JP2020501601A - Ｍｉｔｒａチップ抽出を使用して嚢胞性線維症の変異を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明の開示は、嚢胞性線維症の症状を示す患者、または嚢胞性線維症のリスクがある患者が、１種または複数の抗嚢胞性線維症治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法を提供する。これらの方法は、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプルにおける、遺伝性の嚢胞性線維症に関連する変異を検出することに基づく。本方法の実施において使用するためのキットも提供される。【選択図】図１

Description

本発明の開示は、嚢胞性線維症の症状を示す患者、または嚢胞性線維症のリスクがある患者が、１種または複数の抗嚢胞性線維症治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法を提供する。これらの方法は、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプルにおける、遺伝性の嚢胞性線維症に関連する変異を検出することに基づく。１種または複数の嚢胞性線維症に関連する変異に対応する標的核酸配列における変更は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して検出することができる。本方法の実施において使用するためのキットも提供される。

以下の本発明の開示の背景の記載は、単に読者が本開示を理解するのを助けるために提供され、本発明の開示に対する従来技術を記載または構成することを認めるものではない。

嚢胞性線維症（ＣＦ）は、コーカソイド人口において最も一般的な重度の常染色体の劣性遺伝的障害である。北米では、２，５００人の生児出生のうちおよそ１人がそれに罹患する（Ｂｏａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，６ｔｈ ｅｄ．，ｐｐ ２６４９−２６８０，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ（１９８９））。北欧のコーカソイドの２５人のうちおよそ１人が、その疾患の保因者である。関与する遺伝子は、第７染色体の長腕に存在する２５０，０００塩基対のゲノム配列に局在していた。この配列は、「嚢胞性線維症膜貫通制御因子」（または「ＣＦＴＲ」）と呼ばれる膜結合型タンパク質をコードする。ＣＦＴＲ遺伝子中には、嚢胞性線維症遺伝学分析コンソーシアム〔Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium〕に現在報告されている１０００種より多くの異なる変異があり、それぞれ異なる集団で出現頻度が異なる。これらの変異は、ＣＦＴＲ遺伝子の、コード領域（例えば、ΔＦ５０８であり、これは、ＣＦ対立遺伝子の約７０％に見出される変異であり、５０８位におけるフェニルアラニン残基の欠失を表す）と、非コード領域（例えば、５Ｔ、７Ｔ、および９Ｔバリアントは、イントロン８のスプライスブランチ／アクセプター部位に位置する５、７、または９チミジン塩基の配列に対応する）の両方に存在する。

嚢胞性線維症の主要な症状としては、慢性的な肺疾患、膵外分泌の機能不全、および汗の電解質レベルの上昇が挙げられる。症状は、外分泌障害である嚢胞性線維症と一致する。近年、ＣＦ患者の細胞の上皮の頂端膜を通過するイオン輸送の分析において進歩がなされてきたが、塩素チャンネルの異常な制御が、疾患における一次的な欠陥に相当するのかは、明らかではない。

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、その高いデータスループットと、単一のアッセイで複数の遺伝子の変更を検出する能力により、嚢胞性線維症などの遺伝的障害の診断に広く使用されている。しかしながら、生体サンプル（例えば血液）から核酸を収集し調製することに関連する手順は通常厄介であり、特殊化した器具または専門的な能力を必要とすることが多い。さらに、高齢者または乳児などの特定の患者グループは、繰り返しの試験のために大量の血液を提供することができない。

したがって、患者が、嚢胞性線維症を発症させる遺伝学的基準を有するかどうか、または嚢胞性線維症に罹る子孫を生じるリスクがあるかどうかを決定するための迅速で非侵襲的な方法への必要性がある。

一態様において、本発明の開示は、サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、サンプルＣＦＴＲ核酸を抽出すること；（ｂ）サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成すること；および（ｃ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、ライブラリー中のアンプリコンの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を検出することを含む、方法を提供する。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスである。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと接触させることによって実行される。特定の実施形態において、溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。さらなる実施形態において、溶解緩衝液は、８００ｍＭの塩酸グアニジン；３０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．０；３０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；５％のＴｗｅｅｎ ２０；および０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。他の実施形態において、溶解緩衝液は、２．５〜１０％のドデシル硫酸ナトリウムを含む。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、９０℃で最大１５分接触させることによって実行される。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、プロテイナーゼＫと、５６℃で最大１時間接触させることによって実行される。他の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、プロテイナーゼＫと、５６℃で最大１６〜１８時間接触させることによって実行される。

一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、１０〜２０μＬ以下である。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、４００ｎｇ以下のゲノムＤＮＡが溶出される。他の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、約１００ｎｇから約４００ｎｇのゲノムＤＮＡが溶出される。一部の実施形態において、本方法は、アダプター配列を、複数のアンプリコンの末端にライゲートすることをさらに含む。アダプター配列は、Ｐ５アダプター、Ｐ７アダプター、Ｐ１アダプター、Ａアダプター、またはＩｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ（商標）バーコードアダプターであり得る。加えて、または代替として、一部の実施形態において、本方法は、１つまたは複数のベイト配列を、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズすることをさらに含む。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、少なくとも１つの変異は、塩基の変化、遺伝子欠失および遺伝子重複から選択される。加えて、または代替として、一部の実施形態において、少なくとも１つの変異は、嚢胞性線維症に関連しており、表２に列挙された１つまたは複数の変異を包含していてもよい。

上記実施形態のいずれかにおいて、乾燥生体液サンプルは、嚢胞性線維症の症状を示す、または嚢胞性線維症の家族歴もしくはＣＦＴＲ変異を有する個体から得られる。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、嚢胞性線維症または少なくとも１つのＣＦＴＲ変異を有する産婦人科の患者の男性パートナーから得られる。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、複数の標的セグメントは、一緒になって、ＣＦＴＲ遺伝子の全てのコード領域および非コード領域にまたがる。一部の実施形態において、複数の標的セグメントはさらに、ＣＦＴＲ遺伝子の第１のエクソンのすぐ上流のプロモーター領域の約１０００ヌクレオチドにまたがる。一部の実施形態において、複数の標的セグメントはさらに、ＣＦＴＲ遺伝子のすぐ下流の約２００から３５０ヌクレオチドにまたがる。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、ハイスループット大規模並列シーケンシングは、パイロシーケンシング、可逆的ダイターミネーターシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ヘリオスコープ単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、またはＳＭＲＴ（商標）シーケンシングを使用して実行される。特定の実施形態において、ハイスループット大規模並列シーケンシングは、読み取り深度アプローチを含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、複数のアンプリコンは、固有のインデックス配列をさらに含む。

別の態様において、本発明の開示は、サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成することを含み、サンプルＣＦＴＲ核酸は、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫによって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから抽出される、方法を提供する。さらなる実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸中の少なくとも１つの変異は、ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して検出される。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントは、参照ＣＦＴＲヌクレオチド配列の対応する領域と比較して、少なくとも１つの変更を含む。特定の実施形態において、参照ＣＦＴＲヌクレオチド配列は、野生型ＣＦＴＲ核酸配列を含む。

一態様において、本発明の開示は、抗嚢胞性線維症治療剤での処置のために、嚢胞性線維症の症状を示す患者、または嚢胞性線維症のリスクがある患者を選択するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、患者の乾燥生体液サンプルを溶出させることであって、乾燥生体液サンプルは、サンプルＣＦＴＲ核酸を含む、溶出させること；（ｂ）サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成すること；（ｃ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、ライブラリー中のアンプリコンの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を検出すること；および（ｄ）抗嚢胞性線維症治療剤での処置のために、患者を選択することを含む、方法を提供する。乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血であってもよい。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスである。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。一部の実施形態において、患者は、ＣＦＴＲ遺伝子中に１つまたは複数の変異を有しており、表２に列挙された１つまたは複数の変異を包含していてもよい。

上記実施形態のいずれかにおいて、抗嚢胞性線維症治療剤は、ペニシリン、アモキシリン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、アミノグリコシド、コリスチン、アムシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン〔Betamethosone diproprionate〕、クロベタゾール、クロコルトロン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、デュタステライド、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、フルランドレノリド、ヒドロフルメチアジド、アセクロフェナク、アセメタシン、アスピリン、セレコキシブ、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、ジクロフェナク、エトドラク、エトリコキシブ、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、去痰薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、デキストロメトルファン、高張食塩水、ドルナーゼアルファ、粘液溶解剤、膵酵素、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、および胃酸を低減するサプリメントからなる群から選択される１種または複数の薬剤である。

別の態様において、本発明の開示は、個体において、嚢胞性線維症に罹患していること、または嚢胞性線維症の保因者であることに関する遺伝学的基準を検出するための方法であって、（ａ）個体から得られたＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントを増幅することによって、アンプリコンライブラリーを生成することであって、サンプルＣＦＴＲ核酸は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから抽出される、生成すること；（ｂ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、アンプリコンライブラリー中のアンプリコンをシーケンシングすること、および（ｃ）ＣＦＴＲ核酸の標的セグメントの１つまたは複数のヌクレオチド配列が嚢胞性線維症に関連する変異を含む場合、嚢胞性線維症に罹患していること、または嚢胞性線維症の保因者であることに関する遺伝学的基準を検出することを含む、方法を提供する。

乾燥生体液サンプル中のサンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するためのキットであって、皮膚を穿刺するツール、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、およびプロテイナーゼＫを含み、少なくとも１つの変異は、表２に列挙された１つまたは複数のＣＦＴＲ変異を含む、キットも本明細書で提供される。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、キットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする１つまたは複数のプライマー対をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする１つまたは複数のベイト配列をさらに含む。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。

本発明の技術のキットの上記実施形態のいずれかにおいて、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。

図１は、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）自動抽出プラットフォーム上のＤＮＡ調査キットを使用した、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップからの１つのチップの抽出によるＤＮＡ収量と二重のチップの抽出によるＤＮＡ収量との比較を示す。二重のチップの抽出の場合、同じ患者からの２つの個々のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップから溶出させた溶解生成物を一緒に合わせた。図１から、二重のチップの抽出は、平均して、ＤＮＡ収量の２倍の増加をもたらすことが実証される。 図２は、嚢胞性線維症拡張パネル（ＣＦｖａｎｔａｇｅ（登録商標）拡張スクリーン）上の、カバーされたＣＦＴＲ標的領域（またはホットスポット）当たりの読み取りカバー度を示す。図２は、搭載された全ての３８４種のサンプルの実行で（すなわち試料が、全収容能力をもって実行されたプレート上で実行され、すなわち、３７７種の操作サンプル（Ｏｐｓ）および７種のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップサンプルであった）、全ての７種のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ試料が、全てのカバーされたＣＦＴＲ標的領域にわたり最小のＱＣ基準を超えることを実証する。

本発明の開示は、嚢胞性線維症の症状を示す患者、または嚢胞性線維症のリスクがある患者が、１種または複数の抗嚢胞性線維症治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法を提供する。これらの方法は、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプルにおける、遺伝性の嚢胞性線維症に関連する変異を検出することに基づく。本方法の実施において使用するためのキットも提供される。

定義
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明の技術が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

数値への言及における用語「約」は、本明細書で使用される場合、一般的に、別段の指定がない限り、または文脈からそうではないことが明白でない限り、その数値のいずれかの方向で（それより大きいかまたはそれより小さい方向で）１％〜１０％の範囲内に入る数値を包含すると解釈される。

用語「アダプター」は、別の分子への付着を容易にするために核酸配列の末端にライゲートするのに使用できる、短い化学合成された核酸配列を指す。アダプターは、一本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよい。アダプターは、ＰＣＲ増幅またはシーケンシングに有用な短い（典型的には５０塩基対未満の）配列を取り込んでいてもよい。

対象への治療剤または薬物の「投与」は、本明細書で使用される場合、化合物を、その意図した機能を発揮させるために対象に導入または送達するあらゆる経路を包含する。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、または局所などのあらゆる好適な経路によって行うことができる。投与は、自己投与および他者による投与を包含する。

遺伝子または遺伝子産物（例えば、マーカー遺伝子または遺伝子産物）の「変更」は、本明細書で使用される場合、遺伝子または遺伝子産物内の１つまたは複数の変異、例えば、正常なまたは野生型遺伝子と比較して遺伝子または遺伝子産物の量または活性に影響を与える変異の存在を指す。遺伝子の変更は、罹患した組織または細胞における遺伝子または遺伝子産物の量、構造、および／または活性において、正常なまたは健康な組織または細胞（例えば、対照）におけるその量、構造、および／または活性と比較して変化をもたらす可能性がある。例えば、嚢胞性線維症に関連する変更としては、罹患した組織または細胞中の膜結合型タンパク質「嚢胞性線維症膜貫通制御因子」（または「ＣＦＴＲ」）をコードする遺伝子の、正常な、健康な組織または細胞内で観察されたものと比較して、変更されたヌクレオチド配列（例えば、変異）、アミノ酸配列、染色体転移、染色体内の逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性を挙げることができる。例示的な変異としては、これらに限定されないが、点変異（例えば、サイレント、ミスセンス、またはナンセンス）、欠失、挿入、転位、連鎖変異、重複、転移、染色体間および染色体内再編成が挙げられる。変異は、遺伝子のコードまたは非コード領域中に存在していてもよい。特定の実施形態において、変更は、表現型、例えば、嚢胞性線維症に関連する表現型と関連する。

核酸配列に関する用語「増幅する」または「増幅」は、本明細書で使用される場合、サンプル中の核酸配列の集団としてあるものを増加させる方法を指す。増幅反応においてインビトロで生成した特定の標的核酸配列のコピーは、「アンプリコン」または「増幅生成物」と呼ばれる。増幅は、指数関数的であってもよいし、または一次関数的であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡなど）であってもよいし、またはＲＮＡであってもよい。後述される例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した増幅に関するが、例えば等温法、ローリングサークル方法などの多数の他の方法が当業者周知である。当業者は、これらの他の方法が、ＰＣＲ方法の代わりに、またはそれと一緒に使用できることを理解するであろう。例えば、Ｓａｉｋｉ，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ” ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ １９９０，ｐｐ １３−２０；Ｗｈａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４（２００１）を参照されたい。

「ベイト」は、本明細書で使用される場合、シーケンシングのために標的核酸配列を検索するハイブリッド捕捉試薬の一種である。ベイトは、標的核酸にハイブリダイズすることができ（例えば、それに相補的であり）、それにより標的核酸の捕捉を可能にする核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。一実施形態において、ベイトは、ＲＮＡ分子（例えば、天然に存在するまたは改変されたＲＮＡ分子）；ＤＮＡ分子（例えば、天然に存在するまたは改変されたＤＮＡ分子）、またはそれらの組合せである。他の実施形態において、ベイトとしては、結合性の実体が挙げられ、例えば親和性タグであり、それは例えば結合性の実体に結合することによって、ベイトとベイトにハイブリダイズした核酸とによって形成されたハイブリッドの捕捉および分離を可能にするものである。一実施形態において、ベイトは、液相ハイブリダイゼーションに好適である。

「ベイトのセット」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のベイト分子を指す。

用語「保因者の状態」または「嚢胞性線維症の保因者」は、本明細書で使用される場合、嚢胞性線維症に関連する変異ＣＦＴＲ核酸配列を有するＣＦＴＲ対立遺伝子、および変異ＣＦＴＲ核酸配列ではない第２の対立遺伝子を保有する人を意味する。嚢胞性線維症は、「常染色体劣性」疾患であり、これは、変異が、疾患に関連しない対立遺伝子とヘテロ接合型の状態で存在する場合、表現型の作用をほとんど生じないが、人がホモ接合型または複合ヘテロ接合体である場合、すなわち両方のＣＦＴＲ対立遺伝子が変異ＣＦＴＲ核酸配列である場合、「疾患の状態」を生じることを意味する。

「ＣＦＴＲ核酸」は、本明細書で使用される場合、ＣＦＴＲの遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡの配列またはこのようなＣＦＴＲ配列の一部を含有する核酸を指す。ＣＦＴＲ核酸は、ＣＦＴＲコード領域を含有していてもよい。ＣＦＴＲ核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の一本鎖のみが、増幅および／またはシーケンシングされる。一部の実施形態において、二本鎖ＣＦＴＲのＤＮＡの両方の鎖が、増幅およびシーケンシングされる。ＣＦＴＲ核酸は、生体サンプル中に存在していてもよいし、またはＣＦＴＲ核酸は、生体サンプルから単離されてもよい。

用語「ＣＦＴＲプロモーター領域」は、本明細書で使用される場合、翻訳開始部位から上流の少なくとも最初の２５０ヌクレオチド（ｎｔ）を表すＣＦＴＲ遺伝子のセグメントを指す。他の実施形態において、プロモーター領域は、開始コドンのすぐ上流の配列の、最初の２５０ｎｔ、最初の３００ｎｔ、最初の３５０ｎｔ、最初の４００ｎｔ、最初の４５０ｎｔ、最初の５００ｎｔ、最初の１ｋｂ、最初の５ｋｂ、最初の１０ｋｂ、最初の１５ｋｂ、最初の２０ｋｂ、最初の２１ｋｂ、または最初の２２ｋｂを包含し得る。プロモーター領域の欠失は、本明細書において定義される場合、ＣＦＴＲ遺伝子の全てではないが、下流のエクソン／イントロンの欠失に付随して起こる場合がある。一部の実施形態において、ＣＦＴＲプロモーター領域および下流のＣＦＴＲ遺伝子配列を含む、同調して起こる欠失は、約１０個未満のエクソンを含み、より典型的には、５個未満のエクソンを含む。ＣＦＴＲプロモーター領域の欠失または重複は、欠失または重複した配列の端部にあるプライマーを使用して検出することができる。特定の実施形態において、プロモーターの欠失または重複は、少なくとも１つまたはそれより多くのヌクレオチド、少なくとも４つまたはそれより多くのヌクレオチド、少なくとも５つまたはそれより多くのヌクレオチド、少なくとも８つまたはそれより多くのヌクレオチド、または少なくとも１２個またはそれより多くのヌクレオチドのセグメントを含む。

用語「コード配列」は、本明細書で使用される場合、転写および／または翻訳されて、対応するｍＲＮＡ、および／またはポリペプチドもしくはそれらの断片を産生することができる、核酸もしくはその相補物の配列、またはそれらの一部を意味する。コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未成熟の一次ＲＮＡ転写物中にエクソンを包含し、エクソンは、細胞の生化学的機構によって一体化されて、成熟ｍＲＮＡが提供される。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補物であり、コード配列は、それから推測することができる。用語「非コード配列」は、本明細書で使用される場合、インビボでアミノ酸に転写されない、またはｔＲＮＡがアミノ酸を配置するように相互作用しないかもしくはアミノ酸を配置するように試みない、核酸もしくはその相補物の配列またはそれらの一部を意味する。非コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未成熟一次ＲＮＡ転写物中のイントロン配列と、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子関連配列との両方を包含する。

用語「相補物」、「相補的」または「相補性」は、本明細書でポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）の言及において使用される場合、ワトソン／クリックの塩基対合ルールを指す。核酸配列の相補物は、本明細書で使用される場合、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対合するように核酸配列と並べた場合に「逆平行会合」の状態であるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。本明細書に記載される核酸中に、天然に存在する核酸に一般的に見出されない特定の塩基が包含されていてもよい。そのようなものとしては、例えば、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。相補性は必ずしも完全でなくてもよく、安定な二重鎖は、ミスマッチした塩基対、変性性の、またはマッチしない塩基を含有する場合もある。核酸技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、ミスマッチした塩基対のイオン強度および発生率などの可変値の数を経験的に検討して、二重鎖の安定性を決定することができる。また相補配列は、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列またはその相補配列であってもよいし、ｃＤＮＡであってもよい。

用語「実質的に相補的な」は、本明細書で使用される場合、２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。当業者は、実質的に相補的な配列が、必ずしもそれらの全長にわたりハイブリダイズしていなくてもよいことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする隣接する塩基配列に対して３’または５’に位置する標的配列にハイブリダイズしない隣接する塩基配列を含んでいてもよい。

「対照」または「参照」は、本明細書で使用される場合、比較目的のために実験で使用される代替サンプルである。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。「対照核酸サンプル」または「参照核酸サンプル」は、本明細書で使用される場合、対照または参照サンプルからの核酸分子を指す。特定の実施形態において、参照または対照核酸サンプルは、野生型または変異していないＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。特定の実施形態において、参照核酸サンプルは、精製または単離される（例えば、参照核酸サンプルが、その天然の状態から取り出される）。他の実施形態において、参照核酸サンプルは、同じまたは異なる対象からの、罹患していないサンプル、例えば、血液対照、組織対照、または他のあらゆる罹患していないサンプル由来である。

「カバー度の深度」は、所与の位置にマッピングされるシーケンシングの読み取りからのヌクレオチドの数を指す。

用語「欠失」は、本明細書で使用される場合、核酸から１つまたは複数のヌクレオチドを除去する変異を包含する。逆に言えば、用語「重複」は、核酸中のこの配列のすぐ隣に、同一な配列の１つまたは複数のヌクレオチドを挿入する変異を指す。一部の実施形態において、欠失または重複は、４つまたはそれより多くのヌクレオチドのセグメントを含む。

用語「検出すること」は、本明細書で使用される場合、サンプル中の目的の核酸における変異または変更の存在を決定することを指す。検出は、１００％の感度をもたらすための方法を必要としない。

用語「量」または「遺伝子量」は、サンプル中に存在する遺伝子または遺伝子の一部のコピー数を指す。

用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、所望の治療および／または予防作用を達成するのに十分な量を指し、例えば、嚢胞性線維症の発症の予防、または嚢胞性線維症に関連する１つまたは複数の症状における改善をもたらす量を指す。治療または予防的適用の状況において、対象に投与される治療剤の量は、疾患のタイプおよび重症度、ならびに個体の特徴、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物耐性によって決まる。またこのような量は、疾患の程度、重症度およびタイプによっても決まる。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な投薬量を決定できるであろう。治療薬物または薬剤の「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、嚢胞性線維症などの遺伝性障害の生理学的作用が最低限でも改善されるレベルを意味する。治療有効量は、１回または複数の投与で与えることができる。

用語「抽出」または「単離」は、本明細書で使用される場合、サンプル中に存在する他の細胞性物質から核酸を分離すると解釈されるあらゆる作用を指す。抽出または単離という用語は、機械的または化学的な溶解、界面活性物質またはプロテアーゼの添加、または他の細胞性物質の沈殿および除去を包含する。

用語「端部にある」は、本明細書でプライマーに関して使用される場合、プライマーが、標的上の増幅しようとする関心領域に隣接する標的核酸にハイブリダイズすることを意味する。最適なプライマーは、好適なＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオチドがプライマーの３’末端に付加できるように、標的二本鎖ＤＮＡ分子の各鎖に１つずつ、関心領域から５’でハイブリダイズするプライマー対であることを、当業者は理解するであろう。ＣＦＴＲエクソンの端部にあるプライマーは、一般的に、エクソン配列にはアニールしないが、エクソンに隣接する配列（例えば、イントロン配列）にアニールするように設計される。しかしながら、一部の実施形態において、増幅プライマーは、エクソン配列にアニールするように設計されていてもよい。

「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡの産生に必要な調節およびコード配列を含むＤＮＡ配列を指し、このようなＲＮＡは、非コード機能を有していてもよいし（例えば、リボソームまたはトランスファーＲＮＡ）、またはポリペプチドまたはポリペプチド前駆体を包含していてもよい。ＲＮＡまたはポリペプチドは、全長コード配列によってコードされていてもよいし、または所望の活性または機能が保持される限り、コード配列のいずれの部分によってコードされていてもよい。核酸の配列はＤＮＡの形態で示すことができるが、対応するＲＮＡ配列は、チミンがウラシルで置き換えられた、すなわち「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられた類似の配列を有することを、当業者は認識している。

個体における「嚢胞性線維症に関する遺伝学的基準」は、個体の遺伝子型、特にそれらのＣＦＴＲ核酸の遺伝子型、および個体が嚢胞性線維症に寄与する少なくとも１つのＣＦＴＲ変異を有するかどうかを指す。用語「野生型」は、本明細書でＣＦＴＲ遺伝子またはそれらの遺伝子座に関して使用される場合、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座番号Ｍ５８４７８（ＨＵＭＣＦＴＣ）、ＡＣ０００１１１およびＡＣ００００６１に見出されるＣＦＴＲ遺伝子配列を指す。ＣＦＴＲ遺伝子に関するｃＤＮＡは、Ａｕｄｒｅｚｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２３（４），３４３−３５７（２００４）および／またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４９２．３に見出すことができる。「稀なＣＦＴＲ変異」は、嚢胞性線維症患者の０．１％未満に存在するＣＦＴＲ遺伝子配列中の変異である。「プライベートなＣＦＴＲ変異」は、一つの家族または小さいグループでのみ見出されるＣＦＴＲ遺伝子配列中の変異である。「一般的なＣＦＴＲ変異」は、嚢胞性線維症に関連しており、嚢胞性線維症を有する患者の少なくとも０．１％に存在するＣＦＴＲ遺伝子配列中の変異である。

用語「ハイブリダイズする」は、本明細書で使用される場合、２つの実質的に相補的な（少なくとも１４から２５ヌクレオチドのストレッチにわたり、少なくとも約６５％相補的な、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％相補的な）核酸鎖が適切にストリンジェントな条件下で互いにアニールして、相補的塩基対間の水素結合の形成を介して二重鎖またはヘテロ二重鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは、典型的には、さらに好ましくは、プローブの長さの核酸分子、好ましくは１５〜１００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１８〜５０ヌクレオチドの長さの核酸分子を用いて実行される。核酸ハイブリダイゼーション技術は当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、および形成されたハイブリッドの熱融点（Ｔ_ｍ）のような要因の影響を受ける。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が、安定してハイブリダイズするが、より低い相補性を有するものはハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推測し調整するかを理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメーターの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。一部の実施形態において、特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で起こる。標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズする」ことになる。

用語「個体」、「患者」、または「対象」は、本明細書で使用される場合、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであり得る。好ましい実施形態において、個体、患者または対象は、ヒトである。

用語「ライブラリー」は、本明細書で使用される場合、核酸配列の集合体、例えば、ゲノム全体、サブゲノム断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、またはそれらの組合せ由来の核酸の集合体を指す。一実施形態において、ライブラリー核酸配列の一部または全ては、アダプター配列を含む。アダプター配列は、一方または両方の末端に配置されていてもよい。アダプター配列は、例えば、シーケンシング方法（例えば、ＮＧＳ方法）、増幅、逆転写、またはベクターへのクローニングにとって有用であり得る。

ライブラリーは、核酸配列、例えば、標的核酸配列（例えば、ＣＦＴＲ核酸配列）、参照核酸配列、またはそれらの組合せの集合体を含んでいてもよい。一部の実施形態において、ライブラリーの核酸配列は、単一の対象由来であってもよい。他の実施形態において、ライブラリーは、１人より多くの対象（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０人またはそれより多くの対象）からの核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態において、異なる対象からの２つまたはそれより多くのライブラリーを組み合わせて、１人より多くの対象からの核酸配列を有するライブラリーを形成してもよい。一実施形態において、対象は、嚢胞性線維症を有するかまたは有するリスクがあるヒトである。

「ライブラリー核酸配列」は、ライブラリーのメンバーである核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せを指す。典型的には、ライブラリー核酸配列は、ＤＮＡ分子、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。一部の実施形態において、ライブラリー核酸配列は、断片化された、例えば、剪断された、または酵素によって調製されたゲノムＤＮＡである。特定の実施形態において、ライブラリー核酸配列は、対象からの配列、および対象由来ではない配列、例えば、アダプター配列、プライマー配列、または同定を可能にする他の配列、例えば「バーコード」配列を含む。一部の実施形態において、ライブラリーは、標的核酸配列、例えばサンプルＣＦＴＲ核酸配列の複数のセグメントに対応するアンプリコンを含む。

用語「マルチプレックスＰＣＲ」は、本明細書で使用される場合、別個のプライマー対を使用して重合開始される２種またはそれより多くの生成物の増幅を指す。

「次世代シーケンシングまたはＮＧＳ」は、本明細書で使用される場合、個々の核酸分子のヌクレオチド配列を決定するか（例えば、単一分子シーケンシングで）、またはハイスループットの並列様式で個々の核酸分子につきクローン的に拡張された代用データ〔proxies〕のヌクレオチド配列を決定するか（例えば、１０^３個より多く、１０^４個、１０^５個またはそれより多くの分子が同時にシーケンシングされる）のいずれかの、あらゆるシーケンシング方法を指す。一実施形態において、ライブラリー中の核酸種の相対的な存在度は、シーケンシング実験によって作成されたデータにおけるそれらの同族配列の相対的な発生数を数えることによって推測することができる。次世代シーケンシング方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ１１：３１−４６（２０１０）で説明されている。

「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、主として規定の間隔の同一な単量体単位で構成される骨格上に核酸塩基の配列を有する分子を指す。塩基は、それらがオリゴヌクレオチドの塩基に相補的な塩基配列を有する核酸と結合できるような様式で骨格上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の骨格を有する。２’位にヒドロキシル基を有さないオリゴデオキシリボヌクレオチドと、２’位にヒドロキシル基を有するオリゴリボヌクレオチドとは、区別することができる。またオリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えばアリル基で置き換えられた誘導体を包含する場合もある。プライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも約１０〜１５ヌクレオチドの長さ、または最大約７０、１００、１１０、１５０または２００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５から２５ヌクレオチドの長さである。特定の標的核酸を特異的に増幅したり、または特異的に検出したりするためのプライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、一般的に、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。

用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、標的核酸鎖に相補的なプライマーの伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、適切な緩衝液（「緩衝液」は、ｐＨ、イオン強度、補因子などを包含する）中において好適な温度で、異なるヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼの存在下に配置された場合、核酸配列合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーのヌクレオチドの１つまたは複数は、例えばメチル基、ビオチンもしくはジゴキシゲニン部分、蛍光性タグの付加によって、または放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾されていてもよい。プライマー配列は、必ずしもテンプレートの正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド断片が、プライマーの５’末端に付着されており、プライマー配列の残りが、鎖に実質的に相補的であってもよい。本明細書で使用されるプライマーという用語は、合成することができるプライマーの全ての形態、例えばペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオエートで修飾されたプライマー、標識されたプライマーなどを包含する。用語「フォワードプライマー」は、本明細書で使用される場合、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のアンチセンス鎖にアニールするプライマーを意味する。「リバースプライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニールする。

プライマーは、典型的には、少なくとも１０、１５、１８、または３０ヌクレオチドの長さ、または最大約１００、１１０、１２５、または２００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、プライマーは、好ましくは約１５から約６０ヌクレオチドの間の長さであり、最も好ましくは約２５から約４０ヌクレオチドの間の長さである。一部の実施形態において、プライマーは、１５から３５ヌクレオチドの長さである。最適なハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅にとって標準的な長さはない。特定のプライマーの適用にとって最適な長さは、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＦＯＲ ＤＮＡ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，（１９８９）に記載される方式で容易に決定することができる。

用語「プライマー対」は、本明細書で使用される場合、目的の核酸の所与の領域を増幅するのに一緒に使用できるフォワードプライマーとリバースプライマーとの対（すなわち、左側のプライマーと右側のプライマーとの対）を指す。

「プローブ」は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションを介して標的核酸と相互作用する核酸を指す。プローブは、標的核酸配列に完全に相補的であってもよいし、または部分的に相補的であってもよい。相補性のレベルは、一般的にプローブの機能に基づく多くの要因によって決まる。プローブは、標識されていてもよいし、もしくは非標識でもよく、または当技術分野において周知の様々な方法のいずれかで修飾されていてもよい。プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。プローブは、オリゴヌクレオチド、人工染色体、断片化した人工染色体、ゲノム核酸、断片化したゲノム核酸、ＲＮＡ、組換え核酸、断片化した組換え核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、環状の複素環のオリゴマー、または核酸のコンジュゲートであり得る。プローブは、修飾された核酸塩基、修飾された糖部分、および修飾されたインターヌクレオチド結合を含んでいてもよい。プローブは、典型的には、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００ヌクレオチドの長さであるか、またはそれより長い。

用語「サンプル」は、本明細書で使用される場合、患者から得られた臨床サンプルを指す。好ましい実施形態において、サンプルは、対象から収集される組織または体液などの生物学的な源から得られる（すなわち、「生体サンプル」）。サンプル源としては、これらに限定されないが、粘液、痰（処理済みまたは未処理）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、気管支洗浄液（ＢＷ）、血液、体液、髄液（ＣＳＦ）、尿、血漿、血清、または組織（例えば、生検材料）が挙げられる。好ましいサンプル源としては、血漿、血清、または全血が挙げられる。

「サンプルＣＦＴＲ核酸」は、生体サンプル中の、または生体サンプルから単離されたＣＦＴＲ核酸である。核酸を解離させる、またはそれ以外の方法で核酸を検出に利用できるようにするための処理方法は当技術分野において周知であり、そのようなものとしては、核酸操作の工程、例えば生体サンプルからのＤＮＡまたはＲＮＡ抽出、および生体サンプルからＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを調製することを挙げることができる。生体サンプルは、体液または組織サンプルであり得る。一部の実施形態において、生体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、便、表皮サンプル、膣サンプル、皮膚サンプル、頬スワブ、精液、羊水、培養細胞、骨髄サンプルおよび／または絨毛膜絨毛、培養細胞などを含んでいてもよい。一部の実施形態において、生体サンプルは、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスによって収集された乾燥生体液サンプルであり得る。また固定または凍結した組織も、使用することができる。１０〜１５ｍｌの羊水、２つのＴ−２５フラスコ中の８０〜１００％のコンフルエントな培養細胞、および２５ｍｇの絨毛膜絨毛が、処理に有用なサンプル量である。

用語「感度」は、本明細書で本発明の技術の方法への言及において使用される場合、配列のヘテロジニアスな集団中で予め選択された配列バリアントを検出する方法の能力の尺度である。予め選択された配列バリアントがサンプル中の配列の少なくともＦ％として存在するサンプルと仮定して、方法が、予め選択されたＣ％の信頼性、時間のＳ％で予め選択された配列を検出することができる場合、その方法は、Ｆ％のバリアントに対してＳ％の感度を有する。一例として、予め選択されたバリアント配列がサンプル中の配列の少なくとも５％として存在するサンプルと仮定して、方法が、予め選択された９９％の信頼性、１０回のうち９回（Ｆ＝５％；Ｃ＝９９％；Ｓ＝９０％）で予め選択された配列を検出することができる場合、その方法は、５％のバリアントに対して９０％の感度を有する。例示的な感度としては、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、および９９％が挙げられる。

「シーケンシング深度」または「読み取り深度」は、本明細書で使用される場合、配列がシーケンシングされた回数（シーケンシングの深度）を指す。一例として、読み取り深度は、複数のシーケンシング実行の結果を並べ、特定のサイズ（例えば、１００ｂｐ）のオーバーラップしていないウィンドウ中の読み取りの開始位置を数えることによって決定することができる。コピー数多型は、当技術分野において公知の方法、例えば、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１９（９）：１５８６−１５９２（２００９）；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０：８０（２００９）；またはＭｅｄｖｅｄｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（１１ Ｓｕｐｐｌ）：５１３−２０（２００９）に記載される方法を使用して、読み取り深度に基づき決定することができる。このタイプの方法および分析の使用は、「読み取り深度アプローチ」と称される。

用語「特異的な」は、本明細書でオリゴヌクレオチドプライマーへの言及において使用される場合、オリゴヌクレオチドと核酸とを並べたときに、プライマーのヌクレオチド配列が、増幅しようとする核酸の一部と少なくとも１２塩基の配列同一性を有することを意味する。核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で、目的の標的にハイブリダイズできるが、目的ではない核酸に実質的にハイブリダイズしないものである。より高いレベルの配列同一性が好ましく、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも８５〜９５％であり、より好ましくは、少なくとも９８％の配列同一性である。配列同一性は、市販のコンピュータープログラムを、当技術分野において周知のアルゴリズムを採用するデフォルト設定で使用して決定することができる。「高い配列同一性」を有する配列は、本明細書で使用される場合、並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約５０％、好ましくは並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約６０％、より好ましくは並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約７５％に、同一なヌクレオチドを有する。

「特異性」は、本明細書で使用される場合、実際に存在する予め選択された配列バリアントを、シーケンシングアーティファクトまたは他の密接に関連した配列から区別する方法の能力の尺度である。これは、偽陽性検出を回避する能力である。偽陽性検出は、サンプル調製中に目的の配列に導入されたエラー、シーケンシングのエラー、または偽遺伝子もしくは遺伝子ファミリーのメンバーのような密接に関連した配列の不注意なシーケンシングに起因する可能性がある。Ｘ_Ｔｒｕｅ種の配列が実際にバリアントであり、Ｘ_{Ｎｏｔ ｔｒｕｅ}種が実際にバリアントではないＮ_{Ｔｏｔａｌ}種の配列のサンプルセットに適用されたとき、方法が、実際にバリアントではないものの少なくともＸ％をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、Ｘ％の特異性を有する。例えば、５００種の配列が実際にバリアントであり、５００種が実際にバリアントではない１，０００種の配列のサンプルセットに適用されたとき、方法が、５００種の実際にバリアント配列ではないものの９０％をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、９０％の特異性を有する。例示的な特異性としては、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、および９９％が挙げられる。

用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用される場合、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの超音波破砕したサケ精子ＤＮＡ、および５×デンハルト溶液中での、４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた、４５℃での洗浄；および０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた、４５℃での洗浄と少なくとも同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す。別の例において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０個の隣接するヌクレオチドのストレッチにわたり２つより多くの塩基が異なる２つの核酸のハイブリダイゼーションを許容しないはずである。

用語「標的核酸」または「標的配列」または「標的セグメント」は、本明細書で使用される場合、分析しようとするサンプル中の、検出および／または定量化しようとする目的の核酸配列を指す。標的核酸は、染色体のセグメント、遺伝子間配列を有するまたは有さない完全な遺伝子、遺伝子間配列を有するまたは有さない遺伝子のセグメントもしくは一部、またはプローブまたはプライマーが設計される核酸の配列で構成されていてもよい。標的核酸としては、野生型配列、変異、欠失、挿入もしくは重複、タンデムリピートエレメント、目的の遺伝子、目的の遺伝子の領域、またはそれらのあらゆる上流もしくは下流の領域を挙げることができる。標的核酸は、特定の遺伝子の代替配列または対立遺伝子を表す場合もある。標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡから誘導されたものでもよい。

用語「処置する」、「処置すること」または「処置」は、本明細書で使用される場合、有益なまたは所望の臨床結果、例えば、これらに限定されないが、疾患または状態の１つまたは複数の徴候または症状の軽減または改善（例えば、部分的または完全な後退）、疾患の程度を低減すること、疾患の安定した状態（すなわち、悪化しないこと、疾患の安定を達成すること）、疾患の状態の改善または一時的緩和、進行速度または進行時間を低減すること、および寛解（部分寛解または完全寛解のいずれも）などを達成するための行為を指す。

本発明の技術の方法で採用されるマイクロサンプリングデバイス
従来の乾燥血液のスポット技術は、不正確なサンプル体積や、一定のサンプル粘度への依存（すなわち、サンプルがサンプルカード上に均一に塗り広げられるという見込み）などの多数の欠点が付随する。カード上に等しい体積サンプルが投与される場合、粘度が一定であれば、血液スポットの直径は一定のままになる。しかしながら、粘度は、血液中のヘマトクリット（ＨＣＴ）またはパック細胞容積（ＰＣＶ）レベルが異なるために、血液サンプル間で顕著に変動する。高いヘマトクリットレベルを有するサンプルは、血液スポット紙上により小さい直径のスポットを形成することから、サンプリングしたスポットの固定した直径内に異なる濃度の血液をもたらす。ＰＣＶレベルは、スポット直径において約４５％の変動を示すと考えられる。内部標準はスポットされた血液上に噴霧されるため、これは、定量化において４５％のエラーを引き起こす可能性がある。本明細書で開示された方法で採用されるマイクロサンプリングデバイスは、より正確な血液体積を回収できること、ヘマトクリットの偏りがないこと、および実験室での処理のために標準的な液体を取り扱う者でも簡単に自動化できる能力などの数々の利点を付与する。

加えて、従来の血液スポット技術は、開示されたマイクロサンプリングデバイスと比べて比較的大量の血液を必要とする。乾燥血液スポットは、一般的に、スポット１つ当たり５０〜７５μｌを必要とするが、マイクロサンプリングデバイスは、およそ２０μｌから結果を得ることができる。乾燥血液スポットはしばしば、ウイルス負荷量を検出する場合、血漿などの他のサンプルタイプと比較して性能が一定しない問題を有すること（Ｐａｎｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９５：４８（ｅ５４７５）（２０１６））、さらに、特定のタイプの評価（例えば、光学密度）の場合、乾燥血液スポットの体積を、血清などの他のサンプルタイプと比較して著しく多くする必要性がある場合があること（Ｂｒａｎｄａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５７：９８−１０２（２０１３））が当技術分野において認識されている。実際に、抗レトロウイルス剤療法を受けているＨＩＶ患者においてウイルス負荷量および処置の失敗を検出するための乾燥血液スポットと血漿スポットの両方のスクリーニングを使用したところ、どちらも高い割合の偽陽性を生じたことが見出された（Ｓａｗａｄｏｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２（１１）：３８７８−８３（２０１４））。

本発明の技術の方法において有用なマイクロサンプリングデバイスは、遠位端および近位端を有する吸収性チップを含む。吸収性チップの遠位端の幅は、近位端の幅と比較して狭い。近位端は、ホルダーに取り付けられ、それに対して遠位端は、血液などの吸収させようとする流体と接触するように設計される。マイクロサンプリングデバイスは、血液などの生体液サンプルを、容易に乾燥させ、輸送し、次いで後で分析することを可能にする。特定の実施形態において、生体液は、指先穿刺による血液である。

吸い上げ作用により、血液は吸収性チップに吸い込まれる。吸収性チップとホルダーとの間に任意選択の障壁があってもよく、それにより血液がホルダーに通過したりまたは吸い上げられたりすることを防ぐ。吸収性チップは、過量の流体が利用可能であっても、実質的に同じ体積の流体を吸い上げる材料で構成される（容量測定式の吸収性マイクロサンプリングまたはＶＡＭＳ（商標））。吸収性チップの体積は、吸収された流体の体積に影響を与える。吸収性チップのサイズおよび形状は、吸収される血液の体積および吸収の速度を調整するために、変更することができる。約７〜１５μＬ、約２０μＬ、さらには最大約３０μＬもの血液体積を受け入れることができる。サンプリング時間は、約２秒、約３秒、約５秒、または最大約１０秒であり得る。

一部の実施形態において、吸収性チップに使用される材料は、親水性である（例えば、ポリエステル）。代替として、材料は、最初のうちは疎水性であってもよく、その後、それを親水性になるように処理してもよい。疎水性マトリックスは、様々な公知の方法、例えばマトリックスのプラズマ処理または界面活性剤処理（例えば、Ｔｗｅｅｎ−４０またはＴｗｅｅｎ−８０）によって親水性にすることができる。一部の実施形態において、プラズマ処理は、ポリオレフィン、例えばポリエチレンなどの疎水性材料を親水性にするのに使用される。代替として、表面への親水性ポリマーのグラフト化、および糖などの極性または親水性分子での表面上の活性基の化学的官能化が、吸収性チップのために親水性表面を達成するのに使用することができる。また共有結合による改変も、吸収性チップの表面に極性または親水性官能基を付加するのに使用することができる。吸収性チップにとって好適な他の材料としては、焼結ガラス、焼結鋼、焼結セラミック、および焼結プラスチックポリマー、および焼結ポリエチレンが挙げられる。

一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、約２〜５秒で最大約２０μＬの血液を吸収するのに十分なサイズを有し、約５ｍｍ（０．２インチ）未満の長さ、および約２０ｍｍ^２未満の断面積、および約４ｇ／ｃｃ未満の密度を有する、親水性のポリマー性材料で作製された吸収性チップを含む。一部の実施形態において、吸収性チップは、ポリエチレンで構成され、好ましくは１〜７秒以内、より好ましくは約１〜５秒以内に約１〜２０マイクロリットルの血液を吸収するように設計される。吸収性チップは、乾燥血液、乾燥抗凝血剤または内部標準の１つまたは複数を含有していてもよい。

特定の実施形態において、吸収性チップは、約３５ｍｍ^３の体積を有し、約３秒で約１３〜１４マイクロリットルの血液を吸収し、約２．５秒で９〜１０マイクロリットルの血液を吸収し、約３８％の細孔容積を有する。他の実施形態において、吸収性チップは、約２４マイクロリットルの体積、約０．６ｇ／ｃｃの密度を有し、約２．５秒で約１０マイクロリットルの血液を吸収し、約４０％の細孔容積を有する。一部の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＵＳ２０１３／０１１６５９７に記載されるようなＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。

吸収性チップは、狭く丸い遠位端を有する円錐台に似た外形に成形されてもよい。一部の実施形態において、ホルダーは、吸収性チップの中心内部の凹部にはまり、吸収性チップとホルダーの縦軸に沿って伸びる円筒状の柱を有する。吸収性チップの円錐型の形状は、サンプルを迅速かつ均一に吸い上げることを助ける。

ホルダーは、ピペットとの使用に適合させることができる。一部の実施形態において、管状の円錐型の形状のホルダーが好ましく、吸収性チップは、ホルダーの狭い末端上にある。ホルダーのより幅広な逆の末端は、閉じていてもよいし、または開いていて中空であってもよく、任意選択で、ピペットチップに取り付けられるように設計されていてもよい。ホルダーは、外側に伸長するフランジを有していてもよく、このようなフランジは、ホルダー、乾燥棚または試験器具中の合わせ構造を突き合わせて、このようなホルダー、乾燥棚および試験器具中の所望の位置に吸収性チップを位置決めするのを助けるように配置される。

特定の実施形態において、ホルダーは、ピペットチップ、またはピペットチップと入れ子になるように設計された先細の管状構造を包含していてもよい。吸収性チップは、ポリエチレンで構成されていてもよく、吸収性チップとホルダーはどちらも、無菌条件下で作製されるか、または最後に滅菌される。吸収性チップは、乾燥抗凝血剤を含有していてもよい。一部の実施形態において、ホルダーは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有する。リブは、輸送のために、または吸収性チップ中の乾燥血液の抽出のために、吸収性チップが、ホルダーおよび吸収性チップが設置されている凹部の壁と接触することを防ぐように選択された高さおよび長さを有していてもよい。

少量のサンプルを吸収した後、吸収性チップを乾燥させる。一部の実施形態において、少量の血液サンプルを、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、周囲温度または室温で乾燥させる。特定の実施形態において、少量の血液サンプルを約２〜３時間乾燥させる。

乾燥は、好適な棚またはホルダー上で行ってもよいし、または好ましくは、吸収性チップおよびホルダーは、吸収性チップと乾燥容器の壁または他の可能性のある汚染物質表面との接触を最小化しながら、乾燥を促進するように設計された特殊な乾燥容器に移してもよい。乾燥容器は、乾燥を促進するために、乾燥剤を有していてもよい。また乾燥容器は、汚染を防ぐために、運送のために密封できる保護カバーを備えていてもよい。一部の実施形態において、カバーは、表面を有し、その上に、乾燥血液サンプルの源を識別し、他の関連情報を提供するために、印刷された表示が記載されていてもよい。一部の実施形態において、容器の寸法、および容器内のホルダーの相対的な位置は、ＳＢＳ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌのプレートの仕様に従うものとする。マイクロサンプリングデバイスおよび乾燥容器は、乾燥を助けるために乾燥剤と共にプラスチックバッグ中に入れてもよく、さらに、この様式で輸送されるか、または乾燥剤を除去した後に輸送されるかのいずれでもよい。

一部の実施形態において、ホルダーのより幅広な逆の末端は、中空であり、容器は、ホルダーの中空の末端にはまり、取り外し可能にかみ合う大きさの、据え付けの突出部分を有する第１の部分を有する。加えて、または代替として、容器は、第１の部分に取り外し可能に留められた第２の部分を有し、さらに、ホルダーの運送のために、ホルダーの一部を内包するように設計された凹部を有する。容器は、空気をマイクロサンプリングデバイスの吸収性チップと接触させる複数の開口部を含んでいてもよい。さらに、第１の部分は、その中にアクセスポートを有する面を有していてもよく、このような面は、ポート全体に、さらにホルダーが据え付けの突出部上にある場合はホルダー上に表示を適用できるように、十分なサイズを有し、そのように配置される。

吸収性チップは、試験場所で受け取ったら、手作業かまたは自動化手段を介するかのいずれかで、予め決定された体積の好適な緩衝液（本明細書に記載されるように）中で溶出させて、乾燥血液から目的の核酸またはタンパク質を抽出することができる。流体および／または吸収性チップの物理的なかき混ぜ技術、例えば超音波破砕またはボルテックス混合は、乾燥血液から液体サンプルマトリックスへの抽出プロセスを促進することができる。さらなる分析のためのサンプルマトリックスをさらに簡易化にするために、物理的な分離技術、例えば遠心分離、蒸発／再溶解、濃縮、沈殿、液体／液体抽出、および固相抽出を使用することができる。

各容器が複数のホルダーを内包していてもよく、その場合、各ホルダーは、その遠位端に吸収性チップを含み、中空の近位端を有する。容器は同様に、それぞれ複数のホルダーの中空の末端にはまり、取り外し可能にかみ合う大きさの複数の細長い据え付けの突出部を有する。容器の第２の部分は、容器内の別々の囲いの中に複数のホルダーのそれぞれを別々に内包するように設計された凹部を有する。特定の実施形態において、複数のホルダーのそれぞれは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有し、リブは、吸収性チップが容器の壁と接触することを防ぐように設計されている。要求に応じて、吸収性チップ中の血液の乾燥または乾燥の維持を助けるために、容器の内部に乾燥剤が入れられていてもよい。各ホルダーは、シリアルナンバーなどの、ホルダーを容器や少なくとも１つの他のホルダーと関連付ける可視的な表示を有していてもよく、シリアルナンバーの様々な部分は、関連するホルダー／吸収性チップおよびその中にホルダーを輸送する容器を示す。

核酸の抽出
一態様において、本発明の開示は、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイス（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）を用いて収集された乾燥生体液サンプルからゲノムＤＮＡを抽出するための方法を提供する。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと接触させることによって溶出される。溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含んでいてもよい。プロテイナーゼＫは、広範囲のｐＨ範囲（４〜１２）にわたり安定な広範に使用されるセリンプロテアーゼであり、最適なｐＨはｐＨ８．０である。プロテイナーゼＫ切断の優勢な部位は、ブロックされたアルファアミノ基を有する脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシル基に隣接するペプチド結合である。反応温度を３７℃から５０〜６０℃に上昇させることは、プロテイナーゼＫ活性を数倍に増加させる可能性がある。プロテイナーゼＫ活性は、０．５〜１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３Ｍ塩化グアニジニウム、１Ｍグアニジニウムチオシアネート、または４Ｍ尿素の添加によって強化することができる。

代替として、核酸の抽出のための他のプロトコールを本発明の技術の方法で使用してもよい。他の市販の核酸精製キットの例としては、Ｍｏｌｚｙｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ ＫＧ（Ｂｒｅｍｅｎ、ＤＥ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ）、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Ｄｕｅｒｅｎ、ＤＥ）、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、ＣＨ）またはＳｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ＤＥ）が挙げられる。また、支持体材料としてのポリスチレンビーズなどの使用に基づく核酸精製のための他のシステムも使用することができる。

一部の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを用いて収集された乾燥生体液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、乾燥生体液サンプル中に存在する細胞中の核タンパク質複合体を変性させることを含む。特定の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを用いて収集された乾燥生体液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、タンパク質汚染物質を除去すること、ヌクレアーゼ活性を不活性化すること、および／または乾燥生体液サンプル中に存在する生物学的および／または化学的な汚染物質を除去することを含む。

一部の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを用いて収集された乾燥生体液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、自動ＤＮＡ抽出プラットフォームを使用して実行することができる。一部の実施形態において、自動ＤＮＡ抽出プラットフォームは、ハイスループット能力を有し、例えば１サイクル当たり最大１００種の抽出能を有する。特定の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを用いて収集された乾燥生体液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、市販の自動ワークステーション、例えばＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）またはＨａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）オートメーションを使用して実行することができる。一部の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを用いて収集された乾燥生体液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、ＥＺ１ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＸＬ、ＥＺ１ Ａｄｖａｎｃｅｄ、またはＥＺ１ ＤＮＡ調査キットを備えたＢｉｏｒｏｂｏｔ（登録商標）ＥＺ１（商標）自動システムで実行される。一部の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを用いて収集された乾燥生体液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、市販の試薬キットを使用して実行される。

ＮＧＳプラットフォーム
一部の実施形態において、ハイスループットの大規模並列シーケンシングは、可逆的ダイターミネーターを用いた合成によるシーケンシングを採用する。他の実施形態において、シーケンシングは、ライゲーションによるシーケンシングを介して実行される。さらに他の実施形態において、シーケンシングは、単一分子シーケンシングである。次世代シーケンシング技術の例としては、これらに限定されないが、パイロシーケンシング、可逆的ダイターミネーターシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ヘリオスコープ単一分子シーケンシングなどが挙げられる。

Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）アンプリコンシーケンシングシステムは、ＤＮＡ複製における未改変ヌクレオチドの取り込み中の水素イオンの放出によって引き起こされるｐＨ変化を検出する、フローベースのアプローチを採用する。このシステムとの併用のために、シーケンシングライブラリーは、最初に、シーケンシングアダプターを端部に有するＤＮＡ断片を生成することによって産生される。一部の実施形態において、これらの断片は、エマルジョンＰＣＲにより粒子上でクローン的に増幅することができる。次いで増幅したテンプレートを有する粒子は、シリコン半導体シーケンシングチップ中に入れられる。複製中、チップに順次１種ずつヌクレオチドが注入され、チップの特定のマイクロウェル中でヌクレオチドがＤＮＡ分子を補完すると、それが取り込まれることになる。ポリメラーゼによってヌクレオチドがＤＮＡ分子中に取り込まれるときに、プロトンが自然に放出され、結果としてｐＨの検出可能な局所的変化が生じる。次いで、そのウェル中で溶液のｐＨが変化し、それがイオンセンサーによって検出される。テンプレート配列中にホモポリマーの反復が存在する場合、１回のサイクルで複数のヌクレオチドが取り込まれることになる。それにより、対応する数の放出された水素および比例的により多くの電子シグナルが生じる。

４５４ＴＭ ＧＳ ＦＬＸ（商標）シーケンシングシステム（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）は、ラージスケールの並列パイロシーケンシングシステムにおいて光ベースの検出手法を採用する。パイロシーケンシングは、ＤＮＡ重合、一度に１種のヌクレオチド種を付加すること、および付着したピロリン酸の放出によって放出された光により所与の配置に付加されたヌクレオチドの数を検出し定量化することを使用する。４５４（商標）システムとの併用のために、アダプターがライゲートしたＤＮＡ断片を、油中水型エマルジョン中の低分子ＤＮＡ捕捉ビーズに固定し、ＰＣＲ（エマルジョンＰＣＲ）によって増幅する。ＤＮＡが結合したビーズのそれぞれをピコタイタープレート上のウェルに入れ、シーケンシング試薬をプレートのウェルにわたり送達する。シーケンシング処理中に、４種のＤＮＡヌクレオチドを、ピコタイタープレートデバイスにわたり固定した順番で逐次的に添加する。ヌクレオチドのフロー中、ビーズのそれぞれに結合したＤＮＡの数百万のコピーが並行してシーケンシングされる。テンプレート鎖に相補的なヌクレオチドがウェルに添加されると、ヌクレオチドは既存のＤＮＡ鎖上に取り込まれ、光シグナルを生成し、これが機器中のＣＣＤカメラによって記録される。

可逆的ダイターミネーター：ＤＮＡ分子に基づくシーケンシング技術は、まずスライド上にプライマーを付着させ、局所的なクローンのコロニーが形成されるように増幅する。４種のタイプの可逆的ターミネーター塩基（ＲＴ−塩基）を添加し、取り込まれなかったヌクレオチドを洗い落とす。パイロシーケンシングとは異なり、ＤＮＡは、一度に１種のヌクレオチドだけ伸長する。カメラで蛍光標識ヌクレオチドの画像を撮影し、次いで末端の３’ブロッカーを伴う色素がＤＮＡから化学的に除去されて、次のサイクルが可能になる。

Ｈｅｌｉｃｏｓの単一分子シーケンシングは、フローセル表面に付着させた、ポリＡテールアダプターが付加されたＤＮＡ断片を使用する。各サイクルで、ＤＮＡポリメラーゼおよび単一種の蛍光標識ヌクレオチドを添加し、その結果、表面に固定されたプライマー−テンプレート二重鎖のテンプレート依存性の伸長が起こる。読み取りは、ヘリオスコープシーケンサーによって実行される。フルアレイをタイリングした画像獲得後、蛍光標識を化学的に切断および放出することにより、それに続く伸長および画像化のサイクルを可能にする。

合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）は、「オールドスタイルの」ダイターミネーション電気泳動シーケンシングのように、塩基配列を決定するためにＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みに頼る。アダプターが取り付けられたＤＮＡライブラリーを一本鎖に変性させ、フローセルにグラフト化し、続いてブリッジ増幅して、ガラスチップ上にスポットの高密度アレイを形成する。可逆的ターミネーター方法は、ダイターミネーターの可逆的バージョンを使用するものであり、一度に１種のヌクレオチドを添加し、ブロッキング基の繰り返しの除去によって各位置で蛍光を検出して、別のヌクレオチドの重合を可能にする。ヌクレオチド取り込みのシグナルは、いずれも使用された、蛍光標識ヌクレオチド、リン酸によって駆動する光反応、および水素イオンの感知に応じて様々であり得る。ＳＢＳプラットフォームの例としては、ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡ、ＨｉＳｅｑ２５００、ＨｉＳｅｑ１５００、ＨｉＳｅｑ２０００、またはＨｉＳｅｑ１０００が挙げられる。またＭｉＳｅｑ（登録商標）パーソナルシーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）も、可逆的ターミネーター化学を用いた合成によるシーケンシングを採用する。

合成によるシーケンシング方法とは対照的に、ライゲーションによるシーケンシング方法は、標的配列を決定するのにＤＮＡリガーゼを使用する。このシーケンシング方法は、テンプレートＤＮＡ鎖上での、局所的な相補性を介した隣接するオリゴヌクレオチドの酵素によるライゲーションに頼る。この技術は、シーケンシングした位置に従って標識された、固定した長さの全ての存在し得るオリゴヌクレオチドのパーティションを採用する。オリゴヌクレオチドがアニールされ、ライゲートされると、配列を一致させるためのＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションにより、その位置で、ジヌクレオチドによってコードされた色空間シグナルが生じる（オリゴに沿った公知の位置における公知のヌクレオチドに対応する蛍光標識プローブの放出を介して）。この方法は、主としてＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＯＬｉＤ（商標）シーケンサーによって使用される。シーケンシングの前、ＤＮＡをエマルジョンＰＣＲによって増幅する。得られたビーズはそれぞれ同じＤＮＡ分子のコピーのみを含有し、それを固体の平面の基質上に堆積させる。

ＳＭＲＴ（商標）シーケンシングは、合成によるシーケンシングアプローチに基づく。ＤＮＡは、ゼロモードウェーブガイド〔zero-mode wave-guides〕（ＺＭＷｓ）、すなわちウェルの底部に配置された捕捉ツールを備えた、小さいウェル様の容器で合成される。シーケンシングは、未改変ポリメラーゼ（ＺＭＷの底部に付着した）、および溶液中を自由に流動する蛍光標識ヌクレオチドの使用により実行される。ウェルは、ウェルの底部で発生する蛍光のみを検出するように構築される。蛍光標識は、それがＤＮＡ鎖に取り込まれるときにヌクレオチドから取り外されて、未改変ＤＮＡ鎖が残る。

またＤＮＡのハイスループットシーケンシングは、生物学的プロセス（例えば、ｍｉＲＮＡ発現または対立遺伝子の変異性（ＳＮＰ検出））のモニターを可能にするＡｎｙＤｏｔ−チップ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ、ドイツ）を使用して行うこともできる。例えば、ＡｎｙＤｏｔ−チップは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出の１０倍〜５０倍の強化を可能にする。他のハイスループットシーケンシングシステムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ Ｍａｒｃｈ ２０００；およびＭ．Ｊ，Ｌｅｖｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ ２００３；ならびに米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号および２００６／００７８９３７号で開示されたものが挙げられる。

本発明の技術の嚢胞性線維症の検出アッセイ
サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成することを含み、サンプルＣＦＴＲ核酸は、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫを用いて、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）から溶出させた乾燥生体液サンプルから抽出される、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸中の少なくとも１つの変異は、塩基の変化、遺伝子欠失および遺伝子重複から選択される。特定の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸中の少なくとも１つの変異は、嚢胞性線維症に関連しており、本発明の開示の１つまたは複数の表２に列挙された変異を含む。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の少なくとも１つの変異は、ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して検出される。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。

一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、嚢胞性線維症の症状を示す、または嚢胞性線維症の家族歴もしくはＣＦＴＲ変異を有する患者から得られる。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、嚢胞性線維症または少なくとも１つのＣＦＴＲ変異を有する産婦人科の患者の男性パートナーから得られる。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乳児または高齢者などの、繰り返しの試験のために大量の血液を提供することができない患者から得られる。

一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと接触させることによって実行することができる。特定の実施形態において、溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。さらなる実施形態において、溶解緩衝液は、８００ｍＭの塩酸グアニジン；３０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．０；３０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；５％のＴｗｅｅｎ ２０；および０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、９０℃で最大１５分接触させることによって実行される。加えて、または代替として、特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、プロテイナーゼＫと、５６℃で最大１時間接触させることによって実行される。他の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、プロテイナーゼＫと、５６℃で最大１６〜１８時間接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、１０〜２０μＬ以下である。

本方法の一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、４００ｎｇ以下のゲノムＤＮＡが溶出される。本方法の他の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、約１００ｎｇから約４００ｎｇのゲノムＤＮＡが溶出される。一部の実施形態において、本方法は、アダプター配列を、複数のアンプリコンの末端にライゲートすることをさらに含む。アダプター配列は、Ｐ５アダプター、Ｐ７アダプター、Ｐ１アダプター、Ａアダプター、またはＩｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ（商標）バーコードアダプターであり得る。加えて、または代替として、一部の実施形態において、本方法は、１つまたは複数のベイト配列を、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズすることをさらに含む。

特定の実施形態において、本発明の技術に従って増幅およびシーケンシングされるＣＦＴＲ標的セグメントは、ＣＦＴＲ遺伝子の１つまたは複数の個々のエクソンもしくはエクソンの一部、またはＣＦＴＲのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの１つまたは複数の一部を表していてもよい。また標的セグメントは、ＣＦＴＲプロモーター領域および／または１つまたは複数のＣＦＴＲイントロンも包含していてもよい。一部の実施形態において、標的セグメントは、ＣＦＴＲ遺伝子全体またはＣＦＴＲコード領域全体を表す。一部の実施形態において、標的セグメントは、ＣＦＴＲコード領域全体、および少なくとも１つのイントロンまたはそれらの一部、およびコード配列のすぐ上流に配置された（５’方向に）隣接する領域を表す。隣接する上流領域は、ＣＦＴＲコード配列のすぐ上流に配置された、約１００ヌクレオチドから、約５００、７５０、１０００、１１００、または１２００ヌクレオチドまでの配列を含んでいてもよい。一部の実施形態において、隣接する上流領域は、ＣＦＴＲプロモーター配列の全てまたは一部を含む。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸は、ゲノムＤＮＡである。

別の態様において、本発明の開示は、サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成することであって、サンプルＣＦＴＲ核酸は、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫによって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから抽出される、生成すること、およびハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントは、参照ＣＦＴＲヌクレオチド配列の対応する領域と比較して、少なくとも１つの変更を含む。参照ＣＦＴＲヌクレオチド配列は、正常な（嚢胞性線維症に罹患していない、および嚢胞性線維症の保因者ではない）個体からの、ＣＦＴＲのゲノムもしくはｃＤＮＡ配列、またはそれらの一部であってもよい。一部のケースにおいて、参照ＣＦＴＲ配列は、野生型ＣＦＴＲ核酸配列を含んでいてもよい。当技術分野において公知の様々な方法（例えば、読み取り深度アプローチ）は、シーケンシングデータを分析して、参照ＣＦＴＲ核酸配列と比較して、差がサンプルＣＦＴＲ核酸配列中に存在するのかどうかを決定するのに採用することができる。

一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸中の少なくとも１つの変異は、塩基の変化、遺伝子欠失および遺伝子重複から選択される。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸中の少なくとも１つの変異は、嚢胞性線維症に関連しており、表２に開示された１つまたは複数の変異を包含していてもよい。

一部の実施形態において、本明細書で開示される方法は、個体から得られたＣＦＴＲサンプル核酸における１種または複数の稀なＣＦＴＲ変異またはプライベートな変異を検出し、それにより１種または複数の稀なまたはプライベートなＣＦＴＲ変異を有する個体を同定するのに使用することができる。一部の実施形態において、本発明の技術の方法は、慣例的なスクリーニング試験で保因者が共通の変異に関して陰性と試験された後、嚢胞性線維症の絶対保因者における稀な家族性変異を同定するのに使用される。このような慣例的なスクリーニング試験としては、ＣＦ変異スクリーン（Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＣＦＴＲスクリーン、嚢胞性線維症スクリーン（Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および嚢胞性線維症の保因者スクリーン（ＬａｂＣｏｒｐ）を挙げることができる。一部の実施形態において、本発明の方法はまた、少なくとも１つの慣例的な嚢胞性線維症の変異スクリーニング試験によって同定された２つのＣＦＴＲ配列変異を有していなかった、嚢胞性線維症に罹患した（すなわち症状を示す）個体における稀な変異を同定するのにも使用することができる。

一態様において、本発明の開示は、個体において、嚢胞性線維症に罹患していること、または嚢胞性線維症の保因者であることに関する遺伝学的基準を検出するための方法であって、（ａ）個体から得られたＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントを増幅することによって、アンプリコンライブラリーを生成することであって、サンプルＣＦＴＲ核酸は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから抽出される、生成すること；（ｂ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、アンプリコンライブラリー中のアンプリコンをシーケンシングすること、および（ｃ）ＣＦＴＲ核酸の標的セグメントの１つまたは複数のヌクレオチド配列が嚢胞性線維症に関連する変異を含む場合、嚢胞性線維症に罹患していること、または嚢胞性線維症の保因者であることに関する遺伝学的基準を検出することを含む、方法を提供する。

一部の実施形態において、本明細書で開示される方法は、１種または複数の稀なまたはプライベートな変異を有する、嚢胞性線維症に罹患した個体の、例えば親、兄弟または他の親族などの個体における嚢胞性線維症の保因者のステータスを確認するのに採用される。一部の実施形態において、少なくとも１つの変異は、嚢胞性線維症に関連しており、表２に開示された１つまたは複数の変異を包含する。遺伝子配列と遺伝子量はいずれも、本明細書で開示される方法を使用して、核酸サンプル中で決定することができる。遺伝子量（コピー数多型またはＣＮＶとも称される）は、次世代シーケンシングを実行すること、および読み取り深度アプローチを使用することによって決定することができる。ＣＮＶは、ある種の２つの個体間での５０ｂｐを超えるゲノム配列の獲得量および損失量である（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７０：５９−６５（２０１１））。全ての他のアンプリコンに関する通常の遺伝子量は、正常な試料の場合は１となり、ホモ接合型の欠失の場合は２分の１となり、ホモ接合型の重複の場合は１と２分の１となる。

一部の実施形態において、ＣＦＴＲ遺伝子の少なくとも２、５、１０、２０、２５、または２８個、最大２５、２９、または３０個の標的セグメントをシーケンシングすることができ、ゲノム配列の獲得量および損失量（＞５０ｂｐ）は読み取り深度アプローチを使用して決定される。一実施形態において、ＣＦＴＲコード領域（全てのエクソン／イントロンジャンクションを包含する）を表す２９個の標的セグメントがシーケンシングされる。別の実施形態において、ＣＦＴＲ遺伝子の約１ｋｂ上流および約３００ｋｂ下流に加えて、ＣＦＴＲコード領域（全てのエクソン／イントロンジャンクションを包含する）がアッセイされる。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、各ＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、標的セグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマー対を用いて増幅することができる。一部の実施形態において、プライマー対の単一のプライマーまたは両方のプライマーは、プライマーの標的に特異的な配列部分の５’末端にライゲートした特異的なアダプター配列（シーケンシングアダプターとも称される）を含む。このシーケンシングアダプターは、隣接する未知の核酸の増幅とシーケンシングの両方のためのプライミング部位を提供できる、公知の配列の短いオリゴヌクレオチドである。そのようなものとして、アダプターは、次世代シーケンシングのためのフローセルへの断片の結合を可能にする。本発明の技術で使用されるプライマー中に、あらゆるアダプター配列が包含されていてもよい。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンは、アダプターでタグ付けされたアンプリコンを産生するために、オリゴヌクレオチドシーケンシングアダプターを含有するプライマーを使用して生成される。他の実施形態において、採用されたプライマーは、アダプター配列を含有せず、産生されたアンプリコンは、その後（すなわち増幅後）、アンプリコンの一方または両方の末端でオリゴヌクレオチドシーケンシングアダプターにライゲートする。

一部の実施形態において、全てのフォワードアンプリコン（すなわち、標的セグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズしたフォワードプライマーから伸長したアンプリコン）は、同じアダプター配列を含有する。一部の実施形態において、二本鎖シーケンシングが実行される場合、全てのフォワードアンプリコンは、同じアダプター配列を含有し、全ての逆のアンプリコン（すなわち、標的セグメントのセンス鎖とハイブリダイズしたリバースプライマーから伸長したアンプリコン）は、フォワードアンプリコンのアダプター配列とは異なるアダプター配列を含有する。一部の実施形態において、アダプター配列は、インデックス配列（インデックスタグ、「バーコード」またはマルチプレックス識別子〔multiplex identifier〕（ＭＩＤ）とも称される）をさらに含む。

一部の実施形態において、アダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンサー（ＭｉＳｅｑおよびＨｉＳｅｑ）に関して推奨されるＰ５および／またはＰ７アダプター配列である。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，６３（１）：１６７−７７（２０１０）を参照されたい。一部の実施形態において、アダプター配列は、Ｐ１、Ａ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのシーケンサーに関して推奨されるＩｏｎ Ｘｐｒｅｓｓ（商標）バーコードアダプター配列である。他のアダプター配列は当技術分野において公知である。一部の製造元は、それらの製造元が提供する特定のシーケンシング技術および機構と共に使用するための特異的なアダプター配列を推奨する。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、１つより多くのサンプルからのサンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンがシーケンシングされる。一部の実施形態において、全てのサンプルが同時に並行してシーケンシングされる。上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１、５、１０、２０、３０個、または最大３５、４０、４５、４８または５０個の異なるサンプルからのサンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンが、本明細書に記載される方法を使用して増幅およびシーケンシングされる。

一部の実施形態において、単一のサンプル源由来のアンプリコンは、アンプリコン生成のもととなった源を示す同一なインデックス配列をさらに含み、各サンプルのインデックス配列は、全ての他のサンプルからのインデックス配列と異なる。したがって、インデックス配列の使用は、シーケンシング処理ごとに複数のサンプルをプールすることを可能にし、その後、サンプル源を、インデックス配列に基づき確認する。一部の実施形態において、Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ（商標）システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）またはＡｐｏｌｌｏ３２４システム（Ｗａｆｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）は、１回のセットアップでサンプルからの核酸を同時に増幅することによってバーコード付きの（インデックス付きの）アンプリコンライブラリーを生成するのに使用される。

一部の実施形態において、インデックス付きのアンプリコンは、インデックス配列を含有するプライマー（例えば、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマー）を使用して生成される。このようなインデックス付きのプライマーは、特異的なアンプリコンを特定のサンプル源に由来するとして同定するための「バーコード化」ツールとして、ライブラリー調製中に包含させることができる。アダプターがライゲートした、および／またはインデックス付きのプライマーが採用される場合、アダプター配列および／またはインデックス配列は、増幅中に、アンプリコンに組み込まれる（標的特異的なプライマー配列と共に）。それゆえに、得られたアンプリコンは、シーケンシングに適切であり、従来のライブラリー調製プロトコールを必要としない。さらに、インデックスタグの存在は、複数のサンプル源からの配列の区別を可能にする。

一部の実施形態において、アンプリコンは、アダプターがライゲートしていない、および／またはインデックス付きではないプライマーを用いて増幅してもよく、その後、シーケンシングアダプターおよび／またはインデックス配列を、得られたアンプリコンのそれぞれの一方または両方の末端にライゲートしてもよい。一部の実施形態において、アンプリコンライブラリーは、マルチプレックスＰＣＲアプローチを使用して生成される。

１つより多くのサンプル源からのインデックス付きのアンプリコンは、個々に定量化され、次いでハイスループットシーケンシングの前にプールされる。したがって、インデックス配列の使用は、シーケンシング処理ごとに複数のサンプル（すなわち、１つより多くのサンプル源からのサンプル）をプールすることを可能にし、その後、サンプル源を、インデックス配列に基づき確認する。「マルチプレックス化」は、複数のアダプターでタグ付けされた、およびインデックス付きのライブラリーのプールを、単一のシーケンシングで処理することである。インデックス付きのプライマーセットが使用される場合、この能力は、比較研究のために活用することができる。一部の実施形態において、１つより多くのサンプル源からのアンプリコンが、ハイスループットシーケンシングの前にプールされる。一部の実施形態において、最大４８個の別々の源からのアンプリコンライブラリーが、シーケンシングの前にプールされる。

一部の実施形態において、シーケンシングテンプレート（アンプリコン）は、特殊化した融合プライマー（アダプター配列を含有する）および捕捉ビーズを使用する、標的セグメントのエマルジョンベースのクローン的な増幅によって調製される。単一のアダプターが結合した断片がビーズの表面に付着し、必要な増幅試薬を含有する油エマルジョンが、ビーズ／断片の構成要素の周りに形成される。数百万の一本鎖断片を用いた数百万のビーズの並列増幅により、すぐシーケンサーで使用できるライブラリーが産生される。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、アダプターでタグ付けされた（および任意選択でインデックス付きの）アンプリコンライブラリーを構成するアンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生される。一部の実施形態において、アンプリコンライブラリーは、マルチプレックスＰＣＲアプローチ、例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第８，０９２，９９６号で開示されたものを使用して生成される。

ブリッジＰＣＲは、シーケンシングのための調製においてライブラリーを生成した後のインビトロにおけるクローン的な増幅のためのさらに別の方法である。このプロセスは、固体表面などの画定された物理的な領域、例えば懸濁液中のビーズまたはスライドガラス上のクラスター中で、単一の標的分子、ライブラリーのメンバーをクローン的に増幅する手段である。この方法において、断片は、固体表面に付着したプライマーを使用して増幅されて、「ＤＮＡコロニー」または「ＤＮＡクラスター」を形成する。この方法は、ゲノム分析器であるＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）によって製造されたシーケンサーの一部で使用されている。

加えて、または代替として、一部の実施形態において、複数のアンプリコンは、複数のアンプリコンの少なくとも１つに相補的な核酸配列を含むベイトのセットを使用して濃縮される。一部の実施形態において、ベイトのセットの核酸配列は、ＲＮＡベイト、ＤＮＡベイト、またはそれらの組合せである。

アンプリコンライブラリーの産生後、アンプリコンは、ハイスループット大規模並列シーケンシング（すなわち次世代シーケンシング）を使用してシーケンシングされる。ハイスループット大規模並列シーケンシングを実行するための方法は、当技術分野において公知である。特定の実施形態において、ハイスループット大規模並列シーケンシングは、パイロシーケンシング、可逆的ダイターミネーターシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ヘリオスコープ単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、またはＳＭＲＴ（商標）シーケンシングを使用して実行される。

嚢胞性線維症の処置
患者が、嚢胞性線維症のための１つまたは複数の処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法が本明細書で開示される。

嚢胞性線維症のための処置の例は当技術分野において周知であり、そのようなものとしては、患者の器官における感染性のマイクロバイオームを制御する療法、例えば抗生物質での処置または抗炎症薬療法、胸部の理学療法（ＣＰＴ）、気道クリアランス技術（ＡＣＴ）および薬物療法、栄養療法、臓器移植（例えば、肺置換手術）などが挙げられる。

好適な抗生物質または抗生物質の組合せが、嚢胞性線維症に関連する感染を処置するのに使用することができる。嚢胞性線維症の処置において有用な抗生物質のクラスとしては、ペニシリン、例えばペニシリンおよびアモキシリン、セファロスポリン、例えばセファレキシン（ケフレックス）、マクロライド、例えばエリスロマイシン（Ｅマイシン）、クラリスロマイシン（ビアキシン）、およびアジスロマイシン（ジスロマック）、フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン〔ciprofolxacin〕（シプロ）、レボフロキサシン（レバキン）、およびオフロキサシン（フロキシン）、スルホンアミド、例えばコトリモキサゾール（バクトリム）およびトリメトプリム（プロロプリム）、テトラサイクリン、例えばテトラサイクリン（スミシン〔Sumycin〕、パンマイシン）およびドキシサイクリン（ビブラマイシン）、アミノグリコシド、例えばゲンタマイシン（ガラマイシン）およびトブラマイシン（トブレックス）、およびコリスチンが挙げられる。

抗炎症薬療法は、嚢胞性線維症に関連する感染によって引き起こされる炎症および痛みを低減するのに使用することができる。抗炎症薬療法のクラスとしては、ステロイドベースの抗炎症剤、例えばアムシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、クロベタゾール、クロコルトロン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、デュタステライド、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、フルランドレノリドおよびヒドロフルメチアジドが挙げられる。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）としては、アセクロフェナク、アセメタシン、アスピリン、セレコキシブ、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、ジクロフェナク、エトドラク、エトリコキシブ、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、およびチアプロフェン酸が挙げられる。

粘液低粘稠化薬物療法は、患者の肺および気道をきれいな状態に保つのを助けるのに使用することができる。粘液低粘稠化薬物療法のクラスとしては、去痰薬、抗ヒスタミン薬、および鎮咳薬、例えばグアイフェネシン、デキストロメトルファン、高張食塩水、ドルナーゼアルファおよび粘液溶解剤が挙げられる。

胸部の理学療法（ＣＰＴ）は、胸部のクラッピングまたは叩打法を含んでいてもよい。患者の胸部と背中を繰り返し叩くことは、患者が粘液を吐き出すことができるように、粘液を緩めて肺から追い出すことを助けることができる。一部の嚢胞性線維症の治療レジメンにおいて、ＣＰＴは、１日当たり３回から４回患者に実行される。一部の嚢胞性線維症の治療レジメンにおいて、患者は、肺からの粘液排出を容易にするために、ＣＰＴが実行されている間、座っていてもよいし、またはうつぶせになっていてもよい。ＣＰＴでは、プロセス中の患者の不快感を低減するために、特定のデバイスを使用することができる。例示的なデバイスとしては、これらに限定されないが、電動の胸部を叩く装置、粘液を肺から追い出すための高周波数のエアウェーブを使用する膨張式の治療用ベスト、患者がこれを使用して息を吐くと、粘液を追い払う振動を引き起こすフラッターデバイス、および逆圧を作り出して、気道を開いたままにすることを助け、さらに気道壁から粘液を追い払うのを容易にする呼気陽圧マスクが挙げられる。

気道クリアランス技術（ＡＣＴ）は、咳または息の吐き出しによって患者の肺から排除できるように、濃厚な粘性の粘液を緩めることを助けることができる。気道をきれいにすることは、肺感染の減少を助け、肺の機能を改善することができる。様々なＡＣＴが公知であり、臨床的に実行されている。例えば、咳は、基礎的な気道クリアランス技術である。咳は、不随意反射の場合もあるし、または粘液を消去するための肺にとって健康的な自然の方式として制御される場合もある。加えて、数々の呼吸技術が、患者の気道をきれいにすることを助けることもある。これらの技術の例としては、２回強制的に息を吐き出し、それに続いてリラックスして呼吸することを含む努力呼気技術〔forced expiration technique〕（ＦＥＴ）；および粘液を緩め気道の開きを助けることができる深呼吸運動を含む自己排痰法〔active cycle breathing〕（ＡＣＢ）が挙げられる。一部の嚢胞性線維症の治療レジメンにおいて、ＡＣＴは、気道壁の筋肉の弛緩を助け、粘液を薄めて追い払う薬物の吸入などの他の処置と併用される。このような薬物療法としては、これらに限定されないが、気管支拡張剤、抗生物質、および粘液低粘稠化剤が挙げられる。一部の実施形態において、薬物療法は、ＡＣＴ中にネブライザーを介して取り扱われる。

栄養療法は、単独で使用してもよいし、または嚢胞性線維症を処置するための他の療法と組み合わせて使用してもよい。例えば、患者は、脂肪およびタンパク質の消化ならびにビタミンの吸収に役立つ、膵酵素を受けることができる。脂溶性ビタミンの追加の源を提供するために、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫサプリメントが患者に投与されてもよい。栄養管、例えば胃瘻管（Ｇ管）は、患者の胃に栄養溶液を直接供給するのに使用することができる。経口の膵酵素と同時に、胃酸を低減することができる薬物療法またはサプリメントが投与されてもよい。消化の問題を正すことによって、栄養療法の一環として腸閉塞を処置するために、他の粘液低粘稠化剤が、個々に、または同時に投与されてもよい。

一態様において、本発明の開示は、抗嚢胞性線維症治療剤での処置のために、嚢胞性線維症の症状を示す患者、または嚢胞性線維症のリスクがある患者を選択するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、患者の乾燥生体液サンプルを溶出させることであって、乾燥生体液サンプルは、サンプルＣＦＴＲ核酸を含む、溶出させること；（ｂ）サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成すること；（ｃ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、ライブラリー中のアンプリコンの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を検出すること；および（ｄ）抗嚢胞性線維症治療剤での処置のために、患者を選択することを含む、方法を提供する。乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血であってもよい。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスである。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。一部の実施形態において、患者は、ＣＦＴＲ遺伝子中に１つまたは複数の変異を有しており、表２に列挙された１つまたは複数の変異を包含していてもよい。

嚢胞性線維症のリスクがある患者としては、（ａ）嚢胞性線維症に関する遺伝学的基準；（ｂ）嚢胞性線維症に関する遺伝学的基準を有する、例えば嚢胞性線維症の保因者である、少なくとも１人の親または少なくとも１人の祖父母；（ｃ）複数世代における嚢胞性線維症の家族性の発生；または（ｄ）嚢胞性線維症に関連するかまたは嚢胞性線維症によって引き起こされる可能性がある１種または複数の症状、を有する対象が挙げられる。

嚢胞性線維症に関連する症状としては、これらに限定されないが、体の粘液および汗の分泌における混乱、加えて、呼吸器系、消化器系、および生殖系における関連する合併症および症状が挙げられる。例えば、嚢胞性線維症患者は、定期的に、肺および気道に蓄積した、大量の濃厚で粘性の、時には血液を含む粘液を示すことがある。この粘液の蓄積は、咳、喘鳴または息切れを引き起こすことがあり、さらに、呼吸器系における細菌感染もより発生しやすくする。標準的な抗生物質に応答しない異常な病原体によって引き起こされる感染、例えば粘液様のシュードモナス属によって引き起こされる肺感染は、嚢胞性線維症の徴候であり得る。追加の嚢胞性線維症に関連する症状としては、副鼻腔感染症、気管支炎または肺炎、鼻の中で成長するもの（すなわちポリープ）を挙げることができる。

嚢胞性線維症患者は、膵臓において、粘液で閉塞した管を示す場合がある。このような詰まりは、消化管への消化酵素の送達を妨げ、それにより消化および吸収の障害が起こる。したがって、嚢胞性線維症に関連する症状としては、体重の減少または体重増加の失敗、継続的な下痢または大量の悪臭のする脂っぽい便、腸閉塞、過剰なガス、便秘、胃の痛みおよび不快感も挙げることができる。長期的に、これらの消化器系の合併症は、栄養不良、膵臓炎、直腸脱、肝疾患、糖尿病、および胆石を引き起こす可能性がある。

また嚢胞性線維症に関連する徴候および症状としては、不妊症、低い骨密度および関連する骨が薄くなる障害、例えば骨粗鬆症、非常に塩分の強い汗、脱水、体液の平衡失調およびその結果として起こる心拍数増加、疲労、衰弱、低血圧、熱射病、ならびにばち指形成として知られる、指先と足指が広く丸くなることも挙げることができる。

一部の実施形態において、嚢胞性線維症の処置は、感染制御療法、胸部の理学療法、気道クリアランス療法、栄養療法、および臓器移植の１つまたは複数を含む。

上記実施形態のいずれかにおいて、抗嚢胞性線維症治療剤は、ペニシリン、アモキシリン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、アミノグリコシド、コリスチン、アムシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、クロベタゾール、クロコルトロン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、デュタステライド、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、フルランドレノリド、ヒドロフルメチアジド、アセクロフェナク、アセメタシン、アスピリン、セレコキシブ、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、ジクロフェナク、エトドラク、エトリコキシブ、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、去痰薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、デキストロメトルファン、高張食塩水、ドルナーゼアルファ、粘液溶解剤、膵酵素、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、および胃酸を低減するサプリメントからなる群から選択される１種または複数の薬剤である。

キット
本発明の開示は、乾燥生体液サンプル中のサンプルＣＦＴＲ核酸における１つまたは複数の変異を検出するためのキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、皮膚を穿刺するツール、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、およびプロテイナーゼＫを含み、１つまたは複数の変異は、表２に列挙された１つまたは複数の変異を含む。溶解緩衝液は、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含んでいてもよい。他の実施形態において、溶解緩衝液は、２．５〜１０％のドデシル硫酸ナトリウムを含む。

一部の実施形態において、キットは、乾燥生体液サンプル中に存在する細胞中の核タンパク質複合体を変性させるための１つまたは複数の成分をさらに含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、キットは、タンパク質汚染物質を除去するため、ヌクレアーゼ活性を不活性化するため、および／または乾燥生体液サンプル中に存在する生物学的および／または化学的な汚染物質を除去するための、１つまたは複数の成分をさらに含む。

一部の実施形態において、キットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする１つまたは複数のプライマー対をさらに含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、キットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする１つまたは複数のベイト配列をさらに含む。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、ＣＦＴＲ遺伝子のコードまたは非コード領域、例えばエクソンまたはイントロン領域に対応する。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、ＣＦＴＲ領域の調節配列、例えばＣＦＴＲプロモーター領域または下流の調節領域に対応する。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、表２に列挙された１つまたは複数のＣＦＴＲ変異を包含していてもよい。

特に、一部の実施形態において、本発明の技術のキットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントに選択的にハイブリダイズし、それらを増幅または捕捉することにおいて有用な、１つまたは複数のプライマー対またはベイト配列を含む。特に、一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、ＣＦＴＲ遺伝子のコードまたは非コード領域、例えばエクソンまたはイントロン領域に対応する。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、ＣＦＴＲ領域の調節配列、例えばＣＦＴＲプロモーター領域または下流の調節領域に対応する。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、表２に列挙された１つまたは複数のＣＦＴＲ変異を包含していてもよい。

一部の実施形態において、本発明の技術のキットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする、単一のプライマー対またはベイト配列を含む。有用なプライマー対の例は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７８７０に見出すことができる。他の実施形態において、本発明の技術のキットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントにハイブリダイズする、複数のプライマー対またはベイト配列を含む。特定の実施形態において、本発明の技術のキットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする、１つより多くのプライマー対または１つより多くのベイト配列を含む複数のプライマー対またはベイト配列を含む。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、ＣＦＴＲ遺伝子のコードまたは非コード領域、例えばエクソンまたはイントロン領域に対応する。一部の実施形態において、サンプルＣＦＴＲ核酸の標的セグメントは、ＣＦＴＲ領域の調節配列、例えばＣＦＴＲプロモーター領域または下流の調節領域に対応する。したがって、本明細書において、本発明の技術のキットは、サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントを認識してそれに特異的にハイブリダイズする、プライマー対またはベイト配列を含んでいてもよいことが予期される。

本発明の技術のキットの上記実施形態のいずれかにおいて、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。

一部の実施形態において、キットは、複数の容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを含んでいてもよく、それぞれのデバイスは、近位端に中空のホルダー、および遠位端に吸収性チップを有する。吸収性チップは、約１０秒以内またはそれ未満で３０マイクロリットルまたはそれ未満の血液を吸収するように設計された親水性のポリマー性材料を含む。キットはまた、複数の区画を有する容器も包含する。各区画は、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスと取り外し可能にかみ合うように設計されている。容器は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップが、中にマイクロサンプリングデバイスが設置される区画と隣り合わないように設計されている。

加えて、または代替として、特定の実施形態において、キットは、複数のアクセスポートを包含していてもよく、各ポートは、個々の区画と関連付けられる。各ポートは、ポートが関連付けられる区画内に存在する容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスのホルダー上への印刷が可能になるように配置される。特定の実施形態において、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスのホルダーは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有し、リブは、吸収性チップが容器の壁と接触することを防ぐように設計されている。容器は、好ましくは、管状の形態の区画を形成するように設計された２つのパートを有する。容器は、それぞれ異なる区画の一部に沿って伸長する複数の細長い据え付けの突起を有する第１のパートを有していてもよい。容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスのホルダーの中空の末端が据え付けの突起上にはまると、ホルダーが据え付けの突起上に取り外し可能に固定される。

一部の実施形態において、キットは、乾燥生体液サンプル中の、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝性の嚢胞性線維症の変異の増幅および／または検出などのアッセイまたは反応を行うのに必要な、緩衝液、ポリメラーゼ活性を有する酵素、ポリメラーゼ活性を有し、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性または５’から３’および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性の両方が欠失した酵素、酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン、塩、鎖伸長ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、修飾されたｄＮＴＰ、ヌクレアーゼ耐性ｄＮＴＰまたは標識されたｄＮＴＰをさらに含む。

一実施形態において、本発明の技術のキットは、実験処理中のアッセイの完全性を確認するための陽性対照核酸配列および陰性対照核酸配列をさらに含む。またキットは、使用説明書、自動分析のためのソフトウェア、容器、パッケージ、例えば市販を意図したパッケージングなどを含んでいてもよい。

キットは、洗浄緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または試薬、標識付けの緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段の１種または複数をさらに含んでいてもよい。緩衝液および／または試薬は通常、キットが意図される特定の増幅／検出技術に最適化される。また、手順の様々な工程を実行するためのこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールがキットに包含されていてもよい。

本発明の技術のキットは、それに続く増幅および／またはサンプルＣＦＴＲ核酸中の変更（例えば、表２に開示されたＣＦＴＲ変異）の検出のために、乾燥生体液サンプルからの核酸を調製するのに使用される成分を包含していてもよい。このようなサンプル調製成分は、乾燥生体液サンプル、例えば乾燥血清、乾燥血漿、または乾燥全血から核酸の抽出物を産生するのに使用することができる。上述された方法で使用される試験サンプルは、アッセイ様式、検出方法の性質、およびアッセイしようとする試験サンプルとして使用される具体的な細胞または抽出物などの要因に基づき様々となる。サンプルから核酸を抽出する方法は当技術分野において周知であり、利用されるシステムに適合するサンプルが得られるように容易に適合させることができる。試験サンプルから核酸を抽出するための自動サンプル調製システム、例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓのＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲｏｂｏｔ ９６００、ＱｉａｇｅｎのＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ、およびＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＲＩＳＭ（商標）６７００サンプル調製システムが市販されている。

［実施例１］
ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを使用して収集された乾燥血液サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出
この実施例は、本発明の技術の方法が、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを使用して収集された乾燥生体液サンプル（例えば、乾燥血液）から高い収量のゲノムＤＮＡを抽出するのに有用であることを実証する。

合計４人のヒト対象を研究に登録した。３つの抽出方法を同時に試験するために、３つの血液のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを、４人の血液ドナーのそれぞれから収集した。指先穿刺を介して各ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスで１０μＬの固定した体積の血液を収集した。血液サンプルを乾燥させた後、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスの吸収性チップを次いで、１８０μＬの緩衝液Ｇ２（８００ｍＭの塩酸グアニジン；３０ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ８．０；３０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；５％のＴｗｅｅｎ ２０；０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶解緩衝液）中に入れ、ボルテックスで１５秒混合した。３つの抽出方法それぞれの残りのサンプル処理工程を以下に要約する。

次いで抽出されたゲノムＤＮＡを、ｄｓＤＮＡの存在下でのみ蛍光を発するｄｓＤＮＡインターカレート色素を使用する、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットを使用して定量化した。それゆえに、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットを使用するｄｓＤＮＡの定量化は、他の定量化方法に影響を与える可能性があるＲＮＡ、タンパク質、塩、または他の汚染物質によって影響されない。表１は、各ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップから得られたＤＮＡ収量が抽出方法に従って変化することを実証する。抽出方法３（ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを緩衝液Ｇ２と９０℃で１５分、およびプロテイナーゼＫと５６℃で一晩インキュベートすること）が、最大のＤＮＡ量を生じたことが決定された。

これらの結果は、本発明の技術の方法が、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを使用して収集された乾燥生体液サンプル（例えば、乾燥血液）から高い収量のゲノムＤＮＡを抽出するのに有用であることを実証する。

［実施例２］
１つのチップおよび二重のチップの抽出を使用したＤＮＡ収量の比較
個々の患者由来の乾燥血液を含有する単一のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ（１つのチップの抽出）から溶出させた溶解生成物でＤＮＡ抽出を実行した。二重のチップの抽出のために、同じ患者由来の乾燥血液を含有する２つの個々のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップから溶出させた溶解生成物を一緒に組み合わせた。ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを、緩衝液Ｇ２と共に９０℃で１５分、およびプロテイナーゼＫと共に５６℃で一晩インキュベートした。

それに続く核酸抽出を、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）自動抽出プラットフォーム上のＤＮＡ調査キットを製造元の説明書に従って使用して実行した。１つのチップおよび二重のチップの抽出によるＤＮＡ収量を比較した（図１を参照）。

これらの結果から、二重のチップの抽出は、平均して、ＤＮＡ収量の２倍の増加をもたらしたことが実証される（図１）。これらの結果は、本発明の技術の方法が、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスを使用して収集された乾燥生体液サンプル（例えば、乾燥血液）から高い収量のゲノムＤＮＡを抽出するのに有用であることを実証する。

［実施例３］
ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップから抽出された乾燥血液サンプルを使用したＣＦｖａｎｔａｇｅ（登録商標）嚢胞性線維症拡張スクリーン
７人のドナーから得られた乾燥血液試料から、ゲノムＤＮＡを抽出した。各抽出は、単一のＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ、すなわち実施例２に記載した通りの１つのチップの抽出を使用して収集された乾燥血液試料を使用して行われた。次いで抽出されたＤＮＡを、ＣＦＴＲ遺伝子に対応する３８種のアンプリコンを評価するＣＦｖａｎｔａｇｅ（登録商標）嚢胞性線維症拡張パネル上で試験した。ＣＦｖａｎｔａｇｅ（登録商標）嚢胞性線維症拡張パネルは、嚢胞性線維症に関連する１６２種のＣＦＴＲ変異をカバーする（表２）。次世代シーケンシングをＭｉＳｅｑシーケンサーで実行した。カバーされた領域のシーケンシングの成功を評価する品質測定法は、カバーされたホットスポット１つ当たり最小でも３０個の読み取りを包含する。

結果：図２で示されるように、全ての７つのサンプルは、カバーされたホットスポット領域の１００％でＱＣ基準に合格した。

これらの結果から、本発明の技術の方法は、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイス（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）を用いて収集された少量の乾燥生体液サンプル中のサンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出することが可能であることが実証された。

均等物
本発明の技術は、本出願に記載された特定の実施形態の観点で限定されないものとし、それらは本発明の技術の個々の態様の単なる例示であることが意図される。当業者には明らかであろうが、本発明の技術の多くの改変およびバリエーションを、その本質および範囲から逸脱することなく作製することができる。本明細書で列挙されたものに加えて、本発明の技術の範囲内の機能的に同等な方法および装置が、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変およびバリエーションは、本発明の技術の範囲内に含まれることが意図される。本発明の技術は特定の方法、試薬、化合物の組成または生物系に限定されず、当然ながら様々であってもよいことが理解されるものとする。また、本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるものとする。

用語「含む」、「包含する」、「含有する」などは、拡張的に非限定的に解釈されるものとする。加えて、本明細書で採用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および発現の使用において、示された、および記載された特徴またはそれらの一部のあらゆる均等物を排除する意図はないが、特許請求された開示の範囲内で様々な改変が可能であることが認識されている。

加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群の形式で記載される場合、それにより本開示は、マーカッシュ群のいずれの個々のメンバーまたはメンバーの下位群の形式でも記載されることを当業者は認識するであろう。

当業者であれば理解するであろうが、ありとあらゆる目的に関して、特に記載された説明の提供に関して、本明細書で開示される全ての範囲はまた、ありとあらゆる可能な部分範囲およびそれらの部分範囲の組合せも包含する。あらゆる列挙された範囲は、同じ範囲が、少なくとも等しく２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に記載し、それが可能であるとして、容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられたそれぞれの範囲は、下部３分の１、中央３分の１および上部３分の１などに容易に分割できる。やはり当業者であれば理解するであろうが、例えば「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などの全ての言語は、列挙された数値を包含し、上記で論じられたようにそれに続いて部分範囲に分割できる範囲を指す。結論として、当業者には理解されるであろうが、範囲は、それぞれ個々の要素を包含する。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群などを指す。

本明細書で言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および公報は、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、参照により全ての図面および表を含めそれら全体が本明細書に組み入れられる。

Claims (34)

1. サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、
   （ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、サンプルＣＦＴＲ核酸を抽出すること；
   （ｂ）サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成すること；および
   （ｃ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、ライブラリー中のアンプリコンの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を検出すること
   を含む、方法。
2. 乾燥生体液サンプルが、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である、請求項１に記載の方法。
3. マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルが、指先穿刺を介して患者から収集される、請求項１または２に記載の方法。
4. 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫと接触させることによって実行される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 溶解緩衝液が、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む、請求項４に記載の方法。
6. 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、９０℃で最大１５分接触させることによって実行される、請求項４または５に記載の方法。
7. 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、プロテイナーゼＫと、５６℃で最大１時間接触させることによって実行される、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、プロテイナーゼＫと、５６℃で最大１６〜１８時間接触させることによって実行される、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
9. マイクロサンプリングデバイスが、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. マイクロサンプリングデバイスが、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積が、１０〜２０μＬ以下である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、４００ｎｇ以下のゲノムＤＮＡが溶出される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、約１００ｎｇから約４００ｎｇのゲノムＤＮＡが溶出される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 少なくとも１つの変異が、塩基の変化、遺伝子欠失および遺伝子重複から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 少なくとも１つの変異が、表２に列挙された変異から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 少なくとも１つの変異が、嚢胞性線維症に関連する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 乾燥生体液サンプルが、嚢胞性線維症の症状を示す、または嚢胞性線維症の家族歴もしくはＣＦＴＲ変異を有する個体から得られる、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 乾燥生体液サンプルが、嚢胞性線維症または少なくとも１つのＣＦＴＲ変異を有する産婦人科の患者の男性パートナーから得られる、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 複数の標的セグメントが、一緒になって、ＣＦＴＲ遺伝子の全てのコード領域および非コード領域にまたがる、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 複数の標的セグメントがさらに、ＣＦＴＲ遺伝子の第１のエクソンのすぐ上流のプロモーター領域の約１０００ヌクレオチドにまたがる、請求項１９に記載の方法。
21. 複数の標的セグメントがさらに、ＣＦＴＲ遺伝子のすぐ下流の約２００から３５０ヌクレオチドにまたがる、請求項２０に記載の方法。
22. ハイスループット大規模並列シーケンシングが、パイロシーケンシング、可逆的ダイターミネーターシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ヘリオスコープ単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、またはＳＭＲＴ（商標）シーケンシングを使用して実行される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ハイスループット大規模並列シーケンシングが、読み取り深度アプローチを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. サンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するための方法であって、サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成することを含み、サンプルＣＦＴＲ核酸は、溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫによって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから抽出される、方法。
25. サンプルＣＦＴＲ核酸中の少なくとも１つの変異が、ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して検出される、請求項２４に記載の方法。
26. サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントが、参照ＣＦＴＲヌクレオチド配列の対応する領域と比較して、少なくとも１つの変更を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 参照ＣＦＴＲヌクレオチド配列が、野生型ＣＦＴＲ核酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 抗嚢胞性線維症治療剤での処置のために、嚢胞性線維症の症状を示す患者、または嚢胞性線維症のリスクがある患者を選択するための方法であって、
    （ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、患者の乾燥生体液サンプルを溶出させることであって、乾燥生体液サンプルは、サンプルＣＦＴＲ核酸を含む、溶出させること；
    （ｂ）サンプルＣＦＴＲ核酸の複数の標的セグメントに対応するアンプリコンを含むライブラリーを生成すること；
    （ｃ）ハイスループット大規模並列シーケンシングを使用して、ライブラリー中のアンプリコンの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を検出すること；および
    （ｄ）抗嚢胞性線維症治療剤での処置のために、患者を選択すること
    を含む、方法。
29. 抗嚢胞性線維症治療剤が、ペニシリン、アモキシリン、セファロスポリン、マクロライド、フルオロキノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン、アミノグリコシド、コリスチン、アムシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、クロベタゾール、クロコルトロン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、デュタステライド、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロメトロン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、フルランドレノリド、ヒドロフルメチアジド、アセクロフェナク、アセメタシン、アスピリン、セレコキシブ、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、ジクロフェナク、エトドラク、エトリコキシブ、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、去痰薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、デキストロメトルファン、高張食塩水、ドルナーゼアルファ、粘液溶解剤、膵酵素、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、および胃酸を低減するサプリメントからなる群から選択される１種または複数の薬剤である、請求項２８に記載の方法。
30. 乾燥生体液サンプル中のサンプルＣＦＴＲ核酸における少なくとも１つの変異を検出するためのキットであって、皮膚を穿刺するツール、容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、およびプロテイナーゼＫを含み、少なくとも１つの変異は、表２に列挙された１つまたは複数のＣＦＴＲ変異を含む、キット。
31. サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする１つまたは複数のプライマー対をさらに含む、請求項３０に記載のキット。
32. サンプルＣＦＴＲ核酸の１つまたは複数の標的セグメントにハイブリダイズする１つまたは複数のベイト配列をさらに含む、請求項３０または３１に記載のキット。
33. 容量測定式の吸収性マイクロサンプリングデバイスが、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである、請求項３０から３２のいずれか一項に記載のキット。
34. 溶解緩衝液が、塩酸グアニジン、トリスＣｌ、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ ２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載のキット。