BR112019009790A2 - método e kit para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico cftr, e, método para selecionar um paciente exibindo sintomas de fibrose cística - Google Patents

Abstract

a presente divulgação provê métodos para determinar se um paciente exibindo sintomas de fibrose cística, ou um paciente em risco para fibrose cística, beneficiar-se-á de tratamento com um ou mais agentes terapêuticos anti-fibrose cística. estes métodos baseiam-se na detecção de mutações relacionadas com a fibrose cística hereditária em amostras de fluido biológico seco de volume pequeno que são coletadas usando um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico. kits para o uso na prática dos métodos também são providos.

Description

MÉTODO E KIT PARA DETECTAR PELO MENOS UMA MUTAÇÃO EM UMA AMOSTRA DE ÁCIDO NUCLEICO CFTR, E, MÉTODO PARA SELECIONAR UM PACIENTE EXIBINDO SINTOMAS DE FIBROSE CÍSTICA

CAMPO TÉCNICO [001] A presente divulgação provê métodos para determinar se um paciente exibindo sintomas de fibrose cística, ou um paciente em risco para fibrose cística, beneficiar-se-á do tratamento com um ou mais agentes terapêutico anti-fibrose cística. Estes métodos estão fundamentados na detecção das mutações relacionadas com a fibrose cística hereditária em amostras de pequeno volume de fluido biológico seco que são coletadas usando um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico. As alterações nas sequências de ácido nucleico alvo correspondentes para uma ou mais mutações relacionadas com a fibrose cística podem ser detectadas usando um sequenciamento de próxima geração (NGS). Os kits para o uso na prática dos métodos também são providos.

FUNDAMENTOS [002] A seguinte descrição dos fundamentos da presente divulgação é provida simplesmente para auxiliar o leitor no entendimento da divulgação e não é admitido descrever ou constituir técnica anterior em relação à presente divulgação.

[003] A fibrose cística (CF) é o distúrbio genético recessivo autossômico severo mais comum na população caucasiana. Isto afeta aproximadamente 1 em 2.500 nascidos vivos na América do Norte (Boat et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6- ed., pp 2649-2680, McGraw Hill, NY (1989)). Aproximadamente 1 em 25 pessoas dos descendentes caucasianos europeus do norte são portadores da doença. O gene responsável foi localizado em uma sequência genômica com 250.000 pares de base presente no braço longo do cromossomo 7. Esta sequência codifica uma

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2/67 proteína associada à membrana chamada de “regulador de transmembrana de fibrose cística” (ou “CFTR”). Existem mais do que 1000 mutações diferentes no gene CFTR, cada uma tendo frequências variantes de ocorrência em diferentes populações relacionadas com o Consórcio de Análise Genética da Fibrose Cística. Estas mutações existem em ambas as regiões de codificação (por exemplo, AF508, uma mutação encontrada em cerca de 70% dos alelos de CF, representam uma exclusão de um resíduo de fenilalanina na posição 508) e as regiões que não de codificação (por exemplo, as variantes 5T, 7T, e 9T correspondem a uma sequência de 5, 7, ou 9 bases de tiamina localizadas na ramificação de junção/sítio aceitador do intron 8) do gene CFTR.

[004] Os sintomas principais da fibrose cística incluem doença pulmonar crônica, insuficiência exócrina pancreática, e níveis de eletrólitos no suor elevados. Os sintomas são compatíveis com a fibrose cística sendo um distúrbio exócrino. Embora avanços tenham sido feitos na análise do transporte de íons através da membrana apical do epitélio das células CF do paciente, não está evidente se a regulagem anormal dos canais de cloreto representem o defeito primário na doença.

[005] O sequenciamento de próxima geração (NGS) é extensivamente usado nos diagnósticos de distúrbios genéticos, incluindo fibrose cística, devido a sua alta taxa de transferência de dados e capacidade de detectar alterações genéticas múltiplas em um único ensaio. Contudo, os procedimentos associados com a coleta e preparação dos ácidos nucleicos a partir de amostras biológicas (por exemplo, sangue) são geralmente, excessivamente trabalhosos, e muitas vezes requerem equipamento especializado ou habilidade técnica. Além disso, alguns grupos de paciente, tais como os idosos ou crianças, são incapazes de fornecer grandes volumes de sangue para o teste recorrente.

[006] Deste modo, há uma necessidade quanto a métodos rápidos e não invasivos para determinar se um paciente tem uma base genética para

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3/67 desenvolver fibrose cística ou está em risco de produzir descendência que sofrerá de fibrose cística.

SUMÁRIO [007] Em um aspecto, a presente divulgação provê um método para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico CFTR compreendendo (a) extrair o ácido nucleico CFTR da amostra de uma amostra de fluido biológico seco eluído de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra; e (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um dos amplicons na biblioteca usando o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento.

[008] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada de um paciente por intermédio de uma picada no dedo. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é um dispositivo de microamostragem absorvente volumétrico. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.

[009] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com um tampão de lise e Proteinase K. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris’Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X100. Em outra modalidade, o tampão de lise compreende 800 mM de cloridrato de guanidina; 30 mM de Tris*Cl, pH 8,0; 30 mM de EDTA, pH 8,0; Tween 20 a 5%; e Triton X-100 a 0,5%. Em outras modalidades, o tampão de lise compreende de 2,5 a 10% de dodecil sulfato de sódio.

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4/67 [0010] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com o tampão de lise durante até 15 minutos a 90°C. Em algumas modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com Proteinase K durante até 1 hora a 56°C. Em outras modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com a Proteinase K durante até 16 a 18 horas a 56°C.

[0011] Em algumas modalidades, o volume de amostra do dispositivo de microamostragem não é maior do que 10 a 20 pL. Em algumas modalidades, não mais do que 400 ng de DNA genômico são eluídos da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem. Em outras modalidades, cerca de 100 ng a cerca de 400 ng de DNA genômico são eluídos da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem. Em algumas modalidades, o método também compreende ligar uma sequência adaptadora às terminações da pluralidade de amplicons. A sequência adaptadora pode ser um adaptador P5, adaptador P7, adaptador Pl, adaptador A, ou adaptador de código de barras lon Xpress®. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, o método também compreende hibridizar uma ou mais sequências iscas a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra.

[0012] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação é selecionada entre uma mudança de base, uma exclusão de gene e uma duplicação de gene. Adicional ou alternativamente, em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação está associada com a fibrose cística, e pode incluir uma ou mais mutações listadas na Tabela 2.

[0013] Em qualquer uma das modalidades acima, a amostra de fluido biológico seco é obtida de um indivíduo exibindo sintomas de fibrose cística,

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5/67 ou tendo um histórico familiar de fibrose cística ou uma mutação de CFTR. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é obtida de um parceiro do sexo masculino de uma paciente de obstetrícia e ginecologia tendo fibrose cística ou pelo menos uma mutação de CFTR.

[0014] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a pluralidade de segmentos alvos, tomados juntos, transpõem todas as regiões codificadoras e não codificadoras do gene CFTR. Em algumas modalidades, a pluralidade de segmentos alvos transpõem ainda cerca de 1000 nucleotídeos de uma região promotora imediatamente a montante do primeiro exon do gene CFTR. Em algumas modalidades, a pluralidade de segmentos alvos transpõem ainda cerca de 200 a 350 nucleotídeos imediatamente a jusante do gene CFTR.

[0015] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento é realizado usando pirossequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento de SOLiD, sequenciamento de semicondutor iônico, sequenciamento Helioscope de molécula única, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, ou sequenciamento por SMRT®. Em algumas modalidades, o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento envolve um método de profundidade de leitura. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a pluralidade de amplicons também compreendem uma sequência de índice único.

[0016] Em outro aspecto, a presente divulgação provê um método para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico de CFTR compreendendo gerar uma biblioteca que compreende os amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra, em que o ácido nucleico de CFTR da amostra é extraído de uma amostra de fluido biológico seco eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem com um tampão de lise e Proteinase K. Em

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6/67 uma outra modalidade, a pelo menos uma mutação no ácido nucleico de CFTR da amostra é detectada usando o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris’Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100.

[0017] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra compreende pelo menos uma alteração se comparado à região correspondente de uma sequência de nucleotídeo de CFTR de referência. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeo CFTR de referência compreende uma sequência de nucleotídeo CFTR do tipo selvagem.

[0018] Em um aspecto, a presente divulgação provê um método para selecionar um paciente que apresenta os sintomas de fibrose cística, ou um paciente em risco para fibrose cística para o tratamento com um agente terapêutico anti-fibrose cística compreendendo (a) eluir uma amostra de fluido biológico seco do paciente de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem, em que a amostra de fluido biológico seco compreende uma amostra de ácido nucleico CFTR; (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um dos amplicons na biblioteca usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento; e (d) selecionar o paciente para o tratamento com um agente terapêutico anti-fibrose cística. A amostra de fluido biológico seco pode ser plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é um dispositivo de microamostragem absorvente volumétrico. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada de um paciente por intermédio de uma picada no dedo. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. Em algumas modalidades, o

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7/67 paciente abriga uma ou mais mutações no gene de CFTR e pode incluir uma ou mais mutações listadas na Tabela 2.

[0019] Em qualquer uma das modalidades acima, o agente terapêutico anti-fibrose cística é um ou mais agentes selecionados do grupo consistindo de penicilina, amoxicilina, cefalosporinas, macrolídeos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas, aminoglicosídeos, colistina, ancinonida, diproprionato de betametasona, Clobetasol, Clocortolona, Dexametasona, Diflorasona, Dutasterida, Pivalato de flumetasona, Flunisolida, Fluocinolona Acetonida, Fluocinonida, Fluorometolona, Propionato de fluticasona, Propionato de fluticasona, Propionato de fluticasona, Flurandrenolida, Hidroflumetiazida, aceclofenaco, acemetacina, aspirina, celecoxib, dexibuprofeno, dexcetoprofeno, diclofenaco, etodolac, etoricoxib, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofênico, expectorantes, anti-histaminas, supressores de tosse, Dextrometorfano, soluções salinas hipertônicas, domase alfa, mucolíticos, enzimas pancreáticas, vitamina A, vitamina D, vitamina E, vitamina K, e suplementos reduzem o ácido do estômago.

[0020] Em um outro aspecto, a presente divulgação provê um método para detectar uma base genética para ser afetada com a fibrose cística, ou para ser um carregador da fibrose cística em um indivíduo compreendendo: (a) gerar uma biblioteca de amplicon amplificando-se os múltiplos segmentos alvos de um ácido nucleico de CFTR obtidos de um indivíduo, em que o ácido nucleico de CFTR da amostra é extraído de uma amostra de fluido biológico seco eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; (b) sequenciar os amplicons na biblioteca de amplicon usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento, e (c) detectar uma base genética para ser afetada com a fibrose cística, ou para ser um carregador da fibrose cística quando a sequência de nucleotídeo de um ou

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8/67 mais dos segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR compreende uma mutação associada com a fibrose cística.

[0021] Também são aqui providos os kits para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico CFTR em uma amostra de fluido biológico seco compreendendo uma ferramenta de punção da pele, um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico, um tampão de lise, e proteinase K, em que a pelo menos uma mutação compreende uma ou mais das mutações de CFTR listadas na Tabela 2.

[0022] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, os kits também compreendem um ou mais pares de iniciadores que hibridizam o um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra. Em algumas modalidades, os kits também compreendem uma ou mais sequências iscas que hibridizam o um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris’Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100.

[0023] Em qualquer uma das modalidades acima dos kits da presente tecnologia, o dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico é uma ponta MITRA®.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS OF FIGURAS [0024] A FIG. 1 mostra uma comparação do rendimento do DNA da extração de uma ponta contra a extração de duas pontas das pontas MITRA® usando o kit DNA Investigator na plataforma de extração automatizada QIAsymphony®. Para a extração de ponta dupla, os lisados eluídos de duas pontas MITRA® indivíduas do mesmo paciente foram combinados juntos. A FIG. 1 demonstra que a extração de ponta dupla resulta em resultados médios em um aumento de 2 vezes no rendimento de DNA.

[0025] A FIG. 2 mostra a cobertura de leitura por região alvo de CFTR coberta (ou pontos quentes) no Painel Expandido de Fibrose Cística (CFvantage® Triagem Expandida). A FIG. 2 demonstra que todas as 7

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9/67 amostras de ponta MITRA® excederam os critérios de QC mínimo para todas as regiões alvo de CFTR cobertas em uma condução de 384 amostras totalmente sobrecarregada (isto é, as amostras foram conduzidas em uma placa que foi realizada na capacidade total, isto é, 377 amostras de operações (Ops) e 7 amostras de ponta MITRA®).

DESCRIÇÃO DETALHADA [0026] A presente divulgação prove métodos para determinar se um paciente exibindo sintomas de fibrose cística, ou um paciente em risco para fibrose cística, se beneficiará do tratamento com um ou mais agentes terapêuticos anti-fibrose cística. Estes métodos tem base na detecção das mutações relacionadas com a fibrose cística hereditária na amostra de volume pequeno de fluidos biológicos secos que são coletados usando um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico. Os kits para o uso na prática dos métodos também são providos.

Definições [0027] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por aquele de habilidade comum na técnica à qual a presente tecnologia pertence.

[0028] Como aqui usado, o termo “cerca de” na referência a um número é geralmente considerado incluir números que caem dentro de uma faixa de 1% a 10% na direção (maior do que ou menor do que) do número a menos que de outro modo determinado ou de outro modo evidente a partir do contexto.

[0029] O termo “adaptador” ser refere a uma sequência de ácido nucleico curta quimicamente sintetizada que pode ser usada para ligar à terminação de uma sequência de ácido nucleico de modo a facilitar a ligação a uma outra molécula. O adaptador pode ser de filamento único ou filamento duplo. Um adaptador pode incorporar uma sequência curta (tipicamente de

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10/67 menos do que 50 pares de base) útil para a amplificação ou sequenciamento de PCR.

[0030] Como aqui usado, a “administração” de um agente terapêutico ou fármaco a um paciente inclui qualquer via de introduzir ou liberar a um paciente um composto para realizar sua função intencionada. A administração pode ser realizada através de qualquer via adequada, incluindo oralmente, intranasalmente, parenteralmente (intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, ou subcutaneamente), ou topicamente. A administração inclui a autoadministração e a administração por outra pessoa.

[0031] Como aqui usado, uma “alteração” de um gene ou produto de gene (por exemplo, um gene marcador ou produto de gene) refere-se à presença de uma mutação ou mutações dentro do gene ou produto de gene, por exemplo, uma mutação, que afeta a quantidade ou atividade do gene ou produto de gene, se comparado ao gene normal ou tipo selvagem. A alteração genética pode resultar em mudança na quantidade, estrutura, e/ou atividade do gene ou produto de gene em um tecido ou célula doente, se comparado à sua quantidade, estrutura, e/ou atividade, em um tecido ou célula normal ou saudável (por exemplo, um). Por exemplo, uma alteração que está associada com a fibrose cística pode ter uma sequência de nucleotídeo (por exemplo, uma mutação), sequência de aminoácido, translocação cromossômica, inversão intracromossômica, número de cópia, nível de expressão, nível de proteína, atividade de proteína do gene que codifica a proteína associada à membrana “regulador de transmembrana de fibrose cística” (ou “CFTR”) e alterados em um tecido ou célula doente, se comparado àqueles observados dentro de um tecido ou célula normal, saudável. As mutações exemplares incluem, mas não são limitadas a, mutações pontuais (por exemplo, silenciosas, de sentido errado, ou sem sentido), exclusões, inserções, inversões, mutações de ligação, duplicações, translocações, rearranjos inter- e intra-cromossômicos. As mutações podem estar presentes na região de

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11/67 codificação ou não codificação do gene. Em algumas modalidades, as alterações são associadas com um fenótipo, por exemplo, um fenótipo associado com a fibrose cística.

[0032] Como aqui usado, os termos “amplificar” ou “amplificação” com relação às sequências de ácidos nucleicos, referem-se aos métodos que aumentam a representação de uma população da sequência de ácidos nucleicos em uma amostra. As cópias de uma sequência alvo de ácido nucleico particular geradas in vitro em uma reação de amplificação são chamadas de “amplicons” ou “produtos de amplificação”. A amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico alvo pode ser DNA (tal como, por exemplo, DNA genômico e cDNA) ou RNA. Enquanto os métodos exemplares descritos em seguida dizem respeito à amplificação usando a reação de cadeia de polimerase (PCR), vários outros métodos tais como os métodos isotérmicos, métodos de círculo rolante, etc., são bem conhecidos àquele versado na técnica. O técnico versado entenderá que estes e outros métodos podem ser usados no lugar de, ou juntos com, métodos PCR. Ver, por exemplo, Saiki, “Amplification of genomic DNA em PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pp 13-20; Wharam, et al., Nucleic Acids Res. 29(11):E54-E54 (2001).

[0033] “Isca”, como aqui usado, é um tipo de reagente de captura híbrido que recupera a sequência alvo de ácido nucleicos para o sequenciamento. Uma isca pode ser uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, uma molécula de DNA ou RNA, que pode hibridizar a (por exemplo, ser complementar a), e deste modo permitir a captura de um ácido nucleico alvo. Em um modalidade, uma isca é uma molécula de RNA (por exemplo, um molécula de RNA de ocorrência natural ou modificada); uma molécula de DNA (por exemplo, uma molécula de DNA de ocorrência natural ou modificada), ou uma combinação destas. Em outras modalidades, uma isca inclui uma entidade de ligação, por exemplo, um rótulo de afinidade, que

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12/67 permite a captura e separação, por exemplo, através da ligação a uma entidade de ligação, de um híbrido formado por uma isca e um ácido nucleico hibridizado para a isca. Em um modalidade, uma isca é adequada para a hibridização de fase de solução.

[0034] Como aqui usado, “conjunto de iscas” refere-se a um ou uma pluralidade de moléculas de isca.

[0035] O termo “estado do carregador” ou “carregador da fibrose cística” como aqui usado significa uma pessoa que abriga um alelo de CFTR que tem uma sequência de CFTR de ácido nucleico mutante associada com a fibrose cística, e um segundo alelo que não é uma sequência de CFTR de ácido nucleico mutante. A fibrose cística é uma doença “recessiva autossômica”, significando que uma mutação produz pouco ou nenhum efeito fenotípico quando presente em um estado heterozigótico com um alelo não relacionado à doença, mas produz um “estado da doença” quando uma pessoa é homozigótica ou um heterozigoto composto, isto é, ambos os alelos de CFTR são sequências de CFTR de mutantes do ácido nucleico.

[0036] Um “CFTR do ácido nucleico” como aqui usado refere-se a um ácido nucleico que contém uma sequência de um gene CFTR, mRNA, cDNA ou uma porção de tal sequência de CFTR. Um CFTR do ácido nucleico pode conter a região que codifica CFTR. Um CFTR de ácido nucleico pode ser DNA genômico, cDNA, DNA ou mRNA de filamento único. Em algumas modalidades, somente um filamento único de uma amostra de ácido nucleico CFTR é amplificado e/ou sequenciado. Em algumas modalidades, ambos os filamentos do DNA do CFTR de filamento duplo são amplificados e sequenciados. Um ácido nucleico CFTR pode estar presente em uma amostra biológica ou este pode ser isolado de uma amostra biológica.

[0037] O termo “região promotora de CFTR” como aqui usada referese a um segmento do gene CFTR representando pelo menos os primeiros 250

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13/67 nucleotídeos (nt) a montante do sítio de início de translação. Em outras modalidades, a região promotora pode incluir os primeiros 250 nt, primeiros 300 nt, primeiros 350 nt, primeiros 400 nt, primeiros 450 nt, primeiros 500 nt, primeiro 1 kb, primeiros 5 kb, primeiros 10, kb, primeiros 15, kb, primeiros 20, kb, primeiros 21 kb, ou primeiros 22 kb da sequência diretamente a montante do códon de partida. Uma exclusão da região promotora como aqui definida pode ser acompanhada pela exclusão dos exons/introns a jusante mas não todos do gene CFTR. Em algumas modalidades, a exclusão coordenada envolvendo a região promotora de CFTR e a sequência genética de CFTR a jusante envolve cerca de menos do que 10 exons, e mais tipicamente envolve menos do que 5 exons. As exclusões ou duplicações da região promotora de CFTR podem ser detectadas usando iniciadores que flanqueiam a sequência excluída ou duplicada. Em algumas modalidades, uma exclusão ou duplicação do promotor envolve um segmento de pelo menos um ou mais nucleotídeos, pelo menos quatro ou mais nucleotídeos, pelo menos 5 ou mais nucleotídeos, pelo menos 8 ou mais nucleotídeos, ou pelo menos 12 ou mais nucleotídeos.

[0038] O termo “sequência de codificação” como aqui usado significa uma sequência de um ácido nucleico ou seu complemento, ou uma parte desta, que pode ser transcrita e/ou traduzida para produzir o mRNA, e/ou polipeptídeo correspondentes ou um fragmento destes. As sequências de codificação incluem exons em um DNA genômico ou transcritos de RNA primários imaturos, que são unidos pela maquinaria bioquímica das células para fornecer um mRNA maduro. O filamento antissentido é o complemento de tal ácido nucleico, e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir deste. O termo “sequência de não codificação” como aqui usado significa uma sequência de um ácido nucleico ou seu complemento, ou uma parte deste, que não é transcrito em aminoácidos in vivo, ou onde o tRNA não interage para colocar ou tentar colocar um aminoácido. As sequências que não de codificação incluem ambas as sequências de introns do DNA genômico ou

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14/67 transcritos de RNA primários imaturos, e as sequências associadas ao gene tais como promotores, realçadores, silenciadores, etc.

[0039] Os termos “complemento”, “complementar” ou “complementariedade” como aqui usados com referência ais polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos tal como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico alvo) refere-se às regras de pares de base de Watson/Crick. O complemento de uma sequência de ácido nucleico como aqui usado refere-se a um oligonucleotídeo que, quando alinhado com a sequência de ácido nucleico tal que a terminação 5’ de uma sequência é emparelhada com a terminação 3’ da outra, está em “associação antiparalela.” Por exemplo, a sequência “5’-A-G-T-3”’ é complementar à sequência “3’-T-C-A-5’.” Algumas bases não comumente encontradas nos ácidos nucleicos de ocorrência natural podem ser incluídas nos ácidos nucleicos aqui descritos. Estes incluem, por exemplo, inosina, 7-deazaguanina, Ácido Nucleicos Bloqueados (LNA), e Ácidos Nucleicos de Peptídeos (PNA). A complementariedade não precisa ser perfeita; os duplexes estáveis adequados podem conter pares de base desemparelhados, degenerativos, ou bases não emparelhadas. Aqueles versados na técnica da tecnologia do ácido nucleico podem determinar a estabilidade do duplex empiricamente, considerando várias variáveis, incluindo, por exemplo, o comprimento dos oligonucleotídeo, a composição e sequência de base dos oligonucleotídeos, a força iônica e a incidência dos pares de base desemparelhados. Uma sequência de complemento também pode ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA ou sua sequência de complemento, e também pode ser um cDNA.

[0040] O termo “substancialmente complementar” como aqui usado significa que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridização precisas. O técnico versado entenderá que as sequências substancialmente complementares não precisam hibridizar junto com todo seu comprimento.

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Em particular, as sequências substancialmente complementares podem compreender uma sequência de bases contígua que não hibridiza a uma sequência alvo, 3’ ou 5’ posicionada a uma sequência de bases contígua que hibridiza sob condições de hibridização precisas para uma sequência alvo.

[0041] Como aqui usado, um “controle” ou “referência” é uma amostra alternativa usada em um experimento para propósito de comparação. Um controle pode ser “positivo” ou “negativo.” Uma “amostra de ácido nucleico de controle” ou “amostra de ácido nucleico de referência” como aqui usada, refere-se às moléculas de ácido nucleico de uma amostra de controle ou referência. Em algumas modalidades, a amostra de referência ou ácido nucleico de controle é uma sequência de DNA ou RNA do tipo selvagem ou não mutada. Em algumas modalidades, a amostra do ácido nucleico de referência é purificada ou isolada (por exemplo, esta é removida do seu estado natural). Em outras modalidades, a amostra de ácido nucleico de referência é de uma amostra não doente, por exemplo, um controle de sangue, um controle de tecido, ou qualquer outra amostra não doente de um mesmo paciente ou de um paciente diferente.

[0042] “Profundidade de cobertura” refere-se ao número de leituras de sequenciamento que são mapeadas até uma dada posição.

[0043] O termo “exclusão” como aqui usado abrange uma mutação que remove um ou mais nucleotídeos do ácido nucleico. Inversamente, o termo “duplicação” refere-se a uma mutação que insere um ou mais nucleotídeos de sequência idêntica diretamente próximos à sequência no ácido nucleico. Em algumas modalidades, uma exclusão ou duplicação envolve um segmento de quatro ou mais nucleotídeos.

[0044] Como aqui usado, o termo “detectar” refere-se à determinar a presença de uma mutação ou alteração em um ácido nucleico de interesse em uma amostra. A detecção não requer que método forneça uma sensibilidade de 100%.

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16/67 [0045] O termo “dosagem” ou “dosagem de gene” refere-se ao número de cópias de um gene, ou porções de um gene, presentes em uma amostra.

[0046] Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade suficiente para obter um efeito terapêutico ou profilático desejado, por exemplo, uma quantidade que resulta na prevenção do início de ou a melhora de em um ou mais sintomas associados com a fibrose cística. No contexto das aplicações terapêuticas ou profiláticas, a quantidade de um agente terapêutico administrado a um paciente dependerá do tipo e gravidade da doença e das características do indivíduo, tal como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância aos medicamentos. Isto também dependerá do grau, severidade e tipo da doença. O técnico versado será capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo deste e outros fatores. Como aqui usado, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de um fármaco ou agente terapêutico é intencionada significar os níveis no qual os efeitos fisiológicos de um distúrbio hereditário tal como fibrose cística são, em um mínimo, melhorados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser dada em uma ou mais administrações.

[0047] Como aqui usado, os termos “extração” ou “isolação” referemse a qualquer ação tomada para separar os ácido nucleicos de outro material celular presente na amostra. O termo extração ou isolação inclui a lise mecânica ou química, a adição de detergente ou protease, ou precipitação e remoção de outros materiais celulares.

[0048] O termo “flanqueamento” como aqui usado com relação aos iniciadores significa que um iniciador hibridiza a um ácido nucleico alvo adjacente a uma região de interesse procurada ser amplificada no alvo. O técnico versado entenderá que os iniciadores ótimos são pares de iniciadores que hibridizam 5’ de uma região de interesse, um em cada filamento de uma molécula de DNA de filamento duplo alvo, tal que os nucleotídeos podem ser

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17/67 adicionados à terminação 3’ do iniciador através de um DNA polimerase adequado. Os iniciadores que flanqueiam um exon de CFTR são geralmente projetados para não anelar à sequência de exon, mas ao invés disso, para anelar a sequência que une ao exon (por exemplo, sequência de intron). Contudo, em algumas modalidades, o iniciador de amplificação pode ser projetado para anelar a sequência de exon.

[0049] “Gene” como aqui usado refere-se a uma sequência de DNA que compreende as sequências de codificação reguladoras e necessárias para a produção de um RNA, que pode ter uma função que não de codificação (por exemplo, um RNA ribossômico ou de transferência) ou que pode incluir um polipeptídeo ou um precursor de polipeptídeo. O RNA ou polipeptídeo pode ser codificado através de um sequência de codificação de comprimento total ou através de qualquer porção da sequência de codificação contanto que a atividade ou função desejadas sejam retidas. Embora uma sequência de ácidos nucleicos possam ser mostradas na forma de DNA, aquele versado na técnica reconhecerá que as sequências de RNA correspondentes terão uma sequência similar com a timina sendo substituída por uracila, isto é, “T” é substituído com “U.” [0050] Uma “base genética para fibrose cística” em um indivíduo refere-se ao genótipo do indivíduo, em particular, de seus CFTRs de ácido nucleico e se o indivíduo possui pelo menos um CFTR de mutação que contribui para a fibrose cística. O termo “do tipo selvagem” como aqui usado com relação ao gene de CFTR ou um local deste refere-se à sequência do gene de CFTR que é encontrada no NCBI GenBank locus IDs M58478 (HUMCFTC), AC000111 e AC000061. Um cDNA para um gene de CFTR pode ser encontrado em Audrezet et al., Hum. Mutat. 23(4), 343-357 (2004) e/ou número de acesso Genbank NM_000492,3. Uma “mutação de CFTR rara” é uma mutação na sequência do gene de CFTR que está presente em < 0,1% dos pacientes com fibrose cística. Uma “mutação de CFTR privada” é

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18/67 uma mutação na sequência do gene de CFTR que é somente encontrada em uma família única ou um grupo pequeno. Uma “mutação de CFTR comum” é uma mutação na sequência de gene de CFTR que está associada com a fibrose cística e está presente em pelo menos 0,1% dos pacientes com fibrose cística. [0051] O termo “hibridizar” como aqui usado refere-se a um processo onde dois filamentos de ácido nucleico substancialmente complementares (pelo menos cerca de 65% complementares durante um trecho de pelo menos 14 a 25 nucleotídeos, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90% complementares) anelam uns aos outros sob condições apropriadamente severas para formar um duplex ou heteroduplex por toda a formação das ligações de hidrogênio entre os pares de base complementares. As hibridizações são tipicamente e preferivelmente conduzidas com moléculas de ácido nucleico no comprimento da sonda, preferivelmente de 15 a 100 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente de 18 a 50 nucleotídeos de comprimento. As técnicas de hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.I. A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre os ácidos nucleicos) é influenciada por fatores tais como o grau de complementariedade entre os ácidos nucleicos, severidade das condições envolvidas, e o ponto de fusão térmica (T_m) do híbrido formado. Aqueles versados na técnica sabem como estimar e ajustar a severidade das condições de hibridização tal que as sequências tendo pelo menos um nível desejado de complementariedade vão hibridizar estavelmente, enquanto aquelas tendo menor complementariedade não vão. Para exemplos de condições e parâmetros de hibridização, ver, por exemplo, Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Press, Plain view, N.I.; Ausubel, F. M. et al. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. Em

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19/67 algumas modalidades, a hibridização específica ocorre sob condições de hibridização precisas. Um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um iniciador) que são específicos para um ácido nucleico alvo vão “hibridizar” para o ácido nucleico alvo sob condições adequadas.

[0052] Como aqui usado, os termos “indivíduo”, “paciente”, ou “sujeito” podem ser um organismo individual, um vertebrado, um mamífero, ou um ser humano. Em uma modalidade preferida, o indivíduo, paciente ou sujeito é um ser humano.

[0053] Como aqui usado, o termo “biblioteca” refere-se a uma coleção de sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, uma coleção de ácidos nucleicos derivados de fragmentos genômicos integrais, subgenômicos, cDNA, fragmentos de cDNA, RNA, fragmentos de RNA, ou uma combinação destes. Em uma modalidade, uma porção ou todos da biblioteca de sequência de ácidos nucleicos compreendem uma sequência adaptadora. A sequência adaptadora pode estar localizada em uma ou ambas terminações. A sequência adaptadora pode ser útil, por exemplo, para um método de sequenciamento (por exemplo, um método NGS), para amplificação, para transcrição reversa, ou para clonar em um vetor.

[0054] A biblioteca pode compreender uma coleção da sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de CFTR), uma sequência de ácido nucleico de referência, ou uma combinação destes). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos da biblioteca pode ser derivada de um paciente único. Em outras modalidades, uma biblioteca pode compreender a sequência de ácidos nucleicos de mais do que um sujeitos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ou mais sujeitos). Em algumas modalidades, duas ou mais bibliotecas de diferentes sujeitos podem ser combinadas para formar uma biblioteca tendo a sequência de ácidos nucleicos de mais do que um sujeito. Em uma modalidade, o sujeito é um ser humano

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20/67 tendo, ou em risco de ter, uma fibrose cística.

[0055] Uma “sequência de ácidos nucleicos da biblioteca” refere-se a uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um DNA, RNA, ou uma combinação destes , que é um membro de uma biblioteca. Tipicamente, uma sequência de ácido nucleico de biblioteca é uma molécula de DNA, por exemplo, um DNA genômico ou cDNA. Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico de biblioteca é fragmentado, por exemplo, um DNA genômico submetido ao cisalhamento ou enzimaticamente preparado. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos da biblioteca compreende a sequência de um sujeito e sequência não derivada do sujeito, por exemplo, a sequência adaptadora, uma iniciador sequência, ou outras sequências que permitem a identificação, por exemplo, sequências de “código de barras”. Em algumas modalidades, a biblioteca compreende amplicons correspondentes segmentos múltiplos de uma sequência alvo de ácido nucleico, tal como uma amostra de sequência de ácido nucleico CFTR.

[0056] O termo “PCR multiplexo” como aqui usado refere-se à amplificação de dois ou mais produtos que são, cada um, preparados usando um par de iniciadores distintos.

[0057] O “sequenciamento de próxima geração ou NGS” como aqui usado, refere-se a qualquer método de sequenciamento que determina a sequência de nucleotídeo das moléculas de ácido nucleico individuais (por exemplo, em um sequenciamento de molécula única) ou proxies expandidos clonalmente para as moléculas de ácido nucleico individuais de uma maneira paralela com alta taxa de transferência (por exemplo, maior do que 10³, 10⁴, 10⁵ou mais moléculas são simultaneamente sequenciadas). Em uma modalidade, a abundância relativa das espécies do ácido nucleico na biblioteca podem ser estimadas contando-se o número relativo de ocorrências das suas sequências cognatas nos dados gerados pelo experimento de sequenciamento. Os métodos de sequenciamento de próxima geração são

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21/67 conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em Metzker, M. Nature Biotecnology Reviews 11:31-46 (2010).

[0058] Como aqui usado, “oligonucleotídeo” refere-se a uma molécula que tem uma sequência de ácido nucleico com base em uma estrutura compreendida principalmente de unidades monoméricas idênticas em intervalos definidos. As bases são arranjadas na estrutura de tal maneira que posam ligar-se com um ácido nucleico tendo uma sequência de bases as quais são complementares às bases do oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos mais comuns têm uma estrutura de unidades de fosfato de açúcar. Uma distinção pode ser feita entre os oligodesoxirribo-nucleotídeos que não têm um grupo hidroxila na posição 2’ e oligorribo-nucleotídeos que têm um grupo hidroxila na posição2’. Os oligo-nucleotídeos também podem incluir derivados, nos quais o hidrogênio do grupo hidroxila é substituído com grupos orgânicos, por exemplo, um grupo alila. Os oligonucleotídeos que funcionam como iniciadores ou sondas são geralmente de pelo menos cerca de 10 a 15 nucleotídeos de comprimento, ou até cerca de 70, 100, 110, 150 ou 200 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente de pelo menos cerca de 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos usados como iniciadores ou sondas para especificamente amplificar ou especificamente detectar um ácido nucleico alvo particular geralmente são capazes de hibridizar especificamente ao ácido nucleico alvo.

[0059] Como aqui usado, o termo “iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de agir como um ponto de iniciação da sequência de síntese ácido nucleico quando colocado sob condições na qual a síntese de um produto de extensão de iniciador que é complementar a um filamento do ácido nucleico alvo é induzida, isto é, na presença de trifosfatos de nucleotídeo diferentes e uma polimerase em um tampão apropriado (“tampão” inclui pH, força iônica, cofatores etc.) e em uma temperatura adequada. Um ou mais dos nucleotídeos do iniciador podem ser modificados,

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22/67 por exemplo, através da adição de um grupo metila, uma porção biotina ou digoxigenina, uma etiqueta fluorescente ou usando-se nucleotídeos radioativos. Uma sequência de iniciador não precisa refletir a sequência exata do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode estar ligado à terminação 5’ do iniciador, com o restante da sequência de iniciador sendo substancialmente complementar ao filamento. O termo iniciador como aqui usado inclui todas as formas de iniciadores que podem ser sintetizados, incluindo os iniciadores de ácido nucleico peptídico, iniciadores de ácido nucleico bloqueado, iniciadores modificados por fosforotioato, iniciadores rotulados, e os semelhantes. O termo “iniciador avançado” como aqui usado significa um iniciador que recoze ao filamento antissentido do DNA de filamento duplo (dsDNA). Um “iniciador reverso” recoze ao filamento de sentido do dsDNA.

[0060] Os iniciadores são tipicamente pelo menos de 10, 15, 18, ou 30 nucleotídeos de comprimento ou até cerca de 100, 110, 125, ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os iniciadores são de preferivelmente entre cerca de 15 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 25 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os iniciadores são de 15 a 35 nucleotídeos de comprimento. Não existe um comprimento padrão para a hibridização ou amplificação ótimas da reação de cadeia de polimerase. Um comprimento ótimo para uma aplicação de iniciador particular pode ser prontamente determinado na maneira descrita em H. Erlich, PCR Technology, Principles And Application for DNA Amplification, (1989).

[0061] Como aqui usado, o termo “par de iniciador” refere-se a um par de iniciador avançado e reverso (isto é, um par de iniciadores esquerdo e direito) que podem ser usados juntos para amplificar uma dada região de um ácido nucleico de interesse.

[0062] “Sonda” como aqui usado refere-se a um ácido nucleico que

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23/67 interage com um ácido nucleico alvo por intermédio da hibridização. Uma sonda pode ser completamente complementar a uma sequência alvo de ácido nucleico ou parcialmente complementar. O nível de complementariedade dependerá de muitos fatores, em geral, com base na função da sonda. As sondas podem ser rotuladas ou não rotuladas, ou modificadas em qualquer uma de várias maneiras bem conhecidas na técnica. Uma sonda pode especificamente hibridizar a um ácido nucleico alvo. As sondas podem ser DNA, RNA ou um híbrido de RNA/DNA. As sondas podem ser oligonucleotídeos, cromossomos artificiais, cromossomo artificiais fragmentados, ácido nucleico genômico, ácido nucleico genômico fragmentado, RNA, ácido nucleico recombinante, ácido nucleico recombinante fragmentado, ácido nucleico de peptídeo (PNA), ácido nucleico bloqueado, oligômero de heterociclos cíclicos, ou conjugados de ácidos nucleicos. As sondas podem compreender nucleobases modificadas, porções de açúcar modificados, e ligações internucleotídicas modificadas. As sondas são tipicamente de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 nucleotídeos ou mais de comprimento.

[0063] Como aqui usado, o termo “amostra” refere-se às amostras clínicas obtidas de um paciente. Nas modalidades preferidas, uma amostra é obtida a partir de uma fonte biológica (isto é, uma “amostra biológica”), tal como tecido ou fluido corporal coletado de um sujeito. As fontes de amostra incluem, mas não são limitadas a, muco, escarro (processado ou não processado), lavagem brônquica alveolar (BAL), lavagem brônquica (BW), sangue, fluidos corporais, fluido cerebroespinhal (CSF), urina, plasma, soro, ou tecido (por exemplo, material de biópsia). As fontes de amostra preferidas incluem plasma, soro, ou sangue total.

[0064] Uma “amostra de ácido nucleico CFTR” é um ácido nucleico CFTR na, ou na forma isolada de, uma amostra biológica. Os métodos de processamento para liberar ou de outro modo tornar disponível um ácido

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24/67 nucleico para a detecção são bem conhecidos na técnica e podem incluir as etapas de manipulação do ácido nucleico, por exemplo, extração de DNA ou RNA de uma amostra biológica, e preparar um cDNA através da transcrição reversa de RNA a partir da amostra biológica. Uma amostra biológica pode ser um fluido biológico ou uma amostra de tecido. Em algumas modalidades, uma amostra biológica pode compreender sangue, plasma, soro, urina, fezes, amostra da epiderme, amostra vaginal, amostra da pele, amostra de bochecha, esperma, fluido amniótico, células cultivadas, amostra da medula óssea e/ou vilosidades coriônicas, células cultivadas, e os semelhantes. Em algumas modalidades, a amostra biológica pode ser uma amostra de fluido biológico seco coletada através de um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico. Tecidos fixados ou congelados também podem ser usados. Fluido amniótico de 10 a 15 ml, células cultivadas que são de 80 a 100% confluentes em dois frascos T-25 e 25 mg de vilosidades coriônicas são contagens de amostras úteis para o processamento.

[0065] O termo “sensibilidade,” como aqui usado em referência aos métodos da presente tecnologia, é uma medida da capacidade de um método de detectar uma variante de sequência pré-selecionada em uma população heterogênea das sequências. Um método tem uma sensibilidade de % em S para as variantes de % em F se, dada uma amostra na qual a variante de sequência pré-selecionada está presente como pelo menos % em F das sequências na amostra, o método pode detectar a sequência pré-selecionada em uma confiança pré-selecionada de % em C, % em S do tempo. Por via de exemplo, um método tem uma sensibilidade de 90% para as variantes de 5% se, dada uma amostra na qual a sequência variante pré-selecionada está presente como pelo menos 5% das sequências na amostra, o método pode detectar a sequência pré-selecionada em uma segurança pré-selecionada de 99%, 9 de 10 vezes (F = 5%; C = 99%; S = 90%). As sensibilidades exemplares incluem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, e 99%.

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25/67 [0066] A “profundidade de sequenciamento” ou “profundidade de leitura” como aqui usado refere-se ao número de vezes que uma sequência foi sequenciada (a profundidade do sequenciamento). Como um exemplo, a profundidade de leitura pode ser determinada alinhando-se os resultados de operação de sequenciamento múltiplos e contando-se a posição de partida das leituras em janelas não sobrepostas de um certo tamanho (por exemplo, 100 pares de base). A variação do número de cópia pode ser determinada com base na profundidade de leitura usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, os métodos descritos em Yoon et al., Genome Research September, 19(9):1586-1592 (2009); Xie et al., BMC Bioinformatics 10:80 (2009); ou Medvedev et al., Nature Methods 6(Supl 11):513-20 (2009). O uso deste tipo de método e análise é indicado como um “método de profundidade de leitura.” [0067] O termo “específico” como aqui usado em referência a um oligonucleotídeo iniciador significa que a sequência de nucleotídeo do iniciador tem pelo menos 12 bases de identidade de sequência com uma porção do ácido nucleico a ser amplificada quando o oligonucleotídeo e o ácido nucleico estão alinhados. Um oligonucleotídeo iniciador que é específico para um ácido nucleico é aquele que, sob condições de hibridização ou lavagem precisas, é capaz de hibridizar ao alvo de interesse e não hibridiza substancialmente aos ácidos nucleicos que não são de interesse. Níveis maios altos da identidade de sequência são preferidos e incluem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 85 a 95%, e mais preferivelmente pelo menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa computacional comercialmente disponível com um ajuste padrão que utiliza algoritmos bem conhecidos na técnica. Como aqui usado, as sequências que têm “alta identidade de sequência” têm nucleotídeos idênticos pelo menos a cerca de 50% de posições de nucleotídeo alinhadas, preferivelmente pelo

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26/67 menos a cerca de 60% de posições de nucleotídeos alinhados, e mais preferivelmente pelo menos em cerca de 75% de posições de nucleotídeo alinhados.

[0068] “Especificidade,” como aqui usado, é uma medida da capacidade de um método de distinguir uma variante de sequência préselecionada de ocorrência verdadeira a partir dos artefatos de sequenciamento ou outras sequências intimamente relacionadas. Esta é a capacidade de evitar detecções falso positivas. As detecções falso positivas podem surgir a partir dos erros introduzidos na sequência de interesse durante a preparação da amostra, o erro de sequenciamento, ou sequenciamento inadvertido das sequências intimamente relacionadas como pseudogenes ou membros de uma família de genes. Um método tem uma especificidade de % de X se, quando amplificada para um conjunto de4 amostra de sequências Nibtai, em que as sequências Xverdadeira são variantes verdadeiras e XNão verdadeira são as variantes não verdadeiras, o método seleciona pelo menos o % de X da variante não verdadeira como não variante. Por exemplo, um método tem uma especificidade de 90% se, quando aplicado a um conjunto de amostras de 1.000 sequências, em que 500 sequências são variantes verdadeiras e 500 são variantes não verdadeiras, o método seleciona 90% das 500 sequências variantes não verdadeiras como não variantes. As especificidades exemplares include pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, e 99%.

[0069] O termo “condições de hibridização precisas” como aqui usado refere-se às condições de hibridização pelo menos como estritas como o seguinte: hibridização em 50% de formamida, 5x de SSC, 50 mM de NafUPCM, pH a 6,8, 0,5% de SDS, 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmão sonicado, e 5x de solução de Denhart a 42°C durante a noite; lavagem com 2x de SSC, 0,1% de SDS a 45°C; e lavagem com 0,2x de SSC, 0,1% de SDS a 45°C. Em um outro exemplo, as condições de hibridização precisas não devem permitir a hibridização de dois ácidos nucleicos que diferem ao longo

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27/67 de um extensão de 20 nucleotídeos contíguos em mais do que duas bases.

[0070] Os termos “ácido nucleico alvo” ou “sequência alvo” ou “segmento alvo” como aqui usados referem-se a uma sequência de ácido nucleico de interesse a ser detectada e/ou quantificada na amostra a ser analisada. O ácido nucleico alvo pode ser composto de segmentos de um cromossomo, um gene completo com ou sem a sequência, segmentos ou porções intergênicas de um gene com ou sem a sequência intergênica, ou sequência de ácidos nucleicos cujas sondas ou iniciadores são indicados. Os ácidos nucleicos alvos podem incluir sequência(s) do tipo selvagem, uma mutação, exclusão, inserção ou duplicação, elementos de repetição em tandem, um gene de interesse, uma região de um gene de interesse ou qualquer região a montante ou a jusante deste. Os ácidos nucleicos alvos podem representar sequências ou alelos alternativos de um gene particular. Os ácido nucleico alvos podem ser derivados de DNA, cDNA, ou RNA genômicos.

[0071] Como aqui usado, os termos “tratar,” “tratando” ou “tratamento” referem-se a uma ação para obter um resultado clínico benéfico ou desejado, incluindo, mas não limitado ao alívio ou melhora de um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou condição (por exemplo, regressão, parcial ou completa), diminuição do grau da doença, estado de estabilidade da doença (isto é, não piora, obtendo uma doença estável), melhora ou mitigação do estado da doença, diminuição da taxa ou tempo para a progressão e remissão (seja parcial ou total).

Dispositivos de Microamostragem Utilizados nos Métodos da Presente Tecnologia [0072] As técnicas de manchamento de sangue seco convencionais são acompanhadas por várias desvantagens, incluindo um volume de amostra impreciso e confiança em uma viscosidade de amostra constante (isto é, a expectativa de que a amostra se espalhará uniformemente no cartão de

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28/67 amostra). Uma viscosidade constante resulta em diâmetros de mancha de sangue permanecendo constante quando as amostras de volume iguais são administradas aos cartões. Contudo, a viscosidade variedade significantemente entre as amostras de sangue por causa dos níveis de hematócrito diferentes (HCT) ou de volume celular empacotado (PCV) no sangue. As amostras com altos níveis de hematócritos formam manchas de diâmetro menores nos papéis de mancha de sangue, levando a concentrações diferentes do sangue dentro do diâmetro fixo das manchas amostradas. O níveis de PCV são acreditados mostrar uma variação de cerca de 45% nos diâmetros das manchas. Considerando que os padrões internos são pulverizados no sangue manchado, isto pode resultar em um erro de 45% na quantificação. O dispositivo de microamostragem utilizado nos métodos aqui divulgados conferem várias vantagens, incluindo a coleta de volumes de sangue mais precisa, falta de viés de hematócritos, e a capacidade de ser facilmente automatizado com manuseadores de líquido padrão para o processamento laboratorial.

[0073] Adicionalmente, as técnicas de mancha de sangue convencionais requerem um volume comparativamente grande de sangue com relação aos dispositivos de microamostragem divulgados. Uma mancha de sague seca geralmente precisaria de 50 a 75 μΐ por mancha, enquanto um dispositivo de microamostragem pode produzir resultados de aproximadamente 20 μΐ. foi reconhecido na técnica que as manchas de sangue secas muitas vezes tiveram problemas de viabilidade de desempenho para detectar a carga viral se comparado a outros tipos de amostras, tais como plasma (Pannus et al., Medicine, 95:48(e5475) (2016)), e o volume de uma mancha de sangue seco pode precisar ser significantemente maior para certos tipos de avaliações (por exemplo, densidade ótica) se comparado a outros tipos de amostra, tais como soro (Brandao et al., J. Clin. Virol., 57:98-102 (2013)). De fato, foi verificado que o uso tanto da triagem de mancha de

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29/67 sangue seco quanto de mancha de sangue para detectar a carga viral e a falha do tratamento em pacientes com HIV recebendo terapia antirretroviral verificou que ambos produziram uma alta taxa de falso positivos (Sawadogo et al., J. Clin. Microbiol., 52(11):3878-83 (2014)).

[0074] O dispositivo de microamostragem útil nos métodos da presente tecnologia compreende uma ponta absorvente tendo uma terminação distai e uma terminação proximal. O comprimento da terminação distai da ponta absorvente é estreito se comparado ao comprimento da terminação proximal. A terminação proximal é ligada a uma recipiente, considerando que a terminação distai é configurada para comunicar um fluido a ser absorvido, tal como sangue. O dispositivo de microamostragem permite que as amostras biológicas fluidas, tais como sangue, sejam facilmente secadas, embarcadas, e depois analisadas mais tarde. Em algumas modalidades, o fluido biológico é o sangue de uma picada no dedo.

[0075] A ação capilar retira o sangue na ponta absorvente. Uma barreia opcional entre a ponta absorvente e o recipiente previne o sangue de passar ou subir por capilaridade para o recipiente. A ponta absorvente é composta de um material que puxa por capilaridade substancialmente o mesmo volume de fluido, mesmo quando o fluido em excesso está disponível (microamostragem absortiva volumétrica ou VAMS®). O volume da ponta absorvente afeta o volume do fluido absorvido. O tamanho e forma da ponta absorvente pode ser variado para ajustar o volume do sangue absorvido e a taxa de absorção. Os volumes de sangue de cerca de 7 a 15 μΐ, cerca de 20 μΐ e ainda até cerca de 30 μΐ podem ser aceitáveis. O tempo de amostragem pode ser de cerca de 2 segundos, cerca de 3 segundos, cerca de 5 segundos, ou até cerca de 10 segundos.

[0076] Em algumas modalidades, o material usado para a ponta absorvente é hidrofílico (por exemplo, poliéster). Altemativamente, o material pode ser inicialmente hidrofóbico e é subsequentemente tratado para tomá-lo

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30/67 hidrofílico. As matrizes hidrofóbicas podem ser tomadas hidrofílicas através de uma variedade de métodos conhecidos, tais como tratamento plasmático ou tratamento tensoativo (por exemplo, Tween-40 ou Tween-80) da matriz. Em algumas modalidades, o tratamento plasmático é usado para tomar um material hidrofóbico tal como uma poliolefina, por exemplo, polietileno hidrofílico. Altemativamente, o enxerto de polímeros hidrofílico à superfície e a funcionalização química dos gmpos ativos na superfície com moléculas polares ou hidrofílicas tais como açúcares podem ser usadas para obter uma superfície hidrofílica para a ponta absorvente. A modificação covalente também pode ser usada para adicionar gmpos funcionais polares ou hidrofílicos à superfície da ponta absorvente, outros materiais adequados para a ponta absorvente incluem vidro sinterizado, aço sinterizado, cerâmica sinterizada, e polímeros plásticos sinterizados, e polietileno sinterizado.

[0077] Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem compreende uma ponta absorvente feita de um material hidrofílico polimérico de tamanho suficiente para absorver um máximo de cerca de 20 μΐ de sangue em cerca de 2 a 5 segundos, e tendo um comprimento de menos do que cerca de 5 mm (0.2 polegadas) e uma área transversal de menos do que cerca de 20 mm²e uma densidade de menos do que cerca de 4 g/cc. Em algumas modalidades, as pontas absorventes são compostas de polietileno e configuradas para absorver cerca de 1 a 20 microlitros de sangue, preferivelmente dentro de 1 a 7 segundos, e mais preferivelmente dentro de cerca de 1 a 5 segundos. A ponta absorvente pode conter um ou mais de sangue seco, anticoagulante seco ou um padrão interno.

[0078] Em algumas modalidades, as pontas absorventes têm um volume de cerca de 35 mm³, absorvem cerca de 13 a 14 microlitros de sangue em cerca de 3 segundos, absorvem de 9 a 10 microlitros de sangue em cerca de 2,5 segundos, e têm um volume de poro de cerca de 38%. Em outras modalidades, as pontas absorventes têm um volume de cerca de 24

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31/67 microlitros, uma densidade de cerca de 0,6 g/cc, absorvem cerca de 10 microlitres de sangue em cerca de 2,5 segundos, e têm um volume de poro de cerca de 40%. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico é uma ponta MITRA®, como descrito na US 2013/0116597, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0079] A ponta absorvente pode ser formada com uma exterior semelhante a um cone truncado com uma extremidade distai estreita e arredondada. Em algumas modalidades, o recipiente tem um poste cilíndrico que se ajusta em um recesso dentro do centro da ponta absorvente e se estende ao longo do eixo longitudinal da ponta absorvente e recipiente. A forma cômica da ponta absorvente ajuda a puxar por capilaridade a amostra de maneira rápida e uniforme.

[0080] O recipiente pode ser adaptado para o uso com uma pipeta. Em algumas modalidades, um recipiente tubular de forma cônica é preferido, com a ponta absorvente na extremidade estreita do recipiente. A extremidade oposta mais ampla do recipiente pode ser fechada, ou aberta e oca, e pode ser opcionalmente configurada para anexar a uma ponta de pipeta. O recipiente pode ter flanges que se estendem para fora que são arranjadas para apoiar estruturas conjugadas nos recipientes, cremalheiras de secagem ou equipamento de secagem para ajudar a posicionar a ponta absorvente nos locais desejados e, tais recipientes, cremalheiras de secagem e equipamento de teste.

[0081] Em algumas modalidades, o recipiente pode incluir uma ponta de ou um estrutura tubular que se afina configurada para embutir com uma ponta de pipeta. A ponta absorvente pode ser composta de polietileno, e tanto a ponta absorvente quanto o recipiente são feitos sob condições assépticas, ou são termicamente esterilizantes. A ponta absorvente pode conter anticoagulante secado. Em algumas modalidades, o recipiente tem uma pluralidade de reforços se estendendo ao longo de um comprimento do

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32/67 recipiente. Os reforços podem ter uma altura e comprimento selecionados para evitar que a ponta absorvente entre em contato com as paredes de um recesso no qual o recipiente e ponta absorvente são colocados para embarque, ou para extração do sangue e seco na ponta absorvente.

[0082] Depois de absorver uma amostra de volume pequena, a ponta absorvente é então secada. Em algumas modalidades, a amostra de sangue de volume pequeno é secada por pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, ou pelo menos 96 horas na temperatura ambiente ou do recinto. Em algumas modalidades, a amostra de sangue de volume pequeno é secada por cerca de 2 a 3 horas.

[0083] A secagem pode ser realizada em uma cremalheira ou recipiente adequados, ou preferivelmente a ponta absorvente e o recipiente podem ser transferidos a um recipiente de secagem especial configurado para facilitar a secagem enquanto minimizando o contato entre a ponta absorvente e as paredes do recipiente de secagem ou outras superfícies contaminantes potenciais. O recipiente de secagem pode ter um dissecante parta facilitar a secagem. O recipiente de secagem também pode prover uma tampa e proteção que pode ser selada para o transporte para prevenir a contaminação. Em algumas modalidades, a tampa tem uma superfície na qual indícios impressos podem ser escritos para identificar a fonte da amostra de sangue seco e fornecer outras informações relevantes. Em algumas modalidades, as dimensões do recipiente, e as posições relativas dos recipientes dentro do recipiente, estarão em conformidade às especificações dá placa SBS Microwell. O dispositivo de microamostragem e o recipiente de secagem podem ser colocados em uma bolsa plástica junto com um dissecante para

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33/67 auxiliar a secagem e pode ser embarcada deste maneira, ou embarcada depois que o dissecante for removido.

[0084] Em algumas modalidades, a extremidade oposta mais ampla do recipiente é oca e o recipiente tem uma primeira porção com uma porção de projeção de montagem medidas para ajustar no e engatar liberavelmente à extremidade oca do recipiente. Adicional ou altemativamente, o recipiente tem uma segunda porção removível ficada à primeira porção e tem um recesso configurado para fechar uma porção do recipiente para o transporte do recipiente. O recipiente pode compreender uma pluralidade de aberturas permitindo que o ar acesse a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem. Além disso, a primeira porção pode ter um lado com uma porta de acesso nesta contida de um tamanho suficiente e localizada de modo que indícios podem ser aplicados através da porta e no recipiente quando o recipiente está na projeção de montagem.

[0085] Na recepção no local de teste, a ponta absorvente pode ser eluída em um volume pré-determinado de um tampão adequado (como aqui descrito) manualmente ou por intermédio de meios automatizados para extrair os ácidos nucleicos ou proteínas de interesse do sangue seco. As técnicas de agitação física tais como a sonicação ou turbilhonamento do fluido e/ou a ponta absorvente podem acelerar o processo de extração do sangue seco em uma matriz de amostra líquida. As técnicas de separação físicas, tais como centrifugação, evaporação/reconstituição, concentração, precipitação, extração de líquido/líquido, e extração de fase sólida podem ser usadas para novamente simplificar a matriz de amostra para outra análise.

[0086] Cada recipiente pode incluir uma pluralidade de dententores, em que cada detentor compreende uma ponta absorvente na sua extremidade distai e tem uma extremidade proximal oca. Do mesmo modo, o recipiente tem uma pluralidade de projeções de montagem alongadas, cada uma medida para ajustar e fixar de forma liberável as extremidades ocas da pluralidade de

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34/67 detentores. A segunda porção do recipiente tem recessos configurados para fechar separadamente cada uma de uma pluralidade de detentores em um compartimento separado dentro do recipiente. Em algumas modalidades, cada uma das pluralidades de detentores tem uma pluralidade de reforços que se estendem ao longo do comprimento do recipiente com os reforços configurados para evitar a ponta absorvente de contato com as paredes do recipiente. Como desejado, um dessecante pode ser colocado dentro do recipiente para ajudar a secar o sangue na ponta absorvente ou manter a secura. Cada detentor pode ter indícios visíveis associando o detentor com o recipiente e com pelo menos um outro detentor, tal como os números de série com várias porções do número indicando os detentores/pontas absorventes e o recipiente no qual os detentores são enviados.

Extração do Ácido Nucleico [0087] Em um aspecto, a presente divulgação provê um método para extrair o DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico (por exemplo, Ponta MITRA®). Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é eluída colocando a ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico em contato com um tampão de lise e proteinase K. O tampão de lise pode compreender cloridrato de guanidina, Tris*Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100. A proteinase K é uma serina protease de amplo espectro que é adequada sobre uma faixa ampla de pH (4a 12), com um pH ótimo de pH 8,0. O sítio predominante da clivagem de Proteinase K é a ligação de peptídeo adjacente ao grupo carbonila dos aminoácidos alifáticos ou aromáticos com grupos alfa amino bloqueados. A elevação da temperatura de reação de 37°C a 50 a 60°C pode aumentar a atividade de Proteinase K em várias vezes. A atividade de Proteinase K pode ser aumentada através da adição de 0,5 a 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 3 M de cloreto de guanidino, 1 M de tiocianato de guanidino, ou 4 M

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35/67 de ureia.

[0088] Altemativamente, outros protocolos para a extração do ácido nucleico podem ser usados nos métodos da presente tecnologia. Os exemplos de outros kits de purificação de ácido nucleico comercialmente disponíveis incluem Molzym GmbH & Co KG (Bremen, DE), Qiagen (Hilden, DE), Macherey-Nagel (Düren, DE), Roche (Basel, CH) ou Sigma (Deisenhofeno, DE). Outros sistemas para a purificação do ácido nucleico, que são fundamentados no uso das esferas de poliestireno etc., como material de suporte também podem ser usados.

[0089] Em algumas modalidades, a extração do DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico compreende desnaturar os complexos nucleoproteicos nas células presentes na amostra de fluido biológico seco. Em algumas modalidades, a extração do DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico compreende remover os contaminantes proteicos, inativando a atividade de nuclease, e/ou removendo os contaminantes biológicos e/ou químicos presentes na amostra de fluido biológico seco.

[0090] Em algumas modalidades, a extração do DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico pode ser realizada usando as plataformas de extração de DNA automatizadas. Em algumas modalidades, a plataforma de extração de DNA automatizada tem uma capacidade de alta taxa de transferência, tal como até 100 extrações por ciclo. Em algumas modalidades, a extração do DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico pode ser realizada usando estações de trabalho comercialmente disponíveis, tais como a automação QIAsymphony® ou Hamilton®. Em

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36/67 algumas modalidades, a extração de DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico é realizada em um sistema automatizado EZ1 Advanced XL, EZ1 Advanced, ou Biorobot® EZ1® com um Kit de pesquisa de DNA EZL Em algumas modalidades, a extração do DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico é realizada usando kits de reagente comercialmente disponíveis.

Plataformas NGS [0091] Em algumas modalidades, o sequenciamento massivamente paralelo com alta taxa de transferência utiliza um sequenciamento-por-síntese com terminadores de corante reversível. Em outras modalidades, o sequenciamento é realizado por intermédio do sequenciamento-por-ligação. Ainda em outra modalidades, o sequenciamento é um sequenciamento de molécula única. Os exemplos de técnicas de sequenciamento de próxima geração incluem, mas não são limitados ao pirosequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento de semicondutor iônico, sequenciamento Helioscope de molécula única etc.

[0092] O sistema de sequenciamento de amplicons Ion Torrent® (Life Technologies, Carlsbad, CA) utiliza um método com base em fluxo que detecta as mudanças do pH causadas pela liberação dos ions de hidrogênio durante a incorporação dos nucleotídeos não modificados na replicação do DNA. Para o uso com este sistema, uma biblioteca de sequenciamento é inicialmente produzida gerando-se os fragmentos de DNA flanqueados pelos adaptadores de sequenciamento. Em algumas modalidades, estes fragmentos podem ser clonalmente amplificados em partículas através do PCR de emulsão. As partículas com o modelo amplificado são depois colocados em um chip de sequenciamento de semicondutor de silício. Durante a replicação,

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37/67 o chip é inundado com um nucleotídeo após o outro, e se um nucleotídeo complementa a molécula de DNA em um micropoço particular do chip, depois este será incorporado. Um próton é naturalmente liberado quando um nucleotídeo é incorporado através da polimerase na molécula de DNA, resultando em uma mudança de local detectável do pH. O pH da solução depois muda naquele poço e é detectado pelo sensor de íons. Se as repetições homopoliméricas estão presentes na sequência de modelo, os nucleotídeos múltiplos serão incorporados em um ciclo único. Isto leva a um número correspondente de hidrogênios liberados e um sinal eletrônico proporcialmente alto.

[0093] O sistema de sequenciamento 454TM GS FLX® (Roche, Alemanha), utiliza uma metodologia de detecção com base em luz em um sistema de sequenciamento de larga escala. O pirosequenciamento usa a polimerização de DNA, adicionando uma espécie de nucleotídeo em um tempo e detectando e quantificando o número de nucleotídeos adicionados a um dado local através da luz emitida pela liberação dos pirofosfatos ligados. Para o uso com o sistema 454®, os fragmentos de DNA ligados ao adaptador são fixados às esferas de captura de DNA em uma emulsão de água em óleo e amplificados através da emulsão de PCR (PCR de emulsão). Cada esfera de ligação ao DNA é colocado em um poço em uma placa de picotitulação e os reagentes de sequenciamento são liberados através dos poços da placa. Os quatro nucleotídeos de DNA são adicionados sequencialmente em uma ordem fixa através do dispositivo de placas picotituladoras durante uma operação de sequenciamento. Durante o fluxo de nucleotídeo, milhões de cópias de DNA ligadas a cada uma das esferas são sequenciadas em paralela. Quando um nucleotídeo complementar ao filamento de molde é adicionado a um poço, o nucleotídeo é incorporado no filamento de DNA existente, gerando um sinal de luz que é registrado por uma câmera de CCD no instrumento.

[0094] Tecnologia de sequenciamento com base em terminadores de

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38/67 corante reversível: As moléculas de DNA são primeiro ligadas aos iniciadores em uma lâmina e amplificadas de modo que as colônias de clones locais sejam formadas. Quatro tipos de bases terminadoras reversíveis (bases de RT) são adicionadas, e os nucleotídeos não incorporados são lavados. Diferente do pirosequenciamento, o DNA pode ser estendido um nucleotídeo por vez. Uma câmera coleta imagens dos nucleotídeos fluorescentemente rotulados, depois o corante junto com o bloqueador terminal 3’ é quimicamente removido do DNA, permitindo o próximo ciclo.

[0095] O sequenciamento de molécula única de Helicos usa os fragmentos de DNA com adaptadores de cauda poliA adicionados, que são ligados à superfície celular do fluxo. Em cada ciclo, o DNA polimerase e uma espécie única de nucleotídeo fluorescentemente rotulado são adicionados, resultando em uma extensão dependente do modelo extensão dos duplexes de iniciador-padrão imobilizados na superfície. As leituras são realizadas pelo sequenciador Helioscope. Depois da aquisição das imagens colocando a matriz completa, a clivagem e a liberação química do rótulo fluorescente permite o ciclo subsequente da extensão e visualização.

[0096] O sequenciamento por síntese (SBS), como o sequenciamento eletroforético de terminação de corante “de estilo antigo”, conta com a incorporação de nucleotídeos por um DNA polimerase para determinar a sequência de base. Uma biblioteca de DNA com os adaptadores fixados é desnaturada em filamentos únicos e enxertada em uma célula de fluxo, seguido pela amplificação de ponte para formar um arranjo de alta densidade de manchas em um chip de vidro. Os métodos terminadores reversíveis usam versões reversíveis de terminadores de corante, adicionando um nucleotídeo em um tempo, detectando a fluorescência em cada posição através da remoção repetida do grupo de bloqueio para permitir a polimerização de outro nucleotídeo. O sinal da incorporação de nucleotídeo pode variar com os nucleotídeos fluorescentemente rotulados, as reações de luz conduzidas por

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39/67 fosfato e a sensibilização de íon de hidrogênio tendo sido todos usados. Os exemplos de plataformas SBS incluem Illumina GA, HiSeq 2500, HiSeq 1500, HiSeq 2000, ou HiSeq 1000. O sistema de sequenciamento pessoal MiSeq® (Illumina, Inc.) também utiliza o sequenciamento por síntese com a química de terminador reversível.

[0097] Ao contrário do sequenciamento pelo método de síntese, o sequenciamento pelo método de ligação usa um DNA ligase para determinar a sequência alvo. Este método de sequenciamento tem base na ligação enzimática dos oligonucleotídeos que são adjacentes através da complementariedade local em um filamento de DNA de modelo. Esta tecnologia utiliza uma partição de todos os oligonucleotídeos possíveis de uma extensão fixa, rotulada de acordo com a posição sequenciada. Os oligonucleotídeos são andados e ligados e a ligação preferencial por DNA ligase para as sequências emparelhadas resulta em um sinal de espaço de cor codificado por dinucleotídeo na posição (através da liberação de uma sonda fluorescentemente rotulada que corresponde a um nucleotídeo conhecido em uma posição conhecida junto com o oligo). Este método é principalmente usado pela sequenciadores SOLiD® da Life Technologies’. Antes do sequenciamento, o DNA é amplificado pelo PCR de emulsão. As esferas resultantes, cada um contendo apenas cópias da mesma molécula de DNA, são depositadas em um substrato planar sólido.

[0098] O sequenciamento SMRT® tem base no sequenciamento pelo método de síntese. O DNA é sintetizado em guias de onda no modo zero )recipientes semelhantes a poço pequeno (ZMWs com as ferramentas de captura localizadas no fundo do poço. O sequenciamento é realizado com o uso de polimerase não modificada (ligada ao fundo do ZMW) e os nucleotídeos fluorescentemente rotulados fluindo livremente na solução. Os poços são construídos de uma maneira que somente a fluorescência que ocorre no fundo do poço é detectada. O rótulo fluorescente é destacado do

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40/67 nucleotídeo na sua incorporação no filamento do DNA, deixando um filamento de DNA não modificado.

[0099] O sequenciamento de alta taxa de transferência de DNA também pode ocorrer usando chips AnyDot (Genovoxx, Alemanha), que permite a monitoração dos processos biológicos (por exemplo, a expressão de miRNA ou variabilidade de alelo (detecção de SNP)). Por exemplo, os chips AnyDot permitem o aumento de 10X-50X da detecção de sinal da fluorescência de nucleotídeo. Outros sistemas de sequenciamento de alta taxa de transferência incluem aqueles divulgados em Venter, J., et al., Science 16 de fevereiro de 2001; Adams, M. et al., Science 24 de março de 2000; e M. J, Levene, et al., Science 299:682-686, janeiro de 2003; bem como a Pub. de Pedido U.S. No. 2003/0044781 e 2006/0078937.

Ensaios de Detecção de Fibrose Cística da Presente Tecnologia [00100] São aqui providos os métodos para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico CFTR compreendendo gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra, em que o ácido nucleico de CFTR da amostra é extraído de uma amostra de fluido biológico seco eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem (por exemplo, ponta MITRA®) com um tampão de lise e Proteinase K. Em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação no ácido nucleico de CFTR da amostra é selecionada entre uma mudança de base, uma exclusão de gene e uma duplicação de gene. Em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação no ácido nucleico de CFTR da amostra está associada com a fibrose cística, e compreende uma ou mais das mutações listadas na Tabela 2 da presente divulgação. Em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação do ácido nucleico de CFTR da amostra é detectada usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris’Cl, EDTA, Tween 20, e Triton

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X-100.

[00101] Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seca é obtida de um paciente exibindo sintomas de fibrose cística, ou tem um histórico familiar de fibrose cística ou uma mutação de CFTR. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é obtida de um parceiro do sexo masculino de uma paciente de obstetrícia e ginecologia tendo fibrose cística ou pelo menos uma mutação CFTR. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco é obtida de um paciente que é incapaz de prover grandes volumes de sangue para o teste recorrente, tal como uma criança ou uma pessoa idosa.

[00102] Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada de um paciente por intermédio da picada no dedo. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. A eluição da amostra de fluido biológico seco pode ser realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com um tampão de lise e Proteinase K. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris’Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100. Em uma outra modalidade, o tampão de lise compreende 800 mM de cloridrato de guanidina; 30 mM de Tris*Cl, pH a 8,0; 30 mM de EDTA, pH a 8,0; 5% de Tween 20; e 0,5% de Triton X-100.

[00103] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com o tampão de lise durante até 15 minutos a 90°C. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com Proteinase K durante até 1 hora a 56°C. Em outras

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42/67 modalidades, a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com a Proteinase K durante até 16 a 18 horas a 56°C. Em algumas modalidades, o volume de amostra do dispositivo de microamostragem não é maior do que 10 a 20 μΐ.

[00104] Em algumas modalidades do método, não mais do que 400 ng de DNA genômico são eluídos da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem. Em outras modalidades do método, cerca de 100 ng a cerca de 400 ng do DNA genômico são eluídos da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem. Em algumas modalidades, o método também compreende ligar uma sequência adaptadora às terminações da pluralidade de amplicons. A sequência adaptadora pode ser um adaptador P5, adaptador P7, adaptador Pl, adaptador A, ou um adaptador de “código de barras” lon Xpress®. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, o método também compreende hibridizar uma ou mais sequências iscas a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra.

[00105] Em algumas modalidades, o segmento de alvo CFTR que é amplificado e sequenciado de acordo com a presente tecnologia pode representar um ou mais indivíduo exon(s) ou porção(ões) de exon(s) do gene CFTR ou uma ou mais porções de um mRNA ou cDNA de CFTR. Um segmento alvo também pode incluir a região promotora de CFTR e/ou um ou mais introns de CFTR. Em algumas modalidades, os segmentos alvos representam o gene de CFTR inteiro ou a região inteira que codifica CFTR. Em algumas modalidades, os segmentos alvos representam a região inteira que codifica o CFTR e pelo menos um intron ou uma porção deste, e uma região adjacente localizada imediatamente a montante (na direção 5’) da sequência de codificação. A região adjacente a montante pode compreende de cerca de 100 nucleotídeos até cerca de 500, 750, 1000, 1100, ou 1200

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43/67 nucleotídeos da sequência localizados imediatamente a montante da sequência de codificação e CFTR. Em algumas modalidades, a região adjacente a montante compreende toda ou uma porção da sequência promotora de CFTR. Em algumas modalidades, o ácido nucleico CFTR da amostra é um DNA genômico.

[00106] Em um outro aspecto, a presente divulgação provê um método para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico de CFTR compreendendo gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra, em que o ácido nucleico de CFTR da amostra é extraído de uma amostra de fluido biológico seco eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem com um tampão de lise e Proteinase K, e detectar a pelo menos uma mutação no ácido nucleico de CFTR da amostra usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento. Em algumas modalidades, o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris*Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100.

[00107] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra compreende pelo menos uma alteração comparada à região correspondente de uma sequência de nucleotídeo de CFTR de referência. Uma sequência de nucleotídeo de CFTR de referência pode ser uma sequência genômica de CFTR ou uma sequência de cDNA, ou uma porção destes, a partir de um indivíduo normal (que não aflito por fibrose cística e não carregador da fibrose cística). Em alguns casos, uma sequência de CFTR de referência pode compreender uma sequência de nucleotídeo CFTR do tipo selvagem. Vários métodos conhecido na técnica (por exemplo, método de profundidade de leitura) podem ser utilizados para analisar os dados de sequenciamento para determinar se as diferenças estão presentes no ácido nucleico de CFTR da sequência de amostra se comparado a uma sequência de CFTR do ácido

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44/67 nucleico de referência.

[00108] Em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação no ácido nucleico CFTR da amostra é selecionada de uma mudança de base, uma exclusão de gene e uma duplicação de gene. Em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação no ácido nucleico de CFTR da amostra está associada com a fibrose cística, e pode incluir mais ou mais mutações divulgadas na Tabela 2.

[00109] Em algumas modalidades, os métodos aqui divulgados podem ser usados para detectar uma ou mais mutações de CFTR raras ou mutações privadas em uma amostra de CFTR de ácido nucleico obtida de um indivíduo, identificando deste modo um indivíduo que possui uma ou mais mutações de CFTR rara(s) ou privada(s). Em algumas modalidades, os métodos da presente tecnologia são usados para identificar as mutações familiares raras em um carregador da fibrose cística compelido depois do carregador ter sido testado negativo em um teste de triagem de rotina para as mutações comuns. Tais testes de triagem de rotina podem incluir a Triagem de Mutação de CF (Quest Diagnostics), Triagem de CFTR, Triagem de Fibrose Cística (Quest Diagnostics), e Triagem de Carregador da Fibrose Cística (LabCorp). Em algumas modalidades, os presentes métodos também podem ser usados para identificar as mutações raras em um indivíduo afetado pela fibrose cística (isto é, sintomático) que não teve duas mutações de sequência de CFTR identificadas por pelo menos um teste de triagem de mutação de fibrose cística de rotina.

[00110] Em um aspecto, a presente divulgação provê um método para detectar uma base genética para ser afetada com a fibrose cística, ou para ser um carregador da fibrose cística em um indivíduo compreendendo: (a) gerar uma biblioteca de amplicon amplificando-se os múltiplos segmentos alvos de um ácido nucleico de CFTR obtidos a partir do indivíduo, em que o ácido nucleico de CFTR da amostra é extraído de uma amostra de fluido biológico

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45/67 seco eluído de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem; (b) sequenciar os amplicons na biblioteca de amplicon usando o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento, e (c) detectar uma base genética para ser afetada com fibrose cística, ou para ser um carregador da fibrose cística quando a sequência de nucleotídeo de um ou mais dos segmentos alvos do ácido nucleico CFTR compreendem uma mutação associada com a fibrose cística.

[00111] Em algumas modalidades, os métodos aqui divulgados são utilizados para confirmar o estado do carregador da fibrose cística em um indivíduo, tal como, por exemplo, um pai ou mãe, um irmão ou irmã ou outros parentes de um indivíduo afetado com fibrose cística com uma ou mais mutações raras ou privadas. Em algumas modalidades, a pelo menos uma mutação está associada com a fibrose cística, e inclui uma ou mais mutações divulgadas na Tabela 2. Tanto a sequência genética quanto a dosagem genética pode ser determinada em uma amostra de ácido nucleico usando os métodos aqui divulgados. A dosagem de genes (também indicadas como uma variação do número de cópias ou CNVs) pode ser determinada realizando-se o sequenciamento de próxima geração e usando um método de profundidade de leitura. As CNVs são ganhos e perdas da sequência genômica >50 pares de base entre dois indivíduos de uma espécie (Mills et al., Nature 470: 59-65 (2011)). Uma dosagem formal em relação a todos os outros amplicons para uma amostra normal será, Vi para uma exclusão homozigótica e 1½ para uma duplicação homozigótica.

[00112] Em algumas modalidades, pelo menos 2, 5, 10, 20, 25, ou 28 e até 25, 29, ou 30, de segmentos alvos do gene CFTR podem ser sequenciados com ganhos e perdas da sequência genômica (>50 pares de base) determinados usando um método de profundidade de leitura. Em uma modalidade, 29 segmentos alvos são sequenciados, representado a região que codifica CFTR (incluindo todas as junções de exons/introns). Em uma outra

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46/67 modalidade, a região que codifica CFTR (incluindo todas as junções de exons/introns) além de cerca de 1 kb a montante e cerca de 300 kb a jusante do gene CFTR são ensaiados.

[00113] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, cada segmento alvo do ácido nucleico de CFTR pode ser amplificado com um preparador de oligonucleotídeo ou par de preparadores específicos para o segmento alvo. Em algumas modalidades um único preparador ou ambos os iniciadores de um par de preparadores compreendem uma sequência adaptadora específica (também indicada como um sequenciamento adaptador) ligado à terminação 5’ da porção de alvo específica do iniciador. Este sequenciamento adaptador é um oligonucleotídeo curto de sequência conhecida que pode fornecer um sítio de iniciação tanto para a amplificação quanto para o sequenciamento do ácido nucleico contíguo desconhecido. Como tal, os adaptadores permitem a ligação de um fragmento para uma célula de fluxo para o sequenciamento de próxima geração. Qualquer sequência adaptadora pode ser incluída em um iniciador usado na presente tecnologia. Em algumas modalidades, os amplicons correspondentes à pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra são gerados usando os iniciadores que contém um adaptador de sequenciamento de oligonucleotídeo para produzir os amplicons rotulados com adaptador. Em outras modalidades, os iniciadores utilizados não contém as sequências adaptadoras e os amplicons produzidos são subsequentemente (isto é, depois da amplificação) ligados a um adaptador de sequenciamento de oligonucleotídeo em uma ou ambas extremidades dos amplicons.

[00114] Em algumas modalidades, todos os amplicons avançados (isto é, amplicons estendidos dos iniciadores avançados que hibridizaram com os filamentos antissentido de um segmento alvo) contêm a mesma sequência adaptadora. Em algumas modalidades quando o sequenciamento de filamento duplo é realizado, todos os amplicons avançados contém a mesma sequência

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47/67 adaptadora e todos os amplicons reversos (isto é, amplicons estendidos dos iniciadores reversos que hibridizaram com filamentos antissentido de um segmento alvo) contêm uma sequência adaptadora que é diferente da sequência adaptadora dos amplicons avançados. Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras também compreendem uma sequência de índice (também indicadas como um rótulo de indexação, um “código de barras” ou um identificador de multiplexos (MID)).

[00115] Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras são as sequências adaptadoras de P5 e/ou P7 que são recomendadas para os sequenciadores Illumina (MiSeq e HiSeq). Ver, por exemplo, WilliamsCarrier et al., Plant J., 63(1):167-77 (2010). Em algumas modalidades, as sequências adaptadoras são as sequência adaptadoras Pl, A, ou de código de barras lon Xpress® que são recomendadas para os sequenciadores da Life Technologies. Outras sequências adaptadoras são conhecidas na técnica. Alguns fabricantes recomendam as sequências adaptadoras específicas para o uso com a tecnologia de sequenciamento particular e maquinaria que estes oferecem.

[00116] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, os amplicons correspondentes à pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra de mais do que uma amostra são sequenciados. Em algumas modalidades, todas as amostras são sequenciadas simultaneamente em paralelo. Em qualquer uma das modalidades acima, os amplicons correspondentes à pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra de pelo menos 1, 5, 10, 20, 30 ou até 35, 40, 45, 48 ou 50 amostras diferentes são amplificadas e sequenciadas usando os métodos aqui descritos.

[00117] Em algumas modalidades, os amplicons derivados de uma fonte de amostra única também compreende uma sequência de índice idêntica que indica a fonte a partir da qual o amplicon é gerado, a sequência de índice

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48/67 para cada amostra sendo diferente das sequências de índice de todas as outras amostras. Como tal, o uso das sequências de índice permite que amostras múltiplas sejam reunidas por operação de sequenciamento e a fonte de amostra subsequentemente determinada com base na sequência do índice. Em algumas modalidades, o Sistema Access Array® (Fluidigm Corp., San Francisco, CA) ou o Sistema Apollo 324 (Wafergen Biosystems, Fremont, CA) é usado para gerar uma biblioteca de código de barras (indexada) de amplicon simultaneamente amplificando-se os ácidos nucleicos das amostras em um ajuste.

[00118] Em algumas modalidades, os amplicons indexados são gerados usando iniciadores (por exemplo, iniciadores avançado e/ou iniciadores reversos) contendo a sequência de índice. Tais iniciadores de indexação podem ser incluídos durante a preparação da biblioteca como uma ferramenta de “código de barras” para identificar os amplicons específicos como se originando de uma fonte de amostra particular. Quando os iniciadores ligados ao adaptador e/ou indexados são utilizados, a sequência adaptadora e/ou a sequência de índice se incorpora no amplicon (junto com a sequência de iniciador específica ao alvo) durante a amplificação. Portanto, os amplicons resultantes são competentes do sequenciamento e não requerem o protocolo de preparação de biblioteca tradicional. Além disso, a presença do rótulo de indexação permite o diferenciamento das sequências a partir de fontes de amostra múltiplas.

[00119] Em algumas modalidades, os amplicons podem ser amplificados com iniciadores não ligados ao adaptador e/ou não indexados e um adaptador de sequenciamento e/ou uma sequência de índice pode ser substancialmente ligada a uma ou ambas as extremidades de cada um dos amplicons resultantes. Em algumas modalidades, a biblioteca de amplicon é gerada usando um método de PCR multiplexado.

[00120] Os amplicons indexados de mais do que uma fonte de amostra

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49/67 são individualmente quantificados e depois reunidos antes do alto sequenciamento de transferência de dados. Como tal, o uso das sequências de índice permitem amostras múltiplas (isto é, amostras de mais do que uma fonte de amostra) a ser reunida por operação de sequenciamento e a fonte da amostra subsequentemente determinada com base na sequência de índice. “Multiplexação” é a reunião de adaptadores múltiplos rotulados e bibliotecas indexadas em uma única operação de sequenciamento. Quando os conjuntos de iniciadores indexados são usados, esta capacidade pode ser explorada por estudos comparativos. Em algumas modalidades, os amplicons de mais do que uma fonte de amostra são reunidos antes do sequenciamento de alta taxa de transferência. Em algumas modalidades, as bibliotecas de amplicon de até 48 fontes separadas são reunidos antes do sequenciamento.

[00121] Em algumas modalidades, os modelos de sequenciamento (amplicons) são preparados através da amplificação clonal com base em emulsão dos segmentos alvos usando os iniciadores de fusão especializados (contendo uma sequência adaptadora) e esferas de captura. Um fragmento de ligação adaptadora única é ligado à superfície de um leito, e uma emulsão em óleo contendo os reagentes de amplificação necessários é formada em torno do componente de esfera/fragmento. A amplificação em paralelo dos milhões de esferas com milhões de fragmentos de filamento único produzem uma biblioteca sequenciadora pronta.

[00122] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, os amplicons que constituem a biblioteca de amplicon rotulado com adaptador (e, opcionalmente, indexado) são produzidos através da reação de cadeia de polimerase (PCR). Em algumas modalidades, a biblioteca de amplicon é gerada usando um método de PCR multiplexado, tal como aquele divulgado na Pat. U.S. No. 8.092.996, aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00123] O PCR de ponte é ainda um outro método para a amplificação clonal in vitro depois de uma biblioteca ser gerada, em preparação para o

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50/67 sequenciamento. Este processo é um meio para amplificar clonalmente uma molécula alvo simples, um membro de uma biblioteca, em uma região física definida tal como uma superfície sólida, por exemplo, uma esfera em suspensão ou um cluster em um lâmina de vidro. Neste método, os fragmentos são amplificados usando iniciadores ligados à superfície sólida formando “as colônias de DNA” ou “clusters de DNA.” Este método é usado em alguns dos sequenciadores analisadores de genomas fabricados pela Illumina, Inc. (San Diego, Calif.).

[00124] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, a pluralidade de amplicons são enriquecidas usando um conjunto de iscas compreendendo as sequência de ácidos nucleicos que são complementares a pelo menos uma da pluralidade de amplicons. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos do conjunto de iscas são iscas de RNA, iscas de DNA, ou uma combinação destes.

[00125] Após a produção de uma biblioteca de amplicon, os amplicons são sequenciados usando sequenciamento paralelo massivo com alta taxa de transferência, (isto é, sequenciamento de próxima geração). Os métodos para realizar o sequenciamento massivamente paralelo com alta taxa de transferência são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento é realizado usando pirosequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento de semicondutor iônico, sequenciamento Helioscope de molécula única, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, ou sequenciamento por SMRT®.

Tratamento da Fibrose Cística [00126] São aqui divulgados os métodos para determinar se um paciente se beneficiará de um ou mais tratamentos para fibrose cística.

[00127] Os exemplos de tratamento para a fibrose cística são bem conhecidos na técnica e incluem as terapias que controlam o microbioma

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51/67 infeccioso em um sistema de paciente, tal como tratamento com antibióticos ou medicações anti-inflamatórias, terapias físicas do tórax (CPTs), técnicas de depuração das vias aéreas (ACTs) e medicações, terapias de nutrição, transplantes de órgãos (por exemplo, cirurgia de substituição do pulmão), etc. [00128] Os antibióticos adequados ou combinação de anticorpos podem ser usados para tratar infecções associadas com a fibrose cística. As classes de antibióticos que são úteis no tratamento da fibrose cística incluem Penicilinas tais como penicilina e amoxicilina, Cefalosporinas tais como cefalexina (Keflex), Macrólideos tais como eritromicina (E-Micina), claritromicina (Biaxin), e azitromicina (Zithromax), Fluoroquinolonas tais como ciprofolxacin (Cipro), levofloxacina (Levaquina), e ofloxacina (Floxina), Sulfonamidas tais como co-trimoxazol (Bactrim) e trimetoprim (Proloprim), Tetraciclinas tais como tetraciclina (Sumicina, Pamicina) e doxiciclina (Vibramicina), aminoglicosídeos tais como gentamicina (Garamicina) e tobramicina (Tobrex), e Colistina.

[00129] As medicações anti-inflamatórias podem ser usadas para reduzir a inflamação e dor causada pelas infecções associadas pela fibrose cística. As classes de medicações anti-inflamatórias incluem agentes antiinflamatórios com base em esteroides, tais como Ancinonida, Diproprionato de betametasona, Clobetasol, Clocortolona, Dexametasona, Diflorasona, Dutasterida, Pivalato de flumetasona, Flunisolida, Fluocinolona Acetonida, Fluocinonida, Fluorometolona, Propionato de Fluticasona, Propionato de Fluticasona, Propionato de Fluticasona, Flurandrenolídeo e Hidroflumetiazida. Fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) incluem aceclofenaco, acemetacina, aspirina, celecoxib, dexibuprofeno, dexcetoprofeno, diclofenaco, etodolac, etoricoxib, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxen, sulindac, tenoxicam, e ácido tiaprofênico.

[00130] As medicações para a diluição de muco pode ser usada para

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52/67 auxiliar a manter o pulmão e as vias aéreas de um paciente limpas. As classes de medicação para a diluição de muco incluem expectorantes, anti-histaminas, e supressores de tosse, tais como Guaifenesina, Dextrometorfano, Soluções salinas hipertônicas, domase alfa e mucolíticos.

[00131] As terapias físicas para o tórax (CPTs) podem envolver golpes ou percussão no peito. Golpear o tórax do paciente e de volta repetidamente pode ajudar a desprender e expelir o muco dos pulmões de modo que o paciente possa tossir o muco. Em alguns regimes terapêuticos de fibrose cística, a CPT é realizada no paciente de três a quatro vezes ao dia. Em alguns regimes terapêuticos de fibrose cística, os pacientes podem sentar ou deitar no seu estômago enquanto a CPT é realizada para facilitar a drenagem do muco dos pulmões. Alguns dispositivos podem ser usados em CPT para reduzir o desconforto do paciente durante o processo. Os dispositivos exemplares incluem, mas não são limitados a, um golpeador de peito elétrico, um colete terapêutico inflável que usa ondas de ar de alta frequência para forçar o muco para fora do pulmões, um dispositivo de flutuação que um paciente usa para respirar, causando vibrações que expelem o muco, e uma máscara de pressão espiratória positiva que cria uma retropressão para ajudar a manter as vias aéreas abertas, facilitando novamente que o muco seja expelido das paredes das vias aéreas.

[00132] As técnicas de depuração das vias aéreas (ACTs) podem ajudar a soltar o muco grosso pegajoso de modo que este possa ser depurado dos pulmões do pacientes através da tosse ou da expiração forçada. A depuração das vias aéreas pode ajudar a diminuir as infecções pulmonares e melhorar a função pulmonar. Várias ACTs são conhecidas e clinicamente realizadas. Por exemplo, a tosse é uma técnica de depuração das vias aéreas básica. A tosse pode ser um reflexo involuntário ou pode ser controlada como uma maneira saudável natural para os pulmões eliminar o muco. Adicionalmente, Várias técnicas de respiração também podem ajudar a limpar

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53/67 as vias aéreas do paciente. Os exemplos destas técnicas incluem a técnica de expiração forçada (FET) que envolve forçar algumas respirações das espirações forçadas seguido pela respiração relaxada; e respiração de ciclo ativo (ACB) que envolve exercícios de respiração profunda que podem perder o muco e ajudar a abrir as vias aéreas. Em alguns regimes terapêuticos da fibrose cística, as ACTs são usadas com outros tratamentos, incluindo as medicações de inalação que ajudam a relaxar os músculos da parede das via aéreas, e dissolver e expelir o muco. Tais medicações podem incluir, mas não são limitadas aos broncodilatadores, antibióticos, e diluentes de muco. Em algumas modalidades, as medicações são tomadas através de um ACTs durante a nebulização.

[00133] A terapia nutricional pode ser usada sozinha ou em combinação com outras terapias para tratar a fibrose cística. Por exemplo, um paciente pode receber enzimas pancreáticas que auxiliam na digestão de gorduras e proteínas, e a absorção de vitaminas. Os suplementos de vitamina A, D, E, e K podem ser administrados ao paciente para prover uma fonte adicional de vitaminas solúveis em gordura. Os tubos de alimentação tais como um tubo de gastronomia (tubo G), podem ser usados para alimentar as soluções nutricionais diretamente ao estômago do paciente. As medicações ou suplementos que podem reduzir o ácido do estômago podem ser administradas concomitantemente com as enzimas pancreáticas orais. Outros diluentes de muco podem ser administrados individualmente ou concomitantemente para tratar o bloqueio intestinal como parte de uma terapia nutricional corrigindo-se os problemas digestivos.

[00134] Em um aspecto, a presente divulgação provê um método para selecionar um paciente apresentando sintomas de fibrose cística, ou um paciente em risco para fibrose cística para o tratamento com um agente terapêutico anti-fibrose cística compreendendo (a) eluir uma amostra de fluido biológico seco do paciente de uma ponta absorvente de um dispositivo

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54/67 de microamostragem, em que a amostra de fluido biológico seco compreende uma amostra de ácido nucleico CFTR; (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra; (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um dos amplicons na biblioteca usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento; e (d) selecionar o paciente para o tratamento com um agente terapêutico anti-fibrose cística. A amostra de fluido biológico seco pode ser plasma seco, soro seco, ou sangue total seco. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é um dispositivo de microamostragem absorvente volumétrico. Em algumas modalidades, a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada de um paciente por intermédio da picada no dedo. Em algumas modalidades, o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®. Em algumas modalidades, o paciente abriga uma ou mais mutações no gene CFTR e pode incluir uma ou mais mutações listadas na Tabela 2.

[00135] Os pacientes em risco para fibrose cística incluem os sujeitos tendo: (a) uma base genética para a fibrose cística; (b) pelo menos um pai ou mãe ou pelo menos um avô ou avó tendo uma base genética para a fibrose cística, tal como sendo um carregador da fibrose cística; (c) incidências familiares da fibrose cística em múltiplas gerações; ou (d) um ou mais sintomas possivelmente relacionados a ou causados pela fibrose cística.

[00136] Os sintomas relacionados com a fibrose cística incluem, mas não são limitados a, perturbações na secreção do corpo do muco e suor, bem como as complicações e sintomas associados no sistema respiratório, sistema digestivo, e sistema reprodutivo. Por exemplo, um paciente com fibrose cística pode apresentar rotineiramente grandes quantidades de muco espesso, pegajoso, e algumas vezes com sangue que se acumula nos pulmões e nas vias aéreas. Esta formação do muco pode resultar em tosse, ofegação ou respiração

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55/67 curta, e também pode tornar mais fácil para a bactéria causar infecções no sistema respiratório. Uma infecção causada por um patógeno não usual que não responde aos antibióticos padrão, tais como infecções pulmonares causadas por Pseudomonas mucoid, pode ser um sinal da fibrose cística. Os sintomas adicionais relacionados com a fibrose cística podem incluir infecções dos seios nasais, bronquite ou pneumonia, neoplasmas (isto é, pólipos) no nariz.

[00137] Um paciente com fibrose cística pode apresentar tubos obstruídos com muco no pâncreas. Estes bloqueios previnem a liberação de enzimas digestivas ao trato intestinal, que resulta na digestão e absorção prejudicada. Portanto, os sintomas relacionados com a fibrose cística também podem incluir a perda de peso ou falha no ganho de peso, diarréia constante ou fezes volumosas, mal cheirosas e gordurosas, bloqueios intestinais, gases em excesso, constipação, dor e desconforto no estômago. No longo prazo, estas complicações do sistema digestivo podem resultar na má nutrição, pancreatite, prolapso retal, doenças hepáticas, diabetes, e cálculos biliares.

[00138] Os sinais e sintomas relacionados com a fibrose cística incluir infertilidade, baixa densidade óssea e distúrbios de desbaste ósseo relacionados, tais como osteoporose, suor muito salgado, desidratação, desequilíbrio dos fluidos corporais e taxa cardíaca aumentada resultante, fatiga, fraqueza, baixa pressão sanguínea, insolação, e ampliação e arredondamento das pontas dos dedos e dedos do pé conhecidos como braqueteamento.

[00139] Em algumas modalidades, o tratamento da fibrose cística compreende uma ou mais de terapia de controle da infecção, terapia física do tórax, terapia de depuração das via aéreas, terapia de nutrição, e transplante de órgãos.

[00140] Em qualquer uma das modalidades acima, o agente terapêutico anti-fibrose cística é um ou mais agentes selecionados do grupo consistindo

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56/67 de penicilina, amoxicilina, cefalosporinas, macrólidos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, Tetraciclinas, aminoglicosideos, colistina, Ancinonida, Diproprionato de betametasona, Clobetasol, Clocortolona, Dexametasona, Diflorasona, Dutasterida, Pivalato de flumetasona, Flunisolida, Fluocinolona Acetonida, Fluocinonida, Fluorometolona, Propionato de fluticasona, Propionato de fluticasona, Propionato de fluticasona, Flurandrenolida, Hidroflumetiazida, aceclofenaco, acemetacina, aspirina, celecoxib, dexibuprofeno, dexcetoprofeno, diclofenaco, etodolac, etoricoxib, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofênico, expectorantes, anti-histaminas, supressores de tosse, Dextrometorfano, soluções salinas hipertônicas, alfa dornase, mucoliticos, enzimas pancreáticas, vitamina A, vitamina D, vitamina E, vitamina K, e suplementos que reduzem o ácido do estômago.

Kits [00141] A presente divulgação provê kits para detectar uma ou mais mutações em uma amostra de ácido nucleico CFTR em uma amostra de fluido biológico seco. Em algumas modalidades, os kits compreendem uma ferramenta de punção da pele, um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico, um tampão de lise, e proteinase K, em que a uma ou mais mutações compreende uma ou mais mutações listadas na Tabela 2. O tampão de lise pode compreender cloridrato de guanidina, Tris*Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100. Em outras modalidades, o tampão de lise compreende de 2,5 a 10% de dodecil sulfato de sódio.

[00142] Em algumas modalidades, os kits também compreendem um ou mais componentes para desnaturar os complexos nucleoproteicos nas células presentes na amostra de fluido biológico seco. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, os kits também compreendem um ou mais componentes para remover os contaminantes proteicos, inativar a

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57/67 atividade da nuclease, e/ou remover os contaminantes biológicos e/ou contaminantes químicos presentes na amostra de fluido biológico seco.

[00143] Em algumas modalidades, os kits também compreendem um ou mais pares de iniciadores que hibridizam a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra. Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, os kits também compreende, uma ou mais sequências iscas que hibridizam a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra correspondem a uma região de codificação ou não codificação do gene CFTR, tal como uma região de exon ou intron. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra correspondem a uma sequência reguladora da região de CFTR, tal como uma região promotora de CFTR ou uma região reguladora a jusante region. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra podem incluir uma ou mais mutações de CFTR listadas na Tabela 2.

[00144] Particularmente, em algumas modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem um ou mais pares de iniciadores ou sequências iscas que seletivamente hibridizam a, e são úteis na amplificação ou captura de um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra. Particularmente, em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra correspondem a uma região de codificação ou não codificação do gene CFTR, tal como uma região de exon ou intron. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra corresponde a uma sequência reguladora da região de CFTR, tal como uma região promotora de CFTR ou uma região reguladora a jusante. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra podem incluir uma ou mais mutações de CFTR listadas na Tabela 2. [00145] Em algumas modalidades, os kits da presente tecnologia

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58/67 compreendem um único par preparador ou uma sequência de isca que hibridizam para um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra. Os exemplos de pares de iniciadores úteis podem ser encontrados na PCT/US2014/027870, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em outras modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem múltiplos pares de iniciadores ou sequências iscas que hibridizam a múltiplos segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra. Em algumas modalidades, os kits da presente tecnologia compreendem pares de iniciadores múltiplos ou sequências iscas compreendendo mais do que um par de preparadores ou mais do que uma sequência isca que hibridiza a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra correspondem a uma região de codificação ou não codificação do gene CFTR, tal como uma região de exon ou intron. Em algumas modalidades, os segmentos alvos do ácido nucleico de CFTR da amostra correspondem a uma sequência reguladora da região de CFTR, tal como uma região promotora de CFTR ou uma região reguladora a jusante. Deste modo, é aqui considerado que os kits da presente tecnologia podem compreender os pares de iniciadores ou sequências iscas que reconhecem e especificamente hibridizam a um ou mais segmentos alvos de uma amostra de ácido nucleico de CFTR.

[00146] Em qualquer uma das modalidades acima dos kits da presente tecnologia, o dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico é uma ponta MITRA®.

[00147] Em algumas modalidades, os kits podem compreender uma pluralidade de dispositivos de microamostragem absortiva volumétricos, cada um tendo um vasilhame oco na extremidade proximal e uma ponta absorvente na extremidade distal. A ponta absorvente compreende um material hidrofílico polimérico configurado para absorver 30 microlitros ou menos de sangue dentro de cerca de 10 segundos ou menos. O kit também inclui um

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59/67 recipiente tendo uma pluralidade de compartimentos. Cada compartimento é configurado para se encaixar de maneira desafixável um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico. O recipiente é configurado para prevenir as pontas absorventes dos dispositivos de microamostragem das adjacências dos compartimentos dentro dos quais o dispositivo de microamostragem é colocado.

[00148] Adicional ou altemativamente, em algumas modalidades, os kits podem incluir uma pluralidade de portas de acesso com cada porta associada com um compartimento individual. Cada porta está localizada para permitir a impressão no vasilhame de um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico presente dentro do compartimento com o qual a porta está associada. Em algumas modalidades, o vasilhame de um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico tem uma pluralidade de reforçadores que se estendem ao longo do recipiente com os reforços configurados para evitar que a ponta absorvente comuniquem com as paredes do recipiente. O recipiente preferivelmente tem duas partes configuradas para formar os compartimentos de forma tubular. O recipiente pode ter uma primeira parte com uma pluralidade de protrusões de montagem alongadas, cada uma se estendendo ao longo de uma porção de um diferente compartimento. A extremidade oca do recipiente do dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico se ajusta na protrusão de montagem para apertar de forma removível o vasilhame na protusão de montagem.

[00149] Em algumas modalidades, os kits também compreendem tampões, enzimas tendo atividade de polimerase, enzimas tendo atividade de polimerase e atividade de exonuclease sem 5’—>3’ ou a atividade de nuclease tanto de 5’—> 3’ quanto de 3’—> 5’, os cofatores de enzima tais como magnésio ou manganês, sai, nucleotídeos de extensão de cadeia tais como trifosfatos de desoxinucleosídeos (dNTPs), dNTPs modificados, dNTPs resistentes à nuclease ou dNTPs rotulados, necessários para carregar um

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60/67 ensaio ou reação, tal como a amplificação e/ou detecção de uma ou mais mutações hereditárias de fibrose cística aqui descritas, em uma amostra de fluido biológico seco.

[00150] Em um modalidade, os kits da presente tecnologia também compreendem uma sequência de ácido nucleico de controle positivo e uma sequência de ácido nucleico de controle negativo para garantir a integridade do ensaio durante as operações experimentais. O kit também pode compreender as instruções para o uso, suporte lógico para a análise automatizada, recipientes, acondicionamentos tis como acondicionamentos intencionados para a venda comercial e os semelhantes.

[00151] O kit também pode compreender um ou mais de: tampões e/ou reagentes de lavagem, tampões e/ou reagentes de hibridização, tampões e/ou reagentes de rotulação, e meios de detecção. Os tampões e/ou reagentes são geralmente aperfeiçoados para a técnica de amplificação/detecção particular para a qual o kit é intencionado. Os protocolos para usar estes tampões e reagentes para realizar diferentes etapas do procedimento também podem ser incluídos no kit.

[00152] Os kits da presente tecnologia podem incluir componentes que são usados para preparar ácidos nucleicos de uma amostra de fluido biológico seco para a subsequente amplificação e/ou detecção de alterações em uma amostra de ácido nucleico CFTR (por exemplo, mutações de CFTR divulgadas na Tabela 2). Tais componentes de preparação de amostra podem ser usados para produzir extratos de ácido nucleico a partir das amostras de fluido biológico seco, tal como soro seco, plasma seco, ou sangue total seco. As amostras de teste usadas nos métodos acima descritos variarão com base nos fatores tais como o formato do ensaio, a natureza do método de detecção, e as células ou extratos específicos usados como a amostra de teste a ser ensaiada. Os métodos de extrair os ácidos nucleicos das amostras são bem conhecidos na técnica e podem ser prontamente adaptados para obter uma

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61/67 amostra que é compatível com o sistema utilizado. Os sistemas de preparação de amostra automatizados para extrair os ácidos nucleicos de uma amostra de teste são comercialmente disponíveis, por exemplo, sistema de preparação de amostra Roche Molecular Systems’ COBAS AmpliPrep System, Qiagen’s BioRobot 9600, Qiagen’s BioRobot EZ1, QIAsymphony, e Applied Biosystems’ PRISM® 6700.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Extração do DNA genômico das Amostras de Sangue Seco Coletadas Usando Pontas MITRA® [00153] Este exemplo demonstra que os métodos da presente tecnologia são úteis para extrair altos rendimentos de DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco (por exemplo, sangue seco) coletado usando um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico.

[00154] Um total de quatro sujeitos humanos foram matriculados no estudo. Três pontas MITRA® do sangue foram coletadas de cada um dos 4 doadores de amostra de modo a testar simultaneamente os três métodos de extração. Um volume fixo de 10 μΐ de sangue foi coletado em cada dispositivo de coleta de ponta MITRA® por intermédio de uma picada no dedo. Depois de secar as amostras de sangue, as pontas absorventes dos dispositivos de coleta de ponta MITRA® foram depois colocadas em 180 μΐ de Tampão G2 (um tampão de lise contendo 800 mM de cloridrato de guanidina; 30 mM de Tris*Cl, pH de 8,0; 30 mM de EDTA, pH de 8,0; 5% de Tween 20; 0,5% de Triton X-100) e foram turbilhonados por 15 segundos. As etapas de processamento da amostra restante para cada um dos três métodos de extração são resumidos abaixo:

Etapa	Método 1	Método 2	Método 3
1	Incubar a ponta MITRA® em Tampão G2 a 90°C por 15 min	-	Incubar a ponta MITRA® em tampão G2 a 90°C por 15 min
2	Turbilhonamento por 15 s	-	Turbilhonamento por 15 s
3	Adicionar 10 pl de Proteinase K
4	Turbilhonamento por 15 s
5	Incubar com a Proteinase K a 56°C por 1 hora	Incubar com a Proteinase K a 56°C por 1 hora	Incubar com a Proteinase K a 56°C durante a noite

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Turbilhonamento de 15 s

7	Alíquota de lisado celular ao tubo novo
8	Realizar a extração do DNA genômico restante em EZ1® Biorobot usando o protocolo de tecido de DNA

[00155] O DNA genômico extraído foi depois quantificado usando o kit de ensaio Qubit® dsDNA HS, que usa um corante de intercalamento de dsDNA que somente fluoresce na presença de dsDNA. Portanto, a quantificação do dsDNA usando o Kit de ensaio Qubit® dsDNA HS não é afetada pelo RNA, proteínas, sais, ou outros contaminantes que podem afetar outros métodos de quantificação. A Tabela 1 demonstra que o rendimento de DNA obtido a partir de cada ponta MITRA® variou de acordo com o método de extração. Foi determinado que o método de extração 3 (Incubação de ponta MITRA® com Tampão G2 a 90°C por 15 min, e com Proteinase K a 56°C durante a noite) produziu a quantidade mais alta de DNA.

Tabela 1. Faixa de rendimento de DNA obtido por Ponta MITRA®
Método de Extração	Rendimento de DNA Total (ng)
1	111-248
2	163-210
3	222-390

[00156] Estes resultados demonstram que os métodos da presente tecnologia são úteis para extrair altos rendimentos de DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco (por exemplo, sangue seco) coletado usando um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico.

Exemplo 2: Comparação do Rendimento de DNA Usando Extrações de Uma Ponta e Duas Pontas.

[00157] As extrações de DNA foram realizadas nos lisados eluídos de uma ponta MITRA® única (extração de uma ponta) contendo sangue seco derivado de um paciente individual. Para as extrações de duas pontas, os lisados eluídos de duas pontas MITRA® individuais contendo o sangue seco derivado do mesmo paciente foram combinados juntos. As pontas MITRA® foram incubadas com Tampão G2 a 90°C por 15 min, e com Proteinase K a 56°C durante a noite.

[00158] A extração subsequente do ácido nucleico foi realizada usando

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63/67 o kit DNA Investigator na plataforma de extração automatizada QIAsymphony® de acordo com as instruções do fabricante. Os rendimentos do DNA das extrações de uma ponta e duas pontas foram comparados (Ver a FIG. 1).

[00159] Estes resultados demonstram que a extração de ponta dupla em média resultou em um aumento de 2 vezes no rendimento do DNA (FIG. 1). Estes resultados demonstram que os métodos da presente tecnologia são úteis para extrair altos níveis de DNA genômico de uma amostra de fluido biológico seco (por exemplo, sangue seco) coletado usando um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico.

Exemplo 3: Triagem Expandida de Fibrose Cística CFvantage® usando Amostras de Sangue Secas Extraídas das Pontas MITRA® [00160] O DNA genômico foi extraído das amostras de sangue seco obtidas de 7 doadores. Cada extração foi realizada usando uma amostra de sangue seco coletada usando uma ponta MITRA® única, isto é, extração de uma ponta como descrito no Exemplo 2. O DNA extraído foi depois testado no Painel Expandido de Fibrose Cística CFvantage®, que avaliou os 38 amplicons correspondentes ao gene CFTR. O Painel Expandido de Fibrose Cística CFvantage® cobre as 162 mutações de CFTR que são associadas com a fibrose cística (Tabela 2). O sequenciamento de próxima geração foi realizado no Sequenciador MiSeq. As medidas de qualidade avaliando o sequenciamento de sucesso de uma região coberta inclui um mínimo de 30 leituras por ponto quente abrangido.

[00161] Resultados'. Como mostrado na FIG. 2, todas as 7 amostras passaram nos critérios do Controle de Qualidade para 100% das regiões de pontos quentes abrangidos.

[00162] Estes resultados demonstraram que os métodos da presente tecnologia são capazes de detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico de CFTR em uma amostra de volume pequeno de fluido

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64/67 biológico seco que é coletada com um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico (por exemplo, ponta MITRA®).

Tabela 2. Mutações de CF Detectadas na Triagem de Fibrose Cística

Expandida CFvantage®	Nome Convencional Nomenclatura de cDNA HGVS
Nome Convencional	Nomenclatura de cDNA i HGVS i
296+2T>A	c, 164+2T>UM ]	2143delT	c,2012delT
394delTT	c,262_263delTT i	2183AA>G	c,205 l_2052delAAinsG
4O5+1G>A	c,273+lG>A i	2184delA	c,2052delA
4O6-1G>A	c,274-lG>A ί	2184insA	c,2052_2053insA
444delA	c,313delA i	2307insA	c,2175_2176insA
457TAT>G	c,325_327delTATinsG i	2347delG	c,2215delG
574delA	c,442delA i	2585delT	c,2453delT
621+1G>T	c,489+lG>T ί	2622+1G> A	c,2490+lG>A
663delT	c,531delT i	2711delT	c,2583delT
711+1G>T	c,579+lG>T i	2789+5G>A	c,2657+5G>A
711+3A>G	c,579+3A>G i	2869insG	c,2737_2738insG
711+5G>A	c,579+5G>A ί	3007delG	c,2875delG
712-1G>T	c,580-lG>T i	312O+1G>A	c,2988+lG>A
852del22	c,720_741del22 i	3120G>A	c,2988G>A
935delA	c,803delA i	3121-1G>A	c,2989-lG>A
936delTA	c,805_806delAT ί	3171delC	c,3039delC
1078delT	c,948delT i	3199del6	c,3067_3072delATAGTG
1154insTC	c,1022_1023insTC i	3272-26A>G	c,3140-26A>G
116 IdelC	c,1029delC i	3659delC	c,3528delC
1213delT	c,1081delT ί	3667del4	c,3535_3538delACCA
1248+1G>A	c,1116+lG>A i	379 IdelC	c,3659delC
1259ins/\	c,l 127_1128insA ;	3821delT	c,3691delT
1288insTA	c,l 153_1154insAT i	3849+10kbC>T	c,3717+12191C>T
1341+1G>A	c,1209+lG>A ί	3876delA	c,3744delA
1461ins4	c,1329_1330insAGAT i	3905insT	c,3773_3774insT
1525-1G>A	c,1393-lG>A i	4005+1G>A	c,3873+lG>A
1548delG	c,1418delG i	4016insT	c,3884_3885insT
1609delCA	c,1477_1478delCA ί	4209TGTT>AA	c,4077_4080delTGTTinsAA
1677delTA	c,1545_1546delTA i	4382delA	c,4251delA
1717-1G>A	c,1585-lG>A i	A455E	c,1364C>A
1717-8G>A	c,1585-8G>A i	A559T	c,1675G>A
1811+l,6kbA>G	c, 1679+1,6kbA>G ί	C524X	c,1572C>A
1812-1G>A	c,1680-lG>A i	CFTRdele2,3	c,54-5940.273+10250del2 Ikb
1898+1G>A	c,1766+lG>A i	CFTRdele22,23	c,3964-78_4242+577del
1898+1G>T	c,1766+lG>T i	D110H	c,328G>C
1898+3A>G	c,l 766+3A>G ί	D579G	c,1736A>G
1898+5G>T	c,1766+5G>T i	E60X	c,178G>T
2043delG	c,1911delG i	E92K	c,274G>A
2055del9>A	c,1923_1931del9insA i	E92X	c,274G>T
2105dell3ins5	c,1973_1985dell3insAGAAÍ A i	E585X	c,1753G>T
2108delA (continuação)	c,1976delA i	E822X	..............................................c.2464G>T...........................................
Nome Convencional	Nomenclatura de cDNA | HGVS |	Nome Convencional Nomenclatura de cDNA HGVS
E831X	c.2491G>T |	R75X	c,223C>T
Ε1104Χ	c.331 ()(i>r 1	RI 17C	c.349C>T

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1311 dei	c,933_935del('TT |	R117H	c.35OG>A
l<508dcl	c,1521_1523del('l Γ [	R334W	c.l ()()()('>T
G85Ha	c.254G>A ΐ	R34711	c,1040G>A
G91R	c.271G>A |	R347P	c.l()40G>('
G178R	c,532G>A ]	R352Q	c,1055G>A
G33OX	c.988G>T ]	R553X	c,1657C>T
G480C	c,1438G>T 1	R560K	c,1679G>A
G542X	c,1624G>T [	R560T	c,1679G>C
G551D	c,Í652G>Ã ]	R709X	c,2125C>T
G970R	c,2908G>C ]	R764X	c,2290C>T
G1244H	c.3731G>A 1	R851X	c.2551C> T
11199Y	c.595C>T i	Rl 066C	c.3196C>T
I336K	c,1007T>A |	R1066H	c,3197G>A
I507del	c,1519_1521delATC ]	Rl 128Χ	c.3382A>T
11234V	c,3700A>G |	R1158X	c,3472C>T
Κ710Χ	c.2128A>T |	Rl 162Χ	c.3484C>T
L206W	c.617T>G I	R1283M	c.3848G>T
L467P	c,1400T>C |	S341P	c,1021T>C
L732X	c.2195T>G 1	S466X	c,1397('>A ouc,1397('>G
L927P	c,2780T>C |	S489X	c,1466('>A
L1065P	c,3194T>(' |	S492P’	c. 1475( '>T
L1077P	c.3230T>(' 1	S549N	c, 1646G>A
L1093P	c,3278T>C |	S549R	c,1645A>C ou c,1647T>G
M1V	c,lA>G ]	S945L	c.2834C>T
Ml 101K	c.33O2T>A |	SI 196Χ	c.3587C>G
N1303K	c,3909C>G ]	S1251N	c,3752G>A
P67L	c.200(’>T ]	S1255X	c,3764(’>A
P205S	c,613C>T [	T338I	c,1013C>T
P57411	c,1721('>A |	V520P’	c,1558G>T
Q39X	c.H5('>T 1	W401X	c,1202G>A ouc,1203G>A
Q98X	c,292C>T |	W846X	c,2537G>A
Q220X	c,658C>T [	W1089X	c,3266G>A
Q493X	c,1477C>T ]	W1145X	c,3435G>A
Q525X	c,1573C>r 1	W1204X	c,3611G>A ou c.3612G>A
Q552X	c,1654(’>T 1	W1282X	c.3846G>A
Q890X	c,2668C>T ]	Y122X	c,366T>A
Q1238X	c.3712C>T |	Υ1092Χ	c.3276C>A ou c.3276C>G
Q1313X	c,3937C>T [	S364P	c. 1090T>C

EQUIVALENTES [00163] A presente tecnologia não é limitada em termos das modalidades particulares descritas neste pedido, que são intencionadas como ilustrações únicas dos aspectos individuais da presente tecnologia. Muitas modificações e variações desta presente tecnologia podem ser feitas sem romper com seu espírito e escopo, como será evidente àqueles habilitados na técnica. Os métodos e dispositivos funcionalmente equivalentes dentro do escopo da presente tecnologia, além daqueles aqui enumerados, serão evidentes àqueles habilitados na técnica a partir das descrições precedentes. Tais modificações e variações são intencionadas estar dentro do escopo da

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66/67 presente tecnologia. Deve ser entendido que esta presente tecnologia não é limitada aos métodos, reagentes, compostos, composições ou sistemas biológicos particulares, que podem, naturalmente, varias. Também deve ser notado que a terminologia aqui usada é para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas, e não deve ser limitante.

[00164] Os termos “compreendendo,” “incluindo,” “contendo,” etc. Devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões aqui utilizadas devem ser usados como termos da descrição e não de limitação, e não há a intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções destas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da divulgação reivindicada.

[0001] Além disso, onde as características ou aspectos da divulgação são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a divulgação também é assim descrita em termos de qualquer membro ou subgrupo individual dos membros do grupo Markush.

[00165] Como será entendido por aquele versado na técnica, for qualquer e todos os propósitos, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas aqui divulgadas também abrangem qualquer e todas as subfaixas possíveis e combinações de subfaixas destes. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo suficientemente e permitindo a mesma faixa sendo quebrada em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos, etc, iguais. Como um exemplo não limitante, cada faixa aqui divulgada pode ser prontamente quebrada em um terço menor, terço médio e terço superior, etc. Como também será entendido por aquele versado na técnica, todas as linguagens tais como “até,” “pelo menos,” “maior do que,” “menor do que,” e outros, incluem o número citado e se refere às faixas que podem ser subsequentemente quebradas em subfaixas como divulgado acima. Finalmente, como será entendido por aquele versado

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67/67 na técnica, uma faixa inclui cada membro individual. Deste modo, por exemplo, um grupo tendo de 1 a 3 células se refere aos grupos tendo 1, 2, ou 3 células. Similarmente, um grupo tendo de 1 a 5 célula se referem aos grupos tendo 1, 2, 3, 4, ou 5 células, e assim por diante.

[00166] Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações aqui indicados ou citados são incorporados por referência na sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, até o grau que não sejam incompatíveis com as divulgações explicitas deste pedido.

Claims (34)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico CFTR, caracterizado pelo fato de que compreende (a) extrair o ácido nucleico CFTR da amostra de uma amostra de fluido biológico seco eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem;

   (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra; e (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um dos amplicons na biblioteca usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico seco é plasma seco, soro seco, ou sangue total seco.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico seco na ponta absorvente do dispositivo de microamostragem é coletada de um paciente via picada no dedo.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com um tampão de lise e Proteinase K.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris*Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato

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   2/6 com o tampão de lise durante até 15 minutos a 90°C.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a

   6, caracterizado pelo fato de que a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com Proteinase K durante até 1 hora a 56°C.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a

   7, caracterizado pelo fato de que a eluição da amostra de fluido biológico seco é realizada colocando a ponta absorvente do dispositivo de microamostragem em contato com Proteinase K durante até 16 a 18 horas a 56°C.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   8, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem é um dispositivo de microamostragem absorvente volumétrico.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem é uma ponta MITRA®.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o volume de amostra do dispositivo de microamostragem não é maior do que 10 a 20 pL.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que não mais do que 400 ng de DNA genômico são eluídos da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que cerca de 100 ng a cerca de 400 ng de DNA genômico são eluídos da ponta absorvente do dispositivo de microamostragem.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma mutação é selecionada dentre uma mudança de base, uma deleção de gene e uma duplicação de gene.

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    3/6
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma mutação é selecionada de uma mutação listada na Tabela 2.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma mutação está associada com fibrose cística.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico seco é obtida de um indivíduo exibindo sintomas de fibrose cística, ou tendo um histórico familiar de fibrose cística ou uma mutação CFTR.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido biológico seco é obtida de um parceiro do sexo masculino de uma paciente de obstetrícia e ginecologia tendo fibrose cística ou pelo menos uma mutação CFTR.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de segmentos alvos, juntos, transpõem todas as regiões codificadoras e não codificadoras do gene CFTR.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de segmentos alvos transpõem adicionalmente cerca de 1000 nucleotídeos de uma região promotora imediatamente a montante do primeiro exon do gene CFTR.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de segmentos alvos transpõem adicionalmente cerca de 200 a 350 nucleotídeos imediatamente a jusante do gene CFTR.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento é realizado usando pirossequenciamento, sequenciamento de terminador de corante reversível, sequenciamento SOLiD, sequenciamento de semicondutor iônico, sequenciamento de molécula única Helioscope,

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    4/6 sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação, ou sequenciamento SMRT®.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento envolve uma abordagem de profundidade de leitura.
24. 24. Método para detectar pelo menos uma mutação em uma amostra de ácido nucleico CFTR, caracterizado pelo fato de que compreende gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra, em que o ácido nucleico CFTR da amostra é extraído de uma amostra de fluido biológico seco eluída de uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem com um tampão de lise e Proteinase K.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma mutação no ácido nucleico CFTR da amostra é detectada usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento.
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra compreende pelo menos uma alteração comparada com a região correspondente de uma sequência de nucleotídeo CFTR de referência.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo CFTR de referência compreende uma sequência de nucleotídeo CFTR do tipo selvagem.
28. 28. Método para selecionar um paciente exibindo sintomas de fibrose cística, ou um paciente em risco para fibrose cística para o tratamento com um agente terapêutico anti-fibrose cística, caracterizado pelo fato de que compreende (a) eluir uma amostra de fluido biológico seco do paciente de

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    5/6 uma ponta absorvente de um dispositivo de microamostragem, em que a amostra de fluido biológico seco compreende uma amostra de ácido nucleico CFTR;

    (b) gerar uma biblioteca compreendendo amplicons correspondentes a uma pluralidade de segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra;

    (c) detectar pelo menos uma mutação em pelo menos um dos amplicons na biblioteca usando sequenciamento paralelo massivo de alto rendimento; e (d) selecionar o paciente para o tratamento com um agente terapêutico anti-fibrose cística.
29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico anti-fibrose cística é um ou mais agentes selecionados do grupo consistindo de penicilina, amoxicilina, cefalosporinas, macrolídeos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, Tetraciclinas, aminoglicosídeos, colistina, Amcinonida, diproprionato de Betametasona, Clobetasol, Clocortolona, Dexametasona, Diflorasona, Dutasterida, Pivalato de Flumetasona, Flunisolida, Fluocinolona Acetonida, Fluocinonida, Fluorometolona, propionato de Fluticasona, propionato de Fluticasona, propionato de Fluticasona, Flurandrenolida, Hidroflumetiazida, aceclofenaco, acemetacina, aspirina, celecoxib, dexibuprofeno, dexcetoprofeno, diclofenaco, etodolac, etoricoxib, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofênico, expectorantes, antihistaminas, supressores de tosse, Dextrometorfano, soluções salinas hipertônicas, domase alfa, mucolíticos, enzimas pancreáticas, vitamina A, vitamina D, vitamina E, vitamina K, e suplementos para reduzir ácido estomacal.
30. 30. Kit para detectar pelo menos uma mutação em uma

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    6/6 amostra de ácido nucleico CFTR em uma amostra de fluido biológico seco, caracterizado pelo fato de que compreende uma ferramenta de punção da pele, um dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico, um tampão de lise, e proteinase K, em que a pelo menos uma mutação compreende uma ou mais das mutações CFTR listadas na Tabela 2.
31. 31. Kit de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais pares de iniciadores que hibridizam a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra.
32. 32. Kit de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais sequências iscas que hibridizam a um ou mais segmentos alvos do ácido nucleico CFTR da amostra.
33. 33. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a

    32, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de microamostragem absortivo volumétrico é uma ponta MITRA®.
34. 34. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a

    33, caracterizado pelo fato de que o tampão de lise compreende cloridrato de guanidina, Tris’Cl, EDTA, Tween 20, e Triton X-100.