G上，得到的阳性克隆 P2-G-CORE(a.a.l-28)-His表达的目的蛋白即为带有肽类标签的笫二抗原。另外， 2005年 2月 2 曰申请号为 PCT/CN2005/00149专利申请中的带有肽类标签的笫二抗原均可作为本发明中的笫二抗原使用。

下面将以生物素化笫二抗原为例进行说明。

3 酶标记物的制备

生物素的结合配偶体即链霉亲和素的酶标记方法为 NaI0₄氧化法。称取 lOmgHRP溶解于 1ml超纯水中，再緩慢滴加 1ml超纯水新鲜配制的 5mg/ml NaI0₄(生工，货号 ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌 40分钟后加入 20%乙二醇 (生工，货号 E0582)溶液 0.05ml，室温下避光搅拌 40分钟。然后立即加入事先对 lOOmM, pH9.51 碳酸盐緩冲液透析 2 小时， 2.5mg/ml 的链霉亲和素 (生工，货号 SE497)溶液 lml, 4°C避光对 lOOmM, pH9.51 碳酸盐緩冲液透析过夜。次日，向混合物中滴加 0.1ml新鲜配制的 4mg / ml NaBH₄(生工，货号 ST1268)溶液，混匀， 4°C静置 2小时。将上述液装入透析袋中，对 PBS 緩冲液 ( OmM, pH7.4)透析， 4。C过夜。加入酶保护剂及终浓度 50%的甘油混匀后 -20°C避光保存备用。实施例 3 还原试剂浓度的选择

以 HCVAgl和 HCVAg分别作为包被抗原，在包被液中加入不同浓度的 β -巯基乙醇进行间接法检测 (结果见表 1)，我们在封闭液中加入不同浓度的 β -巯基乙醇也得到了类似结果，结果显示还原试剂在一定的程度上提高 HCV抗原的活性，表明重组 HCV抗原存在着错配二硫键，而还原试剂的处理使错配二硫键能够重新打开，让 HCV抗原恢复原来的构象。 β -巯基乙醇在包被液和封闭液中的最适浓度范围是 0.5-5%。，优选 1°/₀₀。

表 1 包被液中 Ρ -巯基乙醇对 HCV间接法试剂盒灵敏度的影响被琉基 20%。 10%。 596。 296。 1%。 0.596。 0.296。 0.1%。 0 5.10 5.62 5.89 6.31 6.54 6.19 5.78 5.12 5.20

注: Cut Off值 = 0.200

将 HRP稀释一定的比例，在其中加入不同浓度的还原试剂后直接加入底物显色，结果是随着还原试剂浓度的增加 HRP 的活性逐渐降低直至消失，该结果表明还原试剂对 HR 的活性有破坏作用 , 也说明 HRP内部的四个二硫键对维持其活性至关重要。

综合上述结果，一方面还原试剂可在很大程度上提高 HCV抗原的活性，另一方面它又对 HRP 的活性有破坏作用。当笫二抗原与酶标记物一起加入反应系统中时，为了使以此方法进行检测的试剂盒达到最佳检测效果，就必须摸索出还原试剂合适的使用浓度。

我们在笫二抗原与酶标记物的稀释液中加入一定浓度的 β -巯基乙醇，并进行试剂盒灵敏度的检测 (数据见表 2)，由此得出 β -巯基乙醇的最佳浓度为 0.075%。，此时灵敏度达到最高。表 2 两步法第二抗原的稀释液中巯基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响笫二抗原的禅释液中

5% 3 o 2 ο 1%ο 0.5%o 0.2%o 0.196ο 0.0596ο 0.02%₀

基乙醇浓度 ο.01%ο 0 阳性血清 OD平均值 /

4.35 4.96 5.27 5.62 5.88 6.11 6.59 7.31 6.25 5.34 3.59 临界值

注： Cut Off值 = 0.150

本发明同样也在一步法和三步法试剂盒的笫二抗原稀释液中加入 β - 巯基乙醇，研究不同浓度的巯基乙醇对灵敏度的影响。表 3 和表 4 的结果均表明加入巯基乙醇后，一步法的阳性血清 OD平均值 / Co从 7.24提高到了 16.54, 而三步法也从从 7.35提高到了 17.26, 不同浓度的琉基乙醇均有作用，试剂盒的灵敏度得到较大改善。本结果进一步验证了巯基试剂可以打开重组 HCV抗原的错配二硫键，让 HCV抗原恢复原来的构象，在一定的程度上提高 HCV抗原的活性。由表 3结果我们确定了一步法笫二抗原稀释液中 β -巯基乙醇的浓度为优选为 0.05-20%。，更优选为 1-10%。，最优选为 5%。。由表 4结果我们确定三步法第二抗原稀释液中 β -琉基乙醇的浓度为 0.01-50%。，优选为 0.0⁵_30%。，更优选为 0.2- 20%。，更优选为 0.5-10%。，更优选为 0.5-5%₀ , 最优选为 1%。。表 3 —步法笫二抗原稀释液中 Ρ -琉基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响

ο

第 ^ϊ^^ϊϊΐ中 50%。 30%。 20%ο 10%ο 5%₀ 1%₀ 0.5 ο 0.2 ο 0.1%ο 0.05% 0.01%ο 0

0 -31¾乙醇度

1_{2 81 14 93} 15.67 16.05 16.54 16.19 15.60 14.87 13.70 12.54 11.30 7.24

注： Cut Off值 = 0.150 表 4三步法第二抗原稀释液中 β -巯基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响第 f ^ϊϊ 中 ⁵⁰%。 30%。 20%。雇。 596。 1%ο 0.5%。 0.2%。 0.1%。 0.05%₀ 0 |3 - 基乙醉浓度

F0.1iiLj OD -f 12.33 14.85 _{15 4g 16 12 16 84} π.26 16.63 15,78 14.22 12.67 11.45 7.35 临界伹

注：样品稀释液中已加入 5%。 β -琉基乙醇

Cut Off值 = 0.150 我们尝试在三步法试剂盒第二抗原稀释液中加入 1%。 β -巯基乙醇的同时，在其样品稀释液中也加入 β -巯基乙醇，见表 5。由表中结果我们可以确定三步法样品稀释液中 β -巯基乙醇的浓度为 0.01-50%。，优选为 0.1-20 %, 更优选为 0.5-10%。，最优选为 5%₀。表 5 三步法样品稀释液中 β -琉基乙醇对本发明试剂盒灵敏度的影响

第二抗原的稀释液中

50% 30%o 20%o 10%o 5%ο 1 ο 0.5%o 0.2 o 0.1 o 0.05 % 0.01%₀ 0 基乙醇浓度

阳' fiik清 OD平均值 /

12.56 14.03 15.46 16.61 17.30 16.81 15.94 15.12 14.79 13.92 12.53 7.30 临界值

注： Cut Off值 = 0.150

我们又进一步对针对 CORE 区抗原的抗体进行了如上述三步法同样的样品稀释液和第二抗原稀释液中 β -巯基乙醇浓度的摸索，也得到了与上述结果类似的结论，其中针对 CORE 区抗原的抗体主要是利用 CORE 区抗原制备亲和柱，純化不同患者血清中 HCV抗体中针对 CORE抗原的多抗。这说明 P -巯基乙醇的加入除了能打开 NS3 抗原的错配二硫键，提高 NS3抗原的活性外，还能够提高 CORE区抗原的活性，推测是与打开 NS3抗原错配二硫键的同时使 CORE区抗原的表位暴露更加充分有关。

另外，我们也尝试了利用二硫苏糖醇代替 β -巯基乙醇作为巯基试剂，但在稳定性考核实验中发现其如许多报道所提到的一样稳定性相对较差，并且其还原二硫键的能力在本试剂盒中与 β -巯基乙醇相当，并不像有些报道所提到的远远好于 β -巯基乙醇。实施例 4 本发明试剂盒的生产及检测流程

1. 生物素化 HCV抗原作为第二抗原的试剂盒

将 HCV包被抗原以一定比例用碳酸盐緩冲液 (50mM, pH9.51 , 含 1%₀ β -巯基乙醇 (生工，货号 Μ0482))稀释， lOOul/孔加入酶标板 (深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)， ⁴°C包被 ²4小时，次日用 PBST(10mM PB, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH7.4)洗涤液洗板二次，拍干。 120ul/孔加入含 30% 新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）， 8%蔗糖， 5%。酪蛋白（美国 Sigma-Aldrich公司,货号 C-8645), 1%。 β -巯基乙醇， 150mM NaCl的 ρΗ7.4， lOmM PB封闭液， 37°C封闭 2小时，甩掉孔内液体，拍干。置室温 20-25 。C、湿度 55%-65%、有通风设备的房间内风干后封装于加有干燥剂的铝膜袋中。

检测时可分一步、两步和三步三种方法进行，方法如下：

1.1 一步法

在包被酶标板中先加入 50ul含 5%。 β -巯基乙醇， 0.5%。TritonX-100， 20% 新生牛血清， 5%。酪蛋白， 150mM NaCl 及以一定比例稀释生物素化 HCV 笫二抗原 (临用前稀释)的 pH⁷.4的 ²0mM PB緩冲液，再 50ul/孔加入待测样品、阴性 (正常人阴性血清)、阳性 (HCV抗体阳性血清)对照， ³7°C温育分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。

用含 1 %。酪蛋白， 20%新生牛血清及以一定比例稀释链霉亲和素酶标记物 (临用前稀释)的 pH7.4的 20mM PB緩冲液， lOOul/孔加入反应板， 37 °C温育 30分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。

加入含 0.5%。过氧化氢尿素 (生工，货号 UB1753)、 4.76%。三水合乙酸钠、 0.9%。;水醋酸的显色剂 A及含 0. 32%。TMB (生工，货号 TB0514)、 5mM柠檬酸、 0.5mM EDTA-2Na、 5%曱醇、 2%。二甲基曱酰氨的显色剂 B各 50ul, 37 °C避光显色 30分钟。每孔加 50ul, 含 2M硫酸的终止液终止反应，酶标仪 450nm波长 (参考波长 ⁶30nm)空白孔校零后读取 OD值， Cutoff Value计算： COV =阴性对照平均 OD值 X 2.0 (阴性对照 OD值低于 0.075作 0.075 计算，高于 0.075按实际 OD值计算)，待测样品 OD ¾ > COV 为阳性，待测样品 OD值 < COV 为阴性。

1.2 两步法

将一定稀释比例的 HCV 生物素化抗原加入（临用前加入)含 0.5 %。 TritonX-100, 20%新生牛血清， 5%。酪蛋白， OmM NaCl及以一定比例稀释链霉亲合素酶标记物的 pH7.4, 20mM PB的酶稀释液中制成酶预备液。

在包被酶标板中先 50ul/孔加入含 5%。β -巯基乙醇， 0.5%。TritonX-100， 20%新生牛血清， 5%。酪蛋白， 150mM NaCl, ρΗ7·4， 20mM PB 的样品稀释液，再加入 ⁵0ul待测样品、阴性 (正常人阴性血清)、阳性 (HCV 抗体阳性血清)对照， 37 °C温育 60分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。临用前往上述酶预备液中加入 β -巯基乙醇至终浓度为 0.075%。制成酶工作液， lOOuV孔加入包被酶标孔中， 37°C温育 30分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。显色及结果判定同前述 1.1中的一步法。

1.3 三步法：

在包被板中先加入标本稀释液 (含 5%。β -巯基乙醇， l%。TritonX-100， 20%新生牛血清， pH7.4的 ²0mM PB)⁵0ul, 再加入 50ul待测样品、阴性、阳性对照， 37°C温育 60分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。

lOOul/孔加入含 1%。 β -巯基乙醇， l%。TritonX-100， 20%新生牛血清， 150mM NaCl及以一定比例稀释的生物素化 HCV抗原 (临用前稀释)的 pH7.4 的 20mM PB緩冲液， 37°C温育 30分钟后用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。

用含 1 %。酪蛋白， 20%新生牛血清及以一定比例稀释链霉亲和素酶标记物的 pH7.4的 20mM PB緩冲液， lOOul/孔加入反应板， 37°C温育 30分钟；用 PBST洗涤液洗板五次，拍干。

显色及结果判定同前述 1.1中的一步法。

上述生物素化 HCV抗原及链霉亲和素酶标记物的稀释比例应根据实际情况具体摸索以达到最佳效果，反应物稀释比例及各步反应时间也可以根据需要在实际生产中进行调整以便在保证检测效果的同时缩短检测时间提高工作效率，这种摸索和调整为本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法，在此不再详述。

2. 使用不同检测流程的试剂盒的比较

为了比较上述 3种检测方式，我们以 HCVAgl为第一抗原，以 HCVAg 为笫二抗原，分别采用上述 3种夹心方法检测 12份丙型肝炎阳性血清 (包括 2份前滞血清)和 10份阴性血清。结果如表 6显示，当笫二抗原和酶标记物一起加入时，试剂盒灵敏度较低，已经接近间接法检测时的灵敏度，无法体现出夹心法的优势。这表明：虽然我们已经确定了 β -巯基乙醇的最佳浓度为 0.075%。，但在这浓度下， β -巯基乙醇对 HRP的活性影响还是存在的。我们又作了在三种方法的反应步骤中均不加 β -巯基乙醇的实验，发现两步法灵敏度明显偏低，这说明酶标记物与笫二抗原预先混合后笫二抗 2005/000645

21 原活性有较大损失。因此，本发明试剂盒的检测流程优选三步法和一步法。但由于一步法存在前滞效应 (HOOK效应，如对前滞血清 SP1和 SP2的反应），本发明试剂盒更优选三步法。本发明下面所提到的夹心法 HCV抗体检测试剂盒如无特殊说明均指三步法。表 6 釆用不同检测流程时试剂盒灵敏度的比较

检测方式一步法两步法三步法

SP1 0.318 * *

SP2 0.056 * *

P1 2.450 1.120 2.544

P2 2.232 1.043 2.318

P3 2.409 2.592

P4 o

2.388 1.093 2.501

P5 2.514 1.140 2.650

P6 2.291 1.026 2.411

P7 2.205 1.087 2.380

P8 2.470 1.160 2.562

N7 0.041 0.022 0.017

N8 0.047 0.030 0.021

N9 0.043 0.025 0.016

N10 0.037 0.020 0.011 注：表中的数值为反应的 OD值；

SP表示抗体滴度极高的阳性血清 (即前滞血清)，

P表示阳性血清， N表示阴性血清， *表示 OD值大于 3.0。实施例 5 本发明试剂盒的性能评价

(一)、灵敏度

为了将生物素化 HCV蛋白作为笫二抗原的夹心法试剂盒与现有商品化间接 ELISA试剂盒的灵敏度进行比较，我们以本发明的试剂盒对两份正常人阴性血清稀释的 100份 HCV 阳性血清进行检测，对照选用英科新创 (厦门）科技有限公司 HCV 间接法诊断试剂（简称新创间接法）及 Abbott公司 Murex Anti-HCV 4.0。结果如表 7，表明本发明的试剂盒和商品化间接 ELISA试剂盒对各稀释度血清反应的灵敏度差异均具有统计意义 (P<0.05)。由此可见，本发明试剂较现有间接法试剂的灵敏度有较大的提高。表 7 本发明试剂盒与现有商品化间接 ELISA试剂盒的灵敏度比较

血清稀释度 (倍）

1 25 50 100 200

本发明试剂盒 100 100 99 97 84 新创间接法 100 72 59 37 26

Murex Anti-HCV 4.0 100 83 69 45 35 注：表中的数值表示各试剂对 100份 HCV阳性血清的检出数

(二)、特异性

本发明采用了三步特异性识别，所以较只有一步特异性识别的间接法试剂有了极大改善。我们用本发明试剂盒和英科新创 (厦门）科技有限公司的 HCV 间接法试剂分别检测了 3000份临床阴性血清，本试剂假阳性率为 0.067%，而该间接法为 0.67%, 我们又进一步将后者的 20份假阳性经 Murex Anti-HCV 4.0间接 ELISA试剂盒检测，仍有 12份检测为阳性，其假阳性率最低为 0.4%。

(三)、可疑血清

我们经过筛选，得到如下 12份本室间接法试剂判定为阳性， HCV RIBA确证试剂 (新加坡 Genelabs公司，货号 11130-018)检测为可疑， PCR 检测 (瑞士 ROCHE公司 COBAS Ampliscreen^TM HCV 2.0)为阴性，其提供者在临床上不具有任何肝炎症状的可疑血清 (数据见表 8), 除 C5之外的 11份血夹心法为阴性，用夹心法所使用的笫一抗原和笫二抗原包被的间接法检测均为阳性， RIBA结果除 C4和 C6外的 9份血为 NS4单独阳性，但本夹心法使用的两抗原均无 NS4区段，综上所述，可推知这 9份血应为本室间接法试剂的假阳性。 C4和 C6在夹心法试剂、 Murex试剂和 PCR 检测中均为阴性 , 结合临床也基本可推断为本室间接法试剂的假阳性。 C5 虽然其在夹心法检测中为阳性，但夹心法反应 OD值明显低于间接法，推测其应为间接与夹心的共同假阳性。同理可推导除 C4、 C6 外的其它 10份应为 Murex Anti-HCV 4.0试剂盒的假阳性。综上所述，本发明试剂盒对可疑血清判定的准确性较现有商品化试剂和本室内部的间接法试剂均有较大提高。表 8 本发明试剂盒检测可疑血清 (均为阴性)情况

Genelabs HCV

本发明第一抗原间接生物素化第二抗原

标本 Murex Anti- BLOT Version PCR 试剂盒 ELISA法检测间接 ELISA法

HCV 4.0 3.0

C1 - + + + NS4 + -

C2 - + + + NS4 + -

C3 - + + + NS4 + -

C4 - + + - NS3-1 + -

C5 弱 + + + + NS4 + -

C6 - + + - NS3-1 + -

C7 - + + + NS4 + 一

C8 - + + + NS4 + 一

C9 - + + + NS4 + -

C10 - + + + NS4 + 一

C11 - + + + NS4 + -

C12 - + + + NS4 + 一注： +表示阳性， -表示阴性

(四)、重复性

对阴、阳性待测样品各 240份，釆用不同时不同批次不同操作者进行多次检测，考查本发明试剂盒判定结果的重复性，结果显示本发明试剂盒对阴、阳性判定结果的重复性为 100%。这表明本方法检测结果的再现性好，结果判定可靠。

(五)、稳定性

将整套试剂（包括包被酶标板、样品稀释液、笫二抗原、笫二抗原稀释液、链霉亲和素酶标记物、酶稀释液、阴性对照、阳性对照、显色剂 A和 B、终止液 )³7°C考核 72小时，取出后与同时 4°C存放的试剂在同一条件下检测相同的阴、阳性质控血清，其结果见表 9。实验表明，两条件下标本测得 OD值无明显差异，说明本发明试剂盒稳定性较好。表 ⁹本试剂盒稳定性实验结果

阳性对照阴性对照

试剂保存状态线性 CV值

均值均值

4°C 99.90% 9% 2.500 0.050

37°C , 72小时 99.90% 8% 2.318 0.048

(六)、精密性

在同一反应板上对同一份已知阳性标本，多次平行做大于等于 10 孔重复检测，得到各孔的检测 OD值，计算其 CV值均低于 15%, 说明本试剂盒精密性较好。

申请人或代理人档案号 FPCH05160012

PCT/C 2005 / 0 0 0 6 45 关于微生物保藏的说明

(细则 13之二）

A.对说明书铕 12 页，第 24 行所述的微生物的说明

B. 保藏事项保藏单位名称中国典型培养物保藏中心

滅单位地址

(包括邮政编码和国名）

中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内，邮编 430072

保藏日期 2005年 1月 21 日保藏号 CCTCC M 205009

c.补充说明（必要时）本栏内容有补充页 □

D.本说明是为下列指定国作的（如果说明不是为所有指定国而作的)

E.补充说明（必要时)

下列说明将随后向国际局提供（写出说明的类别，例如： "保藏的编号")

由国际局填写

□ 国际局收到本页日期受权官员申请人或代理人档案号 FPCH05160012

m^m PIM 2005 / 00064：5 关于微生物保藏的说明

(细则 13之二）

Claims

权利要求书

1. 一种检测 HCV抗体的试剂盒，该试剂盒以 "支持物-笫一抗原-待测 HCV抗体-笫二抗原 -酶标记物-可识别信号" 形式完成检测，其中笫二抗原与酶标记物之间进行一步或多步的结合反应，该试剂盒包括样品稀释液、笫二抗原稀释液、酶标记物稀释液，其特征在于所述笫二抗原稀释液和酶标记物稀释液分别采用独立包装。

2. 权利要求 1的试剂盒，其中所述笫二抗原稀释液中含有还原试剂。

3.权利要求 2 的试剂盒，其中所述还原试剂为 P -巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺曱酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

4.权利要求 3的试剂盒，其中所述还原试剂为 β -巯基乙醇。

5.权利要求 4的试剂盒，其中检测过程中待测样品和笫二抗原同时加入反应系统中并一起进行孵育时，样品稀释液和笫二抗原稀释液可以是同一溶液，即包装于一个容器中的笫二抗原稀释液，其中第二抗原稀释液的 β -巯基乙醇浓度为 0.01-50% , 优选为 0.05-20% , 进一步优选为 1-10%。, 最优选为 5%。。

6.权利要求 4的试剂盒，其中待测样品和第二抗原分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育时，笫二抗原稀释液中的 β -巯基乙醇浓度为 0.01-50% , 优选为 0.05-30% , 优选为 0.2-20% , 进一步优选为 0.5-10%, 进一步优选为 0.5-5%。，最优选为 1%。。

7.权利要求 1-4和 6任一项的试剂盒，其中所述样品稀释液中含有还原试剂。

8.权利要求 7 的试剂盒，其中所述还原试剂为 β -巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、硫代胺甲酸盐、二硫亚磺酸钠、抗坏血酸盐、二氯化锡或硼氢化钠。

9.权利要求 8的试剂盒，其中所述还原试剂为 β-巯基乙醇。

10. 权利要求 9 的试剂盒，其中所述样品稀释液中的 Ρ -巯基乙醇浓度为 0.01-50%。，优选为 0.1-20%。，进一步优选为 0.5-10%。, 最优选为 5%。。

11. 权利要求 1-10任一项的试剂盒，所述试剂盒包括预包被酶标板、笫二抗原、洗涤液、显色液、终止液、阴性对照、阳性对照、盖板膜、自封袋及说明书和包装盒。

12. 权利要求 1 的试剂盒，所述笫二抗原为 HCV蛋白与标签的结合物，所述标签为肽类标签或非肽类标签。

13. 权利要求 12 的试剂盒，其中所述肽类标签为含有 His Tag, T7 Tag, S Tag、 Flag Tag, HA Tag或 HCV肽片段的肽或蛋白。

14. 权利要求 12的试剂盒，其中所述非肽类标签为化合物、半抗原、维生素、类固醇、染料、激素、抗生素、核酸或者为它们与肽或蛋白的组合物。

15. 权利要求 13 的试剂盒，其中所述化合物为二硝基苯酚或溴脱氧尿苷；维生素为生物素或其衍生物；类固醇为地高辛；染料为吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯或荧光素。

16. 权利要求 12的试剂盒，所述标签为生物素。

17. 一种利用权利要求 1-16 任一项的试剂盒进行检测的方法，其以 "支持物-第一抗原 -待测 HCV抗体-笫二抗原 -酶标记物-可识别信号" 形式完成检测，而且包括以下检测步骤：

A.笫一抗原捕获抗体：加入待测样品后孵育，预包被酶标板上的笫一抗原捕获样品中的 HCV抗体；

B.抗体捕获笫二抗原：加入笫二抗原溶液后孵育， HCV 抗体捕获笫二抗原；

C.检测：利用标签通过一步或几步孵育引入酶标记物进行检测； ' 其中 B步骤在还原条件下进行，步骤 A和 B可以合并，即待测样品和笫二抗原可以同时加入反应系统中一起温育，该方法的特征为所述笫二抗原与酶标记物分两步依次加入反应系统中并分别进行孵育。