JP2003512598A - Ｃ型肝炎に続く肝不全の予測 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した個体における肝不全の危険性を決定するための方法が提供される。この方法は、この個体の体液におけるＨＣＶコアに対する抗体の力価を測定する工程、およびこの力価を、肝不全を発症する危険性に対して相関付ける工程を包含し、ここで、この力価は、その危険性に逆に関連する。その方法は、力価を測定するための標準的な技術を使用し、この技術としては、液相免疫アッセイおよび固相免疫アッセイが挙げられる。この方法を実施するための試薬および説明書を含むキットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、特定の個体における肝不全の可能性を決定するための方法
に関する。より具体的に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した個
体における肝不全の危険性を決定するための新規な方法に関する。さらに、本発
明は、この方法の容易な実行を可能にするキットに関する。

【０００２】 （背景技術） Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ属の一本鎖ＲＮＡウ
イルス）は、１９８９年に発見され、そしてその後、ほとんどの場合の非Ａ非Ｂ
輸血後肝炎を説明することが示されている。Ｃｈｏｏら（１９８９）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４：３５９−３６２；Ａｌｔｅｒら（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．
Ｍｅｄ．３２１（２２）：１４９４−１５００。急性疾患を患う患者の約８０％
は、慢性的な肝アミノトランスフェラーゼ上昇を伴うかまたは伴わない検出可能
なウイルス血症として現れる持続的なＨＣＶ感染を発症する。Ａｌｔｅｒら（１
９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ．２：１５５−１６６；Ａｌｔｅ
ｒ（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０（１１）：７８４−７８６。
２０年の期間にわたって慢性Ｃ型肝炎を患う患者は、肝硬変を発症する２０％ま
での危険性を有する。Ｔｏｎｇら（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３
２：１４６３−１４６６；Ｋｏｒｅｔｚら（１９９３）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．
Ｍｅｄ．１１９：１１０−１１５。一旦肝硬変が確立されると、肝細胞癌が、１
年当たり１〜４％の割合で発症する。Ｄｅｌ Ｏｌｍｏら（１９９８）Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２４：５６０−５６４。

【０００３】 米国において、ほとんどのＨＣＶ感染は、薬物使用のために共有される用具、
汚染された体液への保健医療従事者の暴露、または１９９０年代初期に実行され
たドナースクリーニングおよび他の安全な手順の前の血液または血液製剤の輸血
から生じる。Ａｌｔｅｒ（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０（１１
）：７８４−７８６。１９８０年代初期および中期の間に、薬物使用集団および
血液輸血集団はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の高い危険性にあっ
た。例えば、ボルチモアの非経口薬物使用者の中で、２５％は、両方のウイルス
に感染し、そして６４％は、ＨＣＶのみに感染した。Ｔｈｏｍａｓら（１９９５
）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）７４：２１２−２２０。さらに、米
国血友病集団の半分は、ＨＣＶおよびＨＩＶの両方に感染し、そしてさらなる２
６〜３８％は、ＨＣＶに感染したが、ＨＩＶには感染しなかった。Ｅｙｓｔｅｒ
ら（１９９３）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．６
：６０２−６１０。ＨＣＶの血清有病率（ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、
血漿由来第ＶＩＩＩ因子濃縮物または血漿由来第ＩＸ因子濃縮物の頻繁な注入を
必要とする人々の中で１００％に近い。同書。

【０００４】 以前の報告は、ＨＣＶ／ＨＩＶ同時感染患者は、肝不全の高い危険性を有する
ことを示唆した。Ｅｙｓｔｅｒら（１９９３）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ
Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．６：６０２−６１０；Ｔｅｌｆｅｒら（１９９４）
Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８７：５５５−５６１。しかし、ＨＣＶに感染し
たかなりの数のＨＩＶ陰性患者は、肝不全についても危険性がある。現在のとこ
ろ、肝不全の危険性を評価するために、このような個体をスクリーニングするた
めの信頼できる方法は存在しない。従って、肝不全を発症する危険性を決定する
ために、ＨＣＶ感染個体（ＨＩＶ同時感染を有するか、または有さない）をスク
リーニングするための手段を提供することは有利である。

【０００５】 （発明の要旨） 従って、ＨＣＶに感染した個体における肝不全の危険性を決定するための方法
を提供することによって、当該分野における上記の必要性をアドレスすることが
、本発明の主な目的である。

【０００６】 個体の体液におけるＨＣＶコアに対する抗体の力価を測定すること、および力
価を肝不全を発症する危険性に相関付けることに基づいて、ＨＣＶに感染した個
体における肝不全の危険性を決定するための方法を提供することが本発明の別の
目的である。

【０００７】 個体の体液における抗原−抗体複合体を測定することに基づいて、ＨＣＶに感
染した個体における肝不全の危険性を決定するための方法を提供することが本発
明のなお別の目的である。

【０００８】 ＨＣＶに感染した個体における肝不全の危険性を決定するためのキットを提供
することが、本発明のさらに別の目的である。

【０００９】 本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、部分的に以下の説明に記載
され、そして部分的に以下を試験した際に当業者に明らかになるか、または本発
明の実施によって理解され得る。

【００１０】 従って、第一の実施形態において、ＨＣＶに感染した個体における肝不全の危
険性を決定するための方法が提供され、この方法は、個体の体液におけるＨＣＶ
コアに対する抗体の力価を測定する工程、および肝不全を発症する危険性にその
力価を相関付ける工程を包含し、ここで、その力価は、肝不全を発症する危険性
に逆に関連する。

【００１１】 好ましくは、本発明は、測定する工程が、ＨＣＶコアに対する抗体が、体液中
に存在する場合、ＨＣＶコアに対する抗体に結合し、そして抗原−抗体複合体を
形成する量の抗原に体液のサンプルを抗原−抗体複合体の形成を可能する条件下
で接触させることによって、アッセイを実施すること（ここで、添加された抗原
の量は、体液のサンプルに存在するＨＣＶコアに対する実質的に全ての抗体に結
合するに十分である）；そして、アッセイにおいて形成される抗原−抗体複合体
の量を決定することによって、実施されることを提供する。そのアッセイは、酵
素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（例えば、ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。

【００１２】 測定する工程で使用されるアッセイは、固相免疫アッセイであることがまた好
ましい。免疫アッセイにおいて使用される好ましい固相としては、例えば、ビー
ズ、膜、微粒子およびプレートが挙げられる。固相を含む酵素免疫アッセイが特
に好ましく、そして例えば、組換え免疫ブロットアッセイ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏ
ｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡから入手可能なＲＩＢＡ（登録商標））が
挙げられる。組換え免疫ブロットアッセイは、固相としてのニトロセルロース膜
を、および組換え産生された抗体を使用する。

【００１３】 第２の実施形態において、ＨＣＶに感染した個体における肝不全の危険性を決
定するためのキットが提供され、このキットは、ＨＣコアの一部に特異的である
抗体に結合する抗原；その表面に抗体が付着している基材；およびどのように、
抗原および肝不全を発症する危険性に対する力価の逆の相関を使用するＨＣＶコ
アの一部に特異的である抗体を、どのように測定するのかの説明を記載する１組
の説明書を含む。

【００１４】 第３の実施形態では、Ｃ２２抗原を含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染し
た個体における肝不全の危険性を決定するためにＣ２２抗原を用いる方法が提供
され、この方法は、Ｃ２２抗原に対する抗体の力価を測定する工程；および肝不
全を発症する危険性に対してこの力価を相関させる工程を包含し、ここで、この
力価は、肝不全を発症する危険性に逆に関連する。

【００１５】 （発明を実施するための形態） （Ｉ．定義および概要） 本発明を詳細に記載する前に、特定の試薬、アッセイ形式などは変動し得るの
で、本発明は、特定の試薬、アッセイ形式などに限定されないことが理解される
べきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的の
ためのみであり、そして限定されることを意図していないこともまた理解される
べきである。

【００１６】 本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形の「ａ」
、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、状況がそうでないことを明らかに示すのでない
限り、複数形への言及を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、
「ＨＣＶコアに特異的な抗体」に対する言及は、１、２またはそれより多くのこ
のような抗体を含み、「抗体−抗原複合体」に対する言及は、１、２またはそれ
より多くのこのような複合体を含む、などである。さらに、本明細書および添付
の特許請求の範囲において使用する場合、用語「肝（ｈｅｐａｔｉｃ）不全」お
よび「肝（ｌｉｖｅｒ）不全」は、同一の意味を有し、そして完全に交換可能で
ある。

【００１７】 以下の本明細書および特許請求の範囲では、以下の用語を以下に示す定義に従
って用いる。

【００１８】 状況がそうでないことを明確に示さない限り、用語「抗原」は、ＨＣＶコアに
特異的な抗体が結合するエピトープを規定するかまたは含む、少なくとも５アミ
ノ酸、より通常は少なくとも約８〜１０アミノ酸のポリペプチドを意図する。抗
原は、ＨＣＶコア全体、ＨＣＶコアセグメントまたはそれらの誘導体からなり得
る。ＨＣＶコアは、ウイルスのコーティングを含む。従って、抗原は、コーティ
ング全体、コーティングのセグメントまたはそれらの誘導体（例えば、天然に存
在するアミノ酸配列の１以上の置換または欠失を有する、合成によって調製され
たペプチド）を含み得る。しかし、全ての場合、抗原は、ＨＣＶコアに特異的な
抗体が結合する少なくとも１つのエピトープを含まねばならない。

【００１９】 本明細書中で使用する場合、「体液」は、リンパ液、乳汁、血漿、唾液、精液
、血清、髄液、涙、皮膚の外部セクション、および気道、腸管および尿生殖管の
分泌物を含むがこれらに限定されない、個体から単離された流体のサンプルをい
う。好ましくは、体液は血清である。

【００２０】 本明細書中で使用する場合、「抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件」は
、抗体がその相補的なエピトープに結合するのを可能にするに充分な時間、温度
、ｐＨおよび試薬濃度の条件を意味することが意図される。当該分野で周知のよ
うに、結合に必要な時間、温度、ｐＨおよび濃度は、特定の抗原、抗体と抗原と
の間の相補性の程度および反応混合物中の他の物質の存在に依存する。任意の特
定の場合において結合のために必要な実際の条件は、当業者によって容易に決定
され得る。

【００２１】 代表的な結合条件としては、約７〜約８．５、より好ましくは約７．４のｐＨ
へと緩衝化される溶液、約２８℃〜約４２℃、好ましくは約３０℃〜約３８℃、
そして最も好ましくは約３７℃の温度、ならびに約１秒間〜約２４時間、好まし
くは約７分間から約１６時間、そして最も好ましくは約１０分間〜約１０時間の
時間の使用が挙げられる。

【００２２】 「任意の」または「必要に応じて」は、その後で記載される状況が、起こって
も起こらなくてもよく、その結果、その記載は、その状況が起こる例およびその
状況が起こらない例を含むことを意味する。例えば、固相アッセイ中の「任意の
」洗浄工程は、洗浄工程が行われるアッセイおよび洗浄工程が行われないアッセ
イを含む。

【００２３】 （ＩＩ．方法） 本発明は、ＨＣＶに感染した個体における肝不全の危険性を決定するための方
法を提供する。この方法は、その個体の体液中のＨＣＶコアに対する抗体の力価
を測定する工程、およびその力価を肝不全を発症する危険性と相関させる工程を
包含する。肝不全の危険性は、ＨＣＶコアに特異的な抗体の力価に対して逆に関
連する。

【００２４】 この方法は、ＨＣＶ陽性個体を必要とする。しばしば、しかし常にそうではな
いが、このような個体はまた、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および／ま
たは他のウイルスに同時感染し得る。同時感染したＨＣＶ陽性個体はまた、本発
明の方法から利益を受け得る。

【００２５】 その個体において一旦確立されたら、ＨＣＶはそれ自体複製し、そして新たな
細胞を冒す。その応答において、その個体の免疫系は、このウイルスの種々の成
分に対する抗体を発達させる。一般に、これらの抗体は、ＩｇＧ抗体またはＩｇ
Ｍ抗体であるが、免疫系はしばしば、他の免疫グロブリンのバラエティーもまた
産生する。この抗体はそれ自体が個体の身体全体に分布し、そして個体から抽出
され得る体液中に存在する。当該分野で周知の技術を用いて、体液のサンプルは
、個体から採取され、公知の技術を用いて分析のために調製され（必要な場合）
、そして測定されて、個体の抗体力価が決定される。

【００２６】 個体の抗体力価を測定することは、ＨＣＶコアに特異的な抗体を検出し得る任
意のアッセイ形式を用いることによって達成される。測定方法が、遠心分離、ク
ロマトグラフィー、電気泳動、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、免疫沈降、受動的
凝集、組換え免疫ブロットアッセイ（ＲＩＢＡ（登録商標））および固相親和性
からなる群より選択されるアッセイを用いることが好ましい。しかし、測定工程
において用いられるアッセイが組換え免疫ブロットアッセイであることが好まし
い。これらのアッセイは、当該分野で公知であり、そして当業者によって、単な
る慣用実験を用いて、体液中のＨＣＶコアに対する抗体の力価を測定するように
適応され得る。別の好ましいアッセイは、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）である。

【００２７】 ＨＣＶコアに対する特異抗体を同定するために、アッセイは、ＨＣＶコア全体
、ＨＣＶコアの一部分またはそれらの誘導体を含む抗原を用いなければならない
。本発明の方法について使用するための抗原の調製は、以下に考察される。

【００２８】 本明細書において有用なアッセイの全てに共通の特徴は、ＨＣＶコア由来の少
なくとも１つのエピトープを有する抗原が用いられることである。ＨＣＶウイル
スのコアは、図１のアミノ酸１〜１２０を含む。ＨＣＶコア抗原は、ＨＣＶコア
アミノ酸配列、ＨＣＶコアアミノ酸配列の一部分またはそれらの誘導体から完全
に構成されるポリペプチドの形態であり得る。コアは、多くのエピトープ（すな
わち、特異抗体についての結合部位）を含む。従って、ＨＣＶコア配列の一部分
のみが抗原として用いられる場合、その部分は、少なくとも１つのエピトープを
含まなければならない。抗原が、ＨＣＶコア配列中に存在する「Ｃ２２」として
公知のエピトープを含むことが好ましい。あるいは、この配列は、「Ｃ２２抗原
」として同定され得る。

【００２９】 一旦エピトープが選択されると、抗原は調製されなければならない。抗原は好
ましくは、当該分野で周知の技術によって組換え技術を用いることによって調製
される。特に、組換え技術（例えば、所望の抗原をコードするＤＮＡを構築する
こと、ＤＮＡを発現ベクター中にクローニングすること、宿主細胞（例えば、細
菌、酵母または哺乳動物の細胞）を形質転換すること、およびＤＮＡを発現して
所望の抗原を産生すること）は周知である。有利なことに、組換え産生されたＨ
ＣＶ抗原は、融合タンパク質（すなわち、２以上の遺伝子配列を組み合わせるこ
とによって作製されるハイブリッド遺伝子の発現によって形成されるタンパク質
）として産生され得る。従って、例えば、所望のタンパク質の適切なＤＮＡ遺伝
子配列は、β−ガラクトシダーゼまたはユビキチンのようなタンパク質をコード
する既存の遺伝子の発現ベクター中に、当該分野で周知の技術を用いて挿入され
る。例えば、２つの遺伝子（すなわち、天然の遺伝子および所望の抗原をコード
する遺伝子）をコードするＤＮＡ配列は、例えば、抗生物質に対する耐性を付与
するプラスミドベクターによって宿主細胞のＤＮＡに導入される。一旦細胞が増
殖すると、所望の遺伝子配列を保有する宿主細胞が、この場合、培養培地への適
切な抗生物質の適用によって選択される。その後、選択された細胞がクローニン
グされ、そして所望のタンパク質（すなわち、融合タンパク質）は、従来技術を
用いてこの細胞から回収される。例えば、融合タンパク質は、細胞を溶解し、例
えば、サイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分離し、そして融合
タンパク質を収集することによって回収され得る。この組換え技術および他の組
換え技術は、発現レベルを上昇させるためおよび／または抗原の水溶性を上昇さ
せるために役立つ。さらに、これらの技術は、融合タンパク質が同じ分子内で（
同一であるかまたは異なるかのいずれかの）複数のエピトープを提示することを
可能する。

【００３０】 しかし、融合タンパク質におけるエピトープは、ＨＣＶコア由来のエピトープ
のみでなければならない。例えば、Ｃ２２抗原内に含まれる繰り返しエピトープ
をコードするＤＮＡの連続フラグメントが構築され得、発現ベクター中にクロー
ニングされ得、そしてＣ２２配列由来の複数のエピトープを有する融合タンパク
質を発現するために用いられ得る。同様の様式で、Ｃ２２抗原および代替のＨＣ
Ｖコア抗原の融合タンパク質が用いられ得る。以前に示されたように、Ｃ２２抗
原は、図１のアミノ酸１〜１２２の配列によって規定される。

【００３１】 あるいは、この抗原は、合成によって産生され得る。抗原の合成産生は一般に
、当該分野で周知の標準的な固相ペプチド合成の技術を用いる。このような方法
において、ペプチドの合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．
Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４によって記載されるよ
うな固相合成の一般原則に従って所望のアミノ酸残基を一回に１つずつ、成長中
のペプチド鎖に取り込ませることによって連続して行われる。ペプチドの化学合
成に共通なのは、保護基が最後に除去されるまでその部位での化学反応が生じる
のを防ぐ適切な保護基を用いた、種々のアミノ酸部分の反応性側鎖基の保護であ
る。その実体をカルボキシル基で反応させながら、アミノ酸上のα−アミノ基を
保護し、続いてα−アミノ保護基を選択的に除去してその後の反応がその部位で
生じるのを可能にすることもまた周知である。適切なα−アミノ保護基および側
鎖保護基の例は、当該分野で周知である。

【００３２】 さらに、ＨＣＶコア抗原は、ウイルス自体から入手され得る。例えば、ウイル
スは、タンパク質分解酵素および／またはウイルスをばらばらに分解するのに充
分な条件を用いて切断され得る。次いで、所望のＨＣＶコアセグメントは、例え
ば、遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて分離および回収され
る。

【００３３】 ＨＣＶコア抗原は、液相または固相のいずれかの免疫アッセイにおいて用いら
れ得る。両方の例は当該分野で周知であり、そして以下に考察される。固相免疫
アッセイでは、ＨＣＶコア抗原は、固相に固定化される。好ましくは、抗原は、
ビーズ、微粒子、膜およびプレートからなる群より選択される固相に結合される
。固相は、抗原を固定化するために適切な任意の物質から作製され、そして例え
ば、ニトロセルロース（例えば、膜の状態）、ポリ塩化ビニル（例えば、シート
またはマイクロタイターウェルの状態）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビ
ーズまたはマイクロタイタープレートの状態）、ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌ
ｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（例えば、マイクロタイタープレ
ートの状態）、およびポリスチレン（例えば、ビーズの状態）が挙げられる。抗
原を固相に共有結合または非共有結合させるための方法は、当該分野で周知であ
る。例えば、抗原は、抗原が標準的な固相タンパク質合成を用いて合成された場
合、固相に共有結合される。あるいは、非共有結合相互作用（例えば、水素結合
またはファンデルワールス力）は、抗原を固相と接触させた場合に抗原を結合し
得る。抗原は、固相の表面全体に結合し得るか、またはパターン状に（例えば、
バンド状に）分布して、抗原−抗体結合の検出を容易にし得る。

【００３４】 液相（すなわち均一）アッセイにおいては、抗体の検出は、単一の試験管内で
、抗原−抗体複合体を結合していない抗原および抗体から分離する必要なく、実
施される。例えば、抗体の存在を検出するために、蛍光標識と消光剤との両方を
含む抗原が使用される。クエンチャーは、蛍光標識の蛍光発光を消光する能力を
有する（この場合には、蛍光標識は、例えば結合が起こる場合にこの消光剤を抗
原から放すことによって、消光剤に対するその空間的関係が変化するまで、検出
不可能である）。従って、結合の前には、二重の蛍光団／クエンチャー標識抗原
は、蛍光を発しない。結合に続いて、このクエンチャーは、抗原から離され、こ
れによって、蛍光が肉眼または自動化蛍光測定によって検出されることを可能に
する。

【００３５】 一旦調製されると、抗原は、ＨＣＶ陽性個体由来の体液のサンプルに添加され
るか、またはこのサンプルと接触される。この工程は、抗原がこの体液中に存在
するような任意の抗体と結合することを可能にする条件下で、実施される。代表
的に、このアッセイは、約２８℃〜約４２℃、好ましくは、約３０℃〜約３８℃
、そして最も好ましくは、約３７℃の温度で実施される。さらに、このアッセイ
は、約７〜約８．５のｐＨで、好ましくはｐＨ７．４で実施される。さらに、抗
原−抗体複合体の形成は、実質的に全てのＨＣＶコア特異的抗体を抗原に結合さ
せるに十分な時間にわたって進行することが可能である。しかし、抗原−抗体複
合体の形成は、この抗原が体液に添加された後約１０分間から約１０時間にわた
って、進行することが可能であることが好ましい。

【００３６】 固相アッセイの形式においては、固相は、必要に応じて、あらゆる試薬、結合
していない抗体、およびこのアッセイの特異性または感度に影響を与え得る類似
の部分を除去するために、洗浄される。しかし、一般に、１つ以上の洗浄工程を
、この固相アッセイの間および／または後に実施することが、好ましい。

【００３７】 一旦、抗原−抗体複合体の形成が起こると、形成した複合体を検出し、そして
この複合体の量を測定することが、必要である。代表的に、複合体形成の検出お
よび測定は、標識され、そしてＨＣＶ抗体と結合し得る、二次抗体の使用によっ
て、達成される。適切な標識としては、例えば、化学発光部分、比色定量部分、
酵素部分、蛍光部分および放射性部分が挙げられる。この複合体からのシグナル
を増幅する方法もまた公知であり、そして例えば、ビオチンおよびアビジンの使
用、ならびに酵素標識（すなわち、ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。直接的または間
接的な蛍光アッセイが、使用され得る。シグナルの測定は、裸眼、顕微鏡、また
は密度計のような測定機器を使用して、達成され得る。密度計は、アッセイスト
リップ上のバンドを読み取るために、特に好ましい。

【００３８】 あるいは、抗原−抗体複合体の形成は、免疫沈降アッセイまたは凝集アッセイ
（ＨＣＶ抗体に結合し得る二次抗体を用いる）において、溶液または懸濁液から
沈殿するネットワークを検出することによって、検出および測定される。このネ
ットワークは、沈殿物の可視の層またはフィルムを形成する。抗ＨＣＶ抗体が試
験標本中に存在しない場合には、可視の沈殿は形成しない。

【００３９】 酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）ならびに蛍光標識および化
学発光標識を使用する他の免疫アッセイは、本発明のアッセイの測定工程を実施
するために、特に好ましい。測定工程のために好ましい別のアッセイは、組換え
免疫ブロットアッセイ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃ
Ａから入手可能なＲＩＢＡ（登録商標））である。このアッセイは、抗原（例え
ば、Ｃ２２抗原）、ＳＯＤバンド、およびＩｇＧコントロールバンドを有するニ
トロセルロースストリップを使用する。この試験は、ＨＣＶ抗体を検出するため
に非常に高感度であり、そしてウェスタンブロットアッセイと類似の様式で実施
される。

【００４０】 本発明の方法を実施するために必要な試薬および器具は、好都合に、キットに
包装され得る。このキットは、ＨＣＶに感染した個体における肝不全の危険性を
検出するために使用され、そして以下を含む：ＨＣＶコアの部分に特異的な抗体
に結合する、抗原；ならびに１組の説明書であって、この抗原を使用してＨＣＶ
コアの部分に特異的な抗体、および肝不全を発症する危険性に対する力価の逆相
関を測定する方法の説明を記載する、説明書。好ましくは、このキットは、表面
に抗原が付着した基材をさらに含む。この基材がニトロセルロースであることが
もまた、好ましい。このキットはまた、液相アッセイを実施するための、溶液中
の抗原を含み得る。このキットはまた、基材、コントロール抗体、標識抗体（ア
ッセイ形式がそのように要求する場合）、および標識が直接的なシグナルを生成
しない場合にはシグナル発生試薬（例えば、酵素基材）に抗原を結合させるため
の試薬を含み得る。

【００４１】 （ＩＩＩ．有用性） ＨＣＶウイルスに感染した個体の全てが、肝不全を発症するわけではない。し
かし、本発明の方法およびキットは、肝不全に対してより高い危険性を有するＨ
ＣＶ陽性個体を同定するために、効果的である。肝不全に対する高い危険性を有
する個体については、肝不全は、３０年以内、そして潜在的には１５年以内に起
こる。比較的高い力価の、ＨＣＶコアに対する抗体を発生させるＨＣＶ陽性個体
は、肝不全を発症する危険性が低いことが見出された。対照的に、比較的低い力
価の、ＨＣＶコアに対する抗体を有するＨＣＶ陽性個体は、肝不全を発症するよ
り高い危険性を有する。

【００４２】 例えば、ＨＣＶコアに対する弱い抗体力価は、１５年後の肝不全の機会の３７
％に関連し、一方で強い抗体力価は、肝不全の機会の１５％に関連したことが見
出された。「弱い」応答または「強い」応答を構成する抗体力価は、当業者によ
って実験的にか、または実施例に記載されるように、決定され得る。

【００４３】 ＨＣＶは、肝臓の実質を攻撃して、広範な病理を引き起こす。臨床的には、肝
不全は、以下を提示し得る：肝性脳障害（肝臓によるアンモニア除去の失敗に起
因する）；黄疸（ビリルビンの除去の失敗に起因する）；および出血（凝固因子
の合成の失敗に起因する）。不運なことに、肝不全を罹患する個体のための処置
は、しばしば、本質的に待期的であるのみである。従って、本発明の方法は、即
座の予防措置がとられてこの生命が危険な疾患への進行を最小化し得るために、
どの個体が肝不全を発症する危険性がより大きいかを決定するための手段を提供
する点で、非常に有用である。このような予防措置としては、例えば、アルコー
ルおよび肝毒性（ｈｅｐａｔｏｘｉｃ）薬物の差し控え、Ｃ型肝炎感染を処置す
るための薬物（例えば、インターフェロン）の投与、ならびに肝不全の危険性を
増加させることが既知である他の病原体（例えば、ＨＩＶ）に感染する危険性を
減少させることが挙げられる。

【００４４】 本発明を、その好ましい特定の実施形態とともに記載したが、上記記載および
以下の実施例は、例示であって本発明の範囲を限定しないことが意図されること
が、理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明が属
する分野の当業者に明らかである。

【００４５】 本明細書中の上記および下記の両方に確認される範囲は全て、包括的である。

【００４６】 （実験） 以下の実施例は、本明細書中に開示され、そして特許請求される、本発明の完
全な開示および記載を、当業者に提供するために、記載される。数（例えば、量
、温度など）に関して正確さを確実にするよう努力したが、いくらかの誤差およ
び偏差が、考慮されるべきである。他に示さない限り、温度は℃であり、そして
圧力は海面における大気圧またはその近くである。

【００４７】 他に示さない限り、全ての材料および試薬は（例えばＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇ
ｍａおよびＩＣＮから）購入し、そしてさらに精製することなく使用した。

【００４８】 （実施例１） （方法） 予想されるコホート研究法を実施して、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）お
よび関連する状態に関する危険因子を、米国の１２の総合血友病センターおよび
欧州の４の総合血友病センターに登録された、血友病および他の凝固障害を罹患
する全ての患者の間で、決定した。おおよそ年１回の間隔で、各被験体は、標準
化された診察（１週間あたりのアルコール摂取の回数に関する質問を含む）、医
学記録の再検査、および静脈切開を受けた。全ての被験体のＨＣＶ抗体状態を、
市販の第二世代または第三世代の酵素免疫アッセイを用いて決定した。ここで、
最も反応性のサンプルを、組換え免疫ブロットアッセイ（ＨＣＶ ＲＩＢＡ（登
録商標）２．０または３．０、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ
ｅ ＣＡ）によって確認した。８の年齢グループの各々における、２０のＨＩＶ
陽性被験体および２０のＨＩＶ陰性被験体の、層別化した無作為なサンプルを選
択した。これらの被験体の大部分は、ＨＣＶレベル、遺伝子型および血清型を決
定するために十分な血清または血漿を有した。

【００４９】 ＨＣＶ血漿レベルを、２００，０００（５．３ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬ）の感度
の下限を有する分枝状ＤＮＡ技術（Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ ＨＣＶ ＲＮＡ ２
．０、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）を用いて決定
した。ＨＣＶ血清型を、ＲＩＢＡ（登録商標）Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ ＳＩＡ（
Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）を用いて決定した。
個々のＲＩＢＡ（登録商標）バンドを、外部標準を使用して、０（真白）から１
０（真黒）の１１ポイントのグレースケールで、スコア付けした。ここで、この
スケールにおける８未満（従来の可視スケールにおける３＋未満）を、弱とみな
した。遺伝子型決定については、ＨＣＶ ＲＮＡを逆転写し、そして内包された
ビオチン化プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、高
度に保存された５’非コード領域まで増幅した。選択したサンプルをまた、市販
のＨＣＶ ＲＮＡアッセイ（Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ、Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ
ＮＪ）を使用して増幅した。遺伝子型決定を、市販のラインプローブアッセイ（
ＬｉＰＡ、バージョン１．０、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｚｗｉｊｎｄｒ
ｅｃｈｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、標識アンプリコン上で実施した。Ｌｉ
ＰＡに関するＰＣＲ産物を有さないサンプルを、ＰＣＲ陰性と称する；非定型の
バンドパターンを有するサンプルを、遺伝子型未特定と称する。全てのサンプル
を−７０℃で貯蔵し、そして大部分を、決して予め解凍しなかった。これら３つ
のアッセイを、別個の実験室において、互いの結果およびバックグラウンドデー
タがわからないようにして、実施した。ＨＣＶ血漿レベルを、全ての分析物に関
して、ｌｏｇ₁₀に変換した。

【００５０】 均一性に関するデータの最初の調査の後に、１６の層を、ＨＩＶ陽性被験体お
よびＨＩＶ陰性被験体について、年齢による五分位数（１９８２年５月において
：９歳未満、９〜１６歳、１７〜２３歳、２４〜３２歳、および３２歳より上）
にした。これら１０の層にわたる度数分布を、複数のＨＣＶ遺伝子型を有するサ
ンプル、主要な遺伝子型の１つを有するサンプル（ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２、Ｈ
ＣＶ−３、およびＨＣＶ−４）、および検出可能なウイルスバンドを有さないサ
ンプル（ｎ＝４８）または未特定バンドを有するサンプル（ｎ＝１７）に関して
、計算した。度数をまた、規定可能なＨＣＶ血清型（１、２、３、１／３）、お
よび規定不可能な血清型のバンド（ｎ＝１０）を有するサンプルに関して、計算
した。ＨＣＶ１、ＨＣＶ２、およびＨＣＶ３についての、遺伝子型と血清型との
間の確率を越えた一致を、κ統計を用いて決定した。平均［±２標準誤差（ＳＥ
）］ＨＣＶレベル（ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬ）を、分散分析によって、グループ間
で比較した。

【００５１】 肝不全を、食道静脈瘤、肝性脳障害、または持続性腹水の初期の発症として定
義した（肝不全に寄与した場合には、これらの状態の非肝性要因、または死を排
除した）。これらの症例の確認を、全ての医学記録、およびコホートの残りにお
けるＨＣＶ血清陽性被験体の６％の無作為サンプルの独立した再抽出によって、
実施した。潜在的な寄与要因（例えば、投薬または慢性活動性Ｂ型肝炎ウイルス
感染）を、排除しなかった。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ産物制限法を使用して、
肝不全発生数［±１標準誤差（ＳＥ）］を、中央ＭＨＣＳ ＨＩＶセロコンバー
ジョン日（１９８２年５月２９日）または被験体の誕生日のうちの遅い方から、
推定した。全てのＨＣＶ血清陽性被験体に対して、そして無作為サンプルを使用
するケースコホート設計において（Ｅｐｉｃｕｒｅ，ＨｉｒｏＳｏｆｔ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）、比例的危険モデ
ル化を使用して、ＨＣＶ遺伝子型、ＨＣＶ血漿レベル、ＨＩＶ状態、年齢、およ
び他の変数によって、肝不全の相対的危険性［±９５％信頼区間（ＣＩ）］を決
定した。全てのデータを、１６年目（１９９８年５月２８日）に打ち切った。

【００５２】 （結果） ＭＨＣＳにおける２０５６の血友病被験体のうちの、１１９４（５８％）がＨ
ＩＶおよびＨＣＶに対して血清陽性（「同時感染された」）であり、６２４（３
０％）がＨＣＶのみに対して血清陽性であり、２０（１％）がＨＩＶに対しての
み血清陽性であり、そして２１８（１１％）が両方のウイルスに対して陰性であ
った。

【００５３】 ＭＨＣＳにおける１３７のＨＣＶ陽性被験体は、肝不全（肝臓死として定義さ
れる（肝細胞癌であることが確認されるもの、および肝細胞癌であることが疑わ
れるものを含む））、肝性脳障害、食道静脈瘤、または他の同定可能な原因を伴
わない持続性腹水を発症した。肝不全は、１１９４ＨＩＶ陽性被験体のうち１２
７被験体（１０．６％）で発症したのに比較して、６２４のＨＩＶ陰性被験体で
は１０被験体（１．６％）が発症した。ＨＩＶ陽性の２つの場合において、開始
日（１９８２年５月）前に肝不全が発症したので、それらを除外し、将来の分析
のために１１９２ＨＩＶ陽性被験体を残した。１７被験体（そのうち１４がＨＩ
Ｖ陽性であり、３がＨＩＶ陰性）を、肝不全が発症する前にインターフェロン−
αで処置し、肝不全を有していなかった１４被験体（そのうち１３がＨＩＶ陽性
）についても同様にインターフェロン−αを処置した。

【００５４】 １６年の経過観察における産物限定評価（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｌｉｍｉｔ ｅｓ
ｔｉｍａｔｉｏｎ）によると、肝不全は、ＨＩＶに感染していなかった６２４被
験体の２．７（±０．９ＳＥ）％において発症したのに比較して、ＨＩＶを同時
感染した１１９２被験体では２０．１（±１．９ＳＥ）％が発症した（Ｐ＜０．
０００１、図２Ａ）。肝不全の危険性は、最高齢の被験体について非常に高かっ
た。ＨＩＶ陽性被験体の中で、肝不全の１６年の累積発症率（ｃｕｍｕｌａｔｉ
ｖｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）は、第２の分位点（２４〜３２歳、Ｐ＝０．００２
）における２３．６（±４．１ＳＥ）％と比較して、最高齢の分位点（３２歳を
すぎた登録者）において４１．８（±４．１ＳＥ）％であった。肝不全の発症率
は、第３の分位点、第４の分位点、および最年少（９歳未満の登録者）の分位点
においてさらに低くなり、それぞれ１４．４％、１６．２％、および６．４％で
ある（２４〜３２歳と比較される各々についてＰ＜０．０５、図２Ｂ）。ＨＩＶ
陰性被験体の中で、最高齢の分位点（より若い被験体中の１．２％の累積発症率
に対して８．６％の累積発症率、Ｐ＝０．０００６）において１０の肝不全症例
のうち７が発症した。利用可能なデータは、ＨＣＶ感染、長期感染もしくは両方
において、この関係が加齢に関連するものであるか否かを明確に区別するために
は不十分であった。

【００５５】 比例危険モデリング（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄｓ ｍｏｄｅ
ｌｉｎｇ）によって、肝不全の危険性は、ＨＩＶ同時感染[相対的危険性７．９
（９５％ＣＩ４．２、１５．２）]および加齢[１７〜３２歳についての相対的危
険性１．６（９５％ＣＩ１．０、２．５）；３２歳過ぎたときの相対的危険性５
．０（９５％ＣＩ３．２、７．９）]と共にかなり増加した。加齢は、ＨＩＶ陽
性被験体よりもＨＩＶ陰性被験体に対してより有害であるようにみえるが、信頼
区間は実質的に重複した。

【００５６】 ３つのレベル（１週間につき飲酒する回数が、０回、８回未満、８回以上）に
おいて報告されたアルコール消費は、ＨＩＶ陽性被験体[相対的危険性１．３（
９５％ＣＩ１．０２、１．７）]およびＨＩＶ陰性被験体[相対的危険性２．３（
９５％ＣＩ０．９６、５．６）]における肝不全に直接関連した。年齢調節は、
ＨＩＶ陰性被験体[相対的危険性１．４（９５％ＣＩ０．５、３．６）]における
アルコールに対するこの関係を弱いものとしたが、ＨＩＶ陽性被験体[相対的危
険性１．３（９５％ＣＩ０．９６、１．７）]においてはそうではなかった。

【００５７】 利用可能な血清学データおよびワクチン接種データは、ＨＩＶを有しない６１
６被験体についてのＢ型肝炎ウイルス状態を明確に定義するのに十分であり、そ
の中で、１６年の累積発症率は、Ｂ型肝炎状態と関連しなかった（Ｐ＝０．６１
、データは示されず）。ＨＣＶおよびＨＩＶの同時感染について、１６年の肝不
全発症率は、慢性的Ｂ型肝炎表面抗原血症を有する１０４被験体中で４０．５（
±１０．６ＳＥ）％、消散化Ｂ型肝炎感染を有する９８５被験体中で２０．２（
±２．１ＳＥ）％、およびいまだかつてＢ型肝炎ウイルスに感染していない９１
被験体中で３．２（±２．３ＳＥ）％であった（Ｐ＝０．００３）。年齢調節に
ついて、慢性的抗原血症を伴う高い危険性およびＢ型肝炎感染を伴わない低い危
険性は、もはや有意ではなかった（それぞれ、Ｐ＝０．２４および０．０７）。

【００５８】 重篤な血友病Ａの罹患率（Ｐ＝０．８０）；ＨＩＶ陽性被験体中の１６年の累
積性生存率（Ｐ＝０．４４）およびＨＩＶ陰性被験体中の１６年の累積性生存率
（Ｐ＝０．４７）；ならびにＨＩＶ陽性被験体中の、肝不全発症率（Ｐ＝０．５
１）および年齢群との関連性（データは示されず）により決定される場合、ＨＣ
Ｖの遺伝子型決定、血清型決定、および血漿レベル試験について選択された３１
０の被験体の階層化された無作為サンプルは、ＭＨＣＳ集団の中の代表的なもの
であり、なおかつＭＨＣＳ集団の経験内容と異なるものではなかった。

【００５９】 １７３（５６％）の被験体は、ＨＣＶ遺伝子型１を有し、サブタイプ１ａおよ
びＩｂの数はほぼ等しかった。３２被験体は、遺伝子型２を有し、３０被験体は
、遺伝子型３を有し、そして３被験体は、遺伝子型４を有した。７被験体（２％
）は、複数の遺伝子型が検出され；１７被験体は、特定できない遺伝子型を有し
；そして４８（１５％）は、ＰＣＲ陰性であった。それぞれ、血清型２および血
清型３を有する、わずか１６被験体および２４被験体と比較して、２４８（８０
％）の被験体がＨＣＶ血清型１を有した。９被験体が、かすかな血清型バンドを
有するか、または有せず、そして１３被験体について、このアッセイは、血清型
１と血清型３を区別できなかった。ＨＣＶ遺伝子型とＨＣＶ血清型との間の一致
レベルは、ＨＣＶ１（κ＝０．２５）およびＨＣＶ２（κ＝０．２１）について
は低く、そしてＨＣＶ３については良好であった（κ＝０．４４）。

【００６０】 ＨＩＶ陰性被験体と比べると、ＨＩＶ陽性被験体において、平均ＨＣＶ血漿レ
ベルは、有意に高く（６．２±０．１対５．９±０．１ ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬ
、Ｐ＝０．０００１）なおかつ４．９年という平均をさらに超えて有意に増加し
た（０．４２±０．０５対０．１６±０．０４ ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬ、Ｐ＝０
．０００２）。ウイルスレベルは、重篤な血友病Ａ（６．１±０．１ ｌｏｇ₁₀ コピー／ｍＬ）、穏やかな、もしくは中程度の血有病Ａ（６．１±０．１ ｌｏ
ｇ₁₀コピー／ｍＬ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビター（６．１±０．１ ｌｏｇ₁₀ コピー／ｍＬ）、またはヴォン・ヴィレブランド病（５．９±０．３ ｌｏｇ₁₀ コピー／ｍＬ）を有する被験体において類似していたが、それらは、血友病Ｂを
有する被験体の中では有意に低くかった（５．８±０．１ ｌｏｇ₁₀コピー／ｍ
Ｌ）。ＨＣＶレベルは、ほぼ全てのＰＣＲ陰性被験体および遺伝子型未特定被験
体において検出不可能であった。ＰＣＲ陽性被験体の中で、このＨＣＶレベルは
、１ａ型ＨＣＶ、１ｂ型ＨＣＶおよび２型ＨＣＶと類似していたが（６．３ｌｏ
ｇ₁₀コピー／ｍＬ）、遺伝子型３についてはより低く（６．１ｌｏｇ₁₀コピー／
ｍＬ）そして複数の遺伝子型を有する７被験体中ではより高い（６．６ｌｏｇ₁₀ コピー／ｍＬ、図３Ａ、エラーバーを表わす斜線部分）ようであった。このＨＣ
Ｖレベルは、１６歳を超える被験体の中では類似していたが、それは、より若い
被験体においては有意に低いものであった（図３Ｂ、エラーバーを表わす斜線部
分）。ＨＣＶ ＰＣＲ陽性被験体（遺伝子型１を有する多変量モデル）；参照群
として、ＨＩＶ陰性であり、なおかつ１７歳未満の被験体において、そのＨＣＶ
血漿レベルは、ＨＣＶ遺伝子型３については、独立して、なおかつ有意に低く（
Ｐ＝０．０５）、そしてＨＩＶ陽性（Ｐ＝０．０３）で、なおかつ年輩（Ｐ＜０
．００４）の被験体についてはより高かった。このモデルに加えられた血友病Ｂ
は、ＨＣＶレベルに関連しなかった（Ｐ＝０．４３）。

【００６１】 ＨＩＶ陽性被験体の症例コホート（ｃａｓｅ−ｃｏｈｏｒｔ）分析において、
肝不全の危険性は、全ての被験体（Ｐ_trend＝０．８７）およびＨＣＶ遺伝子型
１を有するか、または有しない（それぞれ、Ｐ_trend＝０．９９および０．２４
）サブグループ内のＨＣＶ血漿レベルに関連しなかった。危険性はまた、ＨＣＶ
遺伝子型および血清型（それぞれ、Ｐ＝０．１８および０．５３）に関連しなか
ったが、その危険性は、遺伝子型２または３についてよりも遺伝子型１について
の方がより高いようであった（Ｐ＝０．０６）。個々の血清型バンドの強度は、
肝不全のより高い危険性を表わし、ＨＣＶコア−１[単位当たり１１ポイントス
ケールで相対的危険性０．８６（９５％ＣＩ０．７７、０．９６）]またはＨＣ
Ｖコア−２[相対的危険性０．８８（９５％信頼区間０．７８、０．９９８）]に
対してより弱い抗体反応性を有した。多変量モデルにおいて（示されず）、有意
な逆の関連性が、コア−１およびＣＤ４⁺リンパ球レベルについては主張される
が、コア−２または３つのＮＳ４バンドについては主張されなかった。

【００６２】 血清型バンドについてのこれらの結果を考慮して、類似の分析を、７４７のＨ
ＩＶ陽性被験体においてＨＣＶ血清反応陽性を確認したＲＩＢＡ（登録商標）の
バンドに対して実施した。肝不全発症率は、ｃ１００、ｃ５−１−１、ｃ３３ｃ
、およびＮＳ５ ＲＩＢＡ（登録商標）バンドの強度に関連しなかったが（Ｐ＞
０．０１、データは示さず）；肝不全発症率は、Ｃ２２バンドに対する弱い反応
性を伴って、実質的に増大した。ＨＩＶ陽性被験体において、推定された１６年
の肝不全発症率は、強いＣ２２反応性を有する若い被験体が有する１０％から弱
いＣ２２反応性を有する年輩の被験体が有する５５％までに渡った（図４）。

【００６３】 ＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺リンパ球の計数は、６４８のＨＩＶ陽性被験体において
、ＲＩＢＡ（登録商標）サンプルとほぼ同時に実施された。より下位の２つの分
位点におけるＣＤ４⁺計数値（２５９細胞／μＬ以下）は、肝不全の有意により
高い発症率（Ｐ＝０．０００３）と関連したが、危険性は、その２つの最下位の
分位点間においても、３つの最高位の分位点間においても異なるものではなかっ
た（Ｐ＞０．７１）。危険性は、最下位の分位点のＣＤ８⁺計数値（３０７ＣＤ
８⁺細胞／μＬ以下、Ｐ＝０．０００８）において同様に増加されたが、この関
係は、他の変数についての調節を主張しなかった。

【００６４】 ＨＣＶレベルは、平均４．９年を超えて変化し、肝不全を患っていなかった２
４２被験体の０．４１ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬと比較して、肝不全の４４症例にお
いて、０．４８ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬ増加した。ウイルスレベルの増加はまた、
低レベルのＣＤ４⁺リンパ球（０．５０対０．３８ｌｏｇ₁₀コピー／ｍＬ、Ｐ＝
０．２７）または低レベルの抗Ｃ２２ＨＣＶ抗体（０．５１対０．２７ｌｏｇ₁₀ コピー／ｍＬ、Ｐ＝０．１２）と共に注目されたが、統計学的に有意ではなかっ
た。

【００６５】 最終的な多変量比例危険モデルにおいて、肝不全の危険性は、いまだかつてＢ
型肝炎ウイルスに感染していない４７被験体に対しては低く（相対的危険性０．
１、９５％ＣＩ、０．０２、１．０）、低いＣＤ４⁺計数値を有する被験体にお
いて２．４倍（９５％ＣＩ、１．５、３．８）に増加し、弱い抗Ｃ２２反応性を
有する被験体において２．０倍（９５％ＣＩ、１．２、３．２）に増加し、そし
て強く加齢に関連した。

【００６６】 （考察） コホートの被験体の５８％を、ＨＣＶおよびＨＩＶで感染させ、そしてさらに
３０％を、ＨＩＶを伴わずにＨＣＶで感染させた。肝不全の危険性は、加齢およ
びＨＩＶとの同時感染で顕著に増加し、３２歳を過ぎると、１６年の経過観察の
間に４２％に達した。年齢およびＢ型肝炎状態を制御する多変量分析において、
ＨＣＶおよびＨＩＶの同時感染を伴う肝不全の危険性は、低いＣＤ４⁺リンパ球
計数値を有する被験体において２．４倍に増加し、そしてＨＣＶ Ｃ２２コアタ
ンパク質に対する弱い抗体応答性を有する被験体において２倍に増加した。

【００６７】 これらの結果は、ＨＣＶ関連肝不全の発症に対する損なわれた免疫の意味深い
効果を指摘する。ＨＣＶコアタンパク質に対する損なわれたＣＤ４⁺Ｔ細胞応答
性は、慢性Ｃ型肝炎に関連した。理論に拘束されることを望まないが、ＨＣＶペ
プチドに対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答性がＨＩＶ感染において損われて、さらに、
ＨＣＶ特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性が維持され得るということ
が推定される。

【００６８】 ＨＣＶコアタンパク質に対する弱い体液性免疫は、肝不全の高い危険性と関連
した。いくつかの研究は、ＨＩＶを同時感染している患者の大多数は、Ｃ１００
タンパク質、Ｃ５−１−１タンパク質、Ｃ３３ｃタンパク質、およびＮＳ５ＲＩ
ＢＡ（登録商標）タンパク質に対するＨＣＶ抗体反応性を欠如または喪失してい
るが、Ｃ２２タンパク質に対しては一般的にそうではないということに注目して
きた。抗Ｃ２２反応性が経時的に減退したか否かは不明であり、抗Ｃ２２反応性
が、肝不全にまで進行した被験体においては比較的弱いものであったということ
だけしか分かっていない。強力な抗コア抗体は、中和抗体または防御抗体である
ことが可能であるが、弱い抗体は、抗原抗体複合体形成、機能障害性の免疫応答
、または線維症および究極的な肝不全をもたらす非免疫原性経路までもを単に反
映し得る。

【００６９】 肝不全の危険性（ＨＣＶ血漿レベルに関連してはいないが）は、ＨＣＶ遺伝子
型１でわずかに増加した。遺伝子型１はまた、ＡＩＤＳのより高い危険性および
ＨＣＶ／ＨＩＶ同時感染した血友病患者の死と関連してきた。Ｓａｂｉｎら、（
１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：１６４−１６８。患者の過半数
を、ＨＣＶ遺伝子型１で感染させた。

【００７０】 肝毒性薬物およびおそらく感染が肝不全の危険性を増大させたようである。Ｐ
ｏｙｎａｒｄとその共同研究者たちは、進行性の肝性線維症は、ＨＣＶ感染期間
、感染時の年齢、およびアルコールの取り過ぎに直接関連するということを報告
した。Ｐｏｙｎａｒｄら、（１９９７）Ｌａｎｃｅｔ ３４９：８２５−８３２
。本研究は、ＨＩＶ同時感染を伴っても伴わなくとも、飲酒は肝不全の危険性と
弱く関連するということを明らかにした。

【００７１】 Ｂ型肝炎ウイルス感染は、かなり蔓延しており、肝硬変の典型的な原因である
。肝不全の危険性は、一変量分析において、慢性Ｂ型肝炎とともに増大したが、
おそらく、この関係は、この疾患に寄与しているというよりはむしろ加齢を反映
したものにすぎない。対照的に、多変量分析は、いまだかつてＢ型肝炎に感染し
たことがない数人の被験体について有意に減少した危険性を明らかにし、このこ
とは、消散化Ｂ型肝炎感染後の損われた肝機能を示唆した。肝不全の危険性は、
このコホートのＧ型肝炎ウイルス感染とともに増加しなかった。

【００７２】 従って、ＨＣＶおよびＨＩＶを同時感染している被験体において、肝不全の発
症率は、血漿中のＨＣＶレベルに関連せず、ＨＣＶ遺伝子１型を有し、なおかつ
アルコールを消費する被験体においてわずかに増加し、そして加齢、低いＣＤ４ ⁺ リンパ球計数値およびＨＣＶコアタンパク質に対する弱い抗体応答を有する被
験体において実質的に増加した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＨＣＶウイルスの最初の１２２個のアミノ酸の配列を提供する。

【図２Ａ】 図２Ａは、実施例において評価した場合の、肝不全をＨＩＶ状態へと発達させ
るＨＣＶ陽性個体の比率を示す。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、実施例において評価した場合の、肝不全を発症するＨＩＶ陽性個体
およびＨＣＶ陽性個体の年齢群ごとの比率を示す。

【図３Ａ】 図３Ａは、実施例において評価した場合の、ＨＣＶ陽性個体のサンプルにおけ
る種々のＨＣＶ遺伝子型のウイルス負荷量を示す。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、実施例において評価した場合の、ＨＣＶ陽性個体のサンプルの年齢
群ごとのウイルス負荷量を示す。

【図４】 図４は、実施例において評価した場合の、肝不全を発症するＨＣＶ陽性個体の
年齢群ごとの比率を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 トッド， ジョン エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549， ラフィエット， オーチャード ロード 1096 Ｆターム(参考） 4H045 AA11 BA10 CA01 DA75 DA86 EA50 EA53

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体における肝不全の危険性を
   決定するための方法であって、該方法は、以下： 該個体の体液中のＨＣＶウイルスに対する抗体の力価を測定する工程；および 該力価を肝不全を発症する危険性に対して相関付ける工程、 を包含し、ここで、該力価は、肝不全を発症する危険性に逆に関連する、方法。
2. 【請求項２】 前記体液が血清である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記測定する工程が、以下： ＨＣＶコアに対する抗体が前記体液中に存在する場合、該ＨＣＶコアに対する
   抗体に結合しそして抗原−抗体複合体を形成する量の抗原に体液のサンプルを、
   抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させることによってアッセイ
   を実施すること；および 該アッセイにおいて形成される抗原−抗体複合体の量を測定することにより該
   力価を決定すること、 によって実施され、ここで、添加された抗原の該量は、該サンプルに存在する該
   ＨＣＶコアに対する実質的に全ての抗体に結合するに十分な量である、請求項１
   に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記抗原が組換え産生された、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記抗原が合成によって産生された、請求項３に記載の方法
   。
6. 【請求項６】 前記抗原がＣ２２抗原を含む、請求項３に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記アッセイが、約２８℃〜約４２℃の温度で実施される、
   請求項３に記載の方法。
8. 【請求項８】 抗原−抗体複合体形成を、前記抗原が前記体液に添加された
   後に、約１０分〜約１０時間進行させる、請求項３に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記アッセイが固相免疫アッセイである、請求項３に記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 前記抗原が、ビーズ、微粒子、膜およびプレートからなる
    群から選択される固相に結合する、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記固相がニトロセルロース膜である、請求項１０に記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 前記アッセイが液相免疫アッセイである、請求項３に記載
    の方法。
13. 【請求項１３】 前記測定する工程は、遠心分離、クロマトグラフィー、電
    気泳動、酵素免疫アッセイ、免疫沈降、受動的凝集反応、組換え免疫ブロットア
    ッセイ、および固相アフィニティーからなる群から選択されるアッセイを使用し
    て実施される、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記測定する工程が、酵素免疫アッセイを使用して実施さ
    れる、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記測定する工程が、組換え免疫ブロットアッセイを使用
    して実施される、請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記抗体がＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体である、請求項１
    に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記肝不全が３０年以内で起こる、請求項１に記載の方法
    。
18. 【請求項１８】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した個体における肝不
    全の危険性を決定するためのキットであって、該キットは、以下： ＨＣＶコアの一部に特異的な抗体に結合する抗原；および 該抗原および肝不全を発症する危険性に対する力価の逆の相関を使用して該Ｈ
    ＣＶの一部に特異的な抗体をどのように測定するのかの説明を記載する１組の説
    明書、 を備える、キット。
19. 【請求項１９】 さらに基材を含み、該基材の表面には、前記抗原が付着さ
    れている、請求項１８に記載のキット。
20. 【請求項２０】 前記基材がニトロセルロースである、請求項１９に記載の
    キット。
21. 【請求項２１】 前記抗原が溶液中にある、請求項１８に記載のキット。
22. 【請求項２２】 前記抗原がＣ２２抗原を含む、請求項１８に記載のキット
    。
23. 【請求項２３】 Ｃ型肝炎ウイルスに感染した個体における肝不全の危険性
    を決定するためにＣ２２抗原を使用する方法であって、該方法は、以下： Ｃ２２抗原； 該Ｃ２２抗原に対する抗体の力価を測定する工程；および 肝不全を発症する危険性に対して該力価を相関付ける工程、 を包含し、ここで、該力価は、肝不全を発症する危険性に対して逆に関連する、
    方法。