JP2004201666A - 緑内障発症リスク判断のための遺伝子検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】緑内障関連遺伝子と緑内障発症の関係から、緑内障の発症リスクを事前に予知するための遺伝子の検査方法を提供する。
【解決手段】緑内障関連遺伝子であるＧＰＲＫ７遺伝子のコード領域を含む遺伝子領域における塩基の変異を指標として将来の緑内障の発症を予測する。具体的には、特定の塩基配列における６０６位のＴの欠失、１１９２位のＧからＴ、１３２８位のＡからＧ、１３７８位のＣからＡ、１６４９位のＧからＡへの変異を検出することによる。
【選択図】なし
【解決手段】緑内障関連遺伝子であるＧＰＲＫ７遺伝子のコード領域を含む遺伝子領域における塩基の変異を指標として将来の緑内障の発症を予測する。具体的には、特定の塩基配列における６０６位のＴの欠失、１１９２位のＧからＴ、１３２８位のＡからＧ、１３７８位のＣからＡ、１６４９位のＧからＡへの変異を検出することによる。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査の分野における緑内障関連遺伝子の検査方法および該遺伝子の変異を指標として緑内障発症リスクを予測するための検査方法に関する。例えば緑内障遺伝子として知られているＧタンパク結合受容体キナーゼ７（以下「ＧＰＲＫ７」という。）遺伝子の異常を検出し、該検出された異常、すなわち遺伝子の特定位置における塩基の変異を指標として緑内障を診断する遺伝子の検査方法、特に個体について将来発症する可能性を予知するための検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
緑内障は、目の中にある房水が排出されない状態となり、眼圧が上がって目の機能が落ちる疾患である。放置しておくと、見える範囲が狭まったり、視力が落ちたりして失明する。ただし、眼圧が正常にも関わらず、視神経に障害をきたす場合がある。
【０００３】
緑内障は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）、原発性閉鎖隅角緑内障（ＰＡＣＧ）、先天性緑内障および続発性緑内障の５つの病態に分類され、緑内障の２０％が遺伝性のものと言われている。これらのうち、最も多いのがＰＯＡＧである。１９８８年から１９８９年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、４０歳以上の人口のうち３．５６％が緑内障患者であると報告されている。
【０００４】
緑内障の主な危険因子は家族歴であり、その発症には遺伝子が関与していることが強く示唆される。１９９６年５月１７日に出願されたＮｇｕｙｅｎらの米国特許第５，７８９，１６９号（特許文献１）において、緑内障関連遺伝子としてＴＩＧＲ（小柱網誘導グルココルチコイド応答）タンパク質をコードする遺伝子が開示された。ＴＩＧＲ遺伝子は、別名ＭＹＯＣ遺伝子としても知られている。特許文献１は、またそのタンパク質のｃＤＮＡ配列、タンパク質自身、それに結合する分子、および結合分子をコードする核酸分子を開示しており、また緑内障および関連疾患の診断、ならびに心血管疾患、免疫疾患または該タンパク質の発現や活性に影響する他の疾患や状態といった他の疾患または状態の診断のための改善された方法および試薬を提供した。また、緑内障関連遺伝子のうちＣＹＰ１Ｂ１遺伝子における突然変異を検出し、該突然変異の存在を緑内障の指標として個体における緑内障の診断を行う方法も開示されている（特許文献２：特表２００１−５１２９６９号公表公報）。さらに、ＧＬＣ１Ｅとして知られる原因遺伝子に関して、Ｒｅｚａｉｅ ＴらがＯＰＴＮ（Ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ）遺伝子を同定した（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２ Ｆｅｂ ８；２９５（５５５７）：１０７７−９．（非特許文献１）） （Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２１９８０）。このＯＰＴＮ遺伝子は過去ＦＩＰ２遺伝子として知られていた。しかしながら、当該文献においても将来における緑内障の発症リスクを予知する手段は開示されていない。
【０００５】
一方、ＷＯ ０１／８８１２０ Ａ１ 国際公開公報（特許文献３）では、該公報の配列表に示すＭＹＯＣ遺伝子のプロモーター領域である−１５３位の遺伝子の変異を検出する方法が開示され、遺伝性が心配される家系や未発症キャリアーであることが心配される患者においては、緑内障のスクリーニングとして使用することができることが示されている。しかしながら、緑内障の原因遺伝子として考えられる遺伝子は複数存在するため、単一の遺伝子の変異を検出するだけでは十分ではないことは明らかである。緑内障は潜行性であるため、視神経に対し重大な損傷が起こる前に予防また軽減する方法をとることができるように、緑内障が発生する可能性を早期に診断または効果的に予測する一層優れた方法が要望されている。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，７８９，１６９号公報
【特許文献２】
特表２００１−５１２９６９号公表公報
【特許文献３】
国際公開ＷＯ０１／８８１２０号パンフレット
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２ Ｆｅｂ ８；２９５（５５５７）：１０７７−９．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝的に緑内障の危険因子を保有し、将来における発症リスクが高い個体を特定し、その個体に関して重点的に緑内障の検査を実施することができれば、効率的に緑内障の早期発見、早期治療をなしうると考えられる。係る状況に鑑みて、本発明は緑内障関連遺伝子と緑内障発症の関係から、緑内障の発症リスクを効果的に予知するための遺伝子の検査方法を提供する事を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、緑内障の発症が遺伝子の変異に関与することに着目し、緑内障患者および非患者の緑内障原因遺伝子のコード領域の遺伝子配列の分析を行い、鋭意研究を重ねた結果、該遺伝子で観察される変異の頻度が患者群と非患者群で有意に異なることを見出した。さらに、この変異の有無により緑内障の有病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
１．緑内障関連遺伝子であるＧＰＲＫ７遺伝子領域における少なくとも１箇所以上の塩基の変異を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法、
２．遺伝子領域が配列番号１で示される塩基配列である前項１に記載の検査方法、
３．配列番号１で示される塩基配列における１３２８位のＡからＧへの置換を検出する前項２に記載の検査方法、
４．配列番号１で示される塩基配列における１３７８位のＣからＡへの置換を検出す前項２に記載の検査方法、
５．配列番号１で示される塩基配列における１６４９位のＧからＡへの置換を検出する前項２に記載の検査方法、
６．配列番号１で示される塩基配列における１１９２位のＧからＴへの置換を検出する前項２に記載の検査方法、
７．配列番号１で示される塩基配列における６０６位のＴの欠失を検出する前項２に記載の検査方法、
８．配列番号１で示される塩基配列における塩基の１以上の置換、欠失および／または挿入を検出する前項２に記載の検査方法、
９．緑内障が開放隅角緑内障および／または正常眼圧緑内障である前項１〜８のいずれか１に記載の検査方法、
１０．緑内障関連遺伝子の遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドを用いて変異を検出することを特徴とする前項１〜９のいずれか１に記載の検査方法、
１１．緑内障関連遺伝子の遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、以下に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より少なくとも１以上選択され、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）配列番号６から１９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
１２．前項１１に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行うことを含む前項１０に記載の検査方法、
１３．前項１〜１０または１２のいずれか１に記載の検査方法に使用する試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬キット、からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明者らは、緑内障患者および非患者において、配列番号１に示される塩基配列からなる緑内障原因遺伝子を構成する各エキソンのコード領域の遺伝子配列の決定を行った。その過程において、該遺伝子のコード領域に患者群と非患者群で頻度に差が観察される遺伝的多型が存在することを確認した。さらに、この遺伝的多型の有無の検討によって、緑内障の有病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化する事実を見出した。本発明は、上記新知見に基づいて構成される。
【００１１】
（緑内障関連遺伝子）
本発明における、緑内障関連遺伝子の例としてＧＰＲＫ７（Ｇタンパク結合受容体キナーゼ７）遺伝子が挙げられる。ＧＰＲＫ７遺伝子の構造および配列は、図１および配列番号１に表されているとおりであって、例えば転写されタンパク質に翻訳されるコード領域および翻訳されない非翻訳領域ならびに他の要素がある。該ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基の位置は、配列番号１において定めた塩基番号に従う（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ２２０４５２２７）。このＧＰＲＫ７タンパク質をコードする領域は、翻訳される４個のエキソンから構成される。それぞれのエキソンおよびその周辺の配列は、エキソン１の配列を配列番号２に、エキソン２の配列を配列番号３に、エキソン３の配列を配列番号４に、エキソン４の配列を配列番号５に表す。また、配列番号１に表されるＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列と、配列番号２から４に表される各エキソンの塩基配列の対応は、配列番号２の３０１−９１２位が配列番号１の１−６１２位に、配列番号３の２０１−６３８位が配列番号１の６１３−１０５０位に、配列番号４の２０１−４７５位が配列番号１の１０５１−１３２５位に、配列番号５の２０１−５３７位が配列番号１の１３２６−１６６２位に対応する。
【００１２】
（遺伝子の変異）
本発明の緑内障関連遺伝子の変異とは、ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列中の特定位置の塩基が、異なる塩基に置換、欠失および／または挿入があることをいう。該特定位置は、配列番号１に示される塩基配列の６０６位、１１９２位、１３２８位、１３７８位、１６４９位をいう。
【００１３】
（検査方法）
当該遺伝子の変異の検査方法は、本発明によって開示するＧＰＲＫ７遺伝子の特定の変異を検出しうる限りにおいて、その手法は何ら限定されるものではなく、公知もしくは将来得られうる各種の方法を広く用いることができる。
被験者のＧＰＲＫ７遺伝子について本発明で開示される変異を検査するために、当該変異位置を含む塩基配列を解析する各種の方法を用いることができる。これらの方法としては、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８： ５０３−５１７ （１９７５）等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法（サンガー法）、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ： Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８６： ２７６６−２７７０ （１９８９）等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（ＳＳＯ： Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Ｎａｔｕｒｅ， ３２４： １６３−１６６ （１９８６）等参照）］等を例示することができる。本発明によって検出すべき遺伝子変異の位置が開示され特定されている以上、当業者にとっては公知の方法を用いてその変異を検出することができる。
【００１４】
（検査用試料の調製）
被験者のＧＰＲＫ７遺伝子を解析するために、本発明の検査方法に供される検査用試料は、被験者のＧＰＲＫ７遺伝子を含む生物学的試料であれば良く、特に限定されない。このような生物学的試料としては、生体材料組織、手術切除組織、口腔粘膜組織等の生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、射出精液、喀痰、唾液、脳脊髄液、毛髪等が挙げられる。例えばブレンダーを用いて組織等の生物学的試料を破砕し、フェノール・クロロホルム法などの公知の遺伝子抽出方法で抽出したＧＰＲＫ７遺伝子を被検用試料とすることができる。さらに抽出したＧＰＲＫ７を増幅し、濃縮したものを被検用試料とすることができる。
【００１５】
ここで、被検用試料は、ＧＰＲＫ７遺伝子の全長ＤＮＡでもよく、ＤＮＡ断片（部分ＤＮＡ）であってもよい。ＤＮＡ断片が検査に供される場合には、ＧＰＲＫ７遺伝子のコード領域を含み、少なくとも１個、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上のエキソンにかかる領域を含むことが必要である。当該ＤＮＡ断片は、本発明の遺伝子変異の検出に利用できるもの、即ち、塩基置換の測定のために供される被験ＤＮＡとしての測定可能な塩基長を有するものであれば、特にその塩基長について制限はない。そのようなＤＮＡの塩基長として、通常１０塩基長程度以上、好ましくは２０塩基長程度以上のものを選択することができ、一般的には１００〜１０００程度の、好ましくは２００〜３００程度の塩基長からなるものが選択される。
【００１６】
また、被検用試料は、ＤＮＡ、ＤＮＡ転写産物のいずれであってもよい。具体的には、ＤＮＡより転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でもよいし、さらにそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、あるいは相補ＤＮＡであってもよい。本発明の遺伝子変異の検出法において採用され得る各種の操作、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡ断片の合成、ＤＮＡの切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、複製、選択、ＤＮＡ断片の増幅などはいずれも常法に従うことができる（分子遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行等参照）。またこれらは必要に応じて、適宜常法に従い修飾して用いることもできる。
【００１７】
被検用試料を調製するための核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法またはその変法に従って実施することができる（ＰＣＲテクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照）。この場合、緑内障関連遺伝子の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチド、具体的には変異にかかる上記特定位置を少なくとも１以上有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜選択したプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【００１８】
（プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）
プライマー機能を有するオリゴヌクレオチドとして、例えば１）配列番号６〜１９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。ＰＣＲによりＤＮＡを増幅するのに好ましい組合せとしては、例えばプライマーＦ１Ａ（配列番号６）とプライマーＲ１Ａ（配列番号７）、プライマーＦ１Ｂ（配列番号８）とプライマーＲ１Ｂ（配列番号９）、プライマーＦ１Ｃ（配列番号１０）とプライマーＲ１Ｃ（配列番号１１）、プライマーＦ２Ａ（配列番号１２）とプライマーＲ２Ａ（配列番号１３）、プライマーＦ２Ｂ（配列番号１４）とプライマーＲ２Ｃ（配列番号１５）、プライマーＦ３（配列番号１６）とプライマーＲ３（配列番号１７）およびプライマーＦ４（配列番号１８）とプライマーＲ４（配列番号１９）が挙げられる。
【００１９】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により設計することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができ、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２１】
（ＤＮＡの変異の検出）
ＤＮＡの変異は、例えば、被検用試料に含まれるＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列をサンガー法により決定し、検出することができる。
１本鎖の目的ＧＰＲＫ７遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、これをプライマーとして５´から３´方向に相補鎖をＤＮＡポリメラーゼによって合成させる。このときに使用するオリゴヌクレオチドは、例えば上記（プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）で説明したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
【００２２】
反応の基質として４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のほかに少量のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を塩基ごとに別々に加え、相補鎖を合成させる。ｄｄＮＴＰはデオキシリボースの３´位の−ＯＨ基が−Ｈ基になっているｄＮＴＰのアナログ（類似物質）で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれると、それ以上相補鎖が合成されなくなり、様々な長さのＤＮＡが合成される。反応系に、例えば化学発光物質や放射性同位元素（ＲＩ）で標識したプライマーやｄＮＴＰを加えることにより、合成されるＤＮＡを標識し、反応物を変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することにより塩基配列を決定することができる。
【００２３】
サンガー法に用いるＤＮＡポリメラーゼとして、例えばクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素、Ｔ７ファージや好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらは共通してエキソヌクレアーゼ活性を遺伝子工学的に除いてある。当初、サンガー法では目的の遺伝子を１本鎖ＤＮＡにして用いていたが、現在では２本鎖プラスミドをそのままアルカリ変性させて用いる方法も多用されている。
【００２４】
シークエンス反応はサンガー法またはサイクルシークエンス法により行うことができる。サイクルシークエンス法はサンガー法とＰＣＲを組み合わせた方法で、鋳型ＤＮＡを１本鎖にする必要はなく、反応系にＤＮＡとプライマー１種類、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、そして耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを加えて行う。ＰＣＲ反応中にｄｄＮＴＰｓが取り込まれ、伸長が止まり、結果として３´末端が同一の塩基のＤＮＡが合成される点はサンガー法と同じである。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法と、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法等がある。
【００２５】
（検査用試薬および検査用試薬キット）
本発明はまた、緑内障の遺伝子検査方法に使用する検査試薬および検査試薬キットも含むものである。検査試薬としては、例えば被検試料増幅用プライマー、被検用試料の塩基配列決定用プライマー、各種ポリメラーゼ、塩基基質、標識物質など本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであっても良い。また、検査用試薬キットは本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであれば良い。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２７】
【実施例１】
ＧＰＲＫ７遺伝子のＤＮＡ解析
（１）ＤＮＡの抽出
被験者から提供を受けた血液を常法に従って処理し、有核細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出キットとして製品名「ＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）」（タカラバイオ社製）を用い、同製品規定のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
【００２８】
（２）鋳型ＤＮＡの増幅
得られたＤＮＡ抽出液を鋳型とし、ＰＣＲ増幅用キット、製品名「ＬＡＴａｑ（アプライドバイオシステムズ社製）」を用いてＰＣＲにより、ＧＰＲＫ７遺伝子の増幅を行った。
エキソン１から４までの各エキソンの配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号２２０４５２２７によって開示されており、各配列のうちアミノ酸に翻訳される領域の配列はそれぞれ配列番号２から４のうち、次に表される領域の塩基配列で表される。
エキソン１ 配列番号２、 ３０１−９１２位
エキソン２ 配列番号３、 ２０１−６３８位
エキソン３ 配列番号４、 ２０１−４７５位
エキソン４ 配列番号５、 ２０１−５３７位
【００２９】
配列番号６から１９の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを各エキソンを増幅するためのプライマーとして使用した。各プライマーとエキソンとの位置関係は、図２から図５に表される。ただし、各アンチセンスプライマーは配列番号２から５に表される配列の相補鎖に基づく配列からなる。
【００３０】
エキソン１用プライマー
順鎖 プライマーＦ１Ａ 配列番号 ６；領域＝配列番号２、５１−６９位
逆鎖 プライマーＲ１Ａ 配列番号 ７；領域＝配列番号２、４７８−４９５位の相補配列
順鎖 プライマーＦ１Ｂ 配列番号 ８；領域＝配列番号２、２０５−２２４位
逆鎖 プライマーＲ１Ｂ 配列番号 ９；領域＝配列番号２、８１５−８３４位の相補配列
順鎖 プライマーＦ１Ｃ 配列番号 １０；領域＝配列番号２、５０３−５２２位
逆鎖 プライマーＲ１Ｃ 配列番号 １１；領域＝配列番号２、１０２９−１０４８位の相補配列
エキソン２用プライマー
順鎖 プライマーＦ２Ａ 配列番号 １２；領域＝配列番号３、４０−５９位
逆鎖 プライマーＲ２Ａ 配列番号 １３；領域＝配列番号３、５２１−５４０位の相補配列
順鎖 プライマーＦ２Ｂ 配列番号 １４；領域＝配列番号３、２６２−２８１位
逆鎖 プライマーＲ２Ｂ 配列番号 １５；領域＝配列番号３、７６２−７８２位の相補配列
エキソン３用プライマー
順鎖 プライマーＦ３ 配列番号 １６；領域＝配列番号４、２６−４３位
逆鎖 プライマーＲ３ 配列番号 １７；領域＝配列番号４、６３９−６６４位の相補配列
エキソン４用プライマー
順鎖 プライマーＦ４ 配列番号 １８；領域＝配列番号５、２０−３９位
逆鎖 プライマーＲ４ 配列番号 １９；領域＝配列番号５、６６３−６８４位の相補配列
ＰＣＲ反応は、９４℃１分の加熱の後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃
３０秒のサイクルを３０回実施した。
【００３１】
（３）各エキソンのＤＮＡ断片の塩基配列決定
上記ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片について、自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１００（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、同製品規定のプロトコールに従って各エキソン毎にＤＮＡの塩基配列を決定した。このとき、各エキソンのＰＣＲ反応に用いたプライマーのうち、順鎖プライマーと逆鎖プライマーのいずれかを用いてサイクルシーケンス反応を行った。
【００３２】
（４）対照群の各エキソンのＤＮＡ断片の塩基配列決定
さらに、対照となる非患者ボランティア群から得られた血液を上記手法に従って処理し、各エキソンのＤＮＡ断片において非患者群で多数を占める塩基配列を決定した。
【００３３】
【実施例２】
（１）ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列の多型の解析１
医療機関によって開放隅角緑内障と診断された患者から得られた血液を上記実施例の手法に従って処理し、ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列を調べ、非患者群の塩基配列と比較した。
その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
（２）リスク判定
ベイズの定理にしたがって、ＧＰＲＫ７遺伝子の配列に変異を有する場合の緑内障発症のリスクを予測する。
ある被験者が緑内障を将来発症する確率は、事前に何の情報も無い場合には、疫学的に得られた一般集団における有病率で判断される。この有病率をＰ（Ｇ）とし、緑内障を発症しない確率をＰ（Ｎ）とすると、Ｐ（Ｎ）＝１−Ｐ（Ｇ）とと表される。
【００３６】
一方、ＧＰＲＫ７遺伝子の配列に単一もしくは複数の変異を有する場合をＭとして、Ｍを保有している被験者が緑内障を将来発症する確率を条件付確率Ｐ（Ｇ｜Ｍ）とする。ここで、もしＰ（Ｇ｜Ｍ）＞Ｐ（Ｇ）であるならば、その変異Ｍを保有している被験者は将来緑内障を発症する確率が一般集団よりも高いことになり、高リスク者と判定される。
【００３７】
条件付確率Ｐ（Ｇ｜Ｍ）は、以下のように算出される。
緑内障患者群においてＭを保有する確率をＰ（Ｍ｜Ｇ）、非患者においてＭを保有する確率をＰ（Ｍ｜Ｎ）とする。ベイズの定理（図７）よりＰ（Ｍ｜Ｎ）は式１で示される。Ｐ（Ｇ）値には、１９８８年から１９８９年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、４０歳以上の人口のうち３．５６％が緑内障患者であると報告されている数値を引用することができる。さらに、緑内障患者および非患者の各位置におけるＧＰＲＫ７遺伝子の塩基の変異の確率を、各々式１、Ｐ（Ｍ｜Ｇ）値、Ｐ（Ｍ｜Ｎ）値にあてはめることができる。
【００３８】
【式１】
【００３９】
以上の数式を用いて変異についてＰ（Ｇ｜Ｍ）を算出したところ、配列番号１における各位置での変異はそれぞれ、
６０６位の変異では ７．２倍の割合で、
１１９２位の変異では ３．０倍の割合で、
１３２８位の変異では ３．０倍の割合で、
１３７８位の変異では ３．０倍の割合で、
１６４９位の変異では ２８．１位の割合で、
Ｐ（Ｇ）よりもＰ（Ｇ｜Ｍ）の数値が高く算出され、これらの位置で変異を有することが緑内障の高リスク群であることを示すことが判明した。このことより、上記遺伝子の位置における変異を検出することが、開放隅角緑内障の発症リスクの予知に有効であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明にかかる遺伝子の変異に関する情報は、緑内障の将来における発症予測に有効である。本発明の遺伝子検査方法によりＧＰＲＫ７遺伝子の変異を検出することで、特に開放隅角緑内障の発症を予測することができれば、発症前の段階で発症予防または早期に治療することが可能となる。
【００４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＰＲＫ７遺伝子の構造を示す図である。（実施例１）
【図２】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン１の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図３】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン２の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図４】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン３の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図５】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン４の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図６】ベイズの定理を示す図である。（実施例２）
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査の分野における緑内障関連遺伝子の検査方法および該遺伝子の変異を指標として緑内障発症リスクを予測するための検査方法に関する。例えば緑内障遺伝子として知られているＧタンパク結合受容体キナーゼ７（以下「ＧＰＲＫ７」という。）遺伝子の異常を検出し、該検出された異常、すなわち遺伝子の特定位置における塩基の変異を指標として緑内障を診断する遺伝子の検査方法、特に個体について将来発症する可能性を予知するための検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
緑内障は、目の中にある房水が排出されない状態となり、眼圧が上がって目の機能が落ちる疾患である。放置しておくと、見える範囲が狭まったり、視力が落ちたりして失明する。ただし、眼圧が正常にも関わらず、視神経に障害をきたす場合がある。
【０００３】
緑内障は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）、原発性閉鎖隅角緑内障（ＰＡＣＧ）、先天性緑内障および続発性緑内障の５つの病態に分類され、緑内障の２０％が遺伝性のものと言われている。これらのうち、最も多いのがＰＯＡＧである。１９８８年から１９８９年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、４０歳以上の人口のうち３．５６％が緑内障患者であると報告されている。
【０００４】
緑内障の主な危険因子は家族歴であり、その発症には遺伝子が関与していることが強く示唆される。１９９６年５月１７日に出願されたＮｇｕｙｅｎらの米国特許第５，７８９，１６９号（特許文献１）において、緑内障関連遺伝子としてＴＩＧＲ（小柱網誘導グルココルチコイド応答）タンパク質をコードする遺伝子が開示された。ＴＩＧＲ遺伝子は、別名ＭＹＯＣ遺伝子としても知られている。特許文献１は、またそのタンパク質のｃＤＮＡ配列、タンパク質自身、それに結合する分子、および結合分子をコードする核酸分子を開示しており、また緑内障および関連疾患の診断、ならびに心血管疾患、免疫疾患または該タンパク質の発現や活性に影響する他の疾患や状態といった他の疾患または状態の診断のための改善された方法および試薬を提供した。また、緑内障関連遺伝子のうちＣＹＰ１Ｂ１遺伝子における突然変異を検出し、該突然変異の存在を緑内障の指標として個体における緑内障の診断を行う方法も開示されている（特許文献２：特表２００１−５１２９６９号公表公報）。さらに、ＧＬＣ１Ｅとして知られる原因遺伝子に関して、Ｒｅｚａｉｅ ＴらがＯＰＴＮ（Ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ）遺伝子を同定した（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２ Ｆｅｂ ８；２９５（５５５７）：１０７７−９．（非特許文献１）） （Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０２１９８０）。このＯＰＴＮ遺伝子は過去ＦＩＰ２遺伝子として知られていた。しかしながら、当該文献においても将来における緑内障の発症リスクを予知する手段は開示されていない。
【０００５】
一方、ＷＯ ０１／８８１２０ Ａ１ 国際公開公報（特許文献３）では、該公報の配列表に示すＭＹＯＣ遺伝子のプロモーター領域である−１５３位の遺伝子の変異を検出する方法が開示され、遺伝性が心配される家系や未発症キャリアーであることが心配される患者においては、緑内障のスクリーニングとして使用することができることが示されている。しかしながら、緑内障の原因遺伝子として考えられる遺伝子は複数存在するため、単一の遺伝子の変異を検出するだけでは十分ではないことは明らかである。緑内障は潜行性であるため、視神経に対し重大な損傷が起こる前に予防また軽減する方法をとることができるように、緑内障が発生する可能性を早期に診断または効果的に予測する一層優れた方法が要望されている。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，７８９，１６９号公報
【特許文献２】
特表２００１−５１２９６９号公表公報
【特許文献３】
国際公開ＷＯ０１／８８１２０号パンフレット
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２ Ｆｅｂ ８；２９５（５５５７）：１０７７−９．
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝的に緑内障の危険因子を保有し、将来における発症リスクが高い個体を特定し、その個体に関して重点的に緑内障の検査を実施することができれば、効率的に緑内障の早期発見、早期治療をなしうると考えられる。係る状況に鑑みて、本発明は緑内障関連遺伝子と緑内障発症の関係から、緑内障の発症リスクを効果的に予知するための遺伝子の検査方法を提供する事を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、緑内障の発症が遺伝子の変異に関与することに着目し、緑内障患者および非患者の緑内障原因遺伝子のコード領域の遺伝子配列の分析を行い、鋭意研究を重ねた結果、該遺伝子で観察される変異の頻度が患者群と非患者群で有意に異なることを見出した。さらに、この変異の有無により緑内障の有病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
１．緑内障関連遺伝子であるＧＰＲＫ７遺伝子領域における少なくとも１箇所以上の塩基の変異を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法、
２．遺伝子領域が配列番号１で示される塩基配列である前項１に記載の検査方法、
３．配列番号１で示される塩基配列における１３２８位のＡからＧへの置換を検出する前項２に記載の検査方法、
４．配列番号１で示される塩基配列における１３７８位のＣからＡへの置換を検出す前項２に記載の検査方法、
５．配列番号１で示される塩基配列における１６４９位のＧからＡへの置換を検出する前項２に記載の検査方法、
６．配列番号１で示される塩基配列における１１９２位のＧからＴへの置換を検出する前項２に記載の検査方法、
７．配列番号１で示される塩基配列における６０６位のＴの欠失を検出する前項２に記載の検査方法、
８．配列番号１で示される塩基配列における塩基の１以上の置換、欠失および／または挿入を検出する前項２に記載の検査方法、
９．緑内障が開放隅角緑内障および／または正常眼圧緑内障である前項１〜８のいずれか１に記載の検査方法、
１０．緑内障関連遺伝子の遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドを用いて変異を検出することを特徴とする前項１〜９のいずれか１に記載の検査方法、
１１．緑内障関連遺伝子の遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、以下に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より少なくとも１以上選択され、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）配列番号６から１９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
１２．前項１１に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行うことを含む前項１０に記載の検査方法、
１３．前項１〜１０または１２のいずれか１に記載の検査方法に使用する試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬キット、からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明者らは、緑内障患者および非患者において、配列番号１に示される塩基配列からなる緑内障原因遺伝子を構成する各エキソンのコード領域の遺伝子配列の決定を行った。その過程において、該遺伝子のコード領域に患者群と非患者群で頻度に差が観察される遺伝的多型が存在することを確認した。さらに、この遺伝的多型の有無の検討によって、緑内障の有病率が一般集団の有病率と比較した場合に統計的に有意に変化する事実を見出した。本発明は、上記新知見に基づいて構成される。
【００１１】
（緑内障関連遺伝子）
本発明における、緑内障関連遺伝子の例としてＧＰＲＫ７（Ｇタンパク結合受容体キナーゼ７）遺伝子が挙げられる。ＧＰＲＫ７遺伝子の構造および配列は、図１および配列番号１に表されているとおりであって、例えば転写されタンパク質に翻訳されるコード領域および翻訳されない非翻訳領域ならびに他の要素がある。該ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基の位置は、配列番号１において定めた塩基番号に従う（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号 ２２０４５２２７）。このＧＰＲＫ７タンパク質をコードする領域は、翻訳される４個のエキソンから構成される。それぞれのエキソンおよびその周辺の配列は、エキソン１の配列を配列番号２に、エキソン２の配列を配列番号３に、エキソン３の配列を配列番号４に、エキソン４の配列を配列番号５に表す。また、配列番号１に表されるＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列と、配列番号２から４に表される各エキソンの塩基配列の対応は、配列番号２の３０１−９１２位が配列番号１の１−６１２位に、配列番号３の２０１−６３８位が配列番号１の６１３−１０５０位に、配列番号４の２０１−４７５位が配列番号１の１０５１−１３２５位に、配列番号５の２０１−５３７位が配列番号１の１３２６−１６６２位に対応する。
【００１２】
（遺伝子の変異）
本発明の緑内障関連遺伝子の変異とは、ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列中の特定位置の塩基が、異なる塩基に置換、欠失および／または挿入があることをいう。該特定位置は、配列番号１に示される塩基配列の６０６位、１１９２位、１３２８位、１３７８位、１６４９位をいう。
【００１３】
（検査方法）
当該遺伝子の変異の検査方法は、本発明によって開示するＧＰＲＫ７遺伝子の特定の変異を検出しうる限りにおいて、その手法は何ら限定されるものではなく、公知もしくは将来得られうる各種の方法を広く用いることができる。
被験者のＧＰＲＫ７遺伝子について本発明で開示される変異を検査するために、当該変異位置を含む塩基配列を解析する各種の方法を用いることができる。これらの方法としては、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８： ５０３−５１７ （１９７５）等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法（サンガー法）、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ： Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８６： ２７６６−２７７０ （１９８９）等参照）、ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（ＳＳＯ： Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Ｎａｔｕｒｅ， ３２４： １６３−１６６ （１９８６）等参照）］等を例示することができる。本発明によって検出すべき遺伝子変異の位置が開示され特定されている以上、当業者にとっては公知の方法を用いてその変異を検出することができる。
【００１４】
（検査用試料の調製）
被験者のＧＰＲＫ７遺伝子を解析するために、本発明の検査方法に供される検査用試料は、被験者のＧＰＲＫ７遺伝子を含む生物学的試料であれば良く、特に限定されない。このような生物学的試料としては、生体材料組織、手術切除組織、口腔粘膜組織等の生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、射出精液、喀痰、唾液、脳脊髄液、毛髪等が挙げられる。例えばブレンダーを用いて組織等の生物学的試料を破砕し、フェノール・クロロホルム法などの公知の遺伝子抽出方法で抽出したＧＰＲＫ７遺伝子を被検用試料とすることができる。さらに抽出したＧＰＲＫ７を増幅し、濃縮したものを被検用試料とすることができる。
【００１５】
ここで、被検用試料は、ＧＰＲＫ７遺伝子の全長ＤＮＡでもよく、ＤＮＡ断片（部分ＤＮＡ）であってもよい。ＤＮＡ断片が検査に供される場合には、ＧＰＲＫ７遺伝子のコード領域を含み、少なくとも１個、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上のエキソンにかかる領域を含むことが必要である。当該ＤＮＡ断片は、本発明の遺伝子変異の検出に利用できるもの、即ち、塩基置換の測定のために供される被験ＤＮＡとしての測定可能な塩基長を有するものであれば、特にその塩基長について制限はない。そのようなＤＮＡの塩基長として、通常１０塩基長程度以上、好ましくは２０塩基長程度以上のものを選択することができ、一般的には１００〜１０００程度の、好ましくは２００〜３００程度の塩基長からなるものが選択される。
【００１６】
また、被検用試料は、ＤＮＡ、ＤＮＡ転写産物のいずれであってもよい。具体的には、ＤＮＡより転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でもよいし、さらにそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、あるいは相補ＤＮＡであってもよい。本発明の遺伝子変異の検出法において採用され得る各種の操作、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡ断片の合成、ＤＮＡの切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、ＤＮＡの単離、精製、複製、選択、ＤＮＡ断片の増幅などはいずれも常法に従うことができる（分子遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行等参照）。またこれらは必要に応じて、適宜常法に従い修飾して用いることもできる。
【００１７】
被検用試料を調製するための核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法またはその変法に従って実施することができる（ＰＣＲテクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行等参照）。この場合、緑内障関連遺伝子の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチド、具体的には変異にかかる上記特定位置を少なくとも１以上有する所望のＤＮＡ断片を特異的に増幅するように適宜選択したプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【００１８】
（プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）
プライマー機能を有するオリゴヌクレオチドとして、例えば１）配列番号６〜１９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。ＰＣＲによりＤＮＡを増幅するのに好ましい組合せとしては、例えばプライマーＦ１Ａ（配列番号６）とプライマーＲ１Ａ（配列番号７）、プライマーＦ１Ｂ（配列番号８）とプライマーＲ１Ｂ（配列番号９）、プライマーＦ１Ｃ（配列番号１０）とプライマーＲ１Ｃ（配列番号１１）、プライマーＦ２Ａ（配列番号１２）とプライマーＲ２Ａ（配列番号１３）、プライマーＦ２Ｂ（配列番号１４）とプライマーＲ２Ｃ（配列番号１５）、プライマーＦ３（配列番号１６）とプライマーＲ３（配列番号１７）およびプライマーＦ４（配列番号１８）とプライマーＲ４（配列番号１９）が挙げられる。
【００１９】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により設計することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ，ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができ、その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２１】
（ＤＮＡの変異の検出）
ＤＮＡの変異は、例えば、被検用試料に含まれるＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列をサンガー法により決定し、検出することができる。
１本鎖の目的ＧＰＲＫ７遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、これをプライマーとして５´から３´方向に相補鎖をＤＮＡポリメラーゼによって合成させる。このときに使用するオリゴヌクレオチドは、例えば上記（プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド）で説明したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。
【００２２】
反応の基質として４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のほかに少量のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を塩基ごとに別々に加え、相補鎖を合成させる。ｄｄＮＴＰはデオキシリボースの３´位の−ＯＨ基が−Ｈ基になっているｄＮＴＰのアナログ（類似物質）で、ｄＮＴＰの代わりにｄｄＮＴＰが取り込まれると、それ以上相補鎖が合成されなくなり、様々な長さのＤＮＡが合成される。反応系に、例えば化学発光物質や放射性同位元素（ＲＩ）で標識したプライマーやｄＮＴＰを加えることにより、合成されるＤＮＡを標識し、反応物を変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することにより塩基配列を決定することができる。
【００２３】
サンガー法に用いるＤＮＡポリメラーゼとして、例えばクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素、Ｔ７ファージや好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらは共通してエキソヌクレアーゼ活性を遺伝子工学的に除いてある。当初、サンガー法では目的の遺伝子を１本鎖ＤＮＡにして用いていたが、現在では２本鎖プラスミドをそのままアルカリ変性させて用いる方法も多用されている。
【００２４】
シークエンス反応はサンガー法またはサイクルシークエンス法により行うことができる。サイクルシークエンス法はサンガー法とＰＣＲを組み合わせた方法で、鋳型ＤＮＡを１本鎖にする必要はなく、反応系にＤＮＡとプライマー１種類、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、そして耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを加えて行う。ＰＣＲ反応中にｄｄＮＴＰｓが取り込まれ、伸長が止まり、結果として３´末端が同一の塩基のＤＮＡが合成される点はサンガー法と同じである。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法と、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法等がある。
【００２５】
（検査用試薬および検査用試薬キット）
本発明はまた、緑内障の遺伝子検査方法に使用する検査試薬および検査試薬キットも含むものである。検査試薬としては、例えば被検試料増幅用プライマー、被検用試料の塩基配列決定用プライマー、各種ポリメラーゼ、塩基基質、標識物質など本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであっても良い。また、検査用試薬キットは本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであれば良い。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明する。但し、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００２７】
【実施例１】
ＧＰＲＫ７遺伝子のＤＮＡ解析
（１）ＤＮＡの抽出
被験者から提供を受けた血液を常法に従って処理し、有核細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出キットとして製品名「ＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）」（タカラバイオ社製）を用い、同製品規定のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
【００２８】
（２）鋳型ＤＮＡの増幅
得られたＤＮＡ抽出液を鋳型とし、ＰＣＲ増幅用キット、製品名「ＬＡＴａｑ（アプライドバイオシステムズ社製）」を用いてＰＣＲにより、ＧＰＲＫ７遺伝子の増幅を行った。
エキソン１から４までの各エキソンの配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号２２０４５２２７によって開示されており、各配列のうちアミノ酸に翻訳される領域の配列はそれぞれ配列番号２から４のうち、次に表される領域の塩基配列で表される。
エキソン１ 配列番号２、 ３０１−９１２位
エキソン２ 配列番号３、 ２０１−６３８位
エキソン３ 配列番号４、 ２０１−４７５位
エキソン４ 配列番号５、 ２０１−５３７位
【００２９】
配列番号６から１９の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを各エキソンを増幅するためのプライマーとして使用した。各プライマーとエキソンとの位置関係は、図２から図５に表される。ただし、各アンチセンスプライマーは配列番号２から５に表される配列の相補鎖に基づく配列からなる。
【００３０】
エキソン１用プライマー
順鎖 プライマーＦ１Ａ 配列番号 ６；領域＝配列番号２、５１−６９位
逆鎖 プライマーＲ１Ａ 配列番号 ７；領域＝配列番号２、４７８−４９５位の相補配列
順鎖 プライマーＦ１Ｂ 配列番号 ８；領域＝配列番号２、２０５−２２４位
逆鎖 プライマーＲ１Ｂ 配列番号 ９；領域＝配列番号２、８１５−８３４位の相補配列
順鎖 プライマーＦ１Ｃ 配列番号 １０；領域＝配列番号２、５０３−５２２位
逆鎖 プライマーＲ１Ｃ 配列番号 １１；領域＝配列番号２、１０２９−１０４８位の相補配列
エキソン２用プライマー
順鎖 プライマーＦ２Ａ 配列番号 １２；領域＝配列番号３、４０−５９位
逆鎖 プライマーＲ２Ａ 配列番号 １３；領域＝配列番号３、５２１−５４０位の相補配列
順鎖 プライマーＦ２Ｂ 配列番号 １４；領域＝配列番号３、２６２−２８１位
逆鎖 プライマーＲ２Ｂ 配列番号 １５；領域＝配列番号３、７６２−７８２位の相補配列
エキソン３用プライマー
順鎖 プライマーＦ３ 配列番号 １６；領域＝配列番号４、２６−４３位
逆鎖 プライマーＲ３ 配列番号 １７；領域＝配列番号４、６３９−６６４位の相補配列
エキソン４用プライマー
順鎖 プライマーＦ４ 配列番号 １８；領域＝配列番号５、２０−３９位
逆鎖 プライマーＲ４ 配列番号 １９；領域＝配列番号５、６６３−６８４位の相補配列
ＰＣＲ反応は、９４℃１分の加熱の後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃
３０秒のサイクルを３０回実施した。
【００３１】
（３）各エキソンのＤＮＡ断片の塩基配列決定
上記ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片について、自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１００（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、同製品規定のプロトコールに従って各エキソン毎にＤＮＡの塩基配列を決定した。このとき、各エキソンのＰＣＲ反応に用いたプライマーのうち、順鎖プライマーと逆鎖プライマーのいずれかを用いてサイクルシーケンス反応を行った。
【００３２】
（４）対照群の各エキソンのＤＮＡ断片の塩基配列決定
さらに、対照となる非患者ボランティア群から得られた血液を上記手法に従って処理し、各エキソンのＤＮＡ断片において非患者群で多数を占める塩基配列を決定した。
【００３３】
【実施例２】
（１）ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列の多型の解析１
医療機関によって開放隅角緑内障と診断された患者から得られた血液を上記実施例の手法に従って処理し、ＧＰＲＫ７遺伝子の塩基配列を調べ、非患者群の塩基配列と比較した。
その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
（２）リスク判定
ベイズの定理にしたがって、ＧＰＲＫ７遺伝子の配列に変異を有する場合の緑内障発症のリスクを予測する。
ある被験者が緑内障を将来発症する確率は、事前に何の情報も無い場合には、疫学的に得られた一般集団における有病率で判断される。この有病率をＰ（Ｇ）とし、緑内障を発症しない確率をＰ（Ｎ）とすると、Ｐ（Ｎ）＝１−Ｐ（Ｇ）とと表される。
【００３６】
一方、ＧＰＲＫ７遺伝子の配列に単一もしくは複数の変異を有する場合をＭとして、Ｍを保有している被験者が緑内障を将来発症する確率を条件付確率Ｐ（Ｇ｜Ｍ）とする。ここで、もしＰ（Ｇ｜Ｍ）＞Ｐ（Ｇ）であるならば、その変異Ｍを保有している被験者は将来緑内障を発症する確率が一般集団よりも高いことになり、高リスク者と判定される。
【００３７】
条件付確率Ｐ（Ｇ｜Ｍ）は、以下のように算出される。
緑内障患者群においてＭを保有する確率をＰ（Ｍ｜Ｇ）、非患者においてＭを保有する確率をＰ（Ｍ｜Ｎ）とする。ベイズの定理（図７）よりＰ（Ｍ｜Ｎ）は式１で示される。Ｐ（Ｇ）値には、１９８８年から１９８９年にかけて社団法人日本眼科医会が実施した全国疫学調査によると、４０歳以上の人口のうち３．５６％が緑内障患者であると報告されている数値を引用することができる。さらに、緑内障患者および非患者の各位置におけるＧＰＲＫ７遺伝子の塩基の変異の確率を、各々式１、Ｐ（Ｍ｜Ｇ）値、Ｐ（Ｍ｜Ｎ）値にあてはめることができる。
【００３８】
【式１】
以上の数式を用いて変異についてＰ（Ｇ｜Ｍ）を算出したところ、配列番号１における各位置での変異はそれぞれ、
６０６位の変異では ７．２倍の割合で、
１１９２位の変異では ３．０倍の割合で、
１３２８位の変異では ３．０倍の割合で、
１３７８位の変異では ３．０倍の割合で、
１６４９位の変異では ２８．１位の割合で、
Ｐ（Ｇ）よりもＰ（Ｇ｜Ｍ）の数値が高く算出され、これらの位置で変異を有することが緑内障の高リスク群であることを示すことが判明した。このことより、上記遺伝子の位置における変異を検出することが、開放隅角緑内障の発症リスクの予知に有効であることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明にかかる遺伝子の変異に関する情報は、緑内障の将来における発症予測に有効である。本発明の遺伝子検査方法によりＧＰＲＫ７遺伝子の変異を検出することで、特に開放隅角緑内障の発症を予測することができれば、発症前の段階で発症予防または早期に治療することが可能となる。
【００４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＰＲＫ７遺伝子の構造を示す図である。（実施例１）
【図２】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン１の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図３】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン２の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図４】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン３の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図５】ＧＰＲＫ７遺伝子のエキソン４の構造と対応するプライマーの位置関係を示す図である。（実施例１）
【図６】ベイズの定理を示す図である。（実施例２）
Claims (13)
- 緑内障関連遺伝子であるＧＰＲＫ７遺伝子領域における少なくとも１箇所以上の塩基の変異を検出し、該変異を指標として将来の緑内障の発症を予測することを特徴とする遺伝子の検査方法。
- 遺伝子領域が配列番号１で示される塩基配列である請求項１に記載の検査方法。
- 配列番号１で示される塩基配列における１３２８位のＡからＧへの置換を検出する請求項２に記載の検査方法。
- 配列番号１で示される塩基配列における１３７８位のＣからＡへの置換を検出する請求項２に記載の検査方法。
- 配列番号１で示される塩基配列における１６４９位のＧからＡへの置換を検出する請求項２に記載の検査方法。
- 配列番号１で示される塩基配列における１１９２位のＧからＴへの置換を検出する請求項２に記載の検査方法。
- 配列番号１で示される塩基配列における６０６位のＴの欠失を検出する請求項２に記載の検査方法。
- 配列番号１で示される塩基配列における塩基の１以上の置換、欠失および／または挿入を検出する請求項２に記載の検査方法。
- 緑内障が開放隅角緑内障および／または正常眼圧緑内障である請求項１〜８のいずれか１に記載の検査方法。
- 緑内障関連遺伝子の遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドを用いて変異を検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１に記載の検査方法。
- 緑内障関連遺伝子の遺伝子領域の一部に特異的にハイブリッドを形成しうるオリゴヌクレオチドであって、以下に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より少なくとも１以上選択され、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）配列番号６から１９のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
２）前記１）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドと約６０％の相同性を有するオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。 - 請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅処理方法を行うことを含む請求項１０に記載の検査方法。
- 請求項１〜１０または１２のいずれか１に記載の検査方法に使用する試薬を含んでなる検査用試薬または検査用試薬キット。
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|---|---|---|---|
| JP2003027247A JP2004201666A (ja) | 2002-10-30 | 2003-02-04 | 緑内障発症リスク判断のための遺伝子検査方法 |
Applications Claiming Priority (2)
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Publications (2)
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2003
- 2003-02-04 JP JP2003027247A patent/JP2004201666A/ja active Pending
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