JP2013528058A - 高処理スクリーニング用の組合せ配列バーコード - Google Patents

高処理スクリーニング用の組合せ配列バーコード Download PDF

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Abstract

本発明は、高処理配列決定用のサンプルＤＮＡ調製における、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子の組合せの方法、および使用を含む。したがって、複数の調製サンプルＤＮＡの高処理配列決定において、サンプルＤＮＡの各調製物は、少なくとも２種ヌクレオチド配列識別子の固有の組合せを含み、ここで、第一ヌクレオチド配列識別子が、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択され、第二ヌクレオチド配列識別子が、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される。
【選択図】なし

Description

本発明は、分子生物学の分野に関し、特に配列決定方法のためのサンプルＤＮＡの調製に関する。より詳しくは、本発明は、高処理配列決定用のヌクレオチド配列識別子の使用に関する。
低コスト配列決定への高い需要が、高処理配列決定技術の開発を推し進めている。そのような技術では、数百万の配列が平行して生成される。たとえば、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、現在のＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社は、ＤＮＡを断片化するステップと、アダプタをＤＮＡ断片に連結するステップと、単一ＤＮＡ断片をプライマが被覆されたビーズで捕捉するステップと、油中水滴（エマルジョンＰＣＲ）中、各ＤＮＡ断片をビーズ上で増幅するステップと、次いで、各ビーズをピコリットル−ウェルに入れ、各増幅ＤＮＡ断片をパイロシーケンスで配列決定するステップと、を含む、サンプルＤＮＡの高処理配列決定技術を開発した。高処理配列決定技術は、一般的に、アダプタのＤＮＡ断片への連結を含み、該アダプタは、ＤＮＡ断片の捕捉、増幅および／または配列決定に使用されるプライマ結合部位を含んでもよい。多数の配列を生成することができるので、単一高処理配列決定の実行では、しばしば異なる起源からのサンプルが組合される。プールされたサンプルから各サンプルの起源を遡るために、現在の高処理配列決定の適用は、ヌクレオチド配列識別子の使用に依存している。用語ヌクレオチド配列識別子（ＮＳＩ）、配列ベースバーコードまたは配列インデックスは、交換可能であり、同じ意味を持つ。ヌクレオチド配列識別子は、識別子として使用される特別のヌクレオチド配列である。ヌクレオチド配列識別子は、プライマ結合部位から配列される際、識別子配列のヌクレオチド配列が決定されるように、アダプタ中のプライマ結合部位の下流に含有される。異なるヌクレオチド配列識別子を含む異なるアダプタは、異なるサンプルに連結され、その後、サンプルをプールすることができる。プールされたサンプルの配列が決定されると、ヌクレオチド配列識別子は、アダプタが連結された断片の配列の一部とともに配列決定される。したがって、ヌクレオチド配列識別子の存在または不存在は、前記プール中のサンプルＤＮＡの存在または不存在を決定する。さらに、ヌクレオチド配列識別子は、サンプルＤＮＡ起源を識別する働きをするため、ヌクレオチド配列識別子とともに配列決定された内部配列の配列は、その配列を、起源である特別のサンプルへ割当てることを可能にする。
たとえば、Ｒｏｃｈｅ社により開発された高処理配列システムでは、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸシステム、多重化識別子配列（ＭＩＤ）が使用される。ＭＩＤは、配列解読を個々のサンプルに割り当てるためにアダプタ内に導入される１０−ｍｅｒ配列である。現在、１００を超える異なるＭＩＤが使用されている（非特許文献１）。類似のヌクレオチド配列識別子が、他の配列決定システムに使用可能である。
ヌクレオチド配列識別子がプライマの５’−末端に導入される方法が、たとえば、非特許文献２および特許文献１に記載されている。概して、ヌクレオチド配列識別子は、標的配列と有意に相補的でない。したがって、プライマは、５’−末端にヌクレオチド配列識別子を含むセクションと、３’−末端に標的配列に相補的な配列とを含む。サンプルを、プライマがヌクレオチド配列識別子を含むプライマペアで増幅すると、その増幅産物は、ヌクレオチド配列識別子を含有することになる。続いて、サンプルをプールし、高処理配列決定方法に供すると、ヌクレオチド配列識別子は、配列増幅産物の起源を識別する働きをする。したがって、増幅産物の起源は、ヌクレオチド配列識別子を決定することによって決定される。同時に、増幅され、またヌクレオチド配列識別子とともに配列決定された内部配列も、それらの起源であるサンプルに遡ることができる。
両シナリオ、ヌクレオチド配列識別子を含むアダプタまたはプライマでは、その概念、すなわち、高処理配列決定プラットホームを使用して多重化された、たとえば、サンプル調製プロセスのどこかで組合されたまたはプールされた複数のＤＮＡサンプルから生成した配列のサンプル起源を決定することは同じである。
国際公開第２００７／０３７６７８号パンフレット
４５４Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ（２００９）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．００５−２００９ Ｒｉｇｏｌａら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２００９；４（３）：ｅ４７６１
高処理配列決定技術容量の容量は、その導入から２年の期間毎に、大幅に増加してきている。ますます増大する数のサンプルの多重化を可能にする高処理配列決定では、サンプルの起源を同定するのに必要な固有のアダプタまたはプライマの数も増えていく。１００個の異なるプライマまたはアダプタの使用が、すでに試されていると思われるが、その数が１０００個にまで増えた場合、障害になる場合がある。したがって、使用しなければならないプライマおよび／またはアダプタの数を減らせることが望ましく、これにより、サンプル調製を単純化し、作業量を減らし、技術的性能を最適化し、そしてコストを減らすことができるからである。
本発明は、異なる、必要なプライマおよび／またはアダプタの数の減少を可能にする。その数は、いわゆる「スプリットバーコード」を使用することによって、減らすことができる。本発明によるスプリットバーコードは、少なくとも２種のアダプタおよび／またはプライマ上に存在するヌクレオチド配列識別子である。サンプルＤＮＡ（またはサンプルＤＮＡの組合せ）は、たとえば、プライマペアおよび／またはアダプタのペアを使用して調製され、ここで、ペアの各プライマまたは各アダプタは、ヌクレオチド配列識別子を含む。生成された増幅産物またはアダプタ連結ＤＮＡ断片は、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子を含む。各異なるサンプルで、ヌクレオチド識別子の固有の組合せを使用することができる。ともにスプリットバーコードとしても示されるヌクレオチド配列識別子の組合せは、識別子としての機能を果たす。
２個のヌクレオチド配列識別子を持つサンプルＤＮＡから増幅産物を調製する方法。２個のプライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）が隣接する内部配列（ＩＳ）を含むサンプルＤＮＡが提供され（１）、ならびに３’−末端でプライマ結合部位に相補的な配列およびその５’でヌクレオチド配列識別子（ＮＳＩ１およびＮＳＩ２）を含む増幅プライマ（２）のペアが提供される。サンプルＤＮＡは、増幅プライマ（３）で増幅され、結果として両側に２個のヌクレオチド配列識別子を持つ増幅産物となる。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示し、３’−末端は、注釈はない。） ２個のヌクレオチド配列識別子を持つサンプルＤＮＡからアダプタ連結ＤＮＡ断片を調製する方法。サンプルＤＮＡが提供され（１）、これを断片化してＤＮＡ断片が得られ（２）、第一および第二ＮＳＩ（ＮＳＩ１およびＮＳＩ２）を含むアダプタのペアが提供され（３）、これらをＤＮＡ断片の両末端に連結し、結果としてアダプタ連結ＤＮＡ断片（４）となる。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） サンプルＤＮＡおよび２、３または４個のヌクレオチド配列識別子から増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片を調製する方法。サンプルＤＮＡが提供され（１）、これを断片化してＤＮＡ断片が得られ（２）、アダプタのペアであって、そのうちの少なくとも１つが、ＮＳＩ（ＮＳ１および場合によっては（ＮＳ２））を含み、両方が、プライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）を含むアダプタのペアが提供され、これらを、ＤＮＡ断片（３）、すなわち、内部配列（ＩＳ）で連結し、結果としてアダプタ連結ＤＮＡ断片の両末端にプライマ結合配列を含むアダプタ連結ＤＮＡ断片となる（４）。増幅プライマのペアが提供され（５）、該プライマは、それぞれ、配列プライマ結合部位に相補的な配列を３’−末端に含み、少なくとも１個の増幅プライマは、５’−末端にヌクレオチド配列識別子（ＮＳＩ３または場合によっては（ＮＳＩ４））を含む。アダプタ連結ＤＮＡ断片は、増幅プライマのペアで増幅される（６）。結果物（７）は、少なくとも２種のＮＳＩを含む増幅アダプタＤＮＡ断片である。少なくとも２種のＮＳＩは、ＩＳと隣接することが可能でありおよび／または少なくとも２種のＮＳＩは、ＩＳの同じ側に存在することが可能である。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示し、丸括弧は、第二および／または第四ＮＳＩの包含が本方法で任意にあり得ることを示す。） サンプルＤＮＡおよび２、３、または４個のヌクレオチド配列識別子から、アダプタ連結増幅産物を調製する方法。２個のプライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）が隣接する内部配列（ＩＳ）を含むサンプルＤＮＡが提供され（１）、ならびにプライマ結合部位に相補的な配列を３’−末端におよびヌクレオチド配列識別子（ＮＳＩ１および場合によっては（ＮＳＩ２））を５’−末端に含む少なくとも１個のプライマを含む増幅プライマ（２）のペアが提供される。サンプルＤＮＡは、増幅プライマで増幅され（３）、少なくとも１個のヌクレオチド配列識別子を持つ増幅産物となる（４）。第三および任意の第四ヌクレオチドＮＳＩ（ＮＳＩ３および任意の（ＮＳＩ４））を含むアダプタのペアが提供され、これらを増幅産物の両端に連結し、これによりアダプタ連結増幅産物が得られる（６）。少なくとも２種のＮＳＩは、ＩＳに隣接することが可能でありおよび／または少なくとも２種のＮＳＩは、ＩＳと同じ側に存在することが可能である。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示し、丸括弧は、第二および／または第四ＮＳＩの包含が本方法で任意にあり得ることを示す。） アダプタ連結ＤＮＡ断片の２個のヌクレオチド配列識別子配列を決定する方法。サンプルＤＮＡが提供され（１）、断片化されてＤＮＡ断片が得られ（２）、第一および第二ＮＳＩ（ＮＳＩ１およびＮＳＩ２）を含むアダプタのペアが提供され（３）、これらをＤＮＡ断片の両末端に連結し、結果としてアダプタ連結ＤＮＡ断片となる（４）。アダプタは、それぞれ、配列決定プライマ結合部位（ＳＥＱ１およびＳＥＱ２）および場合によっては、それぞれ、増幅プライマ結合部位（（Ｐ１）および（Ｐ２））を含む。アダプタに存在する部位の順番は、（Ｐ）−ＳＥＱ−ＮＳＩ、たとえば、（Ｐ１）−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１である。ＤＮＡ断片に連結するアダプタの側は、ＮＳＩを含む側である。アダプタ連結ＤＮＡ断片は、場合によっては、プライマ結合部位に指向されたプライマで増幅されてもよい（４）。アダプタ連結ＤＮＡ断片の各鎖は、配列決定反応のためのテンプレートとしての役割を果たしてもよい。使用される１つのテンプレート鎖として、以下の３’−（Ｐ１）−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１−ＩＳ−ＮＳＩ２（Ｐ２）−ＳＥＱ２−５’が挙げられ、これで、配列決定プライマは、ＳＥＱ１に対して使用される。配列決定プライマは、ＳＥＱ１またはＳＥＱ２の各テンプレートから、ＮＳＩ配列（複数を含む）が決定されるように提供される。配列は、別々に決定されてもよい。配列は、連続して、たとえばペア−エンド配列決定によって、決定されてもよい。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） アダプタ連結ＤＮＡ断片の２個のヌクレオチド配列識別子配列を決定する方法：シングル−リード・ダブル−タギング。サンプルＤＮＡが提供され（１）、これを断片化してＤＮＡ断片が得られ（２）、第一および第二ＮＳＩ（ＮＳＩ１およびＮＳＩ２）を含むアダプタのペアが提供され、これらをＤＮＡ断片の両末端に連結し（３）、結果としてアダプタ連結ＤＮＡ断片となる（４）。アダプタは、それぞれ、配列決定プライマ結合部位（ＳＥＱ１またはＳＥＱ２）を含み、および、それぞれ、場合によっては、増幅プライマ結合部位（（Ｐ１）または（Ｐ２））を含む。２個のアダプタに存在する部位の順番は、（Ｐ１）−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１およびＳＥＱ２−ＮＳＩ２−（Ｐ２）である。アダプタは、（Ｐ１）および（Ｐ２）部位がアダプタ連結ＤＮＡ断片の外側部位となるように、ＤＮＡ断片に連結され（４）、これを、場合によっては、これに指向されたプライマで増幅してもよい（５）。アダプタ連結ＤＮＡ断片の１本の鎖は、２つの異なる配列決定反応においてＳＥＱ１およびＳＥＱ２配列決定プライマ結合部位を使用して、すなわち、対応する異なる配列決定プライマを使用して、配列決定のためのテンプレートとしての役割を果たしてもよい。使用されるテンプレート鎖として、以下の３’−（Ｐ１）−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１−ＩＳ−ＳＥＱ２−ＮＳＩ２−（Ｐ２）−５’が挙げられる。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） サンプルＤＮＡから増幅産物の２個のヌクレオチド配列識別子の配列を決定する方法。２個のプライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）が隣接する内部配列（ＩＳ）を含むサンプルＤＮＡが提供され（１）、ならびにプライマ結合部位に相補的な配列を３’−末端におよび配列決定プライマ結合部位（ＳＥＱ）を５’−末端に含む増幅プライマ（２）のペアが提供される。増幅プライマでは、間に、ヌクレオチド配列識別子が位置する。サンプルＤＮＡは、増幅プライマで増幅され（３）、結果として両側に２個のヌクレオチド配列識別子を持ち、その外末端に２個のＳＥＱ（ＳＥＱ１およびＳＥＱ２）を持つ増幅産物となる。増幅産物の各鎖は、配列決定反応のためのテンプレートとしての役割を果たしてもよい。使用される１本のテンプレート鎖は、以下の３’−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１−Ｐ１−ＩＳ−Ｐ２−ＮＳＩ２−ＳＥＱ２−５’として表され、これで、配列決定プライマは、ＳＥＱ１に対して使用される。配列決定プライマは、各テンプレートからＮＳＩ配列（複数を含む）を決定するように提供される。配列は、別々に決定されてもよい。配列は、たとえばペアエンド配列決定で行うように、連続して決定されてもよい。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） サンプルＤＮＡから増幅産物の２個のヌクレオチド配列識別子の配列を決定する方法：シングル−リード・ダブル−タギング。２個のプライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）が隣接する内部配列（ＩＳ）を含むサンプルＤＮＡが提供され（１）、ならびにプライマ結合部位に相補的な配列を３’−末端に含む増幅プライマ（２）のペア（Ｃ１またはＣ２）が提供される。プライマは、さらに、ＮＳＩおよび配列決定プライマ結合部位を含み、前記異なるプライマは、以下の５’−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１−Ｃ１およびＣ２−ＳＥＱ２−ＮＳＩ２−５’で表される、異なる部位／配列を含む。サンプルＤＮＡは、増幅プライマで増幅され（３）、結果として両側にヌクレオチド配列識別子を持ち、増幅産物の外末端にＳＥＱ１およびもう１つの外末端にＮＳＩ２を持つ増幅産物となる（４）。増幅産物の１本の鎖は、２つの異なる配列決定反応においてＳＥＱ１およびＳＥＱ２配列決定プライマ結合部位を使用して、すなわち、対応する異なる配列決定プライマを使用して、配列決定のためのテンプレートとしての役割を果たしてもよい。使用されるテンプレート鎖は、以下の３’−ＳＥＱ１−ＮＳＩ１−Ｐ１−ＩＳ−Ｐ２−ＳＥＱ２−ＮＳＩ２−５’と表される。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） サンプルＤＮＡから増幅産物の４個のヌクレオチド配列識別子の配列を決定する方法：シングル−リード・ダブル−タギング。２個のプライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）が隣接する内部配列（ＩＳ）を含むサンプルＤＮＡが提供され（１）、ならびにプライマ結合部位に相補的な配列（Ｃ１またはＣ２）を３’−末端に含む増幅プライマ（２）のペアが提供される。プライマは、さらに、ＮＳＩを含み、プライマの１個は、配列決定プライマ結合部位を含む。異なるセクションを含む異なるプライマは、以下の５’−ＮＳＩ１−Ｃ１およびＣ２−ＳＥＱ２−ＮＳＩ２−５’と表される。サンプルＤＮＡは、増幅プライマで増幅され（３）、１つの外末端に２個のヌクレオチド配列識別子を持つ増幅産物となる。次に、アダプタのペアを提供する（４）。１つのアダプタは、配列決定プライマ結合部位 （ＳＥＱ１）と、ＮＳＩ（ＮＳＩ３）とを含み、もう１つのプライマは、ＮＳＩ（ＮＳＩ４）を含む。アダプタは、増幅産物の両末端に連結され、結果としてＳＥＱ１セクションがその外末端にあるアダプタ連結増幅産物となり（５）、ＳＥＱ１およびＳＥＱ２は、ＩＳと隣接する。アダプタ連結ＤＮＡ断片の１本の鎖は、２つの異なる配列決定反応においてＳＥＱ１およびＳＥＱ２配列決定プライマ結合部位を使用して、すなわち、対応する異なる配列決定プライマを使用して、配列決定のためのテンプレートとしての役割を果たしてもよい。使用したテンプレート鎖は、以下の３’−ＳＥＱ１−ＮＳＩ３−ＮＳＩ１−ＩＳ−ＳＥＱ２−ＮＳＩ２−ＮＳＩ４−５’と表される。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） サンプルＤＮＡから増幅産物の４個のヌクレオチド配列識別子配列を決定する方法。２個のプライマ結合部位（Ｐ１およびＰ２）が隣接する内部配列（ＩＳ）を含むサンプルＤＮＡが提供され（１）、ならびにプライマ結合部位に相補的な配列を３’−末端に含む増幅プライマ（２）のペア（Ｃ１またはＣ２）が提供される。プライマは、さらに、ＮＳＩを含む。異なるセクションを含む異なるプライマは、以下のように、５’−ＮＳＩ１−Ｃ１およびＣ２−ＮＳＩ２−５’と表される。サンプルＤＮＡは、増幅プライマで増幅され（３）、結果として増幅産物の１つの外末端に２個のヌクレオチド配列識別子を持つ増幅産物になる。次に、アダプタのペアが提供される（４）。各アダプタは、配列決定プライマ結合部位（ＳＥＱ１またはＳＥＱ２）と、ＮＳＩ（ＮＳＩ３またはＮＳＩ４）とを含む。アダプタは、増幅産物の両末端に連結され、結果としてＳＥＱ１およびＳＥＱ２セクションがその外末端にあるアダプタ連結増幅産物になる（５）。アダプタ連結増幅産物の各鎖は、配列決定反応のためのテンプレートとしての役割を果たしてもよい。配列決定プライマは、各テンプレートからＮＳＩ配列（複数を含む）が決定されるように提供される。配列は、別々に決定されてもよい。配列は、たとえばペア−エンド配列決定で行うように、連続して決定してもよい。使用される１本のテンプレート鎖は、以下の３’−ＳＥＱ１−ＮＳＩ３−ＮＳＩ−１−Ｐ１−ＩＳ−Ｐ２−ＮＳＩ２−ＮＳＩ４−ＳＥＱ２−５’と表され、これで、配列決定プライマがＳＥＱ１に対して使用される。（５’は、ヌクレオチド鎖の５’−末端を示す。） プライマペアによる増幅。（ＵＴ１、ユニバーサルテール（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔａｉｌ）１；ＢＣ１、バーコード部１、ＵＴ２、ユニバーサルテール２；ＢＣＰ２、バーコード部２）Ａ．ユニバーサルテール１は、配列プライマ部位１（太い黒色の矢印）であってもよく、およびユニバーサルテール２は、配列プライマ部位２（点状の矢印）、たとえば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧＡペアエンド配列決定の場合におけるＰ５およびＰ７であってもよい。Ｂ．ユニバーサルテール１は、配列プライマ部位１（太い黒色の矢印）であってもよく、およびユニバーサルテール２は、配列プライマ部位２（破線の矢印）、たとえば、同じ鎖の２つのプライマ現象によるＩｌｌｕｍｉｎａのＧＡ配列決定の場合におけるＰ５およびＰ７であってもよい。 バーコード化アダプダのペアの連結。（Ｐ５、Ｐ５＋ｓｅｑ．ｐｒ．部位；ＢＣ１，バーコード部１；ＢＣ２，バーコード部２；Ｐ７，Ｐ７＋ｓｅｑ．ｐｒ．部位；Ｂ、平滑末端アダプタ）Ａ．ＥｃｏＲｌａｎｄ Ｍｓｅｌバーコード化アダプタのＥｃｏＲｌ／Ｍｓｅｌ消化ＤＮＡへの連結であって、バーコード部１（ＥｃｏＲｌ側）と２（Ｍｓｅｌ側）との組み合わせが、サンプルを固有に規定する連結。Ｂ．ＥｃｏＲｌおよび平滑末端バーコード化アダプタの、先ずＥｃｏＲｌで消化され、次いでＥｃｏＲｌバーコード化アダプタ連結が起こり（バーコード１）、次いで、アダプタ連結断片の断片化、任意の末端研磨、次いで平滑末端アダプタ連結されたサンプル（バーコード部２）への連結であって、バーコード部１（ＥｃｏＲｌ側）およびバーコード部２（平滑末端側）の組み合わせが、固有にサンプルを規定する連結。
定義
以下の説明および実施例において、数多くの用語が使用される。そのような用語が記載されている範囲を含有する明細書および請求項の明瞭で一貫性のある理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書で他に定義がない限り、使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じである。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、その全てが、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の方法で使用される従来技術を実施する方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、生物情報学、遺伝子学、配列決定および関連分野における従来の技術の行為は、当業者に周知であり、たとえば、以下の文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに論じられている。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ． Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７およびｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ；ならびにｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。
本明細書で使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、明細書で明らかに他のことが記載されていない限り、複数形も含有する。たとえば、単離ＤＮＡは、複数の単離ＤＮＡ分子（たとえば、１０代、１００代、１，０００代、１０，０００代、１００，０００代、１，０００，０００代、またはそれ以上の分子）を含有する。
本発明による「ヌクレオチド配列」は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくは、シトシン、チミンおよびウラシル、ならびにアデニンおよびグアニンのそれぞれ、ならびにこれらの組合せのような、ヌクレオチドの任意のポリマーまたはオリゴマーを含有してもよい（Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂ．１９８２）参照、この文献は、全ての目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分、および任意のその化学変種、たとえば、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化、またはグルコシル化体などを想定する。ポリマーまたはオリゴマーは、その組成が、不均質でも均質でもよく、天然資源から単離されても、または人工的または合成的に生成されてもよい。また、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはこれらの混合物でもよく、単鎖または二重鎖形態中に、永久にまたは過渡的に存在してもよく、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリット形態が挙げられる。
本発明による「サンプルＤＮＡ」は、生物由来であり、ＤＮＡを含むサンプルである。「サンプルＤＮＡ」は、ＤＮＡを含む生物からの細胞を含んでもよいが、また生物の細胞から単離されたＤＮＡを含んでもよい。「サンプルＤＮＡ」が本発明の方法で使用することができるＤＮＡを含む限り、そのようなサンプルＤＮＡは本発明で使用されてよい。サンプルＤＮＡを取得し得る生物として、たとえば、植物、哺乳類、真菌類および微生物がある。また、サンプルＤＮＡは、発現配列タグまたはｃＤＮＡを含んでもよく、ここで、生物の細胞内で発現したＲＮＡそのものが、逆転写によって、二重鎖ＤＮＡに変換される。また、サンプルＤＮＡは、生物の異なる部位および／または数種の異なる生物から得たプールサンプルＤＮＡを含んでもよい。プールサンプルＤＮＡは、たとえば、サンプルＤＮＡに含まれている各サンプルの起源が決定されるように、３−Ｄプールスキームでプールされてもよい（たとえば、国際公開第２００７／０３７６７８号パンフレットに記載されるように）。
「ＤＮＡの断片化」は、サンプルＤＮＡに適用される場合、ＤＮＡ断片となる任意の技術を含有する。当該分野で周知の技術として、超音波処理、せん断および／または酵素的制限があるが、他の技術も想定することができる。
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、たとえば、二重鎖ＤＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列（認識部位）を認識する酵素であり、各認識部位でまたはその近くで、ＤＮＡ分子の両鎖を切断し、平滑末端または３’−もしくは５’−突出末端を離す。認識された特定のヌクレオチド配列は、切断の回数を決定してもよく、たとえば、６個のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、平均で、４０９６個のヌクレオチド毎に起こり、一方、４個のヌクレオチドのヌクレオチド配列は、かなり頻繁に、平均で、２５６個のヌクレオチド毎に起こる。Ｉ型制限酵素は、それらの認識部位と異なり、該部位からある程度の距離（少なくとも１０００ｂｐ）離れている部位で切断する。認識部位は、非対称であり、約６〜８個のヌクレオチドのスペーサーで分離された、２つの部分、−１つは３〜４個のヌクレオチドを含み、もう１つは４〜５個のヌクレオチドを含む−で構成される。ＩＩ型制限酵素は、通常分割されず、回文構造の認識部位を有し、長さは４〜８個のヌクレオチドである。これらは、同じ部位で、ＤＮＡを認識し、切断する。ＩＩ型は、それらの認識配列の外側で切断し、ＩＩＢ型は、それらの認識部位の両側でＤＮＡを切断し、認識部位を切り離す。ＩＩＩ型制限酵素（たとえばＥｃｏＰ１５）は、逆に配向された２個の別個の非回文構造の配列を認識する。これらは、認識部位の後で、ＤＮＡを約２０〜３０個の塩基ペアで切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを切断する。
「研磨」として、平滑末端化された３’または５’突出部を有してもよい、二重鎖ヌクレオチド配列を作成するために使用される任意の技術が挙げられる。たとえば、サンプルＤＮＡが、超音波処理を使用して、または酵素を使用して断片化された場合、ねじれ型の（突出）末端となる。ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片は、５’突出部（３’陥没末端とも呼ばれる）を満たすためおよび３’突出部をチューバックするために使用することができ、またはマングビーンヌクレアーゼは、３’または５’突出部をチューバックするために使用することができる。
本発明による「連結すること」は、別個の二重鎖ヌクレオチド配列の結合に関与する。二重鎖ＤＮＡ分子は、平滑末端化されていてもよく、または突出部が互いにハイブリット形成できるように、適合する突出部（粘着性突出部）を有してもよい。ＤＮＡ断片の結合は、リガーゼ酵素、ＤＮＡリガーゼで、酵素的であってもよい。しかし、ＤＮＡ断片が結合する、すなわち、共有結合を形成する限り、非酵素的連結が使用されてもよい。代表的には、別個の鎖の水酸基とリン酸エステル基との間にホスホジエステル結合が、連結反応によって形成される。二重鎖ヌクレオチド配列は、連結の前に、リン酸エステル化されてもよい。
「増幅プライマ」は、ＤＮＡの合成を刺激することができる単鎖ヌクレオチド配列を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマなしでは、新規に、ＤＮＡを合成することができない。増幅プライマがＤＮＡに対してハイブリッド形成し、すなわち、塩基ペアが形成される。互いに相補的な塩基ペアを形成することができるヌクレオチドは、たとえば、シトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、グアニンとウラシルである。増幅プライマと現存のＤＮＡ鎖との間の相補性は、１００％である必要はなく、すなわち、プライマの全ての塩基が、現存のＤＮＡ鎖とペアを作る必要はない。増幅プライマが（部分的に）ハイブリット形成している、現存のＤＮＡ鎖、たとえば、サンプルＤＮＡまたはアダプタ連結ＤＮＡ断片の配列は、しばしば、プライマ結合部位（ＰＢＳ）と言われる。現存のＤＮＡ鎖でハイブリッド形成されたプライマの３’−末端から、現存の鎖をテンプレートとして使用して、ヌクレオチドが導入される（テンプレート指向ＤＮＡ合成）。また、われわれは、増幅反応で「プライマ」として使用される、合成オリゴヌクレオチド分子にも言及する。増幅反応で新しく合成されたヌクレオチド配列は、内部配列と言われる場合がある。ＰＣＲ反応が行われる場合、内部配列は、一般的に、２つのプライマ結合部位の間の配列である。本発明によれば、プライマが増幅ステップで使用され、追加の配列をＤＮＡに導入することができる。これは、プライマに、追加の配列、たとえば、識別子、配列決定アダプタ、またはビオチン成分のような捕捉リガンドを提供することによって、達成することができる。修飾は、供給するプライマの部分から上流のプライマの５’−末端でそれらを提供し、ＤＮＡの合成を刺激することによって、導入することができる。
「増幅」または「増幅すること」は、ポリヌクレオチド増幅反応、すなわち、１つ以上の出発配列から複製されたポリヌクレオチドの集団を表す。増幅することは、種々の増幅反応を言い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列系増幅、ローリングサークル増幅、およびこのような反応が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、増幅プライマが増幅のために使用され、増幅反応の結果物は、増幅産物である。
「配列決定プライマ」は、ＤＮＡの合成を刺激することができ、ＤＮＡを配列するために使用される単鎖ヌクレオチド配列を表す。また、増幅プライマは、配列決定プライマとして使用してもよい。配列決定プライマは、増幅プライマとして使用することもできる。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマなしでは、新規にＤＮＡを合成することができない。配列決定プライマがＤＮＡに対してハイブリッド形成し、すなわち、塩基ペアが形成される。互いに相補的な塩基ペアを形成することができるヌクレオチドは、たとえば、シトシンとグアニン、チミンとアデニン、アデニンとウラシル、グアニンとウラシルである。増幅プライマと現存のＤＮＡ鎖との間の相補性は、１００％である必要はなく、すなわち、プライマの全ての塩基が、現存のＤＮＡ鎖とペアを作る必要はない。配列決定プライマが（部分的に）ハイブリット形成する、現存のＤＮＡ鎖、たとえば、サンプルＤＮＡまたはアダプタ連結ＤＮＡ断片の配列は、しばしば、配列決定プライマ結合部位（ＳＥＱ）と言われる。現存のＤＮＡ鎖でハイブリッド形成された配列決定プライマの３’−末端から、現存の鎖をテンプレートとして使用して、ヌクレオチドが導入される（テンプレート指向ＤＮＡ合成）。特定のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）の導入は、合成の間、たとえば、パイロシーケンス中、または蛍光で標識化されたヌクレオチドを使用する時に、検出され得る。または、連鎖終止反応、たとえば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定またはＤｙｅ終止配列決定を使用することができる。いずれの場合も、配列決定プライマでＤＮＡを合成し、導入ヌクレオチドおよび／または合成断片を検出することによって、ＤＮＡテンプレートのヌクレオチドの順番が決定される限り、これらおよび他の方法が想定される。
「配列決定」は、核酸サンプル、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、ヌクレオチド（塩基配列）の順番を決定することを表す。Ｓａｎｇｅｒ配列決定および高処理配列決定技術（ＨＴＳ）のような多くの技術が利用可能である。Ｓａｎｇｅｒ配列決定は、１つの実行で、３８４個までの毛細管が配列解析されてもよい、（毛細管）電気泳動を使う検出による配列決定に関与してもよい。高処理配列決定は、一度に、数千、数百万、またはそれ以上の配列の並列型塩基配列決定に関与する。ＨＴＳは、次世代の配列決定、すなわち、固相パイロシーケンスに基づく技術、または単一ヌクレオチド・リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ）に基づく次の次の世代の配列決定として定義され得る。ＨＴＳ技術は、Ｒｏｃｈｅ、ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供されているように、利用可能である。さらなる高処理配列決定技術が、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｂｓｙｓ、ＺＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＧｎｕＢｉｏによって記載されおよび／または利用可能である。これらの配列決定技術は、それぞれ、実際の配列決定ステップの前に、各自のサンプルの調製方法を有する。これらのステップは、高処理配列決定方法に含有されてもよい。ある場合では、配列決定ステップのための特別のステップが、効率または経済的な理由で、実際の配列決定ステップの前に、サンプル調製プロトコルに組み込まれてもよい。たとえば、断片に連結されたアダプタは、後続配列決定ステップで使用することができるセクションを含んでもよい（いわゆる配列決定アダプタ）。または、配列決定の前に断片の一部を増幅するために使用されるプライマは、たとえば、増幅ステップの間、配列決定アダプタまたは捕捉する成分を、後続の配列決定ステップで使用することができる増幅産物中に導入することによって、配列決定ステップで後に使用することができるセクションを導入するそれらの配列内にパートを含んでもよい。また、使用される配列決定技術によっては、増幅ステップを省いてもよい。
「アダプタ」は、限られた数の塩基ペア、たとえば、長さで約１０〜約１００個の塩基ペアを持つ短い二重鎖ＤＮＡ分子であり、これは、ＤＮＡ断片または増幅産物の末端に連結され得るように、設計されている。アダプタは、一般的に、少なくとも部分的に互いに相補的なヌクレオチド配列を有する２個の合成オリゴヌクレオチドで構成されている。アダプタは、平滑末端を有してもよく、ねじれ型の末端を有してもよく、または平滑末端およびねじれ型の末端を有してもよい。ねじれ型末端は、３’または５’突出部である。２つの合成オリゴヌクレオチドを適切な条件下溶液中で混合すると、これらは互いをアニールし、二重鎖構造を形成する。アニール後、アダプタ分子の１つの末端は、制限断片の末端と互換性があり、それに連結され得るように設計されてもよく、アダプタのもう１つの末端は、連結できないように設計することができるが、それは必要のない場合であって、たとえば、アダプタが、ＤＮＡ断片間で連結される場合である。ある場合では、アダプタは、断片に連結され、アダプタ連結断片の後続の操作、たとえば、増幅または配列決定のために、出発点を提供することができる。後者の場合、いわゆる配列決定アダプタは、断片に連結されてもよい。
本発明の第一態様では、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子の組合せの、高処理配列決定用のサンプルＤＮＡの調製での使用が提供される。したがって、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子の組み合わせを、高処理配列決定用のサンプルＤＮＡの調製に使用するステップを含む方法が提供される。これによるサンプルＤＮＡの調製では、サンプルＤＮＡは、少なくとも２種のＮＳＩがサンプルＤＮＡに含有されるように、すなわち、少なくとも２種のＮＳＩが、たとえば、増幅産物および／またはアダプタ連結ＤＮＡ断片もしくはその増幅産物に包含されるように調製されることを意味する。したがって、少なくとも２種のＮＳＩは、単一ポリヌクレオチド分子が少なくとも２種のＮＳＩを包含するようにサンプルＤＮＡのヌクレオチド配列に含有される。ＮＳＩの組合せは、サンプルＤＮＡ用の固有の識別子（「スプリットバーコード」）としての役割を果たす。
設計の面から、使用できるヌクレオチド配列識別子の数に実際的な限定はない。たとえば、１個のヌクレオチドが、既に、ヌクレオチド配列識別子としての役割を果たしてもよい。したがって、４個の異なるヌクレオチド配列識別子は、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴと設計されてもよい。そのような単一ヌクレオチド識別子に隣接する配列は、ＮＳＩの識別を先導する役割を果たしてもよい。バーコードのサイズを大きくすることによって、可能性の数は増える。３個のＤＮＡ塩基は、６４の可能な３−ｍｅｒ配列（４３）、２５６の可能な４−ｍｅｒ（＝４４）、１０２４の可能な５−ｍｅｒ（＝４５）および４０９６の可能な７−ｍｅｒ（＝４６）などを可能にする。しかし、実際のところ、１つしか異ならないヌクレオチド配列識別子（たとえば、４−ｍｅｒの場合のＧＡＴＣおよびＧＡＴＴ）を同じ実験で使用することは、１つの塩基増幅または配列決定エラーの場合、間違った配置になる可能性があるので、これを避けるため、これらの配列からサブセットを選択するのが好ましいかもしれない。同様に、ＮＧＳプラットホームは、いわゆる「ホモポリマー」配列に関し、より高いエラーレートを有するので、２個の同じ塩基が連続しているヌクレオチド配列識別子（たとえば、５−ｍｅｒの場合、ＡＡＴＧＣは２個のＡが連続している）の使用は避けるのが好ましいかもしれない。このような選択基準にもかかわらず、一般的に、塩基の長さの増大は選択する最初の数の４倍高くなるので、適切なヌクレオチド配列識別子の不足はない。
したがって、たとえば、調製サンプルＤＮＡの高処理配列決定方法において、２つのＮＳＩ配列を決定する場合、２つのＮＳＩの組合せが調製サンプルＤＮＡの起源を決定する。このように、ＮＳＩの数、つまり、たとえば、使用しなければならない異なるプライマおよび／またはアダプタの数は、大きく減らすことができる。現在、１００個のサンプルでは１００個のＮＳＩが使用され、たとえばＮＳＩを含む１００個の異なるフォワードプライマが、１個のリバースプライマと組合わされる。本発明によれば、スプリットバーコードを使用することによって、１０個のＮＳＩで十分であり、したがって、１００個の固有の組合せを作ることができる１０個の異なるフォワードプライマおよび１０個の異なるリバースプライマを使用することができる。したがって、使用しなければならないプライマの総数は大きく減らされ、その数は、１０１個のプライマから２０個のプライマに減らされる。したがって、サンプル調製ワークフローの複雑さが減り、サンプルの同じ表示の可能性が増し、作業量および必要な貯蔵容量は減り、実験コストは減る。
さらなる実施形態では、高処理配列決定のためのサンプルＤＮＡの調製における少なくとも２種のＮＳＩの組み合わせの使用であって、高処理配列決定において複数の調製サンプルＤＮＡが使用され、ここで、サンプルＤＮＡの各調製物は、第一ＮＳＩはＮＳＩの一群から選択され、および第二ＮＳＩは該ＮＳＩの群から選択される、少なくとも２種のＮＳＩの固有の組合せを含む使用が提供される。
使用されるＮＳＩの群は、全てのＮＳＩを含む。各サンプルＤＮＡで、ヌクレオチド配列識別子は前記群から選択される。これは、少なくとも２種のＮＳＩのサンプルＤＮＡにおいて、ＮＳＩの組合せ中で同じＮＳＩが選択されてもよいことを意味する。さらに、少なくとも２種のＮＳＩのサンプルＤＮＡにおいて、異なるＮＳＩは、ＮＳＩの組合せで選択されてもよい。ＮＳＩの組合せが各サンプルＤＮＡに関し固有である限り、そのような組合せを使用してもよい。また、ＮＳＩの群は、ＮＳＩの少なくとも２種のサブグループを含んでもよく、ここで、第一および第二ＮＳＩは、それぞれ、異なるサブグループから選択されてもよい。第一および第二ＮＳＩに加えて、ＮＳＩの群から選択されたさらなるＮＳＩが使用されてもよい。ＮＳＩの一群は、少なくとも４、１０、１００または１０００個のＮＳＩを含んでもよい。
発明の全体を通し、ＮＳＩの一群が提供される中で、該群は、仮想的に提供されてもよく、すなわち、物理的でなくてもよいことは理解される。該群は、たとえば、インシリコおよび／またはインフィジコで提供される。たとえば、ＮＳＩの一群は、配列のリストとして提供されてもよい。ＮＳＩは、そのリストから選択され、およびインシリコでプライマおよび／またはアダプタを設計するために使用されてもよい。したがって、ＮＳＩの一群を提供し、アダプタを提供する後続のステップは、インシリコでＮＳＩの一群を提供することと、その群からインシリコでＮＳＩを選択することと、インシリコでアダプタを設計することと、および次にインフィジコでＮＳＩを含むアダプタを提供することとを含んでもよいと理解される。または、ＮＳＩは、インフィジコで提供され、たとえば、ヌクレオチド配列識別子からなるアダプタが使用されるシナリオで、直接使用されてもよい。または、たとえば、ＮＳＩは、インフィジコで提供され、他のヌクレオチド鎖に、アダプタおよび／または増幅プライマが生成されるように結合され（たとえば、連結される、その他）、これによって、ＮＳＩを含むアダプタおよび／または増幅プライマが提供されてもよい。
本発明の理論的根拠は、試薬の前払い費用を減らすために、各サンプルに組み込まれる少なくとも２種の異なるヌクレオチド配列識別子を使用し、増殖力を活用することによって、多数の固有の組合せを創造することである。このことを、表１に２つのＮＳｉの数多くの数学的に最適な条件で示す。
Figure 2013528058
繰返しになるが、前記概念は、表２に示された例示に限定されず、同じように他の組合せも考慮することができる。たとえば、最適ではない組合せが選択されてもよい。２個を超えるＮＳＩに関与してもよい組合せも同様に選択され得る。たとえば、１０個のＮＳＩを使用し、４個のＮＳＩと組合せ、１０×１０×１０×１０＝１０，０００個の固有の組合せが可能である。使用される設計および／または組合せ方法では、実施上の配慮点、たとえば、サンプルＤＮＡの調製に関する実施上の配慮点も考慮に入れられる。
調製サンプルＤＮＡは加工を受けたサンプルＤＮＡであり、それにより、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子は、ＤＮＡに含まれ、すなわち、少なくとも２種のＮＳＩは、２個のＮＳＩとサンプルＤＮＡからのＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ分子に含有される。ＤＮＡ分子は、二重鎖ＤＮＡ分子であっても、単鎖ＤＮＡ分子であってもよい。調製サンプルＤＮＡは、複数の異なるＤＮＡ分子を含んでもよく、ここで、各ＤＮＡ分子は、各ＤＮＡ分子が、それが起源とするサンプルＤＮＡに割り当てられ得るように、ＮＳＩの固有の組合せを含むと理解される。高処理配列決定方法では、ＤＮＡ分子のそれぞれのうち、配列は、複数のＤＮＡ分子から高処理配列決定により決定されてもよい。
一実施形態では、調製サンプルＤＮＡは増幅産物を含む。たとえば、少なくとも２種のＮＳＩは、増幅産物を調製するために使用されるプライマに含有される。したがって、増幅産物は、使用される少なくとも２種の異なるプライマからの少なくとも２種のＮＳＩを含む。増幅産物は、たとえば、ＰＣＲ反応で調製されてもよい。また、増幅産物は、ネステッドＰＣＲ、すなわち、第一の一組のプライマを使用して第一ＰＣＲ反応により第一増幅産物を調製し、次いで、第二の一組のプライマであって、第一の一組のプライマとは異なり、および第一ＰＣＲ反応の増幅産物を増幅するプライマを使用して第二ＰＣＲ反応によって調製されてもよい。ネステッドＰＣＲは、たとえば、非常に低い濃度のＤＮＡ配列を増幅するために行ってもよく、または、たとえば、追加の識別子または追加の識別子を提供する役割を果たしてもよい。
一実施形態では、調製サンプルＤＮＡは、アダプタ連結ＤＮＡ断片を含み、サンプルＤＮＡは、断片化され、およびアダプタは、ＤＮＡ断片に連結される。少なくとも２種のアダプタは、ＤＮＡ断片に連結され、少なくとも２種アダプタのそれぞれが、ＮＳＩを含む。
一実施形態では、調製サンプルＤＮＡは、増幅産物と、アダプタ連結断片とを含む。
一実施形態では、調製サンプルＤＮＡは、増幅アダプタ連結断片および／またはアダプタ連結増幅産物を含む。たとえば、サンプルＤＮＡは、その後、断片化、アダプタ連結および増幅に供されてもよい。反対に、サンプルＤＮＡは、たとえば、その後、増幅、断片化およびアダプタ連結に供されてもよい。この実施形態では、サンプルＤＮＡの調製で使用される全ての増幅プライマおよび／またはアダプタの少なくとも２種が、ＮＳＩを含む。
一実施形態では、本発明による方法は、以下のステップを含む。ａ）アダプタおよび／または増幅プライマを提供するステップであって、少なくとも、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子と第二アダプタまたは増幅プライマとを含む第一アダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含んで提供され、および場合によっては、さらなるアダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含んで提供されるステップと、ｂ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、ｃ）アダプタおよび／または増幅プライマを使用してサンプルＤＮＡ上で連結および／または増幅反応を行い、前記第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子を含む連結および／または増幅サンプルＤＮＡを提供するステップと、ｄ）高処理配列決定を使用して、少なくとも、第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子の配列を決定するステップと、ｅ）連結および／または増幅サンプルＤＮＡのサンプル起源を決定するステップ。
サンプルＤＮＡの調製において、少なくとも２種のＮＳＩを使用し、２個のＮＳＩとサンプルＤＮＡからのＤＮＡ配列とを含む単一ＤＮＡ分子となる限り、そのようなサンプル調製方法は、本発明により想定されてもよい。したがって、調製サンプルＤＮＡに少なくとも２種のＮＳＩを導入するために、別個の異なるアダプタ連結ステップおよび／または別個の増幅ステップは組合わされてもよい。また、サンプルＤＮＡの調製は、ＮＳＩの追加に関与しないステップを含んでもよい。
サンプルＤＮＡの調製では、後続の配列決定ステップで行ってもよいステップが含有されてもよく、逆も同様であると理解される。また、後続の配列決定ステップに必要なステップが、サンプルＤＮＡの調製に含有されてもよい。たとえば、配列決定反応において、テンプレートに存在する配列決定プライマ結合部位に結合する配列決定プライマを使用することができる。したがって、サンプルＤＮＡの調製で使用されるアダプタおよび／または増幅プライマは、さらに、配列決定プライマ結合部位を含んでもよい。または、配列決定プライマ結合部位は、後の段階で、これらの追加の配列を提供する高処理配列決定方法に加えてもよい。
高処理配列決定方法における少なくとも２種のＮＳＩの配列決定に加えて、サンプルＤＮＡからの配列も配列決定されてもよい。そのような配列は、これらは、サンプルＤＮＡ調製方法で捕捉および／または増幅され、目的のサンプルＤＮＡからの未知の配列を表すかもしれない配列であるので、内部配列と言ってもよい。また、これら内部配列は、ＮＳＩとともに配列決定されてもよく、したがって、これらの内部配列を含むサンプルの起源は、ＮＳＩの組合せにより決定され得る。このように、たとえば、遺伝子多型は、小さなヌクレオチド遺伝子多型、遺伝子欠損、挿入その他のような異なるサンプル間で、内部配列を比べるおよび／または内部配列を参照配列と比べることによって検出されてもよい。さらに、これらの内部配列は、たとえば、以下に記載する、異なる配列決定の読みがコンティグを構築するために使用されるシナリオで、調製サンプルＤＮＡに対する異なる読みの割り当を補助してもよい。
高処理配列決定は、一度に行う数千、数百万またはそれ以上の配列の平行配列決定に関与する。使用される高処理配列決定方法のいずれでも、調製サンプルＤＮＡのＮＳＩは、ＮＳＩの各組合せが調製サンプルＤＮＡに割り当てられるように決定される。たとえば、コンティグは、異なる配列決定読みを整列化し、組み合わせることによって構築してもよく、これによって、少なくとも２種のＮＳＩは連結され、したがって、少なくとも２種のＮＳＩを含む単一ＤＮＡ分子に割り当てられ得る。また、２つの配列決定反応は、調製サンプルＤＮＡの相補的な鎖で行われてもよく、これは、たとえば、内部配列が比較的大きい時に、断片の内部配列が両末端から求められる場合、好ましい。２つの配列決定の読みを、少なくとも２種のＮＳＩとサンプルＤＮＡからのＤＮＡ配列とを含む調製サンプルＤＮＡに割り当てることができる場合、そのような高処理配列決定方法は想定され得る。また、少なくとも２種のＮＳＩは、高処理配列決定方法で単一の配列決定読みから決定してもよい。
たとえば、いわゆるペアエンド配列決定方法では、第一配列決定反応において、テンプレートとして前記鎖の１つを使用して、ＮＳＩを含有する第一配列が決定されてもよい。第一配列決定反応の後、最初にテンプレートとして使用された鎖から、相補的な鎖が産生されてもよい。続いて、この新しく産生した鎖を第二テンプレートとして使用して、第二配列決定反応を行うことができる。したがって、２本のＤＮＡテンプレート鎖は、この方法で使用される。たとえば、第一配列決定テンプレート鎖の構造は、３’−配列プライマ結合部位１−ＮＳＩ１−内部配列−逆補体ＮＳＩ２−逆補体配列プライマ結合部位２−５’が可能である。第一配列決定反応の後、第一配列決定テンプレート鎖の逆補体を産生することができ、これは、続いて、第二配列決定反応において使用され得る。したがって、第二配列決定反応は、以下のテンプレート：３’−配列プライマ結合部位２−ＮＳＩ２−逆補体内部配列−逆補体ＮＳＩ１−逆補体配列プライマ結合部位１−５’を有する。両配列解読は共存する（たとえば、同じウェル中、同じビーズ中）ので、ＮＳＩ１およびＮＳＩ２を含む２つの配列解読は、同じ調製サンプルＤＮＡに割り当てられ、調製サンプルＤＮＡを同定するために使用され得る。サンプル調製および後続の配列決定のそのようなシナリオは、図５、７および１０に示されている。
一実施形態では、高処理配列決定方法において、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートが使用される。本発明による単一ＤＮＡテンプレートは、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子を含む単鎖ＤＮＡ分子を意味する。調製サンプルＤＮＡからの単一ＤＮＡテンプレートは、複数の単一ＤＮＡテンプレート分子を含んでもよく、たとえば、サンプルＤＮＡに由来する異なる内部配列であって、該異なる内部配列はそれぞれ、ＮＳＩの固有の組合せと結合しているものを含むと理解される。たとえば、調製サンプルＤＮＡが増幅産物（または複数の増幅産物）である場合、増幅産物は、ＤＮＡの２本鎖を含む。この実施形態では、増幅産物の鎖の１本だけが、ＮＳＩ配列を決定するための配列決定反応で使用される。このように、調製サンプルＤＮＡの起源は、コンティグの構築なしにおよび／または他のＤＮＡテンプレートに由来する配列を必要とせずに決定され得る。ＮＳＩは、調製サンプルＤＮＡの内部配列と隣接してもよい。また、ＮＳＩは、調製サンプルＤＮＡ（の内部配列）の一方の側にあってもよい。これらのシナリオにおいて、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレート分子は、以下の構造：３’−配列プライマ結合部位−ＮＳＩ１−内部配列−ＮＳＩ２−５’または３’−配列プライマ結合部位−ＮＳＩ１−ＮＳＩ２−内部配列−５’を有することできる。調製サンプルＤＮＡは、追加の配列を含んでもよい。配列プライマ結合部位、ＮＳＩおよび内部配列の順番は、この構造的表現において、何が対象であるかである。配列プライマ結合部位は、サンプルＤＮＡの調製の間に導入されてよくおよび／または高処理配列決定方法において導入されてもよい。高処理配列決定で産生された配列の長さおよび／または配列の品質は、限定されてもよい。一方、配列決定長さは、内部配列と隣接する両ＮＳＩが決定できないように、制限してもよい。両配列が単一の読みで決定することができるように、内部配列の片側、すなわち、先ず配列決定される単一ＤＮＡテンプレートのパートに、ＮＳＩを有することが有利であることもある。また、ＮＳＩは、内部配列の両側にあってもよい。
一実施形態では、使用される単一ＤＮＡテンプレートは、２つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよく、ここで、各配列決定プライマ結合部位は、異なるヌクレオチド配列識別子の３’に位置する。一般的に、単一ＤＮＡテンプレートは、第一セクションおよび第二セクションを含んでもよく、その間にサンプルＤＮＡに由来する内部配列がある。第一セクションは、配列決定プライマ結合部位を含み、その５’に位置するＮＳＩおよび任意でさらにＮＳＩを有し、第二セクションは、第二配列決定プライマ結合部位を含む、その５’に位置するＮＳＩおよび任意でさらにＮＳＩを有する。このシナリオでは、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートは、以下の構造：３’−配列プライマ結合部位１−ＮＳＩ１−内部配列−配列プライマ結合部位１ＮＳＩ２−５’を有することができる。調製サンプルＤＮＡは、追加の配列を含んでもよい。配列プライマ結合部位、ＮＳＩおよび内部配列の順番は、この構造的表現において、対象となるものである。したがって、配列決定プライマ結合部位は、直接ヌクレオチド配列識別子の３’に位置することができるが、追加の配列が、配列決定プライマ結合部位とヌクレオチド配列識別子との間に存在してもよい。このシナリオでは、高処理配列決定方法で、単一のテンプレートから、２つの異なる配列決定反応が連続的に行われてもよい。１つの配列決定反応は、１つ（またはそれ以上）のＮＳＩを決定し、第二配列決定反応は、１つの第二ＮＳＩ（またはそれ以上）を決定することとなる。同じテンプレートを使用して高処理配列決定方法で行われるこの実施形態の２つの配列決定反応は、以下、「シングル−リード・ダブル−タギング」配列決定と表す場合がある。シングル−リード・ダブル−タギングのこのようなシナリオを、図６、８および９に示す。
使用されるサンプル調製の間および／または高処理配列決定方法の間、異なるサンプルまたは異なるサンプルの一部は、同時に行われてもよいステップが同時に行われるように、プールされてもよい。サンプルがプールされずまたは異なるサンプルの一部がプールされ、サンプル起源がもはや遡ることがない場合、サンプル起源はさらに決定されてもよい。たとえば、サンプルＤＮＡの調製において、ＮＳＩが異なるステップで加えられるシナリオでは、そのようなステップ後、サンプルの少なくとも一部を調製下にプールすることが有利なこともある。たとえば、６個のＮＳＩが３６個のサンプルのために使用されるシナリオでは、各サンプルＤＮＡは、先ず、６個の異なるＮＳＩ（Ａ−Ｆ）の１個を加えるステップに供される。固有の識別子を含むサンプルはプールされ（Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、Ｅ１、Ｆ１）、そして各プールに６個の識別子が加えられ、ここで、６個の各グループは固有の第二識別子（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２、Ｅ２またはＦ２）を有し、これによって、Ａ１、およびＡ２などは同一または同一でないこともある。最後に、少なくとも２種の固有の識別子が導入されるので、全てのサンプルＤＮＡが調製されると、調製サンプルＤＮＡは、任意の可能な方法で、プールされてもよい（部分的または全体）。
異なる方法で、少なくとも２種のＮＳＩの固有の組合せを含む調製サンプルＤＮＡのサンプル起源を同定することが可能である。
本発明の一実施形態では、複数のサンプルＤＮＡから、増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、ｃ）第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｄ）第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｅ）各サンプルＤＮＡを、第一および第二増幅プライマの固有の一組で増幅し、増幅産物を得るステップと、ｆ）場合によっては、増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、ｇ）該増幅産物の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、ｈ）該増幅産物のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態のこの方法のサンプル調製のスキームを、図１に示す。この方法では、２個のＮＳＩが第一および第二増幅プライマに含有される。増幅産物は、２個のＮＳＩを含む。増幅プライマは、対象である特定の内部配列を増幅するように設計されてもよい。内部配列の少なくとも一部および増幅産物の２個のＮＳＩを配列決定することにより、それぞれ配列決定された（部分的）内部配列を、起源であるサンプルＤＮＡに割り当ててもよい。または、増幅プライマは、特定のプライマ結合部位に対して選択性があるように設計されてもよい。２個のＮＳＩの配列を決定するだけで、特定のサンプルＤＮＡのための増幅産物の存在または非存在が決定される。使用される増幅プライマは、後続の高処理配列決定方法で使用してもよいし、アダプタの連結に適するリン酸化５’−末端を有してもよい。または、必要な場合は、増幅産物がリン酸化されてもよい。
一実施形態では、複数のサンプルＤＮＡから、アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、ｃ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｄ）第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｅ）各サンプルＤＮＡを断片化するステップと、ｆ）固有の一組の第一および第二アダプタを各断片化サンプルＤＮＡに連結し、アダプタ連結ＤＮＡ断片を得るステップと、ｇ）場合によっては、アダプタ連結ＤＮＡ断片の少なくとも一部をプールするステップと、ｈ）アダプタ連結ＤＮＡ断片の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、ｉ）アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態の方法のサンプル調製を示すスキームを、図２に示す。この方法では、２個のアダプタがＤＮＡ断片に連結されている。図２に示すように、アダプタは、断片のどちらの部位に連結されてもよい。特にこれは、そのようなアダプタ連結方法が使用される高処理配列決定方法に適している。２個の異なるアダプタを断片に連結する多くの方法が可能である。たとえば、先ず、ＤＮＡは、２つの異なる認識部位を持つ２個の制限酵素で断片化されてもよい。これにより、１個の制限酵素の結果物である、末端を有するＤＮＡ断片となるが、また、２個の制限酵素の結果物でもある、末端を有する断片ともなる。各末端の特異的な制限末端に連結され得る２個の異なるアダプタが設計される場合、２個の異なるアダプタを含むアダプタ連結断片が形成され得る。さらに、同じアダプタ２個を含むアダプタ連結断片が形成される。または、ＤＮＡは、たとえば、単一の制限酵素で断片化され、次いでそれに相補的なアダプタで連結されてもよい。次に、アダプタ連結断片は、再び、今度はたとえば音波処理によって断片化されてもよい。次に、断片末端は研磨されてもよく、前記研磨末端に平滑末端アダプタが連結される。結果物は、制限酵素に相補的なアダプタを含むアダプタ連結断片を含有するアダプタ連結断片と、平滑末端に相補的なアダプタとの混合物である。両シナリオとも、２個のＮＳＩを含んでもよいアダプタ連結断片が形成される。サンプル起源を決定するのに必要な２個のＮＳＩの組合せであるから、２個の異なるアダプタを含むアダプタ連結断片だけで、サンプル起源を決定することができる。
一実施形態では、アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、ｃ）第一増幅プライマを提供するステップと、ｄ）第二増幅プライマを提供するステップと、ｅ）サンプルＤＮＡを、第一および第二増幅プライマの一組で増幅し、増幅産物を得るステップと、ｆ）場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルＤＮＡの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、ｇ）場合によっては、前記増幅産物を断片化するステップと、ｈ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｉ）第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｊ）場合によっては、さらなるアダプタを提供するステップであって、各アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｋ）第一アダプタを（断片化された）増幅産物に連結するステップと、ｌ）場合によっては、ステップｋ）のアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、ｍ）連結ステップを第二のおよびさらなるアダプタで繰り返し、各連結ステップの後、場合によっては、得られたアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、ｎ）ステップｍ）で得たアダプタ連結増幅産物の第一、第二および場合によってはさらなる識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、ｏ）アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態では、各サンプルＤＮＡは、少なくとも１つのＰＣＲ増幅反応に供される。各サンプルで、たとえば、異なる標的配列に関して、複数のＰＣＲ反応が行われてもよい。各サンプルのこれらの異なる増幅産物は、場合によっては、プールされてもよい。この実施形態のＮＳＩは、別個のステップで加えられてもよく、および各ステップ後、アダプタ連結増幅産物の少なくとも一部がプールされてもよい。
他の実施形態では、アダプタの連結および増幅を組合せ、ここで、調製サンプルＤＮＡのサンプル起源は、調製サンプルＤＮＡの２〜４個のＮＳＩを決定することによって決定され得る。
一実施形態では、複数のサンプルＤＮＡから、増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、ｃ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタは、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｄ）場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、場合によっては、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｅ）各サンプルＤＮＡを断片化するステップと、ｆ）少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、断片化サンプルＤＮＡに連結し、アダプタ連結ＤＮＡ断片を得るステップと、ｇ）場合によっては、アダプタ連結ＤＮＡ断片の少なくとも一部をプールするステップと、ｈ）第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマは、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｉ）場合によっては、第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマは、場合によっては、ヌクレオチド配列識別子の一群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｊ）アダプタ連結ＤＮＡ断片を、第一増幅プライマおよび場合によっては第二増幅プライマで増幅し、増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ＮＳＩの組合せは、各サンプルに関して固有であるステップと、ｋ）場合によっては、増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片の少なくとも一部をプールするステップと、ｌ）増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、ｍ）増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態の方法のサンプル調製のスキームを、図３に示す。このシナリオで、アダプタ連結断片は、先に記載したように調製されてもよい。または、１個のアダプタだけが断片に連結されていてもよい。アダプタ（複数を含む）は、ＮＳＩに加えて、後続の増幅で使用されるプライマ結合部位および好ましくは配列決定プライマ結合部位を含んでもよい。断片の片側で同じアダプタが使用されるシナリオでは、同じ増幅プライマが、アダプタ連結断片を増幅するために使用されてもよい。また、プライマ結合部位は、ＮＳＩ（の一部）を含有してもよい。または、内部配列の制限認識部位配列を超えるＤＮＡ断片の内部配列に、追加の（異なる）相補的なヌクレオチドが必要な、（より）選択的なプライマが使用されてもよい。選択的プライマの概念は、たとえば、国際公開第２００６／１３７７３３号パンフレットに詳細に記載され、この実施形態の方法は、そのような選択的プライマを使用するサンプルＤＮＡの調製に関与する。たとえば、アダプタ配列（の一部）およびアダプタが連結されているサンプルＤＮＡの内部配列に相補的なプライマが、制限認識部位と追加のヌクレオチドとを含むように設計される。追加のヌクレオチドは、プライマに選択性を与える選択的ヌクレオチドである。選択的プライマは、平均して、４個のアダプタ連結制限断片中１個に結合してもよく、伸長された３’−末端を有してもよい。選択的プライマの概念は、ＡＦＬＰ（欧州特許第５３４８５８号明細書）から、複雑な削減方法として周知である。
いずれの場合も、最終結果物は、増幅アダプタ連結断片であって、これは、少なくとも２種のＮＳＩまたは３種または４種のＮＳＩを含んでもよい。より多くのＮＳＩを含有させることは、これにより、さらにＮＳＩの数を減らし得るので、有利である。たとえば、１０，０００個のサンプルに関して、２個のＮＳＩの組合せで１００個のＮＳＩが必要であり（１００×１００）、４個のＮＳＩの組合せでは１０個のＮＳＩが必要である（１０×１０×１０×１０）。
一実施形態では、アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、以下のステップを含む方法が提供される。ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供する方法と、ｃ）第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマは、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｄ）第二増幅プライマを提供ステップであって、各第二プライマは、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｅ）各サンプルＤＮＡを、第一および第二増幅プライマのペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、ｆ）場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルＤＮＡの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、ｇ）場合によっては、増幅産物を断片化するステップと、ｈ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｉ）場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタは、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、ｊ）少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、（断片化された）増幅産物に連結し、アダプタ連結増幅産物を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ヌクレオチド配列識別子の組合せは、各サンプルに固有であるステップと、ｋ）場合によっては、アダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、ｌ）アダプタ連結増幅産物の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、ｍ）アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップ。この実施形態の方法のサンプル調製のスキームを、図４に示す。このシナリオでは、サンプルＤＮＡは、先に記載したように、増幅に供されてもよく、ここでは、少なくとも１つのプライマがＮＳＩを含んでいる。増幅産物は直接使用されてもよく（研磨して、またはせずに）、およびアダプタは増幅産物に連結されてもよい。このシナリオでは、アダプタ連結増幅産物は、どちらの末端も同じアダプタを含むだろう。このアダプタ連結増幅産物は、さらに、断片化および第二アダプタへのアダプタ連結に供してもよく、２個の異なるアダプタを有するアダプタ連結増幅産物を得る。または、増幅産物は、２個の異なるアダプタに相補的な２個の異なる末端を持つ断片を得る断片化ステップに供してもよい。いずれにしても、２〜４個のＮＳＩを含むアダプタ連結増幅産物が形成される。
一実施形態では、先に記載した方法のいずれかに従った方法で、高処理配列決定を使用して識別子配列の配列を決定するステップにおいて、識別子配列の配列が、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートから決定される。前記方法において、調製サンプルＤＮＡは、増幅産物、アダプタ連結断片、アダプタ連結増幅産物および／または増幅アダプタ連結断片を含むことは理解される。
一実施形態では、単一ＤＮＡテンプレートにおいて、第一、第二および任意のさらなる識別子配列は、内部配列の少なくとも３’または５’である。調製サンプルＤＮＡ、これから配列識別子配列が調製サンプルＤＮＡ単一ＤＮＡテンプレートから決定される、のうち、サンプル起源を固有に同定するために必要な識別子配列の組合せは、内部配列の少なくとも３’または５’である。したがって、配列プライマ結合部位および内部配列が隣接する識別子配列を有するＤＮＡ配列決定テンプレートが調製され得る。そのようなＤＮＡ配列決定テンプレートの３’末端は、たとえば、以下のスキーム：’３−ＳＥＱ１−ＮＳＩ４−ＮＳＩ３−ＮＳＩ２−ＮＳ１ｌ−ＩＳ−（など）で表される。このように、テンプレートの配列が決定されると、全ての配列識別子が先ず決定される。そのようなＤＮＡテンプレートは、内部配列の一末端に配列識別子を加えることによってのみ産生されてもよい。たとえば、アダプタをＤＮＡ断片の一端だけに加えることによって、および／または非対称アダプタを使用または１個のプライマだけが配列識別子を含む増幅プライマを使用することによって。または、アダプタおよび／または増幅プライマは、全ての配列識別子が両末端に位置するように、ＤＮＡ断片の５’および３’末端の両方に加えてもよい。そのようなＤＮＡテンプレートは、以下のスキーム：’’’３−ＳＥＱ１−ＮＳＩ４−ＮＳＩ３−ＮＳＩ２−ＮＳ１ｌ−ＩＳ−ＮＳＩ１−ＮＳＩ２−ＮＳＩ３−ＮＳＩ４−５’で表される。１つ以上の別個のステップにおいて、ＩＳの両末端に加えられたＮＳＩおよび一端だけに加えられたＮＳＩを有するこれらの異なる方法の組合せも可能である。そのようなＤＮＡテンプレートは、以下のスキーム：’’’３−ＳＥＱ１−ＮＳＩ２−ＮＳＩ１−ＩＳ−ＮＳＩ１−５’で表される。配列識別子の固有の組合せは配列プライマ結合部位および内部配列が隣接するＤＮＡテンプレートが産生される方法が使用される限り、そのようなＤＮＡテンプレートは充分であろう。したがって、ヌクレオチド配列識別子を持つおよび持たない増幅プライマおよび／またはアダプタの異なる組合せが使用され得る。たとえば、実施例３および４に示すように、任意のＮＳＩ２およびＮＳＩ４が、ＮＳＩ１およびＮＳ３に対応する場合、適切なＤＮＡテンプレートが産生される（すなわち、配列プライマ結合部位はまだ必要とし、それは高処理配列決定用のサンプル調製において加えられてもよい）。同様に、ＮＳＩ２およびＮＳＩ４配列は含有されなくてもよい。また、ＮＳＩ２は含有されずおよびＮＳＩ４はＮＳ３に対応してもよく、またはＮＳ１２はＮＳＩ１に対応しおよびＮＳＩ４は含有されなくてもよい。このシナリオでは、ＤＮＡテンプレートの一末端だけが、ＮＳＩの全てを含んでもよい。さらなる実施形態では、識別子配列の配列が、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートから決定される場合、単一ＤＮＡテンプレートは、各配列決定プライマ結合部位が、異なるヌクレオチド配列識別子の３’に位置し、および高処理配列決定方法において、２つの異なる配列決定反応が、単一ＤＮＡテンプレートの２つの配列決定プライマ結合部位からの２つの配列決定プライマで行われる、２つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよい。２つの異なる配列決定プライマ結合部位および対応５’ＮＳＩまたはＮＳＩは、調製サンプルＤＮＡの内部配列と隣接することができる。調製サンプルＤＮＡは、先に記載したように、増幅産物、アダプタ連結断片、アダプタ連結増幅産物および／または増幅アダプタ連結断片であってもよい。
一実施形態では、単一ＤＮＡテンプレートは、２つの配列決定プライマ結合部位を含み、ここで、少なくとも１つの配列決定プライマ結合部位は、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子の３’に位置し、および高処理配列決定方法において、２つの異なる配列決定反応が、単一ＤＮＡテンプレートの２つの配列決定プライマ結合部位からの２つの配列決定プライマで行われる。
一実施形態では、識別子配列の配列が、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートから決定される場合、単一ＤＮＡテンプレートは、２つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよく、ここで、各配列決定プライマ結合部位は、１個以上のヌクレオチド配列識別子の３’に位置し、および高処理配列決定方法において、２つの異なる配列決定反応は、単一ＤＮＡテンプレートの２つの配列決定プライマ結合部位からの２つの配列決定プライマで行われる。２つの異なる配列決定プライマ結合部位および対応する５’ＮＳＩまたはＮＳＩは、調製サンプルＤＮＡの内部配列と隣接することができる。１個以上のヌクレオチド配列識別子のそれぞれは、同じであってもよい。そのような配置は、以下の’−３’−ＳＥＱ１−ＮＳ１−ＮＳ２−ＩＳ−ＳＥＱ２−ＮＳ１−ＮＳ２−５’と表される。このように、単一のテンプレートからの配列決定によって、固有の識別子の両固有の組合せが２度配列決定される。そのような調製サンプルＤＮＡは、先に記載したように、増幅産物、アダプタ連結断片、アダプタ連結増幅産物および／または増幅アダプタ連結断片であってもよい。
一実施形態では、識別子配列の配列が、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートから決定される場合、単一ＤＮＡテンプレートは、２つの配列決定プライマ結合部位を含んでもよく、ここで、１つの配列決定プライマ結合部位は、２個以上のヌクレオチド配列識別子の３’に位置し、およびもう１つの配列決定プライマ結合部位は、内部配列に隣に位置してもよい。高処理配列決定方法では、２つの異なる配列決定反応が、単一ＤＮＡテンプレートの２つの配列決定プライマ結合部位からの配列決定プライマで行われる。２つの異なる配列決定プライマ結合部位および対応は、調製サンプルＤＮＡの内部配列と隣接してもよい。そのような配置は、模式的に、以下の’−３’−ＳＥＱ１−ＩＳ−ＳＥＱ２−ＮＳ１−ＮＳ２−５’と表される。このように、単一のテンプレートから一回の配列決定操作での配列決定により、内部配列が決定されてもよく、他の配列決定操作で、配列識別子の固有の組合せが決定されてもよい。
実施例１
以下に、スプリットバーコードによるサンプル調製用の２つの異なる適用例を例示するが、２つの異なる分子のサンプルへの導入に関与する他のサンプル調整方法も本発明の範囲に適合する。１）バーコード化プライマを用いるＰＣＲ増幅、２）２つの制限酵素で設計されたサンプルへの、または単一酵素、その後アダプダ連結１、断片化末端の断片化および構築、アダプダ連結２で設計されたサンプルへのアダプダ連結。
ＰＣＲ増幅スプリット
バーコード（バーコード１およびバーコード２）を内部に持つ、プライマペアの機能的要素を記載し、これは、ペアエンド配列決定（Ａ）または２つのプライミング現象で同じ鎖からの配列決定（Ｂ）により決定する。概略図を図１１に示す。図１１Ａにおいて、ユニバーサルテール１（太字の矢印）は配列プライマ部位１（すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位）であり、ユニバーサルテール２（点状の矢印）は配列プライマ部位１（すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位）であることが観察され、例として、それぞれ、ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡペアエンド配列決定で使用されるような、Ｐ５およびＰ７プライマがある。図１１Ｂで、ユニバーサルテール１（太字の矢印）は、配列プライマ部位１（すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位）であり、およびユニバーサルテール２（ストライプの矢印）は配列プライマ部位２（すなわち、配列決定で使用されるプライマ部位）であり、例として、それぞれ、同じ鎖からの２つのプライマ現象によるＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡで使用されるように、Ｐ５およびＰ７プライマがある。概念は、プライマのペアによる増幅に関与する任意の方法を使用することができる。その例として、増幅産物配列決定（たとえば、突然変異、天然の遺伝子多型の検出）、ＫＡＳＰプライマ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓプライマその他のようなＰＣＲプライマに関与する多重化ＳＮＰ遺伝子型判定がある。
アダプダ連結
全ゲノム・フィジカル・マッピング試験で、４８０個の異なるＢＡＣプールサンプルを組み合わせた。これには、４８０個の異なるＥｃｏＲＩバーコード化アダプダが必要であった。アダプダのこの量は、５ｎｔバーコードを有する８０個のＥｃｏＲＩアダプダを、３ｎｔバーコードを持つ６個のＭｓｅｌのアダプダと組み合わせて使用することにより、回避し、これは、組合せで、４８０個の固有の８−ｍｅｒバーコードを産生する。この場合、前記ＰＣＲ増幅および図１１Ｂで記載するように、配列決定を、２つの配列プライマ現象を起こすことにより行った。図１２で、２個のバーコード化アダプダの使用に関する概要を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ配列決定（Ｐ５およびＰ７増幅および配列プライマ領域を使用する）に照らして記載する。パートＡは、ＤＮＡを消化するため２個の制限酵素を使用するサンプル調製を記載し、一方、パートＢは、制限酵素の組合せおよび平滑末端アダプダ連結を使用するサンプル調製を記載する。２つのバーコード化アダプダの使用に関与するサンプル調整のための別の方法も、本発明の範囲に包含される。概念は、制限断片配列決定、ＡＦＬＰ、ＲＡＤ、ＷＧＰ、全ゲノム配列決定、ペアエンド配列決定、還元型表現配列決定、その他のような２つのアダプダの連結に関与する任意の方法を使用することができる。

Claims (18)

  1. 少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子の組合せの、高処理配列決定用のサンプルＤＮＡの調製での使用。
  2. 前記高処理配列決定において複数の調製サンプルＤＮＡが使用され、サンプルＤＮＡの各調製物が、少なくとも２種のヌクレオチド配列識別子の固有の組合せを含み、ここで、第一ヌクレオチド配列識別子がヌクレオチド配列識別子の一群から選択され、第二ヌクレオチド配列識別子が前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される請求項１に記載の使用。
  3. 第一および第二ヌクレオチド配列識別子に加えて、さらに、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるヌクレオチド配列識別子が使用される請求項２に記載の使用。
  4. 調製サンプルＤＮＡが、増幅産物を含む請求項１〜３に記載の使用。
  5. 調製サンプルＤＮＡが、アダプタ連結ＤＮＡ断片を含む請求項１〜４に記載の使用。
  6. 調製サンプルＤＮＡが、増幅アダプタ連結断片および／またはアダプタ連結増幅産物を含む請求項１〜５に記載の使用。
  7. 高処理配列決定方法において、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートを使用する請求項１〜６に記載の使用。
  8. 前記単一ＤＮＡテンプレートが、２個の配列決定プライマ結合部位を含み、各配列決定プライマ結合部位が、異なるヌクレオチド配列識別子の３’位に位置している請求項７に記載の使用。
  9. 連結および／または増幅サンプルＤＮＡのサンプル起源を同定する方法であって、
    ａ）アダプタおよび／または増幅プライマを提供するステップであって、少なくとも、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子と第二アダプタまたは増幅プライマとを含む第一アダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含んで提供され、および場合によっては、さらなるアダプタまたは増幅プライマが、ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含んで提供されるステップと、
    ｂ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｃ）アダプタおよび／または増幅プライマを使用してサンプルＤＮＡ上で連結および／または増幅反応を行い、前記第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子を含む連結および／または増幅サンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｄ）高処理配列決定を使用して、少なくとも、第一、第二および場合によってはさらなるヌクレオチド配列識別子の配列を決定するステップと、
    ｅ）連結および／または増幅サンプルＤＮＡのサンプル起源を決定するステップと、
    を含む方法。
  10. 複数のサンプルＤＮＡから、増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、
    ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、
    ｃ）第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｄ）第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｅ）各サンプルＤＮＡを、第一および第二増幅プライマの固有のペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、
    ｆ）場合によっては、増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｇ）該増幅産物の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、
    ｈ）該増幅産物のサンプル起源を決定するステップと、
    を含む方法。
  11. 複数のサンプルＤＮＡから、アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を同定する方法であって、
    ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、
    ｃ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｄ）第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｅ）各サンプルＤＮＡを断片化するステップと、
    ｆ）第一および第二アダプタの固有のペアを各断片化サンプルＤＮＡに連結し、アダプタ連結ＤＮＡ断片を得るステップと、
    ｇ）場合によっては、アダプタ連結ＤＮＡ断片の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｈ）アダプタ連結ＤＮＡ断片の第一識別子配列および第二識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、
    ｉ）アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を決定するステップと、
    を含む方法。
  12. アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、
    ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、
    ｃ）第一増幅プライマを提供するステップと、
    ｄ）第二増幅プライマを提供するステップと、
    ｅ）サンプルＤＮＡを、第一および第二増幅プライマのペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、
    ｆ）場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルＤＮＡの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｇ）場合によっては、前記増幅産物を断片化するステップと、
    ｈ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｉ）第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｊ）場合によっては、さらなるアダプタを提供するステップであって、各アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択されるさらなるヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｋ）第一アダプタを（断片化された）増幅産物に連結するステップと、
    ｌ）場合によっては、ステップｋ）のアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｍ）連結ステップを第二のおよびさらなるアダプタで繰り返し、各連結ステップの後、場合によっては、得られたアダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｎ）ステップｍ）で得たアダプタ連結増幅産物の第一、第二および場合によってはさらなる識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、
    ｏ）アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップと、
    を含む方法。
  13. 複数のサンプルＤＮＡから、増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を同定する方法であって、
    ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供するステップと、
    ｃ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｄ）場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｅ）各サンプルＤＮＡを断片化するステップと、
    ｆ）少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、断片化サンプルＤＮＡに連結し、アダプタ連結ＤＮＡ断片を得るステップと、
    ｇ）場合によっては、アダプタ連結ＤＮＡ断片の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｈ）第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｉ）場合によっては、第二増幅プライマを提供するステップであって、各第二プライマが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｊ）アダプタ連結ＤＮＡ断片を、第一増幅プライマおよび場合によっては第二増幅プライマで増幅し、増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ヌクレオチド配列識別子の組合せが、各サンプルに関して固有であるステップと、
    ｋ）場合によっては、増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｌ）増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、
    ｍ）増幅アダプタ連結ＤＮＡ断片のサンプル起源を決定するステップと、
    を含む方法。
  14. アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を同定する方法であって、
    ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供するステップと、
    ｂ）ヌクレオチド配列識別子の一群を提供する方法と、
    ｃ）第一増幅プライマを提供するステップであって、各第一プライマが、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第一ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｄ）第二増幅プライマを提供ステップであって、各第二プライマが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第二ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｅ）各サンプルＤＮＡを、第一および第二増幅プライマのペアで増幅し、増幅産物を得るステップと、
    ｆ）場合によっては、それぞれ異なるプライマペアで増幅されたサンプルＤＮＡの増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｇ）場合によっては、増幅産物を断片化するステップと、
    ｈ）第一アダプタを提供するステップであって、各第一アダプタが、前記ヌクレオチド配列識別子から選択される第三ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｉ）場合によっては、第二アダプタを提供するステップであって、各第二アダプタが、場合によっては、前記ヌクレオチド配列識別子の群から選択される第四ヌクレオチド配列識別子を含むステップと、
    ｊ）少なくとも第一アダプタおよび場合によっては第二アダプタを、（断片化された）増幅産物に連結し、アダプタ連結増幅産物を得るステップであって、第一、任意の第二、第三および任意の第四ヌクレオチド配列識別子の組合せが、各サンプルに固有であるステップと、
    ｋ）場合によっては、アダプタ連結増幅産物の少なくとも一部をプールするステップと、
    ｌ）アダプタ連結増幅産物の第一、任意の第二、第三および任意の第四識別子配列の配列を、高処理配列決定を使用して決定するステップと、
    ｍ）アダプタ連結増幅産物のサンプル起源を決定するステップと、
    を含む方法。
  15. 高処理配列決定を使用して識別子配列の配列を決定するステップにおいて識別子配列の配列を、調製サンプルＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートから決定する請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記単一ＤＮＡテンプレートにおいて、第一、第二および任意のさらなる識別子配列が、内部配列の少なくとも３’または５’位にある、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記単一ＤＮＡテンプレートが、２個の配列決定プライマ結合部位を含み、各配列決定プライマ結合部位が、異なるヌクレオチド配列識別子の３’位に位置し、および高処理配列決定方法において、２つの異なる配列決定反応が、単一ＤＮＡテンプレートの２個の配列決定プライマ結合部位からの２個の配列決定プライマを用いて行なわれる請求項１６に記載の方法。
  18. 前記単一ＤＮＡテンプレートが、２個の配列決定プライマ結合部位を含み、少なくとも１個の配列決定プライマ結合部位が、少なくとも２個のヌクレオチド配列識別子の３’位に位置し、および高処理配列決定方法において、２つの異なる配列決定反応が、２つの単一ＤＮＡテンプレートの配列決定プライマ結合部位からの２つの配列決定プライマを用いて行われる請求項１６に記載の方法。
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