CN104237520A - 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)校准品：(2)双标记酶结合物；(3)阴阳性对照物；(4)发光液；(5)微孔包被板，所述发光液包括发光液1和发光液2，发光液1为含有0.7g/L鲁米诺，0.9g/L肉桂酸，0.2g/L4-碘苯硼酸，0.25g/L对碘苯酚，25ml/L二甲基甲酰胺，5g/L聚乙烯醇，8g/L聚乙烯吡咯烷酮，3g/L聚乙二醇600，4g/L乙二胺四乙酸，160万单位/L硫酸庆大霉素，0.4g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0.1mg/ml吖啶酯衍生物、3g/L聚乙二醇600、0.1％TWEEN-20pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液。本发明还公开了试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的优点是反应快速，成本低。

Description

一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种丙型肝炎病毒(HCV)抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是一类单股正链核糖核酸病毒，其具有囊膜，表面有刺状突起结构，病毒颗粒变异较大，它可以通过输血、静脉吸毒、密切接触等途径传播,而输血和注射是我国丙型肝炎病毒重要的传播途径。丙型肝炎发展隐匿,临床表现不典型,临床诊断、疗效观察依赖于实验室检测结果。
丙型肝炎病毒基因组含有开放阅读框架(ORF)，能编码氨基酸残基的病毒前体多肽，分别组成了丙型肝炎病毒的核心蛋白(c)，基质蛋白(M)，外壳蛋白(E)和另5种非结构蛋白(NS1-NS5)。丙型肝炎病毒抗体是由于人体免疫细胞对丙肝病毒感染所做出的反应而产生的。丙型肝炎病毒感染通常是持续性的终生感染,丙肝抗体阳性患者的血中含有丙型肝炎病毒，具有传染性。病人在急性感染后的数天内，血清中会出现病毒RNA，并且在产生抗体前一直会存在几个月。但是和乙型肝炎不同，丙肝抗体没有保护作用。因此，丙型肝炎病毒抗体阳性，并不表示不会再得丙型肝炎，只是表示病人曾经感染过或正在感染丙型肝炎病毒而已。初次诊断丙肝，一般来说，必须是丙肝抗体和HCV-RNA均为阳性才可诊断为丙肝，但是丙肝病毒HCV-RNA阴性却不能完全排除丙肝。目前临床由于HCV-Ag检测方法尚不成熟、HCV-RNA费用较高，HCV-Ab检测存在“窗口期”，所以HCV-Ag和HCV-Ab联合检测是临床筛查丙肝患者的一个非常有效的方法。
目前现有HCV抗原抗体联合检测方法有时间分辨免疫荧光分析法、酶联免疫测定法和化学发光免疫测定法等。
时间分辨免疫荧光分析法仪器兼容性差，价格昂贵，操作相对繁琐，且所涉及试剂对生产制作及应用中的试剂、水质与环境要求较高，特别是富含稀土金属的环境及水质易于产生高本底而降低敏感性。在一定程度上限制了其推广应用。
酶联免疫测定法具备其操作简单、试剂有效期长无污染、高于胶体金的敏感性、特异性好、结果可用仪器测定等特点得以推广，但由于敏感性相对较低，所用标记酶与底物可定量测定范围窄，及仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应用。
现有专利技术中，均未给出详细的抗原抗体检测试剂盒制备方法，尤其利用双标记、双底物进行检测的技术尚未见报道。
发明内容
为解决现有技术中HCV抗原、抗体检测的灵敏度不高、特异性差、不能同时检出的问题，本发明采用的技术方案是：
一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)双标记酶结合物；
(2)阴阳性对照物；
(3)发光液；所述发光液包括发光液1和发光液2，发光液1为含有0.7g/L鲁米诺，0.9g/L肉桂酸，0.2g/L4-碘苯硼酸，0.25g/L对碘苯酚，25ml/L二甲基甲酰胺，5g/L聚乙烯醇，8g/L聚乙烯吡咯烷酮，3g/L聚乙二醇600，4g/L乙二胺四乙酸，160万单位/L硫酸庆大霉素，0.4g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0.1mg/ml吖啶酯衍生物、3g/L聚乙二醇600、0.1％TWEEN-20pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；(4)微孔包被板。
进一步，所述双标记酶结合物的制备方法是：采用改良高碘酸钠氧化法，将辣根过氧化物酶标记到HCV嵌合抗原上，采用EDC法将碱性磷酸酶标记到另一HCV单抗上，将嵌合抗原-HRP按照0.1μg/ml，HCV mab-ALP按照0.2μg/ml稀释到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结合物稀释液中，作为酶工作液，于2～8℃下储存。
进一步，所述微孔包被板制备方法是：将包含有Core、NS3、NS4、NS5的嵌合抗原和HCV单抗用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2小时或2-8℃包被16小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时或2-8℃封闭16小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
进一步，所述阴阳性对照物分别为：采用阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中加入HCV-1抗体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HCV-2抗体作为阳性对照2，在阴性血清中加入HCV抗原作为阳性对照3。
本发明还公开了试剂盒的使用方法：
(1)将50μl阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入不同微孔中，37℃孵育30分钟；
(2)用含有tween20的Tris盐缓冲液清洗5次，拍干；
(3)每孔加入50μl酶工作液，37℃孵育30分钟；
(4)同第(2)步完成清洗后，每孔各加入100μl发光液A，孵育5分钟用光子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2.1倍作为cutoff判定值进行S/CO计算；
(5)完成读书后同第(2)步完成清洗后，每孔加入100μl发光液B，孵育10分钟用光子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2.1倍作为cutoff判定值进行S/CO计算；
(6)第(4)步所测S/CO值大于等于1的样本判定为抗体阳性；
(7)第(5)步所测S/CO值大于等于1的样本判定为抗原阳性；
(8)第(6)步和第(7)步所测S/CO的和为抗原抗体联合检测结果。
本发明提供了一种检测方法，利用双标记、双底物的方法进行HCV抗原、抗体的检测，使得“窗口期”大为缩短，检测特异性强，灵敏度高。弥补了单纯检测HCV抗原或HCV抗体的不足，同时避免了现有技术中操作繁琐，仪器兼容性差，测定范围窄等缺陷。
本发明的HCV化学发光免疫定量测定试剂盒，采用双标记，双底物的化学发光免疫分析检测方法，突破了传统单标记、单底物的检测技术，具有以下优点：
(1)相比较单独检测抗原或抗体的试剂，本发明试剂盒可以同时得到3个检测结果，能够全部测出丙型肝炎早期、急性感染期及HCV抗原抗体复合物存在期等时期体，提高抗原检测的灵敏度，降低本底，大大缩短了“窗口期”，弥补了单独检测抗原或抗体的不足；相比较抗原抗体联检、单独标记的试剂，本发明试剂盒增强了灵敏度，能更加有效的区分“窗口期”、“无症状期”、“发病期”等阶段，为临床诊断治疗提供了更加准确可靠的结果，能更好的对患者进行治疗；
(2)反应快速，可以在30min内出结果，操作简便，无污染；
(3)成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。
具体实施方式
实施例1：
试剂盒
一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包括：
(1)校准品：是用来做标准曲线的一组物质，6瓶；
(2)双标记酶结合物；
(3)阴阳性对照物；
(4)发光液；所述发光液包括发光液1和发光液2，发光液1为含有0.7g/L鲁米诺，0.9g/L肉桂酸，0.2g/L4-碘苯硼酸，0.25g/L对碘苯酚，25ml/L二甲基甲酰胺，5g/L聚乙烯醇，
8g/L聚乙烯吡咯烷酮，3g/L聚乙二醇600，4g/L乙二胺四乙酸，160万单位/L硫酸庆大霉素，0.4g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0.1mg/ml吖啶酯衍生物、3g/L聚乙二醇600、0.1％TWEEN-20pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；
(5)微孔包被板。
实施例2
实施例1所述试剂盒的制备
(1)双标记酶结合物的制备方法是：采用改良高碘酸钠氧化法，将辣根过氧化物酶标记到HCV嵌合抗原上，采用EDC法将碱性磷酸酶标记到另一HCV单抗上，将嵌合抗原-HRP按照0.1μg/ml，HCV mab-ALP按照0.2μg/ml稀释到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结合物稀释液中，作为酶工作液，于2～8℃下储存。
(2)阴阳性对照物分别为：采用阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中加入HCV-1抗体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HCV-2抗体作为阳性对照2，在阴性血清中加入HCV抗原作为阳性对照3。
(3)微孔包被板制备方法是：将包含有Core、NS3、NS4、NS5的嵌合抗原和HCV单抗用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2小时或2-8℃包被16小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
实施例3
实施例1所述试剂盒的制备
(1)双标记酶结合物的制备方法是：采用改良高碘酸钠氧化法，将辣根过氧化物酶标记到HCV嵌合抗原上，采用EDC法将碱性磷酸酶标记到另一HCV单抗上，将嵌合抗原-HRP按照0.1μg/ml，HCV mab-ALP按照0.2μg/ml稀释到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结合物稀释液中，作为酶工作液，于2～8℃下储存。
(2)阴阳性对照物分别为：采用阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中加入HCV-1抗体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HCV-2抗体作为阳性对照2，在阴性血清中加入HCV抗原作为阳性对照3。
(3)微孔包被板制备方法是：将包含有Core、NS3、NS4、NS5的嵌合抗原和HCV单抗用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2小时或2-8℃包被16小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
实施例4
实施例1所述试剂盒的使用方法
(1)将50μl阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入不同微孔中，37℃孵育30分钟；
(2)用含有tween20的Tris盐缓冲液清洗5次，拍干；
(3)每孔加入50μl酶工作液，37℃孵育30分钟；
(4)同第(2)步完成清洗后，每孔各加入100μl发光液A，孵育5分钟用光子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2.1倍作为cutoff判定值进行S/CO计算；
(5)完成读书后同第(2)步完成清洗后，每孔加入100μl发光液B，孵育10分钟用光子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2.1倍作为cutoff判定值进行S/CO计算；
(6)第(4)步所测S/CO值大于等于1的样本判定为抗体阳性；
(7)第(5)步所测S/CO值大于等于1的样本判定为抗原阳性；
(8)第(6)步和第(7)步所测S/CO的和为抗原抗体联合检测结果。

Claims (5)

1.一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)双标记酶结合物；
(2)阴阳性对照物；
(3)发光液；所述发光液包括发光液1和发光液2，发光液1为含有0.7g/L鲁米诺，0.9g/L肉桂酸，0.2g/L4-碘苯硼酸，0.25g/L对碘苯酚，25ml/L二甲基甲酰胺，5g/L聚乙烯醇，8g/L聚乙烯吡咯烷酮，3g/L聚乙二醇600，4g/L乙二胺四乙酸，160万单位/L硫酸庆大霉素，0.4g/L过氧化脲，pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0.1mg/ml吖啶酯衍生物、3g/L聚乙二醇600、0.1％TWEEN-20pH9.0的0.1mol/L的Tris缓冲液；
(4)微孔包被板。
2.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，
所述双标记酶结合物的制备方法是：采用改良高碘酸钠氧化法，将辣根过氧化物酶标记到HCV嵌合抗原上，采用EDC法将碱性磷酸酶标记到另一HCV单抗上，将嵌合抗原-HRP按照0.1μg/ml，HCV mab-ALP按照0.2μg/ml稀释到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结合物稀释液中，作为酶工作液，于2～8℃下储存。
3.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，
所述微孔包被板制备方法是：将包含有Core、NS3、NS4、NS5的嵌合抗原和HCV单抗用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37℃包被2小时或2-8℃包被16小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37℃封闭2小时或2-8℃封闭16小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
4.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，
所述阴阳性对照物分别为：采用阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中加入HCV-1抗体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HCV-2抗体作为阳性对照2，在阴性血清中加入HCV抗原作为阳性对照3。
5.权利要求1-4任一权利要求所述本发明试剂盒的使用方法：
(1)将50μl阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入不同微孔中，37℃孵育30分钟；
(2)用含有tween20的Tris盐缓冲液清洗5次，拍干；
(3)每孔加入50μl酶工作液，37℃孵育30分钟；
(4)同第(2)步完成清洗后，每孔各加入100μl发光液A，孵育5分钟用光子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2.1倍作为cutoff判定值进行S/CO计算；
(5)完成读书后同第(2)步完成清洗后，每孔加入100μl发光液B，孵育10分钟用光子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2.1倍作为cutoff判定值进行S/CO计算；
(6)第(4)步所测S/CO值大于等于1的样本判定为抗体阳性；
(7)第(5)步所测S/CO值大于等于1的样本判定为抗原阳性；
(8)第(6)步和第(7)步所测S/CO的和为抗原抗体联合检测结果。
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