(54) Título: MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE HCV EM UMA AMOSTRA (73) Titular: JOHNSON & JONHSON, Sociedade Norte Americana. Endereço: One Johnson & Johnson Plaza New Brunswick, N.J. 08933-7001, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: CHANDER BAHL; PATRICKC. NIVEN; ANTONIO J. SAMSON; DENISE M. MADJOR
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 20/03/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 20/03/2018
Assinado digitalmente por:
Júlio César Castelo Branco Reis Moreira
Diretor de Patente
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE HCV EM UMA AMOSTRA. Fundamentos da Invenção
Estima-se que 170 milhões de pessoas por todo o mundo tenham sido infectadas pelo vírus da hepatite C (HCV). Nos próximos poucos anos, o número de mortes nos EUA por doenças e por câncer hepáticos causados pelo HCV pode alcançar as mortes causadas pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS),
A transmissão do HCV parece requerer o contato sangue-asangue. Carregando um filamento simples de ácido ribonucléíco (RNA), o HCV contém somente um gene, que codifica uma poliproteína que é subsequentemente processada em pelo menos 10 proteínas funcionais. Evidentemente, a capacidade de testar o fornecimento de sangue em relação ao HCV é de grande importância. Além disso, quanto mais precoce se puder detectar o estágio do HCV, melhor.
Portanto, foi desenvolvido um ensaio baseado em ELISA para a detecção da infecção pelo HCV. Este novo ensaio pode detectar a infecção pelo HCV mais precocemente do que os ensaios utilizados atualmente para analisar o sangue em relação à infecção pelo HCV. Os ensaios atuais são baseados na detecção de anticorpos anti-HCV no sangue infectado através da captura destes anticorpos pelas seqüências da proteína do HCV representada pelas proteínas ou peptídeos recombinantes.
Por exemplo, o Ortho HCV 3,0 ELISA utiliza vários antígenos para detectar anticorpos anti-HCV muito precoce mente na sorocon versão. Entretanto, há um período de janela significativo nos indivíduos em viremia antes destes desenvolverem os anticorpos anti-HCV, Este período de janela pode ser tão longo quanto 60 dias. Durante este período o indivíduo, embora alta mente infeccioso, não poderá ser detectado através de ensaios de determinação de HCV atuais,
Sumário da Invenção
Um objetivo da invenção é fornecer um teste para diagnóstico que possa detectar a infecção por HCV durante o período de janela descrito acima através da captura tanto do antígeno quanto dos anticorpos do núcleo do HCV. É descrito aqui um processo para a detecção da infecção por HCV mais precocemente do que os ensaios com anticorpos utilizados atualmente. Isto foi realizado através do fornecimento de um teste que detecta o antígeno do núcleo do HCV em adição aos anticorpos anti-HCV.
Um outro objetivo da invenção é fornecer um processo para a determinação da presença de HCV em uma amostra, que compreende, o contato da amostra com os antígenos de HCV e os anticorpos do núcleo anti-HCV aderidos a uma fase sólida, a adição de um éter de polioxietileno à dita amostra, a detecção dos antígenos capturados e anticorpos através da adição de anticorpos IgG anti-humanos marcados e do núcleo anti-HCV marcados e a detecção do sinal como uma indicação da presença de infecção pelo HCV.
Um outro objetivo da invenção é fornecer certos detergentes que são necessários para liberar o antígeno do núcleo de HCV do vírus através do rompimento da proteína do envelope e/ou da camada lipídica. Descrição Detalhada da Invenção
É preferível em um ensaio de combinação que os detergentes liberem o antígeno do núcleo do vírus e ainda não possuam um impacto negativo na capacidade das proteínas recombinantes de HCV de capturar anticorpos anti-HCV. Em uma modalidade preferida da invenção, os detergentes da classe dos éteres de polioxietileno são utilizados para esta finalidade. Os detergentes comumente disponíveis nesta classe são: BRIJ 30, BRIJ 35, 56, 58, 92, 96, 98, 700 e MYRJ 52, 59, 53, 45. Estes detergentes auxiliam na liberação do antígeno do núcleo de HCV do vírus mas a presença destes detergentes não tem impacto negativo sobre o ensaio anti-HCV. Certos detergentes podem efetuar a detecção do anticorpo afetando os antígenos recombinantes cobertos sobre uma fase sólida ou inativando os anticorpos anti-HCV na amostra. Alguns dos detergentes como N-Lauril Sarcosina utilizados na detecção do ensaio do núcleo de HCV destroem a capacidade das proteínas recombinantes de HCV c22-3, c200 e NS5 de detectar os anticorpos HCV no Ortho HCV 3.0 ELISA.
Como utilizado aqui uma amostra, refere-se a qualquer substância que pode conter o analito de interesse. Uma amostra pode ser um fluido biológico, tal como o sangue total ou componentes do sangue total incluindo células vermelhas do sangue, células brancas do sangue, plaquetas, soro e plasma, ascitos, urina, fluido cerebroespinhal e outros constituintes do corpo que podem conter o analito de interesse.
Exemplos:
Os exemplos a seguir demonstram as vantagens e a utilidade da invenção através da descrição de uma lista de detergentes avaliados e dos resultados obtidos utilizando o ensaio descrito acima. Um versado na técnica reconhecería que a detecção do anticorpo e do antígeno do HCV pode ser feita separadamente ou simultaneamente. Entende-se que os exemplos são para ilustrar, mas não para limitar, o espírito e o âmbito da invenção.
Exemplo 1: Um ensaio de combinação anticorpo-antígeno.
Os antígenos de HCV c200-3, NS-5 e um antígeno de núcleo modificado C22KSN 47,48 ou C22KSR47L junto com dois anticorpos monoclonais anti-núcleo (monoclonais de murino anti núcleo Pep10,12) foram revestidos em microesferas em tampão fosfato. Os antígenos foram alterados através da modificação dos clones de DNA que codificam as proteínas recombinantes c22-3 contendo a seqüência HCV1. Estes procedimentos envolvem mutagênese sítio direcionada utilizando oligonucleotídeos sintéticos (Sambrook, Fritsh e Maniatis em Molecular Cloning, A laboratory manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Press, Capítulo 15, 1989). Após incubação durante a noite o tampão contendo as proteínas de revestimento foi removido e as microesferas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato contendo um detergente Tween 20. As microesferas revestidas com antígeno/anticorpo foram então tratadas com solução de BSA/sacarose para bloquear todos os sítios de ligação de proteína nas microesferas. Após 2-24 horas, a solução de BSA/sacarose foi removida e as microesferas foram secas com ar e armazenadas sob o agente de dessecação.
Exemplo 2: 100 mL de amostra a ser testada foram diluídos em 100 mL de solução de PBS contendo albumina de soro bovino, superóxido dismutase, extrato de levedura e Brij 58 ou Brij 35 a 1% ou uma mistura de ambos. Os espécimes diluídos foram pipetados nas esferas revestidas com antígeno de HCV/anticorpos monocionais (como descrito no Exemplo 1). Estas microesferas foram incubadas a 37°C durante 90 minutos. As microesferas foram então lavadas 5 vezes com PBS contendo Tween 20 0,5%. Uma solução de 200 mL de um IgG anti-humano marcado com peroxidase de raiz forte (HRP) e um anticorpo monoclonal do núcleo anti-HCV (Anti10 Pep4) marcado com HRP foram adicionados. Após uma incubação de 30 minutos as microesferas foram lavadas 5 vezes com PBS Tween 20. Uma solução de ortofenilenodiamina e peróxido de hidrogênio foi adicionada em cada cavidade. Após incubação no escuro durante 30 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 50 microlitros de ácido suifúrico a 4N. As placas foram lidas a 495 nM. Uma cor alaranjada em cada cavidade indica que o espécime, que está sendo testado, está infectado com HCV.
Exemplo 3 Efeitos dos éteres de polioxietileno sobre os ensaios de anticorpo ou antígeno de HCV
O efeito da adição de vários éteres de polioxietileno sobre o en20 saio anti-HCV HCV 3.0 ou sobre o ensaio ELISA com o antígeno do núcleo de HCV é mostrado abaixo nas Tabelas 1A e 1B. No ensaio de ELISA com o antígeno do núcleo de HCV a N-Lauril sarcosina utilizada no antígeno de núcleo de HCV comercial foi substituída por concentrações diferentes de detergentes na coluna um. No ensaio anti-HCV HCV 3.0, os detergentes foram adicionados ao agente de diluição do espécime utilizado no ensaio HCV 3.0.
Tabela 1A
Detergente Testado |
SIN. |
HCV 3.0 Ab. ELISA |
Matriz de Base |
Anticorpo HCV Reativo |
0,25% |
0,125% |
0,06% |
0,25% |
0,125% |
0,06% |
0,125% |
0,06% |
0,03% |
0,125% |
0,06% |
0,03% |
Polioxietileno |
2 oleiléter |
Brij 92 |
0,056 |
0,035 |
0,041 |
1,543 |
1,432 |
1,405 |
Polioxietileno |
8 estearato |
Myrj 45 |
0,019 |
0,024 |
0,025 |
1,208 |
1,286 |
1,313 |
Polioxietileno |
5 lauriléter |
|
0,033 |
0,046 |
0,058 |
1,168 |
1,274 |
1,351 |
Polioxietileno |
50 estearato |
Myrj 53 |
0,044 |
0,069 |
0,083 |
1,368 |
1,361 |
1,262 |
Polioxietileno |
8 lauriléter |
|
0,064 |
0,070 |
0,059 |
1,223 |
1,219 |
1,277 |
Polioxietileno |
9 lauriléter |
|
0,057 |
0,055 |
0,061 |
1,312 |
1,260 |
1,225 |
Polioxietileno |
10 lauriléter |
|
0,049 |
0,059 |
0,064 |
1,192 |
1,069 |
1,161 |
Polioxietileno |
10 cetiléter |
Brij 56 |
0,053 |
0,093 |
0,059 |
0,994 |
1,212 |
1,209 |
Polioxietileno |
10 oleiléter |
Brij 97 |
0,031 |
0,056 |
0,072 |
1,316 |
1,341 |
1,534 |
Polioxietileno |
100 estea- |
Myrj 59 |
0,047 |
0,050 |
0,045 |
1,751 |
1,615 |
1,418 |
|
rato |
|
|
|
|
|
|
|
Polioxietileno |
20 cetiléter |
Brij 58 |
0,058 |
0,046 |
0,062 |
1,568 |
1,507 |
1,488 |
Polioxietileno |
40 estearato |
Myrj 52 |
0,048 |
0,063 |
0,067 |
1,502 |
1,308 |
1,194 |
Polioxietileno |
100 estearil- |
Brij 700 |
0,043 |
0,045 |
0,052 |
1,600 |
1,482 |
1,503 |
|
éter |
|
|
|
|
|
|
|
Polioxietileno |
20 esteari- |
Brij 98 |
0,053 |
0,044 |
0,050 |
1,632 |
1,542 |
1,493 |
|
léter |
|
|
|
|
|
|
|
Polioxietileno |
23 lauriléter |
Brij 35 |
0,067 |
0,055 |
0,065 |
1,492 |
1,415 |
1,473 |
Polioxietileno |
7 lauriléter |
|
0,065 |
0,105 |
0,100 |
1,151 |
1,458 |
1,497 |
Polioxietileno |
4 lauriléter |
Brij 30 |
0,093 |
0,058 |
0,185 |
0,867 |
1,135 |
1,190 |
Polioxietileno |
3 lauriléter |
|
0,035 |
0,042 |
0,075 |
0,995 |
0,927 |
1,156 |
Pluronic F-127 |
|
|
0,025 |
0,030 |
0,035 |
1,521 |
1,327 |
1,271 |
Controle |
|
|
0,075 |
|
|
1,358 |
|
|
|
|
|
(3,0 SD) |
|
|
(3,0 SD) |
|
|
Tabela 1B
Detergente Testado |
SIN. |
Protótipo do Antígeno de HCV |
Matriz de Base |
Anticorpo HCV Reativo |
0,25% |
0,125% |
0,06% |
0,25% |
0,125% |
0,06% |
0,125% |
0,06% |
0,03% |
0,125% |
0,06% |
0,03% |
Polioxietileno |
2 oleiléter |
Brij 92 |
0,010 |
0,010 |
0,032 |
0,609 |
0,847 |
0,502 |
Polioxietileno |
8 estearato |
Myrj 45 |
0,028 |
0,021 |
0,022 |
0,880 |
0,509 |
0,433 |
Polioxietileno |
5 lauriléter |
|
0,002 |
0,004 |
0,007 |
0,195 |
0,243 |
0,265 |
Polioxietileno |
50 estearato |
Myrj 53 |
0,014 |
0,040 |
0,006 |
0,573 |
0,536 |
0,659 |
Polioxietileno |
8 lauriléter |
|
0,009 |
0,010 |
0,014 |
0,326 |
0,384 |
0,343 |
Polioxietileno |
9 lauriléter |
|
0,008 |
0,008 |
0,005 |
0,360 |
0,379 |
0,212 |
Polioxietileno |
10 lauriléter |
|
0,010 |
0,013 |
0,020 |
0,495 |
0,556 |
0,344 |
Polioxietileno |
10 cetiléter |
Brij 56 |
0,004 |
0,001 |
0,016 |
0,445 |
0,298 |
0,390 |
Polioxietileno |
10 oleiléter |
Brij 97 |
0,004 |
0,006 |
0,021 |
0,371 |
0,419 |
0,479 |
Polioxietileno |
100 estearato |
Myrj 59 |
0,019 |
0,021 |
0,023 |
0,429 |
0,320 |
0,369 |
Polioxietileno |
20 cetiléter |
Brij 58 |
0,008 |
0,011 |
0,028 |
0,546 |
0,898 |
0,564 |
Polioxietileno |
40 estearato |
Myrj 52 |
0,009 |
0,005 |
0,006 |
0,579 |
0,412 |
0,661 |
Polioxietileno |
100 estearil- |
Brij 700 |
0,016 |
0,023 |
0,019 |
0,294 |
0,307 |
0,319 |
|
éter |
|
|
|
|
|
|
|
Polioxietileno |
20 oleiléter |
Brij 98 |
0,008 |
0,011 |
0,032 |
0,557 |
0,718 |
0,539 |
Polioxietileno |
23 lauriléter |
Brij 35 |
0,022 |
0,028 |
0,029 |
0,722 |
0,494 |
0,309 |
Polioxietileno |
7 lauriléter |
|
0,009 |
0,009 |
0,016 |
0,228 |
0,289 |
0,309 |
Polioxietileno |
4 lauriléter |
Brij 30 |
-0,001 |
0,001 |
0,008 |
0,194 |
0,158 |
0,212 |
Polioxietileno |
3 lauriléter |
|
0,004 |
0,005 |
0,013 |
0,106 |
0,168 |
0,162 |
Pluronic F-127 |
|
|
0,013 |
0,013 |
0,012 |
0,324 |
0,285 |
0,268 |
Controle |
|
|
0,001 |
|
|
1,109 |
|
|
|
|
|
(nLs) |
|
|
(nLs) |
|
|
Exemplo 4 Detecção de antígeno do núcleo de HCV e/ou de anticorpos antiHCV.
Detecção de antígeno do núcleo de HCV ou de anticorpos anti5 HCV em placas revestidas com os anticorpos monoclonais c11-3 e c11-7 e com os antígenos de HCV c200-3, NS5 e um antígeno de núcleo modifica7 do. (Proteína fundida SOD contendo as seqüências do núcleo aa 10-99 com aa 47 e 48 deletados (c22KS (V47-48)). Os espécimes utilizados eram 4 extrações de sangue seqüenciais de um grupo de soroconversão disponível comercialmente. O antígeno do núcleo foi detectado utilizando o anticorpo monoclonal c11-4 marcado com HRP, os anticorpos anti-HCV foram detectados através de IgG anti-humana marcada com HRP. Através da utilização dos dois anticorpos juntos foi produzido um sinal cumulativo, como é mostrado na coluna encabeçada por pequeno conjunto na Tabela 2.
Tabela 2
AMOSTRA |
ANTI-lgG |
ANTINÚCLEO DE HCV |
PEQUENO GRUPO |
MÉDIA* NEG |
0,045 |
0,036 |
0,094 |
BCP 62151 |
0,007 |
0,135 |
0,193 |
BCP 62152 |
0,009 |
0,157 |
0,191 |
BCP 6215 3 |
0,014 |
0,231 |
0,270 |
BCP 6215 4 |
0,494 |
0,197 |
0,614 |
*sinal obtido através da utilização de amostras negativas
Exemplo 5 Detecção de antígeno do núcleo de HCV e/ou de anticorpos antiHCV.
Detecção de antígeno do núcleo de HCV e/ou de anticorpos anti-HCV em placas revestidas com os anticorpos monoclonais anti-núcleo c11-3 e c11-7 e com os antígenos de HCV c200-3, NS5 e um antígeno de núcleo modificado. (Proteína fundida SOD contendo as seqüências do núcleo aa 10-99 com a arginina na posição 47 substituída por uma leucina (c22KS (R47L)). Os espécimes utilizados eram 4 extrações de sangue seqüenciais de um grupo de soroconversão disponível comercialmente. O antígeno do núcleo foi detectado utilizando o anticorpo monoclonal c11-4 marcado com HRP, os anticorpos anti-HCV foram detectados através de IgG anti-humana marcada com HRP. No ensaio do pequeno conjunto, os dois anticorpos de detecção, o anticorpo monoclonal antinúcleo e o monoclonal IgG anti-humano marcados com HRP foram adicionados na forma de uma mistura.
Tabela 3
AMOSTRA |
ANTI-lgG |
ANTINÚCLEO DE HCV |
PEQUENO GRUPO |
MÉDIA* NEG |
0,045 |
0,036 |
0,094 |
BCP 6215 1 |
0,007 |
0,135 |
0,193 |
BCP 62152 |
0,009 |
0,157 |
0,191 |
BCP 62153 |
0,014 |
0,231 |
0,270 |
BCP 6215 4 |
0,494 |
0,197 |
0,614 |
Exemplo 6 Comparação Anti-lgG.
Uma comparação da reatividade anti-HCV do grupo de soroconversão em microesferas revestidas com duas proteínas de núcleo de HCV 5 diferentes é mostrada na Tabela 4.
Tabela 4
AMOSTRA |
SOD / C22KS (Δ47-48) |
SOD / c22KS (R47L) |
MÉDIA NEG |
0,045 |
0,076 |
BCP 6215 1 |
0,007 |
0,015 |
BCP 6215 2 |
0,009 |
0,021 |
BCP 6215 3 |
0,014 |
0,028 |
BCP 6215 4 |
0,494 |
0,498 |
Exemplo 7 A comparação da detecção do antígeno de núcleo do grupo de soroconversão em microesferas revestidas com dois antígenos de núcleo diferentes é mostrada na Tabela 5.
Tabela 5
Comparação Antinúcleo de H |
CV |
AMOSTRA |
SOD / c22KS (Δ47-48) |
SOD / C22KS (R47L) |
MÉDIA NEG |
0,036 |
0,047 |
BCP 6215 1 |
0,135 |
0,224 |
BCP 6215 2 |
0,157 |
0,189 |
BCP 6215 3 |
0,231 |
0,304 |
BCP 6215 4 |
0,197 |
0,189 |
Exemplo 8 A comparação da reatividade pequeno conjunto do grupo de soroconversão em microesferas revestidas com dois antígenos de núcleo diferentes é mostrada na Tabela 6.
Tabela 6
Comparação Pequeno Grupo de HCV
AMOSTRA |
SOD / C22KS (Δ47-48) |
SOD / C22KS (R47L) |
MÉDIA NEG |
0,094 |
0,144 |
BCP6215 1 |
0,193 |
0,247 |
BCP6215 2 |
0,191 |
0,226 |
BCP6215 3 |
0,270 |
0,328 |
BCP6215 4 |
0,614 |
0,658 |