JP2016500275A - ハイスループットpcrシーケンシングのための方法及びプライマーのセット - Google Patents
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Abstract
Description
核酸配列は5'末端から3'末端の方向で表記される。本明細書の文脈において、配列断片とは、ひとまとまりの連続した配列を意味する。配列断片は、下付き文字又は上付き文字を適宜伴う文字によって表される。k1、k1'、k2、k2'、s及びs'は、配列断片の表記例である。配列がこれら配列表記で表される場合、そのような配列は、5'末端から3'末端の方向で記載されている。配列断片は、配列要素とも称される。
本発明は、相乗作用を有する3種のプライマー要素(まとめて大文字Kを用いてK−ボックスと表記され、フォワード(順方向)プライマーに含まれるk−ボックス(小文字のkを用いる)及びリバース(逆方向)プライマーに含まれるk'−ボックスとに分類できる)であって、組み合わせて使用することで、次世代シーケンシング(NGS)を含むがこれに限定されない方法を用いて解析可能なPCRライブラリの正確性を顕著に向上させるプライマー要素の、設計指針を提供するものである。
プライマーの簡単な説明及び配列断片を表す略語
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Integration of next-generation sequencing into clinical practice: are we there yet? Kohlmann A et al. Semin Oncol. 2012年2月;39(1):26-36. doi:10.1053/j.seminoncol. 2011.11.008. PMID:22289489
k1/k1'の配列は、既に行われた増幅に由来するコンタミネーションを防止するように設計されている。図1に示すように、第1段階目のPCRに使用されるフォワードプライマーは、(i)標的特異的な部分pC、(ii)各プライマーのセットに特異的な、K−ボックスの要素k1、及び(iii)配列要素maを含む。第1段階目のPCRに使用されるリバースプライマーは、これらと同じように、しかし逆相補配列となるように構成されている。
更なるK−ボックス要素k2及びk2'は、それぞれ第1のプライマーの配列断片ma−K及びma'−K'に含まれるが、これら配列断片に対応する第2の(アダプター)プライマーの配列断片には含まれないものである(図2)。従ってk2及びk2'は、第1のプライマーのみに存在する特徴である。k2(又はk2')及びk1(又はk1')が第1のプライマーに含まれる実施態様においては、要素k2(又はk2')は、要素k1(又はk1')の下流(3'末端側)に位置する。
K−ボックス要素s/s'は、以下に概説するように、k1/k1'及びk2/k2'の配列に依存して起こり得るPCRバイアスを防止する。
これら3種のK−ボックス要素は、相乗作用によって、NGS/HTS技術を使用した増幅におけるPCRに起因するコンタミネーションを防止する効果を奏する。
本発明の第1の観点によると、配列断片tn−tC−tV−tC'−tn'に含まれる標的核酸配列tC−tV−tC'を増幅する方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による複数の増幅反応を行う工程を含む方法が、提供される。換言すれば、本発明は、同じ標的配列(ただし、tVと表記される目的の配列断片に多様性があってもよい)を繰り返し増幅又はシーケンシングする方法に関する。各増幅反応は、PCRによる2個の増幅工程を含む。第1段階目の増幅工程は、第1の(第1段階目の)プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅を行う工程であり、PCR反応に必要な、ヌクレオシド三リン酸(ATP、GTP、TTP、CTP)、適切な緩衝液及びTaqポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ等の、当業者によく知られる反応用物質が必要に応じて使用される。この第1のプライマー対は、2個の配列要素ma−K及びpcを5'末端から3'末端の方向で有する配列ma−K−pcを含む第1の(第1段階目の)左側(フォワード)PCRプライマーと、同様に5'末端から3'末端の方向で配置される配列ma−K'−pc'を含む第1の右側(リバース)PCRプライマーと、を含む。第1段階目の増幅産物を第1の増幅産物と称し、第1の増幅産物は、その配列断片ma−K及びma−K'が両側に隣在する、標的核酸配列を含む(図1)。
k1及びk1'の長さは、それぞれ独立して2から9ヌクレオチド長であり、
k2及びk2'の長さは、それぞれ独立して2から7ヌクレオチド長であり、
s及びs'は、配列要素tn及びtn'とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、s及びs'の長さは、それぞれ独立して、1、2、3、4又は5ヌクレオチド長であり、
aKの配列は配列要素k1の配列と同じであり、aK'の配列は配列要素k1'の配列と同じであり、
aK及びaK'は、それぞれk2及びk2'とハイブリッドを形成しないように設計され、
aP−aKはma−K内の連続した配列とハイブリッドを形成し、aP'−aK'はma−K'内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
pc、pc'、ma−K及びma−K'の配列の長さは、それぞれ独立して、10から40ヌクレオチド長であり、aL及びaL'はそれぞれ独立して任意の配列を有する。
各k1が互いに異なり、かつ各k1'が互いに異なることで、各セットに特有のk1及びk1'の組み合わせが存在する、及び/又は
各k2が互いに異なり、かつ各k2'が互いに異なることで、各セットに特有のk1及びk1'の組み合わせが存在する。
配列番号001から045から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号046から058から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号189から232から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号233から246から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号059から085から選択されるmaを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号086から117から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号118から149から選択されるaL−aPを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号150から182から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマー
a. 上述の観点のいずれかにおいて説明した方法を用いて上記標的配列を増幅する工程、及び
b. 配列要素ma−K及び/又はma−K'を含む第2の増幅産物をシーケンシングして、読み取った配列で構成される配列のセットを生成する工程
c. 上記配列のセットに含まれる各配列を、第1段階目のプライマーに含まれるma−K及び/又はma−K'とアライメントする工程、及び
d. コンタミネーションの指標として、上記配列のセットに含まれる各配列に対し0又は1の値を割り当てる工程、ここで、上記配列のセットに含まれる配列(配列のセットに含まれるある特定の配列)がma−K及び/又はma−K'と完全にアライメントした場合は値0が割り当てられ(この特定の配列を有するコンタミネーション物が存在しないことを意味する)、上記配列のセットに含まれる配列(配列のセットに含まれるある特定の配列)とma−K及び/又はma−K'とのアライメントが不完全だった場合は値1が割り当てられ(この特定の配列を有するコンタミネーション物の配列が読み取られたことすることを意味する)、ここで、
(i)工程d)で割り当てられた値を全て加算し、読み取った全配列数で当該加算値を除算して、コンタミネーション物の百分率を算出する、及び/又は
(ii)上記配列のセットから、値1が割り当てられた配列を削除する
i. 配列ma−K−pcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列ma−K'−pc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマーと、を含む第1のプライマーのセット、及び
ii. 配列aL−aP−aKを含む左側のアダプタープライマー及び配列aL'−aP'−aK'を含む右側のアダプタープライマーと、を含むアダプターPCRプライマー対
ここで、配列の各表記は前述のとおりの意味を持つ。具体的には以下のとおりである。
pcは標的配列のtCに対し相補的な配列を有し、pc'はtC'に対する逆相補配列を有する。
Kは配列要素k1及び3'末端の配列要素sを含み、K'は配列要素k1'及び3'末端の配列要素s'を含み、ここで、
k1及びk1'の長さは、それぞれ独立して2から9ヌクレオチド長であり、
s及びs'は配列要素tn及びtn'とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように設計されたミスマッチ配列であり、s及びs'の長さは、それぞれ独立して、1、2、3、4又は5ヌクレオチド長であり、
aKの配列は配列要素k1の配列に対して相補的であり、aK'の配列は配列要素k1'の配列に対して相補的であり、
aK及びaK'は、それぞれk2及びk2'とハイブリッドを形成しないように設計され、
aP−aKはma−K内の連続した配列とハイブリッドを形成し、aP'−aK'はma−K'内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
pc、pc'、ma−K及びma−K'の配列の長さは、それぞれ独立して、10から40ヌクレオチド長であり、aL及びaL'はそれぞれ独立して任意の配列を有する。
配列番号001から045から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号046から058から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号189から232から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号233から246から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号059から085から選択されるmaを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号086から117から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号118から149から選択されるaL−aPを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号150から182から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマー
コンタミネーションの抑制効果を確認するための原理試験の設計の概要は、下記のとおりである。
1)第1段階目の増幅のPCR産物を、その100%がコンタミネーション物であると見なして第2段階目の増幅の鋳型として使用した。配列断片K1の、このコンタミネーション物の増幅抑制機能及び効果を確認するため、プライマー並びに第1の増幅産物及び第2の増幅産物における、K1間の様々な長さ(N=1、2、3、4、6bp)のミスマッチを確認した。更に、コンタミネーション抑制効果を確認するため、(i)校正活性を有するポリメラーゼ及び校正活性を有さないポリメラーゼ、並びに(ii)ホスホロチオエート結合又はLNAを含むプライマー及びホスホロチオエート結合もLNAも含まないプライマーを使用した。
2)コンタミネーション抑制をしない場合との比較、及びコンタミネーション抑制をしない場合のシミュレーションを行うため、完全にマッチする配列を有するK1を含むプライマーを用いたPCRも同時に行った。
3)1)及び2)に記載の増幅によって得られたPCR産物の量を、後に詳述するように定量及び標準化した。統計的な信頼度を確保するため、各実験について反復実験を行い、PCR産物量の平均及び標準偏差を算出した。
表3は、ホスホロチオエート結合の数の影響を含むK−ボックスのミスマッチによる、K1によるコンタミネーション抑制に関する実験の結果を単一値で表したものである。表4は、表3の簡易統計である。上記試験において、第2段階目の増幅反応用プライマーは、0から3個のホスホロチオエート結合を含むものであった。コンタミネーション物(PeerのDNAを鋳型として、Peerに特異的な第1段階目の増幅用プライマーを用いて得たPCR産物)が100%存在するという状況を、第1段階目の増幅で得られたPCR産物を第2段階目の増幅に供することで模擬的に作り出した。第2段階目の増幅は、マッチする第2段階目の増幅用プライマー(つまりK1のミスマッチが0(ゼロ)である)、及び1bp又は2bp(フォワードプライマーのK1間のミスマッチとリバースプライマーのK1間のミスマッチとの合計)のミスマッチを含むK1を含む2番目の増幅用プライマーを用いた。
K1がコンタミネーションを抑制できることを示すため、コレクション集合(TCRβコレクション集合と称する)を用いた試験を行った。ここで、このTCRβコレクション集合は、TCRβのV断片に特異的な44個のプライマー(pCは配列番号189から232で表されるものである)と、TCRβのJ断片に特異的な14個のプライマー(pC'は配列番号233から246で表されるものである)とを含む。これらプライマーのそれぞれは、5'末端部分に2ヌクレオチド長の配列Sを含む(Sの配列が「GG」のものは配列番号189から193、195、197、198、201から211、213から221、223から229、231、233から241及び243から246で表され、Sの配列が「TG」のものは配列番号194、200及び230で表され、Sの配列が「GT」のものは配列番号196、199、212、222及び242で表され、Sの配列が「TT」のものは配列番号232で表され、ここで、Sの配列は5'末端から3'末端に向かって表記されている。)。
短い配列要素として、k2は配列要素k1の3'末端に連結され、k2'は配列要素k1'の3'末端に連結される(図2、3)。K2は、セットにおいて第1のプライマー対を特定する機能を有し、第2の(アダプター)プライマーの配列要素と相補的な配列は有さないものである。K2の配列は、これまでの増幅反応に由来するコンタミネーション物を検出するよう設計されており、従ってK1の、上述の抑制効率を制御するものである。
「チューブ1」(セット1)の第1段階目の増幅:フォワードプライマー1bpV1及びリバースプライマー1bpJ1
「チューブ2」(セット2)の第2段階目の増幅:フォワードプライマー1bpV2及びリバースプライマー1bpJ1
上記k1(及びk1')並びにk2(及びk2')の機能を向上させるのが、短い離隔用配列を有するs及びs'である(図3、4)。sは第1段階目のプライマー間で不変の配列断片pCと配列断片k1及びk2とを離隔し、s'は第1段階目のプライマー間で不変の配列断片pC'と配列断片k1'及びk2'とを離隔するものである。ここで、連続する増幅反応において、k1/k1'及びk2/k2'はプライマー間で異なるので、いくつかのk1/k1'及びk2/k2'においては、その3'末端部分が、標的配列において第1段階目のプライマーがハイブリッドを形成する領域であるpC及びpC'に隣接する配列と、偶然にマッチする可能性がある。従って、第1段階目のプライマー内の標的配列にマッチする断片が長くなる可能性があり、アニーリング温度の上昇や、PCRバイアスを引き起こす可能性がある。
K1によるコンタミネーション抑制効果及びK2によるコンタミネーション物検出効果を分析するため、前述のとおりこれら効果に関連する配列を有するSを含む、TCRβコレクション集合(配列番号189から246)を用いた試験を行った。セット1から3に使用した要素K1及びK2は、表9に記載したものである。
k1及びk1'の配列の好適な例を示す。それら好適な配列は、(a)後述の表16から19のいずれかに記載される全てのk1及びk1'の配列間でクロスハイブリダイゼーションしないように、(b)k1及びk1'の配列のアニーリング温度幅を小さくするように、及び(c)塩基の多様性が低くならないように全塩基の3分の2超の塩基が同じヌクレオチド(A、C、G、T)にならないように、設計された。
Claims (23)
- 配列断片tn−tC−tV−tC'−tn'に含まれる標的核酸配列tC−tV−tC'を増幅するための、複数の増幅反応を含む方法であって、
前記増幅反応の各々は、
i. 配列ma−K−pcを含む、左側の(フォワード)第1段階目のプライマーと、
ii. 配列ma−K'−pc'を含む、右側の(リバース)第1段階目のプライマーと、
を用いて前記標的核酸配列を増幅して、第1の増幅産物を生成する第1段階目の増幅反応、及び
iii. 配列aL−aP−aKを含む、左側の(フォワード)アダプタープライマーと、
iv. 配列aL'−aP'−aK'を含む、右側の(リバース)アダプタープライマーと、
を用いて前記第1の増幅産物を増幅して、第2の増幅産物を生成する第2段階目の増幅反応を含み、
ここで、
tVは、前記標的核酸配列における可変領域であり、
pcは配列要素tCと同一の配列を有し、かつpc'はtC'に対する逆相補配列を有し、
Kは配列要素k1及び3'末端配列要素sを含み、かつK'は配列要素k1'及び3'末端配列要素s'を含み、
ここで、
k1及びk1'の長さは、それぞれ独立して、2から9ヌクレオチド長であり、
s及びs'は、配列要素tn及びtn'とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、s及びs'の長さは、それぞれ独立して、1、2、3、4又は5ヌクレオチド長であり、
aKの配列は配列要素k1の配列と同一の配列であり、かつaK'の配列は配列要素k1'の配列と同一の配列であり、
aP−aKはma−K内の連続した配列とハイブリッドを形成し、aP'−aK'はma−K'内の連続した配列とハイブリッドを形成し、
pc、pc'、ma−K及びma−K'の配列の長さは、それぞれ独立して、10から40ヌクレオチド長であり、aL及びaL'はそれぞれ独立して任意の配列を有し、
ここで、
前記複数の増幅反応の各々には、特有のプライマーのセットを用い、該プライマーのセットの各々において、
k1は、他のプライマーセットのk1と異なるものである、
及び/又は
k1'は、他のプライマーセットのk1'と異なるものである。 - Kは3'末端配列k1−k2−sを含み、かつKは3'末端配列k1'−k2'−s'を含み、
ここで、k2の長さ及びk2'の長さは、それぞれ独立して、2から7ヌクレオチド長であり、
aK及びaK'はそれぞれ、k2及びk2'とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
前記プライマーのセットの各々の間で、k2及びk2'はそれぞれ、他のk2及びk2'とは異なるものである、及び
k1、k1'、s及びs’は前記されたものである、
請求項1に記載の方法。 - k1の長さ及びk1'の長さは、それぞれ独立して、5から9ヌクレオチド長である、
sの長さ及びs'の長さは、それぞれ独立して、2、3又は4ヌクレオチド長である、及び/又は
k2の長さ及びk2'の長さは、それぞれ独立して、2から6ヌクレオチド長である、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記プライマーのセットの各々において、
k1は、他のプライマーセットのk1と異なるものであり、かつk1'は、他のプライマーセットのk1'と異なるものである、及び/又は
k2は、他のプライマーセットのk2と異なるものであり、かつk2'は、他のプライマーセットのk2'と異なるものである、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - k1及びk1'並びに/又はk2及びk2'は、前記配列要素tn及びtn'とハイブリッドを形成しないように設計されている、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記プライマーのセットは、
配列番号001から045から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号046から058から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号189から232から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号233から246から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号059から085から選択されるmaを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号086から117から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号118から149から選択されるaL−aPを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号150から182から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマーを含む、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記左側の第1段階目のプライマー、前記右側の第1段階目のプライマー、前記左側のアダプター及び前記右側のアダプタープライマーはそれぞれ、その3'末端又はその近傍に、ヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチド若しくはヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオチド類縁体、又はヌクレアーゼ耐性を有するヌクレオシド間結合を含む、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1段階目の増幅及び/又は前記第2段階目の増幅において、3'末端から5'末端方向のエキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を有するDNAポリメラーゼを使用する、
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 配列断片tn−tC−tV−tC'−tn'に含まれる標的核酸配列tC−tV−tC'をシーケンシングする方法であって、
a)請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法を用いて前記標的核酸配列を増幅する工程、及び
b)配列要素ma−K及び/又はma−K'を含む前記第2の増幅産物をシーケンシングして、読み取った配列のセットを生成する工程
を含む、方法。 - 更に、
c) 前記配列のセットに含まれる各配列を、第1段階目のプライマーに含まれるma−K及び/又はma−K'とアライメントする工程、及び
d) コンタミネーションの指標として、前記配列のセットに含まれる各配列に対し0又は1の値を割り当てる工程であって、前記配列のセットに含まれる配列(配列のセットに含まれるある特定の配列)がma−K及び/又はma−K'と完全にアライメントした場合は値0を割り当て、前記配列のセットに含まれる配列(配列のセットに含まれるある特定の配列)とma−K及び/又はma−K'とのアライメントが不完全だった場合は値1を割り当てる工程
を含み、
ここで、
(i)工程d)で割り当てた値を全て加算し、読み取った全配列数で前記加算値を除算して、コンタミネーション物の百分率を算出する、及び/又は
(ii)前記配列のセットから、値1を割り当てた配列を削除する、
請求項9に記載の方法。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の、標的核酸配列を増幅又はシーケンシングする方法に使用するためのプライマーのセットであって、
該プライマーのセットは
i.配列ma−K−pcを含む第1段階目の左側プライマー及び配列ma−K'−pc'を含む第1段階目の右側プライマーを含む第1段階目のPCRプライマー対、及び
ii.配列aL−aP−aKを含む左側のアダプタープライマー及び配列aL'−aP'−aK'を含む右側のアダプタープライマーを含むアダプターPCRプライマー対
を含み、
ここで、
pcは標的配列のtCに対し相補的な配列を有し、かつpc'はtC'に対する逆相補配列を有し、
Kは配列要素k1及び3'末端配列要素sを含み、かつK'は、配列要素k1'及び3'末端配列要素s'を含み、
ここで、
k1及びk1'の長さは、それぞれ独立して、2から9ヌクレオチド長であり、
s及びs'は、配列要素tn及びtn'とハイブリッドを形成する連続的配列が存在しないように選択されたミスマッチ配列であり、s及びs'の長さは、それぞれ独立して、1、2、3、4又は5ヌクレオチド長であり、
aKの配列は配列要素k1の配列と同じあり、かつaK'の配列は配列要素k1'の配列と同じであり、
aP−aKはma−K内の連続した配列とハイブリッドを形成し、aP'−aK'はma−K'内の連続した配列とハイブリッドを形成する、及び
pc、pc'、ma−K及びma−K'の配列の長さは、それぞれ独立して、10から40ヌクレオチド長であり、aL及びaL'はそれぞれ独立して任意の配列を有する、
プライマーのセット。 - Kは3'末端配列k1−k2−sを含み、かつKは3'末端配列k1'−k2'−s'を含み、
ここで、
k2の長さ及びk2'の長さは、それぞれ独立して、2から7ヌクレオチド長である、及び
aK及びaK'はそれぞれ、k2及びk2'とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
請求項11に記載のプライマーのセット。 - 配列番号001から045から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号046から058から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号189から232から選択されるpcを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号233から246から選択されるpc'を含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号059から085から選択されるmaを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号086から117から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマー、及び/又は
配列番号118から149から選択されるaL−aPを含む第1段階目の左側(フォワード)プライマーと、配列番号150から182から選択されるmaを含む第1段階目の右側(リバース)プライマーを含む、
請求項11又は12に記載のプライマーのセット。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の、標的核酸配列を増幅又はシーケンシングする方法に使用するためのセットのコレクションであって、
前記セットは、請求項11〜13のいずれか1項に記載のプライマーのセットであり、
前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、全てのpcは同じ配列を有し、かつ全てのpc'は同じ配列を有し、
前記プライマーのセットの各々において、
k1は、他のプライマーのセットのk1と異なるものである、及び/又は
k1'は、他のプライマーのセットのk1'と異なるものである、
セットのコレクション。 - Kは3'末端配列k1−k2−sを含み、かつKは3'末端配列k1'−k2'−s'を含み、
ここで、k2の長さ及びk2'の長さは、それぞれ独立して、2から7ヌクレオチド長であり、
aK及びaK'はそれぞれ、k2及びk2'とハイブリッドを形成しないように設計されたものであり、
前記プライマーのセットの各々において、
k2は、他のプライマーのセットのk2と異なるものである、及び/又は
k2'は、他のプライマーのセットのk2'と異なるものであって、
k1、k1'、s及びs’は前記されたものである、
請求項14に記載のセットのコレクション。 - k1の長さ及びk1'の長さは、それぞれ独立して、5から9ヌクレオチド長である、
sの長さ及びs'の長さは、それぞれ独立して、2、3又は4ヌクレオチド長である、及び/又は
k2の長さ及びk2'の長さは、それぞれ独立して、2から6ヌクレオチド長である、
請求項14又は15に記載のセットのコレクション。 - 前記プライマーのセットの各々において、
k1は、他のk1と異なるものであり、かつk1'は、他のk1'と異なるものである、及び/又は
k2は、他のk2と異なるものであり、かつk2'は、他のk2'と異なるものである、
請求項14〜16のいずれか1項に記載のセットのコレクション。 - 4、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、160、200、256又は1024個の相異なるプライマーのセットを含む、
請求項14〜17のいずれか1項に記載のセットのコレクション。 - k1及びk1'並びに/又はk2及びk2'は、tn及びtn'とはハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
配列要素aPの配列は全て同じであり、配列要素aP'の配列は全て同じである、及び/又は
aK及びaK'はそれぞれ、k2及びk2'とハイブリッドを形成しないように設計されたものである、
請求項14〜18のいずれか1項に記載のセットのコレクション。 - 請求項14〜19のいずれか1項に記載のプライマーのセットのコレクションを複数含む、コレクション集合であって、前記コレクションの各々は、相異なるpc及びpc’の組み合わせによって特徴付けられる、コレクション集合。
- 各pcは、配列番号001から045から選択される配列を含む、若しくは各pcの配列は配列番号001から045から選択される配列であり、かつ、各pc'は配列番号046から058から選択される配列を含む、若しくは各pc'の配列は配列番号046から058から選択される配列である、又は、
各pcは、配列番号189から232から選択される配列を含む、若しくは各pcの配列は配列番号189から232から選択される配列であり、かつ、各pc'は配列番号233から246から選択される配列を含む、若しくは各pc'の配列は配列番号233から246から選択される配列である、
請求項20に記載のコレクション集合。 - 請求項11〜13のいずれか1項に記載のプライマーのセットを複数含む、複数のセットであって、
前記コレクションに含まれる前記プライマーのセット全てにおいて、配列要素K及びK'は全て同じであり、
前記プライマーのセットの各々において、
pcは他のプライマーのセットのpc'と異なる、及び/又は
pcは他のプライマーのセットのpc'と異なる、
セット。 - 患者のT細胞受容体β鎖のレパトアをex vivoで分析する方法であって、
請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法、請求項11〜13のいずれか1項に記載のプライマーのセット、又は請求項14〜22のいずれか1項に記載のプライマーのセットのコレクションを使用する、方法。
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