JPH07504492A - ＨＣＶ １ｇＭ抗体を検出するためのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＣＶ　Ｉ　Ｍ抗体を検出するためのイムノアッセイ発明の背景 本発明は、一般的には肝炎Ｃ型ウィルス（ＨＣＶ）　、より特定的には検査試料 中のＨＣＶ　ＩｇＭの検出に関する。

世界の輸血肝炎症例の９０％以上は、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）に属する。

ＮＡＮＢＨの主要病因物質はＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ　）と称し、クローンニ ングされている。推定非構造（ＮＳ）−４ゲノム領域によってコードされるｃ− １００と称するイムノドミナント領域（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　ｒｅｇ ｉｏｎ）が発現され、精製され、感染検査試料中のＨＣＶに対する抗体の検出に 有用なイムノアッセイに導入された。例えば、Ｑ、　−Ｌ、　Ｃ４：３６２−３ ６４　（１９８９）；Ｔ、Ｍｉｙａｍｕｒａ７　：　９８３−９８７　（１９９ ０）；及びＣ，Ｌ、Ｖａｎｄｅｒ　Ｐｏｅｌら、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：２９７− ２９８　（１９８９）参照。

最近になって、詳細に記録された２０の輸血後ＮＡＮＢＨ症例の研究により、抗 ＨＣＶが発症するまでの平均遅延時間は輸血後２１．９週間、肝炎発病後１５週 間であると報告された。前出のＡｌｔｅｒらの文献参照。血清変換は、これらの 症例の４０％で６ケ月後、そして−人の患者については約１年後に生起した。前 出のＪ、１．Ｅｓｔｅｂａｎらの文献には輸血後ＮＡＮＢＨについて同様の結果 が報告されており、Ｙ、に、Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、ＵｓＡ　８７：６４４１−６４４４（１９９０）は、Ｃ型肝炎ウィルスを実験 的に感染させたチンパンジーについて同様の結果を報告している。急性ＮＡＮＢ Ｈであると診断される個体の罹患率が比較的低い（１５〜３０％）のは、組換え ｃ１００抗原によって検出される抗ＨＣＶへの血清変換の遅延に原因があると考 えられる。即ち、抗ＨＣＶ陰性症例は実際には、現在の抗ＨＣＶ’ｃ−１００ア ッセイ（いわゆる第一世代アッセイ）によって検出できる免疫応答を誘導しない ＨＣＶ感染によるものであり得る。

これまでの研究でＨＣＶは輸血関連肝炎の主因と確定されたが、ＨＣＶ　ｃ−１ ００抗原によって検出されるＨＣＶに対するイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ抗体は 、急性感染時には存在しないと思われる。Ｖａｌｌａｒｉらは最近になって、Ｉ ｇＧ抗ＨＣＶアッセイに組換えＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ及びＨＣＶ　ＮＳ３　（３３ｃ ）ポリペプチドを加えると、抗ＨＣＶが検出されない輸血後期間が大幅に短縮さ れるこ。この研究では、ＨＣＶに対する最も初期のＩｇＧ応答が、ＨＣＶ　３３ ｃ　（８人の患者）又１１ＨＣＶ　ｃ−１００（６人の患者）に対してよりもＨ ＣＶ　Ｃ０ＲＥ抗原に対して頻繁に検出された（１３人の患者で、最も早くもし くは同時に検出された）。また、ＨＣＶ　ＩｇＧ抗体が、ＨＣＶ　ｃ　−１００ ニ対して（５９，７％）　よりも、ＨＣＶＣＯＲＥ　（９０，８％）又はＨＣＶ 　３３ｃ　（８０，１％）に対して頻繁に検出された。これらの推定ＨＣＶエピ トープのいずれかをＨＣＶ　Ｃ０ＲＥと比較した時に観察される応答と異なり、 ＨＣＶ　３３ｃ抗原によって検出されるＩｇＧ抗体応答とＨＣＶ　ｃ−１００抗 原によって検出されるＩｇＧ抗体応答との間の有意な相関関係は明白であった。

しかしながら、ＨＣＶ　３３ｃも、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥも、これら両者の組み合わ せも、抗ＨＣＶ　ＩｇＧアセッにおけるＨＣＶ　ｃ−１００抗原の必要を回避さ せるものではない。

幾つかの推定ＨＣＶエピトープに対するＨＣＶ　ＩｇＧ抗体の受動トランスファ ーの発見は、これらの抗体の存在がウィルスを中和しないことを意味する。また 、ＨＣＶＣＯＲＥに対する抗体を高レベルで活発に産生ずる患者は肝炎をチンパ ンジーに移すことが判明した。前出のＡｆｔｅｒらの文献参照。現時点では、対 応するウィルス抗原が免疫複合体として存在するのか、又はウィルス粒子中に隔 絶されているのかは不明である。Ｄａｎｅ粒子中に包含されたＢ型肝炎ウィルス （ＨＢＶ）ＣＯＲＥ抗原と、高血清力価の抗ＨＢＶ　Ｃ０ＲＥとがＨＢＶキャリ ヤーにおいて発生することは公知である。別のＨＣＶ構造成分、例えばＨＣＶ推 定エンベロープタンパク質に対する抗体が、ＨＣＶウィルスに対する防護を付与 するかどうかの決定には、更に研究が必要である。しかしながら、現在状々がも っているＨＣＶ血清学の知識は、ＨＣＶに対する抗体を有する個体が感染性の可 能性があることを指摘している。この認識は、抗ＨＣＶ　ｃ−１００陽性血清の ＞４０％が検出可能なＨＣＶ　ＲＮＡを有するという報告によっても裏付けられ るＯＡ、Ｊ、Ｗｅｉｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ　３３６：　６９５　（１９９０） 。

最近のある報告は、抗ＨＣＶ　（ｃ−１００）の血液スクリーニング制度によっ て輸血関連肝炎症例の約半分が回避されるであろうと指摘している。Ｊ、Ｉ、Ｅ ｓｔｅｂａｎら、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３２３：１１０７−１１１２　（ １９９０）。開発中の「第二世代」の抗ＨＣＶスクリーニングアセツィは、ＨＣ Ｖ　Ｃ０ＲＥＳＨＣＶ　３３Ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００抗原を使用するものであ り、ＨＣｖ感染の検出の感度を実質的に増加させると期待される。

感度が増加すれば、輸血関連肝炎の危険が更に低下するだけでなく、集団獲得性 （ｃｏｍｍｕｎｉ　ｔｙ−ａｃｑｕｉｒ　ｅｄ）ＮＡＮＢＨの疫学的解明が進む 可能性がある。

ＨＣＶ　ＩｇＭに関するマーカーが存在する筈であることは認識されているが、 これらのマーカーの同定及びＨＣＶ感染の診断における有用性は不明であった。

感染に対する個体の反応では、ＩｇＭが最初に、即ちＩｇＧより前に出現すると 考えられるため、理論的には、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭを検出することがで きれば、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＧの検出よりも早い診断が可能であろうと推 定されてきた。我々は、ＩｇＭの存在を検出するように設計されたアッセイを使 用すると、多くの誤った反応結果が生じ得ることを発見した。我々は最近になっ て、これらの誤った反応の大部分が、検査試料中のＩｇＭの存在に起因するので はな（、リューマチ性様因子及びＨＣＶ　ＩｇＧの存在に起因するものであるこ とを確認した。このように、１ｇＭの存在を検出するアッセイの必要は存在する が、現在使用可能なアッセイでは信頼できる特異的な結果は得られそうにもない 。従って、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在を敏感且つ特異的に検出するイム ノアッセイを提供し、それによってＮＡＮＢＨに起因する急性感染を確認する手 段を提供することは有利なことと思われる。ＩｇＭの検出は、治療に対する応答 の測定、ワクチンに対する応答のモニター、又はウィルス複製の再活性化、再感 染、もしくはＨＣＶ誘導肝臓疾患の悪化の評価にも有用であり得る。我々は、Ｈ ＣＶ推定キャプシド（ＣＯＲＥ）タンパク質に対するＨＣＶ　ＩｇＭ抗体の検出 が、輸血後ＨＣＶ感染のマーカーを提供することを発見した。我々はまた、検査 試料中の抗ＨＣＶ　ＩｇＭ抗体の存在を高感度且つ特異的に検出することができ 、従ってＨＣＶ感染の有用敏感なマーカーを提供する新規のイムノアッセイを発 見した。

発明の概要 本発明は、検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭ の存在及び／又は量を決定するためのアッセイを提供する。抗ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ 　ＩｇＭ抗体は、感染の敏感なマーカーとして有用であることが示される。該ア ッセイは、検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質（ｒｈｅｕｍａｔｏ ｉｄ　ｆａｃｔｏｒ−１ｉｋｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ）の作用（影響）が存在 した場合に、その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、ＨＣＶ　Ｃ ０ＲＥＳＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶｃ−１００から選択した１種類以上のＨＣＶ 抗原に検査試料を接触させ、得られた混合物を抗原／抗体複合体の形成に十分な 時間及び条件下でインキュベートする操作を含む。次いで前記複合体を、ＨＣＶ 特異的結合メンバーに結合したシグナル発生化合物からなる指示試薬と接触させ 、得られた混合物を反応の生起に十分な時間及び条件下でインキュベートする。

発生したシグナルは、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び／又は量を示すも のである。検査試料中に存在するＨＣＶ　ＩｇＭの量は、発生したシグナルに比 例する。

本発明は、検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭ の存在及び／又は量を決定するためのアッセイであって、検査試料中に存在し得 るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合にその作用を阻止するのに十分 な条件に検査試料をかけ、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ。

ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００から選択した１種類以上のＨＣＶ抗原に 検査試料を接触させ、得られた混合物を抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及 び条件下でインキュベートし、次いで前記複合体を、哺乳動物抗ヒト■ｇＭに結 合したエンハンサ−化合物を含むプローブと接触させて第二の混合物反応生成物 を形成し、該第二の混合物反応生成物を、エンハンサ−化合物結合メンバーに結 合したシグナル発生化合物からなる指示試薬と接触させ、得られた混合物を、指 示試薬反応生成物の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートすることから なるアッセイも提供する。ＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び量は、検査試料中のＨＣＶ 　ＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとして発生するシグナルを検出すること により決定される。検査試料中に存在するＨＣＶ　ＩｇＭの量は発生したシグナ ルに比例検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び／又は量を決定するための別の アッセイ方式も提供する。例えば、別のアッセイの一つは、検査試料中に存在し 得るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合にその作用を阻止するのに十 分な条件に検査試料をかけ、検査試料を抗ヒトＩｇＭと接触させ、得られた混合 物を複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いで前記複合 体を、少なくともＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ抗原を含むＨＣＶ抗原に結合したシグナル発 生化合物からなる指示試薬と接触させ、得られた混合物を反応の生起に十分な時 間及び条件下でインキュベートすることからなる。ＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び量 は、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとして発生する シグナルを検出することにより決定される。検査試料中に存在するＨＣＶ　Ｉｇ Ｍの量は発生したシグナルに比例する。

更に別のアッセイ方式は、検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作 用が存在した場合にその作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、検査 試料を哺乳動物抗ヒトＩｇＭと接触させ、得られた混合物を抗原／抗体複合体の 形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いで前記複合体を、少なく ともＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ抗原を含むＨＣＶ抗原に結合したエンハンサ−化合物から なるプローブと接触させて第二の混合物反応生成物を形成し、該第二の混合物反 応生成物を、エンハンサ−化合物結合メンバーに結合したシグナル発生化合物か らなる指示試薬と接触させ、得られた混合物を指示試薬反応生成物に十分な時間 及び条件下でインキュベートすることからなる。ＨＣＶＩｇＭの存在及び量は、 検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとして発生するシグ ナルを検出することにより決定される。検査試料中に存在するＨＣＶ　ＩｇＭの 量は、発生したシグナルに比例する。

更に別のアッセイ方式は、検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作 用が存在した場合にその作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、検査 試料を抗ヒトＩｇＭと接触させ、得られた混合物を複合体の形成に十分な時間及 び条件下でインキュベートし、次いで前記複合体を、少なくともＨＣＶ　Ｃ０Ｒ Ｅ抗原を含むＨＣＶ抗原と接触させ、得られた混合物を反応生成物の形成に十分 な時間及び条件下でインキュベートし、該反応生成物を、シグナル発生化合物に 結合した抗ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ抗原からなる指示試薬と接触させ、反応が生起する のに十分な時間及び条件下でインキュベートすることからなる。ＨＣＶＩｇＭの 存在及び量は、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとし て発生するシグナルを検出することにより決定される。検査試料中に存在するＨ ＣＶＩｇＭの量は、発生したシグナルに比例する。

本明細書に記載のアッセイは、ＨＣＶ抗原を結合するための固相を含み得る。固 相としては、ポリマーもしくはガラスのビーズ、ニトロセルロース、微小粒子（ ｍ　ｉｃ　ｒ　。

ｐａｒｔｉｃｌｅ）、反応トレーのウェル、試験管及び磁気ビーズを選択し得る 。シグナル発生化合物としては、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び化 学発光化合物が挙げられる。酵素の具体例としては、アルカリホスファターゼ、 西洋ワサビペルオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。エンハン サ−化合物の具体例とじては、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが挙げられる 。エンハンサ−化合物結合メンバーの具体例としては、ビオチン、抗ビオチン及 びアビジンが挙げられる。リューマチ性因子様物質の作用を阻止するためには、 検査試料を、リューマチ性因子様物質の作用を阻止するのに十分な条件にかける 。この条件は、検査試料を適量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成し、該 混合物を、リューマチ性因子様物質を実質的に含まない反応混合物生成物の形成 に十分な時間及び条件下でインキュベートする操作を含む。

本発明は、検査試料中のＨＣＶ　ＩｇＭの存在及び／又は量を決定するのに有用 な検査キットも包含する。この種の検査キットは、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥＳＨＣＶ　 ３３ｃ及ＣＦＨＣＶ　ｃ−１００から選択した１種類以上のＨＣＶ抗原を入れた 容器と、適量の抗ヒトＩｇＧを入れた容器と、適量の哺乳動物抗ヒトＩｇＭを入 れた容器とを含む。該キットはまた、ポリマーもしくはガラスのビーズ、ニトロ セルロース、微小粒子、反応トレーのウェル、試験管及び磁気ビーズといった固 相に結合したＨＣＶ抗原を含み得る。哺乳動物抗ヒトＩｇＭはシグナル発生化合 物に結合し得る。

シグナル発生化合物は、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び化学発光化 合物であってよい。あるいは、哺乳動物抗ヒトＩｇＭをエンハンサ−化合物に結 合してもよい。

エンハンサ−化合物の具体例としては、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンが挙 げられる。また、シグナル発生化合物をエンハンサ−化合物結合メンバーに結合 することもできる。エンハンサ−化合物結合メンバーの具体例としてはビオチン 、抗ビオチン及びアビジンが挙げられる。

図面の簡単な説明 第１図は、非構造（ＮＳ）遺伝子及び構造遺伝子すなわちＣ０ＲＥ　（Ｃ）及び エンベロープ（Ｅ）を示すＨＣＶゲノムの地図である。

第２図は、ＨＣＶ　ＩｇＭアッセイ検査でリューマチ性す作用（影響）を示すグ ラフであり、ΔＤＲががＲＦ　（ＴＵ／ｍｌ）に対してプロットされている。塗 りつぶした三角形の間の実線は抗ＨＣＶ　３３Ｃの線であり、白抜きの円の間の 実線は抗ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥの線である。

第３図は、試料Ｎｏ、１０１０の１ｇＭ活性を示すグラフであり、ＤＲ読取り値 （ＤＲｒｅａｄｆｎｇ）がフラクション番号に対してプロットされている。白抜 きの四角形の間の実線は抗ＣＫＳ−ＣＯＲＥを示し、「＋」の間の実線は抗３３ −ｃを示し、白抜き菱形の間の実線は抗Ｃ−１００を示す。

第４図は、試料Ｎｏ、１０１０のＩｇＧ活性を示すグラフであり、ＤＲ読取り値 がフラクション番号に対してプロットされている。白抜きの四角形の間の実線は 抗ＣＫＳ−ＣＯＲＥを表し、「＋」の間の実線は抗３３ｃを表し、白抜き菱形の 間の実線は抗ｃ−１００を表す。

発明の詳細な説明 本発明は、特異的結合メンバーを使用するイムノアッセイを提供する。この場合 の「特異的結合メンバー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｅｍｂｅｒ） Ｊとは、特異的結合対（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｉｒ）、即ち 、一方の分子が化学的又は物理的手段により他方の分子に特異的に結合する２つ の異なる分子の一員を意味する。従って、一般的なイムノアッセイの抗原及び抗 体特異的結合対以外に、別の特異的結合対として、ビオチン及びアビジン、炭水 化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター及びレセプター分子 、補因子及び酵素、酵素阻害物質及び酵素等が挙げられる。特異的結合対としで は更に、元の特異的結合対の類似体である結合メンバー、例えばアナライト（分 析対象物）−類似体が挙げられる。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、抗 原、抗原フラグメント、モノクローナル及びポリクローナルの抗体及び抗体フラ グメント並びにこれらの複合体、例えば組換えＤＮＡ分子によって形成されたも のが挙げられる。本明細書で使用する「ハプテン」という用語は、抗体に結合す ることはできるが、担体タンパク質に結合しない限り抗体形成を誘起することが できない部分的抗原又は非タンパク質結合メンバーを意味する。

本明細書中の「捕捉試薬（ｃａｐｔｕｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）Ｊは、サンドイッ チアッセイの場合のようにアナライトに特異的であるか、競合アッセイの場合の ように指示試薬もしくはアナライトに特異的であるか、又は間接アッセイの場合 のように、それ自体がアナライトに対して特異性を示す補助的特異的結合メンバ ーに対して特異的である非標識特異的結合メンバーを意味する。該捕捉試薬は、 アッセイの実施前又は実施中に固相材料に直接的又は間接的に結合し得、それに よって検査試料からの固定複合体の分離を可能にする。

本明細書に記載の本発明の方法で検査できる検査試料としては、ヒト及び動物の 体液、例えば全血、血清、血漿、脳を髄液、尿、生物学的液体、例えば細胞培養 上清、組織試料及び細胞試料挙げられる。

エンハンサ−は、アッセイで発生したシグナルの検出に使用し得る。「エンハン サ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）Ｊとは、イムノアッセイで発生するシグナルを強め、 それによつて発生シグナルを増幅することができる物質を意味する。イムノアッ セイで発生するシグナルを増強し増幅する方法は当業者に幾つか知られている。

また、アビジン−ビオチンの使用のようなシグナルエンハンサ−の使用も公知で ある。

例えば、Ｈｅｖｅｙらの米国特許第４，２２８，２３７号には、アビジンで標識 した酵素も使用する方法で使用されるリガンドに対するビオチン標識特異的結合 物質の使用が開示されている。ビオチン−抗ビオチン系の使用は１９８４年５月 １０日に出願された米国特許出願筒６０８．８４９号に記述されている。該米国 特許出願は共通の所有権下にあり、本明細書に参考として包含される（１９８５ 年１１月１３日に欧州特許出願第１６０，９００号として公開された）。

本明細書中の「プローブ（ｐｒｏｂｅ）Ｊという用語は、「エンハンサ−」化合 物に結合した特異的結合対の一員を意味する。「エンハンサ−」化合物は、シグ ナル発生化合物によって発生したシグナルを増強することができる、該アッセイ で使用される任意の化合物であり得る。例えば、ビオチンのようなハブテン、及 びフルオレセイン、ジニトロフェノール等がエンハンサ−化合物として挙げられ る。

指示試薬は、特異的結合メンバーに結合した外部手段により検出し得る測定可能 なシグナルを発生することができるシグナル発生化合物（標識）を含む。本明細 書中の「特異的結合メンバー」は、特異的結合対、即ち一方の分子が化学的又は 物理的手段により他方の分子に特異的に結合する２つの異なる分子の一員を意味 する。指示試薬は、ＨＣＶに対する特異的結合対の抗体メンバーである他に、ハ プテン−抗ハブテン系を含む任意の特異的結合対の一員、例えば、ビオチン又は 抗ビオチン、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチ ド配列、エフェクター又はレセプター分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害物質 又は酵素等であり得る。免疫反応性特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセ イの場合のようにＨＣＶに結合するか、競合アッセイの場合のように捕捉試薬に 結合するか、又は間接アッセーイの場合のように補助的特異的結合メンバーに結 合することができる、抗体、抗原又は抗体／抗原複合体であってよい。例えば、 該アッセイでエンハンサ−を使用する場合、指示試薬は、エンハンサ−特異的化 合物（エンハンサ−化合物結合メンバー）、例えばビオチン又は抗ビオチン、ア ビジン又はビオチン、及び当業者に公知の他の化合物に結合したシグナル発生化 合物からなる。

例えば、使用するエンハンサ−化合物がビオチンの場合は、抗ビオチン又はアビ ジンをエンハンサ−特異的化合物として使用し得る。

使用し得る種々のシグナル発生化合物（標識）としては、ブロモクロロインドー ルホスフェート（ＢＣＩＰ）のような色原体、酵素のような触媒、フルオレセイ ン及びローダミンのような発光化合物、アクリジニウム、フエナントリジニウム もしくは１，２−ジオキセタン化合物のような化学発光化合物、放射性元素及び 直接的視覚標識が挙げられる。酵素の具体例としては、アルカリホスファターゼ 、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。特定標 識の選択は重要なものではないが、単独で、又は例えば酵素をシグナル発生化合 物として使用する場合の酵素基質の使用のように、１種類以上の別の物質と結合 した状態でシグナルを発生することができるものを選択する。

アッセイに使用する試薬は、バイアル又はビンのような容器を１つ以上含むキッ トの形態で提供し得ると考えられる。各容器にはモノクローナル抗体のような別 個の試薬を入れるか、又はアッセイで使用するモノクローナル抗体のカクテルを 入れる。

該アッセイ形態では、本発明の実施に固相を使用し得る。

この場合の「固相（ｓｏｌ　ｉｄ　ｐｈａｓｅ）Ｊとは、不溶性であるか又は後 続の反応によって不溶性にし得る任意の材料を意味する。固相としては、捕捉試 薬を引き付けて固定する能力を本来的に備えているものを選択し得る。あるいは 、捕捉試薬を引き付けて固定する能力を有する別のレセプターを保持できるもの を使用し得る。別のレセプターとしては、捕捉試薬に対して、又は捕捉試薬に結 合した帯電物質に対して、逆の電荷を有する帯電物質が挙げられる。更に別の変 形例として、レセプター分子は、固相上に固定され、特異的結合反応を介して捕 捉試薬を固定する能力を有する任意の特異的結合メンバーであってもよい。レセ プター分子は、アッセイの実施前又はアッセイの実施中に捕捉試薬を固相材料に 間接的に結合することができる。

本発明のアッセイの実施にアッセイデバイスを使用する場合、該アッセイデバイ スは多（の形態を有し得、そのうちの幾つかは固相として選択した材料に依存す る。例えば、固相としては任意の適当な多孔質材料を使用し得る。「多孔質（ｐ ｏｒｏｕｓ）Ｊとは、検査試料を容易に透過させることができる材料を意味し、 これには吸水性（ｂｉｂｕｌｏｕｓ）及び非吸水性の両方の固相材料が含まれる 。本発明で使用し得る固相としては、１種類以上のアッセイ試薬を含む１つ以上 の層を有する注入及び流出型（ｐｏｕｒａｎｄ　ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）ア ッセイデバイスで使用されるファイバーグラス、セルロースもしくはナイロンパ ッド、浸漬読取り型（ｄｉｐ　ａｎｄ　ｒｅａｄ）アッセイで使用されるディツ プスティック、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）用の試験片（例えば紙）、ある いは薄層クロマトグラフィーもしくは毛細管作用技術用の試験片（例えばニトロ セルロース）、又は当業者に良く知られている別の多孔質もしくは開孔材料（例 えばポリエチレンジ−４材料）が挙げられる。しかしながら固相は多孔質材料に は限定されない。固相としては、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微粒子、管 、シート、プレート、スライド、ウェル、テープ、試験管等、又は本来電荷を有 するか、あるいは帯電物質を保持することができる他の任意の材料も使用し得る 。

天然材料、合成材料、又は合成的に改質した天然材料を固相として使用でき、こ れには、多糖類、例えば紙及びセルロース誘導体、例えば酢酸セルロース及びニ トロセルロース；シリカ；失活アルミナ、ケイ藻土、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜のような 無機材料、もしくは微粉砕して、塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマ ー及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーのようなポリマーを含む多孔質ポリマ ーマトリクス中に均等に分散させた別の無機材料、天然布（例えば木綿）及び合 成布（例えばナイロン）；シリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチン のような多孔質ゲル；ポリアクリルアミドのようなポリマーフィルム等が含まれ る。固相は妥当な強度を有しているか、又はサポートにより強度を付与すること ができるものでなければならず、また検出可能シグナルの発生を妨害するような ものであってはならない。

流出型（ｆ　ｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）アッセイデバイスの場合に好ましい固相 材料としては、多孔質ファイバーグラス材料のようなフィルター紙、又は別の繊 維マトリクス材料が挙げられる。この種の材料の厚みは決定的に重要ではな（、 通常はアッセイすべき試料又はアナライトの特性、例えば検査試料の流動性に基 づいて選択すべきものである。

固相の本来の電荷を変えるか又は増強するためには、帯電物質を材料に直接コー ティングするか、又は微粒子にコーティングして該微粒子を固相支持材料により 保持し得る。

あるいは、微粒子をカラム内に保持するか又は可溶性試薬と検査試料との混合物 中に懸濁させて固相として使用するか、又は粒子自体を固相支持材料で保持し固 定してもよい。［保持し固定する（ｒｅｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｉｍｍｏｂｉｌ ｉｚｅｄ）Ｊとは、支持材料上又は支持材料中の粒子が支持材料内の別の位置に 実質的に移動できないようにすることを意味する。粒子は当業者が任意の適当な タイプの粒状材料から選択し得、例えば、ポリスチレン、ポリメチルアクリレー ト、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロ ニトリル、ポリカーボネート又は類似の材料を使用し得る。粒子の大きさは決定 的に重要ではないが、粒子の平均直径は使用する支持材料の平均孔サイズより小 さいことが好ましい。

固体支持体は当業者に公知であり、具体例としては、反応トレーのウェルの壁、 試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、メン プラン、ラテックス粒子のような微粒子、ガラス、プラスチック、誘導体化プラ スチック、金属及びケイ素のチップ等が挙げられる。

本発明の第一の実施態様では、ＨＣＶ　ＩｇＭを含み得る検査試料を、ＨＣＶ抗 原を結合した固体支持体と接触させて、混合物を形成する。該混合物を、ＨＣＶ 抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートする。次いで 、エンハンサ−を結合した哺乳動物抗ヒトＩｇＭからなるプローブを前記ＨＣＶ 抗原／抗体複合体と接触させて第二の混合物を形成する。この第二の混合物を、 第二の混合物反応生成物を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベート する。次いで、エンハンサ−化合物結合メンバーと測定可能なシグナルを発生す ることができるシグナル発生化合物とからなる指示試薬を前記第二の混合物反応 生成物と接触させる。この第三の混合物を、指示試薬反応生成物の形成に十分な 時間及び条件下でインキュベートする。発生したシグナルを検出することによっ てＨＣＶＩｇＭの存在及び／又は量を決定する。検査試料中に存在するＨＣＶ　 ＩｇＭの量は発生したシグナルに比例する。

本発明の別の実施態様は、ＨＣＶ　ＩｇＭを含み得る検査試料を、ＨＣＶ抗原を 結合した固体支持体と接触させて混合物を形成し、該混合物を、ＨＣＶ抗原／抗 体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いで、ＨＣＶ　 ＩｇＭに対する特異的結合メンバーに結合した測定可能シグナルを発生すること ができるシグナル発生化合物からなる指示試薬を前記複合体と接触させて第二の 混合物を形成し、該第二の混合物を、反応の生起に十分な時間及び条件下でイン キュベートし、発生したシグナルを検出することによってＨＣＶ　ＩｇＭの存在 及び／又は量を決定するアッセイからなる。検査試料中に存在するＨＣＶＩｇＭ の量は発生したシグナルに比例する。

更に別のアッセイ方式では、固相上にコーティングした哺乳動物抗ヒト■ｇＭに 検査試料を接触させ、ヒトＩｇＭ／抗ヒト■ｇＭ複合体の形成に十分な時間及び 条件下で反応させる。次いで該複合体を、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ、ＨＣＶ３３ｃ及び ＨＣＶ　ｃ−１００から選択した１種類以上のＨＣＶ抗原をエンハンサ−化合物 に結合したものからなるプローブと接触させる。好ましいエンハンサ−化合物は ビオチンである。これらを、抗原／抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条 件下で反応させる。次いで該複合体を、エンハンサ−化合物結合メンバーに結合 したシグナル発生化合物からなる指示試薬と接触させる。最も好ましいシグナル 発生化合物は酵素アルカリホスファターゼである。

最も好ましいエンハンサ−化合物結合メンバーは抗ビオチンである。得られた混 合物を、反応の生起に十分な時間及び条件下で反応させる。酵素を使用する場合 は、酵素基質の添加後にシグナルを検出し測定する。検査試料中に存在するＨＣ Ｖ　ＩｇＭの量は発生したシグナルに比例する。

更に別のアッセイ形態を、本発明の教示を実施することによりＨＣＶ　ＩｇＭを 検出するように調整することができ、そのようなアッセイ形態も本発明の範囲内 に含まれるものとする。

検査試料は、検査試料中に存在し得、且つアッセイの実施を妨害し得るリューマ チ性因子様物質を除去すべく処理するのが好ましい。この種の処理は当業者に公 知の様々な方法で実施することができ、例えば検査試料にプロティンＡもしくは プロティンＧ１熱凝集１ｇＧを予め吸収させ、該検査試料を、妨害する実質量の リューマチ性因子様物質を結合するのに十分な量の抗ヒトＩｇＧと接触させる方 法がある。検査試料を処理するための最も好ましい方法は、検査試料中に存在し 得るリューマチ性因子様物質を結合するのに十分な量のヤギ抗ヒトＩｇＧを含む 希釈試料緩衝液に検査試料を希釈することからなる。この希釈ステップは、検査 試料を捕捉試薬、ＨＣＶ抗原と接触させる前に実施するのが好ましい。好ましい 緩衝液は、検査試料中に存在し得る妨害性ＩｇＧを完全に除去することができる ものである。例えば、十分な量の抗ＩｇＧを含む緩衝液を希釈試料緩衝液として 使用し得る。該アッセイで使用し得る緩衝液の具体例としては、トリス緩衝塩水 、リン酸塩緩衝塩水及び当業者に公知の他の緩衝液が挙げられる。最も好ましい 緩衝液は、ヤギ抗ヒトＩｇＧを加えたトリス緩衝塩水（ｐＨ７，２）からなる。

該緩衝液には、非特異的結合を阻止するために更に別の化合物を加え得る。この 種の化合物の選択は、該アッセイ用に選択した成分に依存し、普通の技能をもつ 当業者の判断に委ねられる。

哺乳動物抗ヒトＩｇＭの由来源はヤギ、ウサギ、ヒツジであり得、又は当業者に 公知の他の哺乳動物の抗ヒトＩｇＭであってもよい。抗ヒトＩｇＭの好ましい哺 乳動物由来源はヤギである。

本明細書に記載のアッセイでＨＣＶ抗原を捕捉試薬として使用する場合は、１種 類以上のＨＣＶ抗原を固相に結合した状態で、又は溶液形態で使用する。−該抗 原としては、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥＳＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　Ｃ−１００を使用 し得る。我々は、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥが本発明のアッセイの実施で使用するのに最 も好ましい抗原であると確認シタ力、ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ−１００も 単独で又は任意に組み合わせて使用し得る。例えば、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ抗原をＨ ＣＶ　３３ｃ及び／又はｃ−１００又は別のＨＣＶ抗原と組み合わせ、本明細書 に記載の方法で捕捉抗原として使用し得る。

また、可溶性捕捉試薬が、陰イオン物質のような帯電物質に結合したアナライト 特異的結合メンバーを含み得るサンドイッチアッセイを実施できるとも考えられ る。本発明は競合アッセイの実施にも使用し得る。競合形態でも、可溶性捕捉試 薬は、特異的結合相手を結合すべき陰イオンポリマーのような帯電物質に結合し た特異的結合メンバーを含む。このような帯電物質を使用するアッセイは、１９ ８８年１月２９日出願の係属中の米国特許出願第１５０．２７８号及び１９８９ 年７月７日出願の米国特許出願第３７５．０２９号に記述されている。これらの 特許出願はどちらも本願と共通の所有権下にあり、本明細書に参考として包含さ れる。

あるいは、該アッセイを走査型プローブ顕微鏡検査によって実施し得ることも考 えられる。この場合は、試験片に結合したアナライト、アナライト類似体又はア ナライト特異的物質を、アナライトを含んでいる疑いのある検査試料と接触させ 、反応の生起に十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いでアナライトの 存在を走査型プローブ顕微鏡検査で調べる。このようなアッセイは、１９９１年 ２月２８日に出願された係属中の米国特許出願第（弁理士事件番号　Ｄ−１７８ ０８）に記述されている。該米国特許出願は本願と共通の所有権下にあり、本明 細書に参考として包含される。

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。尚、これらの実施例は本発明の精神及 び範囲を示すためのものであって、これを限定するものではない。

実施例 実施例１ 半自動化ドツトプロットイムノアッセイ半自動ドツトプロットイムノアッセイで 、ＡＢＢＯＴＴＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザー（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ。

ＩＬから市販）を用いて、ニトロセルロースからなるテストカード上にコーティ ングした精製組換えＨＣＶ抗原を検出した。この技術は、本願と共通の所有権下 の同時係属米国特許出願第２２７．４０８号（欧州特許庁［ＥＰＯ］公開第０　 ３５３　５９１号として公開された）、２２７゜５９０号（ＥＰＯ公開第０　３ ５３　５９２号として公開）、２２７，５８６号（ＥＰＯ公開第０　３５３　５ ８９号として公開）及び２２７，２７２号（ＥＰＯ公開第０３５３　５９０号と して公開）に記述されている。これらの特許出願はいずれも本出願に参考として 包含される。要約すれば、テストカードを後述のように用意し、用意したテスト カードを本明細書に記載のアッセイに使用した。各テストカードは陰性対照を含 んでいた。陰性対照は、自己ブランキング（ｓｅｌｆ−ｂｌａｎｋｉｎｇ）及び バリディティチェックを考慮したものである。

酵母中に発現されたＨＣＶクローンｃ１００−３　（ＫｕＯらにより５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４４：３６２−３６４［１９８９］に記載されている）キメラポリペプ チドと、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に発現された組換えＨＣＶポリペプチド、例 えばｐＨＣＶ−２３（最初の１０７個のＮ末端アミノ酸を欠失しているｃ１００ フラグメント）　、ｐＨｃＶ−２９（ＣＫＳ−３３ｃ）　、ｐＨＣＶ−３４（Ｃ ＫＳ−ＣＯＲＥ）　及ｒＪｒｙＨＣＶ−３５１ｐＬ　Ｃ０ＲＥ）　及びｐＨＣＶ −４５（ＮＳ４／ＮＳ５結合体）に由来するものとからなるＨＣＶテストカード を開発した。第１図は、本明細書に記載のＨＣＶのｒＤＮＡ発現領域の地図であ る。これらのＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列は当業者に公知であり、１９９ ０年９月１９日に公開された欧州特許出願第０　３８８　２３２号に開示されて いる（３２及び３４ページ参照）。該欧州特許出願は本明細書に参考として包含 される。

総てのタンパク質はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）融合タンパク質とし て発現された（Ｔ、ＪＢｏｌｌｉｎｇ及びＷ、Ｍａｎｄｅｃｋｉ、”Ａｎ　Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ 　ｈｉｇｈ−１ｅｖｅｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ ｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＣＭＰ−ＫＤＯ５ｙ ｎｔｈｅｔａｓｅ”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　８：４８８−４９０　［１ ９９０］の教示通り）。但し、ｐＨｃｖ−３５は例外であり、ラムダ（λ）ｐＬ 発現系中に発現された。各テストカードは更に、アッセイの確認でも有用である ことが判明したバックグラウンドシグナルを検出するための参照スポット（ｒｅ ｆｅｒｅｎｃｅ　５ｐｏｔ）（陰性対照）を含んでいた。組換えポリペプチドの 調製は、ニトロセルロースからなる固体支持体上への吸着によるスポツティング に合わせて個々に最適化した。好ましい緩衝液、ｐＨ条件及びスポツティング濃 度は表１に示す。これは、本明細書に参考として包含される同時係属の且つ共通 所有権者の米国特許出願第５３２，４８９号に記述されている通りである。しか しながら、これらの最適因子以外に、異なるｐＨ値、洗剤組成及び塩濃度でも、 テストカードに対するポリペプチドの適用は首尾よく達成された。

表１ プラスミド／　ｎｇ／スポット　スポツティング緩衝液ｃｌｏ０　１００−１５ ０　２０ｄ　トリス−ＨＣｌ、　０．９％ＮａＣ１，０，０１５％ＳＯ５，ｐＨ ８，３ｐＨｃＶ−２３／ＣＫＳ−ＢＣＤ　１００−１５０　２０ｍＭ　）すＸ− ＨＣｌ、　０．９％ＮａＣ１，０，０１５％ＳＯ３，ｐ［１８，３ｐＨｃＶ−２ ９／ＣｌＦ５−３３ｃ　１００−１５０　５ｈＭリン酸Ｎａ、　０．０１％　） リドンＸ−１００（ｎｉｌ）、　ｐＨ６，５ｐｔｌｃＶ−３５／Ｃ０ＲＥ　１０ ０−１５０　５０ａｌｌ　トリス−ＩＩＣｌ、　０．００２５％Ｔｗｅｅｎ−２ ０（１１ｍＭ）、　ｐｕ刀A　５ ｐＨＣＶ−３４／ＣＫＳ−ＣＯＲＥ　７５−１００　５０ｍ１！リン酸Ｎａ、　 ０．００２５％Ｔｗｅｅｎ−２０（１１１１）、　ｐＨ１２C０ ｐＨ（Ｊ−４５／ＣＫＳ−Ｅ　１００−１５０　５０ｍＭ　トリス−１１ｃ１． ０．０１５％ＳＤＳ、　ｐＨ８，５スポツテイング後、固体支持体を室温で乾燥 し、その後固体支持体をトリス緩衝塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭｈリス緩衝液、Ｑ、 ５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％　ＮａＮｇを含む、ｐＨ７，４〜７．６）で濯いだ。

次いで、固体支持体を、（１％）ブタゼラチンと（１％）カゼイン酸加水分解産 物と（５％）Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）とのＴＢＳ中溶液で、３５℃で約３ ０分間被覆した。該固体支持体をＴＢＳで更に２回濯ぎ、次いで検査細胞カート リッジに組み込む前に３７℃の炉で風乾した。

実施例２ ＩｇＭを測定するためのＨＣＶアッセイ手順１０μｌの検査試料を、１ｉ＋１の 試料希釈物（１，５％ｖ／ｖＢｒ　ｉ　ｊ−３５（登録商標）と０．１％ｗ　／ 　ｖ　Ｅ　ＤＴＡと０．１％ＮａＮ、とを含む２０ｍＭ　ＴＢＳ中の、１％ｗ／ ｖウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］　と、０．５％Ｗ／Ｖ脱脂粉乳と、０．０３％ 酵母抽出物と、ＣＫＳタンパク質を含む５％ｗ　／　Ｖ大腸菌溶解物とからなる ）と混合した。希釈物がリューマチ性因子様妨害を抑制するための哺乳動物抗ヒ トＩｇＧを含んでいる場合は、試料／希釈物混合物を室温で約１５分間インキュ ベートした。該インキュベーションの後に、試料／希釈物混合物を１２．００Ｏ ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、沈殿したＩｇＧ凝集体を除去した。上清を該ア ッセイで希釈検査試料として使用した。

該希釈検査試料１ｍｌを前述のように用意した検査セルに移した。該検査セルを 検査試料と共に３５℃で約６０分間インキュベートした。

次いで、検査セルをＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザーで約 １５分間ＴＢＳで洗浄した。洗浄は、検査セルを少な（とも３回洗浄し濯ぐ一連 の洗浄ステップを含んでいた。次いで、１ｍｌの抗ヒトＩｇＭ：ビオチンプロー ブを２００ｎｇ／ｍｌでプローブ希釈液（ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商 標）プローブ希釈液、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｆｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ 　Ｐａｒｋ、ＩＬから市販）で希釈した。最も好ましい抗ヒトＩｇＭはヤギ抗ヒ トＩｇＭ（ヤギ抗ヒトＩｇＭ、、Ｆ（ａｂ′）！：ビオチン結合体、Ｓｉｇｍａ 　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯから市販）であった が、全ヤギ抗ヒトＩｇＭ：ビオチン結合体プローブも使用し得ると確認された。

該混合物を３５℃で３０分間インキュベートした。該インキュベーション後、更 に１５分間の洗浄を前述のように行った。次いで、１ｍｌの抗ビオチン：アルカ リホスファターゼ結合体を反応セルに加え、３５℃で３０分間インキュベートし た。使用した抗ビオチン抗体はウサギポリクローナル抗体である。酵素は仔牛腸 由来のアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）又は大腸菌組換えアルカリホスファターゼ（Ａ ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、ＩＬ）であった。前記インキュベ ーション後、更に１５分間の洗浄を前述のように行った。次いで、１ｍｌの５− ブロモ−４−クロロ−３−インドールホスフェート（ＢＣｔＰ）を反応セルに加 え、該混合物を３５℃で３０分間インキュベートした。該インキュベーションの 後に、１５分間の最終洗浄を前述のように実施した。

ｆｉ終洗浄１％了１．？＝ｆｆｌ、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ア ナライザーで反応セルを乾燥しく３５℃で２５分間）、反応セルのアレイ内の所 定位置での反射率を測定して、個々の反応の程度を客観的に測定した。結果はＤ Ｒ（反射密度、ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　ｄｅｎｓｔｔｙ）又はΔＤＲ（陰性対 照スポットのＤＲ値を検査スポ・ツ１−ＤＲから差し引いた自己ブランク化（ｓ ｅｌｆ−ｂｌａｎ　ｋ　ｅ　ｄ）結果）として現れた。後述のように、選択集団 （ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）＋こ基づむ１て各抗原の反応性 カットオフ値を計算した。

実施例３ 選択集団 抗ＨＣＶ−１ｇＭアッセイを適切にするためには、陰性試料及び陽性試料両方の 特徴付けされた集団が必要であった。陰性集団グループは、現在のＨＣＶアッセ イ、好ましくは組換えＨＣＶタンパク質を用いるアッセイにより、総ての試料が 抗ＨＣＶ陰性であることを要求することによって明らかにされるであろうと決定 された。陽性集団は、現在に至るまで記録がないため、定義するのがより困難で あった。高リスク又は高確率集団、例えば抗ＨＣＶ反応性集団、及び、アラニン アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のような代理マーカーに対して反応性を示 す集団をターゲットにすることに決定した。これら３つのグループは、（１）ア ッセイカットオフを確立するために使用される陰性集団、（２）代理マーカー反 応性集団、即ち高ＡＬＴ試料、及び（３）抗ＨＣＶ反応性集団、即ち「サクラメ ント試料（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）Ｊであった。

１、陰性集団でのアッセイカットオフの決定陰性対照を用いて各反応セルをブラ ンキングした。反応セルは、反応セル上の各検査スポット毎に得たＤＲ値から陰 性対照ＤＲ値を差し引くことによってブランキングした。

陰性対照は試料毎のバックグラウンドの不一致（ｓ　ａｍｐｌｅ−ｔｏ−ｓａｍ ｐｌｅ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　１ｎｃｏｎｓ　１ｓｔｅｎｃｉｅｓ）をブラン クアウトしただけでなく、存在するバックグラウンドの量を評価するための絶対 標準としても使用された。特定試料に関する陰性対照ＤＲ値が所定ＤＲ値を超え た場合は、検査結果の妥当性を疑わしいとみなし、アッセイ結果を無効とした。

陰性対照のこのような二重の特色、即ち自己ブランキング及びバリディティチェ ックは、該アッセイに従来のＥＩＡよりも大きい特異性コントロールを与えた。

本発明のＨＣＶ　ｒｇＭイムノアッセイのアッセイカットオフを確立するために 使用した方法は次の通りである。

該アッセイ形態は、患者の試料を複数の抗原及びコントロールスポットと反応さ せることからなるため、各検査スポット毎に１つずつで複数のカットオフを決定 した。これらのカットオフを決定するために、既知のＨＣＶ非反応性試料の選択 集団を、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザーにより下記のよ うに実施した本発明のＨＣＶＩｇＭアッセイによって検査した。陰性試料を記載 のようにアッセイし、ΔＤＲ値を各試料について各抗原検査スポット毎に計算し 、集団セットについて統計をとった。陰性対照スポラ）ＤＲ値及び各抗原スポッ トΔＤＲ値に関するデータ全体にわたり平均偏差及び標準偏差を計算した。

カットオフは通常、抗原スポット平均ΔＤＲ値＋６つの標準偏差（ｓｄ）の値に セットした。一般的に、カットオフ値は、最大有効陰性対照ＤＲ値＝ｏ、ｉｏｏ 〜０．１５０で、ΔＤＲ値＝０．０３０〜０．０５０の近傍にあるべきと確認さ れた。基本的カットオフ値が確立されると、各試料の反応性の計算は用意に決定 された。考慮した別の因子は、反射読取り値（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｄ ｓ）の非線形に起因するアッセイオフセットである。各スポットのカットオフは 、陰性対照スポットの値に基づいて各ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標） 反応セル毎に調整しなければならないことが確認された。この計算は下記の通り であった： カットオフ、ｌ、＝カットオフ、。、＋０．１５本陰性対照Ｄ　Ｒ、、。

前記式中、カットオフ、１．は、試料量についてアッセイした検査セル上の特定 抗原に対して使用すべきカットオフであり、カットオフ、。、は計算したカット オフ（平均＋６ｓｄ）であり、陰性対照ＤＲ，，，は試料ｉの陰性対照ＤＲ値で ある。カットオフ計算値には関係なく、最大カットオフ値はΔＤＲ＝０．０３０ であった。

２、高ＡＬＴ試料 １（ＣＶ　１ｇＭ反応性試料を同定するために、高ＡＩ、Ｔ値を有する９１個の 試料血漿ユニットからなる集団を供給し、本発明のＨＣＶ　１ｇＭアッセイで検 査した。これらの試料は、複数のＨＣＶアッセイ、即ちプロトタイプアッセイＡ ＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登ｉ商標）ＨＣｖアッセイ、プロトタイプアッセイ ＡＢＢＯＴＴ　ＩＭ、（登録商標）ＨＣｖアッセイ、市販のライセンスアッセイ でありＨＣＶ　ｃｌｏｏを捕捉抗原として使用するＡＢＢＯＴＴ“１．０”アッ セイ、及び更に２つの組換えＨＣＶタンパク質（３３Ｃ及びＣ０ＲＥ）を使用す るプロトタイプアッセイＡＢＢＯＴＴ　”２．０ＥＩＡ”　（これらのテストは いずれもＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、 ＩＬから入手可能）により、抗ＨＣＶ（ＩｇＧ）活性について予めスクリーニン グした。アッセイした９１個の試料のうち、３つの試料（試料Ｎｏ、１０１０． １０３４及び１０８９）は、前述の種々のＨＣＶアッセイ（ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡ ＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣｖアッセイ、ＡＢＢＯＴＴ“１，０１アツセイ及びプ ロトタイプＡＢＢＯＴＴ”２．０ＥＩＡ”）”Ｃ”ＨＣＶ　ＩｇＧ反応性を示し た。これら３つの試料を前記実施例１及び２で詳述した手順に従って本発明のＨ ＣＶ　１ｇＭアッセイで検査した。これら３つの試料のうちの１つ、試料１０１ ０１は、本発明のＨＣＶ　１ｇＭアッセイで一貫して反応性を示した。この試料 を後述の複数の確認手続きにかけ、ＨＣＶＩｇＭアッセイの陽性対照として選択 した。別の試料、試料１０８９は、セルロット−ロット反応性Ｃｃｅ１１１ｏｔ −ｔｏ−１ｏｔ　ｒｅａｃｔｉｖｅ）／非反応性挙動を示した。この反応性は、 試料希釈物への抗ヒトＩｇＧの添加によって中和できる偽反応性であることが確 認された。

３、抗ＨＣＶ反応性集団 ＨＣＶ　１ｇＭ反応性試料の由来源である別の集団グループは、「サクラメント 試料（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ　５ｐｅｃ　ｉｍｅｎｓ）Ｊと称する試料コレクシ ョンであると同定された。これらの試料はカリファルニア州すクラメントの血液 スクリーニングサービス（Ｓａｃｒａｍｅｎｔ。

Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｔｏｎ、Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｂｌｏｏｄ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ）から入手したものであり、オーツ社製（Ｏｒｔｈｏ−ｄｉｓｔ ｒｉｂｕｔｅａ）ＨＣＶアッセイ（Ｏｒｔｈｏ（登録商標）ＨＣＶＥＬＩＳＡ　 Ｔｅ５ｔ　５ｙｓｔ、ｅｍ、０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔ ａｎ、ＮＪから市販）が入手可能になった後で、カリファルニア州すクラメント の前記血液スクリーニングサービスでスクリー・ニングされた最初の２０．００ ０個の血液ユニットに由来する総ての０ｒｔｈｏ　ＨＣＶ　（１，０）ＥＩＡ反 復反応性試料を代表するものであった。

０ｒｔｈｏ抗ＨＣＶアツセイ（Ｏｒｔｈｏ（登録商標）ＨＣＶ　ＥＬＩＳＡ　Ｔ ｅ５ｔ　Ｓｙｓｔｅｍ、０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔａｎ 、ＮＪ）によって反復的に反応性であることが判明した１４２の試料のうち６４ 個は、ＨＣＶに関して本明細書に記載のプロトタイプアッセイ（ＡＢＢＯＴＴ　 ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ　ＩｇＧ及びＡＢＢＯＴＴ　ＨＣＶ”２．ＯＥ ＩＡ”）ｉ：ヨリ、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶｃ−１００に 対してＩｇＧ反応性を示すことが判明した。

ＨＣＶ　１ｇＭアッセイは、試料希釈物の組成に応じて明らかに異なる結果を示 すことが観察された。これは、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ　（登録商標）ＨＣ Ｖ　（Ｉ　ｇＧ）試料希釈物、又はＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）Ｈ ＣＶ　（Ｉ　ｇＧ）試料希釈物に加えた哺乳動物抗ヒトＩｇＧのいずれかを用い て実施した実験によって確認された。

哺乳動物抗ヒト■ｇＧは、リューマチ性因子様物質が検査試料中に存在している 場合にそれを沈殿させる目的で試料希釈物に加えた。哺乳動物抗ヒトＩｇＧは、 実施例２に記載の濃度で検査試料に加え、これらの検査試料は実施例１及び２に 記載のようにアッセイした。これら２種類の希釈物は下記の結果をもたらした。

６４個のＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ反応性試料のうち３６ 個（５６，２％）が、第一の希釈物を使用しＡＢＢＯＴＴＭＡＴＲＩＸ（登録商 標）アナライザーを用いた場合に、本発明のアッセイによりＨＣＶ　ＩｇＭに対 して反応性であることが判明し、２９の検査試料のうち７つ（２４，１％）が、 ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アナライザーを使用し、抗ヒトＩｇＧ をも含む希釈物を用いた場合に、本発明のアッセイによりＨＣＶ　ＩｇＭに対し て反応性であることが判明した。従って、第一の希釈物を使用した場合は、２９ 個の反応性試料のうち２２個が偽１ｇＭ反応性を示したことが確認された。「真 性（ｔ　ｒｕｅ）ＪＨＣＶ　１ｇＭ反応性試料、即ち改質希釈物に対して反応性 を示した７つの試料は総て、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥタンパク質（ＣＫＳ−ＣＯＲＥ） に対して反応性を示した。また、ある試料はＨＣｖ　Ｃ０ＲＥ及びＨＣｖ　３３ ｃに対シテ反応性を示しが、別の試料は３種類の抗原縁てに対して反応性を示し た。これらのデータは表６に示す。

実施例４ 輸血後（ＰＴ）ＮＡＮＢＨ患者からの連続採血抗ＨＣＶ　ＩｇＭのプロトタイプ アッセイを確立した後のステップは、どの抗原がＨＣＶ　１ｇＭ応答を誘起する かを同定し、このようなＨＣＶ　１ｇＭ応答を、急性患者及び慢性患者両方の時 間依存型血清学的プロフィルと関連付けることにあった。病気の急性期（ａｃｕ ｔｅ　ｐｈａｓｅ）（症状が出る前及び出ている間）及び後急性期（ｐｏｓｔ− ａｃｕｔｅ　ｐｈａｓｅ）（回復又は慢性感染）の全体を通して一定の時間間隔 で採取した感染患者からの連続採血試料（ｓｅｒｉａｌ　ｂｌｅｅｄ　ｓａｍｐ ｌｅＳ）を用いて、潜在的急性期マーカーの効果を調べた。

３つの異なる連続採血試料グループを、ＨＣＶ　５ＯＤ−Ｃ１００、ＣＫＳ−３ ３Ｃ及びＣＫＳ−ＣＯＲＥ組換え抗原に対する１ｇＭ応答について評価した。こ れらのグループは、血清変換パネル（単位容積量）及びＮＩＨから得た連続採血 試料を含んでいた。

１、血清変換パネル 血清変換パネルは、３人のドナーからの連続採血の１９メンバーパネルで構成し た。前記ドナーはいずれも、最初の連続採血では総てのＨＣＶマーカーについて 血清反応陰性であった。これらのブリードを得る期間の間に、各患者は１種類以 上のＨＣＶ抗原に対するＨＣＶ抗体（ＩｇＧ）に関して反応性に血清変換した。

パネルメンバー１〜６は患者１に由来し、７〜１１は患者２．１２〜１７は患者 ３に由来する。

このパネルをＡｂｂｏｔｔ　ＨＣＶ　１．ＯＥＩＡ。

２、ＯＥＩＡ、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶアッセイ（Ａｂ ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、ＩＬから入手 可能）及び本発明のＨＣＶ　１ｇＭアッセイ（実施例１及び２に詳述）で検査し た。これらのアッセイの結果は表２に示す。表２のデータは、１．０　ＥＩＡ　 （ＳＯＤ−ｃ−１００のみ）の結果と、２．ＯＥＩＡ　（ＳＯＤ−ｃ−１００、 ＣＫＳ−３３ｃ及びＣＫＳ−ＣＯＲＥ）との相違を明白に示している。表２の結 果から、ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ及び３３ｃ反応性はｃ−１００反応性に先行すること が多いことが知見される。この特定グループの患者連続採血について、ＨＣＶＩ ｇＭアッセイは、ある場合にはプロトタイプＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録 商標）ＨＣＶ　（Ｉ　ｇＧ）７ツ４ｚイより１採血前に反応性を示し、別の場合 には１採血後に反応性を示した。一般的には、ＨＣＶ　１ｇＭ応答は一時的（ｔ ｒａｎｓｉｅｎｔ）であり、感染の初期に現れ、急速にピークに達し、次いで低 下した。

表２ パネル　ＡＬＴ　１ｌｉｌｆ［ｌ　１．０　２．ＯＨＣＶＩｇＧ責ｔｌｃＶ１　 ４１０　−−０．０　０．００．１　０．２０．５１．０２　５１７　−−０． １　０．００．１　０．３０．１０．１３　６３１４　−−０．１　０．１０． １　０．１０．００．０４　１８３　２４　−　−　０．１　０．７　４７．４ 本　〇、１　０．１　６９．９零５　４４　４４　＋　＋２．６本　３２２．１ 本　２０２．１本　０．４　０．３　１００．８本６　７２　７２　＋　＋　１ １９．８本　４１７．７本　２０４．０本　〇、５　２．１　９４．３零７　２ ７　０　−　−　０．１　０．０　０．１　０．０　０．００．０８　１８０　 １１　−　−　０．０　０．１　０．４　０．０　０．０６．４本９　４０１　 ４０　−　＋　０．３　３７２．８本　１４６．５本　〇、０　０．０　９１． ８本１０　ｎａ　８２　＋　＋　１２４．９本　４１５．１本　１５７．１本　 ０．０　０．０　１３．９ネ１１　ｎａ　９５　＋　＋　１９４．８本　５７４ ．８本　２４１．４本　０．０　０．１　５．５＊１２　１４　０　−　−　０ ．１　０．０　０．１　０．０　０．００．０１３　１？　？　−−０，１０， １０，１０，００，００，０１４１００，００，００，０ １５１４−０，００，００，０ １６２７４２４−−０，１０，４０，４０，００，００，０１７３４６２８−− ０，１１５，２零　〇、４　０．０　０．００．１１８　１１７５４４　＋　＋ 　７．２本　３６４．５本　９１．４本　〇、５　０．４　４．３＊１９　４２ ９　７２　＋　＋　１３．２本　３１０．９本　９５．０本　０．０　０．１　 １．３零☆Ｓ／ＣＯ値は報告されている：　Ｓ／ＣＯ≧１，００は反応性とみな される：本これらの試料は反応性とみなされた。

実施例１及び２に記載の手順で、哺乳動物抗ヒトＩｇＧを含まない希釈物と、哺 乳動物抗ヒトＩｇＧを含む同じ組成の希釈物とを用いて、パネルをＨＣＶ　Ｉｇ Ｍ抗体について検査した。データは表３に示す。表３のデータから明らかなよう に、抗ヒトＩｇＧを希釈物に加えてもアッセイの反応性は低下しなかった。抗ヒ トＩｇＧでの沈殿によって試料中の抗ＨＣＶ　ＩｇＧが除去されることに起因し て、後期の反応性採血の場合は反応性が少し増加した可能性がある。高力価抗Ｈ ＣＶ　ＩｇＧ抗体が固相抗原への結合に関して抗ＨＣＶ　ＩｇＭと競合したため 、ＩｇＭ結合の量が減少し、その結果反応シグナルが低下した。抗ヒトＩｇＧで の沈殿によって試料からＩｇＧが除去されると、観察された競合が消失したため 、総ての可能なＩｇＭが固相抗原に結合し、最大限の反応シグナルが得られた。

表３ ＨＣＶＩｇＭアッセイ試料希釈物の比較パネル　抗ヒトＩｇＧ無含有☆　抗ヒト ＩｇＧ含有☆１　０．２７　０．００　０．４３　０．２０　０．４７　１．０ ０２　０．３０　０．０７　０．００　０Ｊ３　０．１０　０．１０３　０．２ ３　０．０３　０．１０　０．０？　０．００　０．００４　０．２７　０．０ ３　６３．７７零　０．０？　０．１０　６９．９３本５　１．００　０．００ 　ｇ９．９０本　０．４０　０．２７　１００．８３本６　０．７０　０．００ 　５１．８０本　０．５０　２．１３　９４．３０本７　０．００　０．００　 ０．００　０．００　０．００　０．００８　０．００　０．００　９．２３零 　０．００　０．００　６．４３本９　０．０７　０．２０　９４．０３零　〇 、００　０．００　９１．８３本１０　０．０７　０．００　２１．２３本　０ ．００　０．００　１３．８７本１１　０．０７　０．１３　２．８３本　０． ００　０．１３　５．５３本１２　０．０７　０．００　０．００　０．００　 ０．００　０．００１３　０．０７　０．０３　０．００　０．００　０．００ 　０．００１４　０．０７　０．０３　０．０７　０．００　０．００　０．０ ０１５　’　０．１３　０．０３　０．００　０．００’　０．００　０．００ １６　０．１０　０．０３　０．０？　０．００　０．００　０．００１？　０ ．１０　０．０７　０．０３　０．０３　０．００　０．１０１８　１．３０本 　０．６３本　５．０７＊　０６４７　０．３７　４．３０本１９　０．２３　 ０．２０　０．６３　０．００　０．０７　１．３０本☆Ｓ／ＣＯ≧１．００は 反応性であるとみなされる；零は反応性試料を示す。

２、Ｎ　Ｉ　Ｈ輸血後連続採血 ＨｌＡｌｔｅｒら（前出の文献）によって記録された１９の輸血後非Ａ型非Ｂ型 肝炎患者の研究には、ＨＣＶｃ−１００抗原に対する抗体応答の時間的経過が詳 述されている。ＡｂｂｏｔｔとＮＩＨとの協力の一環として、これらの患者から の連続採血を、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ　ｌ　ｇＧアッ セイ及び本発明のＩｇＭアッセイを用いて調べた。これらの連続採血試料は病気 の急性期をカバーし、それによって急性期マーカーを同定するための貴重なリソ ースを提供してくれた。患者によっては、１０年以上の長期にわたって追跡が行 われた。

この研究では１９人の患者の総てが慢性ＮＡＮＢＨを発症した。検査した１９人 の患者のうち、１７人（８９，５％）が種々のタイプのＨＣＶ　１ｇＭ応答を示 し、２人（１０，５％）の患者が検出可能なレベルのＨＣＶ　ＩｇＭ抗体を示さ なかった。１ｇＭ反応性を示した１７人の患者のうち９人（５２，９％）が２８ 〜１３５日にわたり急性期一時的ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ　１ｇＭ応答を示した。該応 答は、活性ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ　ＩｇＧ抗体産生より前又は同時に生起した。１９ 人の患者のうち４人は、それより後でＣ０ＲＥ　１ｇＭ反応性を示した。

１７人の患者のうち２人（１１，７％）は急性３３ｃＩｇＭを有し、１人だけが 急性期Ｃ１００ＩｇＭ抗体を示した。４人の患者は３３ｃ　ＩｇＧ抗体の検出後 に３３ｃ　ＩｇＭ抗体を示した。

実施例５ リューマチ性因子様物質がＩｇＭの測定に及ぼす影響リューマチ性因子様物質が 存在する場合に、それが検査試料のＨＣＶ　ＩｇＭについて得られる結果に及ぼ す影響を調べるために、検査を行った。該検査は次のように実施した。検査試料 に、１０μｌの試料量に対して種々の濃度でリューマチ性因子を加えた（ｓｐｉ ｋｅｄ）。試料Ｎｏ。

１７０は、抗Ｃ０ＲＥ、３３Ｃ及びｃ−１００に対して強く反応したが、ＨＣＶ 　ＩｇＭに対しては抗ヒトＩｇＧでの前処理に関係なく陰性であった。表４及び 第２図は、ＨＣｖ抗原ｃ−１００、ｒＢｃＤＪ　、３３ｃ及びＣＯＲＥ　１．： ついて検査した時の試料Ｎｏ、１７０について得られたデータを示している。次 いで、前記ＨＣＶ抗原に対するＨＣＶＩｇＭ抗体が存在している場合にその量を 決定すべ（、実施例１及び２の方法でアッセイを実施した。

表４ ＩｇＭ　ＨＣＶアッセイ☆に対するリューマチ性因子様物質の作用Ｖｏ１．ＲＦ 　Ｃ１００ＢＣＤ　３３ｃ　Ａｖｇ、　Ｃ０ＲＥ　ＡＶＧ。

ＩＵ／ｍ１ １０　０　０．０００Δ　ｏ、　ｏｏｏΔ　ｏ、　ｏｏｏΔ　ｏ、　ｏｏｏΔ　 ｏ、　ｏｏｏΔ　ｏ、　ｏｏｏΔ１０　０　０．０００　０．００１　０．００ ０　０．０００１０　３３３　０．００１　０．０００　１１．０３０　１０． ４２２　５．６６０　５．０５０１０　３３３　０．００１　０．０００　９． ４０５　４．４４８１０　５７１　０．００３　０．０００　１０．１０５　９ ．４０５　３．２３５　３．６０４１０　５７１　０．００４　０．０００　８ ．７０５　３．９７３１０　６６６　０．００８　０．０００　１０．１６４　 ９．８６８　３．６９３　３．４２６１０　６６６　０．００９　０．０００　 ９．５７２　３．１５６１０　７５０　０．００４　０．０００　８．４５１　 ９．１９８　１．５８２　２．１６０１０　７５０　０．００４　０．０００　 ９．８５５　２．７３９１０　８８８　０．０２１　０．０１３　ｇ、３９６　 ｇ、７２５　０．３６２　０．３４８１０　８８８　０．０１０　０．０００　 ９．０５４　０．３３４１０　−　０．０２２　０．０００　０．０００　０． ０００　０．０００１０’　−０，００４０，００００，００００，０００☆該 アツセイは抗ＩｇＧを添加せずに行った。

前記表及び第２図のデータは、ＩｇＭに関しては陰性だがＩｇＧに関しては陽性 の試料において、リューマチ性因子が偽陽性ＨＣＶ　１ｇＭ反応性を生起させた ことを示している。反応性の程度は、存在するＲＦの量に依存していた。３３ｃ 及びＣ０ＲＥに対する相対的偽陽性反応は、互いに相関しておらず比例もしてい なかった。

本発明のＨＣＶ　ＩｇＭアッセイにおけるＲＦ誘誘導度反応性中和と、該アッセ イで使用するのに適した抗ヒトＩｇＧ活性力価とを次のように評価した。前述の ように、ＨＣＶ　ＩｇＧに対して強い反応を示しＨＣＶ　ＩｇＭに対しては非反 応性の試料（１０μｍ）を高力価ＲＦ試料（２，５又は１０μｍ）と組み合わせ ることにより偽反応性試料を形成した。試料希釈物に種々の量の抗ヒトＩｇＧ抗 血清（希釈物１ｍｌ当たり０〜１００μｍ）を加えた。陰性対照及び陽性対照と 一緒の偽反応性試料のＨＣＶ　ＩｇＭに関するアッセイを実施例１及び２に記載 の方法で実施した。

結果は表５に示す。抗ヒトＩｇＧは、形成した偽陽性試料の偽反応性を中和する ことが判明した。試料希釈物中の抗ヒトＩｇＧ抗血清の力価が増加するにつれて 、中和率も増加した。希釈物１ｍｌ当たり約４０μｍの抗血清で中和は完了し、 抗血清の量をそれ以上増やしても中和力は増加しなかった。従って、４０μＩ　 ／　ｍ　１の抗血清を、希釈した時の試料を中和するための適当な力価として選 択した。

表５ ＲＦ誘導偽Ｉ　Ｍ反応性試料に対する抗ヒトＩｇＧの効果試料量　試料量　Ｉｇ Ｇ量　ΔＤＲ中和率　ΔＤＲ中和率１０μｍ２ｊｌＯμｍ　９．８４４　６．４ １１０　２　２０　１．３８８　８５．９％　０．３１０　９５．３％１０　２ 　４０　０．８７７　９１．０％　０．００５　９９．９％１０　２　６０　０ ．０４０　９９．５％　０．００１　９９．９％１０　５　０　９．２５９　７ ．９０５ｔｏ　５　２０　３．０５０　６７．０％　０．８１９　８９．６％１ ０　５　４０　３．６５６　６０．５％　０．２７３　９６．５％１０　５　６ ０　０．０９４　９８．９％　０．０１９　９９．７％１０　１０　０　７．５ ４６　６．３１３１０　１０　２０　３．０７７　５９．２％　０．９８１　８ ４．５％１０　１０　４０　１．２３０　８３．７％　０．１４９　９７．６％ １０　１０　６０　０．４１１　９４．６％　ｏ、ｏｏｏ　ｉｏｏ、ｏ％１０　 １０　７０　０．０６９　９９．１％　０．０００　１００．０％１０　１０　 １００　０．０４２　９９．４％　ｏ、ｏｏｏ　ｉｏｏ、ｏ％検査試料中に抗ヒ トＩｇＧが存在する場合に、その存在が当該検査システムでのＨＣＶ　ＩｇＭの 決定に及ぼす効果を調べるために検査を実施した。そのために、検査試料をＳａ ｃｒａｍｅｎｔｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＦｏｕｎｄａＬｉｏｎから入手した（「サ クラメント試料」）。検査試料について得られた結果が、ＩｇＭと交差反応する 検査試料中のＩｇＧの存在に起因するのか、又はＩｇＭの実際の存在に起因する のかを調べるために、ヤギ抗ヒトＩｇＧの存在又は不在をアッセイした。各試料 を、実施例１及び２の方法に従い本発明のアッセイによりサイドバイサイド（ｓ ｉｄｅ−ｂｙ−ｓｔｄｅ）比較テストで　ＩｇＭについて検査した。この検査で は各試料を２つのアリコートに分割した。１つのアリコートはヤギ抗ヒトＩｇＧ で処理しく「処理アリコート」）、もう１つのアリコートはヤギ抗ヒトＩｇＧで 処理しなかつた（「非処理゛７′リコート」）。

これらの検査試料アリコートを実施例１及び２の方法で操作し検査した。データ を下記の表６に示す。

表６ ヤギ抗ヒトＩｇＧ無含有Δ　ヤギ抗ヒトＩｇＧ含有Δ試料　ＮＥＧ、Ｃ，ｃ−１ ００Ｃ０ＲＥ　３３ｃ　ＮＥＧ、Ｃ，ｃ−１００Ｃ０ＲＥ　３３ｃ１０１０☆　 ０．０２３　０．１４８本　１．３４０本　０．０２３　０．０１９　０．１９ ０本　１．０３７＊　０．０３０３９　０．０１９　０．００３　１．９４３本 　〇、０００　０．０１２　０．０００　０．０００　０．０００４３　０．０ ４３　０．０１８　３．２８３本　〇、０４６　０．０３０　０．０１３　１． １３３本　０．１０７４５　０．０６７　０．０１２　１．８４４本　〇、０７ ２　０．０５５　０．００９　０．０２９　０．０００４７　０．０３４　０． ０４３　０．０７７零　〇、００３　０．０７０　０．１１１本　０．２０５本 　０．０５８５６　０．００？　０．０００　０．０５２本　０．０００　０． ００５　０．０００　０．０００　０．０００５７　０．０４９　０．００９　 ０．０２２　０．０００　０．０３４　０．０１？　０．００２　０．００９５ ８　０．００７　０．０００　０．０７０本　〇、０００　０．００６　０．０ ００　０．０００　０．０００７６　０．０３６　０．０１７　０．９１３本　 ０．００４　０．０２４　０．００８　０．５２９零　〇、００２７８　０．０ ０８　０．００６　０．１３３本　０．００９　０．００５　０．０００　０． ０００　０．０００８５　０．００７　０．００３　１．０３０本　〇、００４ 　０．００５　０．０００　０．００８６零　ｏ、ｏｏ。

８９　０．００９　０．００２　２．６０１零　〇、０００　０．００８　０． ００１　０．２５１ネ　ｏ、ｏｏ。

９１　０．００６　０．０００　０．３４３本　〇、５０４　０．００３　０、 ｏｏｏ　ｏ、ｏｏｏ　ｏ、ｏｏ。

９７　０．００６　０．０００　６．０９５零　〇、００２　０．００５　０． ００６　０．０００　０．０００１０５　０．１１６　０．０８２　０．３８９ 本　０．０６６　０．１０９　０．０３０　０．０１７　０．０１４１１６　０ ．０１５　０．０１ｇ　９．３９８本　３．５８０　０．００９　０．００２　 ０．００２　０．００３１５３　０．０１７　０．００３　４．６８３本　０． ００５　０．００８　０．００１　０．０１５　０．００２１５９　０．００４ 　０．０００　？、３６２零　ｏ、ｏｏｏ　ｏ、００４　０．０００　０．００ ０　０．０００１６３　０．０２１　０．００５　１．２２４本　０．０３１　 ０．０１１　０．００２　０．００３　０．０００１７１　０．０２７　０．０ １２　５．５３８本　０．１２８本　〇、０１３　０．００３　０．００３　０ ．００１１７２　０．００５　０．０００　３．４０３本　〇、０２２　０．０ ０３　０．０００　０．００１　０．０００Ｊ、７４　０．０１６　０．００５ 　０．０１９　０．００５　０．０１０　０．００３　０．００５　０．００１ １７９　０．００８　０．００１　０．１３４本　〇、００５　０．００５　０ ．０００　０．０００　０．０００１８０　０．０１８　０．００５　２．８８ １本　〇、０００　０．０１３　０．００２　２．４９９本　ｏ、ｏｏ。

１ｇ１　０．０１１　０．０００　３．４４９本　２．３４３　０．００？　０ ．０００　０．０００　０．０００１８６　０．１１３　０．０２３　０．１９ ８本　０．０２１　０．０５８　０．０２５　０．０００　０．０００１８７　 ０．００６　０．０００　２．２８６本　〇、０００　０．００４　０．０００ 　０．００１　０．０００１９０　０．１０２　０．０３５　８．１１７本　０ ．００１　０．０７Ｉ　Ｏ，０２００，００８０，０００１９６０，０１５０， ００４１，０９３本　０．２９９本　〇、００７　０．００１　０．０００　０ ．０００２０３　０．０２０　０．００８　０．００８　０．００４　０．０１ ２　０．００２　０．００３　０．０Ｏ０２０８０，０１１０，０８６５，５５ ２本　１．５３５ネ　０．００６　０．００２　０．００５　０．００２２０９ 　０．０１６　０．００４　０．１３３本　〇、００２　０．００９　０．００ ２　０．００４　０．０００２１０　０．００９　０．００３　０．１１４本　 〇、００４　０．００５　０．０００　０．００１　０．０００１６５　０．０ ０７　０．００４　０．３５３零　〇、００２　０．００５　０．００１　０． １６２ネ　ｏ、ｏｏ。

Δ総での値はＤＲ読取値である。

☆　試料１０１０は陽性対照として使用した。

本は「陽性」（反応性）反応を示す。

表６のデータは、試料希釈物に抗ヒトＩｇＧを加えない検査で「陽性」反応性で あった試料が、試料希釈物に抗ヒトＩｇＧを加えた検査で必ずしも陽性ではなか ったことを示している。即ち、抗ヒトＩｇＧを吸収させた後でも陽性を示した試 料は７つのみであった。該データは、検査処理をリューマチ性因子様物質の妨害 を除去するための処理にかけないと、ＨＣＶ　ＩｇＭに関して偽陽性反応が生起 し得ることを示している。

実施例６ 確認検査 本発明のアッセイ方式における抗１ｇＭ標識に対する試料の反応性自体は、試料 中のＩｇＭクラス抗ＨＣＶ抗体がアッセイ応答を生起させるということを確立す るものではなかった。ＨＣＶ特異的１ｇＭ反応性の存在を確認するために、幾つ かの検査を行った。即ち、分子量サイジングカラムでの試料の分別、ＲＦ様妨害 を中和するための抗１ｇＧ（ヒト）での試料の処理、及び１ｇＭ反応性を破壊す るがＩｇＧ反応性１某破壊しないジチオトレイトール（ＤＴＴ）での試料の処理 を行った。

１、セファクリルＳ−３００カラムでのサイジングプロフィルＳ−３００クロマ トグラフイーカラムでサイズ排除分別（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｆｒａ ｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）にかけるための試料を幾つか選択した。これらの試料を 分別する目的は、抗ＩｇＭ又は抗１ｇＧを用いてＨＣ■結果プロフィルを形成す ることにあった。ＩｇＭ及びＩｇＧは、分子サイズにより種々のフラクションに 分解するはずであると確認された。従って、抗ＩｇＭ及び抗ＩｇＧ反応性は種々 のフラクションについて生起するはずである。本発明の方法で反応性を示す７つ の抗ＨＣＶ　１ｇＭ試料をＳ−３００カラム（セファクリルＳ−３００カラム、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＹから市販）でサイジングした。

このグループは、サクラメント検査グループからの６つの試料［６／８が抗ヒト ＩｇＧ抗体（Ａｂ）ブロッカ−での処理後に反応性を示しく潜在的真性陽性）、 ２／８がＡｂブロッカ−で中和された（偽陽性）］と、１つの高ＡＬＴ試料（試 料１０１０）とを含んでいた。

１つの試料１０１０からのデータを下記の表７及び８、並びに第３図及び第４図 に示す。

表　７ 試料　Ｎｅｇ、　Ｃ，Ｃ０ＲＥ　３３ｃ　ｃ−１００１０１００，０４５１，８ ０３０，０５９０，３７？７ラクシｊノＮｏ。

１４　０．００３　０．００３　０．００３　０．００３１？　０．０１０　０ ．５３９　０．０１６　０．００３１９　０．０４２　２．７２３　０．１２６ 　０．６００２１　０．０２１　１．１４２　０．０４２　０．１７５２３　０ ．００３　０．２９３　０．０１１　０．０２３２５　０．００４　０．０２０ 　０．００５　０．００６２７　０．００３　０．００６　０．００３　０．０ ０４３１　０．００３　０．００３　０．００３　０．００３３９　０．００５ 　０．００４　０．００４　０．００３Δ　これらの値はＤＲ読取り値を表す。

０，０６より大きい値は陽性とみなされる。

表　８ 試料　Ｎｅｇ、Ｃ，Ｃ０ＲＥ　３３ｃ　ｃ−１００１０１００，０２８６，５１ １８，４９３０，０９６７ラクシ１７Ｎｏ。

１４　０．００４　０．０１０　０．００４　０．００４１７　０．００４　０ ．０１２　０．００４　０．００４１９　０．００５　０．０２６　０．００７ 　０．００５２１　０．００６　０．３１ｇ　０．０４３　０．００７２３　０ ．０１０　２．５３９　３．２３０　θ、０２２２５　０．０２０　６．３ｇ３ 　８．５７２　０．０７８２７　０．０１８　６．００４　７．２７７　０．０ ６８３１　０．００６　０．７９１　０．２５８　０．００８３９　０．００４ 　０．００９　０．００？　０．００６Δ　これらの値はＤＲ読取り値を表す。

０．０６より大きい値は陽性とみなされる。

該試料のフラクションの大部分における抗体活性を、■ｇＧプローブ及びＩｇＭ プローブで測定した。前記表に示すように、フラクション１７〜２１は強い１ｇ Ｍ活性を示し、フラクション２３〜２７は強いＩｇＧ活性を示した。

１ｇＭ活性を示すフラクションは、ＩｇＭ抗体の分子員に対応するボイド容積（ ｖｏ　ｉ　ｄ　ｖｏ　１　ｕｍｅ）に溶離された。これらのフラクションは、極 めて少ない又は無視し得る程度の量のＩｇＧ抗体を有していた。ＩｇＧ活性を示 すフラクションは遅れて（前記空隙の後に）溶離され、１ｇＭ活性を有していな かった。

０．７ｘ５ＱｃｍカラムにＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｓ−３００ゲルを詰めた。１ｍ ｌの試料を濾過しくＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡから市販されて いる０、２μｍフィルター）、前記カラムに充填した。０．０５Ｍトリス、ｐＨ ７，５での溶離を６〜１０ｍ１／時の速度で行った。０．５ｍｌフラクションを 回収した。フラクションを、２８０ｎｍ及び３４０もしくは４００ｎｍでの吸光 率について測定した。

本発明のＨＣＶ　ＩｇＭアッセイを、１０μｌの非希釈試料か、又は１ｍｌの試 料希釈物に希釈した２５μｌのカラム分別試料を用いて、実施例１及び２に記載 の手順で実施した。抗１ｇＭ及び抗ＩｇＧ特異的プローブは、ヤギ抗ヒト（Ｆａ ｂ’　）１：ビオチン結合体（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓ ｔ、Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）であり、２００　ｎ　ｇ／ｍ　１で使用した。酵素試薬 は抗ビオチン：大腸菌アルカリホスファターゼ結合体であった。酵素基質はＢＣ ＩＰであった。データを表９に示す。

表９ ＩＤ　フラクションＮｏ、Ｉｇ輩ア・ソセイ（ΔＤＲ）　ＩｇＧアッセイ（ΔＤ Ｒ）ｃｌｏｏ　３３ｃ　Ｃ０ＲＥ　ｃｌｏｏ　３３ｃ　Ｃ０ＲＥ４３　１４　０ ．００　０．００　０．０２　０．００　０．００　０．０２１５　０．００　 ０．００　０．３５　０．００　０．０５　０．７４２５　０．００　０，００ 　０．００　５．０７　１０．１１８．４２８９　１７　０．００　０．００　 ０．４１　０．０１　０．００　０．０８２８　０．００　０．０　０．００　 ５．０３　５．８４　７．７２１６５　１４　０．００　０．００　０．６３　 ０．００　０．００　０．０１２４　０．００　０．００　０．００　１．０７ 　１．３４　６．８５７６　１８　０．０１　０．００　０．９６　０．００　 ０．００　０．０４２９　０．００　０．００　０．００　０．０２　５．５７ 　９．０６１８０　１５　０．０１　０．００　３．８２　０．０１　０．０１ 　０．１０２５　０．００　０．００　０．００　１．４３　７．１５　６．８ ６１０１０　１９　０．４６　０．１２　２．６７　０．００　０．０１　０． ０２２５　０．０１　０．０１　０．０２　０．０４　８．４２　６．３８１５ ９　１６　０．００　０．００　０．００　０．０１　０．００　１．２２２６ 　０．００　０．００　０．００　４．５８　６．４５　９．１２１９０　２６ 　０．００　０．００　０．００　４．５８　６．４５　９．１２２７　０．０ ０　０．００　０．００　０．０１　０．０７　１２．５９８つの試料のうち２ つは偽反応性試料であった。サイジングにかけると、ピーク１ｇＭフラクション はＨＣＶ　Ｃ０ＲＥに対する１ｇＭ反応性を示さなかったが、Ｃ０ＲＥに対して は実質的なＩｇＧ活性を示した。この挙動は、偽陽性試料に典型的なものである と思われる。また、データは、これらの試料における偽反応性がリューマチ性因 子型の挙動に起因するものであるという前提と合致するものであった。リューマ チ性型妨害に起因する抗体凝集は、サイジングプロフィル全体に分散されるであ ろうＩｇＧ含有分子凝集体の分配を生起させることができると考えられた。

リューマチ性因子タイプの試料は、ＩｇＭが通常見い出されるボイド容積では抗 １ｇＭ反応性を示さなかった。しかしながらＩｇＧ活性は、それが存在するはず であるＩｇＧピークフラクション領域で強いだけでなく、ボイド容積からＩｇＧ ビーク領域を通ってカラム全体にわたり強かった。

実施例６ １ｇＭアッセイに対する還元剤の効果 Ａｂｂｏｔｔ抗ＨＣｖアッセイ（前述（７）ＨＣＶ　ＩｇＧアッセイ、ＡＢＢＯ ＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標））及び本発明の１ｇＭアッセイで抗ＨＣＶに対 して強く反応した５つの試料を、還元剤での処理後に、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲ ＩＸ（登録商標）アッセイで、ＨＣＶ抗原に対するＩｇＧ及びＩｇＭ特異的反応 性について検査した。１ｇＭアッセイは実施例１及び２に記載の方法に従って、 但し下記のように実施した。特定的には、試料希釈物の添加の前に、試料をジチ オトレイトール（ＤＴＴ）と共に酢酸ナトリウム緩衝液中で、最終ＤＴＴ濃度１ ８ｍＭで、１５分間インキュベートした。該１ｇＭアッセイでは、５つの試料の 総てが抗ＨＣＶ　Ｃ０ＲＥについて還元敏感反応性（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　５ｅ ｎｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示シタ。ＩｇＧ抗ＨＣｖアッセイで は、ＨＣＶＣＯＲＥ、ＨＣＶ　３３ｃ及びＨＣＶ　ｃ　−１００ニ対する反応性 は試料への還元剤の添加によって左右されなかった。また、患者１０１０に由来 する分別１ｇＭ反応性又は極めて低い阻害はＤＴＴでの前処理によって破壊され た。

しかしながら該検査試料のＩｇＧフラクションは、ＤＴＴの存在下又は不在下で 処理した時には、ＡＢＢＯＴＴ　ＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アッセイで同様の反 応性又は極めて低い阻害を示した。これらのデータは表１０及び１１に示す。

表１０ 試料ＩＤ　ＤＴＴ＊　ｃ−１００阻害率％　３３ｃ　阻害率％　Ｃ０ＲＥ　阻害 率％非分別　−０，３２５０，１００３，１２３ＩｇＭプローブ　＋　０．００ ４　９８．８　０．００２　９８．０　０．０１５　９９．５ＴｇＭフラクショ ン　−０，３８００，１２７４，２１２＃１９．　ＩｇＭプローブ　＋　０．０ １７　９５．５４　０．０１９　８５．０　０．５１５　８７．７ＩｇＧフラク ション　−０，０３７１６，８１５，１＃２５．　ＩｇＧプローブ　＋　０．０ ５３　１４．５　１３．６　１２．２１　１９．２＊０．０６を超えるＤＲ読取 り値は該アッセイに関して反応性であるとみなされる。

☆「−」は試料にＤＴＴを加えなかったことを表し、「＋」は試料にＤＴＴを加 えたことを表す。

表１１ 試料ＩＤ　ＤＴＴ☆　Ｃ−１００阻害率％　３３ｃ　阻害率％　Ｃ０ＲＥ　阻害 率％１０１０　−　０．３２５　０．１００　３．１２３＋　０．００４　９８ ．８　０．００２９８．ＯＯ，０１５９９，５８１３０−２，４５０７，８００ １４，４７＋　０．０４４　９７．４　０．０９０９９．９　０．２８２　９８ ．０６２６２　−　０．０００　０．１８９　２２．０５０＋　０．００３　０ ．０１４９２．５　０．３１１　９８．５９７１３　−　０．０２２　０．１１ １　１０．２２１＋　０．０１３　０．０１６８６．ＯＯ，２４７９７，５２８ ８−０，００８０，０３３４，８４５＋　０．００２　０．０１４　０．０５　 ９９．０＊０．０６を超えるＤＲ読取り値はアッセイに関して反応性であるとみ なされる。

☆「−」は試料にＤＴＴを加えなかったことを表し、「＋」は試料にＤＴＴを加 えたことを表す。

このように、本明細書に記載の本発明のアッセイ方法は、検査試料中に存在し得 るＨＣＶに対するＩｇＭの存在についてのアッセイに使用し得る。本明細書に記 載の実施態様は実施例であって本発明を限定するものではない。従って本発明の 説明は、本発明を特定の開示実施態様に限定するのではな（、総ての等価事項及 び主題を、前述の、そして「請求の範囲」に記載の本発明の思想及び範囲内に包 含させる意図を有する。

ＲＦ　ＩＵ／ＭＬ ＦＩＧ、　２ フラクシタン番号 ＦＩＧ、　３ １４　１８　２２　２６　３０　３４　３Ｂフラクション番号 ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｎ 　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｌ　９０１５−２Ｊ （７２）発明者　ミムズ、ラリ−・ティーアメリカ合衆国、イリノイ・６００４ ６、レイク・ビラ、ショショニ・トレイル・８ Ｉ （７２）発明者　チョー、カート・エイチアメリカ合衆国、イリノイ・６００４ ８、リバティービル、タマラツク・レーン・１１５５（７２）発明者　バ、レイ リ、ディピッド・ニスアメリカ合衆国、イリノイ・６００３０、ブレイスレイク 、アシユリ−・ドライブ・

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭの存在 及び／又は量を決定するためのアッセイであって、 ａ．検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合に、 その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、少なくともＨＣＶＣＯＲ Ｅ抗原を含むＨＣＶ抗原に検査試料を接触させ、得られた混合物を抗原／抗体複 合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、 ｂ．前記複合体を、哺乳動物抗ヒトＩｇＭに結合したエンハンサー化合物からな るプローブと接触させて第二の混合物反応生成物を形成し、 ｃ．前記第二の混合物反応生成物を、エンハンサー化合物結合メンバーに結合し たシグナル発生化合物からなる指示試薬と接触させ、得られた混合物を、指示試 薬反応生成物の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、ｄ．検査試料 中のＨＣＶＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとして発生するシグナルを検出 するステップを含む前記アッセイ。
2. ２．前記ＨＣＶ抗原が更に、ＨＣＶ３３ｃ抗原、ＨＣＶｃ−１００抗原又はこれ らを任意に組み合わせたものを含む請求項１に記載のアッセイ。
3. ３．ステップ（ａ）の前記ＨＣＶ抗原が固相に結合されている請求項１に記載の アッセイ。
4. ４．前記固相が、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微小粒子、反応トレーのウ ェル、試験管、ニトロセルロースストリップ及び磁気ビーズから選択される請求 項３に記載のアッセイ。
5. ５．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び化 学発光化合物から選択される請求項１に記載のアッセイ。
6. ６．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びβ −ガラクトシダーゼから選択される請求項５に記載のアッセイ。
7. ７．検査試料をリューマチ性因子の作用を阻止するのに十分な条件にかける操作 が、検査試料を適量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成し、該混合物を、 リューマチ性様物質を実質的に含まない反応混合物生成物の形成に十分な時間及 び条件下でインキュベートすることからなる請求項１に記載のアッセイ。
8. ８．検査試料中に存在するＨＣＶＩｇＭの量が、発生したシグナルに比例する請 求項１に記載の方法。
9. ９．検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭの存在 及び／又は量を決定するためのアッセイであって、 ａ．検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合に、 その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、少なくともＨＣＶＣＯＲ Ｅ抗原を含むＨＣＶ抗原に検査試料を接触させ、得られた混合物を抗原／抗体複 合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、 ｂ．前記複合体を、抗ヒトＩｇＭに結合したシグナル発生化合物からなる指示試 薬と接触させ、得られた混合物を反応の生起に十分な時間及び条件下でインキュ ベートし、ｃ．検査試料中のＨＣＶＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとして 発生するシグナルを検出するステップを含み、検査試料中に存在するＨＣＶＩｇ Ｍの量が発生したシグナルに比例する前記アッセイ。
10. １０．前記ＨＣＶ抗原が更に、ＨＣＶ３３ｃ抗原、ＨＣＶｃ−１００抗原又はこ れらを任意に組み合わせたものを含む請求項９に記載のアッセイ。
11. １１．ステップ（ａ）の前記ＨＣＶ抗原が固相に結合されている請求項９に記載 のアッセイ。
12. １２．前記固相が、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微小粒子、反応トレーの ウェル、試験管、ニトロセルロース及び磁気ビーズから選択される請求項１１に 記載のアッセイ。
13. １３．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び 化学発光化合物から選択される請求項９に記載のアッセイ。
14. １４．前記酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び β−ガラクトシダーゼから選択される請求項１３に記載のアッセイ。
15. １５．検査試料をリューマチ性因子の作用を阻止するのに十分な条件にかける操 作が、検査試料を適量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成し、該混合物を 、リューマチ性様物質を実質的に含まない反応混合物生成物の形成に十分な時間 及び条件下でインキュベートすることからなる請求項９に記載のアッセイ。
16. １６．検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭの存 在及び／又は量を決定するためのアッセイであって、 ａ．検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合に、 その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、該検査試料を抗ヒトＩｇ Ｍと接触させ、得られた混合物を、結果として生成される複合体の形成に十分な 時間及び条件下でインキュベートし、ｂ．前記複合体を、少なくともＨＣＶＣＯ ＲＥ抗原を含むＨＣＶ抗原に結合したシグナル発生化合物からなる指示試薬と接 触させ、得られた混合物を反応の生起に十分な時間及び条件下でインキュベート し、 ｃ．検査試料中のＨＣＶＩｇＭの存在及び／又は量を示すものとして発生するシ グナルを検出するステップを含み、検査試料中に存在するＨＣＶＩｇＭの量が発 生したシグナルに比例する前記アッセイ。
17. １７．前記ＨＣＶ抗原が更に、ＨＣＶ３３ｃ抗原、ＨＣＶｃ−１００抗原又はこ れらを任意に組み合わせたものを含む請求項１６に記載のアッセイ。
18. １８．ステップ（ａ）の前記抗ヒトＩｇＭが固相に結合されている請求項１６に 記載のアッセイ。
19. １９．前記固相が、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微小粒子、反応トレーの ウェル、試験管、ニトロセルロース及び磁気ビーズから選択される請求項１８に 記載のアッセイ。
20. ２０．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び 化学発光化合物から選択される請求項１６に記載のアッセイ。
21. ２１．検査試料をリューマチ性因子の作用を阻止するのに十分な条件にかける操 作が、検査試料を適量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成し、該混合物を 、リューマチ性様物質を実質的に含まない反応混合物生成物の形成に十分な時間 及び条件下でインキュベートすることからなる請求項１６に記載のアッセイ。
22. ２２．検査試料中に存在し得るＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＩｇＭの存 在及び／又は量を決定するためのアッセイであって、 ａ．検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合に、 その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、該検査試料を抗ヒトＩｇ Ｍと接触させ、得られた混合物を、結果として生成される複合体の形成に十分な 時間及び条件下でインキュベートし、ｂ．前記複合体を、少なくとも抗ＨＣＶＣ ＯＲＥ抗原を含むＨＣＶ抗原と接触させ、得られた混合物を反応生成物の形成に 十分な時間及び条件下でインキュベートし、ｃ．前記反応生成物を、シグナル発 生化合物に結合した抗ＨＣＶＣＯＲＥ抗原からなる指示試薬と接触させ、反応の 生起に十分な時間及び条件下でインキュベートし、ｃ．検査試料中のＨＣＶＩｇ Ｍの存在及び／又は量を示すものとして発生するシグナルを検出するステップを 含み、検査試料中に存在するＨＣＶＩｇＭの量が発生したシグナルに比例する前 記アッセイ。
23. ２３．前記ＨＣＶ抗原が更に、ＨＣＶ３３ｃ抗原、ＨＣＶｃ−１００抗原又はこ れらを任意に組み合わせたものを含む請求項２２に記載のアッセイ。
24. ２４．指示試薬が更に、ＨＣＶ３３ｃ抗原、ＨＣＶｃ−１００抗原又はこれらを 任意に組み合わせたものを含む請求項２３に記載のアッセイ。
25. ２５．ステップ（ａ）の前記抗ヒトＩｇＭが固相に結合されている請求項２２に 記載のアッセイ。
26. ２６．前記固相が、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微小粒子、反応トレーの ウェル、試験管、ニトロセルロース及び磁気ビーズから選択される請求項２２に 記載のアッセイ。
27. ２７．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び 化学発光化合物から選択される請求項２２に記載のアッセイ。
28. ２８．検査試料をリューマチ性因子の作用を阻止するのに十分な条件にかける操 作が、検査試料を適量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成し、該混合物を 、リューマチ性様物質を実質的に含まない反応混合物生成物の形成に十分な時間 及び条件下でインキュベートすることからなる請求項２２に記載のアッセイ。
29. ２９．検査試料中に存在し得る対肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）ＩｇＭの存在及び ／又は量を決定するためのアッセイであって、 ａ．検査試料中に存在し得るリューマチ性因子様物質の作用が存在した場合に、 その作用を阻止するのに十分な条件に検査試料をかけ、該検査試料を哺乳動物抗 ヒトＩｇＭと接触させ、得られた混合物を抗原／抗体複合体の形成に十分な時間 及び条件下でインキュベートし、ｂ．前記複合体を、少なくともＨＣＶＣＯＲＥ 抗原を含むＨＣＶ抗原に結合したエンハンサー化合物からなるプローブと接触さ せて第二の混合物反応生成物を形成し、ｃ．前記第二の混合物反応生成物を、エ ンハンサー化合物結合メンバーに結合したシグナル発生化合物からなる指示試薬 と接触させ、得られた混合物を指示試薬反応生成物の形成に十分な時間及び条件 下でインキュベートし、ｄ．検査試料中のＨＣＶＩｇＭの存在及び／又は量を示 すものとして発生するシグナルを検出するステップを含む前記アッセイ。
30. ３０．前記ＨＣＶ抗原が更に、ＨＣＶ３３ｃ抗原、ＨＣＶｃ−１００抗原又はこ れらを任意に組み合わせたものを含む請求項２９に記載のアッセイ。
31. ３１．ステップ（ａ）の前記抗ヒトＩｇＭが固相に結合されている請求項２９に 記載のアッセイ。
32. ３２．前記固相が、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微小粒子、反応トレーの ウェル、試験管、ニトロセルロースストリップ及び磁気ビーズから選択される請 求項３１に記載のアッセイ。
33. ３３．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び 化学発光化合物から選択される請求項２９に記載のアッセイ。
34. ３４．検査試料をリューマチ性因子の作用を阻止するのに十分な条件にかける操 作が、検査試料を適量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成し、該混合物を 、リューマチ性様物質を実質的に含まない反応混合物生成物の形成に十分な時間 及び条件下でインキュベートすることからなる請求項２９に記載のアッセイ。
35. ３５．検査試料中に存在するＨＣＶＩｇＭの量が、発生したシグナルに比例する 請求項２９に記載のアッセイ。
36. ３６．検査試料中のＨＣＶＩｇＭの存在及び／又は量を決定するのに有用な検査 キットであって、ａ．ＨＣＶＣＯＲＥ、ＨＣＶ３３ｃ及びＨＣＶｃ−１００から 選択した１種類以上のＨＣＶ抗原を入れた容器と、 ｂ．適量の抗ヒトＩｇＭを入れた容器と、ｃ．適量の哺乳動物抗ヒトＩｇＭを入 れた容器とを含む前記キット。
37. ３７．前記ＨＣＶ抗原が、ポリマーもしくはガラスのビーズ、微小粒子、反応ト レーのウェル、試験管、ニトロセルロース及び磁気ビーズから選択した固相に結 合されている請求項３６に記載のキット。
38. ３８．前記哺乳動物抗ヒトＩｇＭがシグナル発生化合物に結合している請求項３ ６に記載のキット。
39. ３９．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素及び 化学発光化合物から選択したものである請求項３８に記載のキット。
40. ４０．前記哺乳動物抗ヒトＩｇＭがエンハンサー化合物に結合している請求項３ ６に記載のキット。
41. ４１．前記エンハンサー化合物が、ビオチン、抗ビオチン及びアビジンから選択 したものである請求項４０に記載のキット。
42. ４２．エンハンサー化合物結合メンバーに結合したシグナル発生化合物をさらに 含む請求項４１に記載のキット。
43. ４３．前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化合物、及び化学発光化合物から 選択したものである請求項４２に記載のキット。
44. ４４．前記エンハンサー化合物結合メンバーがビオチン、抗ビオチン及びアビジ ンから選択したものである請求項３６に記載のキット。